背景技术
质谱法(简称质谱)是一种与光谱并列的谱学方法,通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱和光谱、核磁共振等方法是并列关系,目前很少有交叉领域。实际上,质谱和这些经典谱学方法之间的交叉,也是应该值得重视的研究领域。质谱仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器等部分组成。
目前质谱的检测对象主要是有机物和生命活性物质,需要用到一些比较特殊(相对于AES激发源)的电离源。这些电离源可分为4类,即电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、解吸电离(DI)、喷雾电离(SI)。除外,每种电离源都能够同时得到大量的正离子和负离子,而且分子离子的种类跟离子化过程中的媒介或基体有关。比如,CI能够产生(M+H)+、(M+NH4)+、(M+Ag)+、(M+Cl)-等离子作为分子离子,也能够产生类似的碎片离子。
白酒是中国传统文化的重要组成部分,它与白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加和金酒并称为世界六大蒸馏酒。由于中国白酒采用特有的窖池固态发酵和固态蒸馏等工艺,使白酒不同于其他的蒸馏酒,含有极为丰富的微量成分。白酒中主体成分酒精与水的含量占总量的97%~98%,风味成分占2%~3%,但是其种类众多。报道过的白酒中发现的挥发性成分已经达到1000种以上,包括醇类、醛类、酮类、醚类、酸类、酯类、缩醛类、硫化物类、吡嗪类、吡啶类、呋喃类、酚类、芳香族类、内酯类等等。这些化合物共同对白酒风味提供重要的作用。由于这类物质多为挥发、半挥发性物质,主要使用气相色谱仪分析。现有的报道方法主要有气相色谱-质谱、多维气相色谱-质谱、气相色谱-闻香、全二维气相色谱-飞行时间质谱等。
例如,CN111707758A采用气相色谱仪将浓香型白酒样品中各风味物质与其他含氧物质分离,采用转化装置将各风味物质转化为CO,利用稳定同位素比值质谱仪检测浓香型白酒中风味物质的δ18O。CN111579692A采用气相色谱质谱进样检测,对色谱图进行积分,鉴定酱香型白酒。CN110954610A使用高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂。CN110514756A通过将SPME Arrow技术和GC-MS技术相结合,对SPME Arrow萃取技术进行优化;应用上述优化后的萃取方法结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)对白酒中的82种香气化合物(酯类、醇类、脂肪酸类、醛酮类、呋喃类、吡嗪类、含硫化合物、酚类、萜烯类和内酯类)进行了定性及定量分析。CN109959734A利用液液萃取方法结合气相色谱-质谱联用技术对兼香型白酒中进行分析检测,从而确定了兼香型白酒中的风味物质。CN109828045A公开了一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法。CN108445134A结合使用顶空固相微萃取、液液萃取、全二维气相色谱/飞行时间质谱和机器学习算法,以白酒作为模式酒,建立了不依赖特征组分分析的酒类识别方法。CN103792300A采用气相色谱-同位素比值质谱联用检测方法,判断白酒是否掺假。
然而,中国白酒特有的固态蒸馏工艺,使得白酒组成非常复杂。白酒特有的空杯留香现象表明白酒中存在大量非挥发成分,是影响白酒口感的重要物质,共同构成了白酒口味的骨架成分,而这些成分用气相色谱仪的手段是难以分析的。相比于挥发性物质,白酒中非挥发性物质含量极低,无论在提取、定性与定量等方面都存在一定的困难,这是白酒中非挥发性成分目前文献报道较少的原因。
如前所述,目前对白酒中风味物质的剖析主要使用气相色谱质谱联用仪,关注的化合物为挥发或半挥发性的物质。白酒中非挥发性成分由于其沸点较高,在气相进样口处不能有效气化,现有的技术手段难以检测。白酒中非挥发性物质,是影响白酒口感的重要骨架成分,例如酚酸、有机酸、氨基酸、高级脂肪酸、高级脂肪酸酯等,以下简称口味物质。
由于白酒中口味物质的文献报道较少,这类物质的检测存在两大难点。第一、非挥发性化合物的检测。白酒口味物质鉴定分析系统采用液相色谱质谱配合电喷雾电离源(ESI),是检测非挥发性化合物的有效手段。该离子源是大气压下电离源,样品无需气化即可电离,是极性化合物分析的首选。第二、未知物的鉴定。气相色谱质谱有公共的NIST谱图库可进行未知物鉴定,液质没有此类数据库。白酒中大量的丰富的低含量的化合物,采集到检测信号无法鉴定出化合物结构。
为解决上述问题,岛津公司与中轻食品检验认证有限公司合作研发,联合推出白酒口味物质鉴定分析系统。该系统包括以下组成:LCMS-9030四极杆飞行时间高分辨质谱联用鉴定系统(以下简称白酒鉴定系统)和LCMS-80X0三重四极杆液质联用分析系统(以下简称白酒分析系统),两者配套的辅助工具分别为:白酒MS/MS特征质谱图库和80X0 MRM检测方法包。白酒鉴定系统可对白酒样品进行高分辨质谱数据采集和定性识别,可与白酒MS/MS特征质谱图库进行自动检索,匹配打分。白酒分析系统可对口味物质进行定量检测,80X0MRM检测方法包采用内标法,使用者仅需购买一种内标物即可实现半定量,降低了检测成本。并且每种化合物下提供1~6个MRM离子对条件,供不同香型白酒基质检测时进行优选。
白酒口味物质鉴定系统使用飞行时间质谱仪LCMS-9030,获取化合物的高分辨质谱图和二级特征碎片离子信息。通过对白酒中已报道化合物的裂解规律进行归纳,对未知物二级质谱图进行剖析,鉴定出15种口味物质,其中多种物质为白酒中首次发现。白酒口味物质分析系统使用岛津LCMS-80X0配合ESI电离源,建立上述口味物质的定量测定方法。该方法液质检测方法包适用于岛津LCMS-8050/LCMS-8045/LCMS-8060等多种机型,简称80X0方法包。岛津白酒口味物质鉴定分析系统解决了白酒口味物质检测两大难点,实现了现有检测技术无法解决的难题,丰富了白酒风味物质的评价手段。
发明内容
基于上述要解决的技术问题,本发明提供了如下技术方案:
一种白酒口味物质鉴定分析系统,其包括以下部分:
(S1)、电喷雾离子源联用质谱;
(S2)、标准品试剂盒,所述标准品试剂盒包括4-氨基丁酸、胆碱和甜菜碱。
进一步的,所述标准品试剂盒包括7-羟基香豆素。
进一步的,所述的标准品试剂盒还包括吡啶、L-脯氨酸、烟酸、L-苯丙氨酸、吡啶-2-羧酸、L-焦谷氨酸、L-酪氨酸。
进一步的,所述的标准品试剂盒还包括油酸、亚油酸、3-羟基-2-甲基吡啶、癸二酸、棕榈酸乙酯。
进一步的,所述的电喷雾离子源联用质谱选自LCMS-9030。
进一步的,所述的电喷雾离子源联用质谱还包括LCMS-80X0。
进一步的,所述的LCMS-9030用于定性鉴定白酒真假,LCMS-80X0用于定量分析白酒口味物质含量。
进一步的,所述的各化合物是等重量份。
本发明还提供了如下技术方案:
一种白酒口味组合物,其包括以下化合物:4-氨基丁酸、胆碱和甜菜碱。
进一步的,所述的组合物还包括吡啶、L-脯氨酸、烟酸、L-苯丙氨酸、吡啶-2-羧酸、L-焦谷氨酸、L-酪氨酸。
进一步的,所述的组合物还包括油酸、亚油酸、3-羟基-2-甲基吡啶、癸二酸、棕榈酸乙酯。
进一步的,所述组合物中各化合物的重量比例为:4-氨基丁酸0.5-5、胆碱6-30和甜菜碱12-30;优选4-氨基丁酸1.2-3、胆碱8-25、甜菜碱17-25;
进一步的,所述组合物中各化合物的重量比例为:吡啶5-25、L-脯氨酸6-22、烟酸1-8、L-苯丙氨酸5-30、吡啶-2-羧酸0.5-8、L-焦谷氨酸35-120、L-酪氨酸40-140;优选吡啶9-22、L-脯氨酸3-25、烟酸2-5、L-苯丙氨酸9-25、吡啶-2-羧酸1-6、L-焦谷氨酸44-103、L-酪氨酸50-136;
进一步的,所述组合物中各化合物的重量比例为:油酸200-350、亚油酸550-700、3-羟基-2-甲基吡啶0.1-4、癸二酸1-5、棕榈酸乙酯2300-4000;优选油酸253-300、亚油酸622-656、3-羟基-2-甲基吡啶0.3-2、癸二酸1.5-3、棕榈酸乙酯2438-3882。
本发明还提供了如下技术方案:
一种白酒鉴定方法,包括以下步骤:
1)样品前处理:将待测白酒体积浓缩至1/10-1/50,优选1/20,过滤,装入液相进样小瓶中,获得白酒样品;
2)标准溶液配制:将标准品试剂盒中的化合物用有机溶剂1配制成混合标准溶液,使用有机溶剂2稀释成标准样品;
3)分别将步骤1)和步骤2)获得的样品使用电喷雾离子源联用质谱进行检测,并将结果进行比对。
进一步的,步骤1)中,浓缩方式优选减压旋转蒸发,旋蒸温度优选40℃。
进一步的,步骤1)中,过滤优选0.22μm滤膜。
进一步的,步骤1)中,还包括在过滤前加入浓缩液1-3倍体积乙醇的步骤,所述乙醇体积优选浓缩液的1.5倍。
进一步的,步骤2)中,所述的有机溶剂为低级醇,优选甲醇。
进一步的,步骤2)中,有机溶剂2为0.1-0.1%甲酸水溶液,优选0.05%甲酸水溶液。
进一步的,步骤3)中,所述的电喷雾离子源联用质谱选自LCMS-9030。
进一步的,步骤3)中,流动相为A:0.05%甲酸水溶液;B:甲醇。
进一步的,步骤3)中,建立白酒MS/MS特征质谱图库。
进一步的,步骤3)中,分别在碰撞能量(CE)5V、15V、25V、35V、45V、55V和35±17V 7个条件下,获取每种单标的MS/MS碎片离子质谱图。
进一步的,步骤3)中,标准品试剂盒中的全部化合物或90%以上均在白酒样品中检测出,则白酒为真。
进一步的,所述的标准品试剂盒所包含的化合物为白酒口味物质鉴定分析系统中标准品试剂盒所包含的化合物。
进一步的,提供一种白酒鉴定方法,包括以下步骤:
1)样品前处理:白酒样品,每份取100mL,经40℃减压旋转蒸发至2mL,再加入3mL乙醇,过0.22μm滤膜过滤,装入液相进样小瓶中,待测;
2)标准溶液配制:将标准品试剂盒中的化合物分别先用甲醇配制成1mg/mL母液,然后混合,用甲醇配制成5mg/L混合标准溶液;再将该混合标准溶液用0.05%甲酸水溶液稀释成500μg/L标准样品;
3)分别将步骤1)和步骤2)获得的样品使用LCMS-9030进行检测,流动相为A:0.05%甲酸水溶液;B:甲醇,将步骤2)获得的标准样品分别在碰撞能量(CE)5V、15V、25V、35V、45V、55V和35±17V7个条件下,获取每种单标的MS/MS碎片离子质谱图,建立白酒MS/MS特征质谱图库,并将步骤1)的结果与其进行比对。
本发明还提供了如下技术方案:
一种白酒分析方法,包括以下步骤:
1)样品前处理:将待测白酒体积浓缩至1/10-1/50,优选1/20,过滤,装入液相进样小瓶中,获得白酒样品;
2)标准溶液配制:将标准品试剂盒中的化合物用有机溶剂1配制成混合标准溶液,使用有机溶剂2逐级稀释成不同浓度的标准样品;
3)将步骤2)的标准样品使用电喷雾离子源联用质谱建立标准曲线;
4)使用与步骤3)相同的条件电喷雾离子源联用质谱对白酒样品进行处理,并代入标准曲线计算白酒样品中相应标准品试剂盒中的各化合物含量。
进一步的,步骤1)中,浓缩方式优选减压旋转蒸发。
进一步的,步骤1)中,过滤优选0.22μm滤膜。
进一步的,步骤1)中,还包括在过滤前加入浓缩液1-3倍体积乙醇的步骤,所述乙醇体积优选浓缩液的1.5倍。
进一步的,步骤2)中,所述的有机溶剂为低级醇,优选甲醇。
进一步的,步骤2)中,流动相为0.05%甲酸水溶液。
进一步的,步骤2)中,不同浓度分别指:1.2μg/L、2.4μg/L、4.9μg/L、9.8μg/L、19.5μg/L、39.1μg/L、78.1μg/L、156.2μg/L、312.5μg/L和625μg/L。
进一步的,步骤2)中,每个浓度级别中均加入7-羟基香豆素做为内标,内标物的浓度为100μg/L。
进一步的,步骤3)中,所述的电喷雾离子源联用质谱选自LCMS-80X0。
进一步的,步骤3)中,流动相为A:0.05%甲酸水溶液;B:甲醇。
进一步的,提供一种白酒分析方法,包括以下步骤:
1)样品前处理:白酒样品,每份取100mL,经40℃减压旋转蒸发至2mL,再加入3mL乙醇,过0.22μm滤膜过滤,装入液相进样小瓶中,待测;
2)标准溶液配制:将标准品试剂盒中的化合物分别先用甲醇配制成1mg/mL母液,然后混合,用甲醇稀释成5mg/L混合标准溶液,取上述混合标准溶液,使用流动相逐级稀释成1.2μg/L、2.4μg/L、4.9μg/L、9.8μg/L、19.5μg/L、39.1μg/L、78.1μg/L、156.2μg/L、312.5μg/L和625μg/L的不同浓度的标准样品,每个浓度级别中均加入7-羟基香豆素做为内标,内标物的浓度为100μg/L;
3)将步骤2)配制的1.2μg/L、2.4μg/L、4.9μg/L、9.8μg/L、19.5μg/L、39.1μg/L、78.1μg/L、156.2μg/L、312.5μg/L和625μg/L不同浓度的混合标准工作溶液采用LCMS-80X0进行测定,流动相为A:0.05%甲酸水溶液;B:甲醇,以7-羟基香豆素做为内标物,内标物的浓度为100μg/L,内标法制作工作曲线,以浓度比为横坐标,面积比为纵坐标;
4)使用与步骤3)相同的条件电喷雾离子源联用质谱对白酒样品进行处理,并代入标准曲线计算白酒样品中相应标准品试剂盒中的各化合物含量。
本发明所述的一种白酒鉴定方法和白酒分析方法,其检测色谱条件为:
色谱柱:Shim-pack Velox PFPP(2.1mm I.D.×150mm L.,2.7μm)
流速:0.2mL/min
进样体积:2μL
柱温:40℃
洗脱方式:梯度洗脱,B相初始浓度为5%;时间5.00min,A相95%B相5%;16.00min,B相100%;20.00min,B相100%,20.10min,A相95%B相5%;25.00min结束。
检测质谱条件为:
离子源: ESI
离子源接口电压: +4.0kV;-3.0kV
雾化气: 氮气3.0L/min
干燥气: 氮气10L/min
碰撞气: 氩气
脱溶剂管温度: 250℃
加热模块温度: 200℃
接口温度: 350℃
鉴定系统工作模式: MS Scan(m/z 100-500)&DDA(m/z 50-500)
分析系统工作模式: MRM多反应离子监测。
本发明鉴定和分析方法中,只有步骤1)中还包括在过滤前加入浓缩液1-3倍体积乙醇的步骤,油酸、亚油酸、棕榈酸乙酯才能被提取并检出到。
本发明还提供了如下技术方案:
所述的白酒口味组合物在鉴定白酒真假中的应用。
所述的白酒口味组合物在分析白酒质量中的应用。
本发明中,所述的白酒优选酱香型白酒,最优选茅台。
综上,本发明的有益效果如下:
(1)本发明利用白酒口味物质鉴定分析系统,建立了白酒中多种口味物质的鉴定分析方法。该方法定性准确,定量灵敏度高。可以满足定性、定量检测白酒中口味物质的要求。
(2)本发明中的检测方法可以同时检测多种非挥发性口味物质,且4-氨基丁酸、胆碱和甜菜碱等化合物在白酒中被首次发现。
(3)本发明中的口味物质特征MS/MS谱图库是基于真实标准物质构建的高分辨质谱图,且记录了7个不同碰撞能下的谱图。是针对白酒中口味物质建立的首个液质高分辨质谱图库。
(4)本发明提供的组合物,联用后可以模拟白酒的口味,用于通过味觉判断白酒的真假;也可以作为标准品使用。
需要指出,本发明所提及的仪器和试剂均可从商业途径获得,例如LCMS-9030、LCMS-80X0可购自岛津公司。
具体实施方式
实施例1白酒口味组合物示例
一种白酒口味组合物,包括以下重量比的化合物:4-氨基丁酸2、胆碱11、甜菜碱22、吡啶14、L-脯氨酸21、烟酸3、L-苯丙氨酸10、吡啶-2-羧酸4、L-焦谷氨酸75、L-酪氨酸76、油酸272、亚油酸638、3-羟基-2-甲基吡啶1、癸二酸2、棕榈酸乙酯3805。
实施例2白酒口味组合物示例
一种白酒口味组合物,包括以下重量比的化合物:4-氨基丁酸1.5、胆碱23、甜菜碱19、吡啶8、L-脯氨酸14、烟酸6、L-苯丙氨酸24、吡啶-2-羧酸6、L-焦谷氨酸41、L-酪氨酸103、油酸300、亚油酸629、3-羟基-2-甲基吡啶1.8、癸二酸2.4、棕榈酸乙酯2685。
实施例3白酒口味物质鉴定分析系统示例
3.1硬件组成
3.1.1白酒口味物质鉴定系统
岛津LCMS-9030超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪,具体配置:LC-30AD×2输液泵,DGU-20A5R在线脱气机,SIL-30AC自动进样器,CTO-20AC柱温箱,CBM-20A系统控制器,LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪,LabSolutions Ver 5.96工作站软件。
3.1.2白酒口味物质分析系统
岛津LCMS-80X0三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为LC-40DXR×2输液泵,DGU-405在线脱气机,SIL-40CXR自动进样器,CTO-40C柱温箱,CBM-40系统控制器,LCMS-80X0三重四极杆质谱仪,LabSolutions Ver.5.97色谱工作站。
3.2检测条件
3.2.1白酒口味物质鉴定分析系统检测色谱条件
色谱柱:Shim-pack Velox PFPP(2.1mm I.D.×150mm L.,2.7μm)
流动相:A:0.05%甲酸水溶液;B:甲醇
流速:0.2mL/min
进样体积:2μL
柱温:40℃
洗脱方式:梯度洗脱,B相初始浓度为5%,梯度洗脱时间程序见表1。
表1时间程序
3.2.2白酒口味物质鉴定分析系统检测质谱条件
离子源: ESI
离子源接口电压: +4.0 kV;-3.0 kV
雾化气: 氮气3.0 L/min
干燥气: 氮气10 L/min
碰撞气: 氩气
脱溶剂管温度: 250℃
加热模块温度: 200℃
接口温度: 350℃
鉴定系统工作模式: MS Scan(m/z 100-500)&DDA(m/z 50-500)
分析系统工作模式: MRM多反应离子监测,见表2。
表2口味物质MRM检测参数
注:7-羟基香豆素是内标物质
因篇幅有限,每种化合物最多收录两个MRM离子对检测参数。
3.2.3白酒样品前处理及标准样品的配置
样品前处理步骤:白酒样品,每份取100mL,经40℃减压旋转蒸发至5毫升,0.22μm滤膜过滤,装入液相进样小瓶中,待测。
标准溶液配制:将化合物用甲醇配置成1mg/mL母液,然后用甲醇配置成5.0mg/L混合标准溶液。取上述5.0mg/L混合标准溶液使用流动相A逐级稀释成1.2μg/L、2.4μg/L、4.9μg/L、9.8μg/L、19.5μg/L、39.1μg/L、78.1μg/L、156.2μg/L、312.5μg/L和625μg/L的不同浓度的标准样品,每个浓度级别中均加入7-羟基香豆素做为内标,内标物的浓度为100μg/L。
3.3标准样品检测色谱图
见图1。
3.4白酒MS/MS特征质谱图库
本谱图库为白酒口味物质鉴定的重要依据,白酒检品中获取的二级质谱图与本谱图库进行对照,相似度在90%以上者鉴定结果为阳性。本谱图库基于500μg/L浓度的单一标准物质构建,分别在碰撞能量(CE)5V、15V、25V、35V、45V、55V和35±17V等7个条件下,获取每种单标的MS/MS碎片离子质谱图。每种化合物下共收录7张质谱图,因篇幅有限,仅展示35±17V碰撞能量下部分化合物的质谱图,见图2。
3.5工作曲线
将3.2.3配制的1.2μg/L、2.4μg/L、4.9μg/L、9.8μg/L、19.5μg/L、39.1μg/L、78.1μg/L、156.2μg/L、312.5μg/L和625μg/L不同浓度的混合标准工作溶液,按3.2中的分析条件进行测定,以7-羟基香豆素做为内标物,内标法制作工作曲线,以浓度比为横坐标,面积比为纵坐标,目标物线性良好,线性方程、相关系数和线性范围见表3。
表3口味物质工作曲线信息
实施例4茅台酒、青花郎酒和白云边酒测试结果示例
按实施例3中3.2.3所述步骤对茅台酒、青花郎酒和白云边酒进行处理,样品经旋蒸浓酸20倍后,按3.4所述方法进行鉴定,口味物质在茅台酒、青花郎酒和白云边酒中均存在。按3.2.2所述分析方法进行测定。茅台酒的实际样品检测色谱图见图3,浓度测定结果见表4。青花郎酒的实际样品检测色谱图见图4,浓度测定结果见表5。白云边酒的实际样品检测色谱图见图5,浓度测定结果见表6。表4,5和6所列结果中,上机浓度为仪器测定值。因前处理过程样品浓缩20倍,上机浓度除以20可得酒中各化合物的浓度。
表4口味物质在茅台酒中检测结果
表5口味物质在青花郎酒中检测结果
表6口味物质在白云边酒中检测结果
综上,本发明能够在白酒的鉴定和分析领域发挥重要作用;上述口味物质在不同白酒中浓度的差异在一定程度上体现了白酒各香型的不同。进一步的研究仍在进行中。