CN104977370A

CN104977370A - 一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法

Info

Publication number: CN104977370A
Application number: CN201510055295.7A
Authority: CN
Inventors: 马磊; 吴建峰; 孙莹
Original assignee: JIANGSU KING'S LUCK BREWERY CO Ltd
Current assignee: JIANGSU KING'S LUCK BREWERY CO Ltd
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: CN104977370B

Abstract

本发明公开了一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，方法具体为：待测酒样经超纯水稀释过滤后，用高效液相色谱实现吡嗪类物质的分离，分离后的吡嗪类物质由带有四级杆-静电场轨道阱质量分析器的质谱仪检测，利用外标法实现白酒中吡嗪类物质定性定量分析。本发明克服了现有检测技术中存在前处理步骤繁琐、分析时间长、萃取不充分、定量限较高等缺点，具有前处理操作简便、分析时间短、样品无损失、检测限低、回收率高、稳定性好等优点，可适用于各种香型白酒中吡嗪类物质的检测分析。

Description

一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法

技术领域

本法明属于白酒风味研究领域，涉及一种检测白酒中吡嗪类物质的方法，具体涉及一种应用高效液相色谱-质谱联用的技术检测白酒中吡嗪类物质的方法。

技术背景

白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的中国特有的蒸馏酒。除酒精和水以外，约占白酒2%的微量成分对酒的香型和品质起着至关重要的作用，这些香味贡献成分种类众多，主要分为醇类、酯类、酸类、醛酮类化合物、缩醛类、芳香族化合物、含氮化台物和呋喃化合物等。含氮化合物主要是吡嗪类，是酱香、芝麻香型白酒的特征成分之一。吡嗪类化合物是一类含 1, 4-二氮杂苯母环化合物的总称，这类物质具有类似炒坚果、青椒、烤肉等怡人香味，其香气透散性好，阈值较低，并且对其他的香味物质具有明显的烘托和叠加作用。吡嗪的衍生物广泛存在于天然和发酵食品中，如可可、咖啡、威士忌、白兰地、朗姆酒、葡萄酒和啤酒中都能检测到吡嗪类物质。中国传统白酒，尤其是酱香、芝麻香和兼香型白酒中也发现含量较高的吡嗪类物质。研究表明，吡嗪类物质是一种对人体有益的物质，尤其是四甲基吡嗪（又名川芎嗪）是中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分，因其具有扩张血管、防止酒精对胃黏膜和肝脏的损伤、改善微循环和抑制血小板凝集的药理等功能，是白酒中的健康功能因子，赋予了中国白酒有益健康的功能。

白酒中吡嗪类物质间含量差距较大，几个μg/L到mg/L之间，检测工作存在一定困难。近年来，随着气相色谱质谱联用技术的不断发展和成熟，气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术被广泛应用于吡嗪类物质的检测。20世纪70年代开始，液液萃取（LLE）被用来提取吡嗪类物质，Liebich等利用乙醚-戊烷作为混合溶剂萃取，再以10%HCl分离，利用GC-MS检测朗姆酒中的7种吡嗪类物质；Wobben等利用减压蒸馏的方式，蒸去酒中大部分水分和乙醇，再利用CH₂Cl₂萃取，利用GC-MS检测朗姆酒和威士忌中的吡嗪类物质；余斌等采用调酸旋转蒸发除去大部分水、醇和易挥发成分，测定酒中吡嗪类物质，提高了回收率。然而，这些方法具有需要消耗大量有机溶剂，样品需求量大、步骤繁琐，回收率低，预处理过程中目标物损失严重等缺点。顶空-固相微萃取技术（HS-SPME）克服了上述缺点，因其无需有机溶剂，样品需求量低，集采集、萃取、浓缩、进样于一体，可与色谱联用等优点，成为了检测酒中吡嗪类物质前处理方法的首选。专利号200710019764.5，江南大学徐岩、范文来等建立了顶空-固相微萃取-气相色谱-火焰离子检测器/质谱检测器（HS-SPME-GC-FID/MS）联用技术检测白酒中9种吡嗪类化合物；专利号200910311435.7，陈华磊等利用HS-SPME-GC-FID/MS联用技术检测啤酒中7种吡嗪类物质；吴建峰等利用顶空-固相微萃取-气相色谱联用对于吡嗪类物质更具特异性的氮磷检测器（HS-SPME-GC-NPD），检测白酒中9种吡嗪类物质。上述方法虽较为成熟，但仍然存在着分析时间长，萃取不充分，目标物质有损失等缺点，因此需要建立一种新的方法来克服当前存在的技术瓶颈。

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在检测分析领域得到了广泛的应用，常用来检测难挥发性物质。目前尚未发现利用LC-MS测定白酒中挥发性的风味成分的研究报告。LC-MS技术测定白酒中吡嗪类物质克服了以往检测方法的前处理步骤繁琐、分析时间长、萃取不充分、定量限较高等缺点，具有前处理简便、分析时间短、样品无损失、检测限低、回收率高、稳定性好等优点，适用于各种香型白酒中吡嗪类物质检测分析，当前相关研究尚属空白。

发明内容

本发明为了克服现有检测技术存在的前处理步骤繁琐、分析时间长、萃取不充分、定量限较高等缺点，提供了一种利用高效液相色谱-质谱联用技术测定白酒中吡嗪类物质的分析方法，可以快速、简便、准确的测定各种香型白酒中吡嗪类物质。

本发明通过以下技术方案实现：

一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，将待测酒样经超纯水稀释3～8倍过滤后，用高效液相色谱实现吡嗪类物质的分离，分离后的吡嗪类物质用质谱仪检测定性，再利用外标法实现白酒中吡嗪类物质定量分析。

本发明的进一步改进方案是：

所述吡嗪类物质定性分析，是通过对比酒样中未知物质的保留时间和分子质量与9种吡嗪标准品的保留时间和分子质量得到。

所述吡嗪类物质定量分析包括如下步骤：

将待测酒样检测后得到的分子质量和保留时间的峰面积代入相应的9种吡嗪类物质的混标样标准曲线中，查出酒样中各吡嗪类物质的含量。

所述吡嗪类物质为2-甲基吡嗪（2-MP）、2,6-二甲基吡嗪（2,6-DMP）、2-乙基吡嗪（2-EP）、2,3,5-三甲基吡嗪（2,3,5-TMP）、2-乙基-6-甲基吡嗪（2-E-6-MP）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（TTMP）、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪（5-E-2,3-DMP）、2,3-二乙基吡嗪（2,3-DEP）和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪（2,3-DE-5-MP ）9种物质。

本发明的更进一步改进方案是：

所述高效液相色谱的色谱条件为：仪器：戴安Ultimate 3000高效液相色谱；色谱柱：Hypersil GOLD色谱柱100 mm×2.1 mm，3 μm；流动相：A为5 mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；流速：0.30 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱程序：0-7 min，5% B-60% B；7-7.1 min，60% B-95% B；7.1-10 min，95% B-95% B；10-10.1 min，95% B-5% B。

所述质谱仪的质谱条件为：仪器：赛默飞Q-Exactive高分辨质谱；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子全扫模式（Full-MS）；鞘气压力：35 arb；辅助气压力：10 arb；毛细管电压：3.80 kv；毛细管温度：350 ℃；探针温度：300℃；分辨率：70,000；扫描范围：50-200 m/z。

本发明的有益效果：

1. 建立了一种利用高效液相色谱-质谱联用的技术，分析白酒中9种吡嗪类物质的方法，该方法具有前处理简便、分析时间短、样品无损失、检测限低、回收率高、稳定性好等特点，能最大限度的反映样品中吡嗪类物质的真实含量，可以快速、简便、准确的测定各种香型白酒中吡嗪类物质。

2. 本发明使得9种吡嗪类物质在8 min内实现分离，在0.93~513 μg/L的检测范围内具有良好的线性关系，其相关系数R²均大于0.999，最低定量限均小于1.0 μg/L，最低检测限均低于0.1μg/L，回收率为96.6 %~116.8%。

3. 9种吡嗪类物质混标当天和隔天的重复进样峰面积和含量的RSD均小于3%，保留时间的标准偏差小于等于0.009 min（0.54s），说明该方法具有良好的稳定性。

附图说明

图1为9种吡嗪类物质标准曲线图。

图2为9种吡嗪类物质标准样液相色谱图。

图3为芝麻香型原酒样品液相色谱图。

图4为酱香型白酒样品液相色谱图。

图5为2-MP的质谱图。

图6为2,6-DMP的质谱图。

图7为2-EP的质谱图。

图8为2,3,5-TMP的质谱图。

图9为2-E-6-MP的质谱图。

图10为TTMP的质谱图。

图11为5-E-2,3-DMP的质谱图。

图12为2,3-DEP的质谱图。

图13为2,3-DE-5-MP的质谱图。

其中：1=2-MP、2=2,6-DMP、3=2-EP、4=2,3,5-TMP、5=2-E-6-MP、6=TTMP、7=5-E-2,3-DMP、8=2,3-DEP、9=2,3-DE-5-MP。

具体实施方式

实施例

主要仪器和试剂：

高效液相色谱仪Ultimate 3000，美国Dionex公司；高分辨质谱仪Q-Exactive、Hypersil GOLD色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），美国Thermo Scientific公司；超纯水仪labostar^TM TWF UV7，德国SIEMENS公司；0.45 μm水相滤头，上海安谱。

2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，纯度≥98%，购于美国Sigma公司；甲酸铵,纯度≥99%，aladdin公司；乙腈、甲醇，色谱级，美国Tiedia公司。

样品：今世缘酒样股份有限公司生产芝麻香型原酒、市售某公司酱香型白酒各一款。

样品制备：使用2 mL移液管分别量取2 mL酒样于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，经0.45μm 水相滤头过滤于样品瓶中，待检测。

高效液相色谱-质谱联用检测：

色谱条件：

色谱柱：Hypersil GOLD色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：A为5 mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；流速：0.30 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

梯度洗脱程序：0-7 min，5% B-60% B；7-7.1 min，60% B-95% B；7.1-10 min，95% B-95% B；10-10.1 min，95% B-5% B。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子全扫模式（Full-MS）；鞘气压力：35 arb；辅助气压力：10 arb；毛细管电压：3.80 kv；毛细管温度：350 ℃；探针温度：300℃；分辨率：70,000；扫描范围：50-200 m/z。

待测酒样中9种吡嗪类物质的定性：

取2款配置好的待测酒样进样检测，检测结果和9种吡嗪物质标准品的保留时间和分子质量对照定性。

待测酒样中9种吡嗪类物质的定量：

（1）配置单标储备液：分别量（称）取10 μL（mg）9种吡嗪类物质的标准品，用色谱级甲醇分别定容于9只100 mL棕色容量瓶中，配置成浓度约100 mg/L的单标储备液。

（2）配置混标储备液：分别量取（1）中所配制的单标储备液各1 mL，用色谱级甲醇定容于1只100 mL容量瓶中，配制成各物质浓度约为1 mg/L的混标储备液。

（3）制作标准曲线：将配置的混标储备液吸取2 mL, 用色谱级甲醇逐级等倍稀释，得到0.93~513 μg/L的10个不同浓度的9种吡嗪类物质的混标样，依次对每一浓度的混标样进样检测，以吡嗪类物质峰面积为纵坐标Y，吡嗪类物质质量浓度为横坐标X，绘制得到9条标准曲线。谱图和标准曲线图如图1、图2所示，具体参数见表1。

表1 9种吡嗪类物质的标准曲线相关参数(单位：μg/L)

由上表可知：所述白酒中9种吡嗪类物质在8 min内实现分离，于1.85~1000 μg/L的检测范围内具有良好的线性关系，其相关系数R²均大于0.999，最低定量限均小于1.0 μg/L，最低检测限均低于0.1 μg/L，回收率为96.6%~116.8%。

在上述条件下，分别将9种吡嗪类物质的混标，当天和隔天分别连续进样6次，对其峰面积、含量和保留时间进行统计，结果见表2、表3。

表2 9种吡嗪类物质混标含量和峰面积的稳定性实验结果（n=6，单位μg/L）

表3 9种吡嗪类物质混标保留时间的稳定性实验结果（n=6，单位 min）

由上表可知：所述酒样当天和隔天重复测定的峰面积和含量的相对标准偏差（RSD）均小于3.0%，保留时间标准偏差均小于等于0.009 min（0.54s）。

（4）测定酒样：取2款配置好的待测酒样进行进样检测，将2款待测酒样检测所得的峰面积代入相应物质的标准曲线，计算得到9种吡嗪类物质在酒样中的含量，每个样品重复测量3次。谱图如图3、图4所示，结果见表4。

表4 样品中9种吡嗪类物质含量（n=3，单位μg/L，均值±标准差）

样品

2-MP

2,6-DMP

2-EP

2,3,5-TMP

2-E-6-MP

TTMP

5-E-2,3-DMP

2,3-DEP

2,3-DE-5-MP

芝麻香

267.18±1.95

3036.08±17.31

ND

623.09±2.06

729.94±2.34

57.74±0.28

191.89±1.30

ND

9.29±0.08

酱香

280.36±2.05

2278.72±12.99

ND

1374.32±4.54

460.22±1.47

2266.01±10.88

420.88±2.86

ND

11.08±0.09

ND：未检测到

由表4可知，芝麻香和酱香型白酒中均能检测到2-MP、2,6-DMP、2,3,5-TMP、2-E-6-MP 、TTMP、5-E-2,3-DMP、2,3-DE-5-MP 共7种吡嗪类物质，2-EP和2,3-DEP未检测到。芝麻香型白酒中含量最高的是2,6-DMP，其他依次是2-E-6-MP、2,3,5-TMP、2-MP、5-E-2,3-DMP、TTMP、2,3-DE-5-MP；酱香型白酒中含量最高的是2,6-DMP和TTMP，其他依次是2,3,5-TMP、2-E-6-MP、5-E-2,3-DMP、2-MP、2,3-DE-5-MP。

Claims

1.一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：将待测酒样经超纯水稀释3～8倍过滤后，用高效液相色谱实现吡嗪类物质的分离，分离后的吡嗪类物质用质谱仪检测定性，再利用外标法实现白酒中吡嗪类物质定量分析。

2.根据权利要求1所述一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：所述吡嗪类物质定性分析，是通过对比酒样中未知物质的保留时间和分子质量与9种吡嗪标准品的保留时间和分子质量得到。

3.根据权利要求1或2 所述一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：所述吡嗪类物质定量分析包括如下步骤：

4.根据权利要求1或2所述一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：所述吡嗪类物质为2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪9种物质。

5.根据权利要求1所述一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：所述高效液相色谱的色谱条件为：仪器：戴安Ultimate 3000高效液相色谱；色谱柱：Hypersil GOLD色谱柱100 mm×2.1 mm，3 μm；流动相：A为5 mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；流速：0.30 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱程序：0-7 min，5% B-60% B；7-7.1 min，60% B-95% B；7.1-10 min，95% B-95% B；10-10.1 min，95% B-5% B。

6.根据权利要求1所述一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，其特征在于：所述质谱仪的质谱条件为：仪器：赛默飞Q-Exactive高分辨质谱；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子全扫模式（Full-MS）；鞘气压力：35 arb；辅助气压力：10 arb；毛细管电压：3.80 kv；毛细管温度：350 ℃；探针温度：300℃；分辨率：70,000；扫描范围：50-200 m/z。