CN111220725A - 污水处理厂活性污泥异常鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

一种污水处理厂活性污泥异常预警和鉴别方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可用于对污水生物处理系统运行过程中出现异常状态和异常状态原因进行预警与鉴别。本发明采用液相色谱串联质谱的代谢组学技术监测微生物代谢中间产物，并由概率线性判别分析，从而预测并鉴别活性污泥系统中异常状态及其原因。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥鉴别方法。

Description

污水处理厂活性污泥异常鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种污水处理厂活性污泥异常状态和鉴别的方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统运行过程中出现异常状态进行鉴别。
背景技术
污水生物处理技术有着经济、高效的特点，并被广泛应用于污水处理领域。传统的污水生物处理过程是通过微生物的生理代谢能力降解有机物，氨氮，磷等污染物。生物处理系统在好氧条件下，自养的氨氧化菌可以将氨氮氧化成亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐再由亚硝酸盐氧化菌氧化成硝酸盐。氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌使用此过程中产生的能量，通过还原性三羧酸循环，还原性单羧酸循环，厌氧乙酰辅酶途径和羟基丙酸途径固定水中的HCO3 -或者CO3 -合成核酸，糖类，氨基酸和蛋白质等维持生理活性的物质。在反硝化和除磷过程，反硝化菌和聚磷菌通过氧化乙酸钠，丙酸钠等有机物产生能量，并通过三羧酸循环同化有机碳源并形成丙酮酸，进而合成各种生命活动所需的必要物质。这些物质的各种合成，转化，分解维持着污水生物处理系统中微生物的代谢活性，让生物系统有着稳定的机物，氮，磷等污染物去除能力。当污水处理过程中的温度，PH，污染物成分等条件发生变化，系统的硝化，反硝化，除磷等功能因此会受到严重的破坏。因为这些抑制过程在初始时难以有有效的手段提前预警和鉴别，所以会导致污水处理生物系统的破坏。随着生物技术的进步，人们逐渐意识到微生物中各种代谢通路的抑制和变化会导致污水处理系统宏观上的活性降低。因为当一种或多种路径被破坏，微生物体内的生物酶合成，生化反应电子传递，RNA转录等过程立即被抑制，进而在宏观上表现为系统的硝化，反硝化，除磷功能的削弱。虽然这些抑制在宏观上表现为处理能力的下降，但是在微观上每一种抑制过程，都有其特殊的破坏路径。因此，可以通过检测这些路径，来鉴定污水生物处理系统中的微生物是否受到了抑制。
代谢组学通过液相色谱串联质谱测量出每种中间代谢产物的含量和相对变化，然后通过这些物质的变化归纳出其受到影响的代谢通路。相比于其他的检测方法，代谢组学有着灵敏度高，准确性高的特点，并且可以从宏观和微观两方面角度评价污水生物处理系统的状态。微生物代谢产物经由液相色谱串联质谱测定后，可以生成一个代谢组分与相对丰度的多维向量矩阵。对这个矩阵进行线性判别分析，概率线性判别分析，神经网络分，支持向量回归分析，可以将排除冗余数据造成的干扰，准确的判别出污水生物系统是否正常。目前对污水处理系统监测主要依靠实时监测进出水中各种污染物是否有明显变化或者污泥沉降性是否正常。但是这种方法有着明显的缺陷,首先，仅仅从表观上的数据并不能提前预判污水生物处理系统是否受到破坏，因此即使发现污水处理系统崩溃也不能找到原因和解决办法。
本发明采用液相色谱串联质谱的代谢组学技术监测微生物代谢中间产物，并由概率线性判别分析，从而预测并鉴别活性污泥系统中异常状态及其原因。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：
(1)活性污泥代谢产物提取的方法。目前，代谢组学主要用于人体疾病检测，肠道菌群监测，农作物灾害防治，发酵过程优化等方面，主要通过特定的标志代谢产物，代谢通路变化来鉴别某些疾病或者优化某种工艺。在水污染治理领域中，一方面用于水中污染物对人或者生物的毒害效果和原理。另一方面，代谢组学常常用于评价藻类的经济产物的积累情况。但是污水处理系统的活性污泥不仅种类复杂，并夹杂着大量污染物和杂质，还以菌胶团的形式裹挟在一起。所以其他领域的成熟技术并不适用污水生物处理系统。目前还没有较为有效的针对活性污泥的代谢组分提取方法，本发明综合优化了活性污泥中代谢产物提取效率，代谢物质保存，干扰物质去除等方面并对以往的研究进行优化。结合物理和化学方法有效的提取代谢产物。
(2)基于液相色谱串联三重四极杆质谱的多反应监测模式检测活性污泥代谢物质。目前大部分代谢组学往往使用液相色谱串联飞行时间质谱。这种方法虽然可以有效的检测到代谢物质，但是极其容易受到外来污染物干扰，造成过饱和或者离子源污染。本发明通过液相色谱串联三重四极杆质谱，通过多反应监测模式，可以有效的过滤掉大量外来污染物质。并且通过自动优化软件，对每一种代谢产物进行优化，极大的增强了液相色谱串联四极杆质谱的识别鉴定能力。并且分别评价了乙烯基吡咯烷酮二乙烯苯杂化碳18色谱柱，乙烯基吡咯烷酮二乙烯苯杂化氨基色谱柱，硅胶基杂化碳18色谱柱在液相中的分离情况。优化了污水处理生物系统代谢产物在正离子模式和负离子模式的洗脱程序和流动相。本发明针对污水生物处理系统生物种类复杂，含有杂质等特点针对性的优化液相及质谱条件，可以有效的鉴别污水生物处理系统代谢产物的种类和含量。
(3)使用概率线性判别分析。线性判别分析是一种将类内和类间方差建模为多维高斯模型的技术。它在可以在最大可分辨性的空间中寻找方向，因此最适合支持类识别任务。相比于其他领域常使用的主成分分析方法，概率线性判别分析可以有监督的在保留样本信息时最大的分离不同的组间的样本。污水处理系统的代谢组分多而且庞杂，而且有着大量的冗余信息，如果直接使用主成分分析，将导致稳定运行的样本有极大可能与异常运行样本重叠。本发明中针对污水处理系统特殊情况，使用概率线性判别分析，可以有效的分离稳定运行样本和异常运行样本。
故本发明利用物理法提取原始污水处理系统活性污泥的代谢组分，然后经过纯化和浓缩，通过液相色谱串联三重四极杆质谱，鉴别获取的代谢组分。最后使用概率线性判别分析判别污水处理系统状态。为污水处理系统提供了一种预警和鉴别异常状态的方法。未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠的污水处理系统预警和鉴别异常状态的方法。利用微生物在不同的状态下，有着代谢物质表达的差异的特点。通过物理法提取代谢产物，之后代谢产物经过净化和浓缩，通过液相色谱串三重四极杆质谱鉴定提取出的代谢产物。然后通过概率线性分析鉴别污水处理系统是否存在差异。可快速、高效地监测活性污泥系统在日常运行时是否出现异常，用于污水处理厂活性污泥系统稳定运行与异常状态预警，指导实际污水处理厂的运行调控，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
1、污水处理厂活性污泥异常预警和鉴别方法，其特征在于：
(1)取污水生物处理系统活性污泥10毫升于15毫升离心管中，在5000转/分钟离心3分钟，弃掉上清液，并向离心管中加入15毫升的0.2摩尔每升磷酸二氢钾缓冲液淘洗三次，然后弃掉上清液；
(2)向15毫升离心管中加入1毫升去离子水，2毫升甲醇，2毫升乙腈，并混匀；
(3)将离心管混匀并浸没入液氮2分钟；
(4)在室温下将离心管内的液体解冻；
(5)在冰浴中将超声破碎仪的探针尖端插入到离心管的液体中，在200瓦功率下，以2秒开2秒关的程序运行30分钟；
(6)将超声破碎后的混合溶液转移到2毫升小管内，然后将其储存在-20摄氏度1小时。最后在-20摄氏度下以14000转/分钟离心15分钟；
(7)取出上清液转移到新的2毫升离心管中，以1500转/分钟的离心力和2帕的真空下浓缩上清液5个小时；
(8)将向离心管中加入200微升体积比为水：乙腈＝1：1的混合液，然后把离心管放入超声清洗仪中超声10分钟；
(9)将离心管取出，并在4摄氏度下以14000转/分钟离心15分钟；
(10)将离心后上清液转移至液相小瓶中；
(11)开启液相色谱串联质谱仪。以含有0.1％体积比甲酸的乙腈和0.1％体积比甲酸的超纯水做正离子模式流动相，以含25毫摩尔氨水的乙腈和25毫摩尔体积比氨水的超纯水做负离子模式流动相，开机检测；
(12)将检测到的结果数据导入SIMCA 14.1软件，选择偏最小二乘法分析，并在编辑模板中选择观察模板，将总氮总磷去除率都高于90％且污泥体积指数小于100的活性污泥的数据输入并设为正常组，将带判定数据输入并设置为测试组，点击运行选项得到结果。如果测试组的点在正常组数据的95％置信区间内，则该活性污泥为正常，若测试组的点远离正常组95％置信区间，则该活性污泥判定为异常。
本发明的有益效果
污水处理生物系统的稳定是污染物有效去除，保护水环境基本要求。为了维持污水处理系统的稳定，必须使用一种灵敏准确的监测手段。本发明提供了一种准确性高，操作方便的污水处理厂活性污泥快速检测异常状态的方法，能够从代谢水平上将评价污水处理系统的稳定性，并借概率线性判别分析快速分辨出活性污泥系统是否有异常状态，指导实际污水处理厂的调控运行。
本发明通过液相色谱串联三重四极杆质谱测定污水处理系统中代谢产物的变化，快速灵敏的判定及分辨污水处理异常状态及其原因。相比于其污泥活性和污泥指数的判别方法，本发明可以在早期提前预测异常状态。从而维持污水处理系统平稳运行，并且操作方便，具有较高的推广使用价值。
本发明的创新点
(1)本发明采用改进的适用于污水生物处理系统的代谢组份提取方法。在有污染物质干扰的条件下，从复杂的活性污泥中提取出来微生物代谢物质。不仅减少杂质对仪器的干扰而且增强了代谢物质在质谱中的响应。本发明丰富了活性污泥系统中微生物分子生物学研究的内容，为研究污水处理系统中相关技术提供技术支持。
(2)本发明采优化了相关污水处理系统中代谢产物的质谱测量方法，采用多反应监测测量代谢产物，并且优化了代谢产物在液相色谱中的洗脱程序。大大的增加了关代谢产物的响应，使监测的准确性和灵敏度大大增加。。本发明丰富了活性污泥系统中微生物分子生物学研究的内容，为研究污水处理系统中相关技术提供技术支持。
附图说明
图1代谢产物聚类分析图。
图1是经聚类分析的代谢产物数据，图中圈ABC为3组正常运行样品的95％置信区间，圈D和E异常状态组的数据。。
具体实施方式
1、活性污泥清洗及淬灭
(1)取污水生物处理系统活性污泥10毫升于15毫升离心管中，在5000转/分钟离心3分钟，弃掉上清液，并向离心管中加入15毫升0.2摩尔每升磷酸二氢钾缓冲液淘洗三次，然后弃掉上清液；
(2)向离心管中依次加入1毫升去离子水，2毫升色谱级甲醇，2毫升色谱级乙腈，并混匀；
(3)将混匀后的离心管浸没到液氮中，持续2分钟，之后取出后在室温下解冻；
2、活性污泥超声破裂
(1)将15毫升离心管置于充满冰水的250毫升烧杯中，并且将探针式超声仪的探针浸没到离心管液体中；
(2)超声仪设置为200瓦功率，2秒开/2秒关运行程序，并超声30分钟；
3、代谢产物纯化
(1)将破碎后的混合溶液均匀的转移到2毫升的离心管内；
(2)将离心管储存在-20摄氏度下，储存1小时；
(3)取出离心管，并将其在-20摄氏度下以14000转/分钟下离心15分钟；
(4)将离心后离心管内上清液转移到新的2毫升离心管内；
(5)将转移后的离心管放入真空浓缩仪内，在1500转/分钟和2帕的真空度下持续浓缩5个小时；
(6)向浓缩后的2毫升离心管内加入200微升体积比为1：1的水：乙腈溶液；
(7)将上述离心管混匀并且在超声清洗仪中超声10分钟；
(8)将超声后的离心管在4摄氏度下以14000转/分钟离心15分钟；
(9)将离心后离心管内的上清液转移到液相小瓶中
4、代谢产物上机检测
(1)将液相色谱串联三重四极杆质谱开机；
(2)将沃特世UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)接入色谱仪，并开启色谱仪，直到色谱系统压力在每分钟内变化小于5帕斯卡；
(3)将质谱系统开启，并将离子源参数设置为：以氮气为鞘气的气体温度350摄氏度；以氮气为干燥气的气体温度350摄氏度，鞘气流量，11升每分钟；干燥气流量10升每分钟，正电压为4000伏特，喷嘴电压500伏特；雾化器压力为30帕斯卡。
(4)将5微升样品注射入液相色谱串联三重四极杆质谱，再以含有0.1％体积比纯甲酸的乙腈溶液和0.1％体积比纯甲酸的超纯水溶液做正离子模式流动相，并以正离子模式开启多反应监测；
(5)代测量结束后，保存数据；
(6)将5微升样品注射入液相色谱串联三重四极杆质谱，以含25毫摩尔氨水的乙腈溶液和含25毫摩尔氨水的超纯水溶液做负离子模式流动相，并以负离子模式开启多反应监测；
(7)测量结束后，保存数据；
5、数据处理
(1)将检测出来的数据导入SIMCA 14软件；
(2)采用偏最小二乘法模式分析数据；
(3)在数据中选择将原始数据对数化处理，并且以总和值归一化；
(4)将总氮总磷去除率都高于90％且污泥体积指数小于100的活性污泥的数据输入并设为正常组，将带判定数据输入并设置为测试组；
(5)观察测试组的点是否在正常组阵列中，如果测试组的点在正常组数据的95％置信区间内，则该活性污泥为正常，若测试组的点远离正常组95％置信区间，则该活性污泥判定为异常。

Claims (1)

1.污水处理厂活性污泥异常鉴别方法，其特征在于：
(1)取污水生物处理系统活性污泥10毫升于15毫升离心管中，在5000转/分钟离心3分钟，弃掉上清液，并向离心管中加入15毫升0.2摩尔每升磷酸二氢钾缓冲液淘洗三次，然后弃掉上清液；
(2)向15毫升离心管中加入1毫升去离子水，2毫升甲醇，2毫升乙腈，并混匀；
(3)将离心管混匀并浸没入液氮2分钟；
(4)在室温下将离心管内的提取液解冻；
(5)在冰浴中对离心管中的活性污泥以200瓦功率超声破碎，以2秒开2秒关的程序运行30分钟；
(6)将超声破碎后的混合溶液转移到2毫升小管内，然后将其储存在-20摄氏度1小时。最后在-20摄氏度下以14000转/分钟离心15分钟；
(7)取出上清液转移到新的2毫升离心管中，以1500转/分钟的离心力和2帕的真空下浓缩上清液5个小时；
(8)向浓缩后的2毫升离心管中加入200微升体积比为水：乙腈＝1：1的重构液，并把离心管混匀后放入超声清洗仪中超声10分钟；
(9)将离心管取出，并在4摄氏度下以14000转/分钟离心15分钟；
(10)将离心后上清液转移至液相小瓶中。
(11)开启液相色谱串联质谱仪。并将离子源鞘气温度设置为350摄氏度；干燥气温度350摄氏度，氮气作为鞘气，流量为11升/分钟；氮气作为干燥气，流量为10升/分钟，正电压为4000伏，伏电压为-3500伏，喷嘴电压500伏；雾化器压力为30帕斯卡。并再以含有0.1％体积比纯甲酸的乙腈溶液和0.1％体积比纯甲酸的超纯水溶液按照体积比为1比1混合的溶液做正离子模式流动相，以含25毫摩尔氨水的乙腈溶液和含25毫摩尔氨水的超纯水溶液按体积比1比1混合的溶液做负离子模式流动相的条件下检测液相小瓶中液体；
(12)将液相色谱串联质谱得到的数据导入SIMCA14.1软件，选择偏最小二乘法分析，并在编辑模板中选择观察模板，将总氮总磷去除率都高于90％且污泥体积指数小于100的活性污泥的数据输入并设为正常组，将带判定数据输入并设置为测试组，点击运行选项得到结果。如果测试组的点在正常组数据的95％置信区间内，则该活性污泥为正常，若测试组的点远离正常组95％置信区间，则该活性污泥判定为异常。
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