WO2010025859A2 - Stabilisierung von zellen durch ionische flüssigkeiten - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the use of ionic liquids and / or compatible solutes for storage and stabilization of eukaryotic cells, especially blood cells such as leukocytes, platelets or erythrocytes.
  • the invention further relates to compositions comprising eukaryotic cells and ionic liquids and / or compatible solutes, medical devices containing ionic liquids and / or compatible solutes, and a method of storing eukaryotic cells in these fluids.
  • the cells may be contained in cell aggregates (cell mixtures, tissues, organs, organisms).
  • Blood is a special, fluid tissue that, with the support of the cardiovascular system, ensures the functionality of the remaining body tissues through a variety of transport and linking functions.
  • the vascular system of the adult human body contains about 70 to 80 mL of blood per kg of body weight, which corresponds to about 5 to 6 L of blood.
  • Blood consists of cellular components (about 44%) and plasma (about 55%), an aqueous solution (90% water) of proteins, salts and low-molecular substances such.
  • B monosaccharides.
  • the cells contained in the blood are divided into erythrocytes (red blood cells), leukocytes (white blood cells, eg granulocytes) and platelets or platelets.
  • the erythrocytes make up about 43% of the total blood volume. They carry out in the organism the vital task of gas transport by (1) transporting the oxygen from the lungs to the organs and cells of the body and (2) a portion of the carbon dioxide from the organs and body cells back to the lungs. Erythrocytes are characterized by their characteristic biconcave disc shape, which causes a significant increase in surface area and also contributes to the enormous deformability of the cells. The diameter of a red blood cell in humans is about 7.5 ⁇ m at a thickness of 2 ⁇ m. Erythrocytes consist of 90% of the dry matter of the oxygen-binding protein hemoglobin.
  • the heme fraction of this protein imparts the red color to the erythrocytes and thus also to the blood ( Figure 1).
  • the oxygen transport with the help of hemo- globin is an energy independent process.
  • erythropoiesis lose until maturation both the nucleus and the ribosomes and mitochondria. They are therefore not capable of DNA replication or de novo protein biosynthesis, nor of energy generation by means of the enzymes of the respiratory chain, the oxidative phosphorylation, the Citratzyklus or beta oxidation dation. Since the erythrocytes no longer have mitochondria, energy is produced by anaerobic glycolysis.
  • the metabolic activity of the erythrocyte corresponds to a specialized maintenance metabolism in which glucose is the obligate substrate.
  • the objectives of this maintenance metabolism are maintaining cell structure, providing functional hemoglobin, synthesizing glutathione and the energy source adenosine triphosphate (ATP), and maintaining existing concentration differences of sodium and potassium ions between intracellular and extracellular space.
  • ATP energy source adenosine triphosphate
  • For the affinity of oxygen to hemoglobin, the content of 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG) is significant (“respiratory motility”), which affects it inversely proportional to its intra-erythrocytic concentration.
  • 2,3-DPG binds to deoxyhemoglobin, it stabilizes it in a state of low oxygen affinity.
  • 2,3-DPG provides both an energy and a a phosphate reserve, which can be mobilized with increased energy demand.
  • blood transfusion refers to the transfer of blood or blood components from the donor (donor) to the recipient (recipient).
  • the discovery of blood circulation by W. Havery (1578-1657) in 1628 was the physiological basis for initial considerations and experimental attempts at blood transmission and is considered to be the beginning of the development of transfusion medicine (Greenwalt, 1997, Ryser, 2000). Since in the past especially whole-blooded canned foods were used, the focus today is on targeted therapy with individual blood components in the form of blood cell and plasma preparations. These are mainly the erythrocyte concentrate (EC), the platelet concentrate (TK, PLT), the granulocyte concentrate (GK), stem cell concentrates (SK), eg from peripheral stem cell donations, but also from bone marrow donations and fresh frozen plasma (FFP).
  • EC erythrocyte concentrate
  • TK platelet concentrate
  • GK granulocyte concentrate
  • SK stem cell concentrates
  • Acute volume depletion and blood loss are treated either with volume expanders or with stored erythrocyte concentrates.
  • the volume expander eg Ringer's solution, HAES (hydroxyethyl starch, also HES, in different chain length, degree of crosslinking and concentration, eg HES 200 / 0.5 6%
  • HAES hydroxyethyl starch, also HES, in different chain length, degree of crosslinking and concentration, eg HES 200 / 0.5 6%
  • blood cells eg granulocyte concentrates
  • the use of stored RBC concentrates is a standardized and routinely performed procedure for erythrocyte substitution in case of blood loss , which was largely freed from blood plasma and buffy coat (leukocytes and platelets) Erythrocytes transfused.
  • the main field of application of the erythrocyte concentrates is on the one hand the therapy of anemias and on the other hand - in combination with the plasma substitute - the therapy of the acute blood loss
  • the erythrocyte lifespan is 100-120 days, under preservation conditions, depending on storage, until transfusion 32-49 days. It depends in particular on the pH, the temperature and the available glucose.
  • the storage damage of the erythrocyte concerns several points: As part of a morphological change in shape, spherocytes, datura forms and microvesicles are formed, which is accompanied overall by reduced deformability or increased rigidity. It comes to functional impairments, which are reflected in a left shift of the oxygen dissociation curve and in a reduced osmotic resistance of the red blood cells. The possible formation of microaggregates after transfusion results in an increased risk of microemboli formation. In addition, the storage damage leads to the release intra-erythrocytic substances such as potassium, lactate dehydrogenase and hemoglobin.
  • Preserved blood contains certain preservative solutions besides blood.
  • stabilizers serve on the one hand the anticoagulation, on the other hand, the maintenance of cell metabolism.
  • the purpose of the additive solutions is to additionally stabilize the cell metabolism and thereby to improve the survival rate and the survival time of the erythrocytes.
  • An important criterion for the preservation success is the survival rate of the erythrocytes in the recipient organism, measured 24 hours after the transfusion. It should be at least 75%.
  • the proportion of extracellular hemoglobin to total hemoglobin up as "indicator" of hemolysis another important criterion 'and should not be more than 1% at the end of the storage period.
  • the composition of the stabilizer solution is in principle chosen so that it prevents coagulation with the aid of citrate ions, the addition of dextrose, the cell metabolism of the erythrocytes. maintained by adding adenine to the intracellular adenosine phosphoric acid pool.
  • ACD Acid.citr. Citrate Dextrose
  • CPD Citrate-phosphate-dextrose
  • the ACD stabilizer In its original composition, it represents a further development of the ACD stabilizer and, in addition to citric acid, citrate and dextrose, also contains phosphate, which ensures the intracellular preservation of organic phosphate compounds and better buffering ratios within the stabilizer. Due to the latter, there is an increase in the pH of the stabilizer itself to 5.6-5.8. After mixing with blood, the preserved blood has a pH of about 7.2. This more alkaline pH compared to the ACD stabilizer results in a slower decrease of the 2, 3-DPG concentration. Even at the end of the preservation period, there is still enough glucose. The average 24-hour survival rate is 72% after three weeks of storage.
  • the CPD stabilizer forms the CPD-A (denin) stabilizer. The addition of adenine results in an extension of the preservation time.
  • These protein-free preservation solutions contain the substances necessary for the erythrocyte preservation, which lead to the maintenance of the energy balance and the membrane stability of the erythrocytes during storage. A longer one Availability of the erythrocyte concentrates is made possible.
  • the additive solution is subsequently added to the erythrocytes, ie after removal of the plasma, as part of a resuspension.
  • SAG-M, PAGGS-S and PAGGS-M are mostly used in Germany.
  • SAG-M consists of adenine, glucose and mannitol. The addition of mannitol leads due to osmotically stabilizing properties to a lower spontaneous hemolysis rate during the storage time.
  • PAGGS phosphate adenine-glucose-guanosine sorbitol
  • SAG-M annit
  • both the cellular ATP and the adenylate pool are better preserved, which is important for the survival of erythrocytes after transfusion. This is partly due to the additional guanosine in addition to adenine in this additive solution, which extends the nucleotide pool in the form of guanosine triphosphate (GTP).
  • GTP guanosine triphosphate
  • the erythrocyte life under preservation conditions is still below the life expectancy expected in vivo and thus represents the limiting factor for the preservability of the preserved foods.
  • the situation is similar for platelet concentrates and granulocyte concentrates. While erythrocytes in anemia and thrombocytes in thrombocytopenia are given with the risk of bleeding, the use of granulocyte donations is the granulocyte deficiency (in extreme cases, agranulocytosis) for the treatment of neutropenic infections.
  • the introduction of high-cell-count steroid or G-CSF-induced granulocyte concentrates has improved the clinical results of granulocyte transfusion.
  • red blood cell concentrates The shelf life of red blood cell concentrates is limited to up to 49 days, depending on the preservation solution. However, numerous blood reserves are needed in Germany every day. Erythrocyte concentrates are an important emergency medication after accidents and acute illnesses for which there is still no adequate replacement ("artificial blood”). Short-term influences always lead to a shortage of red blood cell concentrates. Examples of such factors include (1) a flu epidemic, since only healthy people are allowed to donate, (2) vacation time, as many "parent donors" are abroad, (3) randomly coincidental major accidents, and high blood demand operations; (4) the trend towards long-distance travel, as people who have stayed in tropical areas are not allowed to donate for a long time. Due to the limited availability of erythrocyte concentrates, by further increasing the stability of erythrocytes and thus prolonging the storage time could make a great contribution to securing a adequate care of patients in need of transfusion.
  • eukaryotic cells e.g. Granulocyte concentrates, platelet concentrates or other cells of blood, cell lines, e.g. used in research, or of sample material, e.g. Biopsies or bone marrow donations, is still in need of improvement.
  • eukaryotic cells e.g. Granulocyte concentrates, platelet concentrates or other cells of blood, cell lines, e.g. used in research, or of sample material, e.g. Biopsies or bone marrow donations
  • the skilled person has the problem of providing an alternative possibility for the storage of eukaryotic cells, in particular of erythrocytes, platelets or granulocytes.
  • ionic liquids can be used for the storage and stabilization of cells, in particular eukaryotic cells.
  • Ionic liquids are ion pairs with melting points below 100 0 C. In recent years they have increasingly established itself as a novel solvents for a variety of reactions because they variable dissolution properties with a barely detectable vapor pressure and excellent thermal and chemical stabilities, and by a suitable choice of cations and anions, a gradual adjustment of the polarity and thus a matching of the solubility properties is possible, ranging from water-miscible ionic liquids via water-immiscible to those that form two phases even with organic solvents. Ionic liquids which can be used in the context of the present invention are described, for example, in the publications (BRANCO ET AL. (2002); CHEM. EUR. J. 8 No.
  • ionic liquids can be used for the stabilization of enzymes (Lozano et al., 2001, Fujita et al., 2005).
  • the possibility of whole-cell catalysis in the presence of ionic liquid has been studied to date by only a few research groups. Cuill et al.
  • BMIM PF 6 BMIM PF 6
  • aqueous buffer for biotransformation of 1, 3-dicyanobenzene to 3-cyanobenzamide by whole cells of Rhodococcus R312.
  • the ionic liquid showed less negative impact on the microbial cells than toluene, which is normally used as cosolvent.
  • Immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae have been described by Lou et al. (2006) in the presence of the ionic liquids BMIM PF 6 and BMIM BF4 for the asymmetric reduction of acetyltrimethylsilane to enantiorein (S) -1-trimethylsilylethanol. It could be shown that the ionic liquids greatly increased the activity and stability of the immobilized cells.
  • ionic liquids are used in the present invention, which had a melting point of below 37 0 C, in particular a melting point of below about 20 0 C, below about 10 0 C or below about 4 0 C, so that the liquids are about the desired Storage temperature are preferably liquid.
  • the cells are stored dry, with a dry "shell" of ILs, using an IL that For example, at 4 ° or 25 ° is fixed and liquid only at higher temperatures.
  • ionic liquids and their surprising properties to stabilize eukaryotic cells opens the possibility to store the erythrocyte concentrates or other cell concentrates even at higher temperatures without loss in the quality of the cells. It eliminates on the one hand the great expense and the high cost of maintaining the cold chain and on the other hand the need to dispose of red blood cell concentrates whose cold chain has been interrupted.
  • the cells are stored in a pure ionic liquid (100%) or in an ionic liquid containing further additives or stabilizers (eg those mentioned above) or in a liquid containing 1% - 99% ionic liquid, in particular 2% - 80%, 3% - 60%, 5% - 50%, 6% - 40%, 10% - 38%, 20% - 35% or 25% -30%.
  • % refers, unless otherwise stated, to percent by volume.
  • a non-water-miscible ionic liquid is used in combination with an aqueous solution, in particular an aqueous buffer.
  • the aqueous solution / buffer preferably comprises known additives or stabilizers; erythrocyte storage may be, for example, ACD, CPD or CPD-A solution, preferably in combination with SAG-M, PAGGS-S and PAGGS-M additives ,
  • erythrocyte storage may be, for example, ACD, CPD or CPD-A solution, preferably in combination with SAG-M, PAGGS-S and PAGGS-M additives .
  • a mixture with a classical cell culture medium can be used, eg RPMI or MEM, optionally with serum, eg human serum, horse serum or fetal calf serum.
  • serum content may be, for example, 1-15%, preferably 5-10%.
  • Non-water-miscible ionic liquids in the context of the invention are ionic liquids which have hydrophobic cations and / or anions (Weingärtner, 2008). Water-miscible ionic liquids can also be used.
  • compatible solutes can also be used for the storage of eukaryotic cells, in particular of erythrocytes.
  • Compatible solutes are small organic molecules that are synthesized by microbial organisms to protect against high salt and / or sugar levels in the extracellular environment. The presence of salt can negatively affect cells in two ways: on the one hand by a nonspecific osmotic effect, on the other hand by the specific toxicity of the ions to certain cellular structures such as proteins and membranes.
  • osmotic backpressure many microorganisms have the ability to form compatible solutes which have high water solubility, have no net charge at physiological pH, and generally have little or no effect on the metabolism of the cells.
  • the main compatible solutes in microorganisms and plants are polyols (glycerol, sorbitol and mannitol), non-reducing sugars such as sucrose and trehalose, amino acids (glutamate, proline and betaine) and the tetrahydropyrimidine derivatives ectoine and hydroxyectoine. They are not only compatible with the native states of proteins and membranes, but they Their structures also stabilize against dehydration, heat shock and denaturing reagents.
  • a storage liquid is used which comprises compatible solutes and ionic liquids. Liquids of about 1-99%, 2% -80%, 3% -60%, 5% -50%, 6% -40%, 10% -38%, 20% -35% or 25% can be used Include% -30% compatible solutes.
  • the eukaryotic cells stored in the context of the present invention may be e.g. Blood cells, especially erythrocytes, leukocytes (e.g., granulocytes or platelets), cells of a cell line, or cells in a cell composite (e.g., tissue, organ, or organism).
  • the cells may e.g. may be derived from a biopsy of a patient, or the biopsy may be stored as a tissue sample in the fluid. It can also be a tissue for transplantation. Preferably, it is mammalian cells, in particular human cells.
  • the cells can also be stem cells.
  • the eukaryotic cells are erythrocytes and / or granulocytes.
  • the invention preferably includes storage at temperatures up to about 37 ° C.
  • the cells in particular at room temperature, for example 15-15 0 C or 0 to 30 C. being preferred, at a temperature of about 0 ° C to about 37 ° C stored, also a refrigerated storage at 4 ° C, for example, is possible.
  • the cells can be stored at temperatures below 0 0 C, for example at -15 to -30 0 C, -65 to 0 -9O C or below -130 0 C.
  • cryoprotectants such as serum, HAES and / or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the cells in a storage at a Temperature of more than 4 0 C can be more stable than at 4 0 C. Therefore, the cells are preferably more than 4 0 C, more than 8 ° C, about 10 ° C-37 ° C or about 15 ° C-25 ° C, in particular stored at about 20 0 C to about 25 ° C (room temperature).
  • the ionic liquid is a non-water miscible ionic liquid such as EMIM PF 6 , BMIM PF 6 , HMIM PF 6 , HMIM BTA or Oc 3 NMe BTA.
  • EMIM PF 6 non-water miscible ionic liquid
  • BMIM PF 6 BMIM PF 6
  • HMIM PF 6 HMIM BTA
  • Oc 3 NMe BTA Oc 3 NMe BTA.
  • a mixture of several ionic liquids can also be used within the scope of the invention.
  • the ionic liquid (s) is biocompatible, ie it does not interfere with the vitality of the cells at the concentrations used or even be administered to a patient (preferably a human patient) without significant adverse effects, eg of a toxic nature.
  • Biocompatible ionic liquids may be, for example, N-butyl-N-methylpyrrolidinium dicyanamide, 1-butyl-3-methylimidazolium dighydophosphate, N-butyl-N-methylpyrrolidinium dihydrogenphosphate, choline dihydrogen phosphate or 1-isobutyl-3-methylimidazonium hexafluorophosphate ( Fujita et al., 2005; Shan et al., 2008).
  • biocompatible ionic liquids could be triethylsulfonium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide, 1-butyl-3-methylpyrrolidinium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide, 1-butyl-3-methylimidazolium dicyanamide, triisobutylmethylphosphonium tosylate, 1-ethyl 3-methyl-imidazolium trifluoro-methanesulfonate, N-butyl-N-trimethylammonium bis (trifluoromethyl-sulfonyl) imide, ethanol ammonium formate, ethyl ammonium nitrate, l-ethyl-3-methyl-imidazolium ethyl sulfate (www.iolitec.de ).
  • different ILs showed different stabilizing properties in experiments. The cause probably lies in the large differences between the eukaryotic cells in terms of composition and rigidity of
  • a part of the invention is thus also a test for determining the suitability of a liquid comprising ionic liquid or an ionic liquid for storage of a particular cell type, in which cells of this cell type are stored in the liquid and the vitality of the cells, their functionality or e.g. investigated the release of enzymes like LDH.
  • combinations of different ILs with each other and with compatible solutes of course also in admixture with another liquid, such as a cell culture medium (for example with serum) or an aqueous buffer, in an embodiment with conventional storage, e.g. used by erythrocytes stabilizers.
  • a cell culture medium for example with serum
  • a aqueous buffer in an embodiment with conventional storage, e.g. used by erythrocytes stabilizers.
  • the cells are still vital after storage in ionic liquids or liquids comprising them, and that this storage method stabilizes the cells.
  • water-miscible ionic liquids when used, their solubility-imparting effect can be exploited, for example to obtain hydrophobic substances / substrates / pharmaceuticals in higher concentrations and to bring into contact with the cells.
  • the invention also provides a composition comprising ionic liquids and eukaryotic cells and optionally compatible solutes.
  • This composition may be a medical device or a pharmaceutical composition.
  • the composition is e.g. suitable for transfusion or transplantation, if necessary after preparatory steps such as washing and taking up in a suitable buffer.
  • the ionic liquids are biocompatible, direct transfusion / transplantation is also possible.
  • the above-mentioned cells and ionic liquids or liquids which comprise a portion of an ionic liquid are preferably used.
  • the invention further relates to the use of ionic liquids for the manufacture of a medical device or a pharmaceutical composition / drug.
  • This definition may differ depending on national rules and the terms are therefore used interchangeably herein.
  • It is preferably a pharmaceutical composition / drug or a medical device for transplantation or transfusion, especially if the cells are blood cells such as erythrocytes, for blood transfusion.
  • Diseases requiring transfusion are known in the art, e.g. Anemias, blood loss e.g. after accident, surgery, liver failure, kidney failure or serious infections.
  • a medical device / drug which comprises ionic fluids and optionally compatible solutes, in particular a medical device / drug which further comprises cells, in particular eukaryotic cells, preferably erythrocytes and / or granulocytes.
  • this medical device / drug is used for transplantation or transfusion.
  • the invention also relates to a method of storing cells, in particular eukaryotic cells, in which the cells are contacted with a liquid which comprises or consists of ionic liquids and optionally compatible solutes.
  • a liquid which comprises or consists of ionic liquids and optionally compatible solutes.
  • the above cells, ionic liquids and storage conditions are used.
  • the cells are completely taken up in ionic liquids and optionally compatible solutes or fluids comprising them and dried (almost completely or completely).
  • a combination of ILs / compatible solutes e.g., ectoins
  • ectoins e.g., ectoins
  • the cells are so to speak "encapsulated” and therefore do not completely dry out
  • the cells are preferably taken up again in an aqueous buffer.
  • a washing and / or equilibration step after storage, especially before infusion or transplantation.
  • the ionic liquids are preferably removed to a large extent (eg 80-90% or up to 100%), and the cells are taken up in a suitable buffer.
  • a suitable buffer eg a conventional, for storage and / or infusion of cells suitable buffer
  • Fig. 1 (A) erythrocytes under the light microscope (1024x), (B) heme group: porphyrin ring, (C) 3-dimensional structure of hemoglobin (from http://upload.wikimedia.org)
  • Fig. 2 (A) Wavelength scan of hemoglobin in buffer, (B) Calibration for measurement of hemoglobin concentration on the absorbance of heme (405 nm)
  • Fig. 4 Storage of whole blood donations in CPD buffer at different temperatures. Determination of the free hemoglobin content in the supernatant via absorbance at 405nm
  • Fig. 5 Storage of whole blood donations in CPD buffer at different temperatures. Determination of the percentage of free hemoglobin in total hemoglobin by the Drabkins assay.
  • Fig. 6 basic body of the most common cations from which ionic liquids are composed
  • Fig. 7 Screening of the addition of various ionic liquids to whole blood donations. Photometric examination of the Supernatant at 405nm. Reaction conditions: 1.5 mL EK; 0.1 mL IL, Temp: 25 ° C, Time: 10 min, each 6.25% IL (V / V)
  • FIG. 8 (A) Example: Amoeng 100. (B) Screening of the addition of the Ammoeng series ionic liquids to whole blood donations. Photometric examination of the supernatant at 405nm, reaction conditions: 1.5 mL EK; 0.1 ml of IL; Temp: 25 ° C; Time: 10 min, 6.25% IL (V / V) each
  • Fig. 12 Proportion of extra erythrocytic hemoglobin after incubation of the whole blood donations with different proportions of the solvents n-decane, HMIM PF 6 and Oc 3 NMe BTA via (A) 3h and (B) 21h. (Temp: 20 0 C; shaker: lOOOrpm)
  • FIG. 13 Influence of the Addition of Biocompatible Ionic Liquids on the Form of Erythrocytes (Microscopic Image (4 ⁇ Magnification))
  • FIG. 15 Inhibition of the release of LDH from erythrocytes by [BMIM] [PF 6 ] Examples
  • hemolysis is the destruction of red blood cells, releasing hemoglobin from the cells Determination of the free hemoglobin can thus be a first indication of the influence of ionic liquids on the erythrocytes.
  • a whole blood donation in CPD buffer, blood group AB, Rhesus negative was used.This whole blood donation was portioned and stored cool until use in the experiment.
  • the whole blood donation was leucocyte-depleted according to standard procedures with a leukocyte filter and taken up in SAG-M.
  • the hemoglobin concentration in the whole blood donor supernatant was determined by the absorbance of the heme at 405nm.
  • 1.5 mL of the whole blood donation were centrifuged twice for 10 min at 14,000 rpm and 4 0 C and measured the supernatant after appropriate dilution in the photospectrometer.
  • defined amounts of standard hemoglobin from bovine blood were dissolved in buffer to determine a calibration function and the extinction was determined at 405 nm (FIG. 2).
  • the Drabkins reagent is used for the quantitative, colorimetric determination of hemoglobin concentrations at 540nm.
  • Classical methods for the determination of hemoglobin in blood are based on the determination of oxygen and carbon monoxide uptake or the iron content of the blood.
  • these assays have proven unreliable because of the heterogeneous nature of hemoglobin. Therefore, a colorimetric cyanmethemoglobin method was established, with which the total hemoglobin is rapidly converted to the cyano derivative at basic pH. The absorption of the cyano derivatives is determined at 540 nm.
  • Drabkins solution reacts with all forms of hemoglobin except sulfhemoglobin, a pigment that normally occurs in blood in very low concentrations.
  • the method is based on the oxidation of hemoglobin and its derivatives to methemoglobin in the presence of basic potassium ferricyanide. Methaemoglobin reacts with potassium cyanide to form cyanomemoglobin, which has an absorption maximum at 540nm. The color intensity measured at 540nm is proportional to the total hemoglobin concentration.
  • the graph illustrates that the release of hemoglobin from the erythrocytes at 25 ° C compared to hemolysis at 4 0 C is greatly accelerated.
  • the concentration of extracellular hemoglobin is already about 23 mg / mL, while after storage over the same period at 4 0 C only 0.5 mg / mL free hemoglobin can be detected. If the percentage of released hemoglobin in relation to the total hemoglobin is shown, then it becomes clear that after about 3 weeks storage time in the refrigerator at 4 0 C the proportion of released hemoglobin in relation to the total hemoglobin at 0.6% (1, 2 mg / ml).
  • the aim of the experiments was to investigate the potential use of ionic liquids to maintain the viability and functionality of erythrocytes.
  • the maximum storage capacity at 4 ° C. for erythrocyte concentrates is up to 49 days.
  • the contribution of extracellular hemoglobin to total hemoglobin is an important criterion for durability as an indicator of hemolysis.
  • ionic liquids to the erythrocyte concentrates or whole blood donations should be examined whether they have a stabilizing effect on the cells and thus the hemolysis rate can be reduced.
  • IIs ionic liquids
  • 6% (v / v) of the various ILs were added to whole blood donations.
  • Ionic liquids with different cations and anions were used.
  • the main bodies of the most common cations are shown in FIG.
  • the ionic liquids used contained different substituted imidazolium, ammonium and pyridinium cations with different anions (Table 1).
  • BMIM [OcSO 4 ] 1-methyl-3-pentylimidazolium tetrafluoroborate
  • PMIM [BF 4 ] 1-hexyl-3-methylimidazolium chloride
  • HMIM [Cl] 1-hexyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate
  • HMIM [PF 6 ] 1-hexyl-3-methylimidazolium
  • HMIM bis (trifluorosulfonyl) imide 1-methyl-3-octylimidazolium chloride
  • OMIM bis (trifluorosulfonyl) imide 1-methyl-3-octylimidazolium chloride
  • OMIM bis (trifluorosulfonyl) imide 1-methyl-3-octylimidazolium chloride
  • OMIM bis (trifluorosulfonyl) imide 1-methyl-3-octylimidazolium chloride
  • OMIM [Cl] N, N-dimethylethanol ammonium acetate
  • Me 2 NEt N-dimethylethanol ammonium acetate
  • Ammoeng520 A520 1-Ethyl-3-methyl-imidazolium ethylsulfate [EMIM] [EtSO 4 ] 1-ethyl-3-methyl-imidazolium
  • Triethylsulfonium bistrifluoromethylsulfonylimide [Et 3 S] [BTA] 1-methyl-3-octylimidazolium tetrafluoroborate [OMIM] [BF 4 ] N-methyl-N-trioctylammonium [Oc 3 NMe] [BTA] bis (trifluoromethylsulfonyl) imide 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate [EMIM] [Ac]
  • BMPL 1-butyl-1-methylpyrrolidinium
  • BTA bis (trifluoromethylsulfonyl) imide 1-ethyl-3-methylimidazolium 2 (2- [EMIM] methoxethoxy) ethylene sulfates [MeEtEtSO 4 ]
  • the ionic liquid Oc 3 NMe BTA was first selected in order to investigate the course of hemolysis of the erythrocyte concentrate with addition of this IL at different temperatures and at different times (FIG. 9).
  • the organic solvent n-decane was added to an approach of whole blood donations, which according to Pfründer et al. (2004) has a low cell-damaging effect due to its high logP value unlike other organic solvents.
  • Membrane integrity of Lactobacillus kefir was reduced to 52.7% with n-decane.
  • FIG. 11 shows the course of hemoglobin release from whole blood donations over time.
  • the influence of the ionic liquid on the erythrocyte hemolysis also shows a concentration-dependence. Accordingly, the ionic liquids HMIM PF 6 and Oc 3 NMe BTA and the organic solvent n-decane were selected and added to the whole blood donation at various concentrations. After incubation for 21h at lOOOrpm and 20 0 C, the percentage of extra erythrozytärem hemoglobin relative to total hemoglobin was determined (Fig. 12). The results illustrate that the erythrocytes are most damaged by the solvent n-decane, while the addition of the ionic liquid HMIM PF 6 damages the cells less than the organic solvent. For the ionic liquid OcsNMe BTA, a comparable or lower extra erythrocytic hemoglobin concentration was found at all concentrations than in the untreated whole blood donation.
  • a screening experiment the influence of the addition of biocompatible ionic liquids on the shape of the erythrocytes was further investigated.
  • the erythrocytes were transferred to a drop of ionic liquid and examined under the microscope for their cell shape.
  • Fig. 13 shows the micrographs of the erythrocytes in the presence of the various ionic liquids.
  • the first picture shows the storage of the erythrocytes in a physiological Ringer's solution.
  • the photographs clearly show that some of the biocompatible ionic liquids, e.g.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Fig. 15. shows the lower LDH release with the addition of BMIM-PF6, especially in the concentration range of 1% -20% by volume to erythrocytes of a packed red blood cell before the experiment with blood-group-like plasma in the ratio 40:60 (corresponds to a normal hematocrit 0.40) was mixed to have sufficient LDH assay supernatant.
  • the aim of the further experiments was to investigate the potential use of ionic liquids to maintain the viability and functionality of undifferentiated and differentiated cells, which, unlike red blood cells, have a nucleus and show more cell functions. These cell functions may include metabolism, mitochondrial energy, and sometimes cell division capability (not exhaustive).
  • the shelf life of cells varies greatly. While stem cells can be kept indefinitely in cell culture, at least theoretically, granulocytes, for example, have only a short duration Lifespan of 1-2 days. Granulocyte concentrates must therefore be transfused immediately after preparation from the blood of the donor. Maximum storage times are 6-24h. Liver cells are considered to be barely storable. Only in highly complex bioreactor systems can they be kept alive for a few days. Many, but not all cell types can be frozen at very low temperatures with the addition of eg DMSO and at least some of the cells can be rebuilt after thawing.
  • the ionic liquids used contained different substituted imidazolium, ammonium and pyridinium cations with different anions (Table 1). By way of example, results are shown with the following ILs:
  • the cells were seeded in a concentration of 0.5 ⁇ 10 6 / ml in 24-well plates (500 ⁇ l / well each), incubated with different concentrations of ILs for different times. Subsequently, the cytosolic enzyme lactate dehydrogenase (LDH) was measured in the cell supernatants, which occurs in virtually all cells and indicates damage to the cells very sensitively.
  • LDH concentrations shown in Table 4 were collected after incubation at 37 ° C. under standard cell culture conditions in a 6% IL solution in cell culture medium.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten zur Lagerung und Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, vor allem Blutzellen wie z.B. Leukozyten, Thrombozyten oder Erythrozyten. Die Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, die eukaryontische Zellen und ionische Flüssigkeiten und/oder kompatible Solute umfassen, Medizinprodukte mit ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten, sowie ein Verfahren zur Lagerung von eukaryontischen Zellen. Die Zellen können in Zellverbänden (Zellgemische, Gewebe, Organe, Organismen) enthalten sein.

Description

U EXKU LL & STOLBERG HAMBURG
PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS
THOMAS-WIMMER-RING 9 DIPL. -ING. ARNULF HUBER D-80539 MÜNCHEN DR. ALLARD von KAMEKE
DR. PETER FRANCK
DR. GEORG BOTH
DR. ULRICH-MARIA GROSS
DR. HELMUT van HEESCH
DR. JOHANNES AH ME
Universität Rostock DR. HEINZ-PETER MUTH, LL. M. Universitätsplatz 1 DR. BERND JANSSEN
DR. ALBRECHT von MENGES
DR. MARTIN NOHLEN
D- 18055 Rostock DR. PETER WIEGELEBEN
DR. FELIX LANDRY
DR. ANDRE GUDER
DR. FELIX HARBSMEIER
DR. FABIAN MÜLLER
RECHTSANWÄLTE
DR. FRANK DETTMANN
DR. ALEXANDER THUNKEN, LL. M.
MÜNCHEN
EUROPEAN PATENT ATTORNEYS EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS DIPL.-ING. LARS MANKE DR. OLGA BEZZUBOVA DR. SOLVEIG MORE
25.08.2009 P 80593 SM
Stabilisierung von Zellen durch ionische Flüssigkeiten
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten zur Lagerung und Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, vor allem Blutzellen wie z.B. Leukozyten, Thrombozyten oder Erythrozyten. Die Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, die eukaryontische Zellen und ionische Flüssigkeiten und/oder kompatible Solute umfassen, Medizinprodukte mit ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten, sowie ein Verfahren zur Lagerung von eukaryontischen Zellen in diesen Flüssigkeiten. Die Zellen können in Zellverbänden (Zellgemische, Gewebe, Organe, Organismen) enthalten sein. 1. Hintergrund der Erfindung
1.1 Blut
Blut (lat. sanguis) ist- ein spezielles, flüssiges Gewebe, das mit Unterstützung des Herz-Kreislauf-Systems die Funktionalität der restlichen Körpergewebe über vielfältige Transport- und Verknüpfungsfunktionen sicherstellt. Das Gefäßsystem des erwachsenen menschlichen Körpers enthält etwa 70 bis 80 mL Blut pro kg Körpergewicht, dies entspricht ca. 5 bis 6 L Blut. Blut besteht aus zellulären Bestandteilen (ca. 44 %) und Plasma (ca. 55 %), einer wässrigen Lösung (90 % Wasser) aus Proteinen, Salzen und niedrig-molekularen Stoffen, wie z. B. Monosacchariden. Die im Blut enthaltenen Zellen werden unterschieden in Erythrozyten (rote Blutkörperchen), Leukozyten (weiße Blutkörperchen, z.B. Granulozyten) und Thrombozyten oder Blutplättchen. Die Erythrozyten (griech. erythros für "rot" und kytos für "hohl" oder "Zelle") machen ca. 43 % des gesamten Blutvolumens aus. Sie erfüllen im Organismus die lebenswichtige Aufgabe des Gastransportes, indem sie (1) den Sauerstoff von den Lungen zu den Organen und Körperzellen und (2) einen Teil des Kohlendioxides von den Organen und Körperzellen zurück zur Lunge transportieren. Erythrozyten zeichnen sich durch ihre charakteristische bikonkave Scheibenform aus, welche eine deutliche Oberflächenvergrößerung bewirkt und zudem zu der enormen Verformbarkeit der Zellen beiträgt. Der Durchmesser eines roten Blutkörperchens beträgt beim Menschen etwa 7,5μm bei einer Dicke von 2μm. Erythrozyten bestehen zu 90 % der Trockenmasse aus dem Sauerstoff-bindenden Protein Hämoglobin. Der Häm-Änteil dieses Proteins verleiht den Erythrozyten und somit auch dem Blut die rote Farbe (Fig. 1) . Der Sauerstofftransport mit Hilfe von Hämo- globin ist ein energieunabhängiger Vorgang. Im Rahmen der sog. Erythropoese verlieren Erythrozyten bis zur Reifung sowohl den Zellkern als auch die Ribosomen und Mitochondrien. Sie sind somit weder zur DNA-Replikation oder de-novo-Proteinbiosynthese, noch zur Energiegewinnung mit Hilfe der Enzyme der Atmungskette, der oxidativen Phosphorylierung, des Citratzyklus oder der Betaoxi- dation befähigt. Da die Erythrozyten keine Mitochondrien mehr besitzen, wird Energie über die anaerobe Glykolyse hergestellt.
Die metabolische Aktivität des Erythrozyten entspricht einem spezialisierten Erhaltungsstoffwechsel, bei welchem Glukose das obligate Substrat darstellt. Die Ziele dieses Erhaltungsstoffwechsels sind die Aufrechterhaltung der Zellstruktur, die Bereitstellung funktionstüchtigen Hämoglobins, die Synthese von Gluta- thion und des Energielieferanten Adenosintriphosphat (ATP) , sowie die Aufrechterhaltung bestehender Konzentrationsdifferenzen von Natrium- und Kalium-Ionen zwischen Intra- und Extrazellulärraum. Für die Affinität des Sauerstoffs am Hämoglobin ist der Gehalt von 2, 3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG) wesentlich ("respiratorische Motilität"), die es umgekehrt proportional zu seiner intra- erythrozytären Konzentration beeinflusst. Bindet 2,3-DPG an Desoxyhämoglobin, stabilisiert es dies dadurch in einem Zustand niedriger Sauerstoffäffinität . Eine erhöhte 2, 3-DPG-Konzentration führt somit bei gleich bleibendem pH und pθ2 zu verminderter Sauerstoffaffinität und gesteigerter Sauerstofffreisetzung, es wird von einer „Rechtsverschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve" gesprochen. Des Weiteren stellt 2,3-DPG sowohl eine Energie- als auch eine Phosphatreserve dar, welche bei erhöhtem Energiebedarf mobilisiert werden können. 1.2 Bluttransfusionen
Der Begriff Bluttransfusion bezeichnet die Übertragung von Blut oder Blutbestandteilen vom Spender (Donor) zum Empfänger (Rezi- pient) . Die Entdeckung des Blutkreislaufes durch W. Havery (1578- 1657) im Jahre 1628 war die physiologische Grundlage für erste Überlegungen und experimentelle Versuche zu Blutübertragungen und wird als Beginn der Entwicklung der Transfusionsmedizin angesehen (Greenwalt, 1997; Ryser, 2000) . Nachdem in der Vergangenheit insbesondere Vollblutkonserven verwendet wurden, liegt heute der Schwerpunkt in der gezielten Therapie durch einzelne Blutkomponenten in Form von Blutzeil- und Plasmapräparaten. Dies sind im Wesentlichen das Erythrozyten-Konzentrat (EK) , das Thrombozyten- Konzentrat (TK, PLT) , das Granulozytenkonzentrat (GK) , Stammzellkonzentrate (SK) z.B. aus peripheren Stammzellspenden, aber auch aus Knochenmarksspenden und das Fresh Frozen Plasma (FFP). Akuter Volumenmangel und Blutverlust, seien sie traumatisch oder aber operationstechnisch bedingt, werden entweder mit Volumen-Expandern oder mit gelagerten Erythrozyten-Konzentraten therapiert. Die Volumen-Expander (z.B. Ringer-Lösung, HAES (Hydroxyaethyl- stärke, auch HES, in unterschiedlicher Kettenlänge, Vernetzungsgrad und Konzentration, z.B. HES 200/0,5 6%) sind jedoch nicht in der Lage, Sauerstoff zu transportieren, sondern dienen nur zur Beseitigung des bestehenden Volumenmangels, d.h. zur Kreislaufstabilisierung, z.T. auch zur Gewinnung der Blutzellen (z.B. Granulozytenkonzentrate) . Heutzutage ist der Einsatz von gelagerten Erythrozyten-Konzentraten ein standardisiertes und routinemäßig durchgeführtes Verfahren zur Erythrozytensubstitution bei Blutverlust. Das Erythrozyten-Konzentrat stellt eine Blutkonserve dar, welche weitestgehend von Blutplasma und Buffy coat (Leukozyten und Thrombozyten) befreit wurde. Somit werden überwiegend Erythrozyten transfundiert. Hauptsächliches Anwendungsgebiet der Erythrozyten-Konzentrate ist einerseits die Therapie von Anämien und andererseits - in Kombination mit dem Plasmaersatz - die Therapie des akuten Blutverlusts .
Bei der Herstellung und anschließenden Lagerung der Erythrozyten- Konzentrate kommt es zu Veränderungen der biochemischen und auch der den Sauerstofftransport betreffenden Parameter. Dieses Phänomen wird als Lagerungsschaden bezeichnet. Der Erythrozyten-Stoff- wechsel unterscheidet sich unter Lagerungsbedingungen aufgrund eines komplexen Zusammenspiels verschiedener veränderter Bedingungen und deren Auswirkungen vom Erythrozyten-Stoffwechsel unter physiologischen Bedingungen. Ausschlaggebende Veränderungen sind die niedrigere Temperatur und das geschlossene System. Diese Tatsachen haben maßgeblichen Einfluss auf die Haltbarkeit von sowohl Vollblutkonserven als auch Erythrozyten-Konzentraten. In vivo beträgt die Erythrozytenlebensdauer 100 - 120 Tage, unter Konservierungsbedingungen in Abhängigkeit von der erfolgten Lagerung bis zur Transfusion 32 - 49 Tage. Sie ist insbesondere vom pH-Wert, der Temperatur und der zur Verfügung stehende Glukose abhängig. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Lagerungsschaden des Erythrozyten mehrere Punkte betrifft: Im Rahmen eines morphologischen Formenwandels bilden sich Sphärozyten, Stechapfelformen und Mikrovesikel, dies geht insgesamt mit verminderter Deformabilität bzw. erhöhter Rigidität einher. Es kommt zu funktionellen Beeinträchtigungen, welche sich in einer Linksverschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve sowie in einer verminderten osmotischen Resistenz der roten Blutzellen widerspiegeln. Die mögliche Bildung von Mikroaggregaten hat nach der Transfusion eine erhöhte Gefahr der Entstehung von Mikroembolien zur Folge. Zudem führt der Lagerungsschaden zur Freisetzung intra-erythrozytärer Stoffe, wie beispielsweise Kalium, Laktat- dehydrogenase und Hämoglobin. Um die beschriebenen Auswirkungen der Lagerung auf den Erythrozytenstoffwechsel, insbesondere das Abfallen der Konzentrationen an ATP und 2,3-DPG um einige Wochen hinauszuzögern und damit die Haltbarkeit der Blutkonserven zu verlängern, bedient man sich des Hinzufügens von Stabilisatoren und additiven Lösungen.
1.3 Stabilisatoren und additive Lösungen für die Lagerung von Blutkonserven
Blutkonserven enthalten neben Blut bestimmte Konservierungslösungen. Hierbei unterscheidet man zwischen Stabilisatoren und additiven Lösungen, welche heutzutage beide in Kombination zur Erythrozytenkonservierung verwendet werden. Die Stabilisatoren dienen einerseits der Antikoagulation, andererseits auch der Aufrechterhaltung des Zellstoffwechsels. Die additiven Lösungen haben die Aufgabe, den Zellstoffwechsel zusätzlich zu stabilisieren und dadurch zu einer Verbesserung von Überlebensrate und Überlebenszeit der Erythrozyten zu führen. Als wichtiges Kriterium für den Konservierungserfolg gilt dabei die Überlebensrate der Erythrozyten im Empfängerorganismus, gemessen 24 Stunden nach der Transfusion. Sie sollte mindestens 75 % betragen. Der Anteil des extrazellulären Hämoglobins am Gesamthämoglobin stellt als „Indikator" der Hämolyse ein weiteres wichtiges Kriterium dar ' und sollte am Ende der Lagerungszeit nicht mehr als 1 % betragen.
1.3.1 Stabilisatoren
Die Zusammensetzung der Stabilisatoren-Lösung ist prinzipiell so gewählt, dass mit Hilfe von Citrat-Ionen die Gerinnung verhindert, durch Zugabe von Dextrose der Zellstoffwechsel der Erythro- zyten aufrechterhalten und durch Hinzufügen von Adenin der intrazelluläre Adenosin-phosphorsäure-Pool angehoben werden. Einer der ersten entwickelten Stabilisatoren ist der ACD (Acid.citr.- Citrat-Dextrose) - Stabilisator. Er besteht aus Zitronensäure, Citrat und Dextrose, und wurde 1943 von Loutit et al. konzipiert. Die durchschnittliche Überlebensrate 24 Stunden nach der Transfusion liegt nach dreiwöchiger Lagerzeit bei 70 %. Der heute zumeist verwendete Stabilisator ist der CPD (Citrat-Phosphat-Dex- trose) -Stabilisator . Er stellt in seiner ursprünglichen Zusammensetzung eine Weiterentwicklung des ACD-Stabilisators dar und enthält neben Zitronensäure, Citrat und Dextrose zusätzlich Phosphat, welches für den intrazellulären Erhalt organischer Phosphatverbindungen und für bessere Pufferungsverhältnisse innerhalb des Stabilisators sorgt. Durch letzteres bedingt kommt es zu einer Anhebung des pH-Wertes des Stabilisators selbst auf 5,6 - 5,8. Nach Vermischen mit Blut hat die Blutkonserve einen pH-Wert von etwa 7,2. Dieser im Vergleich zum ACD-Stabilisator alkalischere pH-Wert führt dazu, dass die 2, 3-DPG-Konzentration langsamer sinkt. Auch am Ende der Konservierungszeit ist noch ausreichend Glukose vorhanden. Die durchschnittliche 24-Stunden- Überlebensrate liegt nach dreiwöchiger Lagerzeit bei 72 %. Durch Zugabe des Purins Adenin wird aus dem CPD-Stabilisator der CPD- A(denin) -Stabilisator gebildet. Der Zusatz von Adenin hat eine Verlängerung der Konservierungszeit zur Folge.
1.3.2 Additlvlösungen
Diese proteinfreien Konservierungslösungen enthalten die für die Erythrozytenkonservierung notwendigen Substanzen, welche zur Aufrechterhaltung des Energiehaushalts sowie der Membranstabilität der Erythrozyten während der Lagerung führen. Eine längere Verwendbarkeit der Erythrozyten-Konzentrate wird ermöglicht. Die Additivlösung wird den Erythrozyten nachträglich, d.h. nach Entfernen des Plasmas, im Rahmen einer Resuspendierung hinzugefügt. Heutzutage werden in Deutschland zumeist die additiven Lösungen SAG-M, PAGGS-S und PAGGS-M verwendet. SAG-M besteht neben physiologischer Kochsalzlösung aus Adenin, Glukose und Mannit. Der Zusatz von Mannit führt aufgrund osmotisch stabilisierender Eigenschaften zu einer geringeren spontanen Hämolyserate während der Lagerungszeit. Durch Verwendung von SAG-M in Kombination mit dem CPD-Stabilisator ist eine Lagerung von 5 - 6 Wochen möglich, wobei die Überlebensrate der Erythrozyten 24 Stunden nach der Transfusion bis auf 77 % angehoben wird. PAGGS (Phosphat-Adenin- Glukose-Guanosin-Sorbit) -S (orbit) und PAGGS-M (annit) , bestehen aus physiologischer Kochsalzlösung, Phosphat, Adenin, Glukose, Guanosin und Sorbit bzw. Mannit. Bei einer Lagerzeit von 7 Wochen werden 24-Stunden-Überlebensraten von 78 % erreicht. Im Vergleich zu SAG-M bleiben sowohl das zelluläre ATP als auch der Adenylatpool (ATP + ADP + AMP) besser erhalten, was für die Überlebensfähigkeit der Erythrozyten nach Transfusion von großer Bedeutung ist. Teilweise ist dies zurückzuführen auf das in dieser Additivlösung neben Adenin zusätzlich vorhandene Guanosin, welches den Nukleotid-Pool in Form von Guanosintriphosphat (GTP) erweitert .
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass auch nach Zugabe von Stabilisatoren und additiven Lösungen zu den Blutkonserven die Erythrozyten-Lebensdauer unter Konservierungsbedingungen weiter unter der in vivo zu erwartenden Lebensdauer liegt und somit den begrenzenden Faktor für die Haltbarkeit der Konserven darstellt. Ähnlich ist die Lage bei Thrombozytenkonzentraten und Granu- lozytenkonzentraten. Während Erythrozyten bei Anämie und Thrombozyten bei Thrombopenie mit Blutungsgefahr gegeben werden, ist das Einsatzgebiet von Granulozytenspenden der Granulozytenmangel (im Extremfall Agranulozytose) zur Behandlung neutropener Infektionen. Durch die Einführung von Steroid- bzw. G-CSF- induzierten Granulozytenkonzentraten mit hoher Zellzahl wurden die klinischen Ergebnisse bei Granulozytentransfusion verbessert.
Diese Konzentrate sind noch viel kürzer lagerbar als Erythro- zytenkonzentrate und haben daher ein noch größeres Optimierungspotential .
1.4 Zielsetzung
Die Haltbarkeit von Erythrozyten-Konzentraten ist in Abhängigkeit von der Konservierungslösung auf bis zu 49 Tage begrenzt. Tag für Tag werden in Deutschland jedoch zahlreiche Blutkonserven benötigt. Erythrozyten-Konzentrate sind ein wichtiges Notfallmedikament nach Unfällen und bei akuten Erkrankungen, für die es bis heute keinen adäquaten Ersatz ("Kunstblut") gibt. Kurzfristige Einflüsse führen dabei immer wieder eine Knappheit der Erythrozyten-Konzentrate herbei. Beispiele für solche Faktoren sind z.B. (1) eine Grippewelle, da nur gesunde Menschen spenden dürfen, (2) Urlaubszeit, da sich viele "Stammspender" im Ausland aufhalten, (3) zufällig zusammenfallende schwere Unfälle und Operationen, bei denen hoher Blutbedarf besteht, (4) der Trend zu Fernreisen, da Personen, die sich in Tropengebieten aufgehalten haben, längere Zeit nicht spenden dürfen. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Erythrozyten-Konzentraten könnte durch eine weitere Erhöhung der Stabilität von Erythrozyten und somit eine Verlängerung der Lagerzeit ein großer Beitrag zur Sicherung einer adäquaten Versorgung von Patienten, welche eine Transfusion benötigen, geleistet werden.
Auch die Lagerung anderer eukaryontischer Zellen, z.B. Granulo- zyten-Konzentraten, Thrombozyten-Konzentraten oder von anderen Zellen aus Blut, Zelllinien, die z.B. in der Forschung verwendet werden, oder von Probenmaterial, z.B. Biopsien oder Knochenmarksspenden, ist noch verbesserungsbedürftig.
2. Beschreibung der Erfindung
Dem gegenüber stellt sich dem Fachmann das Problem, eine alternative Möglichkeit zur Lagerung von eukaryontischen Zellen, insbesondere von Erythrozyten, Thrombozyten oder Granulozyten zur Verfügung zu stellen.
Dieses Problem wird von der vorliegenden Erfindung, insbesondere vom Gegenstand der Ansprüche, gelöst.
Es wurde im Rahmen der Erfindung erstmals festgestellt, dass ionischen Flüssigkeiten zur Lagerung und Stabilisierung von Zellen, insbesondere eukaryontischen Zellen verwendet werden können.
Ionische Flüssigkeiten (kurz ILs: „ionic liquids") sind Ionenpaare mit Schmelzpunkten unter 1000C. In den letzten Jahren haben sie sich zunehmend als neuartige Lösungsmittel für eine Vielzahl von Reaktionen etabliert, da sie variierbare Lösungseigenschaften mit einem kaum nachweisbaren Dampfdruck und exzellenten thermischen und chemischen Stabilitäten kombinieren. Durch eine geeignete Wahl von Kationen und Anionen ist eine stufenweise Einstellung der Polarität und damit eine Abstimmung der Löslich- keitseigenschaften möglich. Die Bandbreite reicht dabei von wassermischbaren ionischen Flüssigkeiten über wassernichtmisch- bare bis hin zu solchen, die selbst mit organischen Lösungsmitteln zwei Phasen bilden. Ionische Flüssigkeiten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in den Publikationen (BRANCO ET AL. (2002); CHEM. EUR. J. 8 No. 17, 3865-3871; BRANCO, L. C. ET AL. (2002); ANGEW. CHEM. INT. ED. 41 No. 15, 2771-2773; ANDERSON, J. L. ET AL.; (2002); J. AM. CHEM. SOC. 124, 14247-14254; H.ZHAO; (2003); PHYSICS AND CHEMISTRY OF LIQUIDS 41 No. 6, 545-557; D. -Q. Xu; (2003); SYNTHESIS NO. 17, 2626-2628) genannt, auf die hierin ausdrücklich Bezug genommen wird. Ferner wird noch auf die Datenbanken von Merck (www. ionicliquids-merck.de) und von Solvent Innovation (www . solvent-innovation . com) verwiesen.
Es wurde bereits belegt, dass ionische Flüssigkeiten für die Stabilisierung von Enzymen verwendet werden können (Lozano et al., 2001; Fujita et al., 2005). Die Möglichkeit zur Katalyse mit ganzen Zellen in Gegenwart von ionischen Flüssigkeit wurde bis heute nur von wenigen Forschungsgruppen untersucht. CuIl et al.
(2000) berichteten als erstes über die Verwendung eines Zweiphasen-Systems aus l-Butyl-3-methylimidazoium hexafluorophosphat
(BMIM PF6) und wässrigem Puffer für die Biotransformation von 1, 3-Dicyanobenzen zu 3-Cyanobenzamid durch ganze Zellen von Rhodococcus R312. Die ionische Flüssigkeit zeigte einen geringeren negativen Einfluss auf die mikrobiellen Zellen als Toluen, welches normalerweise als Cosolvenz verwendet wird. Immobilisierte Zellen von Saccharomyces cerevisiae wurden von Lou et al. (2006) in Gegenwart der ionischen Flüssigkeiten BMIM PF6 und BMIM BF4 für die asymmetrische Reduktion von Acetyltrimethyl- silan zu enantioreinem ( S) -1-Trimethylsilylethanol eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die ionischen Flüssigkeiten die Aktivität und Stabilität der immobilisierten Zellen stark erhöhten. Pfründer et al. (2004) untersuchten den Einfluss verschiedener ionischer Flüssigkeiten auf die Zellmembran von Lactobacillus kefir. In Anwesenheit von 20 % (v/v) der ionischen Flüssigkeiten wurde die Membranintegrität im Vergleich zum Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel untersucht. Für die Verwendung organischer Lösungsmittel gilt allgemein, dass die Toxizität von organischen Lösungsmitteln eine starke Abhängigkeit von deren Hydro- phobizität zeigt, welche im log P-Wert ausgedrückt wird, dem Logarithmus des Verteilungskoeffizienten des Lösungsmittel in 1- Octanol und Wasser. Die Membranintegrität von Lactobacillus kefir wurde mit n-Decan (logP=5,0) auf 52,7 % herabgesetzt. Mit MTBE (logP=0,9), Diisopropylether (logP = 1,5), n-Octanol (logP=3,0) und n-Decanol (logP=4,6) betrug die Membranintegrität nur noch 10 % oder weniger. Pfründer et al. statuieren weiterhin, dass die ILs selbst nicht die Zellmembran von L. kefir schädigen. Sie konnten sogar eine Verbesserung der Membranintegrität feststellen, ein Effekt, der erklärt wird durch eine Veränderung in der Morphologie ähnlich zu der in wachsenden Zellen. Im Gegensatz zum wässrigen System wurde bei einem Zusatz von 20 % OMA Tf2N (=Oc3NMe BTA) die Membranintegrität auf über 175 %, bei Zusatz von 20 % BMIM Tf2N auf über 125 % und bei Zusatz von 20 % BMIM PF6 auf über 130 % nachgewiesen.
Insbesondere werden im Rahmen der Erfindung ionische Flüssigkeiten verwendet, die einen Schmelzpunkt von unter 370C aufwiesen, insbesondere einen Schmelzpunkt von unter etwa 200C, unter etwa 100C oder unter etwa 40C, so dass die Flüssigkeiten etwa bei der gewünschten Lagerungstemperatur bevorzugt flüssig sind. In einer Ausführungsform werden die Zellen trocken gelagert, mit einer trockenen „Hülle" aus ILs. Dabei wird ein IL benutzt, das z.B. bei 4° oder 25° fest ist und nur bei höheren Temperaturen flüssig.
Durch den Einsatz ionischer Flüssigkeiten und deren überraschende Eigenschaften zur Stabilisierung von eukaryontischen Zellen wird z.B. die Möglichkeit eröffnet, die Erythrozyten-Konzentrate oder andere Zellkonzentrate auch bei höheren Temperaturen ohne Verluste in der Qualität der Zellen zu lagern. Es entfallen zum einen der große Aufwand und die hohen Kosten zur Erhaltung der Kühlkette und zum anderen die Notwendigkeit, Erythrozyten-Konzentrate, deren Kühlkette unterbrochen wurde, entsorgen zu müssen.
Im Rahmen der Erfindung ist es umfasst, dass die Zellen in einer reinen ionischen Flüssigkeit (100%) gelagert werden, oder in einer ionischen Flüssigkeit, die weitere Additive oder Stabilisatoren (z.B. die oben genannten) enthält, oder in einer Flüssigkeit, die 1% - 99% ionische Flüssigkeit umfasst, insbesondere 2% - 80%, 3% - 60%, 5% - 50%, 6% - 40%, 10% - 38%, 20 %- 35% oder 25%-30%. % bezieht sich im Rahmen der Erfindung, wenn nicht anderes erwähnt, auf Volumenprozent.
Besonders günstige Ergebnisse haben sich gezeigt, wenn hierbei eine nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeit in Kombination mit einer wässrigen Lösung, insbesondere einem wässrigen Puffer, verwendet wird. Bevorzugt umfasst die wässrige Lösung/der Puffer bekannte Additive oder Stabilisatoren, bei Lagerung von Erythrozyten kann es sich z.B. um ACD, CPD oder CPD-A-Lösung, bevorzugt in Kombination mit SAG-M, PAGGS-S und PAGGS-M-Additiven handeln. Ohne an die Hypothese gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass die positive Wirkung eines solchen Systems darauf beruht, dass eine äußere Phase aus ionischer Flüssigkeit eine innere Phase aus wässriger Lösung und Zellen umhüllt. Es kann auch eine Mischung mit einem klassischen Zellkulturmedium verwendet werden, z.B. RPMI oder MEM, gegebenenfalls mit Serum, z.B. Humanem Serum, Pferdeserum oder Fötalem Kälberserum. Der Serumanteil kann dabei z.B. 1-15% betragen, bevorzugt 5-10%.
Als nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeiten werden im Rahmen der Erfindung ionische Flüssigkeiten bezeichnet, die hydrophobe Kationen oder/und Anionen besitzen (Weingärtner, 2008) . Auch wassermischbare ionische Flüssigkeiten können verwendet werden.
Im Rahmen der Erfindung können auch kompatible Solute zur Lagerung von eukaryontischen Zellen, insbesondere von Erythrozyten verwendet werden. Kompatible Solute sind kleine organische Moleküle, die von mikrobiellen Organismen synthetisiert werden, um sich vor hohen Salz- und/oder Zuckerkonzentrationen im extrazellulären Milieu zu schützen. Die Präsenz von Salz kann sich auf zweierlei Weise negativ auf Zellen auswirken: zum einen durch einen nichtspezifischen osmotischen Effekt, zum anderen durch die spezifische Toxizität der Ionen für bestimmte zelluläre Strukturen wie Proteine und Membranen. Für die Schaffung eines osmotischen Gegendrucks besitzen viele Mikroorganismen die Fähigkeit, kompatible Solute zu bilden, welche eine hohe Wasserlöslichkeit besitzen, bei physiologischen pH-Werten keine Nettoladung aufweisen und in der Regel keinen oder einen nur geringen Einfluss auf den Stoffwechsel der Zellen haben. Die hauptsächlichen kompatiblen Solute in Mikroorganismen und Pflanzen sind Polyole (Glycerol, Sorbit und Mannit) , nicht- reduzierende Zucker wie Saccharose und Trehalose, Aminosäuren (Glutamat, Prolin und Betain) und die Tetrahydropyrimidinderivate Ektoin und Hydroxyektoin. Sie sind nicht nur kompatibel mit den nativen Zuständen von Proteinen und Membranen, sondern sie stabilisieren deren Strukturen auch gegen Dehydratation, Hitzeschock und denaturierende Reagenzien. Insbesondere wird eine Flüssigkeit zur Lagerung verwendet, welche kompatible Solute und ionische Flüssigkeiten umfasst. Es können Flüssigkeiten verwendet werden, die etwa 1-99%, 2% - 80%, 3% - 60%, 5% - 50%, 6% - 40%, 10% - 38%, 20 %- 35% oder 25%-30% kompatible Solute umfassen.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelagerten eukaryonti- schen Zellen können z.B. Blutzellen, insbesondere Erythrozyten, Leukozyten (z.B. Granulozyten oder Thrombozyten), Zellen einer Zelllinie oder Zellen in einem Zellverbund (z.B. Gewebe, Organ oder Organismus) sein. Die Zellen können z.B. von einer Biopsie eines Patienten abgeleitet sein, oder die Biopsie kann als Gewebeprobe in der Flüssigkeit gelagert werden. Es kann sich auch um ein Gewebe zur Transplantation handeln. Bevorzugt handelt es sich um Säugerzellen, insbesondere humane Zellen. Die Zellen können auch Stammzellen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die eukaryontischen Zellen Erythrozyten und/oder Granulozyten .
Die Erfindung umfasst bevorzugt die Lagerung bei Temperaturen bis etwa 37°C. Bevorzugt werden die Zellen bei einer Temperatur von etwa O0C bis etwa 37°C gelagert, insbesondere bei Raumtemperatur, z.B. 15-150C oder bis 300C. Auch eine gekühlte Lagerung bei z.B. 4°C ist möglich. Die Zellen können jedoch auch bei Temperaturen unter 00C gelagert werden, z.B. bei -15 bis -300C, -65 bis -9O0C oder unter -1300C. Zur Kryokonservierung kann ein Zusatz von bekannten Kryoprotektoren, z.B. Serum, HAES und/oder Dirnethyl- sulfoxid (DMSO), hilfreich sein.
Es hat sich im Rahmen der Erfindung herausgestellt, dass überraschenderweise die Zellen bei einer Lagerung bei einer Temperatur von mehr als 40C stabiler sein können als bei 40C. Daher werden die Zellen bevorzugt bei mehr als 40C, mehr als 8°C, etwa 10°C-37°C oder etwa 15°C-25°C, insbesondere bei etwa 200C bis etwa 25°C (Raumtemperatur) gelagert.
Bevorzugt ist die ionische Flüssigkeit eine nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeit, wie z.B. EMIM PF6, BMIM PF6, HMIM PF6, HMIM BTA oder Oc3NMe BTA. Im Rahmen der Erfindung kann selbstverständlich auch eine Mischung von mehreren ionischen Flüssigkeiten (gegebenenfalls mit kompatiblen Soluten und/oder wässrigen Puffern, z.B. wie oben beschrieben) verwendet werden. Bevorzugt ist die ionische Flüssigkeit (die kompatiblen Solute) biologisch verträglich, d.h. sie stört in den verwendeten Konzentrationen nicht die Vitalität der Zellen oder ist sogar ohne wesentliche unerwünschte Wirkungen, z.B. toxischer Art, einem Patienten (bevorzugt einem menschlichen Patienten) verabreichbar. Biokompatible ionische Flüssigkeiten können beispielsweise N-Butyl-N- methylpyrrolidinium dicyanamid, l-Butyl-3-methylimidazolium dig- hydrogenphosphat , N-Butyl-N-methylpyrrolidinium dihydrogenphos- phat, Cholin dihydrogenphosphat oder l-Isobutyl-3-methylimidazoi- um hexafluorophosphat (Fujita et al., 2005; Shan et al., 2008) . Weitere biokompatible ionische Flüssigkeiten könnten Triethylsul- fonium bis (trifluoromethylsulfonyl) imid, l-Butyl-3-methyl-pyrro- lidinium bis (trifluoromethylsulfonyl ) imid, l-Butyl-3-methyl- imidazolium dicyanamid, Triisobutylmethyl-phosphonium tosylat, 1- Ethyl-3-methyl-imidazolium trifluoro-methansulfonat, N-Butyl-N- trimethylammonium bis (trifluoromethyl-sulfonyl) imid, Ethanol- ammonium formiat, Ethylammonium nitrat, l-Ethyl-3-methyl- imidazolium ethylsulfat sein (www.iolitec.de). Abhängig vom Zelltyp zeigten in Experimenten unterschiedliche ILs verschieden gute stabilisierende Eigenschaften. Die Ursache liegt wahrscheinlich in den großen Unterschieden zwischen den Eukaryontenzellen in Bezug auf Zusammensetzung und Rigidität der Zellmembran, Stoffwechselaktivität, Zellform und -große.
Deshalb kann es im Rahmen der Erfindung sinnvoll sein, sowohl die Art als auch die Konzentration der ionischen Flüssigkeit auf den konkreten Zelltyp abzustimmen. Teil der Erfindung ist damit auch ein Test zur Bestimmung der Eignung einer ionischen Flüssigkeit oder einer ionische Flüssigkeit umfassenden Flüssigkeit zur Lagerung eines bestimmten Zelltyps, bei dem man Zellen dieses Zelltyps in der Flüssigkeit lagert und die Vitalität der Zellen, ihre Funktionsfähigkeit oder z.B. die Freisetzung von Enzymen wie LDH untersucht.
Im Rahmen der Erfindung können auch Kombinationen von verschiedenen ILs untereinander und mit kompatiblen Soluten, selbstverständlich auch in Mischung mit einer anderen Flüssigkeit, wie einem Zellkulturmedium (z.B. mit Serum) oder einem wässrigen Puffer, in einer Ausführungsform mit konventionell zur Lagerung z.B. von Erythrozyten verwendeten Stabilisatoren, verwendet werden.
Überraschenderweise hat sich im Rahmen der Erfindung herausgestellt, dass die Zellen nach der Lagerung in ionischen Flüssigkeiten oder diese umfassenden Flüssigkeiten noch vital sind, und dass dieses Lagerungsverfahren die Zellen stabilisiert.
Ferner kann bei Verwendung von wassermischbaren ionischen Flüssigkeiten deren Löslichkeits-vermittelnde Wirkung ausgenutzt werden, um z.B. hydrophobe Substanzen/Substrate/Arzneimittel in höheren Konzentrationen zu lösen und mit den Zellen in Kontakt zu bringen .
Im Rahmen der Erfindung wird ferner auch eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, welche ionische Flüssigkeiten und eukaryon- tische Zellen und optional kompatible Solute umfasst. Diese Zusammensetzung kann ein Medizinprodukt oder eine pharmazeutische Zusammensetzung sein. Die Zusammensetzung ist z.B. zur Transfusion oder Transplantation geeignet, ggf. nach vorbereitenden Schritten wie Waschen und Aufnehmen in einem geeigneten Puffer. Sofern die ionischen Flüssigkeiten biologisch verträglich sind, ist jedoch auch eine direkte Transfusion/Transplantation möglich. Bevorzugt werden die oben genannten Zellen und ionischen Flüssigkeiten bzw. Flüssigkeiten, die einen Anteil einer ionischen Flüssigkeit umfassen, verwendet.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Herstellung eines Medizinprodukts oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung/eines Arzneimittels. Diese Definition kann sich abhängig von nationalen Regeln unterscheiden und die Begriffe werden daher hier austauschbar verwendet. Bevorzugt handelt es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung/ein Arzneimittel oder ein Medizinprodukt zur Transplantation oder Transfusion, vor allem, falls es sich bei den Zellen um Blutzellen wie Erythrozyten handelt, zur Bluttransfusion. Krankheiten, bei denen eine Transfusion benötigt wird, sind im Stand der Technik bekannt, z.B. Anämien, Blutverlust z.B. nach Unfall, Operation, Leberversagen, Nierenversagen oder schweren Infektionen.
Damit wird erstmalig ein Medizinprodukt/Arzneimittel bereitgestellt, das ionische Flüssigkeiten und optional kompatible Solute umfasst, insbesondere ein Medizinprodukt/Arzneimittel welches ferner Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen, bevorzugt Erythrozyten und/oder Granulozyten, umfasst. Bevorzugt wird dieses Medizinprodukt/Arzneimittel zur Transplantation oder Transfusion verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Lagerung von Zellen, insbesondere eukaryontischen Zellen, bei dem man die Zellen mit einer Flüssigkeit in Kontakt bringt, welche ionische Flüssigkeiten und optional kompatible Solute umfasst oder daraus besteht. Bevorzugt werden die oben genannten Zellen, ionischen Flüssigkeiten und Lagerungsbedingungen verwendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen komplett in ionischen Flüssigkeiten und optional kompatiblen Soluten bzw. diese umfassende Flüssigkeiten aufgenommen und (fast vollständig oder vollständig) getrocknet. Hierbei ist eine Kombination aus ILs/kompatiblen Soluten (z.B. Ektoinen) besonders vorteilhaft, da kompatible Solute durch hygroskopische Wirkungen das Wasser innerhalb der Zelle halten, und die ILs/Ektoine eine wasserundurchlässige Schutzschicht bilden. Die Zellen werden also sozusagen „verkapselt" und trocknen deshalb nicht völlig aus. Vor der weiteren Verwendung werden die Zellen bevorzugt wieder in einem wäßrigen Puffer aufgenommen.
Allgemein ist es bevorzugt, nach der Lagerung einen Wasch- und/oder Äquilibrierungsschritt durchzuführen, insbesondere vor einer Infusion oder Transplantation. Dabei werden die ionischen Flüssigkeiten bevorzugt zu einem großen Anteil (z.B. 80-90% oder bis 100%) entfernt, und die Zellen in einem geeigneten Puffer aufgenommen. Dabei können auch mehrere Waschschritte vorgenommen werden, wobei eine Inkubation in einem geeigneten Puffer (z.B. einem konventionellen, zur Lagerung und/oder Infusion von Zellen geeigneten Puffer) stattfinden kann, bei der die ionischen Flüssigkeiten wieder aus dem Zellinneren herausdiffundieren.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen illustriert, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Legende
Fig. 1 (A) Erythrozyten unter dem Lichtmikroskop (1024x), (B) Häm-Gruppe: Porphyrinring, (C) 3-dimensionale Struktur des Hämoglobin (aus http://upload.wikimedia.org)
Fig. 2 (A) Wellenlängen-Scan von Hämoglobin in Puffer, (B) Kalibrierung zur Messung der Hämoglobin-Konzentration über die Extinktion von Häm (405 nm)
Fig. 3 Kalibrierung zur Quantifizierung von Hämoglobin mittels Drabkins-Assay
Fig. 4 Lagerung von Vollblutspenden in CPD-Puffer bei unterschiedlichen Temperaturen. Bestimmung des freien Hämoglobin- Gehaltes im Überstand über Extinktion bei 405nm
Fig. 5 Lagerung von Vollblutspenden in CPD-Puffer bei unterschiedlichen Temperaturen. Bestimmung des prozentualen Anteils des freien Hämoglobins am Gesamthämoglobin durch den Drabkins- Assay.
Fig. 6 Grundkörper der gängigsten Kationen, aus denen ionische Flüssigkeiten zusammengesetzt sind
Fig. 7 Screening des Zusatzes verschiedener ionischer Flüssigkeiten zu Vollblutspenden. Photometrische Untersuchung des Überstandes bei 405nm. Reaktionsbedingungen: 1,5 mL EK; 0,1 mL IL, Temp: 25°C, Zeit: 10 min, je 6,25% IL (V/V)
Fig. 8 (A) Beispiel: Amoeng 100. (B) Screening des Zusatzes der ionischen Flüssigkeiten der Ammoeng-Serie zu Vollblutspenden. Photometrische Untersuchung des Überstandes bei 405nm, Reaktionsbedingungen: 1,5 mL EK; 0,1 mL IL; Temp: 25°C; Zeit: 10 min, , je 6,25% IL (V/V)
Fig. 9 Inkubation der Vollblutspenden unter Zusatz verschiedener Additive bei (A) 15°C und (b) 25°C, auf dem Schüttler bei 1000 rpm (zusätzlicher Stress) , je 6,25% IL (V/V)
Fig. 10 Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel (je 6,25% (V/V)) zu den Vollblutspenden
Fig. 11 Zusatz verschiedener ionischer Flüssigkeiten (je 6,25% (V/V) ) zu den Vollblutspenden
Fig. 12 Anteil des extra-erythrozytären Hämoglobin nach Inkubation der Vollblutspenden mit verschiedenen Anteilen der Lösungsmittel n-Decan, HMIM PF6 und Oc3NMe BTA über (A) 3h und (B) 21h. (Temp: 200C; Schüttler: lOOOrpm)
Fig. 13 Einfluss des Zusatzes biokompatibler ionischer Flüssigkeiten auf die Form von Erythrozyten (Mikroskopische Aufnahme (4Ox Vergrößerung))
Fig. 14 Einfluss des Zusatzes kompatibler Solute auf die Form von Erythrozyten
Fig. 15 Hemmung der Freisetzung von LDH aus Erythrozyten durch [BMIM] [PF6] Beispiele
1. Material und Methoden
1.1 Erythrozyten-Konzentrate und Vollblutspenden
Um zu klären, inwieweit sich die Zugabe von ionischen Flüssigkeiten auf Erythrozyten auswirkt, wurde die Hämolyse der Zellen als „Indikator" für die Zellstabilität untersucht. Als Hämolyse wird die Zerstörung der roten Blutkörperchen bezeichnet, bei welcher Hämoglobin aus den Zellen freigesetzt wird. Über die Bestimmung des freien Hämoglobins kann somit ein erster Anhaltspunkt über den Einfluss von ionischen Flüssigkeiten auf die Erythrozyten gefunden werden. Es wurde eine Vollblutspende in CPD-Puffer, Blutgruppe AB, Rhesus negativ verwendet. Diese Vollblutspende wurde portioniert und bis zum Einsatz im Experiment kühl gelagert. Zur Herstellung von Erythrozyten-Konzentraten wurde die Vollblutspende entsprechend Standardverfahren mit einem einem Leukozytenfilter Leukozyten-depletiert und in SAG-M aufgenommen.
1.2 Quantifizierung von Hämoglobin durch Messung der Extinktion von Harn bei 405nm
Es wurde die Hämoglobin-Konzentration im Überstand der Vollblutspende durch die Extinktion des Häms bei 405nm bestimmt. Hierzu wurden 1,5 mL der Vollblutspende zweifach für 10 min bei 14.000 rpm und 40C zentrifugiert und der Überstand nach geeigneter Verdünnung im Photospektrometer vermessen. Zur Darstellung einer Kalibierungsfunktion wurden definierte Mengen eines Standard-Hämoglobins aus Rinderblut in Puffer gelöst und die Extinktion bei 405nm bestimmt (Fig. 2) . 1.3 Drabkins-Assay zur Quantifizierung von Hämoglobin
Das Drabkins Reagenz wird für die quantitative, colorimetrische Bestimmung von Hämoglobin-Konzentrationen bei 540nm eingesetzt. Klassische Methoden zur Bestimmung von Hämoglobin in Blut basieren auf der Determination von Sauerstoff- und Kohlenmonoxid-Auf- nahmefähigkeit oder dem Eisengehalt des Blutes. Diese Assays haben sich jedoch aufgrund der heterogenen Natur des Hämoglobins als unzuverlässig herausgestellt. Daher wurde eine colorimetrische Cyanmethämoglobin-Methode etabliert, mit welcher das Gesamthämoglobin bei basischem pH schnell zum Cyanoderivat konvertiert wird. Die Absorption der Cyanoderivate wird bei 540nm bestimmt. Durch die Kombination der verschiedenen Reaktanten alkalisches Ferricyanid und Cyanid in einem einzigen Reagenz wurde diese Methode noch weiter vereinfacht. Diese sog. Drabkins-Lösung reagiert mit allen Formen von Hämoglobin außer Sulfhämoglobin, einem Pigment, das normalerweise nur in sehr geringen Konzentrationen in Blut vorkommt. Die Methode basiert auf der Oxidation von Hämoglobin und seinen Derivaten zu Methämoglobin in Anwesenheit von basischem Kaliumferricyanid. Methämoglobin reagiert mit Kalium- cyanid und bildet Cyan-methämoglobin, welches ein Absorptionsmaximum bei 540nm aufweist. Die Farbintensität, die bei 540nm gemessen wird, ist proportional zur totalen Hämoglobinkonzentration .
Zur Hämoglobin-Quantifizierung mittels des Drabkin-Assays wurden 20 μL der Vollblutspende bzw. des zentrifugierten Überstandes mit 5 mL Drabkins-Reagenz versetzt und für 15 min bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden die Proben bei 540nm im Photometer vermessen. Zur Erstellung der Kalibrierungsfunktion diente wieder das Standard-Hämoglobin aus Rinderblut (Fig. 3) . 1.4 Zusatz verschiedener Lösungsmittel und ionischer Flüssigkeiten zum Erythrozyten-Konzentrat
Dem Blut wurden verschiedene Lösungsmittel und ionische Flüssigkeiten (0,1g) (1,5g) in Eppendorf-Gefäßen zugesetzt. Die Inkubation der Ansätze erfolgte bei unterschiedlichen Temperaturen im Thermomixer (mit oder ohne Schütteln bei lOOOrpm) , über verschiedene Zeiträume. Zusätzlich wurde ein Ansatz mitgeführt, zu welchem kein Additiv zugesetzt wurde. Die Analyse der Proben auf den extrazellulären Hämoglobin-Gehalt erfolgte nach den beiden oben beschriebenen Methoden zur Hämoglobin-Bestimmung. Hierzu wurden die Ansätze zweifach bei 14 000 rpm zentrifugiert (entspricht ca. 14 000 g, EppendorfZentrifuge, 10s) und der Hämoglobin-Gehalt im Überstand durch die Kalibrierungsfunktion berechnet. Bei Untersuchung durch den Drabkins Hämoglobin-Assay wurde neben der Quantifizierung der Hämoglobin- Konzentration im Überstand auch die insgesamt in der Vollblutspende vorhandene Hämoglobin-Konzentration bestimmt, so dass der prozentuale Anteil des freigesetzten Hämoglobins festgestellt werden konnte.
2 Ergebnisse
2.1 Stabilität von Erythrozyten-Konzentraten und Vollblutspenden
Klassische Vollblutspenden (l,5mL in Eppendorf-Gefäßen in CPD- Puffer) wurden bei 40C im Kühlschrank bzw. bei 25°C im Wasserbad gelagert und täglich eine Probe entnommen, um den Fortgang der Hämolyse zu untersuchen. Die Proben wurden zentrifugiert und der Überstand mittels der photometrischen Messung des Häms bei 405nm und der Durchführung des Drabkin' s Hämoglobin-Bestimmungsassays auf die freigesetzte Konzentration von Hämoglobin und somit die Stabilität der Erythrozytenmembran untersucht. Der Verlauf der Hämoglobin-Freisetzung ist in Fig. 4 dargestellt.
Die graphische Darstellung verdeutlicht, dass die Freisetzung von Hämoglobin aus den Erythrozyten bei 25°C im Vergleich zur Hämolyse bei 40C stark beschleunigt ist. Nach einer Lagerzeit von 17 Tagen bei 250C beträgt die Konzentration des extrazellulären Hämoglobins bereits ca. 23 mg/mL, während nach einer Lagerung über den gleichen Zeitraum bei 40C nur 0,5 mg/mL freies Hämoglobin nachgewiesen werden können. Wird der prozentuale Anteil des freigesetzten Hämoglobins im Verhältnis zum Gesamt-Hämoglobin dargestellt, so wird deutlich, dass nach ca. 3 Wochen Lagerzeit im Kühlschrank bei 40C der Anteil des freigesetzten Hämoglobins in Bezug auf das Gesamthämoglobin bei 0,6 % (1,2 mg/mL) liegt. Wird die Vollblutspende jedoch bei 250C gelagert, so steigt die Hämolyserate dramatisch an und es sind nach 20 Tagen bereits 14 % des Gesamthämoglobins im Überstand nachzuweisen (Fig. 5) . Das Absenken der Temperatur für die Lagerung von Vollblutspenden führt zu einer Verlangsamung des Stoffwechsels einschließlich der Alterungsprozesse der konservierten Zellen. Eine Minderung der Temperatur von 370C auf 40C beispielsweise verursacht eine Verringerung der Stoffwechselrate auf 1/20 bis 1/30. Nach Studien von Bartel et al. (1974) sowie Ruddell et al. (1998) entspricht eine eintägige Lagerung menschlicher Blutkonserven bei 25°C etwa der sieben- bis zehntägigen Lagerung bei einer Temperatur von 40C. Dementsprechend muss für die Lagerung und den Transport von klassischen Vollblutspenden oder Erythrozyten-Konzentraten eine strenge Kühlkette eingehalten werden. 2.2 Zusatz verschiedener ionischer Flüssigkeiten
Das Ziel der Versuche lag in der Untersuchung des potentiellen Einsatzes ionischer Flüssigkeiten zur Aufrechterhaltung von Lebensfähigkeit und Funktionalität von Erythrocyten. In Abhängigkeit von der gebräuchlicherweise verwendeten additiven Lösung beträgt die maximale Lagerungsfähigkeit bei 40C für Erythrozyten- Konzentrate bis zu 49 Tage. Der Anteil des extrazellulären Hämoglobins am Gesamthämoglobin stellt als Indikator für die Hämolyse ein wichtiges Kriterium für die Haltbarkeit dar.
Durch den Zusatz von ionischen Flüssigkeiten zu den Erythrozyten- Konzentraten bzw. Vollblutspenden soll untersucht werden, ob diese eine stabilisierende Wirkung auf die Zellen haben und somit die Hämolyse-Rate herabgesetzt werden kann.
In einem ersten Screening zur Untersuchung der Auswirkung des Zusatzes ionischer Flüssigkeiten (Ils) wurden den Vollblutspenden 6 % (v/v) der verschiedenen ILs zugesetzt. Zum Einsatz kamen dabei ionische Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Kationen und Anio- nen. Die Grundkörper der gängigsten Kationen sind in Fig. 6 dargestellt .
Die verwendeten ionischen Flüssigkeiten enthielten unterschiedliche substituierte Imidazolium-, Ammonium- und Pyridinium-Katio- nen mit verschiedenen Anionen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Untersuchte ionische Flüssigkeiten
Ionische Flüssigkeit Abkürzung Bezeichnung
1, 3-Dimethylimidazolium methyl Sulfate [MMIM] [MeSO4] l-Ethyl-3-methylimidazolium bromide [EMIM] [Br] l-Butyl-3-methylimidazolium Chloride [BMIM] [Cl] l-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborat [BMIM] [BF4] l-Butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphat [BMIM] [PF6] l-Butyl-3-methylimidazolium
[BMIM] [BTA] bis ( trifluorosulfonyl) imide l-Butyl-3-methylimidazolium
Ecoeng4 :1M diethyleneglycolmonomethylethersulfate
Ecoeng 418/ l-Butyl-3-methylimidazolium n-octyl Sulfate
[BMIM] [OcSO4] l-Methyl-3-pentylimidazolium tetrafluoroborate [PMIM] [BF4] l-Hexyl-3-methylimidazolium chlorid [HMIM] [Cl] l-Hexyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphat [HMIM] [PF6] l-Hexyl-3-methylimidazolium
[HMIM] [BTA] bis ( trifluorosulfonyl) imide l-Methyl-3-octylimidazolium Chloride [OMIM] [Cl] N, N-Dimethylethanolammonium acetate [Me2NEt ] [Ac]
[Et2NBu]
N-Butyldiethanolammonium methanesulfonate
[MeSO4]
Trioctylmethylammonium
[Oc3NMe ] [BTA] bis (trifluoromethylsulfonyl) imide
3-Methyl-l-octylpyridinium tetrafluoroborate [3-MOP] [BF4] l-Butyl-4-methylpyridinium
[MBP] [ BTA] bis ( trifluorosulfonyl) imide
AmmoenglOO AlOO
AmmoenglOl AlOl
Ammoengl02 A102
AmmoengllO AIlO
Ammoenglll AlIl
Ammoengl20 A120
Ammoengl30 A130
Ammoeng520 A520 l-Ethyl-3-methyl-imidazolium ethylsulfat [EMIM] [EtSO4] l-Ethyl-3-methyl-imidazolium
[EMIM] [TMS] trifluoromethanesulfonat
Ethylammonium nitrate [EtNH3] [NO3] l-Butyl-3-methyl-imidazolium dicyanamid [BMIM] [DCA]
1-Butyl-l-methyl-pyrrolidinium
[MBP] [BTA] bistrifluoromethylsulfonylimid
Butyl-trimethyl-ammonium
[Me3NBu] [BTA] bistrifluoromethylsulonylimid
2-Hydroxyethylammonium formiat [HAF]
[MePiBu3]
Triisobutylmethylphosphonium tosylat
[Tos]
Triethylsulfunoium bistrifluoromethylsulfonylimid [Et3S] [BTA] l-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate [OMIM] [BF4] N-Methyl-N-trioctylammonium- [Oc3NMe] [BTA] bis ( trifluoromethylsulfonyl) imide l-Ethyl-3-methylimidazolium Acetat [EMIM] [Ac]
1-butyl-l-methylpyrrolidinium [BMPL] [BTA] bis (trifluoromethylsulfonyl) imide l-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2- [EMIM] methoxethoxy) ethylensulfate [MeEtEtSO4]
Die Vollblutspenden wurden nach Zusatz der ionischen Flüssigkeiten für 10 min bei 25°C inkubiert und anschließend zen- trifugiert. Der Überstand wurde photometrisch auf die extrazelluläre Hämoglobin-Konzentration untersucht. Das Experiment wurde im zweifachen Ansatz durchgeführt und der Mittelwert dieser Messungen ist in Fig. 7 dargestellt.
Bereits nach einer Inkubationszeit von 10 min waren deutliche Unterschiede in der Hämolyse-Rate der Erythrozyten zu erkennen. Bereits mit bloßem Auge konnte anhand der rötlichen Färbung des Überstandes beobachtet werden, dass Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen ionischen Flüssigkeiten bestehen. Eine besonders geringe Hämolyse-Rate zeigte sich bei Zusatz der ionischen Flüssigkeiten Oc3NMe BTA, PMIM BF4 und HMIM PF6 (Extinktion 405nm) . Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Art des Kations oder Anions und der Wirkung ist schwer fassbar, allerdings scheint die Mischbarkeit der ionischen Flüssigkeiten mit Wasser einen Einfluss auf die Hämolyse der Erythrozyten zu haben. Die Untersuchungen gaben insgesamt einen Anhaltspunkt, welche der ionischen Flüssigkeiten am sinnvollsten zu weiteren Untersuchungen eingesetzt werden sollten. Neben den in Fig. 7 dargestellten ionischen Flüssigkeiten wurden zusätzlich auch die ionischen Flüssigkeiten der Ammoeng®-Serie (Solvent Innovation, Köln) untersucht, welche Kationen mit Ethylenglykol-Einheiten enthalten (Fig. 8). Die besten Ergebnisse wurden hier mit Ammoeng 130 erhalten. Beispielhaft wird die Formel von Ammoeng 100 wiedergegeben ( Formel I ) :
Figure imgf000031_0001
Anhand der oben dargestellten Ergebnisse wurde zunächst die ionische Flüssigkeit Oc3NMe BTA ausgewählt, um bei verschiedenen Temperaturen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten den Verlauf der Hämolyse des Erythrozyten-Konzentrates unter Zusatz dieser IL zu untersuchen (Fig. 9) . Zum Vergleich wurde zu einem Ansatz der Vollblutspenden das organische Lösungsmittel n-Decan zugesetzt, welches nach Pfründer et al. (2004) aufgrund seines hohen logP- Wertes eine im Gegensatz zu anderen organischen Lösungsmitteln niedrige Zell-schädigende Wirkung besitzt. Die Membranintegrität von Lactobacillus kefir wurde mit n-Decan auf 52,7 % herabgesetzt .
Interessanterweise konnte in diesem Versuch festgestellt werden, dass die Inkubation bei 25°C für den Zusatz von Oc3NMe BTA einen positiveren Einfluss auf die Hämolyse hatte als die Inkubation bei 15°C. Bemerkenswert ist die geringe Hämolyse-Rate bei Verwendung der ionischen Flüssigkeit Oc3NMe BTA, welche deutlich niedriger war als nach Zusatz von n-Decan.
Um die Ergebnisse mit den von Pfründer et al. (2004) publizierten Daten vergleichen zu können, wurden in weiteren Versuchen verschiedene organische Lösungsmittel als Additive verwendet und die Auswirkung auf die Membranintegrität der Erythrozyten über die extrazelluläre Hämoglobin-Konzentration untersucht (Fig. 10). Wiederum wurden 6,25 % (v/v) der organischen Lösungsmittel zu den Konzentraten zugesetzt und die Ansätze bei 100C und 200C auf dem Thermoschüttler (1000 rpm) inkubiert. Durch die Untersuchung des Gesamthämoglobin-Gehaltes im Ansatz und der freien Hämoglobin- Konzentration im Überstand wurde der prozentuale Anteil des ex- tra-erythrozytären Hämoglobins über den Drabkins-Assay bestimmt.
Die Ergebnisse zur Auswirkung des Zusatzes verschiedener organischer Lösungsmittel zeigen, dass von allen organischen Lösungsmitteln eine mehr oder weniger starke Erythrozyten- schädigende Wirkung ausgeht. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Pründer et al. (2004) ist jedoch kein direkter Zusammenhang zwischen dem logP-Wert der organischen Lösungsmittel und dem Einfluss auf die Membranintegrität zu erkennen. Jedoch ist eindeutig, dass mit erhöhter Temperatur (200C) auch die Hämolyse- Rate der Erythrozyten zunimmt und dass das Lösungsmittel n-Decan die Vollblutspenden am wenigsten schädigt.
Zusätzlich wurden die ionischen Flüssigkeiten BMIM PF6, PMIM BF4, HMIM PF6, HMIM Cl und Oc3NMe BTA nach dem gleichen Schema wie die organischen Lösungsmittel als Zusatz zu den Vollblutspenden untersucht. In Fig. 11 wird der Verlauf der Hämoglobin-Freisetzung aus den Vollblutspenden über die Zeit dargestellt.
Die besten Ergebnisse wurden mit den ionischen Flüssigkeiten Oc3NMe BTA und HMIM PF6 erhalten. Für diese ionischen Flüssigkeiten war dabei wiederum festzustellen, dass die Hämolyse bei 200C stärker unterdrückt ist als bei 100C (Tabelle 2). Tabelle 2: Anteil des extra-erythrozytären Hämoglobins-Gehaltes in Anwesenheit verschiedener Zusätze zum EK
Zusatz Inkubation : Inkubation: 200C, 100C, 3h 3h
Anteil freies Anteil freies Hämoglobin Hämoglobin
[%] [%]
Organische MTBE 78,7 89,5 Lösungsmittel
Diisopro- 51,7 90, 1 pylether n-Octanol 95,7 95,1 n-Decan 1,4 4,3
Ionische Flüssigkeit BMIM PF6 9,4 14,5
PMIM BF4 28,0 23,7
HMIM PF6 3,6 3,1
HMIM Cl 60,4 76,8
Oc3NMe BTA 6,5 1,9
Zusätzlich wurde untersucht, ob der Einfluss der ionischen Flüssigkeit auf die Hämolyse der Erythrozyten auch eine Konzentrations-Abhängigkeit aufweist. Dementsprechend wurden die ionischen Flüssigkeiten HMIM PF6 und Oc3NMe BTA und das organische Lösungsmittel n-Decan ausgewählt und der Vollblutspende in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Nach einer Inkubation über 21h bei lOOOrpm und 200C wurde der prozentuale Anteil an extra-erythrozytärem Hämoglobin im Verhältnis zum Gesamthämoglobin bestimmt (Fig. 12) . Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Erythrozyten durch das Lösungsmittel n-Decan am stärksten geschädigt werden, während die Zugabe der ionischen Flüssigkeit HMIM PF6 die Zellen weniger schädigt als das organische Lösungsmittel. Für die ionische Flüssigkeit OcsNMe BTA konnte bei allen Konzentrationen eine vergleichbare oder geringere extra-erythrozytäre Hämoglobin-Konzentration festgestellt werden als in der unbehandelten Vollblutspende.
Die geringste Hämolyse konnte nach einem Zusatz von 38 % Oc3NMe BTA nach 21 h festgestellt werden. Während sich zu diesem Zeitpunkt in der unbehandelten Vollblutspende ca. 5 % freies Hämoglobin nachweisen lassen, sind im Ansatz mit 38 % Oc3NMe BTA nur 4 % extrazelluläres Hämoglobin vorhanden.
In einem Screening-Experiment wurde weiterhin der Einfluss des Zusatzes biokompatibler ionischer Flüssigkeiten auf die Form der Erythrozyten untersucht. Dafür wurden die Erythrozyten in einen Tropfen ionischer Flüssigkeit überführt und unter dem Mikroskop auf ihre Zellform untersucht. Fig. 13 zeigt die mikroskopischen Aufnahmen der Erythrozyten in Anwesenheit der verschiedenen ionischen Flüssigkeiten. Das erste Bild zeigt zum Vergleich die Lagerung der Erythrozyten in einer physiologischen Ringer-Lösung. Die Aufnahmen machen deutlich, dass einige der biokompatiblen ionischen Flüssigkeiten, wie z.B. 1-Butyl-l-methylpyrrolidinium bistrifluoromethylsulfonylimid, Triethylsulfonoium bistrifluoro- methylsulfonylimid und 2-Hydroxyethylammonium formiat die Zellform der Erythrozyten erhalten und somit für die Lagerung der Erythrozyten in Frage kommen.
Entsprechend den im Vorherigen durchgeführten Versuchen zur Untersuchung des Einflusses der ionischen Flüssigkeiten auf die Erythrozytenstabilität, wurden die Zellen unter Zugabe von jeweils 50OmM kompatibler Solute für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Aus Fig. 14 wird anhand der mikroskopischen Aufnahmen ersichtlich, dass die kompatiblen Solute Acetyl-L-Lysin, Betain und Ektoin einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung der Erythrozyten-Zellform haben.
In weiteren Experimenten wurde mit Standardverfahren die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) aus Erythrozyten untersucht. Hierdurch kann ähnlich wie bei der Messung des freien Hämoglobins sehr sensitiv eine Zellmembranschädigung detektiert werden.
Abb. 15. zeigt die geringere LDH-Freisetzung bei Zugabe von BMIM- PF6, vor allem im Konzentrationsbereich von l%-20% Volumenanteilen zu Erythrozyten eines Erythrozytenkonzentrats, das vor dem Experiment mit Blutgruppengleichem Plasma im Verhältnis 40:60 (entspricht einem normalen Hämatokrit von 0,40) gemischt wurde, um ausreichend Überstand zur LDH-Bestimmung zu haben.
3. Stabilität von Zellen und Zelllinien
Das Ziel der weiteren Versuche lag in der Untersuchung des potentiellen Einsatzes ionischer Flüssigkeiten zur Aufrechterhaltung von Lebensfähigkeit und Funktionalität von undifferenzierten und differenzierten Zellen, die anders als Erythrozyten über einen Zellkern verfügen und mehr Zellfunktionen zeigen. Diese Zellfunktionen können Stoffwechsel, Energiegewinnung durch Mitochondrien sowie z.T. auch die Fähigkeit zur Zellteilung umfassen (keine abschließende Aufzählung). Die Lagerfähigkeit von Zellen ist sehr unterschiedlich. Während Stammzellen zumindest theoretisch unbegrenzt in Zellkultur gehalten werden können, haben beispielsweise Granulozyten nur eine kurze Lebensdauer von 1-2 Tagen. Granulozytenkonzentrate müssen deshalb sofort nach der Präparation aus dem Blut des Spenders transfundiert werden. Als maximale Lagerzeiten werden 6-24h angegeben. Leberzellen werden als kaum lagerbar angesehen. Lediglich in hochkomplexen Bioreaktorsystemen können sie für einige Tage am Leben gehalten werden. Viele, jedoch nicht alle Zellarten können aber bei sehr tiefen Temperaturen unter Zusatz von z.B. DMSO eingefroren werden und zumindest ein Teil der Zellen ist nach dem Auftauen rekultivierbar.
Zelllinien haben sich in der Wissenschaft bewährt, da sie einerseits gut charakterisierte Untersuchungsobjekte darstellen und andererseits unkompliziert zur Verfügung stehen, ohne dass eine Blut- oder Gewebespende erfolgen müsste.
Deshalb wurden in den Versuchen folgende Zelllinien stellvertretend als Modellzellen eingesetzt, alle genannten Zelllinien oder Zellgruppen können erfindungsgemäß vorteilhaft gelagert werden:
Tabelle 3 : Untersuchte Zellarten
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Durch den Zusatz von ionischen Flüssigkeiten zu den Zellen soll untersucht werden, ob die ILs eine stabilisierende Wirkung auf die Zellen haben und somit die Zell-Absterbe-Rate herabgesetzt werden kann.
Die verwendeten ionischen Flüssigkeiten enthielten unterschiedliche substituierte Imidazolium-, Ammonium- und Pyridinium-Katio- nen mit verschiedenen Anionen (Tabelle 1). Beispielartig werden Ergebnisse mit folgenden ILs gezeigt:
■ l-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate ( [OMIM] [BF4] ),
■ Dimethylethanolammoniumacetat ( [Me2NEt] [Ac] )
■ N-Methyl-N-trioctylammonium-bis ( trifluoromethylsulfonyl) - imide ( [Oc3NMe] [BTA] ) ,
■ l-Ethyl-3-methylimidazolium Acetat ( [EMIM] [Ac] ) ,
■ l-Ethyl-3-methylimidazolium 2 (2-methoxethoxy) ethylesulfate ( [EMIM] [MeEtEtSO4] ) .
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 0,5xl06/ml eingesät in 24 Well Platten (jeweils 500μl/well), mit unterschiedlichen Konzentrationen von ILs für verschieden Zeiten inkubiert. Anschließend wurde in den Zeilüberständen das zytosolische Enzym Laktatdehydrogenase (LDH) gemessen, das in praktisch allen Zellen vorkommt und eine Schädigung der Zellen sehr sensitiv anzeigt. Die in Tabelle 4 gezeigten LDH-Konzentrationen wurden nach Inkubation bei 370C unter Standard-Zellkulturbedingungen in einer 6%igen IL-Lösung in Zellkulturmedium erhoben. Die Ergebnisse zeigen eine deutlich bessere Zellstabilität in l-Methyl-3-octyl- imidazolium tetrafluoroborate und N-Methyl-N-trioctylammonium- bis (trifluoromethylsulfonyl) imide als bei Zusatz der anderen getesteten ILs. Die Verwendung dieser IL zur Lagerung von Zelllinien ist daher bevorzugt. Interessant und unerwartet sind dabei die deutlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen getesteten Zellen. Von Interesse ist ferner, dass z.B. C3A-Zellen in 10% FCS deutlich unempfindlicher sind als die sich vergleichsweise schnell teilenden Zellen in 15% FCS (Exp. 1 und 2). Differenzierte granulozytäre HL-60 waren deutlich empfindlicher als undifferenzierte Zellen (Exp. 3 und 4).
Tabelle 4 : Anteil des extrazellulären LDH-Gehaltes in Anwesenheit verschiedener Zusätze zu den zeilhaltigen Kulturen (U/l)
Experiment 1
Zellen lonic Liquids 30 min 60 min 120 min
C3A i-Methyl-3-octyl-imidazolium 15%FCS tetrafluoroborate
Dimethylethanolammoniumacetat 42 264 175
N-Methyl-N-trioctylammonium- bis(trifluoromethylsulfonyl)imide 41 60 61
EMIM Acetat 312 345 516
1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2- methoxethoxy)ethylensulfat 360 290 460
Figure imgf000039_0001
Experiment 3
Zellen lonic Liquids 60 min 120 min 180 min differen- 1-Methyl-3-octyl-imidazolium 5 5 n.d.
Figure imgf000040_0001
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Lagerung eukaryontischer Zellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einer Flüssigkeit gelagert werden, die 1% - 99% (V/V) ionische Flüssigkeit umfasst.
3. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen Blutzellen, Zellen einer Zelllinie oder Zellen in einem Zellverbund sind.
4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen Erythrozyten, Thrombozyten, Lymphozyten, Stammzellen oder Granulozyten sind.
5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bei einer Temperatur von 40C bis 37°C gelagert werden, insbesondere bei einer Temperatur von mehr als 4°C, insbesondere bei 200C bis 25°C.
6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit nicht mit Wasser mischbar ist.
7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit PMIM BF6, HMIM PF6, HMIM Cl, MBP BTA, Et3S BTA, HAF, Oc3NMe BTA oder OMIM BF4 ist.
8. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einer Flüssigkeit gelagert werden, die ferner kompatible Solute umfaßt.
9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vital sind.
10. Zusammensetzung, welche ionische Flüssigkeiten und eukar- yontische Zellen umfasst.
11. Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Herstellung eines Arzneimittels, welches eukaryontische Zellen umfasst, zur Transplantation oder Transfusion.
12. Arzneimittel, umfassend ionische Flüssigkeiten.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, welches ferner eukaryontische Zellen, insbesondere Erythrozyten, umfasst.
14. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Transplantation oder Transfusion.
15. Verfahren zur Lagerung und/oder Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen mit einer Flüssigkeit in Kontakt bringt, welche ionische Flüssigkeit umfasst.
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