KR101816288B1

KR101816288B1 - 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스

Info

Publication number: KR101816288B1
Application number: KR1020170069036A
Authority: KR
Inventors: 김정아; 방글; 김영환
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2016-08-11
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2018-01-09
Also published as: WO2018030709A1

Abstract

본 발명은 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)를 이용하여 원심분리 단계 없이도 액체-액체층을 분리하기 위한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스에 관한 것이다.

Description

고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스{METHOD OF PRE-TREATING SAMPLE WITH SUPER ABSORBENT POLYMER AND DEVICE THEREFOR}

본 발명은 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)를 이용하여 원심분리 단계 없이 액체-액체층을 분리하기 위한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스에 관한 것이다.

시료의 전처리란 목적에 따라 기기적 측정을 하기 전에 시료를 적절한 방법을 통해 최적의 측정 조건을 만드는 과정으로서 분석의 오차에 미치는 가장 중요한 요인 중에 하나이다. 따라서 실험 목적과 물질 대상에 따라 분리 및 농축, 오염물질 제거를 통해 결과의 재현성과 정확성 높여야 할 뿐만 아니라 많은 시료를 효율적으로 분석하기 위해 전체 프로세스를 간소화해야 할 필요가 있다.

예로서, 지질은 생물 세포 막의 주요 성분으로서 다수의 생화학적 기능 및 세포 내 세포 신호, 분비, 에너지 저장과 같은 대사 과정에 관여한다. 또한, 지질은 생물학적 메커니즘에서 중요한 역할을 하고 당뇨병, 알츠하이머병, 동맥경화, 및 암과 같은 지질-관련 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이로 인해 생분석 화학 분야에서 지질에 대한 광범위하고 정량적인 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 시료의 분석에서 가장 중요한 이슈는 시료 처리 공정에 따른 시료의 손실에 있다. 이를 극복하기 위하여, 시료 준비 과정에 미세 칩 플랫폼을 적용하여 시료 전달 단계 및 손실 부피를 감소시키기 위한 방법이 개발되고 있다. 또한, 지질의 극성과 분자 백본 구조에 따른 다양한 종류의 지질은 높은 회수율로 모든 종류의 지질의 동시 분석을 복잡하게 만든다. 고도로 정교한 지질 분석 방법에도 불구하고, 성공적인 분석은 세포, 조직, 및 체액과 같은 생체 시료로부터의 복잡한 지질 혼합물의 효율적인 추출 및 분리 방법에 의해 결정된다. 전통적인 지질 추출 방법으로는 액체-액체 추출 (liquid-liquid extraction, LLE) 방법을 기반으로 하는 Folch method 또는 Bligh/ Dyer method 방법이 존재한다. 일반적으로, 상기 LLE 방법은 적은 양의 시료 분석에는 적합하지 않으며 분석에 오랜 시간이 걸리며 또한 낮은 회수율을 보인다. 특히, 혈장, 소변 또는 체액과 같은 지질-기반 시료의 분석시에는 수분의 제거가 전제조건이다.

한편, QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) 방법은 분산 고체상 추출법(d-SPE)에 기반을 둔 간편한 시료 전처리 기술로서 펜실베니아주 윈드모어(Wyndmoor)에 있는 미국 농림부(United States Department of Agriculture, USDA) 산하의 농업 연구 센터(Agricultural Research Center, ARC)에 의한 연구를 기반으로 한 추출방법과 정제(cleanup)방법을 의미한다. 다양한 샘플 매트릭스에서 살충제 잔류물을 추출하고, 분석 이전에 상기 추출물에 대한 일반적인 처리와 정제 단계의 수행에 있어서 효과적이며, 저렴한 방법을 모색하였다. QuEChERS의 개발 전 연구원들은 변경된 루케 추출방법(Modified Luke Extraction Method)을 이용하였으며, 상기 변경된 루케 추출방법은 매우 효과적이긴 하지만 비용이 높다는 문제가 있었다. 고체상 추출 정제 방법도 또한 효과적이지만, 복합한 매트릭스의 경우 연구자들은 다양한 개별적인 카트리지와 흡수제를 이용하여 여러 간섭을 제거하여야만 하였고 또한 비용이 비싸고 공정이 복잡하다는 문제가 있었다. QuEChERS 방법은 시료 추출방법에 구연산염 또는 아세트산과 같은 염과 버퍼를 첨가하여 액체-액체층의 분리를 유도하고, 황산마그네슘 (MgSO₄) 또는 2차 아민 (PSA, Primary secondary amine)을 이용해서 여분의 수분을 제거할 수 있다. 또한 잔여 이물질 등을 제거하기 위해 카본화합물이나 실리카 등을 흡착제로서 이용하기도 한다. 현재 시료 전처리 기술로서 QuEChERS 방법은 식품 중 잔류농약 성분의 추출을 위해 아미노산 및 당, 지질 성분을 제거하기 이용되는 방법으로 고안되었으나 역으로 이들 성분을 추출하는 방법으로 변형되어 이용되고 있다. 최근에는 변형된 QuEChERS 방법을 이용하여 지질을(Bang, et al., J. chromatography A, 2014) 추출한 시료 전처리 방법이 도입된 예가 있다. 이렇듯 QuEChERS는 간편하고 손쉬운 전처리 방법이나 수분을 완벽히 제거해야 하는 전처리 법(예를 들면, 지질추출법)에는 효율적이지 않은 문제가 있다. 또한, 시료의 양이 적은 경우 분리 효율의 한계가 있으며, 고체 흡수제와 시료와의 반응을 위한 교반이 요구되고, 액체-액체층의 분리를 위해 원심분리가 필수적으로 따르는 듯 번거로운 작업이 여전히 요구되며, 자동화하기 어려운 문제가 있다. 따라서 보다 효율적이고 빠른 시간 내에 적은 양의 시료를 정확히 분리할 수 있는 기술과 분리과정이 단순화된 디바이스에 대한 필요성이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 최근 사용되고 있는 QuEChERS법의 복잡한 절차를 개선하고 분리 효율을 증대시키기 위하여 연구하던 중, 고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)를 이용하는 경우 빠른 시간 내 수용액 성분이 고체상에 흡수되어 유기용매 상과의 분리가 손쉽게 이루어져 수용액상의 염 및 버퍼 제거가 용이하며, 유기용매상의 시료 추출이 가능해져 매우 적은 양의 시료도 분리 가능하고 또한 원심분리 단계 없이도 액체 층간의 분리가 용이함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)"는 자체 무게의 최대 5백 내지 1천 배 정도의 수분을 흡수할 수 있는 기능을 가진 합성 고분자 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "시료(sample)"는 분석물을 포함하는 분석대상 화합물 또는 조성물을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 수용액상 또는 수용액을 포함한 유사한 유동성 있는 물질이다. 상기 시료는 생물학적 시료로, 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수 등의 생체 유래 체성분을 포함하며, 그 밖에 조직, 세포 및 미생물로부터 추출된 액체를 포함하는 유동성 있는 물질을 의미한다.

본 발명에 따른 고흡수성 수지를 이용하여 지질을 추출하는 원리를 도 1에 나타내었다. 지질이 함유된 수용성 시료를 고흡수성 수지가 흡수하면 겔화가 일어나게 되면서 용액이 포획되고, 이때 유기용매를 첨가하게 되면 유기용매 층으로 지질이 지질이 용해될 수 있다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)를 이용한 시료의 전처리 방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은:

(A) 수용성 시료를 고흡수성 수지에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계;

(B) 상기 고흡수성 수지에 유기용매를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질과 소수성 물질이 수용액 층과 유기용매 층으로 각각 분리 용해되고 액체층이 상분리되는 단계; 및

(C) 상기 고흡수성 수지를 포함하는 수용액층으로부터 유기용매층을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 시료의 전처리 방법에 있어서, 상기 단계 (C)는 원심분리 없이도 유기용매층과 수용액층이 분리되는 것을 특징으로 한다.

일 예로서 혈장(plasma)으로부터 지질을 추출하는 경우, 본 발명에 따른 시료의 전처리 방법과 종래 QuEChERS 방법을 이용한 지질추출법과 비교하면, 본 발명에 따른 전처리 방법의 경우 QuEChERS 방법에 비해 원심분리단계를 포함하고 있지 않으면서도 단순하고 간단하면서도 시료를 더욱 효과적으로 분리할 수 있다 (도 2).

제2구현예에 따르면,

본 발명은 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법을 위한 디바이스를 제공하고자 하는 것으로, 상기 디바이스는 고흡수성 수지를 포함하여 수용성 시료를 고흡수성 시료와 반응시키기 위한 챔버부를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 디바이스에 있어서, 상기 디바이스는 상기 챔버부에 연결되어 수용성 시료 및 유기용매를 주입하기 위한 시료 주입구를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 상기 수용성 시료 또는 유기용매는 상기 챔버부에 직접 주입될 수 있다.

본 발명에 따른 디바이스에 있어서, 상기 디바이스는 상기 챔버부에 연결되어 상기 챔버부로부터 분리된 유기용매 혹은 추출물을 배출하기 위한 출구부를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 상기 분리된 유기용매와 수용액 추출물은 상기 챔버부로부터 직접 배출될 수 있다.

본 발명에 따른 디바이스에 있어서, 상기 디바이스는 컬럼, 키트 또는 마이크로칩일 수 있다. 상기 본 발명에 따른 마이크로칩의 일 예시적인 구현예를 도 3에 나타내었다. 본 발명에 따른 마이크로칩(100)은 고흡수성 수지를 포함하여 수용성 시료를 전처리하기 위한 챔버부(101)을 포함하고, 상기 수용성 시료는 챔버부에 연결된 시료 주입부(102)을 통해 주입되거나 상기 챔버부(101)에 직접 주입될 수 있다. 또한, 상기 챔버부로부터 분리된 유기용매는 출구부(103)으로 배출되거나 상기 챔버부(101)로부터 직접 배출될 수 있다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법을 위한 미세유체 칩을 제공하고자 하는 것으로,

상기 미세유체 칩은 레이어 바이 레이어(layer-by layer) 형태로 구성된 내부 웰 및 외부 웰을 포함하고, 상기 내부 웰 및 외부 웰 사이의 하단부는 하나 또는 그 이상의 틈을 포함하는 기둥(pillar) 구조를 가지고,

상기 내부 웰에 고흡수성 수지, 수용성 시료 및 유기용매를 첨가하는 경우, 수용성 시료 내 수용성 물질과 소수성 물질이 각각 수용액 층과 유기용매 층으로 분리되어, 상기 유기용매 층으로 분리된 소수성 물질이 내부 웰로부터 하단부의 기둥 구조 내의 틈을 통과하여 외부 웰에 모이게 되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 미세유체 칩의 모식도 및 추출 과정을 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.

본 발명에 따른 미세유체 칩에 있어서, 상기 미세유체칩은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 재질 및, 유리, 메탈 등으로 구현할 수 있다.

본 발명에 따른 미세유체 칩에 있어서, 상기 내부 웰 및 외부 웰은 하나 이상의 복수 열 및 하나 이상의 복수 행으로 배열될 수 있다. 본 발명에 따른 미세유체 칩의 일 예시적인 구현예를 도 6에 나타내었다.

본 발명의 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법에 따르면 고흡수성 수지를 이용하여 Folch 방법 및 QuEChERS 방법에 비해 빠른 시간 동안 적은 양의 시료 분리 가능하고, 또한 원심분리 절차 없이도 유기용매층과 수용액층의 분리가 가능한 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 원심분리 단계가 요구되지 않음으로써 키트 등의 생산에 바로 적용가능하며 또한 마이크로칩 형태에 적용 가능하다는 장점이 있다. 또한 질환 진단에 필요한 체액내 질환 관련 바이오마커들을 추출 및 농축할 수 있는 시료 전처리 진단 키트 개발 등의 의생물 및 화학분야의 산업적 이용 가능성이 매우 높다.

도 1은 본 발명에 따른 고흡수성 수지를 이용하여 지질을 추출하는 원리를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 시료의 전처리 방법과 QeuChERS 방법을 비교한 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 시료의 전처리 방법을 위한 디바이스의 일 예시적인 구현예를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 미세유체 칩의 모식도를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 미세유체 칩을 이용한 지질의 추출 과정을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 미세유체 칩의 일 예시적인 구현예를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 미세유체 칩의 기둥간 간격 및 내부 웰과 외부 웰 간의 간격에 따른 추출 효율을 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 추출 방법에서 유기용매와 SAP에 도입된 지질과의 인큐베이션 시간에 따른, (a) 또는 유기 용매의 반복적인 첨가 횟수 (b)에 따른 지질의 추출 효율을 나타낸다.
도 9는 유기용매의 종류에 따른 본 발명에 따른 방법의 추출 효율을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 효율과 Folch 방법의 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸다 (SAP 10: SAP + 시료량 10 ul, SAP 100: SAP + 시료량 100 ul).
도 11은 생물학적 시료를 이용한 본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 효율과 Folch 방법의 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸다(a: 혈장, b: 뇌, c: 간, 및 d: E.coli).
도 12는 시료 전처리를 위한 본 발명의 방법과 QuEChERS 방법의 추출 단계 과정을 비교한 결과를 나타낸다.
도 13는 본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 효율과 QuEChERS 방법의 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 마이크로 칩의 제조

PDMS 복제를 위한 Si 마스터 몰드는 표준 소프트 리소그래피 공정을 이용하여 제조하였다. 우선, SU-8 포토레지스트 (Microchem Corp., USA)를 100 μm의 두께로 Si 와이퍼에 스핀-코팅하였다. 중심 홀 (직경 6 mm, 깊이 6 mm)을 둘러싸는 원형 기둥(pullar)은 액체가 내부 저장소와 외부 저장소 사이의 빈 공간을 통해 흘러나올 수 있도록 설계하였다. 내부 저장소를 둘러싸는 원형 기동 (100 μm 높이)는 기둥 사이의 3개의 다른 거리 (100, 200 및 300 μm)를 갖도록 설계하였다. Sylgard 184 엘라스토머 (PDMS, Dow Corning, USA)를 약 3-6 mm의 두께로 Si 마스터에 쏟고 열경화 이후에 벗겨내었다. 2개의 다른 직경 (6 mm 및 15 mm)을 갖는 펀치를 이용하여 내부 저장소와 외부 저장소를 생성하였다. PDMS 층을 하단에 본딩하였다 (6 mm × 70 mm). 따라서, 조립된 마이크로 칩은 2개의 저장소로 이루어지게 되었고, 전체 크기는 20 mm × 30 mm이 되었다. 고속 지질 추출을 위하여, 다수의-웰 플레이트-기반 지질 추출 플랫폼을 생성하였다. 복수개의 추출 칩을 위해서 단일의 내부 저장소를 웰 플레이트의 글라스 하단에 부착하여 어레이 형태로 제작 가능하다.

실시예 2. 칩-기반 고체상 추출

SAP 분말은 LG Chemicals, lnc으로부터 구입하였다. SEM을 이용하여 SAP 입자의 크기를 관찰하기 위하여 SEM 분말을 분석하였다. 지질 추출물 및 표준 지질 혼합물을 메탄올 및 클로로포름과 같은 유기용매에 용해시킨 후 최종적으로 물에 희석하였다. 표준 지질 혼합물은 Avanti Polar Lipids, Inc.로부터 구매하였다. 이때 농도는 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.

	Mixture Components	Target Conc. (μg/ml)	Mass
Phospholipid	15:0-18:1(d7) PC	160	753.093
	15:0-18:1(d7) PE	5	711.013
	15:0-18:1(d7) PS	5	777.004
	15:0-18:1(d7) PG	30	764.006
	15:0-18:1(d7) PI	10	847.116
	15:0-18:1(d7) PA	7	689.927
	18:1(d7) LPC	25	528.710
	18:1(d7) LPE	5	486.631
Sterol	18:1(d7) Chol Ester	350	658.143
Miscellaneous	18:1(d7) MG	2	363.583
	15:0-18:1(d7) DG	10	587.965
	15:0-18:1(d7)-15:0 TG	55	812.347
Sphingolipid	18:1(d9) SM	30	738.121
Sterol	Cholesterol (d7)	100	393.697

생물학적 시료의 경우, 혈장 (100 μl)을 전처리 없이 바로 사용하였다. 뇌 추출물 및 E. coli 추출물은 (2:1) MTBE: MeOH 혼합물을 이용하여 5 mg/ml로 농축시키고, D.W로 재희석하여 최종 농도가 1 mg/ml이 되도록 하였다. SAP를 시료 부피에 비례하여, 5-15 mg의 양으로 내부 웰에 로딩하였다. 그 다음, 지질 시료를 SAP에 떨어트리고 약 10분 동안 방치하여 겔화를 완료하였다. 유기용매 (2:1 (v/v) MTBE:MeOH, 클로로포름, 아세토니트릴, 및 메탄올)를 상기 겔이 추가하였다. 지질을 가용화시키고 SAP 겔로부터 추출하여 최종적으로 용매에 용해시켰다. 지질을 함유하는 용매를 내부 웰을 둘러싸는 기둥의 틈을 통해 외부 웰 흘러나와 모이고, 지질 추출물을 외부 웰로 수거하고 최종적으로 피펫 팁으로 취하였다. 추출된 지질을 QIT-TOF MS 분석 및 LC/MS 분석을 수행하였다.

실시예 3. 변형 Folch 방법을 이용한 액체 추출

비교예로서, 변형 Folch 방법을 이용하여 표준 혼합물, 혈장 및 조직 추출물로부터 지질의 추출을 수행하였다. Foch 추출을 위하여, 혈장에 300 μL의 CH₃OH 및 600 μL의 MTBE를 연속적으로 첨가하였다. 1 시간 동안 볼텍싱 이후에, 180 μL의 MS-급 물을 상 분리를 위해 추가한 후 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리를 수행하였다. 상부 유기상을 수거하여 질소 가스로 건조시켰다. 추출된 지질을 Q/TOF MS 분석 전에 4 ℃에서 저장하기 위하여 100 μL의 CHCl₃:CH₃OH (1:1, v/v)에서 용해시켰다.

실시예 4. 형광 마이크로스코프를 이용한 액체 추출물의 시각화

마이크로-장치에서 액체 추출물의 프로세스를 시각화하기 위하여, 2개의 다른 형광 지질 아날로그를 이용하였다. BODIPY FL (Ex/Em: 503/512)이 레이블된 포스파티딜콜린 및 BODIY TR (Ex/Em: 589/617)가 레이블된 세라마이드를 Molecular Probes (USA)로부터 구입하였다. 형광 아날로그 지질을 1 mg/ml의 농도를 갖는 스톡으로서 DMSO에 용해시키고, 물로 0.05 mg/ml가 되도록 희석하였다. 20 μl의 지질 아날로그 시료에 대하여 5 mg의 SAP를 사용하고 80 μl의 용매 (2:1 MTBE: MeOH)를 첨가하였다. 용매는 실온에서 30초부터 5분 까지 시간을 달리하여 혼합하였다. 액체 추출물을 팁으로 취하고 형광 리더 (Beckman Coulter, DTX880, USA)로 분석하였으며, 3회까지 다양하게 반복하였다. 또한, 형광 지질 아날로그의 전체 추출 과정을 2x 배율을 갖는 형광 마이크로스코프 (Olympus, IX81, JAPAN)로 모니터링하였다. 지질 추출 효율 및 회수율을 추출 전 대조 시료와 비교하여 얻었다.

실시예 5. 미세유체의 시뮬레이션

내부 웰로부터 외부 웰로의 용매 시료의 유속을 최적화하기 위하여, 50 μl 용매가 내부 웰에 첨가된 이후에 유기용매가 내부 웰로부터 외부 웰로 완전히 흐를 때까지 요구되는 시간을 측정하였다. 기둥 틈의 크기 (100, 200, 300 μm) 및 기둥 층의 수 (1-3 times)에 따른 유속을 모니터링 하였다. 또한, 내부 웰과 외부 웰 사이의 틈 크기 (1mm, 2.5 mm)에 따른 유속을 모니터링 하였다.

실시예 6. UPLC /Q- TOF MS 분석

유기용매의 종류에 따른 지질의 회수율을 기존 Folch 방법과 비교하여 평가하고, SAP의 양과 시료 부피에 따른 지질의 회수율을 평가하기 위하여 LC-MS 분석을 사용하였다. 지질 표준의 분석은 MassLynx 4.1 소프트웨어로 작동되고 AQUITY UPLC™ 시스템과 결합된 Waters Synapt G2-HDMS mass spectrometer (MA, USA)를 이용하여 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 각각 0.1% 포름산 및 10 mM 암모늄 포르메이트를 갖는 아세토니트릴/물 (60:40 v/v) 및 2-프로판올/아세토니트릴 (90:10 v/v)로 이루어진 이동상 A 및 B를 이용하여 CSH C18 AQUITY UPLC™ column (1.7 μm, 2.1 mm × 100 mm; Waters, MA, USA)에서 수행하였다. 유속 및 주입량은 각각 0.4 mL min - 1 및 3 μL으로 하였다. 선형 기울기 시스템을 40% 이동상 B에서 수행하고 18분 동안 90% 이동상 B로 증가시키고, 40% 이동상 B로 감소시킨 후 2분 동안 등용매로 하였다. 전체 수행시간 크로마토그래피 분리는 20분 이었다. ESI 소스의 양- 및 음-이온 모드에서 MS 및 MS/MS 스펙트라를 얻었다. SAP 및 Folch 방법 사이의 전체 각 지질의 정량 값은 두 이온화 모드에서 내부 표준의 추출된 이온 크로마토그램 (XIC) 피트 영역의 비를 바탕으로 비교하였다. 지질 추출 프로파일링 분석은 양 이온 모드에서 Synapt G2-HDMS mass spectrometer (Waters, Manchester, UK)를 사용하여 수행하였다. 시료를 실린저 펌프를 이용하여 매스 스텍트로미터의 전기방사 소스로 불어넣었다.

실시예 7. MALDI -MS 분석

유기용매 하의 지질 추출에 미치는 SAP의 효과를 연구하기 위하여, 5 mg의 SAP를 5분 동안 4개의 다른 용매 (200 μl)에서 인큐베이트하였다. 내부 대조군으로서, PC를 약 30 fmol 시료에 넣고, 1 μl SAP와 반응된 유기용매를 타겟 플레이트에 떨어트려 매트릭스로서 CHCA와 혼합하였다. CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)FMF 0.5% TFA를 함유하는 10mg/mL 농도에서 50:50 (v/v) 아세토니트릴/물에 용해시켰다. SmartBeam II laser가 설치된 MALDI-MS instrument UltrafleXtreme (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 이용하여 질량 스펙트로미터를 수행하였다.

< 실험예 >

실험예 1. 미세유체 칩의 구조에 따른 추출 효율 비교

상기 실시예 1에서 제조된 미세유체 칩의 기둥간 간격 및 내부 웰과 외부 웰 간의 간격에 따른 추출 효율을 비교하고 이를 도 7에 나타내었다. 그 결과, 기둥간 간격이 작을수록, 기둥 겹 수가 늘어날수록 유기용매가 흘러나오는 시간이 오래 걸림이 확인되었다. 또한, 내부 웰과 외부 웰의 간격이 좁으면 유기용매가 흘러나오는 시간이 빨라지는 것으로 확인되었다. 이는 기둥의 구조를 달리하여 유기용매의 추출 시간이 조절될 수 있음을 나타낸다.

실험예 2. 유기용매에 따른 추출 효율 비교

유기용매의 첨가 횟수에 따른 지질의 추출 효율을 비교하고 이를 도 8에 나타내었다. 그 결과, 유기용매를 반복적으로 첨가하는 경우 지질의 추출 효율이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 유기용매의 종류에 따른 지질의 추출 효율을 비교하고 이를 도 9에 나타내었다. 그 결과, MTBE/MeOH(2:1), CHCl₂/MEOH(2:1), 아세토니트릴, 및 MeOH 중에서도 MTBE/MeOH에서 지질의 추출 효율이 가장 우수한 것으로 확인되었다

실험예 3. Folch 방법과의 비교

본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 효율과 Folch 방법의 추출 효율을 비교하고 이를 도 10에 나타내었다. 그 결과, 본 발명에 따른 지질의 추출 효율은 효율은 기존 지질 추출법인 Folch에 비해 우수한 것으로 나타났다. 특히 그 중에서도 PS의 경우 Folch에 비해 약 9배 이상 추출 효율이 증가함이 확인되었다.

또한, 생물 시료로서 혈액 내 혈장, 미생물, 동물세포 조직 추출물 등을 이용한 경우, 본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 효율을 Folch method의 추출 효율과 비교하고 이를 도 11에 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 방법에 따른 지질의 추출은 Folch 방법과 유사패턴을 나타내었으며, 특히 (a) 플라즈마 시료에서 TAG 계통의 지질 추출은 더 우수한 모습을 보이는 것으로 확인되었다.

실험예 4. QuEChERS 방법과의 비교

본 발명의 방법에 따른 지질의 추출 과정과 효율을 QuEChERS 방법과 비교하고 이를 도 12 및 13에 나타내었다. 그 결과, 기존 방법은 QuEChERS는 시료 첨가시 흡수제로 쓰이는 MgSO₄의 양이 많은 반면 수용액이 흡수가 완벽하지 않고, 고체상 시료의 엉김이 매우 심하고 불균일하게 일어남을 알 수 있다. 따라서 원심분리 후에도 유기용매층과 수용액 층의 분리가 이루어지지 않아 상층액의 수거가 매우 어렵기 때문에 시료의 손실이 심하며 이로 인한 추출의 효율의 감소뿐만 아니라 재현성이 악화된다. 반면, 본 발명에 의한 방법은 SAP에 흡수되는 수용액층과 유기용매층과의 분리가 깔끔하게 이루어지고, 원심분리 단계 없이도 층분리가 이루어지기 때문에 유기용매 층의 수거가 매우 간편하게 이루어진다. 따라서 도 13에서와 같이 기존 방법에 비해 추출의 효율이 매우 높음을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 SAP 방법은 종래 변형된 QuEChERS 방법에 의한 지질추출법에 비해 원심분리절차 없이 간단하면서도 혈장으로부터 지질의 추출 효율이 더욱 우수함을 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)를 이용한 시료의 전처리 방법으로, 상기 방법은:
(A) 수용성 시료를 고흡수성 수지에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계;
(B) 상기 고흡수성 수지에 유기용매를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질과 소수성 물질이 수용액 층과 유기용매 층으로 각각 분리 용해되고 액체층이 상분리되는 단계; 및
(C) 상기 고흡수성 수지를 포함하는 수용액층으로부터 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (C)는 원심분리 없이도 유기용매층과 수용액층이 분리되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수, 조직, 세포 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
고흡수성 수지를 포함하는 챔버부; 및
상기 챔버부에 연결되어 상기 챔버부로부터 분리된 유기용매 또는 추출물을 배출하기 위한 출구부를 포함하고,
상기 챔버부에 수용성 시료 및 유기용매를 주입하는 경우, 수용성 시료 내 수용성 물질과 소수성 물질이 각각 수용액 층과 유기용매 층으로 분리되어, 상기 유기용매 층으로 분리된 소수성 물질이 상기 출구부로 배출되는 것인, 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 디바이스.
제4항에 있어서,
상기 디바이스는 상기 챔버부에 연결되어 수용성 시료 및 유기용매를 주입하기 위한 시료 주입구를 더욱 포함하는 것인, 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 디바이스,
제4항에 있어서,
상기 수용성 시료 또는 유기용매는 상기 챔버부에 직접 주입되는 것인, 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 디바이스.
제4항에 있어서,
상기 디바이스는 컬럼, 키트 또는 마이크로칩인 것인, 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리를 위한 디바이스.
고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법을 위한 미세유체 칩으로,
상기 미세유체 칩은 레이어 바이 레이어(layer-by layer) 형태로 구성된 내부 웰 및 외부 웰을 포함하고, 상기 내부 웰 및 외부 웰 사이의 하단부는 하나 또는 그 이상의 틈을 포함하는 기둥(pillar) 구조를 가지고,
상기 내부 웰에 고흡수성 수지, 수용성 시료 및 유기용매를 첨가하는 경우, 수용성 시료 내 수용성 물질과 소수성 물질이 각각 수용액 층과 유기용매 층으로 분리되어, 상기 유기용매 층으로 분리된 소수성 물질이 내부 웰로부터 하단부의 기둥 구조 내의 틈을 통과하여 외부 웰에 모이게 되는 것인, 미세유체 칩.
제8항에 있어서,
상기 미세유체칩은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 재질, 유리 또는 메탈로 제조되는 것인, 미세유체 칩.
제8항에 있어서,
상기 내부 웰 및 외부 웰은 하나 이상의 복수 열 및 하나 이상의 복수 행으로 배열되는 것인, 미세유체 칩.