CN105353045A - 一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，所述方法为高效液相色谱-串联质谱对酱香型白酒中的吡嗪类化合物进行定性和定量分析，所述方法能够同时测定酱香型白酒中的2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪8种吡嗪类化合物。其中样品直接过膜进样，色谱中同分异构体的拆分不需要使用手性柱或手性添加剂，样品也不需要衍生化，方法灵敏度高，准确度和重复性好，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，属于白酒检测技术领域。
背景技术
近年来，人们对食品中含氮化合物的兴趣越来越浓厚。这主要是由于这类化合物，尤其是吡嗪化合物，在构成食品风味方面有独特的作用，国内白酒界逐渐将这一类化合物看成是构成白酒风味的重要成分之一，因为它们具有极低的风味阈值，还对其他香味物质有明显的烘托叠加作用，可使白酒的香气更为丰满，对白酒的风味有重要贡献。
对于中国白酒行业而言，在历经清香、浓香时代之后，酱香天下已然来临，越来越多的消费者青睐酱香白酒。目前关于酱香型白酒中的香味成分研究成果较少，其主体香也还没有定论，国内关于酱香型酒主体香味成分的说法主要有4种，其中吡嗪说愈来愈受到界内人士的关注。吡嗪类化合物在其他香型白酒中也存在，但酱香型酒中吡嗪类化合物明显高于其他香型，其大都具有焦香、糊香或类似“焙烤”、“酱油”的气味，是酱香型白酒中不可缺少的重要香气组成。酱香型白酒中高温制曲、高温堆积工艺是生成吡嗪类化合物的重要环节。若使用低温大曲作为糖化发酵剂或糟醅不经过高温堆积工序，所产出的酱香型白酒的吡嗪类化合物含量则很低，酱香风格也很差。通过不同级别酱香调味酒的分析检测研究表明，在多种微量成分中酸类、酯类、醇类、醛类、酮类无明显规律可循，只在合理范围内波动。但吡嗪类物质却有规律地波动，横向对比，24批基础酒中的吡嗪类物质要比酱香调味酒普级的低；纵向对比，酱香调味酒普级、优级、特级的吡嗪类物质呈上升趋势。从数据可以看出吡嗪类化合物对酱香调味酒的感官特征有重要的影响。
研究发现吡嗪不仅是白酒中特有的风味成分，也是白酒的重要功能因子，定性出的白酒中有26种吡嗪类化合物。研究结果表明，酱香型和兼香型酒中吡嗪类化合物种类和含量最高，在3000～6000μg/L；浓香型次之；清香型白酒中吡嗪类化合物的含量及其种类都是最少的。其中的四甲基吡嗪是从传统中药伞形科藻本属植物川芎中分离出来的一种活性成分，已经被广泛用于心脏血管和脑血管疾病的治疗中。它能增加脑血管的血流量，减少脑缺血性疾病的发作。国际上研究表明，四甲基吡嗪对中枢神经有影响，能改善学习的障碍，还有防止由无水乙醇引起的胃黏膜损伤、由无水乙醇引起的肾中毒、由硫代乙酰胺引起的急性肝中毒，并能降低脑萎缩的伤害。
目前已有的关于白酒中吡嗪类化合物的检测方法主要是GC和GC-MS。两种方法都是通过传统的液液萃取对酒样进行前处理，样品前处理步骤大概如下：取1000mL酒样，用12N浓盐酸将酒样酸度调pH至1，旋转蒸发浓缩至20mL，浓缩液用20mL重蒸乙醚在分液漏斗中萃取三次，去掉醚层，水相用12NNaOH调pH至7，再用1NNaOH调pH至10，加入NaCl饱和，再用20mL重蒸乙醚在分液漏斗中萃取三次，收集醚层，用5g无水硫酸钠干燥过滤，滤液吹至0.5mL，供GC或GC-MS分析。该法对于更深层次认识白酒中的吡嗪类化合物有重要意义，但是定量具有一定的局限性，一是因为吡嗪类化合物已有标准品有限，大部分发现的化合物没有标准品卖，只能做到半定量；二是整个前处理过程比较复杂，需要大量的酒样，样品经过多次提取转移，影响定量的准确性。用该方法处理酒样，整个前处理时间将近2天，步骤繁琐，用到大量的对人体有害的有机试剂，且将已有标样的吡嗪类物质进行加标回收率试验，发现该前处理方法回收率不高，不适合作为常规的检测方法来使用。该类研究主要通过酒样提取与质谱的NIST谱库进行比对，从而探索酒中含有的吡嗪化合物种类。实验中发现，通过全扫描的方式在检测吡嗪类化合物的同时，也会受到酯类、醇类化合物的干扰，使定量受到影响。
2009年贵州茅台酒股份有限公司利用气相色谱-质谱-离子扫描联用法快速测定白酒中4中吡嗪类化合物(中国酿造,2009,204(3),148～150)，该法酒样直接进样，测定了茅台酒中含量较高是四种吡嗪化合物，即2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，虽然缩短了样品的前处理时间，但是酒样中含有的大量水分对质谱高真空系统来说有较大损伤，为了降低对仪器的损伤选择减小进样量为0.2μL，从而也降低了检测的灵敏度，四种化合物检出限为0.2mg/L左右，所以该法也只测定了茅台酒中含量相对较高的4种吡嗪化合物。
用GC-NPD快速测定了白酒中吡嗪类化合物，酒样直接进样分析，定量了7种吡嗪化合物。但是从色谱图中可以看出，样品分析时基线漂移较大。根据我们的检测实践，这种情况难以保证检测的精密度和准确度。
随着样品提取技术的发展，顶空固相微萃取技术逐渐应用于酒类分析中。应用HS-SPME和GC-MS分析了白酒大曲中微量挥发性成分，从大曲中定性23种吡嗪类化合物；用HS-SPME与GC-FTD相结合,采用内标标准曲线法定量8种有标样的吡嗪类化合物：分别为吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪，8种吡嗪类化合物相对标准偏差在4.09％～11.52％之间，其中对茅台酒和郎酒这两大酱香代表酒进行了定量，结果发现吡嗪和2-乙基吡嗪在所测8种吡嗪中含量排在最后两位，而在酱香酒中含量较高的2-乙基-6-甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪并没有在该研究中进行测定。该小组的专利中，酒样需要重蒸水稀释到最终含酒精量为12％(v/v),放入15ml的顶空瓶中，加入2gNaCl,插入50μm/30μm的CAR/DVB/PDMS萃取头，置于50℃的恒温水浴中搅拌萃取40分钟,用HS-SPME-GC-FTD内标法标准曲线法测定了九种吡嗪,他们是:吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪。由其表一可以看出,该方法对这九种物质的测定中,对于模拟酒样,相对标准偏差(RSD)值大于5％的有6个,对于郎酒和茅台酒,RSD值大于5％的分别有6个和7个，说明该方法的重复性还有待提高。同样,在酱香酒中含量较高的2-乙基-6-甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪在该专利中并没有涉及。另外，该小组使用了火焰热离子检测器，该检测器适合对含氮磷化合物的检测，其通用性不佳。随后应用了SPME-GC-MS-SIM联用检测白酒中含氮化合物，其中定量了2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪六种吡嗪类化合物，相对标准偏差在2.3％～12.2％之间，回收率在71.76％～117.98％之间。HS-SPME-GC-FID检测可可麦汁中的三种吡嗪类化合物分别为2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪，检测对象中没有涉及同分异构体，对色谱分离的要求不高，从标样与样品的色谱图可以看出样品中峰比较多，很多峰是重叠在一起，对测定的干扰较大。
顶空固相微萃取(HS-SPME)是一种无需有机溶剂，集采样、萃取、浓缩、进样于一体的前处理方法，相对早期的液液萃取方法要简便安全得多。但是该方法需要对萃取头进行预处理或活化，同时还要对酒样进行稀释、盐析和调pH值等操作，需要较长的平衡和萃取时间(1小时左右)。萃取温度、萃取时间以及酒样的离子强度这些都是影响萃取效果的重要参数。另外，萃取纤维头的种类有限，选择性较差，受影响因素多，重复性也相对较差，该方法对有些吡嗪检测的灵敏度、准确性和精密度还有待改进。
因此建立一种操作简便，准确性和重复性能够得到保证的检测酱香型白酒中吡嗪类化合物的方法，很有现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，本发明所述的方法能同时测定酱香型白酒中的2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪8种吡嗪类化合物。且本发明的方法对同分异构体的分离不需要使用手性柱或手性添加剂，样品也不需要衍生化，前处理简单，方法灵敏度高，重复性好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法为：使用高效液相色谱-串联质谱的检测方法对酱香型白酒中的吡嗪类化合物进行定性和定量分析。
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，所述的吡嗪类化合物包括2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪。
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中样品前处理方法为：将酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，即得。
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：苯基柱Gemini5μC6－Phenyl110A250mm×4.6mm；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中质谱的检测条件为：APCI离子源+参数：喷雾电压5500V，喷雾气、辅助气、气帘气流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr，喷雾器温度为650℃；MRM优化参数：2-甲基吡嗪：检测离子对：95.1/68.1*，95.1/54.1，锥孔电压：65v，碰撞电压：25v，27v；2,3-二甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,6-二甲基吡嗪：检测离子对:109.1/68.1*，109.1/82.1，锥孔电压：70v，碰撞电压：28v，27v；2,3,5-三甲基吡嗪，2-乙基-6甲基吡嗪：检测离子对：123.1/82.0*,123.1/107.0，锥孔电压：71v，碰撞电压：32v，35v；2,3,5,6-四甲基吡嗪,2,3-二甲基-5-乙基吡嗪：检测离子对：137.0/80.1*,137.0/121.1，锥孔电压：65v，碰撞电压：41v，38v。
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的定量分析为外标法，操作步骤如下：
(1)称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线；
(2)在50.0～5000ng/mL质量浓度范围内，各标准品质量浓度与峰面积值均有良好的线性关系，以S/N＝3确定检出限，8种吡嗪类化合物的检测限均小于50ng/mL；
(3)将酒样进样所测得的8种吡嗪化合物的峰面积，用外标法定量计算出对应的8种吡嗪化合物的浓度。
前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的酱香型白酒为以高粱、小麦、水等为原料，经传统固态法发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香呈味呈色物质，具有酱香风格的白酒。
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究
实验例1：检测方法研究
1仪器与试剂
1.1仪器：4000QTRAP三重四级杆质谱联用仪，ABSciex公司；配Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent公司；氮气发生器，PEAK公司；milli-QAcademic超纯水系统，密理博中国有限公司。
1.2试剂：2-甲基吡嗪(2-Methylpyrazine，纯度≥99.0％)、2,3-二甲基吡嗪(2,3-Dimethylpyrazine，纯度≥99.0％)、2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine，纯度≥98.0％)、2,6-二甲基吡嗪(2,6-Dimethylpyrazine，纯度≥98.0％)、2,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5-Trimethylpyrazine，纯度≥99.0％)、2-乙基-6-甲基吡(2-Ethyl-6-methylpyrazine，纯度≥95.0％)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-Tetramethylpyrazine，纯度≥99.0％)，均购于sigma公司。2,3-二甲基-5-乙基吡嗪(2,3-Dimethyl-5-ethylpyrazine，纯度≥98.0％)，购于山东滕州华东生物科技有限公司。甲酸、三氟乙酸、甲醇(均为色谱纯)Merck公司，超纯水(MILLIPOREDirectQ5型超纯水系统)。
2实验操作
2.1样品前处理
酒样摇匀后取2mL直接过0.22μm滤膜，装入样品瓶，即得。
2.2HPLC色谱条件
色谱柱：Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A80％，B20％；25min：A55％，B45％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
2.3质谱条件
APCI离子源(+)参数：喷雾电压(IS)5500V；喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr；喷雾器温度为650℃。MRM优化参数见表1。
表1选择反应监测的优化参数
2.4线性关系测定和外标计算法
用8种吡嗪类化合物标准品混合溶液，建立浓度范围为50.0、100.0、200.0、500.0、1000、2000、5000ng/mL的标准溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线，在50.0～5000ng/mL质量浓度范围内，标准品质量浓度与峰面积值均有良好的线性关系。以S/N＝3确定检出限，其中2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪检出限为10ng/mL、2-乙基-6甲基吡嗪检出限为45ng/mL、其余五种吡嗪化合物检出限为20ng/mL。将酒样进样所测得的8种吡嗪化合物的峰面积，用外标法定量计算出对应的8种吡嗪化合物的浓度(mg/L)。
3结果
3.1酒样中8种吡嗪化合物的确定
选用典型的酱香型白酒的代表酒样8个，采用酸化液萃取、调碱、再萃取、浓缩的样品前处理，对8个酒样进行吡嗪化合物的提取，采用GC-MS全扫描的方式进行吡嗪类化合物的检测，确定含量高的吡嗪化合物，找到检测目标后，再进行检测方法的建立。其中一个酒样的总离子流图，见附图1。通过峰面积计算发现8个典型酒样有一定的共性，其中检测到的吡嗪种类不等，有19-25种，但是含量高的前五种吡嗪化合物都是2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪，虽然这五种吡嗪在8个酒样中含量高低排列顺序不完全一致，但是他们都排在前五位，且按面积计算含量约占总量的73.97％～90.00％之间。同时还发现8个酒样中含量较高的前九种吡嗪也基本相似，且按面积计算含量约占总量的86.61％～95.50％之间。含量高的前9种吡嗪化合物为：2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪。能买到标准品的有2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪这8种物质。2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪无法购买到标准品，且考虑该物质在这8种酒样中的含量排序都不在前五位，因此以能买到标准品的8种吡嗪化合物作为测定酱香型白酒中吡嗪类化合物的目标物质。即2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪。8种酒样的全扫描峰面积初步定量结果见表2，按峰面积计算含量大概在83.2％～93.9％左右。
表28种酒样气质全扫描含量
3.2检测器的选择
本发明建立对样品前处理要求较低的液相色谱测定吡嗪化合物的方法。申请人考察高效液相色谱-紫外检测器测定8种吡嗪化合物，由于目标化合物8种吡嗪都是烷基取代的吡嗪化合物，且其中有三对是同分异构体，色谱上保留性质比较接近，采用紫外检测器有响应，但是很难实现8种吡嗪化合物的完全分离。申请人使用紫外检测器对每种化合物分别进行定量，标准物质的检出限最低能达到200ppb，灵敏度较低；且在实际进行样品测定的时候发现，吡嗪化合物出峰的位置容易受到白酒中其他物质的干扰，这主要是由于紫外检测器选择性较差，白酒中大多数成分都有紫外吸收，可能是受到白酒中含量相对较高的醇、酯类的干扰。附图2为DAD检测器时，1ppm8种吡嗪化合物标准品的色谱图，优化了色谱条件及色谱柱使8种吡嗪化合物达到最好分离效果的色谱图，附图3为样品实际测定时的色谱图，可以看出2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪这三个同分异构体出峰的地方有较大干扰峰。申请人改用荧光检测器，发现荧光检测器相对紫外检测器来说灵敏度并没有提高，甚至有些物质响应还不如紫外检测器，实际测定酒样时干扰相对紫外检测器有所减小，但是在2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪这三个同分异构体出峰的地方仍有干扰峰。1ppm8种标准品和样品色谱图见附图4和附图5。
质谱是按照化合物的质量m和电荷z的比值m/z(质荷比)大小依次排列而被记录下来的图谱，在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法，它分析范围广，几乎可以检测所有的化合物，分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过质谱的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量，另外检测限低，具备高灵敏度。考虑到检测的8种目标吡嗪化合物性质比较接近，其中包含三对同分异构体，且在酒中含量相对于酯类、醇类低得多，容易受到酯类、醇类化合物的干扰，故我们最终选择专属性好，灵敏度高的质谱检测器。
3.3质谱条件的选择
申请人对目标化合物进行条件优化，找到检测的母离子和子离子，8种化合物都是1,4位含两个杂氮原子的杂环化合物，容易得到质子，所以选择正离子模式，且通过扫描都找到了8种化合物的分子离子峰，即M+H峰。通过优化碰撞能量，找到各自的碎片离子，其中2-甲基吡嗪母离子为95.1，碎片离子有95.1/80.0、95.1/68.1、95.1/54.1；2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪母离子为109.1，碎片离子有109.1/94.1、109.1/82.1、109.1/68.1、109.1/54.1；2,3,5-三甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪母离子为123.1，碎片离子有123.1/107.0、123.1/95.1、123.1/82.0、123.1/67.1、123.1/55.0；2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪母离子为137.1，碎片离子有137.1/121.1、137.1/107.1、137.1/94.1、137.1/80.1；最终在确定的色谱条件下单标分别进样，以信噪比确定响应最高的离子对为定量离子对，次高的为定性离子对。最终确定的离子检测参数见表1(*为定量离子对)：通过标样优化找到8种化合物的检测离子对，连接液相色谱进行分析，最初采用应用广泛的、常用于极性分子分析的ESI为离子源的电离方式，因为ESI电离对测定极性化合物是有利的，而吡嗪属于含二个N原子的极性化合物。优化ESI离子源的各种参数，包括碰撞气流，加热温度等等，发现8种化合物响应很低，检测灵敏度和液相色谱紫外检测器差不多，甚至一些化合物的响应还不如紫外检测器。考虑到虽然吡嗪本身母体结构含两个N原子，属于极性化合物，但是当它的母体骨架上的氢原子被烷基取代后极性减弱，这可能是使用ESI为离子源的电离方式效果不佳的原因。接下来，采用使用得较少的APCI作为离子源的电离方式进行分析，发现8种化合物在APCI离子源的条件下响应大大增高，比ESI离子源提高2-3个数量级，证明了APCI源适合对8种烷基吡嗪类化合物的测定，最终我们通过优化APCI离子源参数，大大提高了检测的灵敏度，从而使样品的前处理变得简单快速。
3.4液相条件的选择
3.4.1柱温和流速的选择：保持其他条件不变，改变柱温进行实验，结果显示柱温对分离的影响很小，因此选择常用温度30℃。由于分析物较多，流速过慢，各物质出峰向后推迟，峰形较宽，灵敏度低且分析时间长，流速过快，同分异构体包裹在一起，不能有效分离，且较高的流速对质谱参数设定要求过高，故选择在1.0mL/min流速下进行分析。
3.4.2色谱柱的选择：首先选择了常用的C18色谱柱为分析柱，使用了菲罗门、安捷伦、热电的不同型号的C18柱，因为分析的8种吡嗪化合物均为烷基取代化合物，其中三对还是同分异构体，在C18柱上的保留行为非常接近，考虑到检测器为质谱检测器，不能在流动相中添加手性添加剂等不挥发性物质，通过改变流动相的pH和缓冲盐等浓度进行试验，然而无论怎样改变8种化合物也只能分出5-7个峰，见附图6和附图7，证明物质之间有包裹。考虑到吡嗪类化合物属于芳杂环，烷基吡嗪的极性降低，亲脂性增强。C18柱常因硅醇基效应而保留时间延长以及产生峰拖尾现象。如果采用苯基柱则可能改善这种情况。因为苯基柱中的苯环结构可以与烷基吡嗪发生л-л和疏水作用，有可能改善吡嗪类化合物的分离。通过流动相的优化，最终在苯基柱上获得了8个吡嗪化合物的最佳的分离效果，见附图8。但是4、5号峰还是不能完全分离。
3.4.3流动相组成的选择：色谱柱影响物质的保留，同样流动相的组成对待分析物质的保留影响很大，由于目标化合物为极性化合物，所以选择了之前分离效果最好的苯基反相柱进行分离。但是，在等度洗脱条件下，测定的8种烷基吡嗪组分不能完全分离，且分析时间较长。因此进行选择梯度洗脱实验，希望测定组分达到完全分离。由于是质谱检测器，对流动相的限制比较大，申请人尝试了甲醇-水体系、乙腈-水体系、甲醇-水(甲酸)体系、乙腈-水(甲酸)体系、甲醇-水(乙酸)体系、乙腈-水(乙酸)体系、甲醇-水(甲酸+三氟乙酸)体系、乙腈-水(甲酸+三氟乙酸)体系、甲醇-水(乙酸+三氟乙酸)体系和乙腈-水(乙酸+三氟乙酸)体系。试验结果表明，以纯水和有机相为流动相体系时，待测物质的峰形很差，灵敏度低。估计是流动相的pH对化合物的分离有较大影响，另外正离子模式下加点酸可以提高灵敏度，于是采用了甲醇-水(甲酸)体系、乙腈-水(甲酸)体系、甲醇-水(乙酸)体系和乙腈-水(乙酸)体系，该条件下化合物峰形尖锐响应提高，且甲酸酸性比乙酸酸性强，分离效果较乙酸更好些，但是无论怎样改变流动相的梯度洗脱条件，2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪这三种化合物无法完全分离，三个化合物只能看到两个峰见附图9。申请人在水相中再加入一定比例的三氟乙酸，一是因为三氟乙酸作为离子对试剂通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用来改善峰形、克服峰展宽和拖尾，另外它优于其他离子修饰剂是因为它容易挥发，可以在质谱中使用。加入三氟乙酸后2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪可分为三个峰。这可能是由于三氟乙酸是一种强的有机酸，可以有效的提供质子与烷基吡嗪的二个碱性N原子相互作用或称质子化，从而减小了烷基吡嗪N原子与固定相残留羟基的相互作用。同时，可能由于质子化后的烷基吡嗪其色谱行为有所不同，因此改善了分离。在甲醇-水(0.1％甲酸+三氟乙酸)体系中，梯度洗脱程序为：0min：A95％，B5％；20min：A65％，B35％；25min：A65％，B35％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。申请人改变三氟乙酸的浓度，分别添加了0.05％、0.08％和0.1％浓度的三氟乙酸到水溶液中，结果2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离变化不大，最终我们选用0.1％浓度的三氟乙酸，见附图10。申请人接下来试验不同的梯度洗脱条件来改善三个化合物的分离。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A70％，B30％；25min：A60％，B40％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％，见附图11。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A75％，B25％；25min：A55％，B45％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％，见附图12。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A80％，B20％；25min：A55％，B45％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％，见附图13。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A85％，B15％；25min：A70％，B30％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％，及见附图14。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；5min：A95％，B5％；20min：A90％，B10％；25min：A70％，B30％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％，见附图15。
梯度洗脱程序为：流动相A：水溶液(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；15min：A95％，B5％；20min：A90％，B10％；25min：A70％，B30％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。可以看出即使在5％有机相等度的条件下，三个同分异构体还是不能完全分离，见附图16。
根据以上试验结果，最终确定的色谱条件为：流动相为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A80％，B20％；25min：A55％，B45％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。在这个条件下，2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物分离最好。
3.5白酒样品中色谱峰的定性
对于白酒样品中的色谱峰定性，采用对照标样与白酒样品色谱峰的保留时间和离子对进行定性，若样品待测溶液中均出现所选择的两个离子对时，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过下表3的范围，则可判断样品中存在被测物。
表3液相色谱－质谱/质谱定性时相对离子丰度最大允许误差
8种吡嗪化合物标准物质的选择离子流图见附图17，酱香白酒样品中的8种吡嗪化合物选择离子流图见附图18。其中1为2,3,5-三甲基吡嗪、2为2-乙基-6甲基吡嗪、3为2,3,5,6-四甲基吡嗪、4为2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、5为2-甲基吡嗪、6为2,3-二甲吡嗪、7为2,6-二甲基吡嗪、8为2,5-二甲基吡嗪。
3.6白酒样品中色谱峰的定量
3.6.1工作曲线和检测限
精密称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，-4℃保存。标准中间液：取8种吡嗪化合物的标准储备液用纯水稀释为100μg/mL的标准中间液，备用。标准工作溶液：取适量标准中间液用水稀释成适当浓度的工作曲线溶液，浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb，以峰面积(Y)对质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，吡嗪类化合物的回归方程见表4。以信噪比3确定检测限。
表48种吡嗪化合物的回归方程及检测限
结果表明，该分析方法的相关系数在0.9994到1.0000之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
3.6.2酒样的测定
将目标酒样摇匀后取2mL过0.22μm滤膜，装入样品瓶，液相色谱-质谱联用进行定量分析，比照标准曲线测定被测酒样中吡嗪类化合物的含量。
3.6.3样品前处理及检测方法的回收率和重复性
通过前面色谱质谱条件的优化，8种吡嗪化合物得到了很好的响应，检出限为ppb级。虽然酱香型白酒中的吡嗪类化合物相对其它香型的白酒含量高，但是与其中所含的酯醇类成分相比属于微量成分。要获得对这类微量成分的准确测定，通常需要进行前处理以除去其它成分的干扰。我们实验了文献报道的液液萃取和顶空微固相萃取的前处理方法，结果发现，液液萃取的方法繁琐，耗时费力，测定的回收率不容易满足要求。顶空微固相萃取的前处理方法，样品需要盐析，需要对萃取头进行预处理，每个样品平衡和萃取需要耗时1小时，测定的回收率也不高。这二种方法对操作人员的要求都较高。由于质谱检测器具有很高的选择性和灵敏度，酒中的其它干扰成分易挥发，不会对仪器产生不良影响。所以申请人尝试将酒样直接过膜进样检测，发现酒样中8种化合物均能检出，将酒样用纯水稀释5倍后进样发现8种化合物都呈倍数的降低，初步证明酒样直接进样没有基质效应，该方法的检出限能满足酱香白酒中吡嗪含量的检测要求。为了进一步确认直接进样的可操作性，申请人进行了方法的回收率试验。试验过程如下：用酒精和水分别配制乙醇含量为40％、50％、55％的模拟酒样(大多数酱香酒酒度为53％，包括在40-55％之间)，根据酒中8种化合物含量的高低分别加入不同浓度的标准溶液配制成低中高三个浓度水平的加标酒样，进行回收率试验，其中2-甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪和2,5-二甲基吡嗪低中高水平加入量分别为0.1mg/kg、0.2mg/kg和0.5mg/kg；2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪低中高水平加入量分别为0.2mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，将加标酒样直接过膜后进液相色谱-质谱联用进行分析，8种吡嗪化合物回收率结果见表5，回收率在82.3％～107.3％之间，重复性即RSD在1.4％～4.2％之间，回收率良好。由于质谱检测器的高专属性和高灵敏度，大大的简化了样品的前处理过程，样品不需要提取转移等前处理直接过膜进样，从而保证了方法的准确性和精密度。实现了简单、准确地同时测定白酒中8种吡嗪类化合物的目标。
表5模拟酒样回收率及RSD(n＝18,每种酒度各加标6个)
4部分酱香型白酒中8种吡嗪化合物的含量测定
采用建立的分析方法，对酱香型白酒进行分析，部分有代表性的酱香型酒样吡嗪类化合物的含量见表6。
表6部分酱香型白酒中吡嗪化合物的含量(mg/L)
从这三十个酱香型白酒酒样测定数据我们可以看出，其中四甲基吡嗪在20个酒中含量排在第一位，在7个酒中含量排在第二位，在3个酒中含量排在第三位；三甲基吡嗪在17个酒中含量排在第二位，在7个酒中含量排在第一位，在6个酒中含量排在第三位；2,6-二甲基吡嗪在三个酒样中排在前三位的占29个，这和本发明最早气质全扫描初步定量的结果是相吻合的，可以看出四甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量大约都在几个毫克每升，对于白酒中的吡嗪类物质来说含量算高的。
5结论
上述实验结果表明：利用质谱检测器特有的专属性和高灵敏度，采用选择性更高的苯基柱进行分离，通过流动相中添加三氟乙酸和梯度洗脱程序等关键技术，大大的简化了样品前处理方法，建立了APCI源的高效液相色谱-串联质谱法测定酱香型白酒中8种吡嗪类物质含量的方法，色谱条件如下：色谱柱，Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动相B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
质谱检测器质谱条件：APCI离子源(+)，2-甲基吡嗪的定量离子对为95.1/68.1；2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪的定量离子对为109.1/68.1；2,3,5-三甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪的定量离子对为123.1/82.0；2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪的定量离子对为137.0/80.1。该方法对8种吡嗪化合物测定的回收率为82.3％～107.3％，相对标准偏差1.4％～4.4％，检出限为：0.01mg/L～0.05mg/L。说明该方法准确度、灵敏度和重复性好，而且样品不需要前处理，只需过膜后直接进样分析，操作简便快速。可望用于白酒中吡嗪类化合物的日常检测。
附图说明
图1是酒样的总离子流图。
图2是DAD检测器时1ppm8种吡嗪化合物标准品的最佳分离色谱图,出峰顺序1-8号峰分别为2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪。
图3是DAD检测器时酒样进行测定的色谱图，2,3-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪出峰位置有很大的干扰峰。
图4是FLD为检测器时，1ppm8种吡嗪化合物标准品的色谱图。
图5是FLD为检测器时酒样进行测定的色谱图，2,3-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪出峰位置的干扰峰相对紫外检测器来说有所减小，但是干扰仍无法消除。
图6是C18柱(Agilent)时8种吡嗪化合物的分离图，8种吡嗪化合物最多只能分出7个峰。峰1为2,3,5,6-四甲基吡嗪、峰2和峰3包含了2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6二甲基吡嗪三种物质、峰4为2-甲基吡嗪、峰5为2,3,5-三甲基吡嗪、峰6为2,3-二甲基-5乙基吡嗪、峰7为2-乙基-6-甲基吡嗪。
图7是C18柱(Phenomenex)时8种化合物的分离图，8种吡嗪化合物最多只能分出7个峰。峰1为2,3,5,6-四甲基吡嗪、峰2为2-甲基吡嗪、峰3为2,3,5-三甲基吡嗪、峰4和峰5包含了2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6二甲基吡嗪三种物质、峰6为2,3-二甲基-5乙基吡嗪、峰7为2-乙基-6-甲基吡嗪。
图8是苯基柱(Phenomenex)时8种化合物的分离图，8种吡嗪化合物实现了分离。峰1为2,3,5,6-四甲基吡嗪、峰2为2-甲基吡嗪、峰3为2,3,5-三甲基吡嗪、峰4为2,3-二甲基吡嗪、峰5为2,6-二甲基吡嗪、峰6为2,5二甲基吡嗪、峰7为2,3-二甲基-5乙基吡嗪、峰8为2-乙基-6-甲基吡嗪。
图9是有机相-水(甲酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，其中三个化合物只有两个峰。
图10是甲醇-水(0.1％甲酸+0.05％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图。
图11是甲醇-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A70％，B30％；25min：A60％，B40％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。
图12是甲醇-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A75％，B25％；25min：A55％，B45％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。
图13是甲醇-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A80％，B20％；25min：A55％，B45％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。
图14是乙腈-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；20min：A85％，B15％；25min：A70％，B30％；30min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。
图15是乙腈-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；5min：A95％，B5％；20min：A90％，B10％；25min：A70％，B30％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。
图16是乙腈-水(0.1％甲酸+0.1％三氟乙酸)体系时2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三个化合物的分离图，此时的梯度洗脱程序为：流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：A95％，B5％；15min：A95％，B5％；20min：A90％，B10％；25min：A70％，B30％；28min：A95％，B5％；35min：A95％，B5％。可以看出即使在5％有机相等度的条件下，三个同分异构体还是不能完全分离。
图17是8种吡嗪化合物的标样选择离子流图。
图18是酒样中8种吡嗪化合物的选择离子流图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明；
具体实施方式
实施例1：
一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，包括下述步骤：
(1)精密称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，建立八种吡嗪类化合物的校正曲线，用于外标法定量计算。
(2)将53度的酱香型白酒酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪分析；高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动相B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
(3)质谱检测器质谱条件：APCI离子源+参数：喷雾电压(IS)5500V；喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr；喷雾器温度为65℃。
(4)用外标法定量计算8中吡嗪化合物的浓度。
实施例2：
一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，包括下述步骤：
(1)精密称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，建立八种吡嗪类化合物的校正曲线，用于外标法定量计算。
(2)将53度的酱香型白酒酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪分析；高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动相B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
(3)质谱检测器质谱条件：APCI离子源+参数：喷雾电压(IS)5500；喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr；喷雾器温度为65℃。
(4)用外标法定量计算8中吡嗪化合物的浓度。
实施例3：
一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，包括下述步骤：
(1)精密称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，建立八种吡嗪类化合物的校正曲线，用于外标法定量计算。
(2)将53度的酱香型白酒酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪分析；高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.08％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动相B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
(3)质谱检测器质谱条件：APCI离子源+参数：喷雾电压(IS)5500V；喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr；喷雾器温度为65℃。
(4)用外标法定量计算8中吡嗪化合物的浓度。
实施例4：
一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，包括下述步骤：
(1)精密称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，建立八种吡嗪类化合物的校正曲线，用于外标法定量计算。
(2)将45度的酱香型白酒酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪分析；高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Gemini5μC6－Phenyl110A苯基柱(250mm×4.6mm)；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动相B5％；流速：1.0mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL。
(3)质谱检测器质谱条件：APCI离子源+参数：喷雾电压(IS)5500V；喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr；喷雾器温度为65℃。
(4)用外标法定量计算8中吡嗪化合物的浓度。
Claims (7)
1.一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：使用高效液相色谱-串联质谱的检测方法对酱香型白酒中的吡嗪类化合物进行定性和定量分析。
2.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的吡嗪类化合物包括2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪。
3.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中样品前处理方法为：将酒样摇匀后，取2mL过0.22μm滤膜，即得。
4.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：苯基柱Gemini5μC6－Phenyl110A250mm×4.6mm；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：含0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A95％，流动相B5％；20min：流动相A80％，流动相B20％；25min：流动相A55％，流动相B45％；28min：流动相A95％，流动相B5％；35min：流动相A95％，流动B5％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
5.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱-串联质谱的检测方法中质谱的检测条件为：APCI离子源+参数：喷雾电压5500V，喷雾气、辅助气、气帘气流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr，喷雾器温度为650℃；MRM优化参数：2-甲基吡嗪：检测离子对：95.1/68.1*，95.1/54.1，锥孔电压：65v，碰撞电压：25v，27v；2,3-二甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,6-二甲基吡嗪：检测离子对:109.1/68.1*，109.1/82.1，锥孔电压：70v，碰撞电压：28v，27v；2,3,5-三甲基吡嗪，2-乙基-6甲基吡嗪：检测离子对：123.1/82.0*,123.1/107.0，锥孔电压：71v，碰撞电压：32v，35v；2,3,5,6-四甲基吡嗪,2,3-二甲基-5-乙基吡嗪：检测离子对：137.0/80.1*,137.0/121.1，锥孔电压：65v，碰撞电压：41v，38v。
6.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的定量分析为外标法，操作步骤如下：
1、称取2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪对照品各100mg，用甲醇定容至10mL，配成10mg/mL的标准储备液，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的吡嗪类混合对照品溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线；
2、在50.0～5000ng/mL质量浓度范围内，各标准品质量浓度与峰面积值均有良好的线性关系，以S/N＝3确定检出限，8种吡嗪类化合物的检测限均小于50ng/mL；
3、将酒样进样所测得的8种吡嗪化合物的峰面积，用外标法定量计算出对应的8种吡嗪化合物的浓度。
7.如权利要求1所述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于：所述的酱香型白酒为以高粱、小麦、水等为原料，经传统固态法发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香呈味呈色物质，具有酱香风格的白酒。
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