CN117363779B - 一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用，所述GbPAL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第515‑726位，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在银杏基因组遗传信息的基础上，结合转录组测序和重亚硫酸盐测序技术，通过差异表达和差异甲基化分析确定了GbPAL10基因上的DNA甲基化分子标记，该分子标记能够用于高产叶用银杏种质选育中，能有效提升高产叶用银杏种质选育的速率。

Description

一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用。

背景技术

银杏是我国特有的中生代孑遗植物，是我国重要的经济树种。银杏叶中富含类黄酮和类萜等次生代谢产物，包含双黄酮和银杏内酯等特有的次生代谢物，这些次生代谢产物不仅在银杏与环境的相互作用中发挥着重要作用，其提取物还能被用于预防和治疗人类的心血管疾病。标准化的银杏叶提取制剂EGb761中含有24％的银杏类黄酮和6％的萜烯三内酯。自2017年以来，银杏叶提取物在全球的销售额已超过100亿美元。为提高银杏叶提取物的产量，选育高产叶用银杏是提高银杏叶提取物产量的重要措施。

类黄酮生物合成途径已在很多植物中被研究，途径中编码关键酶的结构基因的表达量直接影响类黄酮在植物中的积累，苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL)是类黄酮生物合成途径的关键性限速酶。编码PAL的GbPAL基因在银杏叶中表达量最高，且于银杏类黄酮积累呈正相关。银杏类黄酮的积累也与环境情况有关，光照、温度、水分等环境因子的改变会影响银杏类黄酮的积累，在不同环境中银杏类黄酮含量和类黄酮生物合成关键基因的表达都存在差异。

DNA甲基化是一种保守的表观遗传修饰，它在调控基因表达和沉默转座子中发挥着重要作用。DNA甲基化在植物的生长发育过程中发挥着不可或缺的作用。植物在面对光照和温度等环境因子变化时，DNA甲基化的状态会发生变化，从而影响类黄酮生物合成途径中相关基因的表达和类黄酮的积累，最终帮助植物应对环境的变化。DNA甲基化分子标记已被应用于大黄鱼的育种中，辅助育种研究，并有效提升了大黄鱼优良品种的选育速率。

目前，尚无银杏中表观遗传相关的研究，DNA甲基化在银杏中对类黄酮生物合成的调控机制还是未知的。银杏中也没有可用于选育高产叶用银杏的分子标记，基于上述内容，本发明提出一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用，为高产叶用银杏种质筛选提供了新的方法，扩展了在裸子植物中DNA甲基化调控类黄酮生物合成机制的了解，为高产叶用银杏种质选育和提高银杏叶提取物产量提供了新的思路，为增加经济效益及社会效益提供可能。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记，所述GbPAL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第515-726位，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种上述所述的分子标记在选育高产叶用银杏种质中的应用。

本发明还提供了一种利用上述分子标记选育高产叶用银杏种质的方法，包括以下步骤：

(1)从待测银杏叶中提取DNA；

(2)将提取的DNA经亚硫酸盐转化后，以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，再以经亚硫酸盐转化后的DNA为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

(3)对扩增产物进行检测，参照所述分子标记选择GbPAL10基因甲基化水平高的植株，即为高产叶用银杏种质。

进一步改进在于，所述高产叶用银杏种质是指类黄酮合成含量高的叶用银杏种质。

进一步改进在于，所述特异性扩增引物序列为：

SEQ ID NO.3：上游引物：GAGTGTTGGGTAAGAAGGATTTTTA；

SEQ ID NO.4：上游引物：ATAAAACAATAAAACCAAATCTCCC。

进一步改进在于，步骤(2)中，所述亚硫酸盐转化的反应体系：1ng-2μg DNA、85μL重亚硫酸盐溶液，35μLDNAprotect Buffer，加入去RNA水至总体积为140μL。

进一步改进在于，步骤(2)中，所述PCR扩增程序为①98℃30s；②98℃10s；③52℃5s；④72℃2s；②-④循环次数为33；⑤72℃1min。

本发明以邳州(PZ)、曲靖(QJ)和伊宁(YN)三个不同环境地点的类黄酮含量存在差异的银杏叶为样本，通过全基因组亚硫酸盐测序(Whole genome bisulfite sequencing,WGBS)和转录组测序(Transcriptome sequencing)，并通过差异甲基化和差异表达分析分别得到了不同环境中银杏的差异甲基化区域(Differentially methylatedregions，DMR)、差异甲基化区域相关基因(DMRgene)、差异表达基因((Differentially expressed gene，DEG))和差异甲基化相关的差异表达基因(DMR-DEG)，分析得到GbPAL10基因为DMR-DEG，其表达受DNA甲基化的调控，确定了位于GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记gbpal10。将银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记gbpal10应用于江苏镇江下蜀(XS)林场的类黄酮含量不同的银杏种质(XS30、XS34、XS45、XS67、XS123)的筛选，通过亚硫酸盐处理、分子标记gbpal10的引物进行PCR扩增和Sanger测序对类黄酮含量不同种质GbPAL10的DNA甲基化水平的检测加以验证。

结果表明，不同环境中GbPAL10基因甲基化水平的变化影响其表达水平的变化及银杏叶中类黄酮的积累，银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记gbpal10可用于高产叶用银杏种质的选育。GbPAL10基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记gbpal10序列如SEQID NO.2所示，用于扩增分子标记gbpal10的上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQID NO.4所示。

本发明基于工作基础中显示不同环境银杏叶类黄酮含量的差异；采用WGBS分析银杏不同环境中GbPAL10基因甲基化水平变化情况；并通过转录组测序分析其在不同环境中的表达模式；通过差异甲基化和差异表达联合分析证实银杏不同环境中GbPAL10基因受DNA甲基化水平变化的调控，并最终影响银杏叶中类黄酮的含量。并通过对类黄酮含量不同的银杏种质GbPAL10甲基化水平的检测加以验证。

目前，对银杏类黄酮生物合成通路的研究较多，但其生物合成的表观遗传调控机制尚不明晰。本发明从表观遗传学领域研究银杏类黄酮生物合成的调控机制、筛选DNA甲基化调控的类黄酮生物合成关键基因及其DNA甲基化分子标记，进而培育类黄酮积累更多的银杏品种，可用于生产更多的药用银杏叶提取物，拓宽了银杏类黄酮生物合成的研究，对保障我国银杏叶提取物的高产，有着非常重要的理论基础与现实指导意义；同时，对DNA甲基化在其它植物类黄酮生物合成中的作用研究提供理论参考。

因此，本发明的有益效果在于：本发明在银杏基因组遗传信息的基础上，结合转录组测序和重亚硫酸盐测序技术，通过差异表达和差异甲基化分析确定了GbPAL10基因上的DNA甲基化分子标记gbpal10，该分子标记能够用于高产叶用银杏种质选育中，能有效提升高产叶用银杏种质选育的速率。

附图说明

图1为本发明提供的确定与银杏类黄酮生物合成相关的GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记及应用的方法示意图；

图2为本发明提供的不同环境中GbPAL10的DNA基因甲基化水平及表达水平变化分析图；

图3为本发明提供的与类黄酮含量相关的GbPAL10基因DNA甲基化位点；

图4为本发明提供的类黄酮含量不同的银杏种质GbPAL10基因与类黄酮含量相关的甲基化位点的DNA甲基化水平。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

一、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

二、方法

1、确定与银杏类黄酮生物合成相关的GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记，方法示意图如图1所示。

1.1、不同环境中银杏GbPAL10基因甲基化水平变化分析

1.1.1、基因组DNA提取和质检

研究所用的银杏是于邳州市国家银杏良种基地内的一株30年生银杏雌株采集接穗，接穗长度5-8cm，直径0.4-0.6cm，且每条接穗上有两个芽。将采集的接穗通过劈接嫁接至邳州(以下简称，PZ)、曲靖(以下简称，QJ)和伊宁(以下简称，YN)三地的同一品种的三年生银杏实生苗。使用基因组DNA提取试剂盒(Magen，广州)提取PZ、QJ和YN三地银杏叶片的基因组DNA，按试剂盒说明书的实验方法操作，每个地点两个生物学重复。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的降解和被污染情况，使用分光光度计(IMPLEN，美国)检测DNA的纯度，使用/>DNA检测试剂盒在荧光定量仪/>2.0Flurometer(LifeTechnologies，美国)中测定DNA的浓度。

1.1.2、文库构建、质检和上机测序

将加有0.5ngλDNA的总量为100ng的基因组DNA使用Covaris S220(Covaris，美国)超声处理为200-300bp的片段，使用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(Zymo Research，美国)对这些DNA片段进行重亚硫酸盐处理，并构建文库。文库质量在Agilent Bioanalyzer2100(Agilent，美国)系统上评估。然后，在IlluminaNovaseq 6000(Illumina，美国)上对样品进行了双端测序。通过Illumina CASAVA的操作流程分析测序图像和识别碱基，最后生成150bp的双端读长。

1.1.3、测序数据质控、比对和甲基化位点检测

首先，使用FastQC(V0.11.5)(https://github.com/s-andrews/FastQC)对原始读长的质量信息进行基本统计。然后，FASTQ格式的读长序列通过fastp(V0.20.0)进行预处理，去除测序数据的测序接头和低质量片段。通过所有过滤步骤的剩余读数作为干净的读长，所有后续的分析都基于干净的读长。最后，我们用FastQC(V0.11.5)对清洁数据读长的质量信息进行基本的统计。

比对至银杏参考基因组前，分别使用RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org)和cpgIslandExt预测重复序列和基因组的CGI轨迹。通过Bismark软件(V0.16.3)将经重亚硫酸盐处理的读长比对至参考基因组(-X 700--dovetail)。银杏参考基因组会先被转换为重亚硫酸盐-转换版本(C-T和G-A转换)，然后用bowtie2建立索引。干净的读长也会被转化重亚硫酸盐-转换版本(C-T和G-A转换)。

将两个比对过程中产生独特的最佳比对的序列读数(原始的上链和下链)与未转换的银杏基因组进行比较，并推断出所有胞嘧啶位置的甲基化状态。比对至基因组相同区域的读长被认为是重复的。统计测序深度和覆盖率，计算三种序列环境(CG、CHG和CHH)的胞嘧啶位点的覆盖度。重亚硫酸盐非转换率被计算为在λ基因组中胞嘧啶参考位置的胞嘧啶测序的百分比。得到比对结果后，通过Bismark软件(V0.16.3)进行DNA甲基化位点检测，λDNA基因组被用于评估DNA甲基化位点的可靠性，对于鉴定出的DNA甲基化位点，计算其DNA甲基化水平。

公式为：

其中ML为DNA甲基化水平；mC和umC分别代表该位点支持DNA甲基化C的reads数和不支持甲基化C的reads数。

统计三种序列环境中的C位点再启动子(转录起始位点上游2kbp区域)、外显子、内含子和重复区域的DNA甲基化水平。统计基因的基因体和上下游2kbp区域的甲基化水平。

1.1.4、差异甲基化分析

通过R包DSS(v2.12.0)鉴定差异甲基化区域(Differentially methylatedregions，DMR)，DMR的最小长度被设置为50bp，且当两个DMR之间的距离小于100bp时将会被合并，对DMR所在区域进行注释(启动子、外显子、内含子、重复区域、转录起始位点和转录终止位点)，统计DMR的平均甲基化水平及其所在区域的甲基化变化情况。QJ和YN分别与PZ比较，启动子区域或转录起始位点到转录终止位点区域上存在DMR的基因为DMRgene。

1.2、不同环境中GbPAL10基因表达水平变化分析

1.2.1、总RNA提取和质检

研究所用的银杏是于邳州市国家银杏良种基地内的一株30年生银杏雌株采集接穗，接穗长度5-8cm，直径0.4-0.6cm，且每条接穗上有两个芽。将采集的接穗通过劈接嫁接至PZ、QJ和YN三地的同一品种的三年生银杏实生苗。根据试剂盒的说明书，使用Trizol试剂盒(Invitrogen，美国)提取PZ、QJ和YN三地银杏叶片总RNA，每个地点三个生物学重复。使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，美国)仪器评估RNA质量，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检查。

1.2.2、测序文库构建、质检和上机测序

提取总RNA后，mRNA被分离和打断，合成双链cDNA，修复纯化后的cDNA末端并加A尾，连接测序接头，筛选片段后进行PCR文库富集和纯化。使用2.0Flurometer(LifeTechnologies，美国)和Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent，美国)完成文库的质检。然后使用Illumina HiSeq2500进行测序。

1.2.3、测序数据质控、比对和定量

通过Trimmomatic(v0.39)去除接头和过滤低质量序列，获得干净的读长，并使用FastQC(v0.11.9)对干净的读长进行质量评估。使用STAR(v2.7.9a)将干净的读长比对至银杏参考基因组，用RSEM(v1.3.1)计算得到比对到基因的读长数量(Counts)和表达量(Transcripts per kilobase ofexon model per million mapped reads，TPM)。

1.2.4、差异表达分析

使用DESeq2(v1.36.0)进行差异表达分析，QJ和YN分别与PZ比较，得到表达量显著上调或下调的差异表达基因(Differentially expressed gene，DEG)，筛选标准为|Log2(FoldChange)|≥1和padj＜0.05。

1.3、不同环境中GbPAL10基因差异甲基化和差异表达联合分析及DNA甲基化分子标记的确定

如图2所示，基于差异甲基化分析，筛选获得位于GbPAL10启动子区域(chr10:379923148至379923248)的DNA甲基化差异区域DMR，根据差异表达分析的结果，筛选得到不同环境中GbPAL10基因表达量的变化，分析GbPAL10基因是否为差异表达基因DMR-DEG及其DMR甲基化水平与其表达量的关系，并确定DNA甲基化分子标记gbpal10，GbPAL10基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，DNA甲基化分子标记位于所述核苷酸序列的第515-726位，DNA甲基化分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、与银杏类黄酮生物合成相关的GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记的应用

2.1、不同种质银杏叶片中GbPAL10基因DNA甲基化位点检测

2.1.1、引物设计

为了验证GbPAL10基因DNA甲基化分子标记gbpal10与类黄酮含量的关系，我们选取江苏镇江下蜀(XS)林场的类黄酮含量不同的银杏种质(编号为XS30、XS34、XS45、XS67、XS123)，用引物验证GbPAL10在不同种质中单碱基层面甲基化位点的差异，GbPAL10基因，位于9号染色体上。

用MethPrimer网站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测该基因的外显子(Exon)的甲基化的情况，结果表明该基因的外显子存在一个417bp的CpG岛，在上游引物F：GAGTGTTGGGTAAGAAGGATTTTTA，下游引物R：ATAAAACAATAAAACCAAATCTCCC之间存在8个CG甲基化位点，46个CHH甲基化位点，12个CHG甲基化位点(如图3所示)。

2.1.2、银杏基因组的DNA提取

用Magen试剂盒(YITA，北京)按说明书步骤提取江苏镇江下蜀(XS)林场的不同种质银杏(XS30、XS34、XS45、XS67、XS123)叶片的DNA，用Qubit4.0检测其质量，具体步骤如下：

(1)转移≤100mg新鲜/冻藏样品或≤20mg干燥样品至2ml离心管中，放入2颗研磨珠，连带离心管，扔进液氮。对称放入金属适配器，放入研磨机，倒入液氮，盖上金属盖，合上盖子，默认值，研磨两次。

(2)立即加入500ul Buffer SPL、20ul疏基乙醇(伸入液面以下打入)，高速涡旋使样品充分分散。65℃处理15分钟，水浴期间涡旋混匀2次。

(3)加入160ul Buffer PS至样品中。涡旋15秒，冰上放置10分钟以上。14,000xg离心5分钟。

(4)小心转移600ul上清液至新的离心管中，加入10ul RNase A混匀(打入液面以下)，室温放置10分钟消化去除RNA。

(5)加入900ul Buffer PBD(已用无水乙醇稀释)至样品中，涡旋混匀10秒。

(6)把gDNA柱装在收集管中，做标记，转移一半体积的混合液至柱子中。12,000xg离心30～60秒。倒弃滤液把柱子装回收集管，把剩余混合液转移至柱子中。12,000xg离心30～60秒。

(7)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600ul Buffer GW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12,000xg离心30～60秒。

(8)重复上述步骤。

(9)12，000xg离心2分钟去除柱子中残留的乙醇。

(10)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30～60μL预热到65℃BufferAE至柱子的膜中央。室温静置2分钟，12,000xg离心1分钟。

(11)丢弃DNA结合柱，把DNA保存于-20℃。

2.1.3、基因组DNA的重亚硫酸盐处理

使用EpiTect Fast DNABisulfite Kit对其进行重亚硫酸盐处理，具体步骤如下：

(1)将样本DNA在室温溶解，如有必要将重亚硫酸盐加热到60℃，确保所有的沉淀全部溶解。

(2)于200μL的PCR管中按表1加入以下组分。

表1亚硫酸盐反应体系设置

(3)按照表2设置以下重亚硫酸盐转化循环条件。如果PCR仪不允许设置140μL的反应体系，将仪器设置到可用的最大的体系即可。

表2亚硫酸盐转化循环条件

(4)将PCR管放在PCR仪中开始孵化。

(5)将亚硫酸盐转化后的样本DNA进行简单离心并将所有溶液收集管底，转入一个新的1.5mL的离心管。

(6)在每一个样品中加入560μL的Buffer BL后进行短暂旋涡混匀并离心，可以再分别加入250μL 96-100％的乙醇，旋涡混匀15s后离心。

(7)将MinElute DNA柱子放入收集管中后将步骤(6)所有的内容物全部转入相应的柱子中。

(8)以最大速度将柱子离心1min后，将弃废液丢弃，再将柱子重新放入收集管。

(9)每个柱子中加入500μLBuffer BW，离心1min后将废液丢弃，将柱子再次放回到收集管。

(10)每个柱子中加入500μL Buffer BD(注意不要将任何沉淀物转移进柱子)后在室温下孵育15min。

(11)将柱子离心1min后弃废液，将柱子再次放回收集管。

(12)每个柱子中加入500μL Buffer BW，离心1min后将废液丢弃，将柱子再次放回到收集管。

(13)每个柱子中加入500μL Buffer BW，离心1min后将废液丢弃，将柱子再次放回到收集管。

(14)将柱子放进新的2mL的收集管中，离心1min除去残留的液体。

(15)将收集管的盖子打开，在56℃孵育5min以将管中的液体蒸发。

(16)将柱子放进干净的1.5mL的离心管中，将20μLBuffer EB加进柱子膜的中央，轻轻的合上盖子。15,000xg(12,000rpm)离心1分钟，为增加洗脱产量可以再滴加的到离心柱膜中央，最后合并两次洗脱液即可。

(17)转化完成的DNA在2-4℃可以放置24h，如果长期储存需要放置-20℃。

2.1.4、使用高保真酶2×Phanta Max Master Mix(Vzayme，中国)和检测出的引物对亚硫酸盐修饰后的模板DNA进行扩增。PCR反应液的配置及PCR反应程序的设置如表3和表4所示。

表3PCR反应液的配置

表4PCR反应程序

得到PCR产物后，对其进行凝胶电泳，切割目的片段，并用Fast Pure GExtraction Mini Kit(Vazyme，中国)按照其步骤进行回收目的片段。

2.1.5、目的片段与载体的连接

将收获的目的片段与P-EASY-Blunt载体(TransGenBiotech，中国)连接，体系为5μL，包括1μL P-EASY-Blunt载体和4μL PCR产物，轻弹混匀后，低速瞬时离心将液体收集管底，于室温(20-37℃)反应5min后将产物置于冰上。

2.1.6、连接产物的转化

将DH5α感受态细胞(Vazyme，中国)从-80℃冰箱拿出，放在冰上融化，将连接载体后的DNA加入100μL的感受态细胞后轻轻弹管壁使溶液混匀，在冰上静置30min。在42℃水浴锅中热激45sec后，迅速将其放在冰上静置2min，再此将期间勿晃动离心管。再将700μL不含抗生素的LB液体培养基加入此离心管中，旋涡混匀管中液体。再将离心管放在37℃，200rpm摇床中复苏1h。吸取300ul液体用涂布棒将培养基均匀涂布在含抗生素的LB固体培养基的平板上。然后将离心管2,500×g，离心3min，弃掉300μL的上清液，将沉在管底的培养基用移液枪吸打重悬后，再用涂布棒将重悬后的培养基均匀涂布在含抗生素的另一个LB固体培养基的平板上。待菌液被完全吸收以后将平板倒置过来，再过夜培养12h。

2.1.7、阳性克隆鉴定

分别挑取24个单克隆至10μL ddH₂O中，将其吸打混匀后作为模板菌液。采用体系如表5及表6所示来鉴定单克隆。

表5鉴定阳性克隆溶液的配置

表6鉴定阳性克隆的PCR反应程序

将PCR产物进行凝胶电泳，确认阳性克隆后，将剩余的8μL菌液加入1mL含抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm摇床上摇菌16h，以M13F或M13R为引物，进行一代测序。

最后，将测定的序列用DNAMAN分析数据，用CyMATE(https://cymate.org/)呈现其结果(如图4)。A-E分别为XS30、XS34、XS45、XS67、XS123银杏叶片DNA中胞嘧啶甲基化图谱。圆圈、方块和三角均表示胞嘧啶残基，红色圆圈表示CpG，蓝色方块表示CHG，绿色三角表示CHH。实心表示甲基化的胞嘧啶，空心表示未甲基化的胞嘧啶。每一行代表一个克隆的序列。结果发现XS30、XS34、XS45、XS67、XS123的甲基化率分别为1.97％、1.5％、2.1％、1.06％、0.43％。

2.1.8、不同种质银杏叶片DNA中类黄酮含量及其与DNA甲基化水平相关性分析

通过高效液相色谱法对不同种植银杏叶片XS30、XS34、XS45、XS67、XS123的DNA中类黄酮含量进行检测，并将检测获得的数据与2.1.7获得的不同种质银杏叶片的DNA甲基化率进行相关性的分析。结果如表7所示。

表7类黄酮含量和甲基化率及相关性分析

从表中可以看出，银杏类黄酮生物合成相关的GbPAL10基因的DNA甲基化水平与银杏叶类黄酮的积累有关，不同种质银杏叶片DNA中类黄酮含量DNA甲基化水平之间呈现正相关，即DNA甲基化水平越高，对应DNA中类黄酮含量越高，本发明所提供的分子标记，能够用于高产叶用银杏种质选育。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记在选育高产叶用银杏种质中的应用，其特征在于，所述高产叶用银杏种质是指类黄酮合成含量高的叶用银杏种质；所述GbPAL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第515-726位，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种利用银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记选育高产叶用银杏种质的方法，其特征在于，所述高产叶用银杏种质是指类黄酮合成含量高的叶用银杏种质；所述GbPAL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第515-726位，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

方法包括以下步骤：

(1)从待测银杏叶中提取DNA；

(2)将提取的DNA经亚硫酸盐转化后，以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，再以经亚硫酸盐转化后的DNA为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

(3)对扩增产物进行检测，参照所述分子标记选择GbPAL10基因甲基化水平高的植株，即为高产叶用银杏种质。

3.根据权利要求2所述的一种利用银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记选育高产叶用银杏种质的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物序列为：

SEQ ID NO.3：上游引物：GAGTGTTGGGTAAGAAGGATTTTTA；

SEQ ID NO.4：上游引物：ATAAAACAATAAAACCAAATCTCCC。

4.根据权利要求2所述的一种利用银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记选育高产叶用银杏种质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述亚硫酸盐转化的反应体系：1ng-2μg DNA、85μL重亚硫酸盐溶液，35μLDNAprotect Buffer，加入去RNA水至总体积为140μL。

5.根据权利要求2所述的一种利用银杏GbPAL10基因的DNA甲基化分子标记选育高产叶用银杏种质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增程序为①98℃30s；②98℃10s；③52℃5s；④72℃2s；②-④循环次数为33；⑤72℃1min。