CN117534544B - 一种分离沉香螺醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离获得高纯度沉香螺醇的方法，属于分离纯化技术领域，该方法包括以下步骤：先通过楠木原料制得楠木提取物；然后采用硅胶层析柱对楠木提取物预浓缩；再对预浓缩溶液进行萃取和减压蒸馏后，使用硝酸银硅胶层析柱洗脱，得预纯化溶液；最后采用制备型液相色谱法对预纯化溶液进行精制，重复多次，得高纯度沉香螺醇。本发明分离获得高纯度沉香螺醇的纯度最终达到95%以上，实现了从植物中分离获得高纯度沉香螺醇的目标，并且该方法具有原料成本低、分离速度快、分离效率高和溶剂用量少且容易回收等优点。

Description

一种分离沉香螺醇的方法
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种分离沉香螺醇的方法。
背景技术
沉香螺醇（Agarospirol）是一种岩兰烷类螺环倍半萜类的化学物质，分子式为C15H26O，CAS号为1460-73-7。天然沉香螺醇首次由印度学者Varma等人从马来沉香精油中分离而来，但由于当时分离技术水平有限，获得的沉香螺醇纯度不高，只是推测了其可能的化学结构。此后又有学者从白木香挥发油中分离获得天然沉香螺醇，但是其纯度依然不高，难以通过核磁共振波谱解析其结构。2004年有研究报道首次实现了沉香螺醇的人工合成，但是由于沉香螺醇的合成工艺非常复杂，成本高，并且合成产物往往是沉香螺醇和茅苍术醇这一对顺反异构体的混合物，难以分离，人工合成获得的沉香螺醇纯度不高一般不超过50%，因此目前人工合成沉香螺醇的方法由于高成本和低纯度几乎没有商业价值。另外，沉香本身的价格极其昂贵，因此从沉香中分离纯化获得天然沉香螺醇的成本极高，很难被市场接受。此外，沉香中天然沉香螺醇含量不高，分离纯化过程中消耗的溶剂量大，污染环境，且目前分离纯化天然沉香螺醇的相关研究报道也仅限于传统的硅胶柱层析方法，费时且分离获得的沉香螺醇纯度有限。因此，目前国内外尚无任何沉香螺醇产品的销售信息。
桢楠或闽楠的木材中含有大量的沉香螺醇，平均含量20%以上，最高可达40%，远高于在沉香中（最高不足10%）。相比于沉香原料，桢楠或闽楠木材储量大、来源广泛、价格低（最便宜的沉香原料价格也是楠木木材的十几倍之多），并且桢楠和闽楠木材在加工木制品的过程中有将近40%的加工余料是作为垃圾倾倒或燃料焚烧的。因此，相比于沉香原料，以桢楠或闽楠木材为原料分离获得高纯度的沉香螺醇，显著的优势是原料价廉且目标化合物含量高，具有良好的市场开发前景。
据报道，沉香螺醇也存在于一些其他植物中，其中含量最高的是厚朴树皮（中药材）中，其含量接近在桢楠或闽楠木材中。另外，大果紫檀木材、中药荔枝草和可可茶茶花中也有含量3%-6%沉香螺醇，远低于沉香螺醇在桢楠和闽楠木材中的含量，且这些原料的价格都高于桢楠或闽楠木材，因此从这些植物中分离纯化沉香螺醇产品，不仅成本高而且需要消耗大量的溶剂，显然没有以桢楠或闽楠木材为原料更有商业价值。
目前国内外尚无任何从植物中分离纯化获得天然沉香螺醇的专利，也没有任何能获得纯度大于60%的天然沉香螺醇的分离纯化方法的相关科学研究报道。因此，选择成本低的原料和对环境污染少的分离纯化方法获得高纯度沉香螺醇的技术是市场迫切需要的，在工业生产中十分重要。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种分离获得高纯度沉香螺醇的方法，采用硝酸银硅胶层析柱联合制备型液相色谱法，分离的沉香螺醇纯度最终达到95%以上，实现了从植物中分离获得高纯度沉香螺醇的目标，并且该方法具有原料成本低、分离速度快、分离效率高和溶剂用量少容易回收等优点。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：将桢楠或闽楠粉碎后，使用水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳提取法或溶剂提取法提取，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向步骤（1）所得楠木提取物中加入溶解溶剂充分溶解，然后加入柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱，并加压挤出溶解溶剂，再按照极性增加的顺序用不同比例的混合溶剂进行洗脱，收集含有沉香螺醇的洗脱液，得预浓缩溶液；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液使用石油醚和乙酸乙酯中的至少一种萃取后减压蒸馏，然后加入含质量比1%-10%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有含质量比1%-10%硝酸银的硅胶的层析柱中，再按照极性增加的顺序用不同比例的混合溶剂进行洗脱，收集含有沉香螺醇的洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解后，采用制备型液相色谱分离，得沉香螺醇；
溶解溶剂为石油醚、正己烷和乙酸乙酯中的至少一种；
混合溶剂为溶解溶剂与乙酸乙酯的混合溶液。
进一步，步骤（2）和（3）中，楠木提取物、柱层析硅胶和含质量比1%-10%硝酸银的柱层析硅胶的体积质量比为100 mL:100-150 g:100-150 g。
进一步，收集混合溶剂体积比为10-20:1的含有沉香螺醇的洗脱液。
进一步，步骤（4）中，制备型液相色谱法分离，为以下方法中的一种：
（1）用乙腈与体积含量1%的乙酸水溶液的混合溶液梯度洗脱，制备2-5次；
（2）先用乙腈/水混合溶剂梯度洗脱，再用甲醇/水混合溶剂梯度洗脱；
（3）用甲醇/水混合溶剂梯度洗脱。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明方法的原料为桢楠或闽楠，具有木材储量大、来源广泛和价格低廉的特点，并且桢楠和闽楠木材在加工木制品的过程中有将近40%的加工余料是作为垃圾倾倒或燃料焚烧的。因此，以桢楠或闽楠为原料分离获得高纯度的沉香螺醇具有原料廉价的优势，并且桢楠或闽楠的木材中沉香螺醇含量高，有良好的市场开发前景。
2、通过常规的硅胶柱层析法分离沉香螺醇组分难以得到高纯度的产品，楠木提取物经多次重复过柱后沉香螺醇纯度仅能达到30%左右。而本发明选择硝酸银硅胶层析柱分离，利用银离子与不饱和键之间的络合反应，改变楠木提取物中各组分的分配系数，经过吸附、解吸、再吸附和再解吸的分离过程，分离的沉香螺醇纯度最高可达到50%左右。并且，通过硝酸银硅胶柱层析法分离沉香螺醇具有分离能力强、灵敏度高、操作简便和成本低廉的优点。
3、本发明分离获得高纯度沉香螺醇的方法是选择制备型液相色谱法进一步对目标样品进行分离，具有高速、高效和高灵敏度等特点，制备柱可反复使用，溶剂容易回收，样品中沉香螺醇不会被破坏。
4、本发明利用硝酸银硅胶柱联合制备型液相色谱的方法分离的沉香螺醇纯度最终达到95%以上，实现了从植物中分离获得高纯度沉香螺醇的目标，并且该分离获得高纯度沉香螺醇的方法具有原料成本低、分离速度快、分离效能高和溶剂用量少且容易回收等优点，不仅适合于实验室，还易于实现工业规模的分离。
附图说明
图1为实施例1中楠木提取物的HPLC谱图；
图2为实施例1中预浓缩溶液中沉香螺醇的HPLC谱图；
图3为实施例1中预纯化溶液的HPLC谱图；
图4为本发明方法分离的高纯度沉香螺醇的HPLC谱图；
图5为沉香螺醇的2D化学结构图；
图6为沉香螺醇的3D化学结构图。
具体实施方式
实施例1
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：将桢楠树干粉碎后，用水蒸气蒸馏法提取，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向700 mL步骤（1）所得楠木提取物中加入700 mL正己烷充分溶解，然后加入700 g柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱，并加压挤出正己烷，再按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，洗脱步骤和比例依次为：
正己烷，洗脱体积约20 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积20 L，收集洗脱液，得预浓缩溶液；
甲醇，洗脱体积20 L，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液用乙酸乙酯萃取后减压蒸馏，然后加入含5%硝酸银的柱层析硅胶搅拌均匀，倒入填充有5%硝酸银的硅胶的层析柱中，再按照极性增加的顺序用体积比20:1的正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积约20 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积约8 L，收集洗脱液；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积约20 L，收集洗脱液；
合并收集的洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解，采用制备型液相色谱分离纯化，重复制备5次，其中液相色谱制备柱为ZBZ-34型C30柱，制备流动相为乙腈与1%(v/v)乙酸水溶液的不同体积比混合溶液，监测波长242nm，洗脱条件如表1所示。
表1实施例1制备型液相色谱洗脱条件
实施例2
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：将桢楠树根粉碎后，用超临界二氧化碳法提取，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向100 mL步骤（1）所得楠木提取物中加入100 mL正己烷充分溶解，再加入150 g柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱的顶端，加压挤出正己烷后，按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷:乙酸乙酯=30:1，洗脱体积1000 mL，除去后端杂质段1B-1；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积1200 mL，除去后端杂质段1B-2；
正己烷:乙酸乙酯=10:1，洗脱体积200-300 mL，收集洗脱液，得预浓缩溶液；
甲醇，洗脱体积1000 mL，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液用乙酸乙酯萃取后减压蒸馏，加入含1%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有1%硝酸银的硅胶的层析柱中，按照极性增加的顺序用不同体积比的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷，洗脱体积80 mL，除去前端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积150 mL，收集洗脱液，预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解后，采用制备型液相色谱分离纯化，分两次制备：第一次，以反相C18硅胶制备柱，乙腈/水混合溶剂梯度洗脱，除去后段杂质；第二次，以反相C18硅胶制备柱，甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，除去后段杂质，得高纯度沉香螺醇。
实施例2获得的沉香螺醇的纯度为95%。
实施例3
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取:将闽楠树干粉碎后，用超临界二氧化碳法提取，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向200 mL步骤（1）所得楠木提取物中加入200 mL石油醚充分溶解，再加入250 g柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱的顶端，并加压挤出石油醚，再按照极性增加的顺序用不同体积比的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
石油醚:乙酸乙酯=30:1，洗脱体积2000 mL，除去后端杂质段1B-1；
石油醚:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积2400 mL，除去后端杂质段1B-2；
石油醚:乙酸乙酯=10:1，洗脱体积500 mL，收集洗脱液，得预浓缩溶液；
甲醇，洗脱体积2000 mL，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液用石油醚萃取后减压蒸馏，然后加入含10%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有10%硝酸银的硅胶层析柱中，再按照极性增加的顺序用不同体积比的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
石油醚，洗脱体积100 mL，除去前端杂质段；
石油醚:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积200-300 mL，收集洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解，采用制备型液相色谱分离纯化，以反相C18硅胶制备柱，甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，分4次制备，除去后段杂质。
实施例3获得的沉香螺醇的纯度为96%。
实施例4
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：将闽楠树根粉碎，用95%(v/v)乙醇浸泡72 h，然后回流提取1 h，再超声振荡2 h，最后真空抽滤和旋转蒸发，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向350 mL步骤（1）所得楠木提取物中加入350 mL正己烷充分溶解，然后加入350 g柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱的顶端，并加压挤出正己烷，再按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷，洗脱体积20 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积5 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集洗脱液，得预浓缩溶液；
甲醇，洗脱体积10 L，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液用石油醚萃取后减压蒸馏，然后加入含6%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有6%硝酸银的硅胶层析柱中，按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积4 L，收集洗脱液；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集洗脱液；
合并收集的洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解后，采用制备型液相色谱分离纯化，重复制备5次，其中，液相色谱制备柱为ZBZ-34型C30柱，制备流动相为乙腈和1%(v/v)乙酸水溶液的不同体积比混合溶液，波长242nm，洗脱条件如表2所示。
表2实施例4制备型液相色谱洗脱条件
实施例4获得的沉香螺醇纯度为97.5%。
实施例5
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：首先将桢楠树根粉碎后，用95%(v/v)乙醇浸泡72 h，然后回流提取1 h，再超声振荡2 h，最后真空抽滤和旋转蒸发，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向350 mL步骤（1）所得楠木提取物取中加入350 mL正己烷充分溶解，然后加入350 g柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱的顶端，并加压挤出正己烷，再按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷，洗脱体积20 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积5 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集洗脱液，得预浓缩溶液；
甲醇，洗脱体积10 L，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）预浓缩溶液用乙酸乙酯萃取后减压蒸馏，然后加入含6%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有6%硝酸银的硅胶层析柱中，再按照极性增加的顺序用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱。采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积4 L，收集洗脱液；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集洗脱液；
合并收集的洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解，采用制备型液相色谱分离纯化，重复制备约3次，其中，液相色谱制备柱为ZBZ-34型C30柱，制备流动相为乙腈和1%(v/v)乙酸水溶液的不同体积比混合溶液，监测波长242nm，洗脱条件如表3所示。
表3实施例5制备型液相色谱洗脱条件
实施例5获得的沉香螺醇纯度为98.3%。
实施例6
一种分离沉香螺醇的方法，包括以下步骤：
（1）提取：首先将桢楠的木材粉碎后，用乙酸乙酯浸泡72小时，回流提取1h后，超声振荡2h，真空抽滤，旋转蒸发，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向步骤（1）所得楠木提取物350 mL，加入350 mL正己烷，充分溶解，再加入350 g柱层析硅胶，搅拌均匀后，倒入层析柱的顶端，加压挤出正己烷后，按照极性增加的顺序，用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷，洗脱体积20 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积5 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集天然沉香螺醇浓缩段；
甲醇，洗脱体积10 L，除去前段杂质；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液萃取和减压蒸馏后，加入含6%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后，倒入填充有6%硝酸银的硅胶层析柱中，按照极性增加的顺序，用不同体积比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱。采用的洗脱步骤和比例依次为：
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，除去后端杂质段；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积4 L，收集天然沉香螺醇预纯化物；
正己烷:乙酸乙酯=20:1，洗脱体积10 L，收集天然沉香螺醇预纯化物；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积的甲醇充分溶解，采用制备型液相色谱分离纯化，重复制备约5次，液相色谱制备柱为ZBZ-34型C18柱，制备流动相为乙腈和1%(v/v)乙酸水溶液的不同体积比混合溶液，波长242nm，洗脱条件如表4所示。
表4实施例6制备型液相色谱洗脱条件
实施例6获得的沉香螺醇纯度为99.1%。
试验例1
1. 实施例1步骤（1）中获得的楠木提取物的HPLC谱图如图1所示，HPLC谱图峰面积如表5所示。
表5楠木提取物的HPLC谱图峰面积
由图1和表5可知，步骤（1）中获得的楠木提取物中天然沉香螺醇的HPLC谱图峰面积为8.69%（序号58，保留时间为13.993 min）。
2. 实施例1步骤（2）中获得的预浓缩溶液的HPLC谱图如图2所示，HPLC谱图峰面积如表6所示。
表6 预浓缩溶液的HPLC谱图峰面积
由图2和表6可知，步骤（2）中获得的预浓缩溶液中天然沉香螺醇的HPLC谱图峰面积为30.31%（序号24，保留时间为13.419 min）。
3. 实施例1步骤（3）中获得的预纯化溶液的HPLC谱图如图3所示，HPLC谱图峰面积见如表7所示。
表7 预纯化溶液的HPLC谱图峰面积
由图3和表7可知，预纯化溶液中天然沉香螺醇的HPLC谱图峰面积为49.35%（序号6，保留时间为13.590 min）。
4. 实施例1分离获得高纯度沉香螺醇的方法获得的高纯度沉香螺醇的HPLC谱图如图4所示，HPLC谱图峰面积见如表8所示。
表8高纯度沉香螺醇的HPLC谱图峰面积
由图4和表8可知，高纯度沉香螺醇中沉香螺醇的HPLC谱图峰面积为95.1%（序号5，保留时间为11.743 min），实现了分离出高纯度天然沉香螺醇的目标。
5. 实施例1分离获得高纯度沉香螺醇的方法获得的高纯度沉香螺醇的1H-NMR及COSY谱分析如表9所示。
表9 高纯度沉香螺醇的1H-NMR及COSY谱分析
6. 实施例1分离获得高纯度沉香螺醇的方法获得的高纯度沉香螺醇的2D化学结构图如图5所示，其中编号1-15为含碳官能团；3D化学结构图如图6所示；13C-NMR及DEPT、HSQC、HMBC谱分析如表10所示。
表10 高纯度沉香螺醇的13C-NMR及DEPT、HSQC、HMBC谱分析
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (3)

1.一种分离沉香螺醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取：将桢楠或闽楠粉碎后，使用水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳提取法或溶剂提取法提取，得楠木提取物；
（2）预浓缩：向步骤（1）所得楠木提取物中加入溶解溶剂充分溶解，然后加入柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入层析柱，并加压挤出溶解溶剂，再按照极性增加的顺序用不同比例的混合溶剂进行洗脱，收集含有沉香螺醇的洗脱液，得预浓缩溶液；
（3）预纯化：将步骤（2）所得预浓缩溶液使用石油醚和乙酸乙酯中的至少一种萃取后减压蒸馏，然后加入含质量比1%-10%硝酸银的柱层析硅胶，搅拌均匀后倒入填充有含质量比1%-10%硝酸银的硅胶的层析柱中，再按照极性增加的顺序用不同比例的混合溶剂进行洗脱，收集含有沉香螺醇的洗脱液，得预纯化溶液；
（4）精制：向步骤（3）所得预纯化溶液中加入等体积甲醇充分溶解后，采用制备型液相色谱分离，得沉香螺醇；
所述溶解溶剂为石油醚、正己烷和乙酸乙酯中的至少一种；
所述混合溶剂为所述溶解溶剂与乙酸乙酯的混合溶液。
2. 如权利要求1所述的分离沉香螺醇的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，所述楠木提取物、柱层析硅胶和含质量比1%-10%硝酸银的柱层析硅胶的体积质量比为100 mL:100-150 g:100-150 g。
3.如权利要求1所述的分离沉香螺醇的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述制备型液相色谱分离，为以下方法中的一种：
（1）用乙腈与体积含量1%乙酸水溶液的混合溶液梯度洗脱，制备2-5次；
（2）先用乙腈/水混合溶剂梯度洗脱，再用甲醇/水混合溶剂梯度洗脱；
（3）用甲醇/水混合溶剂梯度洗脱。
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