CN109975455A - 一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法 - Google Patents

一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明的一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下工艺步骤：1)土壤样品灭活后，样品加入相应量色谱级提取剂；2)相应温度下超声或超声与离心结合进行提取，提取完样品离心后取上清液，重复上述操作三次；3)合并上清液，干燥，采用提取剂复溶，高速离心得样品液，采用UPLC－MS技术，并控制相应的色谱质谱过程，对样品液进行检测，完成检测分析。本发明的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法对促进地下渗滤系统代谢组学研究、建立统一的提取方法具有重要意义，并且过程操作简单、快捷，检测效率高，灵敏性强，获得代谢物峰数据较大，且对样品重现性较好。实现地下渗滤系统代谢组学样品的快速、高效、精准检测。

Description

一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法。
背景技术：
地下渗滤处理系统是将污水有控制地投配到具有一定深度和良好渗透性的土层中，借毛 细管浸润和土壤渗透作用，污水向四周扩散，微生物作用耦合过滤、沉淀、吸附等物化过程， 使污水得到净化的土地处理工艺。
代谢组学是继基因组学，转录组学，蛋白质组学之后系统生物学的另一重要组成部分， 也是目前组学领域研究的热点之一。微生物代谢组学是代谢组学的一个分支，是指在微生物 细胞生长或生长循环某一特定时间点，以无偏、可重现的方式同时定性和定量分析细胞内、 外存在的全部低分子量代谢产物。微生物作为代谢组学研究的特殊样本，生长速度快，代谢 旺盛。通过微生物代谢产物可以发现生物体在受到外界条件干扰下的应变方式，同时可以区 分个体之间的差异。
微生物代谢组学预处理方法没有统一标准，因此建立高效、快速、准确靶向的地下渗滤 系统微生物代谢组学预处理方法对促进地下渗滤系统代谢组学研究，加强相关研究者之间的 数据交流具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种污水地下渗滤系统微生物代谢 产物检测方法，该方法以UPLC－MS为分析平台，对色谱、质谱条件及提取剂进行优化，采 用ESI正离子模式，分析出最佳的适合地下渗滤系统预处理优化方法，实现地下渗滤系统代 谢组学样品的快速、高效、精准检测。该技术具有分析方法简单，检测效率高，灵敏性强的 特点。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS中采集土壤样品；
(2)样品灭活：将土壤样品进行灭活处理；
(3)按配比为，灭活后样品：色谱级提取剂＝1:(2～3)，单位为g:ml或ml:ml，所述的灭活 后样品为固体状或液体状，当为固体时，以质量计，当为液体时，以体积计，向灭活后样品 中加入色谱级提取剂，进行提取，提取方式采用以下方式中的一种：
(a)超声提取，超声温度为20～25℃，提取时间为10～25min，取上清液，重复超声提取操 作三次；
(b)超声与离心相结合提取，具体为：20～25℃下超声提取5～15min后，将提取样品离心 5～15min，取上清液，并重复该超声与离心操作三次，其中，所述的离心转速为2000rmp，离 心温度为20～25℃；
(4)合并上清液，进行干燥去除水分，形成样品粉末，采用提取剂复溶，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为单一组分或混合组分，流速为0.1～0.3mL/min，并保证流速 不变，色谱柱温度为25～35℃，洗脱时间为59～75min，其中：当为单一组分时，流动相为100％ 水或100％乙腈，当为混合组分时，包括流动相A和流动相B，流动相A为水，流动相B为 乙腈；
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行离子扫描，毛细管电压为1～5KV，干燥气温度150～200℃，干燥气流量 4～8L/min，辅助气压力1.0～3.0Bar，质荷比采集范围：50～1800m/z，获得总离子流图，完成 污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，其中：所述的离子扫描采用的离子源采用大气压离 子源(API)、基质辅助激光解析电离源(MALDI)或快原子轰击源(FAB)中的一种。
所述的步骤1(1)中，样品为SWIS土柱中土壤样品。
所述的步骤1(2)中，灭活方式为以下方式中的一种：
(1)液氮冷冻，低温灭活：所述的液氮冷冻的温度为-196℃；
(2)高氯酸稀释：向样品中加入高氯酸溶液，高氯酸溶液体积与样品质量比为2∶1，单位 为ml：g，混合稀释5～20min后，1000r/min下离心5～15min，提取上清液；
(3)甲醇稀释：向样品中加入温度为-65℃～-58℃的甲醇，甲醇体积与样品质量比为2∶1， 单位为ml：g，混合稀释10～20min后，1000r/min下离心5～15min，提取上清液；
(4)高温灭活：向样品中加入温度为95-100℃的水，水体积与样品质量比为2∶1，单位为 ml：g，混合均匀，1000r/min下离心10-20min，提取上清液。
所述的步骤1(3)中，超声温度为20～25℃。
所述的步骤1(3)中，色谱级提取剂为甲醇、乙腈、甲醇与水的混合液或乙腈与水的混合 液，其中：
当为甲醇与水的混合液时，二者按质量比为，甲醇∶水＝(4～6)∶(6～4)混合；
当为乙腈与水的混合液时，二者按质量比为，乙腈∶水＝(4～6)∶(6～4)混合。
所述的步骤1(4)中，干燥方式为氮吹、真空干燥箱干燥或真空旋转蒸发干燥，其中：
氮吹干燥过程为：将氮气吹入加热样品的表面进行样品浓缩，喷吹时间为20-40min，氮 吹的加热方式为：圆形水浴/油浴，当为水浴时：水温控制为室温～100℃；当为油浴时，采用 甲基硅油，温度控制为室温～150℃，氮气流量控制为≤15L/min；
真空干燥箱干燥过程为：真空度≤133pa，干燥温度为30-200℃，干燥时间为1-2h。
真空下旋转蒸发干燥过程为：真空度为95～98kpa，旋转转速为20～200r/min，旋转时间 为20～30min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃。
所述的步骤1(4)中，提取剂为甲醇与氯仿按质量比为9∶1的混合液、甲醇或乙腈，所述 的提取剂添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准。
所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，具体方式为：
0～3分钟，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min，流动相B由30％匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min，流动相B由75％匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min，流动相B由90％匀速降至30％，流动相A由10％匀速升至70％；
65～70min，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％，洗脱时间为70min，该洗脱参 数方式命名为梯度洗脱参数A。
所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，具体方式为：
0～10分钟，流动相B由15％匀速升至65％，流动相A由85％匀速降至35％；
10～15min，流动相B由65％匀速升至80％，流动相A由35％匀速降至20％；
15～30min，流动相B由80％匀速升至95％，流动相A由20％匀速降至5％；
30～38min，流动相B由95％匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38～55min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
55～56min，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％；
56～59min，流动相B保持在15％，流动相A保持在85％，洗脱时间为59min，该洗脱参 数方式命名为梯度洗脱参数B。
所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，具体方式为：
0-8min，流动相B由10％匀速升至55％，流动相A由90％匀速降至45％；
8-15min，流动相B由55％匀速升至70％，流动相A由45％匀速降至30％；
15-30min，流动相B由70％匀速升至95％，流动相A由30％匀速降至5％；
30-38min，流动相B由95％匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38-60min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
60-68min，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％，洗脱时间为 68min，该洗脱参数方式命名为梯度洗脱参数C。
所述的步骤2(1)中，洗脱方式为双泵洗脱。
所述的步骤2(2)中，离子扫描模式为正离子扫描或负离子扫描，其中：
当为正离子扫描时：毛细管电压为3～5KV；当为负离子扫描时：毛细管电压为1～4KV。
所述的步骤2(2)中，质谱分析过程中，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液进行离线 内标校正。
所述的步骤2(2)中，大气压离子源具体为电喷雾离子源。
UPLC－MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测 系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量 数分离，经检测得到质谱图。样品预处理是微生物代谢组学分析中重要环节，对其精准度要 求极高。UPLC－MS集液相色谱高效分离能力和质谱高灵敏性于一体，大大提高了色谱对复 杂样品的高分离能力。液质联用具有分离度好，分析速度快，检测灵敏度高，应用范围广， 前处理方法简单，无需样品衍生化处理等优点。
本发明的有益效果：
1.提供了一种污水地下渗滤系统微生物代谢组学分析的样品预处理方法，对促进地下渗 滤系统代谢组学研究、建立统一标准提取具有重要意义。
2.样品中所有物质均能够尽量被检测到，即色谱峰较多，出峰效果良好。
3.样品中所有物质的分离度较好。
4.操作简单、快捷，检测分析时间短。
附图说明：
图1为实施例1中正负离子扫描模式基峰离子流色谱图(BPI)，图1(a)为正离子扫描模式， (b)为负离子扫描模式；
图2为实施例2中色谱洗脱参数A和B条件下获得的基峰离子流色谱图(BPI)，图2(a) 为色谱洗脱参数A，图2(b)为色谱洗脱参数B；
图3为实施例3中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图4为实施例4中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图5为实施例5中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图6为实施例6中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图7为实施例7中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图8为实施例8中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图9为实施例9中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图10为实施例10中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图11为实施例11中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图12为实施例12中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图13为实施例13中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图14为实施例14中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图15为实施例15中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图16为实施例16中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图17为实施例17中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图18为实施例18中提取方法获得的总离子流图(TIC)图；
图19为实施例3中提取方法(甲醇条件下)获得的局部放大总离子流图(TIC)图；
图20为实施例11中提取方法(乙腈条件下)获得的局部放大总离子流图(TIC)图；
图21为实施例19中方法对微生物代谢产物进行6次重复的进样分析结果总离子流图 (TIC)。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS土柱中采集土壤样品；
(2)样品灭活：将土壤样品进行灭活处理，灭活方式采用以下方式中一种：
(1)液氮冷冻，低温灭活：所述的液氮冷冻的温度为-196℃；
(2)高氯酸稀释：向样品中加入高氯酸溶液，高氯酸溶液体积与样品质量比为2：1，单位 为ml:g，混合稀释5-20min后，1000r/min下离心5-15min，提取上清液；
(3)甲醇稀释：向样品中加入-65℃～-58℃的甲醇，甲醇体积与样品质量比为2：1，单位为 ml:g，混合稀释10-20min后，1000r/min下离心5-15min，提取上清液；
(4)高温灭活：向样品中加入95-100℃的水，快速灭活，水体积与样品质量比为2：1，单 位为ml:g，混合均匀，1000r/min下离心10-20min，提取上清液；
(3)按配比为，灭活后样品∶色谱级提取剂＝1∶(2～3)，单位为g：ml或ml：ml，所述的灭活 后样品为固体状或液体状，当为固体时，以质量计，当为液体时，以体积计，向灭活后样品 中加入色谱级提取剂，进行提取，进行提取，提取方式采用以下方式中的一种：
(a)超声提取，超声温度为20～25℃，提取时间为10～25min，取上清液，重复超声提取操 作三次；
(b)超声与离心相结合提取，具体为：20～25℃下超声提取5～15min后，将提取样品离心 5～15min，取上清液，并重复该超声与离心操作三次，其中，所述的离心转速为2000rmp，离 心温度为20～25℃；
其中：
色谱级提取剂为甲醇、乙腈、甲醇与水的混合液或乙腈与水的混合液，当为甲醇与水的 混合液时，二者按质量比为，甲醇∶水＝(4～6)∶(6～4)混合；当为乙腈与水的混合液时，二者按 质量比为，乙腈∶水＝(4～6)∶(6～4)混合；
干燥方式为氮吹、真空干燥箱干燥或真空旋转蒸发干燥，其中：
氮吹干燥过程为：将氮气吹入加热样品的表面进行样品浓缩，喷吹时间为20-40min，氮 吹的加热方式为：圆形水浴/油浴，当为水浴时：水温控制为室温～100℃；当为油浴时，采用 甲基硅油，温度控制为室温～150℃，氮气流量控制为≤15L/min；
真空干燥箱干燥时：真空度≤133pa，干燥温度为30～200℃，干燥时间为1～2h；
真空下旋转蒸发干燥时：真空度为95～98kpa，旋转转速为20～200r/min，旋转时间为 20～30min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃；
(4)合并上清液，进行干燥去除水分，形成样品粉末，采用提取剂复溶，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测，其中：提取剂为甲醇与氯仿按质量比为9∶1的混合液、甲醇或乙腈，所述的 提取剂添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为单一组分或混合组分，流速为0.1～0.3mL/min，并保证流速 不变，色谱柱温度为25～35℃，洗脱时间为59～75min，其中：当为单一组分时，流动相为100％ 水或100％乙腈，当为混合组分时，包括流动相A和流动相B，流动相A为水，流动相B为 乙腈；当流动相为混合组分时，双泵洗脱，洗脱方式采用色谱梯度洗脱，具体采用以下三种 方式中的一种：
(一)色谱梯度洗脱参数A方式，洗脱时间为70min，具体方式为：
0～3分钟内，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min内，流动相B由30匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min内，流动相B由75匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min内，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min内，流动相B由90％匀速降至30％，流动相A由10％匀速升至70％；
65～70min内，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％。
(二)色谱梯度洗脱参数B方式，洗脱时间为59min，具体为：
0～10分钟内，流动相B由15匀速升至65％，流动相A由85％匀速降至35％；
10～15min内，流动相B由65匀速升至80％，流动相A由35％匀速降至20％；
15～30min内，流动相B由80匀速升至95％，流动相A由20％匀速降至5％；
30～38min内，流动相B由95匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38～55min内，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
55～56min内，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％；
56～59min内，流动相B保持在15％，流动相A保持在85％。
(三)色谱梯度洗脱参数C方式，洗脱时间为68min，具体为：
0-8min，流动相B由10匀速升至55％，流动相A由90％匀速降至45％；
8-15min，流动相B由55匀速升至70％，流动相A由45％匀速降至30％；
15-30min，流动相B由70匀速升至95％，流动相A由30％匀速降至5％；
30-38min，流动相B由95匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38-60min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
60-68min，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％。
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行正离子扫描或负离子扫描，毛细管电压为1～5KV，干燥气温度150～200℃，干燥气流量4～8L/min，辅助气压力1.0～3.0Bar，质荷比采集范围：50～1800m/z， 获得总离子流图，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，其中：
所述的离子扫描采用的离子源采用电喷雾(ESI)离子源、基质辅助激光解析电离源 (MALDI)或快原子轰击源(FAB)中的一种；
当为正离子扫描时：毛细管电压为3～5KV；当为负离子扫描时：毛细管电压为1～4KV；
并在质谱分析过程中，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液进行离线内标校正。
实施例中检测所用仪器平台及参数条件为：
仪器UPLC-MS；色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18反相柱(3.5μm，100mm×2.1 mm)；
SWIS柱高均为500mm；
所用的蒸发瓶液体容量为1-2ml；
所用的甲醇、乙腈浓度均为100％；
在整体技术方案前提下，分别就影响代谢产物提取效果的样品提取溶剂、提取时间、提 取温度、色谱条件和质谱条件分别进行研究，以获得最优的提取效果实验数据。
1.质谱色谱条件提取效果对比
所用仪器平台及参数条件：仪器UPLC-MS；色谱条件：色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18 反相柱(3.5μm，100mm×2.1mm)。流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈。流速0.2mL/min， 进样量5μL，柱温30C。
表1影响代谢产物提取效果的质谱及色谱条件
梯度洗脱参数A如表2所示：
表2色谱梯度洗脱参数A
梯度洗脱参数B如表3所示：
表3色谱梯度洗脱参数B
实施例1
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS土柱中采集土壤样品，样品中有机污染负荷为220～280mg/L；
(2)样品灭活：将土壤样品采用液氮冷冻进行灭活处理，液氮冷冻的温度为-196℃；
(3)按配比为，灭活后样品∶甲醇＝1∶2，单位为g：ml，向灭活后样品中加入甲醇，20℃下 超声提取8min后，将提取样品在温度为20℃，转速为2000rmp条件下离心12min，取上清 液，并重复该超声与离心操作三次；
(4)合并上清液，进行真空下旋转蒸发干燥，真空度为95～98kpa，旋转转速为100r/min， 旋转时间为20min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃，形成样品粉末，向样品粉末中添 加甲醇进行复溶，添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为混合组分，流速为0.2mL/min，并保证流速不变，色谱柱 温度为30℃，双泵洗脱，色谱梯度洗脱参数C方式，洗脱时间为68min，具体为：
0-8min，流动相B由10匀速升至55％，流动相A由90％匀速降至45％；
8-15min，流动相B由55匀速升至70％，流动相A由45％匀速降至30％；
15-30min，流动相B由70匀速升至95％，流动相A由30％匀速降至5％；
30-38min，流动相B由95匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38-60min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
60-68min，99％B-15％B流动相B由99匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％；
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行正离子扫描，采用电喷雾(ESI)离子源，毛细管电压为4.5KV干燥气温 度180℃，干燥气流量6L/min，辅助气压力2.0Bar，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液 进行离线内标校正，质荷比采集范围：50～1800m/z，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物 检测，获得正离子扫描模式下基峰离子流色谱图(BPI)如图1(a)所示；
并重复该实验过程，在质谱检测分析时，采用负离子扫描，采用电喷雾(ESI)离子源，毛 细管电压为2.6KV干燥气温度180℃，干燥气流量6L/min，辅助气压力2.0Bar，采用质量浓 度为0.1％的甲酸钠标准溶液进行离线内标校正，质荷比采集范围：50～1800m/z，完成污水地 下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得负离子扫描模式下基峰离子流色谱图(BPI)如图1(b)所 示，在两种模式均能够较好检测出峰基础上，正离子扫描模式效果更优。
对样品采集到的总离子流图(TIC)进行可视化检查，对图1中的峰谱数据进行对比分析， 结果显示：TIC在ESI+模式下的响应比较好，大部分代谢产物能够在此模式下出峰；正离子 条件下，检测到的峰的数量明显多于负离子模式，且正离子模式下，检测到的峰谱较集中。 对于地下渗滤系统微生物代谢产物的检测，正离子扫描模式优于负离子扫描模式。因此在后 面的实验中，优选采用正离子扫描模式。
实施例2
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS土柱中采集土壤样品，样品中有机污染负荷为220～280mg/L；
(2)样品灭活：将土壤样品采用液氮冷冻进行灭活处理，液氮冷冻的温度为-196℃；
(3)按配比为，灭活后样品：甲醇＝1∶2，单位为g：ml，向灭活后样品中加入甲醇，20℃下 超声提取8min后，将提取样品在温度为20℃，转速为2000rmp条件下离心12min，取上清 液，并重复该超声与离心操作三次；
(4)合并上清液，进行真空下旋转蒸发干燥，真空度为95～98kpa，旋转转速为100r/min， 旋转时间为20min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃，形成样品粉末，向样品粉末中添 加甲醇进行复溶，添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为混合组分，流速为0.2mL/min，并保证流速不变，色谱柱 温度为30℃，双泵洗脱，洗脱方式选择色谱梯度洗脱参数A方式，如表2所示，洗脱时间为70min，具体为：
0～3分钟内，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min内，流动相B由30匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min内，流动相B由75匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min内，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min内，流动相B由90匀速降至30％，流动相A由10％匀速升至70％；
65～70min内，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％。
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行正离子扫描，采用电喷雾(ESI)离子源，毛细管电压为4.5KV干燥气温 度180℃，干燥气流量6L/min，辅助气压力2.0Bar，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液 进行离线内标校正，质荷比采集范围：50～1800m/z，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物 检测，获得色谱洗脱参数A条件下的基峰离子流色谱图(BPI)如图2(a)所示。
并重复该实验过程，(二)色谱梯度洗脱参数B方式，如表3所示，洗脱时间为59min，具 体为：
0～10分钟内，流动相B由15匀速升至65％，流动相A由85％匀速降至35％；
10～15min内，流动相B由65匀速升至80％，流动相A由35％匀速降至20％；
15～30min内，流动相B由80匀速升至95％，流动相A由20％匀速降至5％；
30～38min内，流动相B由95匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38～55min内，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
55～56min内，流动相B由99匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％；
56～59min内，流动相B保持在15％，流动相A保持在85％。
经同样质谱检测分析过程，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得色谱洗脱 参数B条件下的基峰离子流色谱图(BPI)如图2(b)所示，在两种洗脱方式均能够较好检测出峰 基础上，色谱洗脱参数B方式效果更优。
图2的基峰离子流色谱图(BPI)可以看出色谱梯度洗脱参数B，样品检测时间明显缩短，色 谱图锋形质量好，且分离效果优于色谱梯度洗脱参数A。
因此，结合代谢产物温度稳定性，节省时间及色谱质谱条件等因素的考虑，确立最佳的 色谱质谱条件为：色谱梯度洗脱参数B和正离子扫描模式。
2.不同提取剂提取效果对比
表4影响代谢物提取效果的因素及水平
根据上面的三因素四水平设计正交设计表格如表5：
表5土壤微生物代谢物提取优化试验正交设计表
注：提取温度为20℃，提取剂甲醇∶水＝1∶1、提取剂乙腈∶水＝1∶1
采用上述样品代谢物的最佳色谱质谱条件(色谱梯度洗脱参数B和正离子扫描模式)，对 提取溶剂、提取方式、提取时间进一步优化，采用该16中提取条件进行检测，获得16种提 取方法的实验样本总离子流图(TIC)，具体见实施例3～18。
实施例3
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS土柱中采集土壤样品，样品中有机污染负荷为220～280mg/L；
(2)样品灭活：将土壤样品采用液氮冷冻进行灭活处理，液氮冷冻的温度为-196℃；
(3)按配比为，灭活后样品∶甲醇＝1∶2，单位为g：ml，向灭活后样品中加入甲醇，20℃下 超声提取5min后，将提取样品在温度为20℃，转速为2000rmp条件下离心15min，取上清 液，并重复该超声与离心操作三次；
(4)合并上清液，进行真空下旋转蒸发干燥，真空度为95～98kpa，旋转转速为100r/min， 旋转时间为20min，电压为220v，水槽加热温度为60℃，形成样品粉末，向样品粉末中添加 甲醇进行复溶，添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为混合组分，流速为0.2mL/min，并保证流速不变，色谱柱 温度为30℃，洗脱时间为59min，双泵洗脱，洗脱方式采用色谱梯度洗脱参数B方式，如表3所示，具体为：
0～3分钟内，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min内，流动相B由30匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min内，流动相B由75匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min内，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min内，流动相B由90匀速降至30％，流动相A由10％匀速升至70％；
65～70min内，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％；
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行正离子扫描，采用电喷雾(ESI)离子源，毛细管电压为4.5KV干燥气温度 180℃，干燥气流量6L/min，辅助气压力2.0Bar，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液进 行离线内标校正，质荷比采集范围：50～1800m/z，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检 测，获得总离子流图(TIC)如图3所示，局部放大总离子流图(TIC)如图19所示。
实施例4
实验过程同实施例3，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，离心时间为10min，完成污水 地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得的基峰离子流色谱图(BPI)如图4所示。
实施例5
实验过程同实施例3，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，仅进行超声提取，超声时间 为20min，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC)如图5所示。
实施例6
实验过程同实施例5，区别在于超声时间为15min，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产 物检测，获得总离子流图(TIC)如图6所示。
实施例7
实验过程同实施例4，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去甲醇与水的 混合液，二者配比为1∶1，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC) 如图7所示。
实施例8
实验过程同实施例3，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去甲醇与水的 混合液，二者配比为1∶1，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC) 如图8所示。
实施例9
实验过程同实施例6，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去甲醇与水的 混合液，二者配比为1∶1，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC) 如图9所示。
实施例10
实验过程同实施例5，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去甲醇与水的 混合液，二者配比为1∶1，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC) 如图10所示。
实施例11
实验过程同实施例3，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈，完成 污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC)如图11所示，局部放大总离 子流图(TIC)如图20所示。
实施例12
实验过程同实施例4，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈，完成 污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC)如图12所示。
实施例13
实验过程同实施例5，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈，完成 污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC)如图13所示。
实施例14
实验过程同实施例6，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈，完成 污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流图(TIC)如图14所示。
实施例15
实验过程同实施例4，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈与水的 混合液，二者按配比1∶1混合，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流 图(TIC)如图15所示。
实施例16
实验过程同实施例3，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈与水的 混合液，二者按配比1∶1混合，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流 图(TIC)如图16所示。
实施例17
实验过程同实施例6，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈与水的 混合液，二者按配比1∶1混合，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流 图(TIC)如图17所示。
实施例18
实验过程同实施例5，区别在于样品液提取的步骤1(3)中，色谱级提取剂去乙腈与水的 混合液，二者按配比1∶1混合，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，获得总离子流 图(TIC)如图18所示。
由上述实施例3～18结果显示：不同提取溶剂轮廓具有差异，如4种提取剂各有4个样本， 同一溶剂组内差异较小，不同溶剂组间差异较大。在0-10min出现的峰明显较小，主要溶出 偏大极性的化合物；11-20min，纯乙腈出现的峰的数量最多，有效的富集了此类成分，其次 为纯甲醇；21-30min，中低极性的化合物四种提取剂差别不是很大，甲醇、甲醇：水提取剂 出现的峰最多，乙腈：水提取剂的峰最少；在31-42min，就峰形及数量而言，纯甲醇典型峰 及数量最多，其次为乙腈。
从图3中可以看出实施例3甲醇提取得到的峰多于实施例11乙腈提取，甲醇的提取效果 要明显好于乙腈的提取效果。由此可见，甲醇有较好的浸出能力，溶解性、兼容性较强，适 合比较宽广的极性条件；乙腈适合提取中低极性化合物；混合溶剂有萃取分相的步骤，对大 极性、中高极性化合物具有富集作用，对低极性化合物提取含量较少。通过对提取效果指标(峰 形、高度)分析，提取溶剂对代谢物提取影响最大，其次是提取方式和提取时间。通过对比分 析实施例3～18不同提取剂组内及组间的提取效果得出：50％乙腈和50％甲醇提取后检测到的 化合物数量均明显少于纯溶剂提取，且引入的杂质相对较多；甲醇的提取效果优于乙腈的提 取效果。另外采用先超声后离心的效果比较好。
通过UPLC-MS分析，本发明所确定的最佳提取方法为：在质谱的正离子扫描模式，色 谱梯度洗脱参数B的条件下，以纯甲醇作为提取溶剂，选用先超声后离心的方式提取，提取 20min，效果最佳，其次为纯乙腈提取、甲醇：水约为40％-60％、乙腈：水约为60％-40％。
实施例19
一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS土柱中采集土壤样品，样品中有机污染负荷为370～430mg/L；
(2)样品灭活：将土壤样品采用液氮冷冻进行灭活处理，液氮冷冻的温度为-196℃；
(3)按配比为，灭活后样品∶甲醇＝1∶2，单位为g：ml，向灭活后样品中加入甲醇，20℃下 超声提取8min后，将提取样品在温度为20℃，转速为2000rmp条件下离心12min，取上清 液，并重复该超声与离心操作三次；
(4)合并上清液，进行真空下旋转蒸发干燥，真空度为95～98kpa，旋转转速为100r/min， 旋转时间为20min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃，形成样品粉末，向样品粉末中添 加甲醇进行复溶，添加量以充分溶解样品粉末且不超出容器盛装容量为准，搅拌混合均匀后， 13000rmp条件下离心5-10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进 样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为混合组分，流速为0.2mL/min，并保证流速不变，色谱柱 温度为30℃，洗脱时间为59min，双泵洗脱，洗脱方式采用色谱梯度洗脱参数B方式，具体为：
0～3分钟内，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min内，流动相B由30匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min内，流动相B由75匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min内，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min内，流动相B由90匀速降至30％，流动相A由70％匀速降至10％；
65～70min内，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％；
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行正离子扫描，采用电喷雾(ESI)离子源，毛细管电压为4.5KV干燥气温 度180℃，干燥气流量6L/min，辅助气压力2.0Bar，采用质量浓度为0.1％的甲酸钠标准溶液 进行离线内标校正，质荷比采集范围：50～1800m/z，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物 检测，并重复该实施例整体过程，对SWIS柱中高度H2(500mm)进行了6次重复的进样分析， 分析结果的总离子流图(TIC)见图21，根据样品TIC图可得，样品检测时间短，色谱图形质量 好，6份平行样品在出峰时间、高度和形状上基本一致，试验结果证明该方法简单快速，重 复性好。

Claims (10)

1.一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，样品液提取：
(1)土壤样品采集：在SWIS中采集土壤样品；
(2)样品灭活：将土壤样品进行灭活处理；
(3)按配比为，灭活后样品∶色谱级提取剂＝1∶(2～3)，单位为g∶ml或ml∶ml，所述的灭活后样品为固体状或液体状，当为固体时，以质量计，当为液体时，以体积计，向灭活后样品中加入色谱级提取剂，进行提取，提取方式采用以下方式中的一种：
(a)超声提取，超声温度为20～25℃，提取时间为10～25min，取上清液，重复超声提取操作三次；
(b)超声与离心相结合提取，具体为：20～25℃下超声提取5～15min后，将提取样品离心5～15min，取上清液，并重复该超声与离心操作三次，其中，所述的离心转速为2000rmp，离心温度为20～25℃；
(4)合并上清液，进行干燥去除水分，形成样品粉末，采用提取剂复溶，搅拌混合均匀后，13000rmp条件下离心5～10min，取上清液，即为样品液，取样品液于进样小瓶的内衬管中进样，进行检测；
步骤2，样品液检测：
采用UPLC-MS技术对样品液进行检测，具体过程为：
(1)进行色谱分离：具体色谱分离参数为：
对样品液进行洗脱，流动相为单一组分或混合组分，流速为0.1～0.3mL/min，并保证流速不变，色谱柱温度为25～35℃，洗脱时间为59～75min，其中：当为单一组分时，流动相为100％水或100％乙腈，当为混合组分时，包括流动相A和流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；
(2)质谱检测分析：
色谱分离后进行离子扫描，毛细管电压为1～5KV，干燥气温度150～200℃，干燥气流量4～8L/min，辅助气压力1.0～3.0Bar，质荷比采集范围：50～1800m/z，获得总离子流图，完成污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测，其中：所述的离子扫描采用的离子源采用大气压离子源、基质辅助激光解析电离源或快原子轰击源中的一种。
2.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤1(1)中，样品为SWIS土柱中土壤样品。
3.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤1(2)中，灭活方式为以下方式中的一种：
(1)液氮冷冻，低温灭活：所述的液氮冷冻的温度为-196℃；
(2)高氯酸稀释：向样品中加入高氯酸溶液，高氯酸溶液体积与样品质量比为2∶1，单位为ml∶g，混合稀释5～20min后，1000r/min下离心5～15min，提取上清液；
(3)甲醇稀释：向样品中加入温度为-65℃～-58℃的甲醇，甲醇体积与样品质量比为2∶1，单位为ml∶g，混合稀释10～20min后，1000r/min下离心5～15min，提取上清液；
(4)高温灭活：向样品中加入温度为95-100℃的水，水体积与样品质量比为2∶1，单位为ml∶g，混合均匀，1000r/min下离心10-20min，提取上清液。
4.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤1(3)中，色谱级提取剂为甲醇、乙腈、甲醇与水的混合液或乙腈与水的混合液，其中：
当为甲醇与水的混合液时，二者按质量比为，甲醇∶水＝(4～6)∶(6～4)混合；
当为乙腈与水的混合液时，二者按质量比为，乙腈∶水＝(4～6)∶(6～4)混合。
5.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤1(4)中，干燥方式为真空下旋转蒸发，真空度为95～98kpa，旋转转速为20～200r/min，旋转时间为20～30min，电压为220v，水槽加热温度为25-90℃。
6.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤1(4)中，提取剂为甲醇与氯仿按质量比为9∶1的混合液、甲醇或乙腈。
7.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，洗脱时间为70min，具体方式为：
0～3分钟，流动相B由0匀速升至30％，流动相A由100％匀速降至70％；
3～33min，流动相B由30％匀速升至75％，流动相A由70％匀速降至25％；
33～55min，流动相B由75％匀速升至90％，流动相A由25％匀速降至10％；
55～64min，流动相B保持在90％，流动相A保持在10％；
64～65min，流动相B由90％匀速降至30％，流动相A由10％匀速升70％；
65～70min，流动相B保持在30％，流动相A保持在70％。
8.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，洗脱时间为59min，具体方式为：
0～10分钟，流动相B由15％匀速升至65％，流动相A由85％匀速降至35％；
10～15min，流动相B由65％匀速升至80％，流动相A由35％匀速降至20％；
15～30min，流动相B由80％匀速升至95％，流动相A由20％匀速降至5％；
30～38min，流动相B由95％匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38～55min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
55～56min，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％；
56～59min，流动相B保持在15％，流动相A保持在85％。
9.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤2(1)中，流动相为混合组分时，采用梯度洗脱，洗脱时间为68min，具体方式为：
0-8min，流动相B由10匀速升至55％，流动相A由90％匀速降至45％；
8-15min，流动相B由55匀速升至70％，流动相A由45％匀速降至30％；
15-30min，流动相B由70匀速升至95％，流动相A由30％匀速降至5％；
30-38min，流动相B由95匀速升至99％，流动相A由5％匀速降至1％；
38-60min，流动相B保持在99％，流动相A保持在1％；
60-68min，流动相B由99％匀速降至15％，流动相A由1％匀速升至85％。
10.根据权利要求1所述的污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法，其特征在于，所述的步骤2(2)中，离子扫描模式为正离子扫描或负离子扫描，其中：
当为正离子扫描时：毛细管电压为3～5KV；当为负离子扫描时：毛细管电压为1～4KV。
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