CN115894515A - 一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，本发明提供一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，解决现有制备银杏提取物提取单一成分问题，本发明采用低共熔溶剂在超高压下，将银杏叶中有效成分同步提取，得到总提取物，然后将总提取物按照水溶性和脂溶性分离，再根据各成分的理化性质，逐一分离，层层推进，得到各个单一成分。本发明从全部产品的集成化提取分离考虑，从整体上发明了银杏叶中有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，不只是注重单个产品的提取分离。做到了银杏叶的“吃干榨尽”，是资源综合利用的价值取向。在追求资源“吃干榨尽”的同时，对生产过程中产生的废弃物，变废为宝，化害为利，以达到综合利用的目的，促使循环经济的发展，实现资源节约，环境友好的经济模式。

Description

一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法。

背景技术

银杏叶别称白果叶、飞蛾叶、鸭脚子，银杏科Ginkgoaceae银杏属Ginkgo银杏G.biloba，拉丁学名Ginkgobiloba。银杏为裸子植物，落叶乔木，雌雄异株，曾广泛分布于北半球，2亿5千多年前，侏罗纪恐龙掌控地球时，广泛分布在亚洲、非洲、欧洲、美洲、大洋洲，到了新生代的第三世纪末和第四世纪初，北半球进入冰川期，地球上不少动植物灭绝，银杏属植物在欧洲及北美完全绝种，只在我国幸存下来，汉末三国银杏盛植于江南一带，此后广植全国各地。17世纪末，一些欧美国家引进了银杏树。银杏树在我国除黑龙江、吉林、内蒙古、青海、西藏以外，北至沈阳，南至广州，都有银杏生长，我国大面积集中产区在山东与江苏交界处，江苏邳州、浙江、江西北部、四川、陕西南部、安徽南部、河南、湖南、湖北、广西和辽宁等，银杏叶年产量在2万吨以上。

1928年川村氏从白果肉中分离出白果酸、白果醇和白果酚；1933年古川氏研究出白果酸、白果醇和白果酚的结构式；1932年日本的古川周二从银杏叶中分离出银杏黄素等4种黄酮类化合物；1932年日本学者Furakawa首次从银杏叶中分离出4种银杏萜内酯，并用HNMR等技术对其结构和立体化学进行了研究；1941年中泽浩一分离出了银杏黄素并确定银杏黄素的分子式；BorKer等人从银杏黄素的混合物中分离出白果黄素和异银杏黄素两种双黄酮；1943年祝维章研究认为银杏对小白鼠有致惊厥的作用；1949年林传光等试验认为白果酸在试管中能抑制杆菌的生长，白果醇能促进分枝杆菌的生长；1957年曹仁烈报道了银杏水浸剂对癣菌有抑制作用，白果酚甲对离体兔肠有麻痹作用，使离体子宫收缩，对兔有暂短的降血压的作用；1966年德国科学家首先在银杏叶中发现含有通血脉和降低胆固醇的成分；1967年日本学者首先测定了银杏内酯系列化合物的结构；1983年周日秀对银杏双黄酮进行分离鉴定；1994年刘玲玲报道了银杏叶中西阿多黄素、银杏黄素、异银杏黄素和白果黄素等4种双黄酮；1995年游松进行了银杏内酯的分离与结构测定，1996年用薄层扫描法做了银杏叶中总黄酮苷的含量测定。20世纪80年代，法国科学家Brapuat发现了银杏叶的内酯成分有很强的拮抗血小板活化因子(PAF)的作用，随后银杏叶制剂作为第一个进入临床的PAF拮抗剂进行了三期临床观察，银杏叶制剂的研究和开发进入了一个新的领域；1991年，美国哈佛大学的学者因发现银杏内酯B的分子结构而荣获诺贝尔奖，至今在世界上同一种研究中，唯有银杏两次获诺贝尔奖。

20世纪70年代以来，随着银杏种植业的发展，国内外银杏加工业迅速崛起，诸多银杏制药企业致力于银杏叶提取物(GBE)的研发，且标准不断提高。欧洲和北美各国在加工提取物技术方面居世界领先，但由于资源缺乏，发展受到了制约。我国银杏加工业主要生产银杏药品、化妆品、保健品、食品和饮料及银杏提取物等，深加工水平不高，综合利用不足。德国史瓦伯制药集团和法国博福一益普生制药集团为了解决银杏叶资源问题，先后在法国西南地区和美国南卡罗莱纳州萨姆特分别建立银杏采叶园。我国在江苏、浙江、山东、安徽、江西、四川和湖北等省建立起大面积银杏采叶园。国际上将GBE的生产历程划分为4个时期：第1代只标定GBE的含量；第2代既标定GBE的含量还标定了提取物中黄酮苷的含量；第3代在第2代的基础上增加了内酯含量的标定；第4代明确指出要严格标示银杏内酯A、B、C及白果内酯的含量。当前对GBE产品的质量要求为：黄酮苷22～24％以上，银杏内酯2.5～4.5％以上，白果内酯2.0～4.0％以上，烷基酚酸10mg/kg以下。20世纪60年代末中国得到德国生产银杏叶制剂的信息才生产出“6911”，由于制备工艺及疗效问题，直到80年代国产银杏叶制剂才开始上市。

目前，国内银杏综合加工利用可划分为三大系列：①食用保健品系列：银杏汁、银杏罐头、银杏叶桃果汁、果冻、与白酒、黄酒、啤酒配制成银杏保健酒、银杏叶片、银杏叶茶、银杏叶粉、银杏口服液、银杏树糖果、银杏树糕点、银杏树果茶、银杏叶口香糖、巧克力糖、银杏树牛奶、银杏树豆浆，银杏树蜜、银杏叶可乐饮料和冲剂，以及保健蜜、保健乳和冰淇淋、银杏碳酸饮料、银杏非碳酸饮料、银杏含醇饮料、银杏固体饮料等，银杏叶粉可作为一些食品和饮料，如咖啡、口香糖、快餐面和巧克力糖等的添加剂。②化妆护肤保健品系列：护发乳、生发油、护肤膏、银杏叶保健枕头、减肥敷贴剂、银杏叶药垫、银杏叶背心、工艺品，以及减肥霜、减肥肥皂和减肥雪花膏。③医药品系列：银杏叶胶囊、舒血宁片、斯泰隆片、银杏天宝、地奥心血抗栓宁、络欣通、杏灵颗粒、华宝通、冠心酮、达纳康、静可敏、静可福、金纳多、杏丁注射液等，其剂型有银杏叶片、银杏叶分散片、银杏叶胶囊、银杏叶软胶囊、银杏叶丸、银杏叶滴丸、银杏叶颗粒、银杏露、银杏叶酊、银杏叶口服液等10多个剂型，被广泛用于防治心脑血管疾病，以及银杏叶生物农药和银杏叶兽药。含银杏叶的药品，如片剂、胶囊、口服液、滴剂、注射剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸、酊剂、分散片等琳琅满目。

心脑血管疾病是危害人类健康的头号杀手，我国有着得天独厚的银杏叶资源优势，德国、法国和瑞士等国大量收购我国的银杏叶，银杏叶系列产品的开发有着十分广阔的前景。将银杏叶制剂列为治疗药物的国家仅德国、法国和中国，其他国家均作为保健食品或非处方药。我国银杏叶产品的开发，目前仍处于初始阶段，银杏叶产品开发刚刚起步，有些还是空白，这些产品开发起来会消耗大量的银杏叶，也会进一步带动银杏种植业的发展。因此，我国银杏叶产品的开发蕴藏着巨大的潜力。

1.银杏黄酮

1.1化学成分

银杏黄酮类化合物都含有C15核，黄酮类化合物可分为黄酮苷、黄酮苷元、双黄酮、桂皮酸酯黄酮苷和儿茶素等几类。

①黄酮苷元山萘素、槲皮素、异鼠李素、洋芹素、木犀草素、杨梅槲皮素，它们的结构中含有5，7，4′-三羟基，3-OH若连接糖基，糖基可以是单糖、双糖、三糖，大多数为葡萄糖和鼠李糖；②双黄酮双黄酮即二聚体黄酮6种：阿曼托黄素、白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素、穗花杉双黄酮、5′-甲氧基白果黄素。分子结构皆以芹菜素3′、8″位碳链相连接而成的二聚体，含有1-3个甲氧基；③黄酮苷计20种，它们是山柰酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-7-O-葡萄糖苷、3′-O-甲基杨梅槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、3′-O-甲基杨梅槲皮素-3-O-芸香糖苷、杨梅槲皮素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-葡萄糖-2，6-二鼠李糖苷、槲皮苷、芦丁、苜蓿草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、5，7-二羟基-4′-甲氧基黄酮醇-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-(2″，6″-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-(2″，6″-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2″-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-(2″-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2″-(6″′-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖-2″-(6″′-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷等；④儿茶素类儿茶素类根据母核上2-位碳原子旋光性的不同及5′-位是否含有羟基分为儿茶素、表儿茶素、没食子酸儿茶素、表没食子儿茶素、4，8″-儿茶素没食子儿茶素、4，8″-没食子儿茶素等；⑤其他黄酮类化合物：原花青素和原翠雀素；⑥桂皮酸酯黄酮苷：桂皮素-3-鼠李糖-2-(6-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷、山柰酚-3-鼠李糖-2-(6-对羟基反式桂皮酰)’葡萄糖苷、槲皮素-3-鼠李糖-2-(6-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖-7-葡萄糖苷、槲皮素-3，鼠李糖-2-(6-对葡萄糖氧基-反式桂皮酰)-葡萄糖苷、山柰酚-3-鼠李糖-2-(6-对葡萄糖氧基-反式桂皮酰)-葡萄糖苷、莰菲醇-3-O-(2-O-)-{6-O-[对-(β-D-葡萄糖)-O-反式肉桂酰]-β-D-葡萄糖}-α-L-鼠李糖)、槲皮素-3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反式肉桂酰)-β-D-葡萄糖]-α-L-鼠李糖}和莰菲醇-3-O-{2-O-[6-O-(对-羟基-反式肉桂酰)-β-D-葡萄糖]-α-L-鼠李糖}等(中草药，2014，45，2552-2555；中草药，2013，44，2027-2034；西北药学杂志，2010，25，155-156)。黄酮类化合物结构式如下：

1.1.1单黄酮

1.1.2双黄酮

1.1.3儿茶素

1.2药理作用

银杏黄酮和银杏内酯提取物通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路和体内多组分过程改善脑缺血再灌注损伤(Phytomedicine，2022，99，154028-154028)。银杏黄酮对紫外线辐射诱导的皮肤成纤维细胞损伤具有保护和延缓光老化的作用(中国现代医生，2022，60，12-15)。银杏黄酮对于复发性阿弗他溃疡(RAU)大鼠外周T淋巴细胞亚群和白细胞介素-2的检测结果，可通过提升大鼠外周血T淋巴细胞水平和白细胞介素-2水平治疗RAU，进而可以降低RAU的复发率(中国医学工程，2021，29，14-17)。银杏黄酮苷元可通过上调DUSP1表达抑制雨蛙素诱导的AP腺泡细胞炎症反应，促进细胞凋亡(郑州大学学报(医学版)，2021，56，270-274)。银杏黄酮能够降低非酒精性脂肪肝大鼠脂质和炎症因子水平，减轻肝损伤(郑州大学学报(医学版)，2020，55，100-103)。银杏黄酮对缺血再灌注损伤大鼠脑组织有保护作用(卒中与神经疾病，2019，26，660-663)。高剂量的银杏黄酮能够抑制哮喘大鼠肺组织的HIF-1α和VEGF的表达，影响组织平滑肌的增殖及支气管壁的增厚，干预气道重塑(西部医学，2019，31，1674-1677+1684)。银杏黄酮可以抑制缺氧复氧诱导的H9c2细胞氧化损伤及凋亡的发生，在预防和治疗心肌缺血再灌注损伤疾病方面具有一定的应用前景(遵义医学院学报，2019，42，539-542+547)。使用银杏黄酮对胃癌模型大鼠进行干预，能够明显调控VEGF、Bcl-2、Bax表达水平，为胃癌的临床治疗提供一定的理论帮助(现代消化及介入诊疗，2019，24，245-248+253)。银杏黄酮能改善口腔溃疡大鼠的微循环状态，提高免疫功能，降低相关炎性因子水平，抑制口腔溃疡发生发展，且药物浓度越高治疗效果越好(中国临床药理学杂志，2019，35，253-256)。银杏黄酮能够调节机体抗氧化酶活性，提高大鼠学习记忆功能(山西医科大学学报，2019，50，1-14)。银杏黄酮可以抑制高糖诱导的人HMC细胞氧化损伤，对糖尿病肾病起保护作用(中国中西医结合肾病杂志，2018，19，43-44+97)。银杏叶活性成分银杏内酯和银杏黄酮通过干预BBB低氧模型RAGE及LRP1的表达，促进Aβ的外向转运，从而降低脑Aβ水平，延缓了阿尔茨海默病的进展(广东医学，2016，37，2389-2392)。银杏黄酮对MI/R损伤大鼠心肌具有保护作用，其作用机制可能与抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1表达有关，而与银杏黄酮剂量可能无关(实用心脑肺血管病杂志，2016，24，38-42)。银杏黄酮对化疗所致卵巢功能损伤的保护作用机制可能是升高机体内SOD水平，起到抗氧化清除自由基的作用(西部医学，2015，27，1306-1308)。

银杏黄酮在欧洲被广泛用于治疗痴呆，有助于防止或治疗阿兹海默症，提高思考、学习和记忆能力，对治疗冠心病、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病有神奇疗效，清除有害的氧化自由基，能停止或缓解某些视网膜病变；银杏黄酮明显地减轻月经前不快症状，特别是乳房疼痛和情绪不稳；银杏黄酮能使因扑洛扎克类药物及其它抗抑郁药物导致的性功能下降好，能改善阴茎末端血流循环不良导致的阳痿；银杏黄酮可减轻血胆固醇、三酰甘油和极低密度脂蛋白，减轻血脂，改善微循环，具有胰岛素的调节血糖的功能，从而减少胰岛素抗体、增强胰岛素的敏感性等效果。

1.3提取分离工艺

1.3.1离子液体提取

冯靖采用传统型离子液体1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐浓度0.75mol/L，超声功率66.0W，超声时间6.0min，微波时间2.0min，提取量可达49.91mg/g，新型离子液体1-丁基-3-甲基咪唑谷氨酸盐浓度0.75mol/L，超声功率69.0W，超声时间6.5min，微波时间2.0min，提取量可达41.42mg/g(冯靖，北京石油化工学院，2019年学位论文)。蒋永梅采用离子液体提取银杏叶中4种双黄酮最佳提取条件：离子液体浓度为0.15mol/L，固液比为1∶14g/mL，超声功率为280W，超声时间为25min，提取次数为3次，银杏叶中BIL提取率为2.44mg/g，GIN提取率为4.33mg/g(蒋永梅，遵义医科大学，2020年学位论文)。

1.3.2低共熔溶剂提取

李吉超选择提取剂为氯化胆碱/乙二醇摩尔比为1∶4，含水量20％，最终条件为：时间39min，温度65℃，液固比18mL/g，总黄酮提取量可达17.42mg/g，提取率为96.88％，采用大孔树脂吸附分离提取液中黄酮，筛选出AB-8大孔树脂对黄酮的吸附效果最好，进一步通过动态吸附实验确定了实验条件：在10g干重AB-8树脂条件下，粗提液体积为25mL，流速为1mL/min，分别使用20％乙醇30mL和80％乙醇50mL进行两梯度洗脱，经过干燥后得到产品中总黄酮的含量为28.56％，收率为84.87％(李吉超，北京化工大学，2020年学位论文)。姚金昊等采用氯化胆碱/甘油体系(摩尔比1∶2)为较优的NADESs，当银杏叶与NADESs固液比为1∶30.7(g/mL)，73.2℃下提取4.1h时，类黄酮理论得率可高达5.70％(食品工业科技，2020，41，181-186)。以低共熔溶剂/水混合物为绿色介质从银杏叶中高效提取生物活性黄酮，氯化胆碱/1，3-丁二醇(ChCl/B)、氯化胆碱/乙酰丙酸(ChCl/LA1)和1，2-丙二醇/乙酰丙酸(P/LA1)三种低共熔溶剂的萃取产率明显较高，优化后的提取条件为：以含40％(w/w)水的ChCl/LA1为溶剂，液固比10∶1(v/v)，50℃、150r/min搅拌15min提取银杏黄酮，在最佳工艺条件下，一次可从银杏叶粉末中提取99.87％的银杏黄酮(Chemical and BiochemicalEngineering Quarterly，2018)。

1.3.3超声微波辅助提取

冯靖采用微波法提取，微波时间2min，液料比20∶1(mL/g)，超声时间4min，超声功率228W的条件下，得到黄酮类化合物的最佳提取量为24.3095mg/g(食品研究与开发，2019，40，68-75)。于德涵等提取银杏叶中黄酮的最佳实验条件为乙醇浓度63％，提取时间32min，提取温度50℃，银杏叶中黄酮提取率为5.328％(广州化工，2020，48，64-67)。吴吴等研究了超声-微波协同萃取银杏叶黄酮与银杏内酯B的最佳提取工艺条件，银杏叶黄酮及内酯B的得率分别为2.25％和0.81％(中国酿造，2016，35，153-156)。徐春明等报道了微波辅助银杏叶干粉提取总黄酮的工艺，银杏叶总黄酮的提取得率为2.698％(林产化学与工业，2014，34，131-136)。

1.3.4酶解法

张杨洋等采用酶法提取银杏叶黄酮的最佳提取工艺为：在液料比为20∶1固定值的基础下，酶的添加量为0.16g(纤维素酶0.08g，果胶酶0.08g)，超声温度50℃，超声时间45min，乙醇体积分数60％，在此条件下黄酮的提取率为4.66％(中国食品添加剂，2020，31，70-75)。李保同采用纤维素酶-微波辅助提取，纤维素酶加量5％，酶解时间1h，50℃酶解，银杏叶总黄酮的提取率可达3.96％，是乙醇提取法提取银杏总黄酮提取率的2.6倍(林产化学与工业，2014，34，131-136)。石会军等采用纤维素酶提取银杏叶总黄酮，酶解温度80℃，纤维素酶质量浓度0.9％，酶解时间60min，银杏叶总黄酮的提取率高达3.452％(食品科技，2014，39，208-211)。王蕙等采用酶法提取银杏叶总黄酮，酶解温度为45℃，加入纤维素酶酶解2h，银杏叶总黄酮提取量为6.3676mg/g(辽宁中医药大学学报，2009，11，146-148)。李凤艳等采用复合酶法提取银杏叶总黄酮，酶用量0.4％，酶解温度40℃，酶解时间120min，pH值5.5，纤维素酶/果胶酶/半纤维素酶的配比2∶3∶1，总黄酮提取率提高了36.6％(中国现代中药，2018，20，1142-1145)。

1.3.5双水相提取

王晓军以银杏叶粉末为原料，采用超声辅助乙醇-硫酸铵双水相体系对银杏黄酮的提取工艺进行优化，最优工艺条件为：料液比1∶24(g∶mL)，乙醇体积分数79％，硫酸铵质量分数0.15g/mL，超声功率143W，超声时间40min，银杏黄酮得率在此条件下可达到1.703mg/g(广东化工，2020，47，4-6)。刘宝亮等采用离子液体[C4mim]Br与硫酸铵形成的双水相体系提取银杏黄酮，离子液体质量分数为35.09％，硫酸铵质量分数为27.94％，银杏叶黄酮的预测提取率可以达到1.65％(中国食品添加剂，2018，29，110-117)。刘荣强等研究了银杏叶黄酮在聚丙二醇(PPG)400-(NH₄)₂SO₄双水相体系中的分配情况，最佳萃取条件为pH值6，PPG400质量分数25％，硫酸铵质量分数15％，黄酮萃取率达到98％以上(化学研究与应用，2016，28，1763-1767)。

1.3.6树脂法

邱福祥等确定HPD450为适宜树脂，吸附率为98.87％，解吸率为71.52％，适宜工艺参数为：常温2BV/h上柱吸附，提取液按体积稀释1倍上柱吸附，洗脱流速为3BV/h，用50mL体积浓度80％乙醇洗脱，得到总黄酮得率86.1％，纯度为34.2g/100g(食品工程，2018，(4)，43-48)。李凤艳等确定LX-68大孔树脂纯化银杏叶黄酮的最佳工艺条件为：提取液pH值4.0，上柱流速为2BV/h，先以4BV10％乙醇洗脱杂质，再用70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，银杏叶提取物总黄酮含量达27.3％(化学与生物工程，2018，35，34-37)。赵文龙确定AB-8大孔吸附树脂精制银杏黄酮的最佳工艺参数为：先用浓度为20‰乙醇洗脱，再用80％乙醇洗脱，可得含量35.1％的银杏黄酮提取物，其收率为82.7％；银杏黄酮提取液上样于聚酰胺树脂柱，先用10％乙醇洗脱，再用60％乙醇洗脱，可得含量56.8％的银杏黄酮提取物，其收率为79.7％；树脂联用纯化银杏黄酮的最佳工艺参数为：使用乙醇水溶液作为洗脱液，先经AB-8树脂两梯度洗脱，第一次洗脱的洗脱液浓度为15％，第二次洗脱浓度为70％，后经聚酰胺树脂两梯度洗脱，第一次洗脱的洗脱液浓度为10％，第二次洗脱浓度为60％，可得含量73.6％的银杏黄酮提取物，收率为64.0％(北京化工大学，2018年学位论文)。方同华等将银杏提取液加入到大孔树脂柱中，用1～3BV的纯化水以1.2～2.5BV/h的流速冲洗大孔树脂柱，用2～4BV的10％乙酸钠溶液以1.0～4.0BV/h的流速冲洗大孔树脂柱，用纯化水以1.0～3.0BV/h的流速将大孔树脂柱冲洗至中性，用1～3BV的25％乙醇以1.0～3.0BV/h的流速冲洗大孔树脂柱，用2～6BV的30～60％乙醇以1.0～2.0BV/h的流速冲洗大孔树脂柱，收集洗脱液，得到银杏叶提取物(CN105267257A)。

1.3.7表面活性剂协助泡沫分离

焦萌利用表面活性剂增溶及捕获的双重作用提取富集银杏黄酮，并通过大孔树脂吸附技术对其分离纯化，确定了SDS为表面活性剂增溶剂，最佳工艺下浸提液中银杏黄酮浓度为1.13mg/mL；泡沫分离富集银杏黄酮的最佳工艺条件下，银杏黄酮的富集比和回收率分别提高到5.82和76.25％；S-8型树脂动态吸附/脱附银杏黄酮，脱附液中银杏黄酮的纯度为27.5％(河北工业大学，2015年学位论文)。刘萌对溶剂气浮法分离富集银杏叶黄酮进行了研究，以正辛醇为气浮溶剂、正辛醇与料液体积比1∶10，表面活性剂SDBS浓度100mg/L，料液pH值3.0，气速100mL/min，气浮时间60min为最佳操作条件，黄酮类化合物的富集比与回收率分别为5.73和59.76％(过程工程学报，2009，9，28-32)。修建东等将银杏叶浸出液经氨基酸类乳化剂产生泡沫进行浮选，得黄酮类化合物等的浓缩液(CN103990292A)。

1.3.8色谱法

范丛山等利用模拟移动床从银杏叶黄酮提取物分离黄酮化合物，取适量银杏叶黄酮提取物将其配制进料液，进入四区模拟移动床系统分离(CN108239059B)。兰捷将总黄酮粗品甲醇溶解，过滤，得到的滤液经过硅胶柱层析，洗脱，得到高纯度总黄酮(CN104940253A)。丰加涛等采用二维液相色谱-质谱联用技术，以甲醇-水或乙腈-水为流动相，以反相C18色谱柱为一维制备色谱柱，对银杏叶提取物进行组分切割，得到高纯度的山奈酚-3-O-芸香糖苷，纯度可以达到80％以上(CN103113436A)。于孟飞等将银杏叶提取液上酸性氧化铝柱，再用含乙酸的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥(CN106109511A)。邹其芃将银杏叶提取液用连续色谱分离系统分离，洗脱液浓缩，干燥得到产品低酸银杏叶提取物(CN104208108A)。

1.3.9膜分离

李志平等采用截留相对分子质量依次为30000、10000、5000的陶瓷膜组成梯度膜装置，在压力0.25MPa、温度30℃、时间120min条件下进行分离纯化，黄酮透过率为94.22％，产品中黄酮含量为45.60％(中国油脂，2021，46，131-134)。王成章等采用提取液先进行石英沙过滤，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0-1.5μm，离心转速为3000～6000rpm，将上述滤液通过0.1～0.8μm孔径的陶瓷膜，截留相对分子质量为5000～50000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100～300的纳滤膜进行浓缩，经大孔树脂吸附，流出液减压浓缩，浓缩液进行负压微波喷雾干燥或真空冷冻干燥，得到低酸型银杏提取物，银杏黄酮＞28％，内酯＞8％，银杏酸≤1ppm(CN103961381A)。

1.3.10蒸汽爆破提取

张兵兵等采用蒸汽爆破技术对银杏叶提取黄酮类物质，与传统有机溶剂提取法相比，蒸汽爆破预处理使提取率提高了2.1倍(纤维素科学与技术，2012，20，43-48)。

1.3.11金属离子络合法

张静利用黄酮与金属形成络合物的特性，最佳络合反应发生的pH9.5，合成的黄酮与金属的络合物在以EDTA为解络合剂，以30％乙醇水溶液为反应液中进行解离反应，得到游离的黄酮和EDTA-Zn络合物，最后用甲醇将两者分离，金属络合反应离心后清液经过乙酸乙酯萃取法可以得到含量大于80％的银杏内酯产品(江南大学，2010年学位论文)。

1.3.12改性凹土吸附

尹秀莲等采用改性凹土吸附银杏叶总黄酮，壳聚糖改性凹土对银杏叶总黄酮有较大的吸附量112.70mg/g，解吸率为91％，纯度为56％(食品科学，2010，31，47-50)。吴迪将银杏叶提取浸膏和去离子水混合均匀成混合液，再用氯仿萃取，氯仿萃取液减压浓缩，与凹凸棒土与石油醚按固液比2∶1混合均匀，并使用其制成高为2～3m的过滤槽，将上述银杏叶总黄酮粗品提取液从过滤槽顶部流入，收集过滤槽底部流出的液体，使用三氯甲烷淋洗上述过滤后的过滤槽3～5次，去除洗脱剂回收溶剂，减压过滤，浓缩，干燥，即得银杏叶总黄酮提取物(CN106074630A)。

1.3.13高压提取

许静等利用高压技术对黄酮提取量的影响进行研究，并通过SEM分析等对提取机理进行探讨(食品科技，2008，33，221-223)。于荣雪将银杏叶和75～85％的乙醇混合，加入pH值4～5的稀盐酸，搅拌均匀浸泡，转至提取器中，用加压泵加压至0.4～0.5Mpa压力，升高温度为78～80℃，保温保压提取40～50min(CN105193871A)。

1.3.14超临界流体萃取

雍技将传统的液-液浸提与先进的超临界流体萃取结晶技术相结合，将30％左右的银杏黄酮原料经过一次浸提和一次超临界流体萃取结晶处理后，得到了80％的银杏黄酮产品(合肥工业大学，2005年学位论文)。

1.3.15负压沸腾提取

周昊等对银杏叶采用负压提取，最佳工艺条件为提取压力-0.08MPa，与传统提取法相比，负压沸腾提取温度降低了30℃，提取时间减少了42％(东北林业大学学报，2015，6，128-132)。石灵高采用解吸-减压内部沸腾法提取银杏总黄酮，最佳工艺条件为：在0.067MPa压力及60℃下提取两次，每次5min，银杏总黄酮的得率2.55％，与传统的乙醇提取比较，温度降低了20℃，提取速度仍然快12倍，乙醇用量减少3倍，经过HP-20大孔树脂吸附分离，银杏总黄酮的纯度可以达到29.8％(广西大学，2012年学位论文)。

1.3.16闪式提取

曾思漫等采用闪式提取银杏叶黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶15(g∶mL)，乙醇体积分数70％，提取时间40s，在此提取条件组合下所得银杏叶黄酮的提取率最高为3.99％(农产品加工，2021，17，36-38+42)。赵宏等采用乙醇体积分数为60％，闪式提取时间30s，料液比1∶20时，银杏叶总黄酮的提取率最高为1.99％(时珍国医国药，2013，24，1852-1853)。

1.3.17分子印迹技术

向文艺采用了沉淀聚合法合成印迹分子，在PAN50KD-PES10KD超滤后的滤液经2-VP为功能单体合成的聚合物吸附后效果最佳，能进一步提纯至98％(北京林业大学，2012年学位论文)。

2.银杏内酯

2.1化学组成成及结构

银杏内酯(ginkgolide)化合物属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和6个5元环，包括一个螺(44)壬烷，一个四氢呋喃环和3个内酯环，是银杏叶中重要的活性成分。银杏内酯对于治疗哮喘、器官移植排斥反应，以及多种失眠症等有较好的作用，含白果内酯的药物可以治疗脑病、脊髓病、脑水肿和神经病。20世纪80年代科研人员发现，银杏叶中的银杏内酯为血小板活化因子(PAF)拮抗剂，主要作用于中枢神经系统，可以改善脑组织行为失调，阻止脑损伤，对缺血损伤、抗炎、抗休克和对气管过敏性的保护及对器官移植排斥的保护作用，这一发现成为近20年来德国、日本、美国和法国等国家研究的热点。银杏叶中内酯类物质的总含量最高的约0.3％，在特殊条件下可超过0.5％，最低的只有0.0003％。白果内酯(bilobalide；BB)属倍半萜内酯，是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物。银杏内酯A(ginkgolide A；GA)、银杏内酯B(ginkgolide B；GB)、银杏内酯C(ginkgolide C；GC)、银杏内脂M(ginkgolide M；GM)、银杏内脂N(ginkgolide N；GN)、银杏内脂K(ginkgolide K；GK)和银杏内脂J(ginkgolide J；GJ)为二萜类化合物，其差别在于含有的羟基数目和羟基连接的位置不同，常见代号BN52020、BN52021、BN52022、BN52023和BN52024分别代表银杏苦内酯A、B、C、M、J。结构式如下：

I中：

II中：

银杏内酯A(GinkgolideA)，中文别名：银杏苦内酯A，分子式：C₂₀H₂₄O₉，分子量：408.40，CAS号：15291-75-5。银杏内酯B(Ginkgolide B)，中文别名：白果苦内酯B，1β-羟基银杏内酯A，分子式：C₂₀H₂₄O₁₀，分子量：424.40，CAS号：15291-77-7。银杏内酯C(GinkgolideC)，中文别名：白果苦内酯C，1β，7β-二羟基银杏内酯A，分子式：C₂₀H₂₄O₁₁，分子量：440.40，CAS号：15291-76-6。银杏内酯J(Ginkgolide J)中文别名：白果苦内酯J，分子式：C₂₀H₂₄O₁₀，分子量：424.40，CAS号：15291-78-8。银杏内酯M(Ginkgolide M)，化学名：Ginkgolide A，3-deoxy-1，7-dihydroxy-，(1α，7β)-CAS号：15291-78-8，分子式：C₂₀H₂₄O₁₀，分子量：424.40。银杏内酯K(Ginkgolide K)，分子式：C₂₀H₂₂O₉，分子量：406.38，CAS号：153355-70-5。白果内酯(Bilobalide)，中文别名：银杏内酯BB，分子式：C₁₅H₁₈O₈，分子量：326.30，CAS号：33570-04-6。白果内酯结构式如下：

2.2药理作用

银杏内酯注射液辅助阿替普酶静脉溶栓治疗大动脉粥样硬化性AIS患者可提高疗效，减轻对凝血功能影响，并能降低炎性因子水平，加快神经功能、运动功能恢复(临床研究，2021，29，80-82)。银杏内酯注射液联合乌拉地尔治疗急性高血压脑出血，可减小脑血肿体积，改善血脑屏障功能，抑制炎症和应激反应，安全有效(中外医学研究，2021，19，168-171)。通窍化栓汤联合银杏内酯注射液可改善风痰瘀阻型急性脑梗死患者的脑血管血流动力学、凝血功能及ET、NO水平，降低GMP-140、PAF、HMGB1、MMP-9水平(临床医学研究与实践，2022，7，113-116)。银杏内酯A可减轻中性粒细胞为主的哮喘小鼠气道周围炎症及氧化应激过程，其作用机制与p38丝裂原激活蛋白激酶通路有关，可作为中性粒细胞为主的哮喘的有效治疗药物(临床肺科杂志，2021，26，45-50)。银杏内酯B对糖尿病大鼠心脏具有保护作用，可能通过调控TGF-β₁/Smads信号通路抑制心肌纤维化(中西医结合心脑血管病杂志，2022，20，1399-1403)。银杏内酯B可通过调控MMP9/STAT3通路抑制肺癌细胞A549恶性生物学行为(中医药信息，2022，39，19-23+28)。银杏内酯B能够显著降低抑郁样行为大鼠体内炎症反应和氧化应激，从而缓解大鼠抑郁状态(广西医科大学学报，2021，38，2306-2312)。银杏内酯B对癫痫模型大鼠具有抗痫和脑组织保护作用，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路进而抑制氧化应激和细胞凋亡有关(江苏中医药，2021，53，76-80)。银杏内酯B能更有效地降低血清IL-6水平，抑制急性脑梗死患者血清中炎性反应，有效改善脑血流，促进患者神经功能的恢复(中国老年学杂志，2021，41，4360-4362)。银杏内酯B对糖尿病大鼠肝脏具有保护作用，可能与激活Nrf2/HO-1信号通路进而抑制氧化应激有关(陕西中医，2021，42，1005-1009)。银杏内酯C能增加左心室内压力差，增强心肌的收缩和舒张功能，而对心率没有影响，对心脏具有一定程度的正性肌力作用(临床医药实践，2013，22，524-526)。银杏内酯J通过抑制p38-依赖的pro-炎症介质的产生来保护人滑膜细胞SW982(Molec ular MedicineReports，2021，24，1-7)。银杏内酯J有较强的杀菌或抑菌作用，对枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和绿脓杆菌等均有作用。银杏内酯N能拮抗谷氨酸导致的PC12细胞损伤，银杏内酯N对PC12细胞缺血样损伤有显著的保护作用，银杏内酯N对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用(中药材，2015，38，1694-1698)。银杏内酯N可对抗H₂O₂的神经毒性，其机制与调节凋亡相关基因及蛋白的表达有关(中国老年学杂志，2017，37，3656-3658)。银杏内酯K可多效应减少缺血性脑卒中诱导的神经血管单元损伤，其机制可能与针对不同细胞HIF-1α调节作用不同有关(中国药理学通报，2021，37，645-652)。银杏内酯K通过PI3K/Akt/mTOR信号通路上调VEGF表达促进脑血管生成，改善小鼠缺血性卒中(神经疾病与精神卫生，2020，20，168-174)。白果内酯抑制炎症并促进星形胶质细胞中Aβ降解酶的表达，以挽救AD模型中的神经元缺陷(Tran slational Psychiatry，2021，11，542-542)。白果内脂可通过NLRP3通路抗炎机制达到胃溃疡的保护作用(世界华人消化杂志，2022，30，77-87)。

2.3银杏内酯提取分离方法

2.3.1亚临界水提取

李文东等采用亚临界水提取银杏叶中银杏内酯，提取温度180℃，料液比(g/ml)为1∶25，提取时间30min，提取次数为3h，银杏内酯的提取率为0.4623％(山东农业大学，2017年学位论文)。

2.3.2萃取法

肖志勇等取银杏叶提取物加水溶解，加入乙酸乙酯或乙酸甲酯或二者的混合溶液进行萃取，合并萃取液，减压浓缩回收溶剂至干，即得银杏总内酯提取物，银杏总内酯提取物用溶剂加热溶解，再冷却静置析晶，抽滤，滤饼用溶剂洗涤后，烘干得银杏总内酯粗品，粗品用乙酸乙酯、乙酸甲酯或二者的混合溶液，加热回流至完全溶解，减压浓缩至有结晶析出，静置析晶，抽滤，滤液浓缩至干得到银杏内酯化合物富集物(CN108383852B)。巴卫松等将银杏叶提取液调整pH值4.5～5.0，加入等体积的体积比为3∶1～6∶1的乙酸乙酯与石油醚混合溶液或乙酸乙酯与正庚烷混合溶液进行萃取，有机相依次使用水和饱和氯化钠溶液进行洗涤，洗涤后的有机相进行浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物，重结晶，得到精制银杏内酯(CN105541861A)。

2.3.3超临界流体CO₂萃取

郭庆宇等选择适当的夹带剂，用高压泵在超临界萃取时匀速加入萃取相中，可以改善超临界CO₂流体的极性特征，在适当的温度、压力条件下，银杏叶中的银杏内酯B更易于被萃取，可得到银杏内酯B含量较高的银杏叶提取物(中国石油和化工标准与质量，2020，40，109-112)。张晴晴等采用超临界流体CO₂萃取银杏叶中银杏内酯，此工艺条件下的萃取率可达5.14％(化工设计通讯，2017，43，115-116)。

2.3.4大孔吸附树脂

周严严等研究了HPD-100大孔树脂分离纯化银杏总内酯的工艺：上样量52.5mg/g湿树脂，上样浓度3.5mg/mL，流速为4BV/h，以4BV 10％的乙醇除杂，10BV的pH值6的50％乙醇4BV/h流速洗脱(中华中医药杂志，2016，31，4766-4769)。李雪峰等选择聚酰胺树脂，最佳上样提取物质量与柱体积比1∶50，洗脱溶剂为纯化水，径高比为1∶6，洗脱量2.5倍柱体积，银杏总内酯纯度达到70％以上(药学与临床研究，2015，23，344-346)。张国松等采用DA201型大孔吸附树脂为纯化树脂，上样吸附6h后用10柱体积30％乙醇洗脱，可得到GA和GB总含量达70％以上的提取物(中华中医药杂志，2015，30，1071-1075)。张必荣等将银杏叶提取压滤液上层析柱，流速为1～1.5BV/h，收集流出液，用2～3BV的纯水洗脱层析柱至颜色透亮，不再有浑浊，再用80％甲醇洗脱2.5～3BV，收集80％醇洗脱液并浓缩，浓缩至比重为1.02，喷粉(CN106176839A)。秦勇等采用聚酰胺树脂吸附，用纯化水洗脱，得到银杏内酯粗品，结晶后的母液，减压浓缩后用中等极性有机溶剂萃取，有机相合并后减压浓缩，浓缩液挥干溶剂，残渣用含水乙醇结晶，得到白果内酯粗品，银杏内酯和白果内酯粗品用含水乙醇重结晶，可以分别得到银杏内酯A、B、C及白果内酯单体化合物(CN102911185A)。

2.3.5超声-微波辅助提取

朱兴一等采用微波辅助提取银杏叶萜类内酯，辐射时间为8min，微波功率为500W，萜类内酯提取率可达1.620mg/g，与传统加热回流提取相比，微波辅助提取得到的萜类内酯提取率高出31％，溶剂用量减少33％，提取时间大大缩短(高校化学工程学报，2009，23，1080-1083)。

2.3.6柱色谱

杜月采用正相硅胶色谱法、重结晶、反相硅胶色谱法串联工艺，对该工艺过程主要参数进行考察，确定最优工艺∶取正相硅胶柱色谱径高比1∶10，吸附比1∶50，依次用二氯甲烷∶甲醇(40∶1，v/v)洗脱5个柱体积，二氯甲烷-甲醇(35∶1，v/v)洗脱5个柱体积，收集合并含GA、GB、GC和BB的流分，将得到的流分溶于50％的丙酮重结晶，此时总内酯含量达到80％以上，回收率达到60％(上海中医药大学，2019年学位论文)。苏静将银杏叶萃取液经D101大孔吸附树脂纯化，得总黄酮粗提物，总黄酮含量大于24％；再利用HSCCC从总黄酮粗提物中分离得到了槲皮素单体，最高纯度达98.6％；采用循环HSCCC法再次分离，循环三次后，异鼠李素和山奈酚达到了很好的分离，得到两者的单体，最高纯度均在97％以上；银杏叶烘干粉碎，经25％乙醇热提取，醋酸乙酯萃取，D-101大孔吸附树脂柱和pH值4.0的Al₂O₃柱纯化，得总内酯粗提物，总内酯含量达44.98％，经HSCCC分离得到白果内酯和银杏内酯A、B单体，最高纯度分别达98.3％、98.9％和98.8％；收集含银杏内酯C和杂质的馏分浓缩后作为样品，再次经HSCCC分离得到银杏内酯C单体，最高纯度达98.4％(西南大学，2010年学位论文)。林德良将乙醇溶解银杏叶提取物过酸性氧化铝柱，洗脱，浓缩，得总银杏内酯粗品，向总银杏内酯粗品加入纯水，过滤，收集滤饼，干燥，重结晶得银杏内酯B(CN104817570A)。郑向炜等采用硅胶柱色谱制备法结合重结晶工艺制备高纯度银杏内酯，湿法装柱，干法上样，二氯甲烷-甲醇洗脱，结晶，可获得纯度≥80％的银杏总内酯结晶产物，总转移率为55.4％(中国医药导报，2018，15，36-39)。孙步祥等将银杏内酯溶解，过聚酰胺柱，将流出液再过HP-20大孔树脂柱，用去离子水清洗树脂至流出液体为无色，再用浓度为75～85％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得银杏内酯B产品，含量可达95％以上(CN101054384)。

2.3.7酶法提取

戴余军等采用超声波辅助酶法提取银杏叶总内酯，半纤维素酶的质量浓度为0.7％，酶解温度为50℃，酶解时间为90min，超声功率为420W，超声时间为10min，银杏叶中总内酯提取率达到0.5354％(食品科技，2014，39，244-248)。

2.3.8化学反应法

孙焱辉等将银杏浸膏粉碱溶加热，调pH值7～9，使GA、GB开环变形成活化GA、GB，在含有活化GA、GB的碱溶溶液中加入盐酸，调pH值2.0～2.5，冷却分离出溶液和不溶杂质，在溶液中加入氢氧化钠调pH值4～6左右，使活化GA、GB和杂质结合成GA结合体和GB结合体，形成粗晶沉淀，用乙醇热溶粗晶，分解出GA、GB，经重结晶得成品，经检测GA含量22.95％，GB含量76.15％，总银杏酸未检出(CN106496246A)。李大雄等将银杏内酯B溶于有机溶剂得溶液，所得溶液中加入氟化剂进行脱水反应，经分离纯化得到银杏内酯K(CN105001231A)。崔龙等以银杏内酯B为原料，得到银杏内酯K的最佳制备工艺条件为：投料比(银杏内酯∶二乙氨基三氟化硫)1∶4.5，反应溶剂用量比(银杏内酯∶二氯甲烷)1∶30，反应时间20min，反应温度4℃(中国医药导报，2019，16，49-52)。

3.银杏叶烷基酚类化合物

3.1化学组成及结构

银杏叶中烷基酚酸类物质约占银杏叶干重的1～2％，主要由银杏酸、白果酚和白果二酚组成。各化合物结构与生漆中的致敏物质漆酚类似，是致敏的根源，其中烃基上的双链越多越易致敏。银杏叶中酚酸有7种，原儿茶酸、P-羟基苯酸、香草酸、咖啡酸、P-香豆酸、阿魏酸和绿原酸。

3.1.1银杏酚酸

银杏酸是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物，六位上的侧链碳原子数可从13～19，侧链双键数可为0～3，因此，银杏酸是一混合物，侧链R为C₁₃H₂₇、C₁₅H₃₁、C₁₅H₂₉、C₁₇H₃₃和C₁₇H₃₁等的银杏酸可分别以C13∶0、C15∶0、C15∶1、C17∶1和C17∶2等表示。银杏酸由白果新酸(ginkgonelic acid)、白果酸(ginkgolic acid)、氢化白果酸(hydroginkgolic acid)、氢化白果亚酸(hydroginkgolinic acid)、白果二酚(bilobols)等组成。结构式如下：

C13∶0 R：(CH₂)₁₂CH₃

C15∶1 R：(CH₂)₇-CH＝CH-(CH₂)₅CH₃

银杏酸(C13∶0)，中文别称：白果新酸，英文名称：Ginkgolic Acid，分子式：C₂₀H₃₂O₃，分子量：320.47，CAS号：20261-38-5；银杏酸(C15∶0)，分子式：C₂₂H₃₆O₃，分子量：348.52，CAS号：16611-84-0；银杏酸(C15∶1)，分子式：C₂₂H₃₄O₃，分子量：346.50，CAS号：22910-60-7；银杏酸(C17∶1)，中文别名：白果酸，分子式：C₂₄H₃₈O₃，分子量：374.56，CAS号：111047-30-4；银杏酸(C17∶2)，英文名称：Ginkgolic Acid，分子式：C₂₄H₃₆O₃，分子量：372.54，CAS号：102811-39-2。

3.1.2银杏酚和白果二酚

银杏酚结构式如下：

谭卫红等介绍了银杏叶中烷基酚化合物的分离过程，并鉴定出烷基酚化合物单体3类6种，其中银杏酸类化合物2种，白果酚类化合物3种，白果二酚类化合物1种为：3(8-十五碳烯基)苯酚、3[4(Z)，7(Z)十七碳二烯基]苯酚、3(10-十七碳烯基)苯酚、6(8-十五碳烯基)水杨酸、6(10-十七碳烯基)水杨酸和5(8-十五碳烯基)间苯二酚(林产化学与工业，2001，21，1-6)。刘盼君采用高效液相制备色谱法分离银杏酚同系物，制备银杏酚单体，分离得到了六个银杏酚单体，依次鉴定为：3-十三碳烷基苯酚、3-[8(Z)]十五碳烯基苯酚、3-[9(Z)，12(Z)]十七碳二烯基苯酚、3-十五碳烷基苯酚、3-[10(Z)]十七碳烯基苯和3-[12(Z)]十七碳烯基苯酚(江苏大学，2016年学位论文)。

3.2药理作用

银杏酚酸可能通过ERK-JNK-AKT途径诱导前列腺癌细胞p53依赖性凋亡(山西医科大学学报，2022，(05)，532-542)。银杏酚酸具有良好的体外抗肿瘤活性(化学研究与应用，2022，34，842-849)。10％银杏酚酸SC对甜瓜白粉病具有良好防效，最佳使用剂量为16g/667m²，防效优于80％多菌灵WP，且对甜瓜生长安全，是防治甜瓜白粉病较理想的生物药剂之一(中国果菜，2018，38，43-46)。在银杏酚C17∶1与顺铂联合治疗肝癌的过程中，银杏酚C17∶1能通过调控化疗细胞的自噬与凋亡增强顺铂的抗肿瘤活性，同时还能增强机体免疫力，保护正常肝细胞免受顺铂造成的损伤(刘俊，江苏大学，2017)。银杏酚酸IIIc选择性抑制高表达COX-2的结肠癌细胞的增殖(江苏科技信息，2016，29，46-49)。GPAA对SACC-83的增殖有抑制作用，且与浓度呈正相关。银杏酚酸对SACC-83的生长具有抑制作用，并可诱导细胞凋亡(全科口腔医学电子杂志，2015，2，110-111)。银杏酚酸可能通过抑制PkD-2蛋白质磷酸化途径诱导Tca8113程序性死亡，增加癌细胞对化疗药物的敏感性(国际口腔医学杂志，2011，38，268-273)。银杏酸微乳剂5mg/kg对白菜炭疽病、黄瓜枯萎病、甘蓝黑斑病、茄子白绢病和茄子立枯病等5种病菌菌丝的抑菌率分别为96.7％、93.0％、100.0％、100.0％和100.0％，银杏酸微乳剂10mg/mL以上对5种病原菌菌丝的抑菌率均达到100.0％。六个银杏酚单体的抗肿瘤活性大小依次为C15∶1-Δ8＞C17∶1-Δ10＞C17∶2-Δ9，12＞C17∶1-Δ12＞C15∶0＞C13∶0。银杏酸(C13∶0)有较强的杀菌或抑菌作用，对枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和绿脓杆菌等均有作用，防治老年痴呆，抗抑郁。白果酸具有降低血清胆固醇的作用，能使磷脂和胆固醇的比例趋于正常，用于治疗心绞痛。香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸可促进胃液和胆汁的分泌；香豆酸、香草酸和咖啡酸有抗菌、消炎的作用；原儿茶酸具有抗真菌作用；绿原酸还有刺激神经中枢系统的作用。酚酸(毒八角酸、儿茶素、白果酸、氢化白果酸、白果二酚、白果酚)、氢氰酸、组胺等。银杏酚具有具有抗菌、抗寄生物、抗肿瘤和良好的抗肿瘤活性和热稳定性等多种生理活性，银杏酚促进脑部血液循环，对胃肠粘膜有刺激作用，吸收后可作用于神经系统，使中枢神经先兴奋后抑制，还可引起末梢神经障碍。银杏酚对茄子白绢病菌抑制作用较强，银杏酚属于低毒生物药剂，防治菜蚜效果理想，是目前无公害蔬菜生产中，用于防治菜蚜较好的生物农药。银杏酸的微波降解主要产物为银杏酚，同时也产生了银杏酚的二聚物。

3.3提取分离

3.3.1有机溶剂提取

于秋菊等采用提取溶剂为68％乙醇、料液比为50mg/mL、微波功率310W、微波辐射时间为1min、提取温度为60℃、提取时间为60min，银杏酚酸总提取量为16.02±0.14mg/g(化学研究与应用，2022，34，842-849)。陈晓英等采用石油醚回流提取，80％的碱性甲醇溶液萃取，70％盐酸溶液调pH值3～3.5，石油醚再萃取，浓缩即得银杏酸流浸膏，浸膏中银杏酸总酸的含量可达95.0％以上(福建教育学院学报，2019，20，126-128)。张玲玲等将银杏叶提取物或其制剂适量加入乙酸乙酯或环己烷或甲苯或氯仿加热回流，滤液减压回收溶剂至干，加水溶解，用石油醚(60～90℃)或正己烷或氯仿萃取，萃取液蒸干(CN101757049A)。

3.3.2树脂法

刘欣采用乙醇回流法提取银杏酸，得率为1.66％；微波提取银杏酸，得率为1.57％(西北农林科技大学，2013年学位论文)。姚建标用石油醚回流提取，提取液浓缩，经小孔吸附树脂纯化再经反相中压制备柱分离富集，经乙腈-水系统多次重结晶，采用制备液相进行分离纯化，制得银杏酸单体C13∶0、C15∶1、C17∶1、C15∶0和C17∶29.29g，纯度均大于98％(浙江大学，2013年学位论文)。

3.3.3硅胶色谱法

马景哲采用石油醚(60～90℃)常温浸泡提取银杏酸，硅胶柱色谱，回收率达87.46％；银杏酸单体以制备型液相分离，得到6种银杏酸单体，首次实现了6-(8-十七碳烯基)水杨酸(C17∶1)顺反异构体的分离，测定的纯度C13∶0，99.65％；C15∶1，99.84％；C17∶2，99.78％；C15∶0，99.76％；顺式C17∶1，99.65％；反式C17∶1，99.75％(北京化工大学，2011年学位论文)。赵云奎用乙醇进行回流提取，所得浸膏用石油醚萃取，然后对石油醚萃取物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，将主要含银杏酚酸的组分再次进行硅胶柱层析，梯度洗脱，合并得到银杏酚酸分离物，银杏酚酸纯度为86.7％；银杏酚酸混合物中C15∶1、C17∶1、C13∶0、C15∶0和C17∶2五成分相对百分含量分别为49.85％、22.57％、20.08％、3.22％和2.89％(西北农林科技大学，2007年学位论文)。祝娟娟通过水洗与硅胶层析结合的方法及氢氧化钠萃取法对银杏酸进行纯化，可将银杏酸纯度由33.9％提高到47.82％；硅胶层析法可将水洗处理后的银杏酸纯度升高至67.5％，氢氧化钠溶液萃取法可将银杏酸醇提液的纯度由33.9％提高至62.3％(合肥工业大学，2015年学位论文)。

3.3.4分子印迹法

王晓将银杏酸分子印迹聚合物做柱层析填料装柱，然后用银杏叶提取液上柱，再用体积比10∶1的环己烷/乙醇混合溶液淋洗，最后层析柱用醇洗脱，流出液为银杏酸，首次将分子印迹技术应用于银杏叶加工过程中的银杏酸脱除(CN104189026A)。

3.3.5泡沫分离法

李良英等采用加入表面活性剂，泡沫分离法，从泡沫分离器底部连续鼓入空气，形成泡沫，收集泡沫分离器顶端排出的泡沫，收集泡沫直至无泡沫产生，所得泡沫液即为含银杏酸的溶液，表面活性剂为多元醇表面活性剂(CN104739898A)。

3.3.6合成法

赵剑阳等以2-羟基-5-甲基苯甲酸为起始原料，经甲基化和溴代反应后，通过Wittig反应构建不同链长侧链合成了2-甲氧基-6-十三碳-1-烯基苯甲酸甲酯(6a)和2-甲氧基-6-十五碳-1-烯基苯甲酸甲酯(6b)，用钯碳氢化还原6中的碳碳双键后脱除甲基合成了两种不同链长银杏酸，总收率分别为46％和40％(合成化学，2016，24，359-361)。郑智慧以丁酸苯酯为原料，无水三氯化铝为催化剂，硝基苯为溶剂，探讨了丁酸苯酯经Fries重排选择性制备邻羟基苯丁酮的工艺条，以3-氯丙稀、苯酚为原料，经O-烷化、Claisen重排制备邻烯丙基苯酚，以甲醇为溶剂时，加入氢氧化钠可提高苯酚反应活性，在n(苯酚)∶n(3-氯丙烯)＝1∶1.2(摩尔比)，反应温度60℃，反应时间4h条件下，烯丙基苯基醚收率达65.0％，烯丙基苯基醚在190～220℃下回流反应7h，邻烯丙基苯酚收率达81.2％(广西大学，2007年学位论文)。

4.银杏叶多酚类化合物

4.1化学成分

银杏叶原花青素有85％的(表)没食子儿茶素组成，有15％的(表)儿茶素组成，(表)没食子儿茶素与(表)儿茶素区别使B环5′为多出一个羟基(piant Physiol.1986，82，1132-1138)。

4.2药理作用

银杏叶原花青素，其抗氧化活性较葡萄籽原花青素更强(中国现代应用药学，2016，33，686-690)。原花青素对机体的抗氧化损伤作用，为机体氧化损伤的防治提供参考，也为原花青素资源的开发利用提供科学依据(营养学报，2016，38，96-98)。银杏原花青素对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其抗氧化作用有关(Neural Regeneration Research，2016，11，1779-1783)。

4.3提取分离

丁立好等采用机械力辅助提取银杏叶多酚的最佳工艺条件为：填充率26％、球磨转速为400rpm、球磨时间为15min。在此条件下，银杏叶多酚的得率为7.33％(天然产物研究与开发，2019，31，1147-1154)。闫旭宇等采用乙醇浓度74％、料液比1∶25(g/mL)、提取温度62℃、超声时间30min，在此条件下银杏叶多酚提取率为8.32％(食品研究与开发，2020，41，99-104)。苏二正等提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂(DESs)及其制备方法和提取方法，该深共熔溶剂是由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1∶1～2.5制备而成(CN107759556A)。邱鸿浩提供了银杏叶中单宁的提取及其提纯方法，酶解，溶剂提取，萃取得到单宁(CN107602627A)。王桃云等采用超声波辅助提取银杏叶多酚，银杏叶多酚的得率为6.34％(化学研究与应用，2013，7，999-1005)。王燕芹等采用匀浆法提取银杏叶中的原花青素，原花青素的提取率为2.21％(食品科学，2012，33，12-16)。文赤夫等以乙酸乙酯对石油醚的体积分数为70％的混合溶剂提取银杏叶中的原花青素，经初步纯化的得率为3.0％，色价20.49(食品科学，2010，31，43-45)。云鹏等采用超临界二氧化碳加丙酮和水组成的极性改性剂，从银杏叶中萃取含有原花青素提取物的方法，得到产品含银杏黄酮甙＞35％，萜内酯＞8％，原花青素＞7％，酚酸＜5mg/Kg(CN1228432)。向静等采用不同提取方法的银杏叶多酚得率及含量分别为∶乙醇提取法(11.78±0.13)％、(5.42±0.06)％，酶解-乙醇提取法(12.71±0.09)％、(6.89±1.04)％，超声波-乙醇提取法(12.45±0.11)％、(6.71±0.06)％，微波-乙醇提取法(11.39±0.10)％、(5.97±1.00)％(广州中医药大学学报，2019，36，734-737)。

5.银杏叶类脂类

5.1化学组成

银杏叶类脂主要包括烃类、聚戊烯醇类、萜烯醇类、甾醇类等化合物。银杏叶内含有α-己烯醛，是一种新型杀虫剂，我国民间用银杏叶提取液防治红蜘蛛、稻螟、桑蟥等害虫。银杏叶挥发性物质主要有甾醇类，酮类化合物占1.066％，分别为17，19-二乙酰氧基-4，4-二甲基-13α-雄-5，7-二烯-3-烷酮(0.336％)和17α-乙酰，廿九烷、廿八醇、α-已烯醛等。王成章等鉴定出44个化学成分，主要由31.14％烃类、5.61％醇类、1.78％醛类、46.17％酮类、5.41％酸类和1.1％酯类组成，酮类中以六氢法呢酮占11.15％，含量最高，其次为橙花基酮和β一紫罗兰酮(热带亚热带植物学报，2000，8，329-332)。结构如下：

罗天宇报道了银杏叶中聚戊烯醇含量春季低、秋季高，含量最高为10月份，银杏叶聚戊烯醇包含的同系物分别为C65、C70、C75、C80、C85、C90、C95、C100和C105聚戊烯醇(南京林业大学，2017年学位论文)。

5.2药理作用

银杏叶聚戊烯醇可减少Aβ25-35致损伤dPC12细胞的凋亡，其作用可能与其抗氧化作用和抑制细胞凋亡途径激活有关(中药材，2017，40，1704-1709)。银杏叶聚戊烯醇对Aβ25-35致dPC12损伤有一定的保护作用，为一种潜在的AD治疗药物(中国药房，2017，28，881-884)。聚戊烯醇与硫酸庆大霉素混合可以有效地提高对金黄色葡萄球菌的抗菌效果并延长抗菌时间(林产化学与工业，2017，37，81-86)。银杏叶聚戊烯醇对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在48h内具有一定抗菌性，在前8h内，银杏叶聚戊烯醇对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用较强，致使菌群数量迅速下降，8h以后，两种菌群都有不同程度的再生，抑菌活性减弱(林产化学与工业，2016，36，29-34)。银杏叶聚戊烯醇是由15-21个异戊烯基单元及终端异戊烯伯醇组成的线性长链化合物，对人体无毒、无致突变、无致畸和无致癌作用。对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢菌、沙门氏菌和大肠杆菌均有较好的抑制作用，对啤酒酵母菌和黑曲霉菌无明显抑菌作用。对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用，对造血干细胞具有明显的促进增殖的作用，为一种潜在的AD治疗药物。银杏叶聚戊烯醇大部分以乙酸酯的形式存在，少量为游离醇形式。每100kg银杏叶，可以提取长醇几乎是猪肝内含量的100倍，所以很有开发前景。银杏叶聚戊烯醇是半合成S-多萜醇的理想原料，S-多萜醇是一类存在于动植物组织中具有光学活性的线状异戊烯基长链化合物，S-多萜醇是糖蛋白生物合成的关键载体，具有清除自由基、抗氧化和造血功能。从银杏时中提取的戊烯醇类化合物是一种含长醇类的药物，长醇具有促进机体造血功能，改善肝脏机能，对再生障碍性贫血，肝病和糖尿病等有明显疗效，同时还能提高机体免疫功能。聚异戊烯醇是存在于银杏叶中的一种类酯化合物，属多烯醇类或多萜醇类，具有很强的生物活性，是重要的新药物资源。

5.3提取分离

5.3.1分子蒸馏分离

王成章等以银杏叶为原料，采用分子蒸馏分离技术和溶剂重结晶纯化甾醇类化合物，共分离出17种化合物，其中8种是甾醇类化合物(林产化学与工业，2008，28，43-47)。陶冉通过溶剂提取，皂化等方法制备银杏叶类脂成分，再利用冷冻以及分子蒸馏得到结晶物，轻馏分和重馏分部位，并结合多种色谱技术首次对其各部位进行系统分离，对类脂轻馏分进行Py-GC-MS分析，裂解后化合物中单萜和倍半萜类化合物约为23％，长链醇(酮、酯)及二萜类化合物含量约为47％，烷基酚、甾体类化合物含量约为30％(中国林业科学研究院，2013年学位论文)。

5.3.2硅胶柱层析

张昌伟等通过正己烷提取、皂化、乙醇和丙酮脱蜡，以及硅胶柱层析，获得纯度为98.6％的聚戊烯醇(林产化学与工业，2019，39，41-45.)。葛金涛等报道了银杏聚戊烯醇主要以乙酸酯的形式存在，少量以游离醇的形式存在，在提取银杏聚戊烯醇的过程中将聚戊烯乙酸酯水解为聚戊烯醇，可提高银杏叶中聚戊烯醇的含量，银杏雄株叶片中聚戊烯醇得率的实际测定值达1.536％(江苏农业科学，2017，16，170-173)。李永辉等以聚戊烯醇的纯度为指标，筛选冷冻脱杂和硅胶柱层析最佳条件，获得含量90％以上的提取物，精制后的聚戊烯醇纯度可达92.7％(中药材，2004，27，337-339)。赵其秀等以石油醚为提取溶剂，制得石油醚浸膏中的聚戊烯乙酸酯经水解后转化为聚戊烯醇，然后通过丙酮沉淀及乙醇除杂进一步提高样品纯度，最后过硅胶柱层析得到聚戊烯醇同系物，测定聚戊烯醇纯度为95.27％(辽宁中医杂志，2016，43，1264-1266)。罗天宇对银杏叶中聚戊烯醇采用超临界CO2萃取，提取率(含量)可达11.4mg/g；超声波辅助提取，提取率(含量)为10.9mg/g；经硅胶柱色谱分离纯化聚戊烯醇粗品(南京林业大学，2017年学位论文)。

5.3.3树脂固定床

刘玉桃等采用NKA-II树脂固定床纯化聚戊烯醇，经NKA-II树脂固定床纯化后，聚戊烯醇含量从33.85％提高到71.54％，回收率为88.76％(食品科学，2015，36，63-67)。杨兰采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，聚戊烯醇纯度由38.5％提高到49.6％，脱色过程中聚戊烯醇基本无损失，脱色后的聚戊烯醇再经过一步柱层析即可将纯度提高到90％以上(中国林业科学研究院，2011年学位论文)。

5.3.4配位萃取

杨克迪等建立了银杏叶中多萜长链化合物Ag⁺配位萃取方法，构筑了含Ag⁺配位萃取体系，研究了萃取剂极性、萃取温度、Ag⁺浓度等因素对分配比D的影响，分析测定了银杏叶聚戊烯醇(PPs)与Ag⁺的配位萃取比m，确定了配位萃取条件及解离条件(无机化学学报，2006，22，243-247)。

5.3.5尿素柱色谱

侯相林等采用聚戊烯醇浸膏在醇碱溶液中皂化，用酸中和，浓缩，得到聚戊烯醇浸膏，尿素柱色谱，得到聚戊烯醇(CN101967083A)。

6.有机酸类

6.1化学组成及结构

银杏叶中含有3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸-3，4-二羟基苯甲酸-抗坏血酸-硬脂酸(十八烷酸)、亚油酸(十八碳二烯-9，12-酸)、棕榈酸(十六烷酸)、莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸等有机酸类。

莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸结构式如下：

6.2药理作用

犬尿喹啉酸是色氨酸代谢支路的最终产物，由犬尿氨酸经氨基转移而形成，并排出到尿中，细菌进一步把犬尿喹啉酸变成喹啉-2-羧酸，见于狗尿或给予色氨酸的兔和人的尿中，犬尿喹啉酸具有生物活性，是N-甲基-D-天门冬氨酸的拮抗剂，并与白细胞跟内皮细胞结合的调控密切相关。6-羟基犬尿喹啉酸是广谱中枢神经氨基酸拮抗剂，直接作用于N-甲-D-天冬氨酸，能改善脑缺氧，近年已引起国内外广泛重视。以莽草酸为原料生产的药物“达菲”是治疗甲型H1N1流感的药物之一。

6.3提取分离

6.3.1溶剂提取

李俊等综合提取银杏叶中奎宁酸和莽草酸的优选工艺参数为：料液比1∶8g/mL，70％乙醇，温度70℃，提取2次，第1次提取2h，2次提取1h，奎宁酸含量达5.29％，莽草酸含量达4.90％(应用化工，2022，51，422-425)。

6.3.2离子交换树脂

乔洪翔等以银杏叶提取物生产过程中产生的废水为原料，用阴离子交换树脂吸附分离，洗脱液上阳离子交换树脂进行脱钠，重结晶，得含量98％以上的莽草酸(CN107353201A)。瞿海斌等取经大孔树脂柱层析制备银杏提取物时产生的废液，将废液通过层析柱，用洗涤溶剂洗涤层析柱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到质量分数为35％以上的莽草酸提取物(CN108191639A)。王祖磊试验发现银杏叶中莽草酸的含量4.13％，活性炭对莽草酸具有较强的吸附性，大孔吸附树脂HLD-16纯化效果最好，其次是D201大孔强碱性苯乙烯系I型阴离子交换树脂，再次是大孔吸附树脂H103、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、201×7(717)强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，经过离子交换树脂的进一步纯化纯度最高可达65.41％(浙江大学，2010年学位论文)。

6.3.3硅胶柱层析

王晓玲等将银杏叶乙醇提取液减压浓缩至浸膏状，在去离子水中溶解，然后再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水液蒸干溶于甲醇，硅胶柱层析，得莽草酸(CN106316830A)。

6.3.4化学合成

郑永胜等以丁炔二羧酸二甲酯和对氨基苯酚为原料，经迈克尔加成、环合和碱水解反应合成了6-羟基犬尿喹啉酸，总收率43.3％，纯度99％(合成化学，2013，21，590-592)。

6.3.5大孔树脂

王如伟等将银杏叶提取物生产过程中产生的大孔树脂水洗液废水上聚酰胺树脂，浓缩液用酸调pH至酸性，过滤，得到结晶，干燥，得6-羟基犬尿喹啉酸(CN103784448A)。

7.银杏叶色素

银杏树叶色素主要有叶绿素和类胡萝卜素等。银杏树叶中含有叶绿素，叶绿素捕获光能，把光能以糖等化学物质的形式存储起来，银杏树叶中还含有黄色、橙色以及红色等其他一些色素，这些色素不能进行光合作用，但是其中有一些能够把捕获的光能传递给叶绿素。在春天和夏天，叶绿素在叶子中的含量比其他色素要丰富得多，以叶子呈现出叶绿素的绿色，秋季银杏树叶中的叶绿素因降温而分解而逐渐减少，绿色退去，其他色素叶黄素等留下来，银杏树叶就呈现出金黄的颜色。银杏叶绿色素主要由叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和β-萝卜素组成。银杏叶中的类胡萝卜素主要为叶黄素、紫堇新质、隐黄质、新黄质及其他胡萝卜素，是天然的着色剂，β-胡萝卜素在生物体内可转化为维生素A，用于治疗夜盲症。刘咏采用洗滤法从新鲜银杏叶树叶中提取天然绿色素，银杏叶绿色素为墨绿色，有金属光泽，无臭，难溶于水，易溶于有机溶剂，在碱性条件下比较稳定，而酸性条件会使颜色发生改变，在100℃以下及加入金属离子，对其稳定性无明显影响，在光照下不稳定，其颜色随光照时间的延长会迅速发生改变，银杏叶绿色素主要由叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和β-萝卜素组成(食品科技，2007，32，174-176)。文赤夫以乙酸乙酯对石油醚的体积分数为70％的混合溶剂、液料比25∶1(mL/g)、提取温度40℃、提取时间30min，以此方法提取4次较为彻底，经初步纯化的得率为3.0％，色价20.49(食品科学，2010，31，43-45)。唐仕荣等从银杏渣中提取类胡萝卜素的最佳提取工艺为：丙酮-石油醚(v/v，1∶2)，料液比1∶20，67.5℃水浴回流提取2次，每次提取2h，类胡萝卜素提取率达119.25μg/g，提取液经硅胶柱层析分离，石油醚洗脱馏分为β-胡萝卜素(食品工业科技，2009，30，245-247，301)。汪俊等采用乙醇回流提取银杏叶下脚料，所得滤液减压浓缩，皂化，过滤，滤液减压浓缩，加入水搅拌，加乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，向浓缩液中加入五水硫酸铜水溶液，搅拌加热反应1～4h，加盐酸调节pH值2～3，抽滤，滤渣为粗铜酸，经石油醚洗涤后，弃去石油醚，得铜酸，将所得铜酸上大孔树脂柱，收集乙酸乙酯洗脱段，减压浓缩，得精制铜酸，调节pH值9～11成盐，过滤，干燥，得叶绿素铜钠盐成品(CN102775414A)。

8.银杏叶多糖

8.1化学组成

任兴从银杏叶中分离出多糖U-GBL-1-1、U-GBL-2-1、M-GBL-1-1、M-GBL-2-1，总糖含量分别为88.16％、82.14％、87.52％和85.24％，蛋白质含量分别为8.86％、8.04％、6.43％和5.27％，糖醛酸含量分别为2.67％、2.82％、1.49％和1.53％，分子量分别为61659、50119、257039和275422Da；多糖含有β-糖苷键和吡喃糖环，U-GBL-1-1由鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖(Gal)和半乳糖醛酸(Gal A)四种单糖组成，其摩尔百分数(％)分别为12.58、21.82、51.79和12.74；U-GBL-2-1由Rha、Gal、GalA和木糖(Xyl)四种单糖组成，其摩尔百分数(％)分别为17.01、58.39、18.20和6.37；M-GBL-1-1由Rha、Glc A、Gal、葡萄糖(Glc)、Gal A和阿拉伯糖(Ara)六种单糖组成，其摩尔百分数(％)分别为2.27、15.85、17.26、10.24、42.39和11.99；M-GBL-2-1由Rha、Glc A、Gal、Gal A和Xyl五种单糖组成，其摩尔百分数(％)分别为10.21、12.34、12.07、9.87和55.48(长春师范大学，2021年学位论文)。赵琪珂等对纯化的银杏叶多糖分析为含有吡喃环的硫酸酯多糖，该多糖的单糖组成甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，其摩尔比为1.28∶3.35∶1.42∶3.58∶1.00∶2.66∶2.75(大连工业大学学报，2019，38，5-9)。尹雯等对分离纯化的4种均一多糖进行单糖组成分析，单糖组成与摩尔比分别为鼠李糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿＝2.13∶1.00∶2.50∶6.88；甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿拉伯糖＝1.00∶3.50∶1.00∶1.50∶6.75∶11.50；甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿拉伯糖＝2.50∶4.83∶3.83∶1.00∶3.00∶3.00；甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸＝2.19∶1.57∶1.00(食品科技，2018，43，186-190.)。何钢等对纯化的银杏叶多糖分析其相对分子质量分别为41861、361352和637533，单糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比不同(食品工业科技，2015，36，81-86)。胡绪乔等对纯化的银杏叶两个精多糖分析，分子量分别为26300和19100，单糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，摩尔比分别为(3.48∶8.47∶3.73∶1.76∶1)和(5.34∶5.37∶5.27∶1∶1.68)(中药材，2011，34，1950-1953)。夏秀华对纯化的银杏叶多糖分析其相对分子量为12749，含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中鼠李糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝0.236∶0.2104∶0.1608∶0.078∶0.315，银杏叶多糖含有α-D葡萄吡喃糖苷键(食品科技，2011，36，155-158)。原菲对纯化的银杏叶多糖分析其分子量分别为2.30～103KDa、7.38～103KDa和3.54～103KDa，三个多糖的单糖组成与摩尔比分别为：鼠李糖∶半乳糖∶甘露糖＝4.2∶1∶3.8，支链由(1→4)-α-D-Gal和(1→3，4)-α-D-Man构成，以β-L-Rha为末端，主链由(1→3，4)-α-D-Man构成；鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶甘露糖＝2.2∶3.4∶3.8∶1.3，支链由(1→5)-α-L-阿拉伯糖、(1→4)-α-D-半乳糖和(1→6)-α-D-半乳糖构成，以β-L-鼠李糖为末端，主链由(1→5)-α-L-阿拉伯糖、(1→3，6)-β-D-半乳糖和(1→3，4)-α-D-甘露糖组成；阿拉伯糖∶葡萄糖∶木糖＝1.33∶1.05∶1.15，支链由β-D-Xy1构成，主链由(1→2，5)-α-L-阿拉伯糖和(1→3)-α-D-葡萄糖糖组成(暨南大学，2010年学位论文)。杨静峰等对纯化的银杏叶多糖分析，单糖组成与摩尔比分别为：Gal∶Man∶Glc∶Ara∶Rha∶GalA＝6.0∶2.4∶1.9∶2.1∶1.9∶1.0，为酸性杂多糖，相对分子量为1×105(特产研究，2006，28，51-53)。杨静峰对纯化的银杏叶多糖分析其单糖组成与摩尔比分别为：Glc∶Man∶Gal∶Rha∶GalA＝1.65∶1.38∶2.2∶1.35∶1，分子量约为1万；Gal∶Man∶Glc∶Ara∶Rha∶GalA＝6∶2.4∶1.7∶4.6∶6.8∶1，是一种酸性杂多糖，主要由α-D-(1→6)构型组成，少部分为β构型，其主链主要由Gal(1→6)与Gal(1→3，6)交替连接组成，有少量Glc(1→3，4)和Glc(1→2，4)组成，主链核心分枝部分由Glc(1→3，6)结构构成，末端部分由Gal、Glc、Man和Rha构成，其余Ara、Man和GalA等键型都位于支链部分(东北师范大学，2005年学位论文)。银杏叶多糖的单糖组成一般为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖等。

8.2药理作用

适量添加银杏叶多糖可有效改善发酵乳品质，提高其抗氧化能力，延长发酵乳的保存期(食品工业，2022，43，144-147)。银杏叶多糖具有促进斑秃小鼠毛发生长的作用，减轻毛囊周围炎症，可能是通过调节炎症因子表达实现的，银杏叶多糖可以改善LPS诱导的HUVEC细胞炎症反应，其具体机制是通过调节炎症信号通路中p-p65、p-IκBα、TNF-α、IL-1β蛋白表达来实现的(银杏叶多糖促生发作用及其抗炎机制研究，李英娜，北华大学，2021)。硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗具有免疫协同作用，这为硫酸化银杏叶多糖作为免疫增强剂的开发奠定了试验基础(山东畜牧兽医，2019，40，4-6)。银杏叶多糖具有良好的清除亚硝酸盐活性，当银杏叶多糖浓度为4.91mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率可达50％，当银杏叶多糖浓度为14.7mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率可达95.14％(粮食科技与经济，2019，44，90-93)。银杏叶多糖能明显抑制炎症小鼠TNF-α的表达，0.050g/mL和0.500g/mL的银杏叶多糖能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α的表达(黑龙江畜牧兽医，2018，16，172-173)。银杏叶多糖可能通过升高MMP-9及iNOS的表达水平，从而减轻视网膜神经节细胞的损伤(中国老年学杂志，2018，38，2200-2202)。银杏多糖可以通过增加小鼠脾淋巴细胞增殖、减少G0/G1期细胞的阻滞、促进DNA合成、促进细胞因子IFN-γ、IL-4的分泌及其mRNA的表达、维持IFN-γ/IL-4(Th1/Th2)动态平衡，来提高机体免疫功能(食品工业科技，2021，42，301-306)。银杏多糖对CCl4所诱导的小鼠肝损伤有很强的保护作用，此作用可能与其清除自由基的能力有关(中国中医基础医学杂志，2013，19，953-955)。

8.3提取分离

崔旭兰等等采用不同提取方法的银杏叶多糖提取物得率及含量分别为：水提醇沉12.58％和5.69％；酶法-水提醇沉法14.05％和6.68％；超声波-水提醇沉法14.12％和6.82％；微波-水提醇沉法13.31％和6.15％(广州中医药大学学报，2019，36，121-124)。张晓娜等采用在料液比1∶25(g/mL)、温度86℃、时间170min和氢氧化钠浓度0.13mol/L条件下，多糖得率达到最大值10.37％(粮食与油脂，2021，34，87-89+103)。

8.3.1微波

游美玲等采用微波辅助提取银杏叶中多糖类化合物，得到最佳提取条件为：料液比1∶30，微波时间4min，微波功率900W，在此条件下，银杏叶中多糖类化合物得率为14.72％(德州学院学报，2015，31，35-37)。陈义勇等以水作为提取溶剂、银杏叶多糖提取率为指标，采用微波辅助提取法，最佳出工艺条件为微波功率480W，液料比30∶1(mL/g)，提取时间8min，提取2次，多糖得率为14.70％(食品科学，2012，32，24-28)。

8.3.2超滤膜技术

唐仕荣等以银杏渣为原料，纯水为溶剂，多糖提取率达5.97％，采用超滤技术纯化多糖提取液，以相对分子质量2万的超滤膜在0.05MPa下，对25℃的多糖提取液超滤10min，即可使提取液得到明显浓缩，Sevag法除去浓缩液中蛋白质可得到纯度51.42％的银杏渣多糖(粮油加工，2009，12，163-166)。

8.3.3纤维素酶

张琳等采用纤维素酶法结合水提醇沉，提取银杏叶多糖，10g银杏叶用纤维素酶法的提取银杏叶多糖的量为(0.1953±0.0111)g，水提法的提取量为(0.1669±0.0036)g(化工科技，2017，25，40-42)。赵琪珂等采用超声处理，添加0.75％的纤维素酶，采用水提醇沉，得银杏叶粗多糖，提取率为12.2％，含量为72.38％(中国食品科学技术学会第十三届年会，2016)。

8.3.4 Sevage脱除蛋白法

许春雨等采用Sevage法将提取液中的蛋白从粗多糖中去除，经DEAE-52和Sephadex G-100纯化得到均一多糖，提取率可达到12.8％(大连工业大学学报，2016，35，235-238)。陈芝飞等用沸水提取，浓缩，离心，上清液醇沉，加入1～2‰的木瓜蛋白酶于50±5℃水浴中放置2～4h，采用Sevage法脱除蛋白，活性炭脱色后减压浓缩，冷却后进行流水透析，透析结束后再次醇沉静置，沉淀于60～70℃干燥得粗多糖(CN104031160A)。

8.3.5超声波辅助

莫晓宁等采用超声波提取最佳工艺条件为液料比30∶1、提取温度65℃、超声波功率200W、提取时间40min，该工艺条件下GBLP得率达7.35％(粮食科技与经济，2019，44，90-93)。豆佳媛以蒸馏水为提取剂、料液比1∶20(g∶mL)、超声功率300W、提取时间50min，银杏叶多糖的平均提取率可达4.60％(化学与生物工程，2020，37，51-54)。

8.3.6离子液体提取

刘恩岐等将银杏叶以氨基酸离子液体提取，固液分离，上清液浓缩，加入乙醇进行醇沉，收集沉淀物洗涤，得银杏叶多糖(CN108451970A)。

8.3.7柱色谱

赵琪珂等将提取的粗多糖脱蛋白、透析后分级，经过DEAE-52纤维素柱、SephadexG-100凝胶柱进一步纯化后得到纯化多糖(大连工业大学学报，2019，38，79-83)。王筱瑜采用纤维素酶酶解法提取银杏落叶粗多糖，酶-等电点法除银杏落叶多糖中蛋白，AB-8大孔树脂动态脱色效果优于静态脱色等方法，得到银杏落叶多糖总糖含量在92.07～97.32％之间(王筱瑜，锦州医科大学，2019)。

9.银杏叶蛋白

银杏叶中蛋白质含量极为丰富，就质量而言，所测样品蛋白质中必需氨基酸含量超过了FAO/WHO评分模式中同种氨基酸含量，其必需氨基酸指数均在100以上。银杏叶蛋白质量优于FAO/WHO评分模式，与大豆蛋白相媲美，接近鸡蛋蛋白。如此丰富的蛋白质和质量良好的氨基酸组成，无疑可以成为一种很好的食品营养添加剂。银杏蛋白具有抑菌活性，金黄色葡萄球菌、对肺炎克雷伯氏菌、黑曲霉和戴尔有孢圆酵母有抑菌作用，具有一定清除超氧阴离子自由基及DPPH自由基能力，相对分子量约10～106KD之间，银杏蛋白的等电点(pI)为4.4，具有较好的乳化性、起泡性与乳化稳定性，但泡沫稳定性较差，银杏蛋白以清蛋白和球蛋白为主，占总蛋白85％以上，银杏蛋白天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量高，亮氨酸含量低，氨基酸占蛋白中总量的77.60％，其中必需氨基酸占20.01％，属于半完全蛋白，第一限制性氨基酸为亮氨酸，第二限制限制性氨基酸为赖氨酸。

10.银杏叶纤维

银杏叶丙纶纤维具有调节动脉和毛细血管的血循环、降低血粘度，增加血流量、防止自由基引起的细胞膜破坏、抑制血小板聚集和血栓形成，改善大脑代谢、保护大脑免受缺氧伤害和抗衰老等作用。尚雨婕等用溶液浸润的方法对银杏叶进行纤维制取，对获得的银杏叶纤维长度、细度和强度进行测试，以期能够应用于纺织和服装生产，起到保健效果(轻纺工业与技术，2016，45，37-38)。苗敬芝等取干燥的银杏叶粉碎，过筛，加入水为提取剂，并加入纤维素酶和果胶酶的复合酶剂进行酶法提取，得到提取液，将所得提取液过滤，取滤液经减压浓缩得到浓缩液，取浓缩液醇沉得到沉淀物，即得到所述银杏叶水溶性膳食纤维(CN106520858A)。

综观我国，尽管银杏资源居世界第一，然而制剂在国际市场上的占有量却大幅落后于其他国家。国内从事银杏叶深度开发利用的企业和科研机很少，在资源综合利用的力度和深度上也远不及国外，目前基本上属于粗放型模式，以经营银杏原料为主，90％以上的银杏叶出口国际市场。表面看，通过出口银杏叶或粗加工制品获得了一定的经济利益，实际上，国外企业却通过精深加工从中获取了丰厚利润。简单出口银杏叶或粗加工产品，银杏叶提取物的经营过分依赖国际市场，造成我国银杏叶资源严重的流失。毫无疑问，与世界发达国家相比，我国银杏制品附加值较低，研究开发的深度不够，中低水平重复生产现象严重，高品质的产品极少。开发的企业很多，我国的银杏产业开发，必须转变经营体制，转变生产方式，走资源开发规模化、产品开发系列化、质量标准规范化和生产经营集团化的道路。产值很低，就是缺乏深度加工手段，多数企业设备简陋，提取水平低，且生产不规范，进行低水平重复，产品质量达不到国外的水平，在国际上缺乏竞争力。必须依靠高新技术尽快改变低水平的重复，对银杏叶进行深加工，促进银杏叶产业化的新的飞跃，促进农民增收。资源综合利用水平低，存在高产低效益的现象和资源浪费，产品单一的生产问题，因此银杏叶资源综合利用是银杏叶科技的重要方向。目前，在许多领域都有广泛的应用，如“三药两品”，即人药(银杏叶胶囊、银杏叶片、针剂等)、兽药(从下脚料提取)、农药(生物农药)、保健品(如银杏饮料、银杏叶茶、银杏酒类、银杏枕头等)、化妆品(去皱、抗衰老)。

所有以上文献报道，都只是对银杏叶的某一种或几种成分的提取，并未对银杏叶资源综合利用，本发明提供一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，解决现有制备银杏提取物提取单一成分问题，做到了银杏叶的“吃干榨尽”，是资源综合利用的价值取向。对银杏叶药制除传统的研究黄酮、内酯类化合物外，还应加大银杏叶其他活性成分及其协同作用的研究，开发出新的产品，这样银杏叶的综合利用才能得到保证。我国银杏叶产品的开发还蕴藏着巨大的潜力，随着人们生活水平的提高和科学技术的进步，银杏叶及其制剂所特有的保健、治疗和营养功能必将进一步为人类所利用，银杏叶的综合干发利用前景将更加广阔。

发明内容

背景技术中都只是对银杏叶中某一成分的单独提取，为克服背景技术中的不足，本发明旨在提供一种银杏叶中有效成分的集成化提取分离方法，以银杏叶为原料经过总提取物的制备，再逐一分离得到各个成分。

一种银杏叶全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，本发明采用低共熔溶剂在超高压下，将银杏叶中有效成分同步提取，得到总提取物，然后将总提取物按照水溶性和脂溶性分离，再根据各成分的理化性质，逐一分离，层层推进，得到各个单一成分。本发明从全部产品的集成化提取分离考虑，从整体上发明了银杏叶中有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，不只是注重单个产品的提取分离。“吃干榨尽”是资源综合利用的价值取向。但是，循环经济绝不是“吃干榨尽”，银杏叶中有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，在追求资源“吃干榨尽”的同时，对生产过程中产生的废弃物，变废为宝，化害为利，以达到综合利用的目的，促使循环经济的发展，实现资源节约，环境友好的经济模式。本发明从下脚料中分离提取了叶绿素，制取叶绿素铜钠盐，用作食品、饮料、医药等方面天然着色剂。

一种银杏叶全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，银杏叶匀浆后，超高压提取，提取液在在EOPO/磷酸二氢钾体系中形成ATPs，上相I为EOPO相，下相I为DES相；上相I进行温度诱导分离，自动分成两相，上相II富含水，下相II富含EOPO，分离为水溶性成分和脂溶性成分。上相II通过浓缩，加入溶剂，构建三相体系，三相体系中的上相含有莽草酸和6-羟基犬尿哇啉酸，通过MCI树脂吸附分离得到莽草酸和6-羟基犬尿哇啉酸。三相体系中的中相为蛋白，三相体系中的下相为多糖，通过透析，径向流色谱分离得到银杏多糖和银杏低聚糖。下相II再次进行温度诱导分离，得到上相III富含有机成分，下相III富含EOPO，上相III经浓缩，加水沉淀，得到水溶性成分和沉淀物，水溶性成分经大孔树脂柱吸附分离，得到多酚。沉淀物经石油醚萃取、皂化，加入碱液，硫酸铜反应，得到水相和有相，水相为叶绿素铜钠盐。油相加入乙醇再次分相，将银杏酸和聚戊烯醇巧妙的分离；银杏酚酸分离采用常压硅胶柱层析结合半制备高效液相色谱分离，分离制备了银杏酸C15∶0、C17∶1、C15∶1、C13∶0和C17∶2。类脂类成分聚异戊烯醇通过银化硅胶层析分离，同时得到色素类。石油醚萃取后的萃余液以乙酸乙酯萃取，萃取液为银杏内酯，通过中压柱色谱，分离得到银杏内酯M、白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯A和银杏内酯B。乙酸乙酯萃取后的萃余液，通过配位色谱法分离得到银杏黄酮。

本发明的技术解决方案是：

一种银杏叶全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)银杏叶的总提取物的制备；

将银杏叶和低共熔溶剂放入匀浆器中，匀浆破壁后进行超高压提取，升压阶段，低共熔溶剂在非常高的压力差作用下通过渗透作用迅速进入银杏叶细胞内部，细胞发生了一次破坏，保压阶段，在高压条件作用下，银杏叶有效成分以较快的溶解速度迅速溶解，在浓度差的推动下，有效成分通过渗透由细胞内释放出细胞外；泄压阶段，在非常高的反向压力作用下，细胞发生了二次破坏，经过一次破坏、二次破坏，银杏叶有效成分的提取率都有明显的提高。超高压提取有效成分无损失，无变性，提取率高，有利于纯化和分离，非常方便、快捷，还可以节省大量的物质消耗和时间及设备的占用，节能，无污染。

原料先在温度22～30℃下浸泡30～120min后，在转速1500～2500r/min下搅拌破碎，匀浆30～60s；

所述的匀浆后的物料放入超高压提取装置中，在40～60℃进行提取；

所述的升压阶段：在5～30min内将提取容器内的压强升高到200～700Mpa；压力在几分钟内迅速由常压升为200～700Mpa，银杏叶固体组织细胞内外形成了超高的压力差，DES提取溶剂在超高压力推动下迅速渗透到银杏叶内部维管束和腺细胞内。随着压力迅速升高，银杏叶细胞体积被压缩，如果超过其形变极限，会导致细胞破裂，细胞内的物质与DES溶剂接触被溶解；如果没有超过细胞的形变极限，DES提取溶剂在高压作用下，进入植物细胞内，有效成分溶解在DES提取溶剂中。

所述的保压阶段：保持压强10～30min；超高压力引起体系的体积变化，推动了化学平衡的移动，DES溶剂的渗透、有效成分的溶解快速达到平衡。

所述的泄压阶段：在5～30s内迅速将压强泄为常压；卸压阶段，组织细胞的压力从200～700Mpa的超高压迅速减小为常压，在反方向压力作用下，发生流体以及银杏叶基质体积的爆破膨胀，对银杏叶细胞壁、细胞膜、质膜、核膜、液泡、微管等形成强烈的冲击致使发生变形。如果变形超过了其变形极限，导致细胞结构出现松散、孔洞、破裂等结构变化，有效成分和DES溶剂充分接触，溶解了有效成分的溶液会向细胞外迅速扩散；如果在反方向压力作用下细胞壁的变形没有超过其变形极限，细胞内部已经溶解了有效成分的溶剂在高渗透压差下快速转移到细胞外，达到提取的目的。在流体吸收外界施加的压缩能一定的情况下，卸压时间越短，细胞内流体在向外扩散的同时产生的冲击力越强，引起的湍动效应越强烈，形成的孔洞、碎片越多，一定质量的药物基质的有效比表面会越大，有效成分扩散的传质阻力就会越小、与溶剂接触也就会更充分，提取效率会更高。

所述的升压、保压、泄压阶段重复3～5次，制得固液混合物I；

所述的低共熔溶剂中水的含量为10～30wt％；

所述的银杏叶和低共熔溶剂的料液比为20～100mg/mL；

所述的氢键受体，选自氯化胆碱、甜菜碱或甲基三辛基氯化铵中之一；

所述的氢键供体，选自乳酸、1，4-丁二醇、甘油、丙二酸、乳酸、乙二醇、1，3丙二醇或正丙醇中之一；

所述的低共熔溶剂中氢键受体和氢键供体的摩尔比为1∶(0.5～5)；

所述的升压，用加压泵加压至所需压力。

(2)提取液与料渣的分离

将固液混合物I移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，固液分离后，得到清液I和沉淀物I；

将固液混合物I移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，固液分离后，得到清液I和沉淀物I；

所述的清液I为低共熔溶剂DES提取的银杏叶中多种成分，沉淀物I为银杏叶料渣。

(3)DES与银杏叶多种成分料的分离

所述的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)/盐温度诱导双水相体系分离，EOPO/磷酸二氢钾体系中，加入清液I，混合均匀，静置，形成EOPO/DES双水相体系(ATPS)，上相I为EOPO相，下相I为DES相；温敏性ATPS不仅具有ATPS的特性，还可通过改变温度实现ATPS的成相组分与目标化合物的分离，EOPO时一种温敏性聚合物，在温度诱导下可实现相分离；

所述的共聚物为环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和水按体积比1～3∶1～4混合，然后向其中加入盐；

所述的盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或无水硫酸钠，混合均匀，所得溶液中盐的浓度为0.05～0.15g/mL，向溶液中按2.0～5.0mg/mL的量加入清液I，混合均匀后，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，分离水相和富含环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的有机相；

所述的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的分子量为2000～3000；

所述的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的浓度为30～70wt％。

(4)DES中水溶性成分与脂溶性成分的分离

对上相I(富含EOPO)进行温度诱导分离，加入30mL乙醇和0.5～1.0g氯化镁溶液，加热至60～70℃，保温30min，调pH值3～5，自动分成两相，上相II富含水，下相II富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集；

上相II富含多糖、低聚糖、蛋白质和氨基酸，下相II富含EOPO，溶解有银杏脂溶性成分。

(5)EOPO中脂溶性成分与EOPO的分离

溶解有银杏脂溶性成分的下相II(富含EOPO)再次进行温度诱导分离，在下相II加入0.5～1.0g氯化镁溶液，在50～70℃水浴10～30min，加入30mL乙醇，调pH值3～5，形成新的双水相体系，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，上相III富含有机成分，下相III富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集。

(6)银杏蛋白和氨基酸的分离

将有机溶剂叔丁醇和盐与提取液反应，离心后，混合物分为三相，其中上相为有机溶剂相即叔丁醇相，下相为水相，中间相为蛋白相，三相分离技术可以选择性的将需要的蛋白分离到中间相，而其余的成分分配到其它相中。

所述的上相II，在压力-(0.08～0.095)MPa，温度50～70℃下浓缩，得到浓缩液I；

所述的浓缩液I，加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，浓缩液I与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，分别收集上相IV、中相I和下相IV；

所述的中相I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩，得到浓缩液II；

所述的浓缩液II，加入1500～2000mL乙醇，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉物I；

所述乙醇的质量百分比浓度为70～80％；

所述的醇沉混合物I，移入离心机的离心管中，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液II和沉淀物II；

所述的沉淀物II，在温度50～60℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h后制得银杏蛋白；

所述的上述清液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，该浸膏然后在温度50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h后制得氨基酸。

(7)莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸的分离

上相IV为叔丁醇，富集莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，得浓缩液III；

所述的浓缩液III，加入3～5倍水(w/w)溶解，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液III和沉淀物III；

所述的清液III经MCI树脂吸附分离；

所述的MCI树脂吸附分离，MCI树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将清液III加入树脂柱，待检测流出液刚好有有效成分流出时停止上柱，得吸附饱和的MCI树脂柱，用水和洗脱液梯度洗脱；

所述的水洗涤，对吸附饱和的MCI树脂柱采用2.0～4.0BV，pH值4～6的水进行洗涤，洗去杂质；

所述的洗脱液梯度洗脱，用2.0～4.0BV的体积浓度25～35％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液I；用2.0～4.0BV的体积浓度50～70％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液II；

所述的洗脱液I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩至原体积1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到6-羟基犬尿喹啉酸；

所述的洗脱液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到莽草酸。

所述的MCI树脂为聚苯乙烯基反相填料，是一种新型吸附树脂，因其适合分离中等极性和大极性化合物被广泛应用于天然产物的分离，MCI树脂是一种高效稳定的分离纯化材料，具有易操作、高选择、吸附快等优点，同时兼具酸碱适用范围广、颗粒均匀和可反复使用等特点，随着材料技术的不断发展，MCI树脂具有的优点与特性使其在天然药物化学研究过程中地位日益升高。

(8)银杏多糖的分离

下相IV装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，流水中的透析液为清夜IV，透析袋中的液体为清夜V，清夜V通过径向流色谱纯化进一步纯化；将上述清夜V用洗脱液配成溶液，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液VI和沉淀物IV；

所述的清液清液VI经径向流色谱柱分离银杏多糖；

所述的径向流色谱，将清液VI流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，每10mL收集一个流份，用苯酚-硫酸法检测各流份中的多糖，相同流份合并为一个组分，得到3个组分，为洗脱液III，得到分子量为60000～90000Da的A组分，分子量为160000～200000Da的B组分和分子量为220000～260000的C组分；

所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶离子交换剂A103S；

所述的洗脱液为pH值6.5～8.5的Tris-盐酸缓冲液、pH值6.8～9.0巴比妥-盐酸缓冲液和pH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中之一；

所述的阴离子交换填料用洗脱液浸泡2～4h，配制成m(阴离子交换填料)∶v(洗脱液)＝20∶100～40∶100(g∶mL)的填料液，填料液装入径向流色谱柱得流速10～20mL/min，用逆时针和顺时针各平衡100～200mL；

所述的线性梯度洗脱得洗脱液浓度以0～0.5mol/L，流速为5～15mL/min。

所述的将上述A组分、B组分和C组分分别收集后浓缩，在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后真空干燥，相应地得到白色粉末状的银杏叶多糖。

所述的径向流色谱法与各种化学方法对粗多糖脱蛋白脱色效果的比较表明，径向流色谱脱蛋白、脱色及多糖保留效果都优于其它方法，且适用于不同种类粗多糖的分离纯化过程，在粗多糖纯化中，径向流色谱以较小的路径(3.15cm)取得与轴向色谱(46.00cm)同样的效果。

(9)银杏低聚糖的分离；

清夜III在真空度-(0.07～0.08)MPa，温度60～70℃下浓缩至浸膏，加入1500～2000mL乙醇，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉混合物II；

所述的乙醇的质量百分比浓度为70～80％；

所述的醇沉混合物II，移入离心机的离心管中，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液VII和沉淀物V，弃去上清液IV；

所述的沉淀物V，在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得产物一银杏低聚糖。

(10)银杏多酚的分离

上相III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到浓缩液IV；

所述的浓缩液IV，加入水充分混匀，得到固液混合物II；

所述的固液混合物II，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液VIII和沉淀物VI；

所述的清液VIII，加入质量百分比浓度18％的盐酸，调节pH值3～5，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液IX和沉淀物VII，弃去沉淀物VII；

所述的清液IX，通过XAD型大孔吸附树脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱体制得收集液I；

所述的梯度洗脱，用2.0～4.0BV的8～10％体积溶度的乙醇水溶液洗脱杂质；接着用2.0～4.0BV的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的杂质；再用2.0～5.0BV的质量百分比浓度50～80％的乙醇洗脱多酚，得到收集液II；

所述的收集液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得浓缩液IV；

所述的浓缩液IV，在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏多酚。

(11)叶绿素铜钠盐的制备

将沉淀物III在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得干燥物I；

所述的干燥物I，加入乙醇溶解，加入少量水搅成糊状，得固液混合物III；

所述的固液混合物III，加入石油醚萃取三次，得到萃取液I和萃余液I；

所述的萃取液I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，加入异丙醇和正己烷溶解，得溶液I；

所述的溶液I，加入氢氧化钠液，20％硫酸铜液，60℃皂化30min，得到皂化液I；

所述的皂化液I，加入水，分层，得到上相V和下相V；

所述的下相V，用正己烷萃取，得到萃取液II和萃余液II；

所述的萃取液II和上相V合并，得到油相I；

所述的萃余液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到叶绿素铜钠盐。

(12)银杏酸的分离；

油相I加入1～3倍量(v/v)石油醚和1～3倍量(v/v)90％乙醇，调节pH值10，充分混匀，分层，得到上相VI和下相VI；

所述的下相VI，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物II；

所述的干燥物II，经色谱分离，得到银杏酸；

所述的干燥物II，用甲醇溶解，过滤，滤液加入干燥物II重量1～2倍的48～75μm硅胶，拌匀，挥去溶剂，晾干，粉碎过75μm筛，硅胶色谱柱中加入干燥物II重量15～20倍的48～75μm柱色谱硅胶，进行色谱分离；

所述的硅胶色谱柱径高比为1∶15，洗脱溶剂先用石油醚洗脱，直至流出液色浅，再用石油醚-乙酸乙酯-甲醇(80∶15∶5，v/v/v)洗脱，每30mL为一个保留体积，每3个保留体积收集为一个流份，共收集8个流份，依次为Fr.1～Fr.8；各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；第4～5个流份Fr.4～Fr.5部分主要含银杏酸C15∶1、C13∶0和C17∶2；

所述的色谱柱再用石油醚-乙酸乙酯-甲醇(70∶20∶10，v/v/v)洗脱，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.9～Fr.15，各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，每个梯度洗脱到薄层色谱检测分析无斑点后，更换下一梯度洗脱；Fr.13～Fr.14部分主要含银杏酸C15∶0和C17∶1；

所述的流份Fr.4～Fr.5，合并为Fr.4(5)，进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(60∶40，v/v)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集6个流份，依次为Fr.4(5)-1～Fr.4(5)-6，各个流份分别经硅胶薄层色谱和高效液相色谱检测分析，合并相同的部分，Fr.4(5)-4含银杏酸C15∶1、C13∶0，Fr.4(5)-5含银杏酸C17∶2；

所述的流份Fr.13-Fr.14部分，合并为Fr.13(14)，进一步进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(50∶50，V/V)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.13(14)-1～Fr.13(14)-7，各个流份分别经硅胶薄层色谱和高效液相色谱检测分析，合并相同的部分；Fr.13(14)-5含银杏酸C15∶0和C17∶1；

所述的Fr.4(5)-5部分，经脱色，浓缩，结晶，得到银杏酸C17∶2；

所述的Fr.4(5)-4部分，进行半制各高效液相色谱分离，流动相采用甲醇-水溶液洗脱，分别得到银杏酸C15∶1和C13∶0；

所述的Fr.13(14)-5部分，进行半制备高效液相色谱分离，流动相采用甲醇-水溶液洗脱，分别得到银杏酸C15∶0和C17∶1；

所述的半制备高效液相色谱条件为C18制备柱、波长190～280nm、柱温30℃、流动相甲醇(A)-水(B)，流速5mL/min，进样量1mL，梯度洗脱(0～55min，10～40％B)。

(13)聚戊烯醇和色素的分离

步骤十三中所述的银化硅胶色谱，经银化硅胶的制备，装柱，洗脱色素，梯度洗脱，Ag⁺去除，脱色结晶等；

所述的银化硅胶的制备，在避光条件下，将48～75μm硅胶加入到含有8～20％的硝酸银溶液中，充分搅拌成糊状，在90～95℃水浴下加热搅拌20～40min，然后冷却至25～35℃，抽滤，抽滤物在真空干燥箱内活化15～25h，制得银化硅胶，置于阴暗处备用；

所述的银化硅胶装柱，置于石油醚中搅拌排除气泡，静置使其充分溶胀，加入层析柱中，层析柱用锡纸包裹，用石油醚洗脱平衡；

所述的洗脱色素，干燥物III用石油醚溶解，滴加到银化硅层析柱上端内，打开层析柱下端阀门，让样品液缓缓吸附在银化硅胶，待即将吸附完时加入石油醚洗脱，得到洗脱液IV，减压浓缩，得到银杏叶色素；

所述的梯度洗脱，以石油醚-乙酸乙酯(100∶5～100∶10，v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，10～20mL为一个流份，各个流份分别经TLC和HPLC检测分析，合并相同的流份；

所述的Ag⁺去除，将经TLC和HPLC检测分析主要含有聚戊烯醇的流份合并，得到洗脱液V，旋蒸，除去洗脱剂，用正己烷溶解，加入饱和的氯化钠溶液去除Ag⁺，加入无水硫酸钠脱水，过滤，得到滤液；

所述的脱色结晶，滤液减压蒸干，加入无水甲醇溶解，加入凹凸棒脱色30min，抽滤，滤液在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积1/3～1/4，静置，结晶，得到聚戊烯醇。

本发明根据柱层析法的分离原理即物质在固定相上的吸附力不同而使物质得到分离，同时利用银化硅胶层析柱中银离子能与聚异戊烯醇的碳-碳双键形成络合物来分离提取。

(14)银杏单宁的分离

沉淀物III在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得干燥物IV；

所述的干燥物IV，加入90％乙醇溶解，加入少量水，搅匀，以乙酸乙酯萃取，萃取液III和萃余液III；

所述的萃取液III，以6.0～10.0wt％碳酸钠溶液萃取，得到萃取液IV和萃余液IV；

所述的萃取液IV，以0.5～1.0wt％氢氧化钠萃取，得到萃取液V和萃余液V；

所述的萃余液V，中和后，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得银杏单宁。

(15)银杏内酯的分离

萃取液V经酸性水洗至中性，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得浓缩液V；

所述的浓缩液V，经色谱分离得到银杏内酯；

银杏内酯采用硅胶柱色谱进行分离，所述的层析柱规格为30mm×600mm，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，体积比依次为100∶0、100∶5、100∶10、100∶15、100∶20、100∶25、100∶35、100∶50、100∶70、0∶100，洗脱液流速3～5mL/min，每一梯度的洗脱液用量与固定相量比为5～15mL∶1g，每10～20mL体积为一流份，收集165个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1～5、流份6～14、流份15～22、流份23～32、流份33～44、流份45～57、流份58～63、流份64～79、流份80～114、流份115～132、流份133～150、流份151～165；

所述的第15～22流分，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶20∶5～100∶30∶10，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，经脱色、浓缩、结晶，得到银杏内酯M和白果内酯；

所述的第45～57流分，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶30∶10～100∶40∶15，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，经脱色、浓缩、结晶，得到银杏内酯C和银杏内酯J；

所述的第115～132流分，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶40∶15～100∶50∶20，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，经脱色、浓缩、结晶，得到银杏内酯A和银杏内酯B；

对得到的各成分流份加入凹凸棒和活性炭回流脱色30min，抽滤，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积的0.3～0.4倍，放置养晶。

(16)银杏黄酮的分离

萃余液III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物V；

所述的干燥物V，经色谱分离，得到银杏黄酮；

所述的配位层析柱的制备：取48～75μm柱色谱硅胶与配位剂置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5～15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；

所述的配位层析柱平衡，用乙酸乙酯-甲醇试液冲洗配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；

所述的干燥物V，用甲醇溶解，过滤除去不溶物，加入到配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇试液洗脱，分段收集流出液，用薄层色谱和高效液相色谱检测各段流出液中黄酮的情况；

所述的合并流出液中黄酮含量≥60％的部分合并，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至相对比重1.05～1.08，加入少量石油醚沉淀，过滤沉淀物，真空干燥，得银杏黄酮；

所述的配位剂为含Cu²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等的一种或两种以上混合配位剂。

(17)银杏叶木质素的提取分离

沉淀物I加入pH值9～10的碳酸钠或碳酸氢钠溶液1～2倍量(w/w)，加热煮沸30～80min，抽滤，得清夜X；滤饼水洗至流出液清亮，与前面抽滤液合并，得清夜XI；

所述的清夜XI，减压浓缩至比重1.10～1.20，用盐酸、硫酸或磷酸中之一调节pH值1～3，沉淀，压滤，滤饼烘干，得到银杏叶木质素。

(18)低共熔溶剂的再生

下相I加入活性碳，加热至40～70℃，保温30min，过滤，滤液在真空度72.6～83.8KPa，温度60～70℃下浓缩，得到再生低共熔溶剂。

发明附图

图1银杏叶的提取及银杏叶蛋白和氨基酸的分离

图2莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸的分离

图3银杏多糖和低聚糖的分离

图4银杏多酚的分离

图5叶绿素铜钠的分离

图6银杏色素、银杏酸和聚戊烯醇的分离

图7银杏黄酮、银杏内酯和单宁的分离

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

下述实施例中，室温指15～25℃。

仪器与材料：环氧乙烷环氧丙烷无规共聚物(北京万恩化工制品公司，L64聚氧丙烯相对分子质量1750，EOPO平均相对分子质量2870，L62聚氧丙烯相对分子质量1750，EOPO平均相对分子质量2500，L61聚氧丙烯相对分子质量1750，EOPO平均相对分子质量2000，分别记为EOPO2870、EOPO2500、EOPO2000)、对照品购自美国sigma公司和中国食品药品检定研究院，MCI树脂(麦科仪(北京)科技有限公司)、弱碱性阴离子交换剂A103S(北京碧思源环保科技有限公司)、氯化胆碱、乳酸、1，4-丁二醇、甘油、尿素、丙二酸、乙二醇、葡萄糖、1，3丙二醇、正丙醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水硫酸钠、乙醇、叔丁醇、硫酸铵、乙醚、石油醚(60～90℃)、异丙醇、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙酸乙酯、硝酸银、正己烷、氯化钠、碳酸钠、硫酸铜、氯化铜、六水合三氯化铝、氯化锌、氯化镍、酒石酸亚铁、硝酸铝、亚硝酸钠均购自阿拉丁、百灵威、Aldrich、天津市科密欧化学试剂有限公司和国药集团化学试剂有限公司；二乙氨乙基的琼脂糖凝胶购自北京索莱宝科技有限公司、Tris-盐酸缓冲液和巴比妥-盐酸和磷酸盐缓冲液自配、waters高效液相色谱、Uv-260紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，800离心沉淀器(上海易用器械十厂)，匀浆器(上海净信实业发展有限公司)、水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)、真空干燥箱(南京沃环科技实业有限公司)、透析袋(上海亮惠包装材料有限公司)、XAD型大孔树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)、药典筛(新乡市大汉振动机械有限公司)、硅胶、硅胶薄层板(青岛海洋化工有限公司)、点样毛细管(华西医科大学仪器厂)、凹凸棒(灵寿县玄光矿产品加工厂)、活性碳(溧阳市紫金活性炭有限公司)、真空水泵SHB-IIIG(郑州长城仪器有限公司)、Superflo-250 column径向流色谱仪(美国Sepragen公司)。

DES的配制：将氢键受体氯化胆碱和氢键供体1，4-丁二醇按摩尔比为1∶(0.5～5)混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至透明液体形成，透明液体形成后保存在45～50℃过夜，观察液体有无固体析出，液体稳定没有固体析出，即得到可用于银杏叶提取的低共熔溶剂。

500g银杏叶加入5L低共熔溶剂混合放入匀浆器中，匀浆破壁后进行超高压提取，在温度22～30℃下浸泡30～120min，在转速1500～2500r/min下搅拌破碎，匀浆30～60s，然后将浆料放入超高压提取装置中，在40～60℃进行提取，升压阶段，低共熔溶剂在非常高的压力差作用下通过渗透作用迅速进入银杏叶细胞内部，细胞发生了一次破坏，在5～30min内将提取容器内的压强升高到200～700Mpa，保持压强10～30min，在高压条件作用下，银杏叶有效成分以较快的溶解速度迅速溶解，在浓度差的推动下，有效成分通过渗透由细胞内释放出细胞外；在5～30s内迅速将压强泄为常压，在非常高的反向压力作用下，细胞发生了二次破坏，经过一次破坏、二次破坏，银杏叶有效成分的提取率都有明显的提高。如此重复3～5次，制得固液混合物I。将固液混合物I移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，固液分离后，得到清液I和沉淀物I；清液I为低共熔溶剂DES提取的银杏叶中多种成分，沉淀物I为银杏叶料渣，所述的升压，用加压泵加压至所需压力。

制备双水相体系：所述的双水相体系的制备：将分子量为2000～3000环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)100.0～200.0g加入到100.0～200.0mL丙酮中，超声5～10min，得溶液1，将摩尔比2∶1的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾混合物100.5～170.2g用300～500mL去离子水溶解，得溶液2，将100mL溶液1加热至30～50℃，搅拌下缓慢加入80～150mL溶液2，使溶液中EOPO浓度为30～70wt％，盐的浓度为0.05～0.15g/mL，静置，形成的双水相溶液。向此双水相体系中加入清液I，混合均匀，静置，形成EOPO/DES双水相体系(ATPS)，混合均匀后，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，分离水相和富含EOPO的有机相；上相I为EOPO相，下相I为DES相。

对上相I(富含EOPO)进行温度诱导分离，加入30mL乙醇和0.5～1.0g氯化镁溶液，加热至60～70℃，保温30min，调pH值3～5，自动分成两相，上相II富含水，下相II富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集；上相II富含多糖、低聚糖、蛋白质和氨基酸，下相II富含EOPO，溶解有银杏脂溶性成分。溶解有银杏脂溶性成分的下相II(富含EOPO)再次进行温度诱导分离，在下相II加入0.5～1.0g氯化镁溶液，在50～70℃水浴10～30min，加入30mL乙醇，调pH值3～5，形成新的双水相体系，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，上相III富含有机成分，下相III富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集。

上相II在压力-(0.08～0.095)MPa，温度50～70℃下浓缩，得到浓缩液I；浓缩液I中加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，浓缩液I与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50wt％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，分别收集上相IV、中相I和下相IV；中相I在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩，得到浓缩液II；浓缩液II中加入1500～2000mL乙醇，使乙醇的质量百分比浓度达到70～80％，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉物I；醇沉混合物I移入离心机的离心管中，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液II和沉淀物II；沉淀物II在温度50～60℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h后制得银杏蛋白50.6g；上述清液II在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，该浸膏然后在温度50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h后制得氨基酸。

上相IV为叔丁醇，富集莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得浓缩液III；浓缩液III中加入3～5倍水(w/w)溶解，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液III和沉淀物III；清液III经MCI树脂吸附分离。取MCI树脂用无水乙醇浸泡24h，充分溶胀，然后用无水乙醇淋洗至无浑浊，最后用去离子水洗至无醇味，水洗涤平衡后，吸干树脂水分待用；采用柱径高比为1∶10的层析柱，以处理后的MCI树脂为填料，清液III以0.5mL/min的上样速度上样，待检测流出液刚好有有效成分流出时停止上柱，吸附3～4h，得吸附饱和的MCI树脂柱，用水和洗脱液梯度洗脱；对吸附饱和的MCI树脂柱采用2.0～4.0BV，pH值4～6的水进行洗涤，洗去杂质；用2.0～4.0BV的体积浓度25～35％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液I；用2.0～4.0BV的体积浓度50～70％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液II；洗脱液I在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩至原体积1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到6-羟基犬尿喹啉酸10.35g，含量98.53％；检测方法：色谱柱为XDB-C8(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.1％磷酸-乙腈-甲醇(94∶5∶1)，流速1.0mL/min，检测波长为350nm。制剂样品经粉碎后，用50％甲醇溶解，过滤后进样测定。洗脱液II在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到莽草酸15.26g，含量98.42％。

下相IV装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，流水中的透析液为清夜IV，透析袋中的液体为清夜V，通过径向流色谱纯化进一步纯化；将上述清夜V用洗脱液配成溶液，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液VI和沉淀物IV；清液VI经径向流色谱柱分离银杏多糖。离子交换剂A103S填料用洗脱液浸泡2～4h，配制成m(离子交换填料)∶v(洗脱液)＝20∶100～40∶100(g∶mL)的填料液，以流速10～20mL/min装入径向流色谱柱，用逆时针和顺时针各平衡100～200mL；用恒流泵泵入两倍树脂柱体积的纯净水洗涤，再打开放液阀，将树脂柱内的纯净水放出，将清液IV流过装有离子交换剂A103S填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱得洗脱液浓度以0～0.5mol/L，流速为5～15mL/min。每10mL收集一个流份，用苯酚-硫酸法检测各流份中的多糖，相同流份合并为一个组分，得到3个组分，为洗脱液III，得到分子量为60000～90000Da的A组分，分子量为160000～200000Da的B组分和分子量为220000～260000的C组分。所述的洗脱液为pH值6.5～8.5的Tris-盐酸缓冲液、pH值6.8～9.0巴比妥-盐酸缓冲液和pH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中之一。将上述A组分、B组分和C组分分别收集后浓缩，在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后真空干燥，相应地得到白色粉末状的银杏叶多糖16.73g，含量92.82％。

清夜III在真空度-(0.07～0.08)MPa，温度60～70℃下浓缩至浸膏，加入1500～2000mL乙醇，使乙醇的质量百分比浓度达到70～80％，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉混合物II；醇沉混合物II移入离心机的离心管中，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，取下离心管，得到清液VII和沉淀物V，弃去上清液VII；沉淀物III在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏低聚糖4.28g。

上相III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到浓缩液IV，浓缩液IV中加入水，充分混匀，得到固液混合物II；固液混合物II移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液VIII和沉淀物VI；上清液IV中加入质量百分比浓度18％的盐酸调节pH值3～5，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液IX和沉淀物VII，弃去沉淀物VII；清液IX通过XAD型大孔吸附树脂柱吸附多酚，未吸附的成分流出柱体制得收集液I。新树脂装柱前，应该使用乙醇和纯化水对树脂柱相关管道进行清洗，然后，向柱内注入1/3体积的水，取少量树脂，将树脂从交换柱顶部人孔处装入柱内，关闭人孔，向柱内注水，同时打开交换柱下部排水阀门，用≥178um筛网在排水口拦截，观察是否有树脂泄露，如果有个别小颗粒，属于正常现象，如果有大颗粒树脂出现，且量比较多，说明交换柱下滤板有问题，应把树脂和水放出，检查下滤板焊缝和水帽，查找原因，进行检修，检修完毕后，确定符合要求。量取一定量的树脂与去离子水在烧杯中进行混合，然后将混合的树脂水溶液倒入量筒中，使树脂充分沉降，通过补加和移取，使树脂床层与相应刻度持平。关闭树脂柱下端的出口阀门，用水将量筒中的树脂全部导入树脂柱中，然后打开树脂柱出口阀门，使树脂在柱内沉降压实，然后关闭树脂柱出口阀门，待用，须保留液面高于树脂床层1～2cm，避免干柱。树脂预处理主要是为了清除树脂孔道内残留的有机分子、致孔剂等，一般可采取醇洗、水洗的方式(过柱清洗或浸泡处理)，至清洗出口液或浸泡液无浑浊、无味，待用。用质量百分比浓度50～80％的乙醇洗脱多酚，得到收集液II；收集液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得浓缩液IV；浓缩液IV在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏多酚8.83g，主要为花青素类。

树脂柱梯度洗脱：用2.0～4.0BV的8～10％体积溶度的乙醇水溶液洗脱杂质；接着用2.0～4.0BV的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的杂质；再用2.0～5.0BV的质量百分比浓度50～80％的乙醇洗脱多酚。

将沉淀物III在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得干燥物I；干燥物I中加入乙醇溶解，加入少量水搅成糊状，得固液混合物III；固液混合物III中加入石油醚萃取三次，得到萃取液I和萃余液I；萃取液I在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，加入异丙醇和正己烷溶解，得溶解液I；溶解液I中加入氢氧化钠液，20％硫酸铜液，60℃皂化30min，得到皂化液I；皂化液I中加入水分层，得到上相V和下相V；下相V用正己烷萃取，得到萃取液II和萃余液II；萃取液II和上相V合并，得到油相I；萃余液II在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到叶绿素铜钠盐4.25g。

油相I加入1～3倍量(v/v)石油醚和1～3倍量(v/v)90％乙醇，混合液调节pH值10，充分混匀，分层，得到上相VI和下相VI；下相VI在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物II；干燥物II经色谱分离，得到银杏酸。干燥物II用甲醇溶解，过滤，滤液加入干燥物II重量1～2倍的48～75μm硅胶，拌匀，挥去溶剂，晾干，粉碎过75μm筛，硅胶色谱柱中加入干燥物II重量15～20倍的48～75μm柱色谱硅胶，进行色谱分离；色谱柱径高比为1∶10～1∶20，先用石油醚洗脱，直至流出液色浅，再用石油醚-乙酸乙酯-甲醇(80∶15∶5，v/v/v)洗脱，每30mL为一个保留体积，每3个保留体积收集为一个流份，共收集8个流份，依次为Fr.1～Fr.8；各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同的部分，每个梯度洗脱到硅胶薄层色谱检测无斑点后，更换下一梯度洗脱；第4～5个流份Fr.4～Fr.5部分主要含银杏酸C15∶1、C13∶0和C17∶2；色谱柱再用石油醚-乙酸乙酯-甲醇(70∶20∶10，v/v/v)洗脱，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.9～Fr.15，各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，每个梯度洗脱到硅胶薄层色谱检测无斑点后，更换下一梯度洗脱；Fr.13～Fr.14部分主要含银杏酸C15∶0和C17∶1；流份Fr.4～Fr.5部分合并为Fr.4(5)，进一步进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(60∶40，v/v)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集6个流份，依次为Fr.4(5)-1～Fr.4(5)-6，各个流份分别经硅胶薄层色谱和高效液相色谱检测分析，合并相同部分，Fr.4(5)-4含银杏酸C15∶1、C13∶0，Fr4(5)-5含银杏酸C17∶2；流份Fr.13～Fr.14部分部分合并为Fr.13(14)，进一步进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(50∶50，v/v)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.13(14)-1～Fr.13(14)-7，各个流份分别经硅胶薄层色谱和高效液相色谱检测分析，合并相同部分，Fr.13(14)-5含银杏酸C15∶0和C17∶1。Fr.4(5)-4和Fr.13(14)-5部分分别进行半制备高效液相色谱分离，半制备高效液相色谱条件为C18制备柱，波长190～280nm，柱温30℃，流动相甲醇(A)-水(B)，流速5mL/min，进样量1mL，梯度洗脱(0～55min，10～40％B)。分别得到3.22g银杏酸C15∶1，1.41g银杏酸C13∶0，0.32g银杏酸C15∶0，1.57g银杏酸C17∶1，含量均大于98％。Fr.4(5)-5经脱色，浓缩，结晶，得到0.27g银杏酸C17∶2，含量大于98％。薄层色谱：以硅胶G为固定相，石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(18∶1∶1)为展开剂对银杏酸进行分离，紫外分光光度法测定，波长为307nm。液相色谱检测银杏酸含量的条件：色谱柱InertsilODS 2，流动相为甲醇-3％HAc溶液(92∶8)，流速：10mL·min^-1，柱温：40℃，紫外检测波长310nm。

上相VI经酸性水洗至中性，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物III；干燥物III经色谱分离，得到聚戊烯醇和色素。根据柱层析法的分离原理即物质在固定相上的吸附力不同而使物质得到分离，同时利用银化硅胶层析柱中银离子能与聚异戊烯醇的碳-碳双键形成络合物来分离。银化硅胶的制备：在避光条件下，将48～75μm硅胶加入到含有8～20％的硝酸银溶液中，充分搅拌成糊状，在90～95℃水浴下加热搅拌20～40min，然后冷却至25～35℃，抽滤，抽滤物在真空干燥箱内活化15～25h，制得银化硅胶，置于阴暗处备用；将银化硅胶置于石油醚中搅拌排除气泡，静置使其充分溶胀，加入层析柱中，层析柱用锡纸包裹，用石油醚洗脱，平衡；干燥物III用石油醚溶解，滴加到银化硅层析柱上端内，打开层析柱下端阀门，让样品液缓缓吸附在银化硅胶，待即将吸附完时加入石油醚洗脱，得到洗脱液IV，减压浓缩，得到银杏色素，主要为叶黄素50.34g。

所述的梯度洗脱，使用石油醚-乙酸乙酯(100∶5～100∶10，v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，10～20mL为一个流份，各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同的部分；经薄层色谱检测主要含有聚异戊烯醇的流份合并，得到洗脱液V，旋蒸，除去洗脱剂，用正己烷溶解，加入饱和的氯化钠溶液去除Ag⁺，溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤，得到滤液；滤液减压蒸干，加入无水甲醇溶解，加入凹凸棒脱色30min，抽滤，滤液在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至1/3～1/4体积，静置，结晶，得到聚戊烯醇9.62g，含量98.3％。薄层色谱：以ZnCl2的CH3COOH溶液-CH3COCl(10∶1，v/v)为显色剂，使聚戊烯醇化合物显色。高效液相色谱法确定桑叶聚戊烯醇的异戊烯基单元数和含量的方法，采用ThermoC18ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇-异丙醇(8∶7，v/v)，流速为1.50mL·min^-1，柱温为25℃，检测器为PDA。

萃余液I加入少量水，搅匀，以乙酸乙酯萃取，萃取液III和萃余液III，萃取液III以8wt％碳酸钠溶液萃取，得到萃取液IV和萃余液IV；萃取液IV以0.7wt％氢氧化钠萃取，得到萃取液V和萃余液V；萃余液V中和后，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得银杏单宁6.35g，含量94.62％，采用酒石酸亚铁和硝酸铝-亚硝酸钠双显色体系计算分光光度法测定银杏单宁含量。

萃取液V经酸性水洗至中性，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得浓缩液V；浓缩液V经色谱分离，得到银杏内酯；银杏内酯采用硅胶柱色谱进行分离；粒径48～75μm的硅胶，加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌，所用溶剂为洗脱液组分中极性最低者，将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内，随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用溶剂将其冲入柱中。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定，柱床约被压缩至9/10体积，无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

所述的层析柱规格为30mm×600mm，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，体积比依次为100∶0、100∶5、100∶10、100∶15、100∶20、100∶25、100∶35、100∶50、100∶70、0∶100，洗脱液流速3～5mL/min，每一梯度的洗脱液用量与固定相量比为5～15mL∶1g，每10～20mL体积为一流份，收集165个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同的部分，分别合并流份1～5、流份6～14、流份15～22、流份23～32、流份33～44、流份45～57、流份58～63、流份64～79、流份80～114、流份115～132、流份133～150、流份151～165；所述的第15～22流分进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶20∶5～100∶30∶10，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，分离得到72.5mg银杏内酯M，白果内酯含量均大于98％；所述的第45～57流分进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶30∶10～100∶40∶15，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，分离得到118.2mg银杏内酯C，83.7mg银杏内酯J，含量均大于98％；所述的第115～132流分进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶40∶15～100∶50∶20，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，经薄层色谱和高效液相色谱检测，合并相同部分，分离得到136.5mg银杏内酯A，112.4mg银杏内酯B，含量均大于98％；对得到的各成分流份加入凹凸棒和活性炭回流脱色30min，抽滤，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积的0.3～0.4倍，放置养晶。薄层色谱：用醋酸钠改性硅胶薄层板展开，以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂上行展开，用醋酸蒸汽熏15min，140～160℃加热30min，放冷，紫外灯下检视。高效液相色谱：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Thermo，Hypersil 250mm×4.6mm，5μm)，以正丙醇-水(1∶84，v/v)混合液(A)和四氢呋喃(B)为流动相，柱温35℃，流动相流速1mL·min^-1，漂移管温度为50℃，气体流量为1.2L·min^-1。

萃余液III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物IV；干燥物IV经色谱分离，得到银杏黄酮。配位层析柱的制备：取48～75μm柱色谱硅胶与配位剂置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5～15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；配位层析柱平衡，用乙酸乙酯-甲醇试液冲洗配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；干燥物V用甲醇溶解，过滤除去不溶物，加入到配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇试液洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中黄酮的情况；合并流出液中黄酮含量≥60％的部分合并，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至相对比重1.05～1.08，加入少量石油醚沉淀，过滤沉淀物，真空干燥，得银杏总黄酮8.75g，含量92.46％；所述的配位剂为含Cu²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等的一种或两种以上混合配位剂。高效液相色谱：C18柱(200mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.4％磷酸水溶液(50∶50)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为360nm，柱温为30℃。薄层色谱：硅胶G薄层板上，用体积比25∶2∶1.5∶1.5的氯仿-甲醇-甲酸-水四元溶剂进行展开，显色剂为3％三氯化铝乙醇溶液，365nm紫外光下检视，银杏叶薄层色谱斑点呈黄绿色荧光。

沉淀物I加入pH值9～10的碳酸钠或碳酸氢钠溶液1～2倍量(w/w)，加热煮沸30～80min，抽滤，得清夜X，滤饼用水洗，直至流出液清亮，洗液与滤液合并，得清夜XI；减压浓缩至比重1.10～1.20，用盐酸、硫酸或磷酸中之一调节pH值1～3，沉淀，压滤，滤饼烘干，得到银杏叶木质素。

下相I加入活性碳，加热至40～70℃，保温30min，过滤，滤液在真空度-(0.07～0.08)MPa，温度60～70℃下浓缩，得到再生低共熔溶剂。

Claims (9)

1.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，该提取方法中包括下列步骤：

步骤一：制备银杏叶总提取物 将银杏叶和低共熔溶剂(DES)放入匀浆器中，在温度22～30℃下浸泡30～120min后，在转速1500～2500r/min下搅拌破碎，并匀浆30～60s，然后放入超高压提取容器中，在40～60℃经升压、保压和泄压阶段进行提取；

所述的升压阶段，在5～30min内将提取容器内的压强升高到200～700Mpa；

所述的保压阶段，保持200～700Mpa的压强10～30min；

所述的泄压阶段，在5～30s内迅速将压强泄为常压；

所述的升压、保压、泄压阶段重复3～5次，制得固液混合物I；

所述的升压，用加压泵加压至所需压力；

步骤二：将固液混合物I装入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液I和沉淀物I；

步骤三：在环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)/磷酸二氢钾体系中，加入清液I，混合均匀，静置，形成EOPO/DES双水相体系(ATPS)，上相I为EOPO相，下相I为DES相；

步骤四：对上相I进行温度诱导分离，加入30mL乙醇和0.5～1.0g氯化镁溶液，加热至60～70℃，保温30min，调pH值3～5，自动分成两相，上相II富含水，下相II富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集；

步骤五：下相II再次进行温度诱导分离，在下相II加入0.5～1.0g氯化镁溶液，在50～70℃水浴10～30min，加入30mL乙醇，调pH值3～5，形成新的ATPS，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，上相III富含有机成分，下相III富含EOPO，分液漏斗分离上下相，分别收集；

步骤六：上相II在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩，得到浓缩液I，在浓缩液I中加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，浓缩液I与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50wt％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，分别收集上相IV、中相I和下相IV；

所述的中相I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩，得到浓缩液II；

所述的浓缩液II，加入1500～2000mL乙醇，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉物I；

所述乙醇的质量百分比浓度为70～80％；

所述的醇沉混合物I，移入离心机的离心管中，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液II和沉淀物II；

所述的沉淀物II，在温度50～60℃，真空度-(0.08～0.095)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏蛋白；

所述的清液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至浸膏，该浸膏在温度50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h后制得氨基酸。

步骤七：上相IV为叔丁醇，富集莽草酸和6-羟基犬尿喹啉酸，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得浓缩液III；

所述的浓缩液III，加入3～5倍水(w/w)溶解，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液III和沉淀物III；

所述的清液III，经MCI树脂吸附分离；

步骤八：下相IV装入透析袋中，依次在流水和去离子水中透析，流水中的透析液为清夜IV，透析袋中的液体为清夜V；

所述的清夜V，用洗脱液配成溶液，在转速为4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液VI和沉淀物IV：

所述的清液VI，通过径向流色谱柱分离银杏多糖；

步骤九：清夜III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度60～70℃下浓缩至浸膏，加入1500～2000mL乙醇，并在0～4℃条件下静置20～40min后，制得醇沉混合物II；

所述的乙醇的质量百分比浓度为70～80％；

所述的醇沉混合物II，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min的条件下离心分离10～20min后，得到清液VII和沉淀物V，弃去上清液VII；

所述的沉淀物V，在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏低聚糖；

步骤十：上相III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到浓缩液IV，在浓缩液IV中加入水，充分混匀，得到固液混合物II；

所述的固液混合物II，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液VIII和沉淀物VI；

所述的清液VIII，加入质量百分比浓度为18％的盐酸，调节pH值3～5，移入离心机的离心管中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min后，获得清液IX和沉淀物VII，弃去沉淀物VII；

所述的清液IX，通过XAD型大孔吸附树脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱体制得收集液I；

所述的梯度洗脱，用2.0～4.0BV的8～10％体积溶度的乙醇水溶液洗脱杂质；接着用2.0～4.0BV的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的杂质；再用2.0～5.0BV的质量百分比浓度50～80％的乙醇洗脱多酚，得到收集液II；

所述的收集液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得浓缩液IV；

所述的浓缩液IV，在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得银杏多酚；

步骤十一：将沉淀物III在温度为50～70℃，真空度-(0.07～0.08)MPa条件下，干燥5～10h，制得干燥物I；

所述的干燥物I，加入乙醇溶解，加入少量水搅成糊状，得固液混合物III；

所述的固液混合物III，加入石油醚等体积萃取三次，得到萃取液I和萃余液I；

所述的萃取液I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩成相对比重1.05～1.10的浸膏，加入异丙醇和正己烷溶解，得溶解液I；

所述的溶解液I，加入碱液，20％硫酸铜液，60℃皂化30min，得到皂化液I；

所述的皂化液I，加入水搅匀，分层，得到上相V和下相V；

所述的下相V，用正己烷萃取，得到萃取液II和萃余液II，萃取液II和上相V合并，得到油相I；

所述的萃余液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，得到叶绿素铜钠盐；

步骤十二：油相I加入1～3倍量(v/v)石油醚和1～3倍量(v/v)90％乙醇，混合液调节pH值10，充分混匀，分层，得到上相VI和下相VI；

所述的下相VI，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物II；

所述的干燥物II，经色谱分离，得到银杏酸；

步骤十三：上相VI经酸性水洗至中性，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物III；

所述的干燥物III，经色谱分离，得到聚戊烯醇和色素；

步骤十四：萃余液I加入少量水，搅匀，以乙酸乙酯萃取，萃取液III和萃余液III；

所述的萃取液III，以6.0～10.0wt％碳酸钠溶液萃取，得到萃取液IV和萃余液IV；

所述的萃取液IV，以0.5～1.0wt％氢氧化钠萃取，得到萃取液V和萃余液V；

所述的萃余液V，中和后，在真空度82.7～90.6KPa，温度40～50℃下浓缩，制得银杏单宁；

步骤十五：萃取液V经酸性水洗至中性，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得浓缩液V；

所述的浓缩液V，经色谱分离，得到银杏内酯；

步骤十六：萃余液III在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩，制得干燥物IV；

所述的干燥物IV，经色谱分离，得到银杏黄酮；

步骤十七：沉淀物I加入pH值9～10的碳酸钠或碳酸氢钠溶液1～2倍量(w/w)，加热煮沸30～80min，抽滤，得清夜X，滤饼用水洗，直至流出液清亮，洗液与滤液合并，得清夜XI；

所述的清夜XI：减压浓缩至相对比重1.10～1.20，用盐酸、硫酸或磷酸中之一调节pH值1～3，沉淀，压滤，滤饼烘干，得到银杏叶木质素；

步骤十八：低共熔溶剂的再生下相I加入活性碳，加热至40～70℃，保温30min，过滤，滤液真空度-(0.07～0.08)MPa，温度60～70℃下浓缩，得到再生低共熔溶剂。

2.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤一中所述的低共熔溶剂为氢键受体、氢键供体和水；

所述的低共熔溶剂中水的含量为10～30wt％；

所述的银杏叶和低共熔溶剂的料液比为20～100mg/mL；

所述的氢键受体，选自氯化胆碱、甜菜碱或甲基三辛基氯化铵中之一；

所述的氢键供体，选自乳酸、1，4-丁二醇、甘油、丙二酸、乳酸、乙二醇、1，3丙二醇或正丙醇中之一；

所述的低共熔溶剂中氢键受体和供体给体的摩尔比为1∶(0.5～5)。

3.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤三中所述的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物/磷酸二氢钾双水相体系中，

所述的共聚物为环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和水按体积比1～3∶1～4混合，然后向其中加入盐；

所述的盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或无水硫酸钠，混合均匀，所得溶液中盐的浓度为0.05～0.15g/mL，向溶液中按2.0～5.0mg/mL的量加入上清液I，混合均匀后，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，形成ATPS，上相I为EOPO相，下相I为DES相；

所述环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的分子量为2000～3000；

所述环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的浓度为30～70wt％。

4.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤七中所述的MCI树脂吸附分离，MCI树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将清液III加入树脂柱，待检测流出液刚好有有效成分流出时停止上柱，得吸附饱和的MCI树脂柱，用水和洗脱液梯度洗脱；

所述的水洗脱，对吸附饱和的MCI树脂柱采用2.0～4.0BV，pH值4～6的水进行洗脱，洗去杂质；

所述的梯度洗脱，用2.0～4.0BV的体积浓度25～35％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液I；

用2.0～4.0BV的体积浓度50～70％的乙醇水溶液洗脱，得洗脱液II；

所述的洗脱液I，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度50～60℃下浓缩至原体积的1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到6-羟基犬尿喹啉酸；

所述的洗脱液II，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积的1/3～1/4，加入少量乙醚，放置结晶，得到莽草酸。

5.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤八所述的径向流色谱，将清液VI流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，每10mL收集一个流份，用苯酚-硫酸法检测各流份中的多糖，相同流份合并为一个组分，得到3个组分，为洗脱液III，得到分子量为60000～90000Da的A组分，分子量为160000～200000Da的B组分和分子量为220000～260000的C组分；

所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶离子交换剂A103S；

所述的洗脱液为pH值6.5～8.5的Tris-盐酸缓冲液、pH值6.8～9.0巴比妥-盐酸缓冲液和pH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中之一；

所述的阴离子交换填料用洗脱液浸泡2～4h，配制成m(阴离子交换填料)∶v(洗脱液)＝20∶100～40∶100(g∶mL)的填料液，填料液装入径向流色谱柱得流速10～20mL/min，用逆时针和顺时针各平衡100～200mL；

所述的线性梯度洗脱得洗脱液浓度以0～0.5mol/L，流速为5～15mL/min；

所述的A组分、B组分和C组分，分别收集后浓缩，在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后真空干燥，得到白色粉末状的银杏叶多糖。

6.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤十二所述的银杏酸的分离；

所述的干燥物II用甲醇溶解，过滤，滤液加入干燥物II重量1～2倍的48～75μm硅胶，拌匀，挥去溶剂，晾干，粉碎过75μm筛，硅胶色谱柱中加入干燥物II重量15～20倍的48～75μm柱色谱硅胶，进行色谱分离；

所述的硅胶色谱柱径高比为1∶10～1∶20，先用石油醚洗脱，直至流出液色浅，再用石油醚-乙酸乙酯-甲醇(80∶15∶5，v/v/v)洗脱，每30mL为一个保留体积，每3个保留体积收集为一个流份，共收集8个流份，依次为Fr.1～Fr.8；各个流份分别经TLC检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，每个梯度洗脱到TLC检测分析无斑点后，更换下一梯度洗脱；第4～5个流份Fr.4～Fr.5部分主要含银杏酸C15：1、C13：0和C17：2；

所述的石油醚-乙酸乙酯-甲醇(70∶20∶10，v/v/v)洗脱，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.9～Fr.15，各个流份分别经TLC检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，每个梯度洗脱到TLC检测分析无斑点后，更换下一梯度洗脱；Fr.13～Fr.14部分主要含银杏酸C15：0和C17：1；

所述的流份Fr.4～Fr.5部分，合并为Fr.4(5)，进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(60∶40，v/v)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集6个流份，依次为Fr.4(5)-1～Fr.4(5)-6，各个流份分别经TLC和HPLC检测分析，合并相同部分，Fr.4(5)-4含银杏酸C15：1、C13：0，Fr4(5)-5含银杏酸C17：2；

所述的流份Fr.13～Fr.14，合并为Fr.13(14)，进行硅胶柱色谱分离，采用48～75μm柱色谱硅胶装柱，硅胶拌样，干法上柱，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(50∶50，v/v)，每3个保留体积收集为一个流份，共收集7个流份，依次为Fr.13(14)-1～Fr.13(14)-7，各个流份分别经TLC和HPLC检测分析，合并相同部分；Fr.13(14)-5含银杏酸C15：0和C17：1；

所述的Fr.4(5)-5部分，经脱色，浓缩，结晶，得到银杏酸C17：2；

所述的Fr.4(5)-4部分，进行半制备高效液相色谱分离，流动相采用甲醇-水溶液洗脱，分别得到银杏酸C15：1和C13：0；

所述的Fr.13(14)-5部分，进行半制备高效液相色谱分离，流动相采用甲醇-水溶液洗脱，分别得到银杏酸C15：0和C17：1；

所述的半制备高效液相色谱条件为C18制备柱、波长190～280nm、柱温30℃、流动相甲醇(A)-水(B)，流速5mL/min，进样量1mL，梯度洗脱(0～55min，10～40％B)。

7.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤十三中所述的银化硅胶色谱，经银化硅胶的制备，装柱，洗脱色素，梯度洗脱，Ag⁺去除，脱色结晶等；

所述的银化硅胶的制备，在避光条件下，将48～75μm硅胶加入到含有8～20％的硝酸银溶液中，充分搅拌成糊状，在90～95℃水浴下加热搅拌20～40min，然后冷却至25～35℃，抽滤，抽滤物在真空干燥箱内活化15～25h，制得银化硅胶，置于阴暗处备用；

所述的银化硅胶装柱，置于石油醚中搅拌排除气泡，静置使其充分溶胀，加入层析柱中，层析柱用锡纸包裹，用石油醚洗脱平衡；

所述的洗脱色素，干燥物III用石油醚溶解，滴加到银化硅层析柱上端内，打开层析柱下端阀门，让样品液缓缓吸附在银化硅胶，待即将吸附完时加入石油醚洗脱，得到洗脱液IV，减压浓缩，得到银杏叶色素；

所述的梯度洗脱，以石油醚-乙酸乙酯(100∶5～100∶10，v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，10～20mL为一个流份，各个流份分别经TLC和HPLC检测分析，合并相同的流份；

所述的Ag⁺去除，将经TLC和HPLC检测分析主要含有聚戊烯醇的流份合并，得到洗脱液V，旋蒸，除去洗脱剂，用正己烷溶解，加入饱和的氯化钠溶液去除Ag⁺，加入无水硫酸钠脱水，过滤，得到滤液；

所述的脱色结晶，滤液减压蒸干，加入无水甲醇溶解，加入凹凸棒脱色30min，抽滤，滤液在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积1/3～1/4，静置，结晶，得到聚戊烯醇。

8.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤十五中所述的银杏内酯采用硅胶柱色谱进行分离；

所述的层析柱规格为30mm×600mm，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，体积比依次为100∶0、100∶5、100∶10、100∶15、100∶20、100∶25、100∶35、100∶50、100∶70、0∶100，洗脱液流速3～5mL/min，每一梯度的洗脱液用量与固定相量比为5～15mL∶1g，每10～20mL体积为一流份，收集165个流份，各个流份经TLC检测分析，根据Rf值的大小，合并Rf值相同部分，分别合并流份1～5、流份6～14、流份15～22、流份23～32、流份33～44、流份45～57、流份58～63、流份64～79、流份80～114、流份115～132、流份133～150、流份151～165；

所述的第15～22流份，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶20∶5～100∶30∶10，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，并经TLC和HPLC检测分析，合并相同部分，经脱色、浓缩、结晶，得到银杏内酯M和白果内酯；

所述的第45～57流份，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶30∶10～100∶40∶15，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，并经TLC和HPLC检测分析，合并相同部分，经脱色，浓缩，结晶，得到银杏内酯C和银杏内酯J；

所述的第115～132流份，进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(100∶40∶15～100∶50∶20，v/v/v)为洗脱剂进行洗脱，并经TLC和HPLC检测分析，合并相同部分，经脱色，浓缩，结晶，得到银杏内酯A和银杏内酯B；

所述的脱色、浓缩、结晶，对得到的各成分流份加入凹凸棒和活性炭回流脱色30min，抽滤，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至原体积的0.3～0.4倍，放置养晶。

9.一种银杏叶有效成分全产业链集成化提取富集与分离纯化方法，其特征在于，步骤十六中所述的银杏黄酮的分离，经过硅胶配位色谱分离；

所述的硅胶柱的制备，取48～75μm柱色谱硅胶与配位剂置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5～15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；

所述的配位层析柱平衡，用乙酸乙酯-甲醇试液冲洗配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；

所述的银杏黄酮的分离，将干燥物IV用甲醇溶解，过滤除去不溶物，加入到配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇洗脱剂梯度洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中黄酮的情况；

所述的洗脱剂为乙酸乙酯-甲醇混合溶剂系统，梯度洗脱的体积比依次为100∶0、100∶10、100∶20、100∶35、100∶40、100∶50、100∶60、100∶70、100∶80、0∶100；

所述的流出液中黄酮含量≥60％的部分合并，在真空度-(0.08～0.095)MPa，温度40～50℃下浓缩至相对比重1.05～1.08，加入少量石油醚沉淀，过滤沉淀物，真空干燥，得银杏黄酮；

所述的配位剂为含Cu²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等的一种或两种以上混合配位剂。

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