KR101426804B1 - 혈소판 보존 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용한 혈소판 보존 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈소판을 보존하기 위한 보존 조성물, 이를 포함하는 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 장기간 보존하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈소판을 4주 이상 장기간 보존하기 위한 보존 조성물, 이를 포함하는 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법에 관한 것이다.

Description

혈소판 보존 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용한 혈소판 보존 방법{Platelet preserving composition, and kit for preserving platelet, and method for preserving platelet using the same}
본 발명은 혈소판을 보존하기 위한 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈소판을 활성화 상태로 유지하면서 혈소판을 장기간 보존할 수 있도록 하는 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법에 관한 것이다.
세계적으로 혈액 공급에 대한 관심이 계속적으로 증가되어 왔다. 그러나, 혈액 산물의 보관 안정성이 비교적 짧기 때문에, 농축된 적혈구 및 수혈을 위한 혈액 산물 등은 현재 대부분 보관 기간이 제한되고 있다. 상기 제한된 보관 기간이 지나면, 이들의 pH가 매우 낮아지며, 이와 함께 ATP의 수준도 급격히 낮아지고, 수혈 시 순환 수명이 매우 짧아지게 된다.
적혈구는 보통 35일간 보관이 가능하지만, 특히 혈소판의 경우 골수에서 생성되어 생체 내에서 약 7일간 생존하나 채혈 후에는 일반적으로 보관이 가능한 기간이 다른 혈액 산물보다 더욱 짧아서, 현재 상온의 교반기(shaking machine) 내에서 5일 정도의 보관만이 가능한 것으로 알려져 있다. 혈액에서 혈소판을 분리하는 데 걸리는 24-48시간을 빼면 실질적인 저장 수명은 3-4일에 불과하다. 따라서 혈액에서 채취한 혈소판 중 25%가 유효기간을 넘겨 버려지는 실정이다.
혈소판은 전체 혈액처럼 냉장 보관이 불가능하다. 혈소판은 일단 분리되면 매우 취약해져 냉장 보관할 경우 화학 변화가 일어나고 냉장된 혈소판을 환자에게 주입하면 우리 몸의 면역 세포 중 하나인 대식세포(macrophage)에 모두 잡아먹히기 때문이다.
적혈구 등 다른 혈액 산물에 비해 혈소판의 보관 안정성이 더욱 저하되는 이유 중 하나는 혈소판에는 미토콘드리아가 존재하므로 미토콘드리아에 의한 대사 작용이 계속적으로 일어나기 때문이다. 따라서, 혈소판은 보존 시간이 경과함에 따라 pH 저하와 함께 ATP 감소를 보이고 이와 함께 젖산의 생성이 수반되지만, 미토콘드리아에 의한 해당 작용 때문에 이러한 문제가 더욱 악화되는 경향이 있다.
혈소판은 말초 혈액 내에 존재하는 성분인 혈구의 일종으로 부착과 응집 과정을 통해 일차 지혈 기전을 담당하는 물질이다. 또한 혈소판은 혈소판 유래 성장인자(PDF-platelet derived growth factor)를 비롯한 많은 성장인자들을 생성한다.
나아가, 혈소판은 혈액 응고 기능에 핵심이 되는 혈액 성분으로, 화학 치료, 장기 이식과 관련된 치료, 그리고 심한 화상 치료 등을 받는 환자들에게서 감소되는 성분이다. 혈소판은 갑작스런 전염병의 발생, WMD 상황 및 자연 상황에서의 방사선 노출과 같은 응급 상황에서 가장 핵심적인 혈액 제품이다.
이러한 혈소판의 저장 또는 보존 기간을 늘리기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으나 현재까지는 일주일 이상의 보관은 불가능한 상태이다.
따라서, 장기간의 혈소판 보관이 가능하고 지속적으로 활성화 상태를 유지할 수 있다면, 상기와 같은 관련 성장 인자에 대한 연구 및 다양한 관련 산업에서 상업적으로 이용이 가능할 것이다.
이에 본 발명의 한 측면은 혈소판을 장기간 보존하기 위한 혈소판 보존 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 혈소판을 장기간 보존하기 위한 보존 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 보존 조성물 및 보존 키트를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 2가 양이온, 나트륨염, 비타민 B, 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 혈소판 보존 조성물이 제공된다.
상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 것이 바람직하다.
상기 2가 양이온은 Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 나트륨염은 염화나트륨(NaCl), 브롬화나트륨(NaBr) 및 불화나트륨(NaF)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 비타민 B는 비타민 B6(피리독신)인 것이 바람직하다.
상기 용매는 증류수인 것이 바람직하다.
상기 보존 조성물은 2가 양이온 0.4-0.7mg, 나트륨염 1-4 mg 비타민 B 2-6mg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 0.6cc가 되도록 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기와 같은 혈소판 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 혈소판 보존 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 획득하는 단계; 상기의 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37 ℃의 온도에서 보존하는 단계를 포함하는, 혈소판 보존 방법이 제공된다.
상기 보존은 28일 이상 유지될 수 있다.
상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 것이 바람직하다.
본 발명의 혈소판 보존 조성물, 보존 키트 및 혈소판 보존 방법을 이용하는 경우에는 적어도 4주 이상 장기간의 보존이 가능하고, 이러한 보존 기간 동안 지속적으로 혈소판의 활성화 상태를 유지할 수 있다. 따라서, 혈소판과 관련한 성장 인자의 연구 등과 같은 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1의 좌측 바이알은 본 발명의 보존 조성물을 함유한 것을 나타낸 것이고, 도 1의 우측 바이알은 본 발명의 보존 조성물에 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 주입한 보존 키트를 4주간 배양한 후를 나타낸 것이다.
도 2는 말초 혈액 시료를 주입한 본 발명의 보존 키트를 이용하여 28일간 혈소판을 보존한 후 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행하여 현미경 하에서 관찰한 결과이다(X400).
도 3은 CD61에 대한 면역조직화학 염색 결과를 현미경 하에서 관찰한 것이다(X400).
도 4는 vWF에 대한 면역조직화학 염색 결과를 현미경 하에서 관찰한 것이다(X400).
도 5는 본 발명의 보존 조성물에 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 주입한 보존 키트를 4주간 배양한 후의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다(X15000).
본 발명에 의하면 혈소판을 장기간 보존하기 위한 보존 조성물이 제공된다. 본 발명의 보존 조성물에 의하면 특히 혈소판을 활성화 상태로 유지하면서 장기간의 보존이 가능하다.
본 발명에 의하면 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 혈소판의 상태를 유지하면서 장기간의 보존이 가능하며, 상기 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자는 활성화 혈소판에서 특이적으로 확인될 수 있는 것이다.
상기 CD61은 혈소판 표면의 글리코프로테인(glycoprotein) IIIa와 관련이 있는 세포표시인자로서 혈소판의 표준(standard) 표시인자이며, 상기 vWF는 혈장 내 응고인자에 대한 수용체로써 혈소판이 활성화 상태를 유지하며 응집 기능을 수행할 있음을 나타내는 세포표시인자이다. 혈소판 보관에 있어서 가장 중요한 문제로서 혈소판의 보관 온도가 맞지 않으면 혈소판의 세포막 구조에 이상이 발생하여 응집 기능을 상실하게 되는데, 이러한 경우에는 vWF가 활성화되지 않는다.
본 발명에 있어서, "혈소판의 보존"이란 혈소판을 보관 및/또는 유지하는 것을 의미하며, 이들과 상호교환적으로 사용될 수 있는 것으로, 특히 혈소판을 활성화 상태로 보존하는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 보존 조성물은 2가 양이온, 나트륨염, 비타민 B, 에리스로포이에틴 및 용매를 포함한다.
본 발명에 있어서 사용될 수 있는 용매는 물이며, 바람직하게는 증류수이다.
상기 2가 양이온은 본 발명의 보존 조성물에 있어서 세포를 보호하고 항산화 효과를 부여하기 위해 고안된 성분으로서, Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Zn2 +인 것이다. 상기 2가 양이온은 황산구리, 황산마그네슘 황산아연 등과 같이 황산염, 구연산염 등 당해 기술 분야에 알려진 적절한 염의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, "1종 이상"이란 용어는 각 성분이 단독으로 사용되거나, 2종 이상의 성분이 조합으로 사용될 수 있음을 의미하는 것이다.
상기 2가 양이온은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 0.6cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 0.4 내지 0.7mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 0.5 내지 0.6 mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 2가 양이온이 0.4mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 항산화 효과가 불충분하여 세포 보호 측면에서 문제가 발생할 수 있으며, 0.7mg을 초과하여 포함되는 경우에는 세포 독성이 발생할 수 있는 우려가 있다.
본 발명에 포함된 상기 나트륨염은, 보존 조성물 내 전해질의 농도를 적절히 유지시키는 역할을 하는 것으로, 염화나트륨(NaCl), 브롬화나트륨(NaBr) 및 불화나트륨(NaF)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 염화나트륨인 것이 보다 바람직하다.
상기 나트륨염은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 0.6cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 1-4 mg 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 2-3 mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 나트륨염이 1mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 낮아지는 문제가 있으며, 4mg 을 초과하여 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 높아지는 문제가 있다. 삼투압이 상기와 같이 과도하게 낮아지거나 높아지는 경우에는 혈소판의 보존에 있어서 부적정인 영향을 미치며, 세포 독성을 일으키거나, 활성화 상태의 혈소판의 보존이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.
상기 비타민 B는 특히 비타민 B6(피리독신)인 것이 바람직하며, 상기 비타민 B는 보존 조성물에 있어서 항산화작용을 통해 혈소판 보존 조성물을 안정적으로 유지시켜 세포를 보호하는 역할을 하는 것이다.
상기 비타민 B는 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 0.6cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 2-6mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 3-5mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 비타민 B6가 2mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 항산화 효과가 불충분하여 보존 조성물의 안정성 유지에 문제가 있으며, 6mg를 초과하여 포함되는 경우에는 세포독성이 발생할 우려가 있다.
상기 에리스로포이에틴은 자극을 부여하여 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호를 전달하는 역할을 하는 것으로, 바람직하게는 유전자 재조합 에리스로포이에틴을 사용할 수 있다.
상기 에리스로포이에틴은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 0.6cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 350 -450 I.U의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 380 -420 I.U의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 에리스로포이에틴이 350 I.U 미만의 양으로 포함되는 경우에는 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 자극이 불충분하여 신호 전달이 저하되는 문제가 있으며, 450 I.U를 초과하여 포함되는 경우에는 과자극에 의한 응집이 발생하거나 또는 세포사멸이 발생할 우려가 있다.
본 발명의 보존 조성물은 가장 바람직하게는, 2가 양이온 0.4-0.7mg, 나트륨염 1-4 mg, 비타민 B 2-6mg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 용매를 전체 보존 조성물의 최종 부피가 0.6cc가 되도록 포함한다.
한편, 본 발명에 의하면, 혈소판을 보존하기 위한 보존 키트가 제공된다. 본 발명의 보존 키트는 상술한 본 발명의 보존 조성물이 함유된 밀폐 용기를 포함한다.
나아가, 상기 보존 키트는 내부 압력과 외부 압력이 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 보존 키트에 이용될 수 있는 용기는 멸균 처리된 밀폐 용기인 것이 바람직하고, 상기 용기의 재질은 특히 제한되는 것은 아니며, 혈소판의 보존에 적절한 어떠한 용기도 사용할 수 있으나, 유리인 것이 바람직하다. 다만, 보존 조성물을 안전하게 함유할 수 있는 당업계에 알려진 적절한 어떠한 다른 용기도 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 바이알(vial)을 이용한다.
상기 용기는 상기 본 발명의 보존 조성물을 전체 부피의 약 7/50 내지 9/50의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.
나아가, 본 발명에 의하면 혈소판을 장기간 보존하는 방법이 제공된다
본 발명의 방법은 상기 본 발명의 보존 조성물 및 보존 키트를 이용하며, 보다 상세하게는 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 획득하는 단계; 상기 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하는 단계를 포함한다.
혈소판의 보존을 위해 본 발명의 방법에 사용되는 보존 조성물 및 이를 포함하는 보존 키트는 상술한 바와 같다.
본 발명의 혈소판 보존 방법은, 보다 상세하게는, 먼저 인체로부터 획득한 혈액의 응고를 방지하기 위해 항응고제와 혼합한 후, 이를 원심분리하여 혈소판이 포함되어 있는 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 획득한다.
이 때 상기 혈액은 바람직하게는 인체의 말단으로부터 획득되는 말초 혈액인 것이 바람직하다. 상기 말초 혈액은 정맥으로부터 획득하는 것이 보다 바람직하며, 예를 들어 팔, 다리 등의 정맥으로부터 획득할 수 있다.
이 때 사용될 수 있는 항응고제는 소듐 시트레이트 및 헤파린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항응고제는 말초 혈액 100 중량부 당 9 내지 11 중량부의 비율로 혼합하고, 바람직하게는 약 10 중량부의 비율로 혼합하며, 말초 혈액 100 중량부 당 9 중량부 미만의 항응고제가 혼합되는 경우 항응고 효과가 충분하지 않을 수 있으며, 11 중량부를 초과하는 양의 항응고제가 혼합되는 경우 시트레이드 독성이 발생할 수 있는 문제가 있다.
혈액의 분리를 위한 상기 원심분리는 1500 내지 1700 rpm의 범위에서 20 내지 25 분 동안 수행되며, 1600 내지 1700 rpm의 범위에서 22 내지 24 분 동안 수행되는 것이 보다 바람직하다.
원심분리가 1500 rpm 미만에서 수행되거나 20 분 미만으로 수행되는 경우 원심분리가 불충분하게 수행되는 문제가 있으며, 1700 rpm을 초과하여 수행되거나 25 분을 초과하여 수행되는 경우에는 세포가 손상될 우려가 있다.
원심분리가 완료되면 혈액은 네 층으로 분리된다. 가장 아래층은 약 45-50%를 차지하며 적혈구(Red blood cells)로 이루어진 층이고, 그 윗층은 약 1%를 차지하며 백혈구(White blood cells)를 포함하는 층으로서 '버피 코트(Buffy coat)'라고 불리는 층이고, 그 상부에 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma)층 및 혈장층이 순차적으로 형성되며, 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma)층 및 혈장층은 전체의 약 49-54%를 차지한다.
상술한 본 발명의 보존 조성물을 함유하고 내부 압력이 외부압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 분리된 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma)층 및 혈장층을 주입한다. 상기 외부 압력은 상압을 의미하며, 압력의 조절 방법은 예를 들어 주사기 바늘을 패킹된 고무 마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사바늘을 제거하는 방식으로 이루어질 수 있으나 이러한 방법에 특히 제한되는 것은 아니다.
후속적으로 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma)층 및 혈장층을 주입한 상기 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하며, 보다 바람직하게는 약 36℃의 온도에서 보존한다. 35℃미만에서 보존되는 경우에는 혈소판 전구세포의 분열이 저하되고 보존 조성물 내 혈소판 보존 효율이 저하되는 문제가 있고, 37℃를 초과하여 수행되는 경우에는 세포 열 손상이 발생할 우려가 있다.
본 발명에 따른 혈소판 보존 방법에 의하면, 적어도 28일까지, 즉 4주 이상의 기간 동안 혈소판을 활성화 상태로 보존할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 혈소판 보존 조성물을 포함하는 보존 키트의 제조
정맥으로부터 추출한 혈액 90cc를 응고 방지를 위해 9cc의 시트레이트 완충제(100cc 시트레이트 완충제 내에는 2.45g 덱스트로즈, 2.2g 소듐 시트레이트, 730mg 시트르산을 포함)(Fenwal)와 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액을 1670 rpm에서 24분 동안 원심분리하여 분리된 혈액으로부터 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 피펫으로 채취하여 50cc 용량의 밀폐 유리병인 보존 키트에 주입하였다.
상기 혈액를 원심분리하여 얻은 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장에 대하여 상기 배양 키트에는 하기 표 1과 같은 성분을 포함하는 배양 조성물이 함유되어 있고, 여기에 용매로서 증류수(Distiled water)를 전체 조성물의 최종 부피가 0.6cc가 되도록 추가하였다.
실시예 1
염화나트륨 2.556mg
피리독신 4mg
황산아연 0.528mg
h-에리스로포이에틴 400 I.U
상기 밀폐 유리병으로부터 27 게이지 주사기를 이용하여 패킹된 고무마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사기를 제거하여 유리병 내외의 압력이 동일하도록 하였다.
2. 혈소판의 보존 과정
지원자로부터 혈액을 채취하여 1.에서 제조된 바와 같은 보존 키트를 구성하여 28일 동안 저온 배양기에서 보관하였으며, 보관 온도는 섭씨 36℃로 하였다.
3. 혈소판의 보존 결과 확인
(1) 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색
28일간의 보존 후 보존 키트 내에 포함된 시료를 시린지에 의해 흡입하여 10mL의 시험 튜브에 배치하고, 그 후 각각의 튜브를 3000rpm으로 10분간 실온에서 원심분리한 후 밑에 가라앉아 분리된 세포 성분(pellet)을 채취하여 파라핀에 넣어 10% 포르말린 용액에서 고정시켰다. 파라핀-포매 세포 블록을 형성한 후, 헤마톡실린-에오진 염색의 수행을 위해 각 시료의 박편을 만들고 면역조직화학 염색처리를 하였다.
CD61 및 vWF(von Willebrand factor)에 대한 면역 염색은 수동적으로 수행하였고, Dako Catalyzed Signal Amplification System (Dako)를 적용하였다. 탈파라핀화(deparaffinization) 및 내인성 퍼옥시다제 활성의 차단(blocking) 후 박편을 단백질 차단 용액(protein block solution)으로 5분 동안 처리하고, 항체(CD61 및 vWF(von Willebrand factor))로 20분간 처리하였다.
상기와 같이 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행한 후 현미경 하에서 관찰하였고(X400), 이에 따른 결과를 도 2에 나타내었다.
혈소판의 존재를 확인하기 위한 면역형광검사의 항체목록은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor)으로서, CD61 및 vWF을 이용하는 경우 활성화 상태의 혈소판을 확인할 수 있다.
본 실험에 사용된 면역조직화학 염색의 마커는 하기 표 2와 같다.
항체 제조사 희석 비율 전처리
CD61 DAKO 1:750 오토프로테이제(Autoprotease)
vWF DAKO 1:10 오토프로테이제(Autoprotease)
도 3은 CD61에 대한 면역조직화학 염색 결과를 현미경 하에서 관찰한 것이고(X400), 도 4는 vWF에 대한 면역조직화학 염색 결과를 현미경 하에서 관찰한 것이다(X400).
(2) 전자현미경에 의한 확인
본 발명에 의한 혈소판 보존 조성물을 이용하는 경우 형태학적 관찰을 통해 혈소판의 생존을 보다 명확히 확인하기 위하여 전자현미경에 의한 확인을 실시하였다.
전자현미경에 대한 시료는 상기 1.에서 제조된 바와 같은 보존 키트를 구성하여 상기 2.의 보존 과정과 같이 섭씨 36℃에서 28일 동안 저온 배양기에서 보관한 후 보존 키트 내에 포함된 시료에서 획득한 혈소판에 0.1M 소듐카코딜레이트 완충제(sodium cacodylate buffer)(pH7.2)로 조성된 2.5% 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 상온(약 25℃)에서 4시간 동안 전고정 하고 1% 4산화 오스뮴(osmium tetroxide)으로 후고정 한 후 알코올로 탈수시키고 에폭시 수지에 포매하여 열중합하였다.
제작된 블록은 초박절기(Reichert Ultracut E)를 이용하여 60~70 nm 두께로 절편을 만든 후 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 시트르산납(lead citrate)으로 염색한 다음, 전자현미경(JEM-1200EX II)을 이용하여 15000 배의 배율에서 관찰하였고, 그 결과 획득한 전자현미경 사진을 도 5에 나타내었다. 상기 전자현미경 사진은 연세대학교 원주의과대학 부속 전자현미경실에서 촬영하였다.
혈소판의 생존은 통상적으로 두 가지 기준에 근거하여 판단하는데, 첫 번째는 세포막(cell membrance)의 이중막이 잘 유지되는지 여부(bilayer integrity)이며, 두 번째는 세포 소기관(intracellular organelle)이 잘 유지되는지 여부이다.
본 발명의 경우 도 5의 전자현미경 사진에 나타난 바와 같이 세포막의 이중막이 잘 보존되어 있으며, 나아가 세포 내 소포(vesicle)와 소포막(vesicle membrane)이 잘 보존되어 있는 것을 확인할 수 있고, 이러한 결과는 혈소판의 생존을 보다 명확히 증명하는 것이다.
(3) 소결
도 2 내지 5를 참고하면, 본 발명을 이용하여 28일간 혈소판을 보관한 결과 활성 상태의 혈소판이 다량 유지되고 있음이 확인되었고, 이들은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor)에 대해 모두 강한 면역 반응성을 나타내었다.
상기 실험 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 혈소판 보존 조성물, 보존 키트 및 방법을 이용하여 혈소판을 보존하는 경우에는 28일까지 활성 혈소판을 보존할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 본 발명의 보존 조성물, 키트 및 방법을 이용하는 경우 4주 이상의 장기간 동안 혈소판을 활성 상태로 보존할 수 있는 것을 입증하는 것이다.

Claims (11)

  1. 염화나트륨(NaCl) 및 브롬화나트륨(NaBr)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 나트륨염, Zn2+, 비타민 B6(피리독신), 에리스로포이에틴, 및 증류수를 포함하는, 혈소판 보존 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인, 혈소판 보존 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 보존 조성물은 Zn2+ 0.4-0.7mg, 상기 나트륨염 1-4 mg, 비타민 B6(피리독신) 2-6mg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 증류수를 전체 조성물의 최종 부피가 0.6cc가 되도록 포함하는, 혈소판 보존 조성물.
  8. 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항의 혈소판 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 혈소판 보존 키트.
  9. 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 획득하는 단계;
    제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항의 혈소판 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장을 주입하는 단계; 및
    상기 혈소판 풍부혈장(platelets rich plasma) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하는 단계
    를 포함하는, 혈소판 보존 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 보존은 28일이상 유지되는, 혈소판 보존 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인, 혈소판 보존 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100253819B1 (ko) 1992-09-30 2000-07-01 요시다 쇼지 혈액 보존제 및 혈액 보존 방법
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100253819B1 (ko) 1992-09-30 2000-07-01 요시다 쇼지 혈액 보존제 및 혈액 보존 방법
KR20060019525A (ko) * 2003-05-09 2006-03-03 라이프블러드 메디컬 인코포레이티드 장기와 세포의 생존능을 유지하기 위한 조성물
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