CN114371247A - 一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗心衰中药质量标志物发现方法，该方法包括：一、抗心衰中药提取液的制备；二、心肌线粒体提取；三、心肌线粒体膜色谱柱的制备；四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立；五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察；六、抗心衰中药质量标志物的发现；本发明还公开了一种四逆汤质量标志物群。本发明以心肌线粒体膜为靶标筛选得到抗心衰中药质量标志物，具有快速，高通量，筛选结果准确度高的优点；本发明获得四逆汤中的抗心衰中药质量标志物，实现了四逆汤基于药效成分的质量评价，破解了四逆汤制剂质量的参差不齐导致用药疗效预期不明确及四逆汤质量评价与其药效不关联的问题。

Description

一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群。

背景技术

心力衰竭是所有心脏疾病的最终转归，具有高再住院率、致残率及致死率的特点，给社会和家庭带来了极大的经济负担。中医药已成为心衰综合治疗的重要手段之一，很多中药产品(如中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)具有抗力衰竭作用，如四逆汤，参附汤，芪附汤等。长期以来，中药质量控制手段、质量评价指标及质量标准与其有效性关联不强，严重影响中药的临床疗效和安全性。抗心衰中药的质量控制亦是如此，如四逆汤，它是由附子、干姜和甘草三味中药组成的多成分复杂体系。《中国药典》(2020版)以甘草酸和乌头碱作为四逆汤的质控成分，难以确保其临床疗效的稳定，存在非常大的安全隐患。因此中药产品质量控制的新概念：中药质量标志物(Q-Marker)被提出。中药Q-marker是存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质。中药Q-marker是中药质量的标示性物质，必须与中药的有效性密切相关。目前中药质量标志物研究刚刚起步，抗心衰中药产品尚缺少一种普适性的质量标志物的研究方法。因此，寻找一种可被广泛接受的抗心衰中药质量标志物研究策略尤为重要。

近年来，“能量耗竭学说”已成为国际心力衰竭研究领域的热点(Ingwall JoanneS.Energy metabolism in heart failure and remodelling.Cardiovascular Research,2009,81(3):412-419.；Bertero Edoardo,Maack Christoph.Metabolic remodelling inheart failure.Nature Reviews Cardiology,2018,15(8):457-470.)。线粒体(Mitochondria)是细胞内含有双层膜结构的细胞器，是细胞能量生成的关键细胞器。研究表明心力衰竭的发病和进展过程中，线粒体既是心力衰竭时病理因子攻击的靶标，也是心力衰竭时各种病理变化的起源(Kumar Vikas,Kumar T.R.Santhosh,KarthaC.C.Mitochondrial membrane transporters and metabolic switch in heartfailure.Heart Failure Reviews,2019,24(2):255-267.；Brown David A.,Perry JustinB.,Allen Mitchell E.,Sabbah Hani N.,Stauffer Brian L.,Shaikh Saame Raza,Cleland John G.F.,Colucci Wilson S.,Butler Javed,Voors Adriaan A.,AnkerStefan D.,Pitt Bertram,Pieske Burkert,Filippatos Gerasimos,Greene Stephen J.,Gheorghiade Mihai.Mitochondrial function as atherapeutic target in heartfailure.Nature Reviews Cardiology,2017,14(4):238-250.)。线粒体膜存在众多药物靶点，如渗透转换孔复合体(mPTP)、18kDa转位分子蛋白(TSPO)、线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)等，线粒体膜已成为心力衰竭治疗的重要靶标(Brown David A.,Perry JustinB.,Allen Mitchell E.,Sabbah Hani N.,Stauffer Brian L.,Shaikh Saame Raza,Cleland John G.F.,Colucci Wilson S.,Butler Javed,Voors Adriaan A.,AnkerStefan D.,Pitt Bertram,Pieske Burkert,Filippatos Gerasimos,Greene Stephen J.,Gheorghiade Mihai.Mitochondrial function as a therapeutic target in heartfailure.Nature Reviews Cardiology,2017,14(4):238-250.)。例如，Sharov等研究发现mPTP阻断剂环孢菌素A能够改善心力衰竭犬离体心肌细胞的线粒体呼吸链功能(SharovVictor G.,Todor Anastassia,Khanal Sanjaya,Imai Makoto,Sabbah HaniN.Cyclosporine A attenuates mitochondrial permeability transition andimproves mitochondrial respiratory function in cardiomyocytes isolated fromdogs with heart failure.Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2007,42(1):150-158.)；De Tassigny等研究发现4'-氯地西泮能够与线粒体外膜上的TSPO结合，抑制线粒体ROS的产生和线粒体膜通透性转换孔的开放，减轻阿霉素诱导的心肌细胞死亡(deTassigny Alexandra d'Anglemont,Assaly Rana,Schaller Sophie,Pruss Rebecca M.,Berdeaux Alain,Morin Didier.Mitochondrial translocator protein(TSPO)ligandsprevent doxorubicin-induced mechanical dysfunction and cell death in isolatedcardiomyocytes.Mitochondrion,2013,13(6):688-697.)。因此，以心肌线粒体膜为靶标，寻找与心肌线粒体膜结合成分，可发现抗心衰中药质量标志物。生物色谱技术的发展为寻找心肌线粒体膜结合成分提供可能，然而现阶段仍然缺少基于心肌线粒体膜色谱的抗心衰中药质量标志物的发现的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗心衰中药质量标志物发现方法。该方法以心肌线粒体膜为靶标，筛选得到抗心衰中药质量标志物，具有快速，高通量，筛选结果准确度高的优点，并提供了一种快速发现抗心衰中药质量标志物的思路和方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、抗心衰中药提取液的制备：向抗心衰中药中加入溶剂进行提取得到粗提液，将粗提液过滤得到滤液，滤液经静置后再次过滤并回收溶剂，然后补加去离子水复溶，得到抗心衰中药原液，使用时，将抗心衰中药原液稀释后进行微孔过滤，得到抗心衰中药提取液；

步骤二、心肌线粒体提取：

步骤201、向剪碎的大鼠心脏组织中加入胰蛋白酶在冰浴条件下搅拌酶解，然后加入胰蛋白酶抑制剂搅拌，洗涤后采用细胞滤网过滤，得到的滤饼为酶解组织，将酶解组织在4℃下匀浆后进行一次离心，得到一次上清液和一次沉淀，将一次上清液在4℃下进行二次离心得到二次上清液和二次沉淀，将二次沉淀在4℃下进行三次离心得到三次上清液和三次沉淀，该三次沉淀即为线粒体粗提物；

步骤202、将步骤201中得到的线粒体粗提物进行一次重悬浮，得到的重悬液在4℃下进行一次离心，采用巴斯德吸管吸取离心后重悬液中的线粒体条带，然后稀释并在4℃下进行二次离心，得到的沉淀经二次重悬浮后在4℃下进行三次离心，得到的沉淀物经三次重悬浮后，得到纯化的线粒体悬液，并置于-20℃下保存；

步骤三、心肌线粒体膜色谱柱的制备：

步骤301、固定相载体合成：将脱气硅胶与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶剂、110℃、氩气保护下反应，得到的反应产物经干燥后加入戊二醛甲醇溶液，并在室温下振摇反应进行醛氨缩合，制备得到带有醛基的可与线粒体交联的固定相载体；

步骤302、心肌线粒体膜蛋白制备：将步骤202中得到的纯化的线粒体悬液进行重悬浮，然后进行破碎，得到的破碎的浆液经离心后得到线粒体膜沉淀，将线粒体膜沉淀重悬浮后得到线粒体膜悬浮液；

步骤303、心肌线粒体膜固定相制备：在真空搅拌条件下，将步骤302中得到的线粒体膜悬浮液与步骤301中得到的固定相载体进行反应并在4℃下孵育过夜，经洗涤离心后得到心肌线粒体膜固定相；

步骤304、装柱：在4℃下采用液相泵将步骤303中得到的心肌线粒体膜固定相装入色谱柱中，并进行平衡，得到心肌线粒体膜色谱柱，封柱后置于4℃备用；

步骤四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立：采用高效液相色谱仪及配套的二元泵、单元泵、恒温箱、在线脱气剂、自动进样器为基础，将步骤304中得到的心肌线粒体膜色谱柱作为第一维色谱柱，将C18色谱柱作为第二维色谱柱，采用电控十通阀在线串联心肌线粒体膜色谱柱和C18色谱柱，且第二维色谱柱的流出口与质谱检测器连接，构建得到心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统；

步骤五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察：配制含有靶向线粒体膜的阳性药和阴性药的混合溶液作为标准液，然后将标准液通入步骤四中构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统进行分析，通过考察靶向线粒体膜的阳性药和阴性药在第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱上的保留性能，考察心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性；

步骤六、抗心衰中药质量标志物的发现：将步骤一中制备的抗心衰中药提取液通入步骤五中选择性考察合格的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中进行分析，获得与第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱的保留结合成分，然后选择心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值，获得与心肌线粒体膜色谱的强结合保留成分，作为抗心衰中药质量标志物。

本发明先对抗心衰中药进行提取得到抗心衰中药提取液，然后采用离心和重悬浮方法提取心肌线粒体，获得纯化的线粒体悬液，经破碎得到线粒体膜蛋白再与固定相载体反应，利用线粒体膜蛋白上的氨基与固定相载体表面的醛基的醛氨缩合反应，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷共价修饰硅胶-戊二醛交联的心肌线粒体膜固定相，并装柱得到心肌线粒体膜色谱柱，以该心肌线粒体膜色谱柱为准建立心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统，并通入抗心衰中药提取液进行分析并结合质谱检测，根据在心肌线粒体膜色谱柱上的保留时间，以心肌线粒体膜为靶标，筛选得到抗心衰中药质量标志物。

上述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤201中所述一次离心的条件为：740g离心力下离心5min，并重复一次，所述二次离心的条件为：9000g离心力下离心10min，所述三次离心的条件为：10000g离心力下离心10min，并重复一次。

上述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤202中所述一次离心的条件为：95000g离心力下离心30min；所述二次离心和三次离心的条件均为：6300g离心力下离心10min。

上述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤302所述破碎采用超声法，超声功率为400W，且每次超声2s停止20s，共进行7次；所述离心的条件为：12000g离心力下离心20min。

上述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤五中所述标准液中靶向线粒体膜的阳性药为双氯酚酸和鱼藤酮，靶向线粒体膜的阴性药为卡托普利和硝苯地平。

上述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤五和步骤六中所述分析的过程均为：将标准液或抗心衰中药提取液通入第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱中，采用的流动相为10mM醋酸铵溶液，流速为0.2mL·min^-1，流出液通过切换阀在2个500μL定量环中分别进行收集，通过切换分别进入第二维色谱柱C18色谱柱进行梯度洗脱，采用的流动相为溶剂A体积含量0.1％甲酸水溶液与溶剂B乙腈的混合溶液，流速为0.2mL·min^-1，梯度洗脱的第0～8min，流动相中溶剂B的体积含量由10％上升至60％，第8min～10min，流动相中溶剂B的体积含量保持为60％，第10min～10.01min，流动相中溶剂B的体积含量由60％下降至10％，第10.01min～13min，流动相中溶剂B的体积含量保持为10％；所述抗心衰中药提取液过第二维色谱柱C18色谱柱后的分流比为1：1，并以0.4mL·min^-1进入质谱检测器。

另外，本发明还公开了一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，以四逆汤为抗心衰中药，采用上述的方法制备得到。

四逆汤出自《伤寒论》，是治疗伤寒少阴病的代表方剂，其中成药被收录于《中国药典》(2020版)，具有温中祛寒，回阳救逆的功效，用于治疗阳虚欲脱、冷汗自出、四肢厥逆、下利清谷、脉微欲绝。现代医家通过将古代方书中四逆汤所主治疾病及其症状与西医疾病所表现出来的症状进行比较与分析，发现心力衰竭是四逆汤主治的西医疾病，并通过临床和实验研究证实了四逆汤是治疗心力衰竭的有效方剂。目前，尽管四逆汤在体内外试验中显示了显著的心血管药理活性，但其抗心衰的关键药效物质仍未阐明，其质量控制标准仍不完善，2020版《中国药典》仅以指标成分甘草酸作为含量质量控制成分，难以确保临床疗效的稳定，是急需提升《中国药典》标准的中药品种之一。中药质量控制是实现中药标准化、现代化、产业化、国际化的基础和关键，而质量标志物辨识则是支撑中药质量控制的前提和基石。因此，寻找四逆汤治疗心力衰竭的药效成分(群)，构建基于中药复方药效成分的质量控制方法是四逆汤质量标准提升亟待解决的关键科学问题。

本发明以抗心衰中药四逆汤为研究对象，以心肌线粒体膜为靶标，对四逆汤中的抗心衰中药质量标志物进行分析筛选，获得的质量标志物为代表四逆汤抗心衰活性成分群，并用于四逆汤的质量评价，实现了四逆汤基于药效成分的质量评价，一方面，该活性成分群破解了四逆汤制剂质量的参差不齐导致用药疗效预期不明确及四逆汤质量评价与其药效不关联的问题。

上述的一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，所述四逆汤由附子、干姜、甘草按照3：2：3的质量比组成的原料提取得到。

上述的一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，所述心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值为22.5min，确定宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏、异苷草素、8-姜酚作为四逆汤的抗心衰中药质量标志物。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用离心和重悬浮方法提取心肌线粒体，并与固定相载体反应制备心肌线粒体膜固定相，并以此为中心建立心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统，然后通入抗心衰中药提取液进行分析，结合质谱检测，根据在心肌线粒体膜色谱柱上的保留时间，以心肌线粒体膜为靶标，筛选得到抗心衰中药质量标志物，具有快速，高通量，筛选结果准确度高的优点，很好地体现了中药“多组分-多靶点”整体作用特点和中药质量标志物整体性优势。

2、本发明方法发现的抗心衰中药质量标志物可直接用于制备替代该中药基本等效的药物组合物，从而获得成分明确、组成比例可控的药物。

3、本发明以心肌线粒体膜为中药质量标志物筛选载体，提供了一种快速发现抗心衰中药质量标志物的思路和方法。

4、本发明对四逆汤中的抗心衰中药质量标志物进行分析筛选，获得的质量标志物为代表四逆汤抗心衰活性成分群，实现了四逆汤基于药效成分的质量评价，破解了四逆汤制剂质量的参差不齐导致用药疗效预期不明确及四逆汤质量评价与其药效不关联的问题。

下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明心肌线粒体提取的流程图。

图2为本发明心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统切换模式的结构示意图。

图3为本发明标准液在心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中的分析结果。

图4为本发明四逆汤提取液在心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中二维等高线图分析结果。

图5为本发明四逆汤中抗心衰中药质量标志物和对照成分拮抗阿霉素心脏毒性细胞活力结果图。

具体实施方式

本发明以四逆汤为研究对象，对抗心衰中药质量标志物发现方法进行详细说明。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

步骤一、抗心衰中药提取液的制备：根据2020年版《中国药典》记载的四逆汤组成，分别称取60g附子、40g干姜和60g甘草，用1600mL纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热用四层纱布过滤，再向滤液中加入2倍体积乙醇沉淀多糖和蛋白，在4℃冰箱静置24h，过滤并在60℃减压回收溶剂，得到四逆汤原液，向四逆汤原液中加去离子水复溶至其浓度相当于原药材约为1.0g/mL，得到四逆汤浓缩提取液，分析进样前，取四逆汤浓缩提取液稀释10倍，并用0.2μm微孔滤膜过滤，即得四逆汤提取液；

步骤二、心肌线粒体提取：

首先配制心肌线粒体提取过程中的各溶液，具体如下：

(1)1-M Tris-HCl(pH7.4)：精密称取12.14g三羟甲基氨基甲烷溶于50mL双蒸水中，加HCl调节pH至7.4，用双蒸水稀释至100mL，置于4℃冰箱保存；

(2)0.5M HEPES(pH7.4)：称取2.4g的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶于16mL双蒸水中，加KOH调节pH至7.4，加双蒸水稀释至20mL，置于4℃冰箱保存；

(3)100mM EGTA(pH7.4)：称取3.8g的EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)溶于70mL双蒸水中，加KOH调节pH至7.4，用双蒸水稀释至100mL，置于4℃冰箱保存；

(4)原始缓冲溶液：称取20.5g甘露醇、13g蔗糖溶于400mL双蒸水中，加入15m的1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)，4℃下冷却30min，加KOH调节pH至7.4，用双蒸水稀释至500mL，置于4℃冰箱保存；

(5)MRB溶液：精密称取4.56g甘露醇溶于80mL双蒸水中，加入1mL(2)中配制的0.5MHEPES(pH7.4)，4℃下冷却30min，加KOH调节pH至7.4，加双蒸水稀释至100mL，置于4℃冰箱保存；

(6)IBHeart-1：称取0.75g BSA(牛血清白蛋白)溶于150mL(4)中配制的原始缓冲溶液中，加入750μL(3)中配制的100mM EGTA(pH7.4)，超声5min充分溶解后，置于4℃冰箱保存；

(7)IBHeart-2：称取0.25g BSA(牛血清白蛋白)溶于150mL(4)中配制的原始缓冲溶液中，超声5min充分溶解后，置于4℃冰箱保存；

(8)IBHeart-3：配制方法同原始缓冲溶液；

(9)Percoll介质基础溶液：精密称取2.052g甘露醇溶于25mL双蒸水中，加入2.5mL(2)中配制的0.5M HEPES(pH7.4)、0.5mL(3)中配制的100mM EGTA(pH7.4)，4℃下冷却30min，加KOH调节pH至7.4，加双蒸水稀释至35mL，置于4℃冰箱保存；

(10)Percoll介质溶液：量取4.8mL的Percoll介质，溶于11.2mL(9)中配制的Percoll介质基础溶液中。

步骤201、如图1所示，先采用IBHeart-1冲洗大鼠心脏1次并移除大鼠心脏中的结缔组织，转移至50mL预冷的烧杯中并用IBHeart-3洗涤3次，用定性滤纸吸干水分后在冰浴的蒸发皿中剪碎，剪碎的组织采用10mL的IBHeart-1洗涤1次后用细胞滤网过滤，弃去洗涤液并收集组织、称重，按照每g组织加入2mL胰蛋白酶的比例向收集的大鼠心脏组织中加入胰蛋白酶，在冰浴条件下磁力搅拌3min酶解，然后加入胰蛋白酶抑制剂继续磁力搅拌1min，收集组织并用IBHeart-1洗涤3次后用细胞滤网过滤，弃去洗涤液并收集滤饼得到酶解组织，将酶解组织置于容积40mL的Dounce匀浆器中，加入10mL的IBHeart-1在4℃下采用A棒即研磨棒手动上下研磨组织45次得到匀浆液，将匀浆液转移至15mL预冷的离心管中，在4℃、740g离心力下离心5min，弃去沉淀并将上清液转移至15mL预冷的离心管中，在4℃、740g离心力下离心5min，弃去一次沉淀即未破坏的细胞、细胞核并将一次上清液转移至15mL预冷的离心管中，在4℃、9000g离心力下离心10min，弃去二次上清液即质膜、脂质体、细胞质等并将二次沉淀转移至容积40mL的Dounce匀浆器中，加入10mL的IBHeart-2并轻轻重悬浮沉淀，将重悬浮液转移至15mL预冷的离心管中，在4℃、10000g离心力下离心10min，弃去上清液并将沉淀转移至容积40mL的Dounce匀浆器中，加入10mL的IBHeart-3并轻轻重悬浮沉淀，将重悬浮液转移至15mL预冷的离心管中，在4℃、10000g离心力下离心10min，得到三次上清液即质膜、脂质体、细胞质等和三次沉淀即线粒体粗提物；

步骤202、如图1所示，将步骤201中得到的线粒体粗提物转移至容积7mL的Dounce匀浆器中，加入2mL的MRB溶液轻轻重悬浮沉淀，得到的线粒体重悬液转移至5mL离心管中，向12mL离心管中加入8mL的Percoll介质溶液，在上面轻轻加入2mL线粒体重悬液，再轻轻加入1.5mL的MRB溶液，然后在4℃、95000g离心力下离心30min，采用巴斯德吸管吸取离心后重悬液中的线粒体条带转移至5mL离心管中，采用MRB溶液稀释4倍后在4℃、6300g离心力下离心10min，弃去上清液后将沉淀转移至7mL的Dounce匀浆器中，加入5mL的MRB溶液轻轻重悬浮沉淀，在4℃、6300g离心力下离心10min，弃去上清液后将沉淀采用100μL的MRB溶液重悬浮，得到纯化的线粒体悬液，并置于-20℃冰箱中保存；

步骤三、心肌线粒体膜色谱柱的制备：

步骤301、固定相载体合成：将0.2g脱气硅胶与0.1mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷在10mL甲苯溶剂、110℃、氩气保护下反应12h，得到的反应产物经干燥后加入体积浓度5％的戊二醛甲醇溶液，并在室温下置于摇床中振摇反应2h进行醛氨缩合，使戊二醛与3-氨基丙基三乙氧基硅烷共价修饰硅胶通过醛氨缩合，制备得到带有醛基的可与线粒体交联的固定相载体；

步骤302、心肌线粒体膜蛋白制备：采用5mLPBS缓冲液对步骤202中得到的纯化的线粒体悬液进行重悬浮，然后使用超声破碎仪进行破碎，超声功率为400W，且每次超声2s停止20s，共进行7次，得到的破碎的浆液在4℃、12000g离心力下离心20min得到线粒体膜沉淀，将线粒体膜沉淀重悬浮后得到线粒体膜悬浮液；

步骤303、心肌线粒体膜固定相制备：在真空搅拌条件下，将步骤302中得到的线粒体膜悬浮液与0.04g步骤301中得到的固定相载体进行反应并在4℃下孵育过夜12h，使得线粒体膜蛋白质上的氨基(-NH₂)与固定相载体表面的醛基进行醛氨缩合，采用PBS溶液洗涤3次后在1000g离心力下离心5min，得到心肌线粒体膜固定相；

步骤304、装柱：在4℃下采用液相泵以10mM PBS为流动相，将步骤303中得到的心肌线粒体膜固定相装入10mm×2mm I.D的色谱柱中，并用10mM醋酸铵溶液以0.2ml·min^-1流速平衡色谱柱1h直到出现稳定的柱压和基线，得到心肌线粒体膜色谱柱，采用10mM醋酸铵溶液封柱后置于4℃备用；

步骤四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立：采用安捷伦1200系列高效液相色谱仪及配套的二元泵、单元泵、恒温箱、在线脱气剂、自动进样器为组成基础，并由安捷伦MassHunter工作站控制(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)，将步骤304中得到的心肌线粒体膜色谱柱(长度10mm×内径2mm)作为第一维色谱柱，将C18色谱柱(长度100mm×内径3.0mm)作为第二维色谱柱，采用电控十通阀在线串联心肌线粒体膜色谱柱和C18色谱柱，且第二维色谱柱的流出口与质谱检测器即Agilent 6220Accurate-Mass time-of-flight mass spectrometry(TOF-MS)飞行时间质谱仪连接，构建得到心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统；

步骤五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察：配制含有靶向线粒体膜的阳性药双氯酚酸、鱼藤酮和阴性药卡托普利、硝苯地平的混合溶液作为标准液，然后将标准液通入步骤四中构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中的第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱(缩写为一维心肌线粒体膜色谱柱)中，采用的流动相为10mM醋酸铵溶液，流速为0.2mL·min^-1，流出液通过切换阀在2个500μL定量环中分别进行收集，通过切换电控十通阀(如图2所示，图2中的位置1和位置2为十通阀的两个切换状态及相应流路)分别进入第二维色谱柱C18色谱柱(缩写为二维C18色谱柱)进行梯度洗脱，采用的流动相为溶剂A体积含量0.1％甲酸水溶液与溶剂B乙腈的混合溶液，流速为0.2mL·min^-1，梯度洗脱的第0～8min，流动相中溶剂B的体积含量由10％上升至60％，第8min～10min，流动相中溶剂B的体积含量保持为60％，第10min～10.01min，流动相中溶剂B的体积含量由60％下降至10％，第10.01min～13min，流动相中溶剂B的体积含量保持为10％，抗心衰中药提取液过第二维色谱柱分离C18色谱柱后的分流比为1：1，并以0.4mL·min^-1进入质谱检测器，结果如图3所示，图3中右边的彩色柱图代表色谱峰质谱检测响应相对强度，从图3可以看出，标准液中阴性药卡托普利、硝苯地平在心肌线粒体膜色谱柱中的保留时间分别为2.5min～5.0min、2.5min～7.5min，即基本不保留，很快地被流动相洗脱出色谱柱，而阳性药双氯酚酸、鱼藤酮在心肌线粒体膜色谱柱中的保留时间分别为7.5min～30min、2.5min～25min，即具有很好的保留性能，说明了本实施例构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统具有很好的选择性；

步骤六、抗心衰中药质量标志物的发现：将步骤一中制备的四逆汤提取液通入步骤五中构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中进行分析，进样体积为5μL,其它分析条件步骤五，结果如图4和表1所示，获得24种与第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱的保留结合成分，然后选择心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值为22.5min，获得5种与心肌线粒体膜色谱的强结合保留成分即宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏、异苷草素、8-姜酚作为四逆汤的抗心衰中药质量标志物。

表1四逆汤中与心肌线粒体保留结合成分的二维色谱分析结果

图4为本发明四逆汤提取液在心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中二维等高线图分析结果，图4中右边的彩色柱图代表色谱峰质谱检测响应相对强度，横坐标为四逆汤提取液中的成分在一维心肌线粒体膜色谱柱上的保留时间，纵坐标为一维心肌线粒体膜色谱柱上洗脱的成分在二维C18色谱柱上的保留时间，且在一维心肌线粒体膜色谱柱上的保留时间越长，说明该成分与心肌线粒体膜的结合作用力越强，从图4可知，四逆汤提取液中的成分宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏、异苷草素、8-姜酚在一维心肌线粒体膜色谱柱上的保留时间均到达了选择的保留时间界值22.5min，说明该五种成分为四逆汤的抗心衰中药质量标志物。

对四逆汤中抗心衰中药质量标志物进行活性验证

在表1中四逆汤中与心肌线粒体保留结合成分的二维色谱分析结果的基础上，对本实施例四逆汤中抗心衰中药质量标志物宋果灵、峰尼奥林、峰塔拉萨敏、峰异苷草素、8-姜酚进行活性验证，同时选择四逆汤中与心肌线粒体弱保留结合成分的7种成分即附子灵、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、甘草酸、刺芒柄花素、8-姜烯酚、6-姜烯酚作为对照成分进行活性比较实验，选择经典的阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型作为心力衰竭模型，结合细胞活力分析，具体流程如下：将H9c2心肌细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板上，在37℃、体积含量5％的CO₂恒温培养箱培养至细胞密度约70％～80％时，弃培养液，分别加入含有不同浓度上述11种成分的培养液，6h后直接加入含有2μM阿霉素的培养液，得到样品组；根据样品组的制备过程，另设阿霉素模型组(2μM阿霉素)、正常对照组(有细胞，无阿霉素)和空白对照组(无细胞，无阿霉素)。将上述各组均继续培养18h，弃培养液，每孔加入110μL的CCK8工作液(100μM的DMEM培养基中加入10μL的CCK8)孵育3h，并以空白对照组为参照计算细胞活力，计算公式如下：

图5为本发明四逆汤中抗心衰中药质量标志物和对照成分拮抗阿霉素心脏毒性细胞活力结果图，图五中的^##p<0.01，阿霉素组与对照组比较；*p<0.05,线粒体膜结合成分与阿霉素组比较；**p<0.01,线粒体膜结合成分与阿霉素组比较；11种与线粒体结合的成分给药浓度单位均为μM。从图5可以看出，阿霉素组细胞活力在50％～60％之间，5种与线粒体膜强结合成分即抗心衰中药质量标志物宋果灵(10μM～50μM)、尼奥林(10μM～50μM)、塔拉萨敏(10μM～50μM)、异苷草素(6.25μM～25μM)、8-姜酚(10μM～50μM)在对应的浓度下，表现出细胞活力上升，有抑制阿霉素诱导的心肌损伤的作用；7种与线粒体弱结合成分即对照成分附子灵(10μM～50μM)、苯甲酰新乌头原碱(10μM～50μM)、次乌头碱(10μM～50μM)、甘草酸(10μM～50μM)、刺芒柄花素(12.5μM～50μM)、8-姜烯酚(6.25μM～25μM)、6-姜烯酚(6.25μM～25μM)在各浓度下对抑制阿霉素诱导的心肌损伤的作用无统计学意义。

综上，本发明以心肌线粒体膜为靶标，建立心肌线粒体二维色谱筛选体系，有效实现了抗心衰中药质量标志物的发现；同时，本发明的方法筛选得到宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏、异苷草素、8-姜酚等5种成分作为四逆汤质量标志物群。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (9)

1.一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、抗心衰中药提取液的制备：向抗心衰中药中加入溶剂进行提取得到粗提液，将粗提液过滤得到滤液，滤液经静置后再次过滤并回收溶剂，然后补加去离子水复溶，得到抗心衰中药原液，使用时，将抗心衰中药原液稀释后进行微孔过滤，得到抗心衰中药提取液；

步骤二、心肌线粒体提取：

步骤201、向剪碎的大鼠心脏组织中加入胰蛋白酶在冰浴条件下搅拌酶解，然后加入胰蛋白酶抑制剂搅拌，洗涤后采用细胞滤网过滤，得到的滤饼为酶解组织，将酶解组织在4℃下匀浆后进行一次离心，得到一次上清液和一次沉淀，将一次上清液在4℃下进行二次离心得到二次上清液和二次沉淀，将二次沉淀在4℃下进行三次离心得到三次上清液和三次沉淀，该三次沉淀即为线粒体粗提物；

步骤202、将步骤201中得到的线粒体粗提物进行一次重悬浮，得到的重悬液在4℃下进行一次离心，采用巴斯德吸管吸取离心后重悬液中的线粒体条带，然后稀释并在4℃下进行二次离心，得到的沉淀经二次重悬浮后在4℃下进行三次离心，得到的沉淀物经三次重悬浮后，得到纯化的线粒体悬液，并置于-20℃下保存；

步骤三、心肌线粒体膜色谱柱的制备：

步骤301、固定相载体合成：将脱气硅胶与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶剂、110℃、氩气保护下反应，得到的反应产物经干燥后加入戊二醛甲醇溶液，并在室温下振摇反应进行醛氨缩合，制备得到带有醛基的可与线粒体交联的固定相载体；

步骤302、心肌线粒体膜蛋白制备：将步骤202中得到的纯化的线粒体悬液进行重悬浮，然后进行破碎，得到的破碎的浆液经离心后得到线粒体膜沉淀，将线粒体膜沉淀重悬浮后得到线粒体膜悬浮液；

步骤303、心肌线粒体膜固定相制备：在真空搅拌条件下，将步骤302中得到的线粒体膜悬浮液与步骤301中得到的固定相载体进行反应并在4℃下孵育过夜，经洗涤离心后得到心肌线粒体膜固定相；

步骤304、装柱：在4℃下采用液相泵将步骤303中得到的心肌线粒体膜固定相装入色谱柱中，并进行平衡，得到心肌线粒体膜色谱柱，封柱后置于4℃备用；

步骤四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立：采用高效液相色谱仪及配套的二元泵、单元泵、恒温箱、在线脱气剂、自动进样器为基础，将步骤304中得到的心肌线粒体膜色谱柱作为第一维色谱柱，将C18色谱柱作为第二维色谱柱，采用电控十通阀在线串联心肌线粒体膜色谱柱和C18色谱柱，且第二维色谱柱的流出口与质谱检测器连接，构建得到心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统；

步骤五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察：配制含有靶向线粒体膜的阳性药和阴性药的混合溶液作为标准液，然后将标准液通入步骤四中构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统进行分析，通过考察靶向线粒体膜的阳性药和阴性药在第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱上的保留性能，考察心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性；

步骤六、抗心衰中药质量标志物的发现：将步骤一中制备的抗心衰中药提取液通入步骤五中选择性考察合格的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中进行分析，获得与第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱的保留结合成分，然后选择心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值，获得与心肌线粒体膜色谱的强结合保留成分，作为抗心衰中药质量标志物。

2.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤201中所述一次离心的条件为：740g离心力下离心5min，并重复一次，所述二次离心的条件为：9000g离心力下离心10min，所述三次离心的条件为：10000g离心力下离心10min，并重复一次。

3.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤202中所述一次离心的条件为：95000g离心力下离心30min；所述二次离心和三次离心的条件均为：6300g离心力下离心10min。

4.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤302所述破碎采用超声法，超声功率为400W，且每次超声2s停止20s，共进行7次；所述离心的条件为：12000g离心力下离心20min。

5.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤五中所述标准液中靶向线粒体膜的阳性药为双氯酚酸和鱼藤酮，靶向线粒体膜的阴性药为卡托普利和硝苯地平。

6.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤五和步骤六中所述分析的过程均为：将标准液或抗心衰中药提取液通入第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱中，采用的流动相为10mM醋酸铵溶液，流速为0.2mL·min^-1，流出液通过切换阀在2个500μL定量环中分别进行收集，通过切换分别进入第二维色谱柱C18色谱柱进行梯度洗脱，采用的流动相为溶剂A体积含量0.1％甲酸水溶液与溶剂B乙腈的混合溶液，流速为0.2mL·min^-1，梯度洗脱的第0～8min，流动相中溶剂B的体积含量由10％上升至60％，第8min～10min，流动相中溶剂B的体积含量保持为60％，第10min～10.01min，流动相中溶剂B的体积含量由60％下降至10％，第10.01min～13min，流动相中溶剂B的体积含量保持为10％；所述抗心衰中药提取液过第二维色谱柱C18色谱柱后的分流比为1：1，并以0.4mL·min^-1进入质谱检测器。

7.一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，以四逆汤为抗心衰中药，采用权利要求1～6任一权利要求所述的方法制备得到。

8.根据权利要求7所述的一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，所述四逆汤由附子、干姜、甘草按照3：2：3的质量比组成的原料提取得到。

9.根据权利要求7所述的一种四逆汤质量标志物群，其特征在于，所述心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值为22.5min，确定宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏、异苷草素、8-姜酚作为四逆汤的抗心衰中药质量标志物。

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