CN111323494A - 一种提取贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提取贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法。采用顺序加入甲基叔丁基醚(MTBE)、水(H2O)与甲醇(MeOH)这三种提取溶剂，经过超声、漩涡震荡、高速离心等步骤，达到破碎细胞、除蛋白、提取动物/人体贴壁细胞极性代谢产物与非极性代谢物的两相提取的目的。与已报道的细胞小分子代谢产物的的前处理方法相比较，该方法集破碎细胞、除蛋白、极性代谢产物与非极性代谢产物两相提取与分离于一体，获得了更高的提取效率，减少了前处理过程的样品损失，有效解决了目前大量样品前处理过程繁琐且平行性差的问题，适合成为实验室代谢组学分析的常规前处理方法。

Description

一种提取贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法
技术领域
本发明是一种贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，具体地说是通过加入不同的提取溶剂，经过超声、漩涡震荡、高速离心等步骤，同时满足破碎细胞、除蛋白、提取全组分小分子代谢产物的目的。与常规的细胞小分子代谢产物的的前处理方法相比较，该方法操作简单，提取效率高，且集破碎细胞、除蛋白、极性代谢产物与非极性代谢产物相分离、样品浓缩于一体，减少了前处理过程的样品损失，有效解决了目前大量样品前处理过程繁琐且平行性差的问题，是一种值得推广的快速细胞代谢组学分析的前处理方法。
背景技术
代谢组学是研究生物体内源性代谢物质的整体及其随内因和外因变化的科学，是系统生物学的一个重要组成部分。细胞代谢组学及近年来代谢组学发展的新兴领域，细胞作为生物体结构和功能和结构的基本单位，易获得条件又较为可控，其代谢组学研究已经广泛运用于疾病机制研究、药理学、毒理学、细胞表型分类等，细胞代谢谱的结果既可以作为整体代谢研究的补充，又可以与蛋白组、基因组的数据相关联，丰富细胞的通路研究，更好的解释实验结果。
细胞代谢组学是一门年轻而又潜力十足的技术，但是随着研究的深入开展，一些问题也逐渐凸显。首先，细胞代谢组学细胞样品的前处理方法多种多样，如何制定有效的样品前处理方法来保证结果的重复性和可靠性是亟待解决的问题。
近年来，多个研究团队也在积极探索有效的细胞样品前处理技术，尽可能多的提取代谢产物的同时简化提取步骤，代谢物的提取溶剂多种多样，
研究团队分别研究了细胞淬灭、细胞破碎、提取溶剂及提取时间对细胞代谢物提取效率的影响，研究结果发现，MeOH/H2O的混合物是一种有效的代谢物提取溶剂，可以最大范围的覆盖代谢物；如果对细胞内的非极性代谢物感兴趣，如脂肪酸之类的，MeOH/CHCl3/H2O作为二次提取溶剂是很必要的(Bi,H.C.；Krausz,K.W.；Manna,S.K.；Li,F.；Johnson,C.H.；Gonzalez,F.J.,Optimization of harvesting,extraction,and analyticalprotocols for UPLC-ESI-MS-based metabolomic analysis of adherent mammaliancancer cells.Anal Bioanal Chem 2013,405,(15),5279-5289.)。为了简化提取步骤，缩短提取时间，研究团队发展了快速细胞前处理技术，贴壁细胞液氮淬灭后，通过快速的水洗，加入水、甲醇、氯仿的混合溶剂，在五分钟内快速完成代谢物的提取(Lorenz,M.A.；Burant,C.F.；Kennedy,R.T.,Reducing time and increasing sensitivity in samplepreparation for adherent mammalian cell metabolomics.Anal Chem 2011,83,(9),3406-14)，近年来MTBE作为一种有效的提取溶剂尤其在非极性代谢物的提取方面在组织样品中的提取表现出良好的优势(Chen,S.；Hoene,M.；Li,J.；Li,Y.；Zhao,X.；Haring,H.U.；Schleicher,E.D.；Weigert,C.；Xu,G.；Lehmann,R.,Simultaneous extraction ofmetabolome and lipidome with methyl tert-butyl ether from a single smalltissue sample for ultra-high performance liquid chromatography/massspectrometry.J Chromatogr A 2013,1298,9-16)。
基于此，本专利发明了一种贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，且集破碎细胞、除蛋白、极性代谢产物与非极性代谢产物两相分离于一体，减少了前处理过程的样品损失，有效解决了目前大量样品前处理过程繁琐且平行性差的问题。
发明内容
本发明的目的在于发展一种基于液相色谱-质谱分析的贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法。目前细胞内代谢物的前处理缺乏统一的技术规范，急需建立大规模细胞样品的前处理技术，而本发明提供了一种集破碎细胞、除蛋白、极性代谢产物与非极性代谢产物两相提取与分离于一体，减少了前处理过程的样品损失，有效解决了目前大量样品前处理过程繁琐且平行性差的问题，因此，本发明所采用的技术方案是：
1.贴壁细胞液氮淬灭冻干处理后顺序加入一定量的不同提取溶剂，经过超声、漩涡震荡、高速离心等步骤，达到破碎细胞、除蛋白、提取全组分小分子代谢产物的目的。
a)细胞的淬灭：将细胞用冰冷的去离子水快速清洗后液氮淬灭，抑制细胞内的酶活性，减少代谢物的酶代谢；
b)细胞的破碎：低温状态下加入冰冷的冷去离子水，冰水中超声，使细胞充分破裂脱壁；
c)冷冻干燥：脱壁破碎后的细胞通过冷冻干燥机迅速冷冻干燥；
d)细胞除蛋白及极性代谢产物与非极性代谢物的两相提取：加入一定量的冰MTBE，冰水中超声涡旋，沉淀蛋白的同时提取细胞非极性代谢产物；其次加入冰冷的去离子水形成了与MTBE互不相溶的H2O相，冰水浴超声提取细胞极性代谢产物；最后加入冰冷的MeOH涡旋，进一步提取细胞代谢物；静置，产生相分离；
e)蒸干重溶：将提取后产生相分离的上层有机相与水相分别蒸干，然后加入一定量的二氯甲烷与甲醇重新溶解代谢物并用80％甲醇稀释；
f)离心后过滤，进行液相色谱-质谱分析。
步骤a中的动物细胞为贴壁细胞；
步骤d中三种提取液的比例关系为MTBE：MeOH：H2O＝20：6：7；
本发明的优点是：该方法集细胞脱壁、破碎细胞、除蛋白、极性代谢产物与非极性代谢产物两相提取与相分离于一体，摒弃了繁琐的前处理个步骤，获得了更高的提取效率，减少了前处理过程的样品损失，有效解决了目前大量样品前处理过程繁琐且平行性差的问题；此外，极性代谢产物与非极性代谢产物两相提取可以获得更高的提取效率以及更稳定的平行性；极性代谢物与非极性代谢物相分离实现极性代谢物与非极性代谢物的单独分析；液氮淬灭的细胞在-80℃冰箱可以保存至少两周，适合成为实验室代谢组学分析的常规前处理方法。
与经典的80％的MeOH/H2O与文献报道的MTBE/MeOH/H2O的一相提取方法相比具有更高的提取效率和更好的平行性。
附图说明
图1-3为实施例1的HepG2细胞前处理的提取离子色谱图(Extracted IonChromatogram，XIC)；
图1为MTBE相与水相混合代谢物图；其中的HepG2细胞前处理的提取离子色谱图(Extracted Ion Chromatogram，XIC)MTBE相与水相混合代谢物图；
图2为水相代谢物图；
图3为MTBE相代谢物图。由图可以看出说明MTBE相能较好的提取脂类代谢物，水相能较好的提取极性代谢物。
图4为聚类分析结果图。
具体实施方式
本发明通过以下具体实例进一步描述，但不限制本发明。
实施例1
1)代谢物提取：
取对数期的人肝癌细胞HepG2的6孔细胞培养板(6孔中共2.5*106个细胞)，对其贴壁细胞的代谢物进行提取，冰水(0-4摄氏度冰冷的去离子水)快速清洗(加入30秒后抽出)一遍后，加入液氮淬灭，液氮淹没贴壁细胞；待液氮挥发后加入每孔1ml冷去离子水，并将培养板放置于冰水浴中超声3min，使细胞充分破裂；将培养板中含有破碎细胞的去离子水转移到离心管(一个孔对应一个离心管)中，冷冻干燥后，每个离心管加入300ul的冰(0-4摄氏度)MTBE，冰水浴超声3min，涡旋震荡3min；加入105ul冰冷(0-4摄氏度)的去离子水，冰水浴超声2min；加入90ul冰冷(0-4摄氏度)的MeOH震荡2min，静置，产生相分离；
取100ul上层MTBE相与50ul下层水相蒸干，加入50ul冰冷(0-4摄氏度)的二氯甲烷/甲醇(体积比2:1)溶解，再用100ul冰冷(0-4摄氏度)的体积浓度80％的MeOH/H2O稀释，用于MTBE相与水相混合代谢物的分析；取100ul上层MTBE相蒸干，加入50ul冰冷(0-4摄氏度)的二氯甲烷/甲醇(体积比2:1)溶解，再用50ul冰冷(0-4摄氏度)的体积浓度80％的MeOH/H2O稀释，用于MTBE相代谢物的分析；用于分析的水相不作处理。
4度，14000g，离心10min；过滤后进行UPLC-QTRAP分析。
对比例
取对数期的人肝癌细胞HepG2的6孔细胞培养板，对比常规的三种前处理方法，冻干的细胞加入495ul 80％的甲醇直接提取(方法1)(Wang,F.；Zhang,H.；Geng,N.；Zhang,B.；Ren,X.；Chen,J.,New Insights into the Cytotoxic Mechanism ofHexabromocyclododecane from a Metabolomic Approach.Environ Sci Technol 2016,50,(6),3145-53.)；冻干的细胞加入MeOH/CHCl3/H2O提取(方法2)(Lorenz,M.A.；Burant,C.F.；Kennedy,R.T.,Reducing time and increasing sensitivity in samplepreparation for adherent mammalian cell metabolomics.Anal Chem 2011,83,(9),3406-14)；冻干的细胞加入(90微升甲醇(含内标)+30微升水)微升冰冷的75％的甲醇(含内标)超声2分钟(用于定量与线性测试)破碎细胞。其次，加入300微升MTBE，在室温震荡6分钟，接下来，加入75微升的水震荡2分钟产生相分离，室温静止10分钟，4℃，14000g离心10分钟(方法3)(Chen,S.；Hoene,M.；Li,J.；Li,Y.；Zhao,X.；Haring,H.U.；Schleicher,E.D.；Weigert,C.；Xu,G.；Lehmann,R.,Simultaneous extraction of metabolome andlipidome with methyl tert-butyl ether from a single small tissue sample forultra-high performance liquid chromatography/mass spectrometry.J Chromatogr A2013,1298,9-16)。
实施例2
将实施例1与对比例三种前处理方法分别进行AB SCIEX UPLC/Q-TRAP定量分析。
2)AB SCIEX UPLC/Q-TRAP定量分析：
首先采用MRM模式，得到正离子模式下的TIC谱图，提取各离子对色谱峰对细胞样品进行定量分析。正离子模式质谱参数如下：电喷雾离子源(ESI)温度为550℃，喷雾电压为5500V，气帘气压力为0.241MPa，Gas1压力为0.276MPa，Gas2压力为0.276MPa。
正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1mm×100mm，1.7μm，Waters，USA)，柱温为50℃，进样量为10μL；流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈。流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1正离子模式下流动相的洗脱程序。
Table 1The mobile phase gradient of acetonitrile/water in ESI(+)MSmode.
Figure BDA0001905594900000051
实施例3
使用该方法定性出236种代谢物，其提取色谱图如图1-3所示，其稳定性即数据的重复性见表2；
表2四种提取方法的重复性数据对比
提取方法 方法1 方法2 方法3 本专利方法
检测的代谢物数量 225 227 224 225
RSD<30％ 191 199 208 212
RSD<20％ 159 158 191 189
RSD<10％ 68 78 111 115
(％)RSD<30％ 84.89％ 87.67％ 92.86％ 94.22％
(％)RSD<20％ 70.67％ 69.60％ 85.27％ 84％
(％)RSD<10％ 30.22％ 34.36％ 49.55％ 51.11％
图4为选取使用该四种方法提取的细胞代谢物RSD值均低于30％的71种极性代谢物和91种非极性代谢物的聚类分析结果，由结果表明，顺序加入溶剂法是比较优化的细胞前处理方法。

Claims (10)

1.一种提取贴壁细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：
通过顺序加入三种不同提取溶剂，经过超声、漩涡震荡、高速离心等步骤，达到破碎细胞、除蛋白、提取全组分小分子代谢产物的目的；包括以下步骤：
步骤a、细胞润洗：取出培养板中细胞培养液后，向培养板中细胞上加入0-4摄氏度冰冷的去离子水，清洗细胞后将去离子水吸出；
步骤b、细胞淬灭：向润洗后的细胞上加入液氮后，直接放入零下80-零下90摄氏度冰箱保存备用或者直接后续处理；
步骤c、细胞破碎：向含细胞的培养板中加入去离子水，并将培养板放置于零下4到4摄氏度冰水浴中超声破碎细胞；
步骤d、细胞冻干：将培养板中含有破碎细胞的去离子水转移到离心管中，放在冰箱冷冻，待去离子水冷冻后放在冻干机中冻干；
步骤e、细胞提取：向冻干后的细胞加入甲基叔丁基醚(MTBE)，超声并涡旋；随后加入去离子水(H2O)并超声；最后加入甲醇(MeOH)涡旋震荡产生相分离，产生上层有机相以及下层H2O相；
步骤f、蒸干重溶：将提取后产生相分离的上层有机相、或有机相与水相混合蒸干，然后加入二氯甲烷与甲醇重新溶解代谢物，并用体积浓度60-80％(优选80％)甲醇稀释；用于分析的水相不作处理；
步骤g、离心过滤：离心后过滤，得滤液；
步骤k、取上下层重溶的溶液分别单独进行质谱分析或者混合后进行液相色谱-质谱分析。
2.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：
步骤a中润洗时间不超过30s(优选10-20s)；
步骤b中液氮加入量，需要使液氮淹没细胞；
步骤c中去离子水经0-4摄氏度冰箱放置过夜后再进行应用；冰水浴超声时间为2.5-4min(优选3min)；
步骤e中加入MTBE后超声时间为2.5-4min(优选3min)，漩涡震荡2.5-4min(优选3min)；去离子水并超声时间为1.5-3min(优选2min)；加入MeOH涡旋震荡时间为1.5-3min(优选2min)；
步骤g中高速离心8-12min(优选10min)，转速为12000-14000r/min，温度为0-4摄氏度。
3.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：
步骤e中三种提取液的体积比例关系为，MTBE：MeOH：H2O＝18-20：5-6：6-7(优选MTBE：MeOH：H2O＝20：6：7)；
提取液总体积与细胞个数的比例关系约为300ul(提取溶剂总体积)/106个(细胞)～100ul(提取溶剂总体积)/106个(细胞)。
4.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤e中超声时离心管为封闭的离心管；超声为零下4到4摄氏度冰水浴超声。
5.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤e中所述MTBE、MeOH以及H2O均在0-4摄氏度冰箱放置过夜后再进行应用。
6.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤c和e中所述超声频率为80-120kHz(优选100kHz)。
7.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤e中所述相分离产生上层有机相以及下层H2O相：有机相主要为MTBE，而H2O相主要为甲醇与水的混合物。
8.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤f中所述二氯甲烷与甲醇的体积比为1-3：1(优选2:1)；二氯甲烷、甲醇以及60-80％甲醇均在0-4摄氏度冰箱放置过夜后再进行应用。
9.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：步骤f中将提取后产生相分离的上层有机相、或有机相与水相混合蒸干，然后加入二氯甲烷与甲醇重新溶解代谢物，并用体积浓度60-80％甲醇稀释至蒸干前液体体积的1.5-3倍；甲醇稀释液的量为总体积的50-90％。
10.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的快速前处理方法，其特征在于：所述贴壁细胞可以为贴壁的动物细胞或者人体细胞。
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