JP3928492B2 - 混合微生物系の監視方法および管理方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は微生物の遺伝子解析によって得られた情報を統計解析によって処理し、その結果を基に、生物処理プロセスにおける混合微生物系を監視または管理する混合微生物系の監視方法および管理方法に関する。
【０００２】
生物処理プロセスにおける混合微生物系において、混合微生物群集中の特定の微生物だけを検出し、その微生物の存在量などを指標として生物処理系を監視または管理に利用する方法は一般的に行われている。
しかし、混合微生物群集全体の状態の変化を検出し、生物処理の監視または管理に利用する方法はこれまで存在しなかった。このため生物処理にトラブルが生じても、その原因を把握できず、対処もできなかった。
【０００３】
ところで、遺伝子を対象にして混合微生物系を解析する方法は種々の方法が提案されており、例えばＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）法やＴｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（Ｔ−ＲＦＬＰ）法などが知られている。
しかし、このような混合微生物系を解析する方法を、生物処理プロセスにおける混合微生物系全体の監視または管理に利用した例はない。
【０００４】
また、上記ＤＧＧＥ法およびＴ−ＲＦＬＰ法を、混合微生物系全体の監視または管理に利用しようとした場合、次のような問題点がある。
１）ＤＧＧＥ法ではすべての検出ＤＮＡバンドがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
２）ＤＧＧＥ法では得られたＤＮＡの泳動距離は絶対的な値ではなく、１枚毎に泳動距離が異なるため、１枚のゲル上で得られたデータ同士の比較はできるが、他のゲル上で得られたデータとは比較できない。このためＤＧＧＥ法では、得られたデータを統計解析処理しようとする場合、全ての対象サンプルを一枚のゲル上で泳動させなければならない。
３）Ｔ−ＲＦＬＰ法ではすべてのピークがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
【０００５】
このように、これまでは混合微生物系の解析を短時間で簡単に行う方法が存在しなかったため、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行って、混合微生物系を簡単に監視または管理することができる方法の開発が待たれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる生物処理プロセスにおける混合微生物系の監視方法および管理方法を提案することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の混合微生物系の監視方法および管理方法である。
（１） 生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、
この試料の遺伝子をＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、
混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、
混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、
これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測する
混合微生物系の監視方法。
（２） 混合微生物系が用排水の生物処理プロセスである上記（１）記載の混合微生物系の監視方法。
（３） 管理指標が処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子である上記（１）または（２）記載の混合微生物系の監視方法。
（４） コンピュータおよびデータベースを用いる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として出力装置に出力される上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
（５） コンピュータおよびデータベースを用いる上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その結果が出力装置に出力される上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
（６） 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の監視方法を実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
（７） 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の監視方法を実施し、管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れると推測された場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
【０００８】
本発明の方法を適用する対象となる混合微生物系は、生物処理プロセスにおける混合微生物系であり、微生物を含む試料が採取可能であれば限定されない。例えば、用排水の生物処理プロセスなどがあげられる。
【０００９】
本発明では、まず上記のような生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取する。例えば、混合微生物系から液、水、汚泥などを試料として採取すると、通常この試料中には複数種の微生物が存在していると考えられるので、このような試料を混合微生物群集試料として、Ｔ−ＲＦＬＰ法に供するすることができる。
【００１０】
Ｔ−ＲＦＬＰ法それ自体は公知の方法であり、遺伝子の制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）解析の一方法である。本発明では、前記試料の遺伝子を公知のＴ−ＲＦＬＰ法により解析する。例えば、次のような方法で解析することができる。
【００１１】
まず試料からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをテンプレートにし、プライマーを用いてＤＮＡを増幅させる。このＤＮＡとしては１６ＳｒＤＮＡが適しているが、他に５ＳｒＤＮＡ、２３ＳｒＤＮＡ、ｇｙｒＢなど、Ｔ−ＲＦＬＰ法に供することができるものであれば何でもよい。ＤＮＡ増幅の際には、上流側および下流側に２種類のプライマーを使用するが、どちらか一方または両方のプライマーの５’末端または３’末端を蛍光色素などで標識したものを利用する。
【００１２】
増幅されたＰＣＲ産物は、残存プライマーを取り除いた後、適当な制限酵素で切断し、ＤＮＡ塩基配列を決定するプレートまたはキャピラリー電気泳動装置にかけ、標識した蛍光で検出する。この操作によって、５’末端または３’末端のＤＮＡ断片はサイズの小さいものから分離、検出される。
上記制限酵素としては公知のものが使用でき、例えばＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩ、ＲｓａＩ、ＨａｅIII、ＭｓｐＩ、ＣｆｏＩ、ＭｒｎＩ、ＴａｑＩ、Ｓａｎ９６Ｉ、ＦｏｋＩ、ＡｌｎＩ、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏＩなどがあげられる。これらの制限酵素は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００１３】
検出データは通常エレクトロフェログラム（電気泳動パターン）として得られる。このエレクトロフェログラムを、検出ピーク位置すなわちＤＮＡ断片の大きさと、そのピーク面積すなわち存在量で整理して数値化し、解析データ（以下、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データという場合がある）を得る。エレクトロフェログラムは試料中の微生物相（微生物の種類および存在量）を反映した特有のパターンを示す。すなわち、試料中の微生物の種類または存在量が異なる場合、異なったエレクトロフェログラムが得られるので、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データも微生物相が反映された特有のデータとして得られる。Ｔ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができる。なおＴ−ＲＦＬＰ法による解析では微生物の種類、名称などを特定する必要はないので、短時間で解析することができる。
【００１４】
このようなＴ−ＲＦＬＰ解析データを複数の試料について求め、多次元尺度法による多変量解析を行う。例えば、定期的または任意の時点で同じ場所から試料を採取し、これらの試料についてＴ−ＲＦＬＰ解析を行い、これにより得られた複数のＴ−ＲＦＬＰ解析データを基に多次元尺度法による解析（統計処理）を行う。
【００１５】
多次元尺度法それ自体は公知の多変量解析の一手法である。本発明ではＴ−ＲＦＬＰ解析データを公知の多次元尺度法により解析し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データ間の類似度を演算する。類似度は２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として表示する。２次元プロット図の方が誰にでも判別しやすいが、場合によっては３次元以上でもかまわない。
類似度の演算および２次元もしくは３次元プロット図の作成は、市販のコンピュータ用ソフトフェア、例えばＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ社、商標）などを用いてパソコン上で行うのが簡単である。
【００１６】
多次元尺度法では対象間の関係の強弱が空間上の距離として表示される。従って、２次元または３次元空間上にプロットされた複数の類似度間において、空間上での距離が近い点同士は、試料の混合微生物系の状態が類似しており、離れているほど混合微生物系の状態が異なっていると推測することができる。
【００１７】
このような多次元尺度法の演算結果を利用して、今回採取した試料の微生物群集の状態を推測することができる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の微生物群集の状態は、１）プロット間の距離が近い過去の試料の混合微生物系の状態に似ている、２）プロット間の距離が離れている過去の試料の混合微生物系の状態とは異なっている（変化している）、３）プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の混合微生物系の状態とは異なる、などと推測することができる。また２次元プロット図の位置ごとに微生物相を分類し、この位置にプロットされる場合はある特定の状態にあると、位置からの推測も可能である。前記推測される混合微生物系の状態としては、微生物相、微生物の活性または微生物の生育に及ぼす因子などがあげられる。
【００１８】
例えば、好気性生物処理のような生物処理プロセスにおいて生物処理が良好に行われている場合は、混合微生物系の微生物の状態は類似している場合が多い。このため、処理が良好に行われている際に採取された試料に係る類似度のプロット同士は２次元または３次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集まって表示され、グループ化される。一方、生物処理が良好に行われておらず、その原因が類似している場合も、このような試料係る類似度のプロット同士は２次元または３次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集って表示され、グループ化される。処理が不良となる原因が幾つかあり、それに伴って混合微生物系の微生物の状態が異なる場合にも、その状態に応じてプロットがグループ化される。また良好な状態から不良の状態へ移行している段階、または不良の状態から良好な状態へ回復している過程では、移行の程度に応じた位置にプロットされる。またどのグループにも属さないプロットもある。
【００１９】
このように、２次元または３次元プロット図上では幾つかのグループが認められる場合が多く、全てのプロットが全くランダムにプロットされる場合はほとんどない。従って、今回の試料から求められた類似度のプロットがどのグループに属するか、属さないかにより、今回の混合微生物の状態を推測することができる。
例えば、今回の類似度のプロットが、過去において処理が良好に行われていたプロットのグループに属すると認められる場合、処理は良好に行われている状態にあると推測することができる。また今回の類似度のプロットが、良好な状態から不良の状態へ移行している位置にあると認められる場合、何らかの対処を実施することにより、処理の悪化を早期の段階で対処することができる。一般に混合微生物系の状態の変化は、微生物相の変化が先に起こり、その結果遅れて処理状態の変化が生じるので、本発明の方法によれば、処理状態の変化が認められる前に微生物相の変化を検出して、早い警告や対策を打つことができる。プロットがどのグループに属するか、または属さないかという判断は２次元もしくは３次元プロット図を見るだけで行うことができ、専門知識は必要でない。
【００２０】
本発明では混合微生物系の処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを、混合微生物系の管理指標として試料採取時に調査しておくことにより、今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測することもできる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の管理指標の状態は、１）プロット間の距離が近い過去の試料の管理指標の状態に似ている、２）プロット間の距離が離れている過去の試料の管理指標の状態とは異なっている（変化している）、３）プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の管理指標の状態とは異なる、などと推測することができる。なお管理指標は上記のものに限定されず、混合微生物系の微生物の変化と連動して変化する指標であれば制限はない。
【００２１】
このような推測を行うためには、類似度と混合微生物系の管理指標に関するデータとが関連づけられた蓄積データを作成しておき、類似度から管理指標の状態が検索できるようにしておけばよい。このような蓄積データはコンピュータにデータベースとして蓄積しておくのが検索が容易であるので好ましい。管理指標の状態はできるだけ多くの場合について調査しておくのが好ましいが、ある程度データが蓄積されてきた場合は、調査を省略することができる。
【００２２】
上記のような方法によれば、微生物を培養、単離、特定することなしに、混合微生物系の状態または管理指標の状態を推測することができる。
また試料からのＤＮＡの抽出およびＴ−ＲＦＬＰ解析は約１日で完了する。そしてＴ−ＲＦＬＰ解析データをコンピュータに入力するだけで、多次元尺度法による類似度の演算は瞬時に実行される。このため、混合微生物系の状態または管理指標の状態を迅速に推測することができる。
またＴ−ＲＦＬＰ法はＤＧＧＥ法などの他の方法に比べ、得られたデータを数値化して蓄積できるため、そのままコンピュータによる演算に利用できる。したがって、測定と演算に個人差が入り込む部分がなく、微生物知識のない者でも正しく処理することができる。
さらにＴ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができ、このため本発明では混合微生物系の状態および管理指標の状態を的確に推測することができる。
【００２３】
本発明では、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ試料を分割し、複数個の制限酵素で処理し、同様に多次元尺度解析を行うこともできる。こうして得られた並列データを対比するとにより、操作が面倒になるものの、精度が向上するので細かい監視、管理が可能になる。
【００２４】
本発明では前記種々の生物処理プロセスにおける混合微生物系に本発明の方法を適用することにより、多目的な利用が可能である。
本発明の方法を生物処理プロセスに適用する場合、生物処理プロセスではプロセスに障害が起きる前に微生物群集の状態は変化しているので、この状態の変化を検出することにより、微生物群集が悪い状態に移っているか否かを早い時期に判断することができ、これによりプロセスでトラブルが起きる前に対策を講じることが可能となる。具体的には、活性汚泥法では通常汚泥滞留時間が２０日間程度であり、この間隔で微生物群集の状態が徐々に変化するため、例えば２〜７日間隔で本発明を実施することにより、完全に悪くなる前に状態の変化を検出することができ、このため迅速な対処が可能である。
【００２５】
本発明の方法を用排水の生物処理プロセスに適用した場合、処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。例えば、生物処理プロセスが好気的生物処理系の場合、管理指標の具体的なものとしてはＢＯＤ除去率、ＳＶＩ、呼吸速度、ＤＯ濃度、ｐＨ、温度などがあげられる。また生物処理プロセスが浸漬膜生物処理の場合、管理指標の具体的なものとしてはＢＯＤ除去率、ＳＶＩ、呼吸速度、ＤＯ濃度、ｐＨ、温度、粘度、膜の差圧、膜通水量などがあげられる。
【００２６】
また本発明の方法は土壌浄化プロセスに好適に適用することができ、この場合処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。管理指標の具体的なものとしては塩素化エチレン分解率のような特定成分の分解率、有機酸濃度、水素濃度、ＯＲＰなどがあげられる。
【００３１】
本発明の監視方法はパソコンなどのコンピュータおよびデータベースを用いて行うのが好ましい。データベースにはＴ−ＲＦＬＰ解析データを蓄積しておき、コンピュータに新たにＴ−ＲＦＬＰ解析データを入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として出力装置に出力するように構成するのが好ましい。Ｔ−ＲＦＬＰ解析データはキーボードなどの入力装置から入力することができる。出力装置に出力された２次元または３次元プロット図から、前記のように混合微生物系の状態を推測することができる。
【００３２】
またデータベースにはＴ−ＲＦＬＰ解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータを蓄積しておき、新たにＴ−ＲＦＬＰ解析データをコンピュータに入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その推測結果が出力装置に出力されるように構成するのが好ましい。これにより、生物の専門知識を有しない者、生物処理プロセスなどに関する専門知識を有しない者でも、現在の混合微生物系の管理指標の状態を短時間で的確に把握することができる。前記データベースは混合微生物系の管理指標に関するデータが追加、修正できるものが好ましい。
【００３３】
多次元尺度法の演算に利用することができるソフトフェアである前記ＳＰＳＳは、入力されたデータを蓄積する機能および２次元または３次元プロット図の出力機能を備えてるので、ＳＰＳＳを使用することにより解析データの蓄積、類似度の演算および２次元もしくは３次元プロット図の表示を容易に行うことができる。またデータベースを構築するコンピューターソフトウェアとしてMicrosoft社製のMicrosoft ExelやMicrosoft Access（いずれも商標）などの市販のソフトウェアを使用し、これらのソフトフェアと多次元尺度法による類似度を演算するソフトフェアとを組み合わせて使用することもできる。ソフトフェアはこれらに限定されるものではなく、目的にそったものであればどのようなものでも使用することができる。
【００３４】
本発明の管理方法は上記のような本発明の監視方法を定期的または任意の時点で実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、あるいは今回の解析データに係る類似度から推測される管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法である。
【００３５】
本発明の管理方法によれば、混合微生物系の状態または管理指標の状態が悪化する前にその兆候を検出することができるので、早い段階での警告や対策を打つことができ、生物処理プロセスなどを安定して管理することが可能となる。
また２次元または３次元プロット図上で処理が悪化するグループに属していると判断される場合でも、過去の経験からグループ毎にその対処法が知られている場合は適切な処理を行うことができ、的確かつ効果的に生物処理プロセスを管理することができる。
【００３６】
本発明の混合微生物系の監視方法または管理方法で得られる効果をまとめると次のような効果があげれる。
１）基本的に微生物の特定は不必要であり、微生物の種類を特定することなしに、混合微生物の監視または管理を行うことができる。
２）混合微生物系の解析と統計解析を組み合わせることによって、従来は管理不可能であった混合微生物系を容易に監視または管理できる。
３）混合微生物系の微生物相変化を短時間で容易に検出して、系の状態を監視、管理できる。このため、混合微生物系の状態が悪化してしまう前に状態変化を検出することができ、これによりトラブルなどを事前に予測して、迅速に対策を講じることができる。
４）経験的に行われていた微生物群集の管理を、統計的手法によって確実にできる。
５）Ｔ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な菌種も検出できるので、確実性が高い。したがって、これを用いた監視、管理には確実性がある。
６）混合微生物系の状態を類似度という１個の単純な指標で把握できるため、微生物の専門的知識を持たない者にも利用し易く、熟練を要しない。
７）Ｔ−ＲＦＬＰ法では解析データをコンピューターに保存でき、いつでも過去のデータと比較できる。またＴ−ＲＦＬＰと多次元尺度法の組み合わせでは、データをいつでも加えたり削除したりできる（ＤＧＧＥと多次元尺度法では新しいデータを加える場合、もう一度実験データを取り直す必要がある。）。このように結果をコンピューター上に蓄積し、演算することができるので、いつでも過去のデータと比較するのが容易である。
８）従来の菌種同定法は培養、単離、専門的同定手段の利用によるので手間と時間がかかり非実用的であったが、本発明の方法は１日程度の期間で迅速に測定が完了し、多次元尺度法の演算もコンピューターにより演算することができるので、迅速に管理にまで利用することができる。このため、測定に時間がかかると系の状態がさらに変化することが多いが、そうした問題が発生しない。
９）管理指標を変えることにより多目的な利用が可能である。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の混合微生物系の監視方法は、生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、この試料の遺伝子をＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測するようにしているので、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
本発明の混合微生物系の管理方法は、上記監視方法を定期的または任意の時点で実施し、混合微生物系の状態を監視しているので、混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面により説明する。
図１は浸漬膜を利用した活性汚泥処理装置の系統図であり、この装置により排水を好気性生物処理している生物処理プロセスに本発明の方法を適用した場合の例である。
【００３９】
図１において、１は曝気槽、２、５は散気装置、３は膜浸漬槽、４は浸漬型膜分離装置である。膜浸漬槽３には分離膜６を有する浸漬型膜分離装置４が槽内液に浸漬された状態で設けられ、分離膜６を透過させて槽内液を濃縮するように構成されている。
【００４０】
図１の装置では次のようにして排水が好気性処理される。すなわち、原水路１１から曝気槽１に排水を導入するとともに、散気装置２から空気を散気し、槽内の活性汚泥と混合して好気的に生物処理する。槽内液は系路１２から膜浸漬槽３に送り、膜分離する。
膜浸漬槽３ではポンプＰを駆動し、槽内液を浸漬型膜分離装置４の分離膜６を透過させ、処理水として排出する。膜浸漬槽３では槽内を好気的に維持するとともに分離膜６表面への微生物付着防止のために散気装置５から空気を散気する。透過液は処理水として処理水路１３から排出し、濃縮液は返送汚泥路１４から返送汚泥として曝気槽１に返送する。
【００４１】
このようにして好気性生物処理している好気性処理系に本発明を適用して好気性処理系の混合微生物系を管理するには、膜分離槽３から定期的または任意の時点で槽内液を採取する。この試料中には複数の微生物が存在している。このような試料からＤＮＡを抽出した後、５’末端を標識したプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＤＮＡを増幅する。
【００４２】
次にＰＣＲ増幅産物を電気泳動にかけ１６ＳｒＤＮＡを得た後、このＤＮＡを制限酵素により切断する。切断したＤＮＡ断片をＴ−ＲＦＬＰ法により解析してエレクトロフェログラムを得、次にＤＮＡ断片の大きさと、存在量で整理し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データを得る。このような処理を定期的または任意の時点で繰り返して行い、データベースにＴ−ＲＦＬＰ解析データを蓄積する。
【００４３】
一方、上記のような解析を行う際、試料を採取したとき、膜浸漬槽の管理指標に関するデータも併せて採取し、前記データベースまたは他のデータベースに蓄積する。例えば、膜浸漬槽のｐＨ、温度、水温、膜の差圧、目視による汚泥の性状、顕微鏡による汚泥観察結果、ＢＯＤおよびＣＯＤ負荷量、ＢＯＤおよびＣＯＤ槽負荷量、溶存酸素濃度、粘度、溶解性ＣＯＤ濃度、曝気量などのデータを採取して蓄積する。管理指標に関するデータの採取は常に行う必要はなく、ある程度データが蓄積された場合には省略することもできるし、時々採取することもできる。
【００４４】
今回解析したＴ−ＲＦＬＰ解析データおよびデータベースに蓄積されている過去の解析データを前記ＳＰＳＳなどの多次元尺度法の演算プログラムにより類似度を演算させ、結果を２次元または３次元プロット図としてディスプレイに表示させるか、紙に印刷する。
【００４５】
そして、今回の類似度のプロットが２次元または３次元プロット図のどのグループに属するかまたは属さないかを判定する。今回の類似度のプロットが、処理が良好に行われるグループに属する場合、今回の状態も良好であると判断することができる。一方、処理が良好に行われていなかったグループに属した場合は、今回の状態は悪いか、今後悪くなると判断し、対策を講じる。例えば、ｐＨを調整したり、曝気量を調節したりする。このようにして混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【００４６】
【実施例】
実施例１：浸漬膜を利用した活性汚泥装置の管理
図１の膜浸漬槽から活性汚泥サンプルを定期的に採取し、本発明の方法の適用を行った。
【００４７】
１）ＤＮＡ抽出
活性汚泥を２ｍＬ容のチューブに入れ、８０００ ｘ ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。さらにそのチュープにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１［ｐＨ８．０］、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ｐＨ８．０］、１．５Ｍ ＮａＣｌ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温、再び上記のＢｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００ ｘ ｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルムで夾雑タンパク質を除去した後、上部の水相を分離し、これに等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００ ｘ ｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、１００μＬの滅菌蒸留水に溶解した。
【００４８】
２）Ｔ−ＲＦＬＰ法および多次元尺度法による解析
上記で抽出したＤＮＡをテンプレートに、ＰＣＲ反応条件によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃、２分に続き、第１段階；９４℃、２０秒、第２段階；５５℃、３０秒、第３段階；７２℃、２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃、７分を行った。この際、プライマーはＢａｃｔ０００９（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ Ｃ／ＡＴＧＧＴＣＡＧ−３’）の５’末端を４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）で標識したもの、およびＢａｃｔ１４９２（５’−ＡＣＧＧ Ｃ／Ｔ ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴ−３’）の５’末端を６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）で標識したものを使用した。ＰＣＲ増幅産物はアガロース電気泳動にかけ、目的である１６ＳｒＤＮＡ（約１．５ｋｂ）断片を含む部分を切り出し精製した。
【００４９】
その後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、少量の滅菌蒸留水に溶解させ、適量を制限酵素（ＢｓｔＵＩ）で切断した。切断した１６ＳｒＤＮＡはＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）によりＧｅｎｅ Ｓｃａｎモードで解析し、Ｔ−ＲＦＬＰ（０〜５５０ｂａｓｅｓの範囲）のエレクトロフェログラムを得た。図２に、２０日毎のＴ−ＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムを示す。Ｔ−ＲＦＬＰのエレクトロフェログラムは１６ＳｒＤＮＡの５’末端および３’末端に関して得られたが、ここでは５’末端のＨＥＸによる解析結果のみを利用した。また、内部標準にはＧｅｎｅＳｃａｎ５００ ＲＯＸ（ＲＯＸ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｏｄａｍｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を利用した。
【００５０】
次に、ＳＰＳＳ１０．０Ｊ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＳＰＳＳ Ｊａｐａｎ社製、商標）を利用して、多次元尺度法による類似度解析を、Ｔ−ＲＦＬＰ解析のエレクトロフェログラムを基に行った。１７ｂａｓｅｓのＢａｃｔ００１１より大きい１８〜５１７ｂａｓｅｓの範囲で、エレクトロフェログラムのピークデータは１ｂａｓｅ刻み（四捨五入）でピーク面積により整理した。各々のピーク面積は合計値（全体で１００％に調整）に対する割合（％）とした。この際、ピーク面積が１％以下のものに関しては解析対象外とした。比較するデータ内においてピークが全く観察されなかったサイズのカラムは削除した後、そのデータをＳＰＳＳ１０．０Ｊのデータシートにコピーし、多次元尺度法による解析を行った。これにより類似度の２次元プロットを作成した。結果を図３に示す。
【００５１】
３）Ｔ−ＲＦＬＰ解析結果
図１による活性汚泥処理において、４０日目頃に膜の差圧の上昇（２５ｋｐａ：キロパスカル）が見られた（ここでの曝気量を３００Ｌ／ｍｉｎとする）。そこで、膜浸漬槽内の曝気量を４５０Ｌ／ｍｉｎに増加させたところ６０日目では差圧は正常な値１４ｋｐａに戻った。そこで、再び空気供給量を３００Ｌ／ｍｉｎに絞ったところ、８０日目には差圧が２０ｋｐａに上昇して、その後また酸素供給量を４５０Ｌ／ｍｉｎに増加させた。酸素量を増加させた後、１００日目では差圧は１５ｋｐａに低下した。
【００５２】
図３からわかるように、活性汚泥処理において差圧が低く抑えられたときは、円の範囲に納まることが示されている。
その後は、１週間おきにＴ−ＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムを求め、図３にプロットを追加した。得られたプロットが円周の外側になった場合は酸素の供給量（約５０％）を増やし、円周の内側に入った場合は、通常の酸素量に戻した。常に酸素量を増やすとランニングコストが大きくなるため、このような操作で、必要な場合のみ酸素量を増やすことが可能となり、ランニングコストを最小限に抑えて、安定した処理性能（差圧の正常化も含め）を得ることが可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を適用した浸漬膜を利用した活性汚泥装置の系統図である。
【図２】実施例１で得られたＴＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムである。全てのグラフにおいて、縦軸は蛍光強度、横軸はＴＲＦ（Terminal Restriction Fragment）の長さ（bases）である。
【図３】図２のエレクトロフェログラムから得られたＴＲＦＬＰ解析データを基に多次元尺度法により類似度を演算した結果をプロットした２次元プロット図である。
【符号の説明】
１ 曝気槽
２、５ 散気装置
３ 膜浸漬槽
４ 浸漬型膜分離装置
６ 分離膜
１１ 原水路
１２ 系路
１３ 処理水路
１４ 返送汚泥路
本発明は微生物の遺伝子解析によって得られた情報を統計解析によって処理し、その結果を基に、生物処理プロセスにおける混合微生物系を監視または管理する混合微生物系の監視方法および管理方法に関する。
【０００２】
生物処理プロセスにおける混合微生物系において、混合微生物群集中の特定の微生物だけを検出し、その微生物の存在量などを指標として生物処理系を監視または管理に利用する方法は一般的に行われている。
しかし、混合微生物群集全体の状態の変化を検出し、生物処理の監視または管理に利用する方法はこれまで存在しなかった。このため生物処理にトラブルが生じても、その原因を把握できず、対処もできなかった。
【０００３】
ところで、遺伝子を対象にして混合微生物系を解析する方法は種々の方法が提案されており、例えばＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）法やＴｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（Ｔ−ＲＦＬＰ）法などが知られている。
しかし、このような混合微生物系を解析する方法を、生物処理プロセスにおける混合微生物系全体の監視または管理に利用した例はない。
【０００４】
また、上記ＤＧＧＥ法およびＴ−ＲＦＬＰ法を、混合微生物系全体の監視または管理に利用しようとした場合、次のような問題点がある。
１）ＤＧＧＥ法ではすべての検出ＤＮＡバンドがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
２）ＤＧＧＥ法では得られたＤＮＡの泳動距離は絶対的な値ではなく、１枚毎に泳動距離が異なるため、１枚のゲル上で得られたデータ同士の比較はできるが、他のゲル上で得られたデータとは比較できない。このためＤＧＧＥ法では、得られたデータを統計解析処理しようとする場合、全ての対象サンプルを一枚のゲル上で泳動させなければならない。
３）Ｔ−ＲＦＬＰ法ではすべてのピークがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
【０００５】
このように、これまでは混合微生物系の解析を短時間で簡単に行う方法が存在しなかったため、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行って、混合微生物系を簡単に監視または管理することができる方法の開発が待たれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる生物処理プロセスにおける混合微生物系の監視方法および管理方法を提案することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の混合微生物系の監視方法および管理方法である。
（１） 生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、
この試料の遺伝子をＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、
混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、
混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、
これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測する
混合微生物系の監視方法。
（２） 混合微生物系が用排水の生物処理プロセスである上記（１）記載の混合微生物系の監視方法。
（３） 管理指標が処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子である上記（１）または（２）記載の混合微生物系の監視方法。
（４） コンピュータおよびデータベースを用いる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として出力装置に出力される上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
（５） コンピュータおよびデータベースを用いる上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その結果が出力装置に出力される上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
（６） 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の監視方法を実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
（７） 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の監視方法を実施し、管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れると推測された場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
【０００８】
本発明の方法を適用する対象となる混合微生物系は、生物処理プロセスにおける混合微生物系であり、微生物を含む試料が採取可能であれば限定されない。例えば、用排水の生物処理プロセスなどがあげられる。
【０００９】
本発明では、まず上記のような生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取する。例えば、混合微生物系から液、水、汚泥などを試料として採取すると、通常この試料中には複数種の微生物が存在していると考えられるので、このような試料を混合微生物群集試料として、Ｔ−ＲＦＬＰ法に供するすることができる。
【００１０】
Ｔ−ＲＦＬＰ法それ自体は公知の方法であり、遺伝子の制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）解析の一方法である。本発明では、前記試料の遺伝子を公知のＴ−ＲＦＬＰ法により解析する。例えば、次のような方法で解析することができる。
【００１１】
まず試料からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをテンプレートにし、プライマーを用いてＤＮＡを増幅させる。このＤＮＡとしては１６ＳｒＤＮＡが適しているが、他に５ＳｒＤＮＡ、２３ＳｒＤＮＡ、ｇｙｒＢなど、Ｔ−ＲＦＬＰ法に供することができるものであれば何でもよい。ＤＮＡ増幅の際には、上流側および下流側に２種類のプライマーを使用するが、どちらか一方または両方のプライマーの５’末端または３’末端を蛍光色素などで標識したものを利用する。
【００１２】
増幅されたＰＣＲ産物は、残存プライマーを取り除いた後、適当な制限酵素で切断し、ＤＮＡ塩基配列を決定するプレートまたはキャピラリー電気泳動装置にかけ、標識した蛍光で検出する。この操作によって、５’末端または３’末端のＤＮＡ断片はサイズの小さいものから分離、検出される。
上記制限酵素としては公知のものが使用でき、例えばＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩ、ＲｓａＩ、ＨａｅIII、ＭｓｐＩ、ＣｆｏＩ、ＭｒｎＩ、ＴａｑＩ、Ｓａｎ９６Ｉ、ＦｏｋＩ、ＡｌｎＩ、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏＩなどがあげられる。これらの制限酵素は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００１３】
検出データは通常エレクトロフェログラム（電気泳動パターン）として得られる。このエレクトロフェログラムを、検出ピーク位置すなわちＤＮＡ断片の大きさと、そのピーク面積すなわち存在量で整理して数値化し、解析データ（以下、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データという場合がある）を得る。エレクトロフェログラムは試料中の微生物相（微生物の種類および存在量）を反映した特有のパターンを示す。すなわち、試料中の微生物の種類または存在量が異なる場合、異なったエレクトロフェログラムが得られるので、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データも微生物相が反映された特有のデータとして得られる。Ｔ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができる。なおＴ−ＲＦＬＰ法による解析では微生物の種類、名称などを特定する必要はないので、短時間で解析することができる。
【００１４】
このようなＴ−ＲＦＬＰ解析データを複数の試料について求め、多次元尺度法による多変量解析を行う。例えば、定期的または任意の時点で同じ場所から試料を採取し、これらの試料についてＴ−ＲＦＬＰ解析を行い、これにより得られた複数のＴ−ＲＦＬＰ解析データを基に多次元尺度法による解析（統計処理）を行う。
【００１５】
多次元尺度法それ自体は公知の多変量解析の一手法である。本発明ではＴ−ＲＦＬＰ解析データを公知の多次元尺度法により解析し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データ間の類似度を演算する。類似度は２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として表示する。２次元プロット図の方が誰にでも判別しやすいが、場合によっては３次元以上でもかまわない。
類似度の演算および２次元もしくは３次元プロット図の作成は、市販のコンピュータ用ソフトフェア、例えばＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ社、商標）などを用いてパソコン上で行うのが簡単である。
【００１６】
多次元尺度法では対象間の関係の強弱が空間上の距離として表示される。従って、２次元または３次元空間上にプロットされた複数の類似度間において、空間上での距離が近い点同士は、試料の混合微生物系の状態が類似しており、離れているほど混合微生物系の状態が異なっていると推測することができる。
【００１７】
このような多次元尺度法の演算結果を利用して、今回採取した試料の微生物群集の状態を推測することができる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の微生物群集の状態は、１）プロット間の距離が近い過去の試料の混合微生物系の状態に似ている、２）プロット間の距離が離れている過去の試料の混合微生物系の状態とは異なっている（変化している）、３）プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の混合微生物系の状態とは異なる、などと推測することができる。また２次元プロット図の位置ごとに微生物相を分類し、この位置にプロットされる場合はある特定の状態にあると、位置からの推測も可能である。前記推測される混合微生物系の状態としては、微生物相、微生物の活性または微生物の生育に及ぼす因子などがあげられる。
【００１８】
例えば、好気性生物処理のような生物処理プロセスにおいて生物処理が良好に行われている場合は、混合微生物系の微生物の状態は類似している場合が多い。このため、処理が良好に行われている際に採取された試料に係る類似度のプロット同士は２次元または３次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集まって表示され、グループ化される。一方、生物処理が良好に行われておらず、その原因が類似している場合も、このような試料係る類似度のプロット同士は２次元または３次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集って表示され、グループ化される。処理が不良となる原因が幾つかあり、それに伴って混合微生物系の微生物の状態が異なる場合にも、その状態に応じてプロットがグループ化される。また良好な状態から不良の状態へ移行している段階、または不良の状態から良好な状態へ回復している過程では、移行の程度に応じた位置にプロットされる。またどのグループにも属さないプロットもある。
【００１９】
このように、２次元または３次元プロット図上では幾つかのグループが認められる場合が多く、全てのプロットが全くランダムにプロットされる場合はほとんどない。従って、今回の試料から求められた類似度のプロットがどのグループに属するか、属さないかにより、今回の混合微生物の状態を推測することができる。
例えば、今回の類似度のプロットが、過去において処理が良好に行われていたプロットのグループに属すると認められる場合、処理は良好に行われている状態にあると推測することができる。また今回の類似度のプロットが、良好な状態から不良の状態へ移行している位置にあると認められる場合、何らかの対処を実施することにより、処理の悪化を早期の段階で対処することができる。一般に混合微生物系の状態の変化は、微生物相の変化が先に起こり、その結果遅れて処理状態の変化が生じるので、本発明の方法によれば、処理状態の変化が認められる前に微生物相の変化を検出して、早い警告や対策を打つことができる。プロットがどのグループに属するか、または属さないかという判断は２次元もしくは３次元プロット図を見るだけで行うことができ、専門知識は必要でない。
【００２０】
本発明では混合微生物系の処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを、混合微生物系の管理指標として試料採取時に調査しておくことにより、今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測することもできる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の管理指標の状態は、１）プロット間の距離が近い過去の試料の管理指標の状態に似ている、２）プロット間の距離が離れている過去の試料の管理指標の状態とは異なっている（変化している）、３）プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の管理指標の状態とは異なる、などと推測することができる。なお管理指標は上記のものに限定されず、混合微生物系の微生物の変化と連動して変化する指標であれば制限はない。
【００２１】
このような推測を行うためには、類似度と混合微生物系の管理指標に関するデータとが関連づけられた蓄積データを作成しておき、類似度から管理指標の状態が検索できるようにしておけばよい。このような蓄積データはコンピュータにデータベースとして蓄積しておくのが検索が容易であるので好ましい。管理指標の状態はできるだけ多くの場合について調査しておくのが好ましいが、ある程度データが蓄積されてきた場合は、調査を省略することができる。
【００２２】
上記のような方法によれば、微生物を培養、単離、特定することなしに、混合微生物系の状態または管理指標の状態を推測することができる。
また試料からのＤＮＡの抽出およびＴ−ＲＦＬＰ解析は約１日で完了する。そしてＴ−ＲＦＬＰ解析データをコンピュータに入力するだけで、多次元尺度法による類似度の演算は瞬時に実行される。このため、混合微生物系の状態または管理指標の状態を迅速に推測することができる。
またＴ−ＲＦＬＰ法はＤＧＧＥ法などの他の方法に比べ、得られたデータを数値化して蓄積できるため、そのままコンピュータによる演算に利用できる。したがって、測定と演算に個人差が入り込む部分がなく、微生物知識のない者でも正しく処理することができる。
さらにＴ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができ、このため本発明では混合微生物系の状態および管理指標の状態を的確に推測することができる。
【００２３】
本発明では、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ試料を分割し、複数個の制限酵素で処理し、同様に多次元尺度解析を行うこともできる。こうして得られた並列データを対比するとにより、操作が面倒になるものの、精度が向上するので細かい監視、管理が可能になる。
【００２４】
本発明では前記種々の生物処理プロセスにおける混合微生物系に本発明の方法を適用することにより、多目的な利用が可能である。
本発明の方法を生物処理プロセスに適用する場合、生物処理プロセスではプロセスに障害が起きる前に微生物群集の状態は変化しているので、この状態の変化を検出することにより、微生物群集が悪い状態に移っているか否かを早い時期に判断することができ、これによりプロセスでトラブルが起きる前に対策を講じることが可能となる。具体的には、活性汚泥法では通常汚泥滞留時間が２０日間程度であり、この間隔で微生物群集の状態が徐々に変化するため、例えば２〜７日間隔で本発明を実施することにより、完全に悪くなる前に状態の変化を検出することができ、このため迅速な対処が可能である。
【００２５】
本発明の方法を用排水の生物処理プロセスに適用した場合、処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。例えば、生物処理プロセスが好気的生物処理系の場合、管理指標の具体的なものとしてはＢＯＤ除去率、ＳＶＩ、呼吸速度、ＤＯ濃度、ｐＨ、温度などがあげられる。また生物処理プロセスが浸漬膜生物処理の場合、管理指標の具体的なものとしてはＢＯＤ除去率、ＳＶＩ、呼吸速度、ＤＯ濃度、ｐＨ、温度、粘度、膜の差圧、膜通水量などがあげられる。
【００２６】
また本発明の方法は土壌浄化プロセスに好適に適用することができ、この場合処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。管理指標の具体的なものとしては塩素化エチレン分解率のような特定成分の分解率、有機酸濃度、水素濃度、ＯＲＰなどがあげられる。
【００３１】
本発明の監視方法はパソコンなどのコンピュータおよびデータベースを用いて行うのが好ましい。データベースにはＴ−ＲＦＬＰ解析データを蓄積しておき、コンピュータに新たにＴ−ＲＦＬＰ解析データを入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として出力装置に出力するように構成するのが好ましい。Ｔ−ＲＦＬＰ解析データはキーボードなどの入力装置から入力することができる。出力装置に出力された２次元または３次元プロット図から、前記のように混合微生物系の状態を推測することができる。
【００３２】
またデータベースにはＴ−ＲＦＬＰ解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータを蓄積しておき、新たにＴ−ＲＦＬＰ解析データをコンピュータに入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その推測結果が出力装置に出力されるように構成するのが好ましい。これにより、生物の専門知識を有しない者、生物処理プロセスなどに関する専門知識を有しない者でも、現在の混合微生物系の管理指標の状態を短時間で的確に把握することができる。前記データベースは混合微生物系の管理指標に関するデータが追加、修正できるものが好ましい。
【００３３】
多次元尺度法の演算に利用することができるソフトフェアである前記ＳＰＳＳは、入力されたデータを蓄積する機能および２次元または３次元プロット図の出力機能を備えてるので、ＳＰＳＳを使用することにより解析データの蓄積、類似度の演算および２次元もしくは３次元プロット図の表示を容易に行うことができる。またデータベースを構築するコンピューターソフトウェアとしてMicrosoft社製のMicrosoft ExelやMicrosoft Access（いずれも商標）などの市販のソフトウェアを使用し、これらのソフトフェアと多次元尺度法による類似度を演算するソフトフェアとを組み合わせて使用することもできる。ソフトフェアはこれらに限定されるものではなく、目的にそったものであればどのようなものでも使用することができる。
【００３４】
本発明の管理方法は上記のような本発明の監視方法を定期的または任意の時点で実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、あるいは今回の解析データに係る類似度から推測される管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法である。
【００３５】
本発明の管理方法によれば、混合微生物系の状態または管理指標の状態が悪化する前にその兆候を検出することができるので、早い段階での警告や対策を打つことができ、生物処理プロセスなどを安定して管理することが可能となる。
また２次元または３次元プロット図上で処理が悪化するグループに属していると判断される場合でも、過去の経験からグループ毎にその対処法が知られている場合は適切な処理を行うことができ、的確かつ効果的に生物処理プロセスを管理することができる。
【００３６】
本発明の混合微生物系の監視方法または管理方法で得られる効果をまとめると次のような効果があげれる。
１）基本的に微生物の特定は不必要であり、微生物の種類を特定することなしに、混合微生物の監視または管理を行うことができる。
２）混合微生物系の解析と統計解析を組み合わせることによって、従来は管理不可能であった混合微生物系を容易に監視または管理できる。
３）混合微生物系の微生物相変化を短時間で容易に検出して、系の状態を監視、管理できる。このため、混合微生物系の状態が悪化してしまう前に状態変化を検出することができ、これによりトラブルなどを事前に予測して、迅速に対策を講じることができる。
４）経験的に行われていた微生物群集の管理を、統計的手法によって確実にできる。
５）Ｔ−ＲＦＬＰ法では培養不可能な菌種も検出できるので、確実性が高い。したがって、これを用いた監視、管理には確実性がある。
６）混合微生物系の状態を類似度という１個の単純な指標で把握できるため、微生物の専門的知識を持たない者にも利用し易く、熟練を要しない。
７）Ｔ−ＲＦＬＰ法では解析データをコンピューターに保存でき、いつでも過去のデータと比較できる。またＴ−ＲＦＬＰと多次元尺度法の組み合わせでは、データをいつでも加えたり削除したりできる（ＤＧＧＥと多次元尺度法では新しいデータを加える場合、もう一度実験データを取り直す必要がある。）。このように結果をコンピューター上に蓄積し、演算することができるので、いつでも過去のデータと比較するのが容易である。
８）従来の菌種同定法は培養、単離、専門的同定手段の利用によるので手間と時間がかかり非実用的であったが、本発明の方法は１日程度の期間で迅速に測定が完了し、多次元尺度法の演算もコンピューターにより演算することができるので、迅速に管理にまで利用することができる。このため、測定に時間がかかると系の状態がさらに変化することが多いが、そうした問題が発生しない。
９）管理指標を変えることにより多目的な利用が可能である。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の混合微生物系の監視方法は、生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、この試料の遺伝子をＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測するようにしているので、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
本発明の混合微生物系の管理方法は、上記監視方法を定期的または任意の時点で実施し、混合微生物系の状態を監視しているので、混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面により説明する。
図１は浸漬膜を利用した活性汚泥処理装置の系統図であり、この装置により排水を好気性生物処理している生物処理プロセスに本発明の方法を適用した場合の例である。
【００３９】
図１において、１は曝気槽、２、５は散気装置、３は膜浸漬槽、４は浸漬型膜分離装置である。膜浸漬槽３には分離膜６を有する浸漬型膜分離装置４が槽内液に浸漬された状態で設けられ、分離膜６を透過させて槽内液を濃縮するように構成されている。
【００４０】
図１の装置では次のようにして排水が好気性処理される。すなわち、原水路１１から曝気槽１に排水を導入するとともに、散気装置２から空気を散気し、槽内の活性汚泥と混合して好気的に生物処理する。槽内液は系路１２から膜浸漬槽３に送り、膜分離する。
膜浸漬槽３ではポンプＰを駆動し、槽内液を浸漬型膜分離装置４の分離膜６を透過させ、処理水として排出する。膜浸漬槽３では槽内を好気的に維持するとともに分離膜６表面への微生物付着防止のために散気装置５から空気を散気する。透過液は処理水として処理水路１３から排出し、濃縮液は返送汚泥路１４から返送汚泥として曝気槽１に返送する。
【００４１】
このようにして好気性生物処理している好気性処理系に本発明を適用して好気性処理系の混合微生物系を管理するには、膜分離槽３から定期的または任意の時点で槽内液を採取する。この試料中には複数の微生物が存在している。このような試料からＤＮＡを抽出した後、５’末端を標識したプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＤＮＡを増幅する。
【００４２】
次にＰＣＲ増幅産物を電気泳動にかけ１６ＳｒＤＮＡを得た後、このＤＮＡを制限酵素により切断する。切断したＤＮＡ断片をＴ−ＲＦＬＰ法により解析してエレクトロフェログラムを得、次にＤＮＡ断片の大きさと、存在量で整理し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析データを得る。このような処理を定期的または任意の時点で繰り返して行い、データベースにＴ−ＲＦＬＰ解析データを蓄積する。
【００４３】
一方、上記のような解析を行う際、試料を採取したとき、膜浸漬槽の管理指標に関するデータも併せて採取し、前記データベースまたは他のデータベースに蓄積する。例えば、膜浸漬槽のｐＨ、温度、水温、膜の差圧、目視による汚泥の性状、顕微鏡による汚泥観察結果、ＢＯＤおよびＣＯＤ負荷量、ＢＯＤおよびＣＯＤ槽負荷量、溶存酸素濃度、粘度、溶解性ＣＯＤ濃度、曝気量などのデータを採取して蓄積する。管理指標に関するデータの採取は常に行う必要はなく、ある程度データが蓄積された場合には省略することもできるし、時々採取することもできる。
【００４４】
今回解析したＴ−ＲＦＬＰ解析データおよびデータベースに蓄積されている過去の解析データを前記ＳＰＳＳなどの多次元尺度法の演算プログラムにより類似度を演算させ、結果を２次元または３次元プロット図としてディスプレイに表示させるか、紙に印刷する。
【００４５】
そして、今回の類似度のプロットが２次元または３次元プロット図のどのグループに属するかまたは属さないかを判定する。今回の類似度のプロットが、処理が良好に行われるグループに属する場合、今回の状態も良好であると判断することができる。一方、処理が良好に行われていなかったグループに属した場合は、今回の状態は悪いか、今後悪くなると判断し、対策を講じる。例えば、ｐＨを調整したり、曝気量を調節したりする。このようにして混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【００４６】
【実施例】
実施例１：浸漬膜を利用した活性汚泥装置の管理
図１の膜浸漬槽から活性汚泥サンプルを定期的に採取し、本発明の方法の適用を行った。
【００４７】
１）ＤＮＡ抽出
活性汚泥を２ｍＬ容のチューブに入れ、８０００ ｘ ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。さらにそのチュープにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１［ｐＨ８．０］、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ｐＨ８．０］、１．５Ｍ ＮａＣｌ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温、再び上記のＢｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００ ｘ ｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルムで夾雑タンパク質を除去した後、上部の水相を分離し、これに等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００ ｘ ｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、１００μＬの滅菌蒸留水に溶解した。
【００４８】
２）Ｔ−ＲＦＬＰ法および多次元尺度法による解析
上記で抽出したＤＮＡをテンプレートに、ＰＣＲ反応条件によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃、２分に続き、第１段階；９４℃、２０秒、第２段階；５５℃、３０秒、第３段階；７２℃、２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃、７分を行った。この際、プライマーはＢａｃｔ０００９（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ Ｃ／ＡＴＧＧＴＣＡＧ−３’）の５’末端を４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）で標識したもの、およびＢａｃｔ１４９２（５’−ＡＣＧＧ Ｃ／Ｔ ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴ−３’）の５’末端を６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）で標識したものを使用した。ＰＣＲ増幅産物はアガロース電気泳動にかけ、目的である１６ＳｒＤＮＡ（約１．５ｋｂ）断片を含む部分を切り出し精製した。
【００４９】
その後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、少量の滅菌蒸留水に溶解させ、適量を制限酵素（ＢｓｔＵＩ）で切断した。切断した１６ＳｒＤＮＡはＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）によりＧｅｎｅ Ｓｃａｎモードで解析し、Ｔ−ＲＦＬＰ（０〜５５０ｂａｓｅｓの範囲）のエレクトロフェログラムを得た。図２に、２０日毎のＴ−ＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムを示す。Ｔ−ＲＦＬＰのエレクトロフェログラムは１６ＳｒＤＮＡの５’末端および３’末端に関して得られたが、ここでは５’末端のＨＥＸによる解析結果のみを利用した。また、内部標準にはＧｅｎｅＳｃａｎ５００ ＲＯＸ（ＲＯＸ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｏｄａｍｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を利用した。
【００５０】
次に、ＳＰＳＳ１０．０Ｊ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＳＰＳＳ Ｊａｐａｎ社製、商標）を利用して、多次元尺度法による類似度解析を、Ｔ−ＲＦＬＰ解析のエレクトロフェログラムを基に行った。１７ｂａｓｅｓのＢａｃｔ００１１より大きい１８〜５１７ｂａｓｅｓの範囲で、エレクトロフェログラムのピークデータは１ｂａｓｅ刻み（四捨五入）でピーク面積により整理した。各々のピーク面積は合計値（全体で１００％に調整）に対する割合（％）とした。この際、ピーク面積が１％以下のものに関しては解析対象外とした。比較するデータ内においてピークが全く観察されなかったサイズのカラムは削除した後、そのデータをＳＰＳＳ１０．０Ｊのデータシートにコピーし、多次元尺度法による解析を行った。これにより類似度の２次元プロットを作成した。結果を図３に示す。
【００５１】
３）Ｔ−ＲＦＬＰ解析結果
図１による活性汚泥処理において、４０日目頃に膜の差圧の上昇（２５ｋｐａ：キロパスカル）が見られた（ここでの曝気量を３００Ｌ／ｍｉｎとする）。そこで、膜浸漬槽内の曝気量を４５０Ｌ／ｍｉｎに増加させたところ６０日目では差圧は正常な値１４ｋｐａに戻った。そこで、再び空気供給量を３００Ｌ／ｍｉｎに絞ったところ、８０日目には差圧が２０ｋｐａに上昇して、その後また酸素供給量を４５０Ｌ／ｍｉｎに増加させた。酸素量を増加させた後、１００日目では差圧は１５ｋｐａに低下した。
【００５２】
図３からわかるように、活性汚泥処理において差圧が低く抑えられたときは、円の範囲に納まることが示されている。
その後は、１週間おきにＴ−ＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムを求め、図３にプロットを追加した。得られたプロットが円周の外側になった場合は酸素の供給量（約５０％）を増やし、円周の内側に入った場合は、通常の酸素量に戻した。常に酸素量を増やすとランニングコストが大きくなるため、このような操作で、必要な場合のみ酸素量を増やすことが可能となり、ランニングコストを最小限に抑えて、安定した処理性能（差圧の正常化も含め）を得ることが可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を適用した浸漬膜を利用した活性汚泥装置の系統図である。
【図２】実施例１で得られたＴＲＦＬＰ法によるエレクトロフェログラムである。全てのグラフにおいて、縦軸は蛍光強度、横軸はＴＲＦ（Terminal Restriction Fragment）の長さ（bases）である。
【図３】図２のエレクトロフェログラムから得られたＴＲＦＬＰ解析データを基に多次元尺度法により類似度を演算した結果をプロットした２次元プロット図である。
【符号の説明】
１ 曝気槽
２、５ 散気装置
３ 膜浸漬槽
４ 浸漬型膜分離装置
６ 分離膜
１１ 原水路
１２ 系路
１３ 処理水路
１４ 返送汚泥路
Claims (7)
- 生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、
この試料の遺伝子をＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、
混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、
混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、
これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測する
混合微生物系の監視方法。 - 混合微生物系が用排水の生物処理プロセスである請求項１記載の混合微生物系の監視方法。
- 管理指標が処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子である請求項１または２記載の混合微生物系の監視方法。
- コンピュータおよびデータベースを用いる請求項１ないし３のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が２次元または３次元空間内に布置された２次元または３次元プロット図として出力装置に出力される請求項１ないし３のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。 - コンピュータおよびデータベースを用いる請求項１ないし４のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、Ｔ−ＲＦＬＰ法により得られたエレクトロフェログラム（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）から数値化された解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その結果が出力装置に出力される請求項１ないし４のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。 - 混合微生物系において、定期的または任意の時点で請求項１ないし５のいずれかに記載の監視方法を実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
- 混合微生物系において、定期的または任意の時点で請求項１ないし５のいずれかに記載の監視方法を実施し、管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れると推測された場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
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