CN109917033A - 一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法 - Google Patents

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本发明属于酒类风味与品质研究领域，尤其涉及一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法。所述方法包括步骤：(1)酒样的浓缩；(2)浓缩样品的洗脱及定容：采用甲醇水溶液润洗旋蒸瓶中的旋蒸样品并定容，经膜过滤后待用；(3)再用液相色谱质谱联用方法分析进行定性和定量分析。本发明首次在酱香型白酒中检测到羟基吡嗪类化合物，经过滋味分析，此类化合物呈较强的糊味。建立酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的定量方法便于监测此类物质在酱香型白酒中含量水平，保证酱香型白酒的风味品质稳定性。

Description

一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法
技术领域
本发明属于酒类风味与品质研究领域，尤其涉及一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法。
背景技术
酱香型白酒生产过程中“三高一长”工艺最为特别，即高温制曲、高温堆积(发酵)、高温馏酒、长期贮存，独特的酿造工艺为酱香型白酒带来丰富的呈香呈味物质。以往对白酒的风味研究主要是香气物质研究，鲜有呈味物质研究。糊香是酱香型白酒的风味特征之一，在后期轮次基酒中尤为突出，通过研究发现羟基吡嗪是引起酱香型白酒呈糊香风味特征的一类化合物。
羟基吡嗪由于含有羟基，属于难挥发性物质，目前没有文献报道其定性和定量方法，更未在酱香型白酒及大曲中检测到羟基吡嗪类化合物。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的检测方法。
本发明另一个目的在于提供一种酱香型白酒中2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪3种羟基吡嗪类化合物的检测方法。
为解决以上技术问题，本发明的采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)酒样的浓缩；
(2)浓缩样品的洗脱、定容及过滤；
(3)将(2)得到的滤液用液相色谱质谱联用方法进行定性和定量分析。
(4)作为一种可以选择的实施方式，所述步骤(1)包括量取酱香型白酒于旋蒸瓶中，加入少许玻璃珠防爆沸，于水浴锅中旋蒸，浓缩至干。
作为一种可以选择的实施方式，所述步骤(2)包括采用甲醇水溶液润洗旋蒸瓶中的旋蒸样品并定容，经膜过滤后待用。
作为一种可以选择的实施方式，所述的羟基吡嗪类化合物包括2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(1)中，所述水浴的温度为40-55℃。
作为一种优选的实施方式，步骤(1)中，所述水浴的温度为45-50℃。
其中，旋蒸温度超过55℃容易使酒中的物质分解，温度低于40℃不利于旋蒸效率。
作为一种可以选择的实施方式，所述步骤(1)中，加入的酱香型白酒的体积与步骤(2)中浓缩样品定容的体积比为50-150：3。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中加入的酱香型白酒的体积与步骤(2)中旋蒸样品定容的体积比为50～100:3。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为40％-70％。
作为一种优选的实施方式，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为40％-50％。
作为一种优选的实施方式，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为50％。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(2)中，所述的膜为0.22μm的膜。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(2)中，润洗(即洗脱)次数为3次。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述的液相色谱质谱联用仪的色谱条件为：液相为Accela 1250pump，色谱柱为PFP，流动相由A相和B相组成,A相为水，B相为甲醇，采用梯度洗脱，洗脱程序如下：0～15min溶剂B的体积百分比从10％线性变到90％；在15～15.1min：0.1min之内溶剂B的体积百分比降到10％；15.1～18min溶剂B的体积百分比从10％线性变到90％冲洗色谱柱。
所述B相的体积百分比指的是A相和B相混合液中B相所占的体积百分比。
作为一种优选的实施方式，所述色谱柱为Thermo PFP,2.1mm×50mm,3.5μm。
作为一种优选的实施方式，所述流动相的流速为200-300μL/min。
作为一种更为优选的实施方式，所述流动相的流速为200μL/min。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述的液相色谱质谱联用法的质谱条件为：采用Full MS和Targeted-MS2同时扫描模式，正离子模式监测，全扫范围75～750m/z，电离电压：3500V，离子传输管温度：280℃，离子源温度150℃，雾化气压力：35arb，鞘气：30arb，辅助气压力：10arb，反吹气：5arb，Full MS扫描分辨率35000，Targeted-MS2分辨率17500，质谱采集时间1.8～15min。
作为一种可以选择的实施方式，所述羟基吡嗪类化合物的定性采用保留时间、标准品、母离子和二级碎片离子定性。
作为一种优选的实施方式，所述2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪的母离子的相对分子质量分别为181.13370、181.13356、181.13412。
作为一种可以选择的实施方式，所述步骤还包括用羟基吡嗪类化合物的标准品绘制标准曲线，由此计算待测样品中羟基吡嗪类化合物的含量。
作为一种可以选择的实施方式，所述方法还包括羟基吡嗪类化合物呈味阈值的测定。
作为一种优选的实施方式，所述羟基吡嗪类化合物在46％v/v乙醇水溶液中的呈味阈值为88.39μg/L。
作为一种可以选择的实施方式，所述酒样为酱香型白酒的一轮次至七轮次基酒。
作为一种优选的实施方式，所述酒样为五轮次至七轮次基酒。
作为一种更为优选的实施方式，所述酒样为七轮次基酒。
另一方面，本发明还提供了上述方法在判断酱香型白酒质量方面的应用。
酱香型白酒基酒后期轮次(五至七轮次)具有一定的焦糊味风格，但前期轮次(一至四轮次)不允许具有焦糊味风格，本发明的方法可以快速的监测各轮次基酒中羟基吡嗪糊味化合物的含量，结合口味阈值判断其在前期轮次酒中是否超过限量，为基酒勾兑提供数据支持，可有效提高基酒勾兑合格率。
与现有技术相比，本发明取得的有益技术效果：
1、本研究首次在酱香型白酒中检测到羟基吡嗪类化合物，经过滋味分析，此类化合物呈较强的焦糊味，在46％v/v乙醇水溶液中呈味阈值为88.39μg/L，建立酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的定量方法便于监控此类物质在酱香型白酒中含量水平，保证酱香型白酒的风味品质稳定性。
2、检测酱香型白酒中的羟基吡嗪没有经验借鉴，旋转蒸发在浓缩不挥发性物质的同时除去酒样中的大量乙醇和挥发性物质，避免挥发性物质对不挥发性物质仪器分析时的干扰，高分辨率液质质联用能避免食品尤其是复杂基质中假阳性现象，具有定性定量精准的优点。
附图说明
图1 液质联用分析3种羟基吡嗪类物质的二级提取离子图。
图2 2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪的二级碎片图。
图3 2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪的二级碎片图。
图4 2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的二级碎片图。
图5 2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的标准曲线。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
主要试剂与材料：
2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪标准品为化学合成(纯度为90％)，合成厂家为上海韶远化学科技有限公司，甲醇(HPLC级)购自美国Tedia公司。
本发明实施例中使用的酒样为酱香型白酒的一轮次至七轮次基酒。
主要仪器：
静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国Thermo fisher公司)，色谱柱:Thermo PFP,2.1mm×50mm,3.5μm(美国Thermo fisher公司)，旋转蒸发仪R-300(瑞士BUCHI公司)。
实施例1
一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法，是将酒样旋转蒸发至干，除去乙醇和挥发性物质，用40％的甲醇水溶液洗脱，定容，得到浓缩后目标物质的溶液，再采用液相色谱-高分辨质谱联用仪分析，通过建立羟基吡嗪化合物的标准曲线，最终测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的含量，具体包括以下步骤：
(1)酒样的浓缩：量取50mL七轮次基酒于250mL旋蒸瓶中，加入少许玻璃珠防爆沸，于45℃的水浴锅中旋蒸，浓缩至干。
(2)旋蒸样品的洗脱及定容：采用含有40％体积分数的甲醇水溶液分3次洗脱旋蒸瓶，将洗涤液转至3mL量瓶中，用40％体积分数的甲醇水溶液，最后定容至3mL，摇匀，经0.22μm的有机滤膜过滤后待用。
(3)液相色谱质谱联用仪：液相为Thermo Accela 1250pump，色谱柱:Thermo PFP,2.1mm×50mm,3.5μm；柱温30℃。流动相：A—水；B—甲醇；梯度洗脱：0～15min溶剂B从10％线性变到90％，15～15.1min溶剂B降到10％，15.1～18min溶剂B从10％线性变到90％冲洗色谱柱。流速：200μL/min，进样体积：2μL。采用Full MS和Targeted-MS2同时扫描模式，正离子模式监测，全扫范围75～750m/z。正离子为181.13315。电离电压：3500V，离子传输管温度：280℃，离子源温度150℃，雾化气压力：35arb，鞘气：30arb，辅助气压力：10arb，反吹气：5arb，Full MS扫描分辨率35000，Targeted-MS2分辨率17500，质谱采集时间1.8min～15min。
(4)羟基吡嗪类物质的定性：保留时间、标准品、母离子和二级碎片离子定性。
(5)羟基吡嗪类物质的定量
标准曲线的建立：采用40％体积分数的甲醇水溶液作为基质，将一定浓度5125.19mg/L的2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪加入40％甲醇水溶液中，进行逐级稀释，依次稀释6级，浓度依次为10250.38μg/L、5125.19μg/L、2562.60μg/L、1281.30μg/L、640.65μg/L、320.32μg/L；以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的峰面积为横坐标，以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的浓度为纵坐标建立标准曲线，标准曲线如图5所示；
备注：由于同分异构体化学性质相似，其余2种羟基吡嗪类物质2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪和2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪的含量测定采用2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的标准曲线进行计算。
样品测定：量取50mL酒样于250mL旋蒸瓶中，在45℃的水浴锅中旋蒸近干(或者至干)，采用40％体积分数的甲醇水溶液分3次润洗旋蒸瓶，最后合并润洗液并用40％体积分数的甲醇水溶液定容，摇匀，定容至3mL，经0.22μm的有机滤膜过滤后，采用液相色谱质谱联用仪进行分析，并通过标准曲线和浓缩倍数计算羟基吡嗪类物质的含量，结果如图1、2、3、4所示。
其中，所述2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪的母离子的相对分子质量分别为181.13370、181.13356、181.13412。
表明本发明的实验方法可以成功地检测到酱香型白酒中3种羟基吡嗪类化合物。
实施例2
一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法，是将酒样旋转蒸发除去乙醇和挥发性物质浓缩目标物质后，再采用高分辨液质质谱联用仪分析，通过建立羟基吡嗪类化合物的标准曲线，最终测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的含量，具体包括以下步骤：
(1)酒样的浓缩：量取100mL五轮次基酒于250mL旋蒸瓶中，加入少许玻璃珠防爆沸，于55℃的水浴锅中旋蒸，浓缩至干；
(2)旋蒸样品的洗脱及定容：采用含有60％体积分数的甲醇水溶液分3次洗脱(润洗)旋蒸瓶，最后定容至3mL，经0.22μm的有机滤膜过滤后待用。
(3)液相色谱质谱联用仪：液相为Thermo Accela 1250pump，色谱柱:Thermo PFP,2.1mm×50mm,3.5μm，柱温30℃。流动相：A—水；B—甲醇；梯度洗脱：0～15min溶剂B从10％线性变到90％，15～15.1min溶剂B降到10％，15.1～18min溶剂B从10％线性变到90％冲洗色谱柱。流速：200μL/min，进样体积：2μL。采用Full MS和Targeted-MS2同时扫描模式，正离子模式监测，全扫范围75～750m/z。正离子为181.13315。电离电压：3500V，离子传输管温度：280℃，离子源温度150℃，雾化气压力：35arb，鞘气：30arb，辅助气压力：10arb，反吹气：5arb，Full MS扫描分辨率35000，Targeted-MS2分辨率17500，质谱采集时间1.8min～15min。
(4)羟基吡嗪类化合物的定性：保留时间、标准品、母离子和二级碎片离子定性。
(5)羟基吡嗪类物质的定量
标准曲线的建立：采用60％体积分数的甲醇水溶液作为基质，将浓度为5125.19mg/L的2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪加入60％甲醇水溶液中，进行逐级稀释，依次稀释6级，浓度依次为10250.38μg/L、5125.19μg/L、2562.60μg/L、1281.30μg/L、640.65μg/L、320.32μg/L；以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的峰面积为横坐标，以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的浓度为纵坐标建立标准曲线。
备注：由于同分异构体化学性质相似，其余2种羟基吡嗪类物质2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪和2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪的含量测定采用2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的标准曲线进行计算。
样品测定：将100mL酒样装入250mL旋转蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪在55℃的水浴锅中旋蒸至近干(或者至干)，采用60％体积分数的甲醇水溶液分三次润洗旋蒸瓶，最后合并润洗液并用40％体积分数的甲醇水溶液定容，
摇匀，定容至3mL，经0.22μm的有机滤膜过滤后，采用液相色谱质谱联用仪进行分析，并通过标准曲线和浓缩倍数计算羟基吡嗪类物质的含量，结果表明，本发明的实验方法可以成功地检测到酱香型白酒中3种羟基吡嗪类化合物。
实施例3
一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法，是将酒样旋转蒸发除去乙醇和挥发性物质浓缩目标物质后，再采用高分辨液质质谱联用仪分析，通过建立2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的标准曲线，最终测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的含量，具体包括以下步骤：
(1)酒样的浓缩：量取150mL一轮次基酒于250mL旋蒸瓶中，加入少许玻璃珠防爆沸，于50℃的水浴锅中旋蒸，浓缩至干。
(2)旋蒸样品的洗脱及定容：采用含有50％体积分数的甲醇水溶液分3次洗脱(润洗)旋蒸瓶，最后定容至3mL，经0.22μm的膜过滤后待用。
(3)液相色谱质谱联用仪：液相为Thermo Accela 1250pump，色谱柱:Thermo PFP,2.1mm×50mm,3.5μm；柱温30℃。流动相：A—水；B—甲醇；梯度洗脱：0～15min溶剂B从10％线性变到90％，在15～15.1min溶剂B降到10％，15.1～18min溶剂B从10％线性变到90％冲洗色谱柱。流速：300μL/min，进样体积：2μL。采用Full MS和Targeted-MS2同时扫描模式，正离子模式监测，全扫范围75～750m/z。正离子为181.13315。电离电压：3500V，离子传输管温度：280℃，离子源温度150℃，雾化气压力：35arb，鞘气：30arb，辅助气压力：10arb，反吹气：5arb，Full MS扫描分辨率35000，Targeted-MS2分辨率17500，质谱采集时间1.8min～15min。
(4)羟基吡嗪类物质的定性：保留时间、标准品、母离子和二级碎片离子定性。
(5)羟基吡嗪类物质的定量
标准曲线的建立：采用50％体积分数的甲醇水溶液为基质，将一定浓度的2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪加入甲醇水溶液中，进行逐级稀释，依次稀释6级(稀释浓度依次为10250.38μg/L、5125.19μg/L、2562.60μg/L、1281.30μg/L、640.65μg/L、320.32μg/L)；以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的峰面积为横坐标，以2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的浓度为纵坐标建立标准曲线。
备注：由于同分异构体化学性质相似，其余2种羟基吡嗪类物质2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪和2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪的含量测定采用2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的标准曲线进行计算。
样品测定：将150mL酒样装入旋转蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪在50℃的水浴锅中旋蒸至干，采用50％体积分数的甲醇水溶液分3次润洗旋蒸瓶，最后合并润洗液定容至3mL，经0.22μm的膜过滤后，采用液相色谱质谱联用仪进行分析，并通过标准曲线和浓缩倍数计算羟基吡嗪类化合物的含量。结果表明，本发明的实验方法可以成功地检测到酱香型白酒中3种羟基吡嗪类化合物。
实施例4羟基吡嗪糊味阈值的测定
参照文献报道(ASTM E679-04(2011),Standard practice for determinationof odor and taste thresholds by a forced-choice ascending concentrationseries method of limits[S].ASTM International Publication,PA,USA,2011)阈值的测定方法，即采用三杯法。含有待测定目标物的46％vol乙醇-水溶液经1:1稀释成7个浓度梯度，每个浓度的样品和另外2杯空白(46％vol乙醇-水溶液)组成一组，并用四位数字随机编号提供给8个品评人员进行口尝。品评人员需要在每组样品中挑选出含有焦糊味特征的样品。待7个梯度样品品评完后，按浓度由低到高的顺序整理数据，取不能感知到的浓度和上一个能感知到的浓度的几何平均值为品评人员的个人识别阈值；取个人最佳识别阈值的几何平均值为小组最佳识别阈值，最终通过计算2-羟甲基-3,6二乙基-5-甲基吡嗪在46％vol乙醇-水溶液中的阈值为：88.39ppb(ppb即：μg/L)，感官呈味描述：焦糊味。
实施例5回收率试验
回收率测定：将一定浓度的2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪标准品加入不同轮次基酒中测定加标回收率，样品重复3次测定其相对标准偏差。
样品测定：本发明选取了酱香型白酒中不同轮次的基酒，按实施例1的方法测定酱香型白酒中羟基吡嗪类物质的含量。
分别量取100mL酱香型一至七轮次基酒(每个轮次的基酒样品中加入了浓度为52.89ppb的2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪标准品)，采用旋转蒸发仪在45℃的水浴锅中旋蒸至干，采用40％体积分数的甲醇水溶液分3次润洗旋蒸瓶，最后合并润洗液定容至3mL，经0.22μm的膜过滤后，采用超高效液相色谱质谱联用仪进行分析，并通过标准曲线和浓缩倍数计算羟基吡嗪类物质的含量。其余实验条件同实施例1。结果见表1。
表1酱香型白酒羟基吡嗪类物质的回收率测定
在不同酱香型基酒中添加相近浓度的标准品，计算此方法定量羟基吡嗪类物质的回收率，每个样品重复3次测定其相对标准偏差。由表1可知，该方法对定量羟基吡嗪具有较好的准确性和精确性，能完全满足酱香型白酒羟基吡嗪类物质的定性、定量分析。
对比例1
旋蒸后留在旋蒸瓶中的样品，采用纯水洗脱，会产生浑浊现象，经过滤进行液质联用分析(分析条件同实施例2)，2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的加标回收率只有53.65％，不满足分析要求。因此纯水不能代替甲醇水溶液用于本发明。
对比例2洗脱液甲醇水溶液的浓度对羟基吡嗪类化合物测定结果的影响
酒样(酱香型白酒中一至七轮次的基酒)在旋蒸瓶中旋蒸至干后，采用含有10％、20％、30％体积分数的甲醇水溶液进行洗脱时(其余步骤同实施例5)，会产生浑浊现象，经过滤进行液质联用分析，发现10％、20％、30％甲醇水溶液洗脱的回收率低于80％，不满足分析要求。而当采用80％或更高甲醇浓度的洗脱剂时，由于甲醇浓度高对分析初始流动相的影响而不考虑使用。
对比例3旋蒸温度对酒样的旋蒸效率的影响
由于酱香型白酒中不同轮次的基酒含有一定量的水，温度过低不易旋蒸至干，当旋蒸水浴温度低于40℃时，旋蒸效率大大降低，例如在30℃的水浴温度下旋蒸时，旋蒸4h未蒸干，不但耗时且达不到旋蒸浓缩的目的。

Claims (10)

1.一种酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酒样的浓缩；
(2)浓缩样品的洗脱、定容及过滤；
(3)将(2)得到的滤液用液相色谱质谱联用方法进行定性和定量分析。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)包括量取酱香型白酒于旋蒸瓶中，加入玻璃珠防爆沸，于水浴锅中旋蒸，浓缩至干；
或优选地，所述步骤(2)包括采用甲醇水溶液洗脱并定容，经膜过滤后待用。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的羟基吡嗪类化合物包括2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪和2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水浴的温度为40～55℃；
优选地，所述水浴的温度为45-50℃；
或优选地，所述步骤(1)中加入的酱香型白酒的体积与步骤(2)中浓缩样品定容的体积比为50～150:3；
更为优选地，所述步骤(1)中加入的酱香型白酒的体积与步骤(2)中旋蒸样品定容的体积比为50～100:3；
或优选地，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为40％-70％；
进一步优选地，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为40％-50％；
更为优选地，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积分数为50％；
或优选地，步骤(2)中，所述的膜为0.22μm的膜；
更为优选地，步骤(2)中，所述的膜为有机滤膜；
或优选地，步骤(2)中，洗脱次数为3次。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的液相色谱质谱联用方法的色谱条件为：液相为Accela 1250pump，色谱柱为PFP，流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为甲醇，采用梯度洗脱，洗脱程序如下：0～15min溶剂B的体积百分比从10％线性变到90％，15～15.1min溶剂B的体积百分比降到10％，15.1～18min溶剂B的体积百分比从10％线性变到90％冲洗色谱柱；
或优选地，所述色谱柱为Thermo PFP，2.1mm×50mm，3.5μm；
或优选地，所述流动相的流速为200～300μL/min；
更为优选地，所述流动相的流速为200μL/min。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的液相色谱质谱联用方法的质谱条件为：采用Full MS和Targeted-MS2同时扫描模式，正离子模式监测，全扫范围75～750m/z，电离电压：3500V，离子传输管温度：280℃，离子源温度150℃，雾化气压力：35arb，鞘气：30arb，辅助气压力：10arb，反吹气：5arb，Full MS扫描分辨率35000，Targeted-MS2分辨率17500，质谱采集时间1.8～15min。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述羟基吡嗪类化合物的定性采用保留时间、标准品、母离子和二级碎片离子定性；
优选地，所述2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪的母离子的相对分子质量分别为181.13370、181.13356、181.13412。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述方法还包括用羟基吡嗪类化合物的标准品绘制标准曲线，由此计算待测样品中羟基吡嗪类化合物的含量；
优选地，所述方法还包括羟基吡嗪类化合物呈味阈值的测定；
更为优选地，所述羟基吡嗪类化合物在46％v/v乙醇水溶液中的呈味阈值为88.39μg/L。
9.如权利要求1-8任一所述的测定方法，其特征在于，所述酒样为酱香型白酒的一轮次至七轮次中任一轮基酒；
优选地，所述酒样为酱香型白酒的五轮次至七轮次中任一轮次基酒；
更为优选地，所述酒样为七轮次基酒。
10.权利要求1-8任一所述的测定方法在判断酱香型白酒质量方面的应用。
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