CN113583008B - 一种提取分离蕨藻红素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然药物的提取技术领域，具体涉及一种提取分离蕨藻红素的方法，为提供一种能制备高纯度蕨藻红素且提取、分离过程简洁的方法，本发明先用乙醇/水溶液对藻类植物进行微波热浸提取，浓缩得到浸膏后通过层析富集得到蕨藻红素，本发明方法提取效率高、方便、经济、快捷，且操作简单，所提取得到的蕨藻红素产品纯度高，纯度为90±5％，无需用高成本的高效液相制备色谱法进行再纯化，提取、萃取、柱层析等步骤中的溶剂都可以回收再利用，如此消耗溶剂少，大大的节约了生产成本。

Description

一种提取分离蕨藻红素的方法
技术领域
本发明属于天然药物的提取技术领域，具体涉及一种提取分离蕨藻红素的方法。
背景技术
蕨藻红素(Caulerpin)是一种吲哚生物碱，广泛存在于藻类植物中。蕨藻红素为橙红色立方晶体，熔点为319-319.5℃，其化学计量式为C24H18N2O4。蕨藻红素具有多种显著的生物活性，据报道，蕨藻红素具有显著的促进植物增长的作用，延缓花朵衰老和果实成熟，竞争性抑制生长激素，除草剂，脱草剂等功效。同时有报道表明，蕨藻红素还具有较好的抗氧化、抗炎症、抗肿瘤活性。此外，还有研究表明蕨藻红素能在低碳钢/酸提取接口抑制低碳钢腐蚀，表明蕨藻红素可作为潜在的绿色防腐材料。可见，蕨藻红素具有广阔的应用前景。
目前，蕨藻红素的提取方法多采用溶剂浸提法、多重溶剂重结晶法、索氏提取法等。然而，上述这些传统的提取方法普遍存在提取效率低、操作复杂、溶剂用量大、耗时长及污染严重等缺点。
因此，提供一种能制备高纯度蕨藻红素且提取、分离过程简洁的方法是非常有必要的。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种提取分离蕨藻红素的方法，该方法工艺简单，所提取得到的蕨藻红素产品纯度高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种提取分离蕨藻红素的方法，具体包括以下步骤：
S1、采用乙醇/水溶液对藻类植物进行微波热浸提取，所得提取液经过蒸发得到样品浸膏a；
S2、对步骤S1的样品浸膏a进行层析，经富集得到蕨藻红素。
优选地，所述藻类植物包括但不限于葡萄藻。葡萄藻中含有丰富的蕨藻红素，目前鲜有方法能从葡萄藻分离提纯蕨藻红素。
优选地，所述微波热浸提取的温度为60℃～70℃，微波功率为700W-900W。
优选地，所述乙醇/水溶液为乙醇的体积百分比浓度为70％～90％的乙醇/水溶液。进一步的，所述乙醇/水溶液为乙醇的体积百分比浓度为80％的乙醇/水溶液。
优选地，所述藻类植物与乙醇/水溶液的重量比为1:(10～20)。进一步的，所述藻类植物与乙醇/水溶液的重量比为1:15。
优选地，所述藻类植物的水分小于5wt％。
优选地，所述藻类植物在微波热浸提取前，先粉碎成粉末(70-90目)。
优选地，所述微波热浸提取的次数不少于两次，每次不少于30min。
优选地，所述蒸发为旋转蒸发，温度为50℃～60℃，真空压强为0.07MPa～0.09MPa，转速为90～100r/min。
优选地，所述层析为硅胶柱层析。
优选地，所述样品浸膏a在层析前，先用甲醇/水溶液调至粘稠状，再加入硅胶搅拌均匀，并挥发至干。
更优选地，所述甲醇/水溶液为体积百分比浓度为70％～90％的甲醇/水溶液。进一步的，所述甲醇/水溶液为体积百分比浓度为80％的甲醇/水溶液。
更优选地，所述样品浸膏a与甲醇/水溶液的重量比为1：(1.5～3)，所述样品浸膏a与硅胶的重量比为(1～1.5)：1。进一步的，样品浸膏a与甲醇/水溶液的重量比为1：2，所述样品浸膏a与硅胶的重量比为1.2：1。
优选地，层析时采用80％甲醇/水溶液作为流动相进行等度洗脱。
更优选地，洗脱过程采用紫外检测器进行跟踪，收集流分通过高效液相色谱进行分析，色谱条件为色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：315nm；柱温：30℃；进样体积：10μL；收集315nm吸收峰进行浓缩，采用高效液相色谱分析，峰面积归一法定性纯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种提取分离蕨藻红素的方法，先用乙醇/水溶液对藻类植物进行微波热浸提取，浓缩得到浸膏后通过层析富集得到蕨藻红素。本发明具有如下优点：
(1)浓缩所得浸膏仅进行两次简单的柱层析分离，即得所需要求的产品，工艺过程简单；
(2)分离提取过程简洁，所需周期短，且用于调配极性的溶剂种类少且易购置；
(3)提取、萃取、柱层析等步骤中的溶剂都可以回收再利用，如此消耗溶剂少，大大的节约了生产成本；
(4)分离得到的蕨藻红素产品纯度高，纯度为90±5％，无需用高成本的高效液相制备色谱法进行再纯化；
(5)本发明方法提取效率高、方便、经济、快捷，且操作简单。
附图说明
图1为蕨藻红素柱层析分离后的紫外吸收信号图；
图2为蕨藻红素的13C-NMR图谱；
图3为蕨藻红素的1H-NMR图谱；
图4为蕨藻红素的紫外光谱图；
图5为蕨藻红素的红外光谱图；
图6为蕨藻红素的正离子模式质谱图；
图7为蕨藻红素的负离子模式质谱图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1一种从葡萄藻中提取分离蕨藻红素的方法
该方法包括如下步骤：
(1)葡萄藻的浸提和浓缩
称取50g葡萄藻(水分<5wt％)，经粉碎机粉碎，样品粉末过80目筛筛分，按1:15的重量比加入80％乙醇/水溶液对样品粉末进行微波热浸提取，提取的水浴温度为65℃，微波功率为800W，共提取2次，每次30分钟；过滤、合并两次提取所得的提取液，提取液采用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩蒸去乙醇/水溶液，蒸发的水浴温度为55℃，真空压强为0.08MPa，转速95r/min，得到0.25g样品浸膏a。
(2)硅胶柱层析
用46-60μm的C18反向硅胶2175g填充13×110cm的玻璃层析柱，用流动相浸润硅胶并装柱，将样品浸膏a用80％甲醇/水溶液溶解调至粘稠状，其中，样品浸膏a与80％甲醇/水溶液的重量比为1：2，加入100目硅胶，硅胶与样品浸膏a的重量比为1：1.2，搅拌均匀，于良好通风处挥发至干后，少量多次均匀加入玻璃层析柱中，盖上4～6cm左右的棉花，并用重物压实，然后用80％甲醇/水溶液作为流动相进行等度洗脱，采用紫外检测器进行信息采集，设置波长为315nm进行采集，紫外洗脱过程采用紫外检测器进行跟踪，蕨藻红素的紫外吸收信号如图1所示，图中的第二个峰即为收集的蕨藻红素。收集得到的蕨藻红素样品纯度通过高效液相色谱分析跟踪。色谱条件为色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：315nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。收集315nm吸收峰进行浓缩，采用高效液相色谱分析，峰面积归一法定性纯度【具体方法参照“贺天雨,王尉,徐双双,等.葛根素标准样品的研制.分析仪器,2018,2:82-89”】确定提取得到的样品的纯度为95.64％。
对提取得到的蕨藻红素进行13C-NMR图谱和1H-NMR图谱分析。如图2、图3以及表1所示，蕨藻红素碳谱中只显示12个碳原子的信号，恰为分子式中含碳数的一半，表明蕨藻红素是一个对称性分子，其空间群有一个C2对称轴。
对提取得到的蕨藻红素进行紫外光谱分析。如图4所示，蕨藻红素紫外吸收峰分别为220nm，270nm，290nm和318nm，以上紫外光谱吸收波长数据与文献【(1)A.S.R.AnjaneyuluC.V.S.Prakash,U.V.Mallavadhani Pages.Two caulerpin analogs and asesquiterpene from Caulerpa racemosa Phytochemistry[J].1991,30(9):3041-3042.(2)Aguilar-Santos G.Caulerpin,anew redpigment from green algae ofthe genusCaulerpa.Journal ofthe Chemical Society,1970(6):842-843】对照一致。
对提取得到的蕨藻红素进行红外光谱分析。如图5所示，红外光谱1687(S)和1263(S)表示有共轭的羧基甲酯官能团。红外光谱3381cm-1单一尖峰以及1263cm-1强吸收峰说明存在仲胺，其中3383cm-1为VN-H，1265cm-1为VC-N，1687cm(VC＝O)说明存在羰基，1057cm-1为Vs，C-O-C。以上红外光谱吸收波长数据与文献【(1)吕扬,卢多,郑启泰,等.蕨藻红素(Caulerpin)的结构分析[J].结构化学,1994,13(6):472-476.(2)徐效华，苏镜娱.Caulerpin的分离鉴定及生物活性.中山大学学报(自然科学版).1996,35(2):64-66.】对照一致。
对提取得到的蕨藻红素进行正离子模式质谱分析。如图6所示，m/z＝399.2[M+H]+；m/z＝421.2[M+Na]+，m/z＝437.1[M+K]+，推断该蕨藻红素标准样品分子质量为398.2。
综合上述核磁共振图谱、红外光谱、紫外光谱、质谱分析，可以确认其为蕨藻红素。
对提取得到的蕨藻红素进行负离子模式质谱分析。如图7所示，m/z＝397.0[M-H]-，推断该蕨藻红素标准样品分子质量为398.0。
表1蕨藻红素的核磁共振碳谱及氢谱数据(氘代溶剂DMSO-d6)
Figure BDA0003243292350000041
Figure BDA0003243292350000051
注：表中所述文献指：吕扬,卢多,郑启泰,等.蕨藻红素(Caulerpin)的结构分析[J].结构化学,1994,13(6):472-476.
实施例2一种从葡萄藻中提取分离蕨藻红素的方法
该方法包括如下步骤：
(1)葡萄藻的浸提和浓缩
称取50g葡萄藻(水分<5wt％)，经粉碎机粉碎，样品粉末过70目筛筛分，按1:10的重量比加入70％乙醇/水溶液对样品粉末进行微波热浸提取，提取的水浴温度为60℃，微波功率为700W，共提取2次，每次30分钟；过滤、合并两次提取所得的提取液，提取液采用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩蒸去乙醇/水溶液，蒸发的水浴温度为50℃，真空压强为0.07MPa，转速90r/min，得到0.25g样品浸膏a。
(2)硅胶柱层析
用46-60μm的C18反向硅胶2175g填充13×110cm的玻璃层析柱，用流动相浸润硅胶并装柱，将样品浸膏a用70％甲醇/水溶液溶解调至粘稠状，其中，样品浸膏a与70％甲醇/水溶液的重量比为1：1.5，加入100目硅胶，硅胶与样品浸膏a的重量比为1：1，搅拌均匀，于良好通风处挥发至干后，少量多次均匀加入玻璃层析柱中，盖上4～6cm左右的棉花，并用重物压实，然后用70％甲醇/水溶液作为流动相进行等度洗脱，采用紫外检测器进行信息采集，设置波长为315nm进行采集，紫外洗脱过程采用紫外检测器进行跟踪。收集得到的蕨藻红素样品纯度通过高效液相色谱分析跟踪。色谱条件为色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：315nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。收集315nm吸收峰进行浓缩，采用高效液相色谱分析，峰面积归一法定性纯度【具体方法参照“贺天雨,王尉,徐双双,等.葛根素标准样品的研制.分析仪器,2018,2:82-89”】，确定提取得到的样品的纯度为94.63％。
所提取得到的样品经过核磁共振图谱、红外光谱、紫外光谱、质谱分析(分析结果与实施例1相同或相似)，确认其为蕨藻红素。
实施例3一种从葡萄藻中提取分离蕨藻红素的方法
该方法包括如下步骤：
(1)葡萄藻的浸提和浓缩
称取50g葡萄藻(水分<5wt％)，经粉碎机粉碎，样品粉末过90目筛筛分，按1:20的重量比加入90％乙醇/水溶液对样品粉末进行微波热浸提取，提取的水浴温度为70℃，微波功率为900W，共提取2次，每次30分钟；过滤、合并两次提取所得的提取液，提取液采用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩蒸去乙醇/水溶液，蒸发的水浴温度为60℃，真空压强为0.09MPa，转速100r/min，得到0.25g样品浸膏a。
(2)硅胶柱层析
用46-60μm的C18反向硅胶2175g填充13×110cm的玻璃层析柱，用流动相浸润硅胶并装柱，将样品浸膏a用90％甲醇/水溶液溶解调至粘稠状，其中，样品浸膏a与90％甲醇/水溶液的重量比为1：3，加入100目硅胶，硅胶与样品浸膏a的重量比为1：1.5，搅拌均匀，于良好通风处挥发至干后，少量多次均匀加入玻璃层析柱中，盖上4～6cm左右的棉花，并用重物压实，然后用90％甲醇/水溶液作为流动相进行等度洗脱，采用紫外检测器进行信息采集，设置波长为315nm进行采集，紫外洗脱过程采用紫外检测器进行跟踪。收集得到的蕨藻红素样品纯度通过高效液相色谱分析跟踪。色谱条件为色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：315nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。收集315nm吸收峰进行浓缩，采用高效液相色谱分析，峰面积归一法定性纯度【具体方法参照“贺天雨,王尉,徐双双,等.葛根素标准样品的研制.分析仪器,2018,2:82-89”】，确定提取得到的样品的纯度为94.65％。
所提取得到的样品经过核磁共振图谱、红外光谱、紫外光谱、质谱分析(分析结果与实施例1相同或相似)，确认其为蕨藻红素。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种提取分离蕨藻红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用乙醇/水溶液对藻类植物进行微波辅助提取，所得提取液经过蒸发得到样品浸膏a；所述微波辅助提取的温度为60℃～70℃，微波功率为700W-900W，所述乙醇/水溶液为乙醇的体积百分比浓度为70％～90％的乙醇/水溶液，所述藻类植物与乙醇/水溶液的重量比为1:(10～20)，所述藻类植物选自葡萄藻，所述样品浸膏a在层析前，先用甲醇/水溶液调至粘稠状，再加入硅胶搅拌均匀，并挥发至干；
S2、对步骤S1的样品浸膏a进行层析，经分离纯化得到蕨藻红素，所述层析为C18反相硅胶柱层析，洗脱过程采用紫外检测器进行跟踪，收集流分通过高效液相色谱进行纯度分析，色谱条件为色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：315nm；柱温：30℃；进样体积：10μL；收集层析柱分离315nm吸收峰直接采用高效液相色谱分析，峰面积归一法定性纯度，层析时采用80％甲醇/水溶液作为流动相进行等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种提取分离蕨藻红素的方法，其特征在于，所述样品浸膏a与甲醇/水溶液的重量比为1：(1.5～3)，所述样品浸膏a与硅胶的重量比为(1～1.5)：1。
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