CN110243965A - 一种虎皮大承气汤的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种虎皮大承气汤的检测方法，它是采用HPLC‑MS/MS检测，其操作步骤如下：1)对照品溶液的制备；2)供试品溶液的制备；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪。本发明检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对大黄素、香草酸、橙皮苷、虎杖苷和厚朴酚的准确检测，且操作简便，容易控制，检测成本低，检测结果准确可靠，为虎皮大承气汤及其灌肠后在体内药动学提供了一种行之有效的检测方法。

Description

一种虎皮大承气汤的检测方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种虎皮大承气汤的检测方法。

背景技术

大承气汤出自汉代张仲景的《伤寒论》，由大黄、枳实、厚朴和芒硝 组成，是泻法的代表方剂，具有峻下热结的药效，主治阳明腑实证、热结 旁流和里热实证等。大黄蒽醌类成分是中药大黄泻下的有效成分，厚朴中 的厚朴酚类具有抗病原微生物和调整胃肠运动等药理作用，枳实中的橙皮 素对胃肠道平滑肌、心血管系统、抗炎和利尿等均有一定的作用。以上这 些活性成分是大承气汤药理作用的物质基础。

虎皮大承气汤是在大承气汤的基础上添加了虎杖和瓜蒌皮，可有效改 善急性胰腺炎病情，采用灌肠方式治疗后其通过直肠吸收进入血循环并改 善急性胰腺炎病情的成分分布不清，作用机制不明，既往有研究通过高效 液相色谱-质谱的方法检测大承气汤在急性胰腺炎大鼠体内的分布，而经 过加味后的虎皮大承气汤其成分更加复杂，各成分体内代谢过程更加多 变，迄今尚无可行的检测方法，为其在体药动学的研究及指纹图谱的建立带来更多困难。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种虎皮大承气汤的检测方法，它是 采用HPLC-MS/MS检测，其操作步骤如下：

1)制备对照品溶液：分别取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴酚和香 草酸，加甲醇溶解，即得；

2)制备供试品溶液：取待测样品，加65％甲醇提取，离心，过滤， 取滤液，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪进行 分析：

色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以水为流动相 A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序：

质谱条件如下：

离子化模式，电喷雾离子源；检测方式：负离子扫描；扫描模式： 多反应检测扫描。

进一步地，步骤1)所述对照品溶液中每1mL含大黄素0.98mg、香 草酸0.97mg、橙皮苷0.98mg、虎杖苷0.98mg、厚朴酚0.98mg。

进一步地，步骤2)所述待测样品为虎杖、大黄、瓜蒌皮、厚朴、芒 硝和枳实组成的虎皮大承气汤的配方原料药或配方制剂；所述虎杖、大黄、 瓜蒌皮、厚朴、芒硝和枳实的质量比为：15：12：15：15：9：12。

进一步地，步骤2)所述待测样品和65％甲醇的质量体积比为78g： 50ml。

进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，时间2h；所述离心速度 12000rpm，时间5min；所述过滤是用0.45μm Millipore滤纸过滤。

进一步地，步骤3)所述色谱条件中流速0.4mL/min，柱温30℃； 进样量50μL。

进一步地，步骤3)所述质谱条件中，喷雾电压:5500V，毛细管温度： 500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，离子驻留时间0.10s，虎杖 苷碰撞能量-22eV，大黄素碰撞能量-48eV，橙皮苷碰撞能量-35eV，厚朴 酚碰撞能量-42eV，香草酸碰撞能量-27eV。

进一步地，所述虎杖苷母离子质荷比389.1，子离子质荷比227.1， 大黄素母离子质荷比269.1，子离子质荷比240.1，橙皮苷母离子质荷比 609.2，子离子质荷比301.2，厚朴酚母离子质荷比265.1，子离子质荷比 245.1，香草酸母离子质荷比167.0，子离子质荷比108.0。

本发明一种虎皮大承气汤的在体药动学检测方法，它的操作步骤如 下：

a、取血样或组织离心，取上清液，依次加盐酸、内标物质和乙酸乙 酯混匀，离心，取上清液水浴蒸干，残渣加乙腈水溶液复溶，作为供试品 溶液；

b、按照前述方法检测。

进一步地，步骤a)所述血样离心速度3500r/min，时间30min； 所述组织离心是取组织，加9倍量(v/ml,μL/mg)生理盐水，匀浆，10000 r/min离心10min。

进一步地，步骤a)所述血样或组织上清液、盐酸、内标和乙酸乙酯 的体积比为0.2ml：0.05mL：1mL：1mL；所述混匀后离心的温度为4℃， 时间5min，转速：13000rpm。

更进一步地，所述内标物质是50％甲醇。

进一步地，步骤a)所述水浴温度45℃；所述乙腈水溶液体积 100μL；所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比3：7。

进一步地，步骤b)所述方法中对照品溶液中还需加入空白血浆；所 述对照品溶液空白血浆的体积比为1ml:200ml。

更进一步地，所述空白血浆是没有喂食过任何药物的血浆，按照步骤 a所述方法依次加盐酸、内标物质和乙酸乙酯混匀，离心，上清液蒸干， 残渣加乙腈水溶液复溶得到的溶液。

本发明虎皮大承气汤的检测方法，可以同时实现对大黄素、香草酸、 橙皮苷、虎杖苷和厚朴酚的准确检测，还可以对虎皮大承气汤及血和组织 中其相关成分进行检测，操作简便，容易控制，检测成本低，检测结果准 确可靠，为虎皮大承气汤及其灌肠后在体内药动学提供了一种行之有效的 检测方法。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手 段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式 的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一 步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实 例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1混合对照样品与大鼠血浆HPLC-MS/MS图((1)混合对照品；(2) 大鼠血浆；A：虎杖苷；B：大黄素；C：橙皮苷；D：香草酸；E：厚朴酚； F：内标)

图2混合对照样品与治疗后样品HPLC-MS/MS图((1)混合对照品；(3) 治疗后样品；A：虎杖苷；B：大黄素；C：橙皮苷；D：香草酸；E：厚朴酚； F：内标)

图3两组大鼠各单体成分血浆-时间曲线比较

图4各组大鼠血清淀粉酶水平(6只鼠/组，与假手术组比较， #P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)

图5各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平(6只鼠/组， 与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)

图6各组大鼠结肠MPO、DAO、VIP、水平(6只鼠/组，与假 手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)

图7各组大鼠肺组织MPO、MDA、SOD水平(6只鼠/组，与假 手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05)

图8各组大鼠胰腺、肺、结肠病理结果(病理图片均为HE染色，胰腺 x200倍，肺、结肠病理图x100倍；与假手术组比较，#P<0.05；与模型组 比较，*P<0.05)

具体实施方式

实施例1本发明虎皮大承气汤的检测

1)制备对照品溶液：分别称取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴酚及香 草酸，用甲醇稀释成每1mL含大黄素0.98mg、香草酸0.97mg、橙皮苷0.98 mg、虎杖苷0.98mg和厚朴酚0.98mg的溶液。

2)制备供试品溶液：按生药比例取虎皮大承气汤各药物，其中虎杖 15g，大黄12g，瓜蒌皮15g，厚朴15g，芒硝9g，枳实12g，加入65％甲 醇50mL后超声溶解2小时后，12000rpm离心并取上清液用0.45μm Millipore滤纸过滤，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪，色 谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙 腈为流动相B；流速0.4mL/min；柱温30℃；进样量50μL流动相：梯度 洗脱程序如下：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾负离子模式；扫描模式：多反应检测扫描；喷雾电 压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，碰 撞能量、离子及驻留时间如下：

实施例2本发明血液中虎皮大承气汤的检测方法

1)供试品溶液的制备：

采集血液0.35mL，3500r/min离心30min，取上清200μL，加入0.05 mL0.1mol/LHCl，1mL内标(50％甲醇)，混匀后，加入1mL乙酸乙酯， 混合，4℃离心5min(13000rpm)，转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃ 水浴挥干，残渣用100μL乙腈-水(比例3：7)复溶。

2)空白血浆的制备

采集没有喂食过任何药物的血浆200μL，加入0.05mL0.1mol/L HCl，1mL内标(50％甲醇)，混匀后，加入1mL乙酸乙酯，混合，4℃离 心5min(13000rpm)，转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃水浴挥干， 残渣用100μL乙腈-水(比例3：7)复溶，按照此方法多次制备收集200ml。

3)制备混合对照品溶液：分别称取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴 酚及香草酸，用甲醇稀释成1mg/mL储备液，取储备液1ml,加入空白血浆 200mL，涡旋混匀1min。

4)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪，色谱 条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙 腈为流动相B；流速0.4mL/min；柱温30℃；进样量50μL流动相：梯度 洗脱程序：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾负离子模式；扫描模式：多反应检测扫描；喷雾电 压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v；碰撞气体：氩气；碰 撞能量、离子及驻留时间如下：

实施例3本发明组织中虎皮大承气汤的检测方法

1)供试品溶液的制备：

采集组织100mg，加900μL生理盐水并匀浆，10000r/min离心10min 后取上清200uL；血液及组织样本均分别加入0.05mL0.1mol/L HCl，1mL 内标，混匀后，加入1mL乙酸乙酯，混合，4℃离心5min(13000rpm)， 转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃水浴挥干，残渣用100μL乙腈-水 (比例3：7)复溶。

2)空白血浆的制备

采集没有喂食过任何药物的血浆200μL，加入0.05mL0.1mol/L HCl，1mL内标(50％甲醇)，混匀后，加入1mL乙酸乙酯，混合，4℃离 心5min(13000rpm)，转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃水浴挥干， 残渣用100μL乙腈-水(比例3：7)复溶，按照此方法多次制备收集200ml。

3)制备混合对照品溶液：称取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴酚及 香草酸，用甲醇稀释成1mg/mL储备液，取储备液1ml，加入空白血浆200mL， 涡旋混匀1min。

4)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪，色谱 条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙 腈为流动相B；流速0.4mL/min；柱温30℃；进样量50μL流动相：梯度 洗脱程序：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾负离子模式；扫描模式：多反应检测扫描；喷雾电 压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，碰 撞能量、离子及驻留时间如下：

为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1本发明虎皮大承气汤检测验证1

(1)制备空白血浆溶液：取健康大鼠空白血浆200μL，加入内标(50％ 甲醇溶液)1mL，加入0.05mL0.1mol/L HCl，混匀后，加入1mL乙酸乙酯， 混合，低温离心5min(13000rpm)，转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃ 水浴挥干，残渣用100μL乙腈-水(比例3：7)复溶。

(2)制备混合对照品溶液：分别称取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚 朴酚及香草酸，用甲醇稀释成1mg/mL储备液，加入空白血浆200mL，涡 旋混匀1min。

(3)分别吸取混合对照品溶液和空白血浆溶液注入液相色谱质谱联 用仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙 腈为流动相B；流速0.4mL/min；柱温30℃；进样量50μL流动相：梯度 洗脱程序如下：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾负离子模式；扫描模式：多反应检测扫描；喷雾电 压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，碰 撞能量、离子及驻留时间如下：

从图1中可以看出，在所建立的梯度洗脱条件与质谱条件下，4min内 可测定出虎皮大承气汤中5个有效成分及其含量，且各色谱峰分离良好， 空白血浆中离子浓度显著较混合对照样品低，表明本方法分析速度快，专 属性高。

试验例2本发明血液中虎皮大承气汤的检测方法验证

(1)制备空白血浆溶液：取健康大鼠空白血浆200μL，加入内标(50％ 甲醇溶液)1mL，加入0.05mL0.1mol/L HCl，混匀后，加入1mL乙酸乙酯， 混合，低温离心5min(13000rpm)，转移上清液于尖底玻璃管中，置45℃ 水浴挥干，残渣用100μL乙腈-水(比例3：7)复溶。

(2)制备混合对照品溶液：称取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴酚 及香草酸，用甲醇稀释成1mg/mL储备液，加入步骤(1)空白血浆200mL， 涡旋混匀1min。

(3)供试品溶液的制备：

采集喂食了虎皮大承气汤的大鼠的血液0.35mL，3500r/min离心 30min，取上清200μL，加入0.05mL0.1mol/L HCl，1mL内标，混匀后， 加入1mL乙酸乙酯，混合，4℃离心5min(13000rpm)，转移上清液于 尖底玻璃管中，置45℃水浴挥干，残渣用100μL乙腈-水(比例3：7) 复溶。

(4)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪，色 谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙 腈为流动相B；流速0.4mL/min；柱温30℃；进样量50μL流动相：梯度 洗脱程序：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾负离子模式；扫描模式：多反应检测扫描；喷雾电 压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，碰 撞能量、离子及驻留时间如下：

(5)检测结果

从图2中得出在所建立的梯度洗脱条件与质谱条件下，血浆的内源性 物质不干扰各成分和内标的测定,检测结果稳定可靠，表明液质行为及专 属性良好。

试验例3本发明检测方法建立

一、建立检测方法

1.虎皮大承气汤煎剂的制备：按生药剂量购买虎皮大承承气汤免煎剂， 大黄12g,厚朴15g，枳实12g，芒硝9g，加虎杖15g，瓜蒌皮15g。按1.35g /mL生药浓度加入双蒸水磁力搅拌30min混匀，灌肠剂量为15.6g/Kg.BW。

2.虎皮大承气汤方剂成分检测：在既往研究的基础上，采用Waters高 效液相色谱-质谱-质谱仪，选择液-液、液-固样品预处理技术测定中药大 承气汤煎剂中大黄素、香草酸、橙皮苷、虎杖苷、厚朴酚等成分的浓度。

3.建立急性胰腺炎大鼠模型以及大鼠直肠灌肠方法。

4.虎皮大承气汤灌肠治疗AP的药动学分析：按15.6g/Kg.BW单次灌肠 后5min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、 12h、24h分别抽颈静脉血0.35mL，24h后处死取心血，肺、胰腺、结 肠组织。

5.大鼠血样与组织的保存：采集的血样与组织预处理后需立即进行 -80℃冰冻钳制，从而快速有效地抑制酶活性，以排除生物酶在体外继续 作用产生的偏差。

6.大鼠血样与组织预处理：血样采集后立即3500r/min离心30min，组 织采集并匀浆后10000r/min高速离心10min，-80℃冰冻保存待检测。

7.虎皮大承气汤灌肠治疗AP的药效学分析：急性胰腺炎大鼠造模12h 后给予虎皮大承气汤灌肠治疗一次，24h后取心血，肺，胰腺，结肠组织。

8.统计方法：所有观察数据结果均输入计算机，使用SPSS统计软件包 进行统计处理与分析。

二、具体结果

1、虎皮大承气汤方剂成分检测方法学的建立

通过所建立的液相色谱与质谱条件，在两分钟内检测到虎皮承气汤有 效成分5种，且各色谱峰分离良好，不受内源性物质的干扰。

结论：本实验所建立的液相色谱-质谱-质谱联用检测法分析速度快， 液质行为及专属性良好。

2、虎皮承气汤在大鼠体内药动学过程

2.1虎皮承气汤在两组大鼠体内的均值药时曲线比较

两组大鼠中的均值药时曲线如图3所示，模型组较假手术组达峰时间 早，浓度随时间下降速率快，6h后虎杖苷、大黄素、橙皮苷均呈现二次吸 收高峰，模型组体内贮存量则显著降低。

结论：虎皮承气汤各单体成分在AP大鼠体内代谢加快，二次吸收效率 降低。

2.2虎皮承气汤在两组大鼠体内的药动学参数比较

见表1，从表1可见：治疗组血浆香草酸MRT较对照组显著降低；血浆 虎杖苷MRT低于对照组，Cmax则升高(P<0.05)；治疗组血浆大黄素MRT 较对照组降低，Cmax升高；治疗组血浆厚朴酚MRT较对照组降低，Cmax升 高。

结论：急性胰腺炎不同程度地影响各成分的药动学参数,并显著降低虎 皮承气汤中各成分在大鼠体内的平均驻留时间，促进虎杖苷、厚朴酚、大 黄素的吸收。

表1两组大鼠各单体成分药动学参数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05

2.3虎皮承气汤各单体成分在两组大鼠各组织中分布浓度的比较

见表2，从表2可见：模型组肺组织中虎杖苷浓度显著低于假手术组 (P<0.05)，肺与结肠中厚朴酚含量高于假手术组(P<0.05)。

结论：厚朴酚在肺肠组织中含量明显升高，表明虎皮承气汤作用于急 性胰腺炎大鼠肠肺组织的有效成分可能是厚朴酚。

表2两组大鼠各组织中单体分布

注：与假手术组比较，*P<0.05

3虎皮承气汤灌肠对AP大鼠药效学影响

3.1虎皮大承气汤对AP大鼠血清淀粉酶水平的影响

见图4。从图4可见：模型组淀粉酶水平较假手术组显著升高 (P<0.05)；治疗组较模型组显著降低(P<0.05)；结论：虎皮大承气汤可降 低AP大鼠血清淀粉酶水平。

3.2虎皮大承气汤对AP大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α浓度的影响

见图5，从图5可见：模型组血清IL-6、IL-10水平显著高于假手术 组(P<0.05)；经虎皮大承气汤治疗后，治疗组血清IL-6较模型组明显 降低，IL-10有所升高(P<0.05)，三组TNF-α水平无显著差异(P>0.05)。 结论：虎皮大承气汤在降低AP大鼠血清IL-6的同时可升高IL-10水平， 重建促炎-抗炎平衡。

3.3虎皮大承气汤对AP大鼠结肠炎性损伤的影响

见图6，从图6可见：模型组结肠组织中MPO、DAO含量均高于假手术 组(P<0.05)；治疗组MPO、DAO则显著低于模型组(P<0.05)；结论：虎皮大 承气汤可降低肺组织中MPO、DAO含量，调控AP大鼠结肠组织炎性损伤。

3.4虎皮承气汤对AP大鼠肺组织氧化应激水平的影响

见图7，从图7可见：模型组肺组织中MPO高于假手术组、SOD则低于 假手术组(P<0.05)；经虎皮承气汤治疗后肺组织中MPO显著降低，SOD则 升高(P<0.05)，三组MDA活力无统计学意义。结论：虎皮大承气汤可降 低肺组织中MPO活性、提升SOD含量，减轻AP大鼠肺组织炎性损伤。

3.5虎皮大承气汤对AP大鼠组织病理变化的影响

见图8，从图8可见：通过正置显微镜观察，假手术组胰腺及肺组织可 见少许炎性细胞浸润、水肿、出血，结肠组织少许水肿；模型组胰腺组织 腺泡肿胀，腺泡小叶结构破坏伴大量炎性细胞浸润，见明显液化性坏死灶； 肺组织肺间质重度水肿、增厚，肺泡腔塌陷、融合，伴炎性细胞浸润及局 灶性出血；结肠黏膜层完整性破坏，黏膜层呈灶性坏死，固有层及腺体见 大量炎性细胞浸润及出血点；模型组各组织病理评分均高于假手术组 (P<0.05)；虎皮大承气汤治疗组相对于模型组，胰腺及肺组织炎性浸润、 出血、水肿减少，结肠组织炎性浸润好转，各组织病理评分较模型组显著 降低(P<0.05)。

结论：3.5％牛黄胆酸钠逆行胰胆管注射可造成胰腺、肺、结肠组织损 伤，而虎皮大承气汤可减轻相应组织病理损伤。

4.结论

4.1.灌肠后，虎皮大承气汤多种成分被有效吸收入血发挥作用，其中 厚朴酚在肺肠组织中含量明显升高，表明虎皮承气汤作用于急性胰腺炎大 鼠肠肺组织的有效成分可能是厚朴酚；

4.2.经治疗后，急性胰腺炎大鼠血清淀粉酶水平、炎症因子较模型组 明显降(p<0.05)，肠、肺组织氧化应激水平显著低于模型组(p<0.05)， 肺组织、结肠及胰腺组织病理评分较模型组明显降低(p<0.05)，证明虎 皮大承气汤灌肠能降低AP大鼠血清淀粉酶水平，降低血清炎症因子，重建 促炎-抗炎平衡，降低结肠与肺炎症反应，减轻胰腺炎性损伤，从而缓解急 性胰腺炎病情。

综上，本发明虎皮大承气汤的检测方法，通过特定的样品处理、色谱 分析方法，及有效成分特定的母离子、子离子的质荷比，碰撞能量，可以 同时实现对大黄素、香草酸、橙皮苷、虎杖苷和厚朴酚的准确检测，还可 以对虎皮大承气汤及血和组织中其相关成分进行检测，操作简便，容易控 制，检测成本低，检测结果准确可靠，为虎皮大承气汤及其灌肠后在体内 药动学提供了一种行之有效的检测方法。

Claims (15)

1.一种虎皮大承气汤的检测方法，其特征在于：它是采用HPLC-MS/MS检测，其操作步骤如下：

1)制备对照品溶液：分别取虎杖苷，大黄素，橙皮苷，厚朴酚和香草酸，加甲醇溶解，即得；

2)制备供试品溶液：取待测样品，加65％甲醇提取，离心，过滤，取滤液，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪进行分析：

色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序：

质谱条件如下：

离子化模式，电喷雾离子源；检测方式：负离子扫描；扫描模式：多反应检测扫描。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述对照品溶液中每1mL含大黄素0.98mg、香草酸0.97mg、橙皮苷0.98mg、虎杖苷0.98mg、厚朴酚0.98mg。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述待测样品为虎杖、大黄、瓜蒌皮、厚朴、芒硝和枳实组成的虎皮大承气汤的配方原料药或配方制剂；所述虎杖、大黄、瓜蒌皮、厚朴、芒硝和枳实的质量比为：15：12：15：15：9：12。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述待测样品和65％甲醇的质量体积比为78g：50ml。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取为超声提取，时间2h；所述离心速度12000rpm，时间5min；所述过滤是用0.45μm Millipore滤纸过滤。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件中流速0.4mL/min，柱温30℃；进样量50μL。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述质谱条件中，喷雾电压:5500V，毛细管温度：500℃，毛细管压力：60v，碰撞气体：氩气，离子驻留时间0.10s，虎杖苷碰撞能量-22eV，大黄素碰撞能量-48eV，橙皮苷碰撞能量-35eV，厚朴酚碰撞能量-42eV，香草酸碰撞能量-27eV。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述虎杖苷母离子质荷质比389.1，子离子质荷比227.1，大黄素母离子质荷比269.1，子离子质荷比240.1，橙皮苷母离子质荷比609.2，子离子质荷比301.2，厚朴酚母离子质荷比265.1，子离子质荷比245.1，香草酸母离子质荷比167.0，子离子质荷比108.0。

9.一种虎皮大承气汤的在体药动学检测方法，其特征在于：它的操作步骤如下：

a、取血样或组织离心，取上清液，依次加盐酸、内标物质和乙酸乙酯混匀，离心，取上清液水浴蒸干，残渣加乙腈水溶液复溶，作为供试品溶液；

b、按照权利要求1所述方法检测。

10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于：步骤a)所述血样离心速度3500r/min，时间30min；所述组织离心是取组织，加9倍量(v/ml,μL/mg)生理盐水，匀浆，10000r/min离心10min。

11.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于：步骤a)所述血样或组织上清液、盐酸、内标物质和乙酸乙酯的体积比为0.2ml：0.05mL：1mL：1mL；所述混匀后离心的温度为4℃，时间5min，转速：13000rpm。

12.根据权利要求9或11所述的检测方法，其特征在于：所述内标物质是50％甲醇。

13.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于：步骤a)所述水浴温度45℃；所述乙腈水溶液体积100μL；所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比3：7。

14.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于：步骤b)所述方法中对照品溶液中还需加入空白血浆；所述对照品溶液与空白血浆的体积比为1:200。

15.根据权利要求14所述检测方法，其特征在于：所述空白血浆是没有喂食过任何药物的血浆，按照步骤a所述方法处理得到的溶液。