KR20060019525A

KR20060019525A - 장기와 세포의 생존능을 유지하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20060019525A
Application number: KR1020057021228A
Authority: KR
Inventors: 조세프 피셔; 잰 베이커; 로버트 지. 엘. 쇼르
Original assignee: 라이프블러드 메디컬 인코포레이티드
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2004-05-07
Publication date: 2006-03-03
Also published as: EP1623021A1; US7537885B2; JP2007524368A; CA2523417A1; EP1624750A2; MXPA05012070A; AU2004239310B2; AU2004236402A1; CA2526933C; US7220538B2; JP2007502130A; WO2004101758A3; RU2005138320A; US20050037330A1; EP1475434A1; CN1784142A; CN1816617B; EP1624750B1; WO2004101758A2; JP4870551B2

Abstract

본 발명은 정상적인 생리적 환경에서 분리한 장기, 조직과 세포의 생존능을 유지하는 데에 필요한 나노 입자 조성물에 대한 것이다. 콩팥과 같은 장기를 생체 내외에서 저장하는 방법과 상기 나노 입자 조성물을 포함하는 조성물 또한 개시한다.

Description

장기와 세포의 생존능을 유지하기 위한 조성물{Composition for maintaining organ and cell viability}

[1] 본 발명은 장기, 조직, 세포의 장기 보존, 특히 장기 이식을 위하여 기증한 장기의 보존을 위한 조성물에 대한 것이며 또한 이를 제조하고 사용하는 방법에 대한 것이다.

관련 출원에 대한 교차 참조

[2] 이 출원은 2003년 5월 9일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 60/469,200호의 우선권 이익을 주장하며, 이 가출원은 본 명세서에서 참조문헌으로 개시되어 있다.

[3] 장기이식 의학의 발전에 따라 기증자로부터 생존능을 갖춘 장기, 조직, 세포를 얻으려는 수요가 늘어났다. 조직과 혈액형의 일치에 대한 엄격한 요건과 기증자의 수가 한정되어 있다는 것을 감안할 때, 생명을 연장하는 장기 이식을 기다리고 있는 환자의 수보다 얻을 수 있는 심장, 간, 허파, 콩팥 등의 수가 훨씬 적은 것이 일반적이다. 따라서 기증 장기의 한정된 공급량을 최적화하는 일에 대한 필요성은 계속 남아 있다. 선행기술상으로 기증 장기의 유용성을 최대화하는 방법 중 하나 는 장기 기증 후 보존 방법을 개선하는 것이다.

[4] 일반적으로 현재 기증 장기 보존 방식은 정상 혈류로부터 떼어낸 장기에 대하여 생체내와 유사한 생리적인 상태를 재구성하려고 꾀하지 않는다. 대신에 현행 보존 방식은 저온(20℃ 이하, 전형적으로는 약 4℃)과 삼투압적으로 중성인 결정성(crystalloid) 용액에 저장하는 방식을 이용하고 있다. 심장 보존용으로 가장 자주 쓰이는 보존 용액은 위스콘신 대학교 보존액(UW), 세인트 토마스(St. Thomas) 보존액과 스탠포드 대학교 보존액(SU)이다.

[5] 정상적인 영양 공급원, 예를 들어 살아 있는 동물이나 사람의 혈액 순환으로부터 떼어낸 장기의 생존능을 보존하기 위한 상기 방법과 다른 방법들은 그 장기를 접촉하거나 관류하는 지원 용액이 pH 완충, 삼투압 균형 및/또는 몇 가지 최소 영양분 지원, 예를 들어 포도당과 한정된 다른 기본 영양분의 형태로 제공하는 지원 기능에 의존하게 된다. 이러한 방식은 장기 온도를 물의 어는점 바로 위까지 내리는 조치와 함께 시행하는 것이 전형적이다. 이는 그 장기 조직의 신진대사율을 떨어뜨려, 영양분의 소비와 노폐물의 생산을 줄이기 위해서이다. 선행기술로 공지된 이러한 보존 용액에는, 예를 들어, 등장성(isontonic) 식염수가 속하는데, 이 식염수는 염류, 당류, 삼투압 제제, 국부 마취제, 완충 용액과 기타 성분을 다양한 비율로 가질 수 있다. 식염수 기타 성분에 대해서 기술한 것들을 단순히 예시하자면, Berdyaev 등의 미국 특허 5,432,053호, Belzer 외 특허문헌과 그 제품인 ViaSpan®을 기술한 미국 특허 4,798,824호와 4,879,289호, 4,873,230호가 있고 Taylor의 미국 특허 5,405,742호, Dohi 등의 미국 특허 5,565,317호, Stern 등의 5,370,989호와 5,552,267호가 있다. ViaSpan®의 제품 데이터 설명서에서는 이 제품을 장기의 저온 관류와 저장을 위한 멸균, 비발열성 용액으로 기술하고 있다. 이 용액은 320mOsM의 몰랄 삼투압 효과를 지니며, 나트륨 농도가 29mEq/L, 칼륨 농도는 125mEq/L, 그리고 pH 7.4이다.

[6] 피루브산, 세포막 전위를 유지하는 무기 염류와 알부민 또는 송아지 태아 혈청(fetal calf serum)을 함유하는 보존 용액은 미국 특허 5,066,578호에서 기술하고 있으며, 미국 특허 6,495,532와 6,004,579호에서는 하나나 여러 종의 포스파티드(phosphatidic)산 또는 당류와 리소포스파티드(lysophosphatidic)산 또는 당류를 달걀 흰자위 등의 보존력 향상제(enhancer)와 함께 갖춘 조성물에 대하여 기술하고 있는데, 이 조성물을 추가적으로 리포솜 형태로 전달하는 것을 선택할 수도 있다.

[7] 이러한 방식으로 장기의 저장과 수송을 저온하에서 수행하는 데에는 시간적인 한계가 있다. 계속되는 기증 장기의 부족 현상을 감안할 때, 장기 이식 전까지 장기의 저장과 수송 시간을 늘려야 한다는 필요성은 오래전부터 지금까지도 여전히 지속되었다. 장기 이식 전까지의 저장 시간이 짧아지는 것은 저온 저장 동안 일어나는 장기의 손상과 그에 이어 온도가 올라가고 이식받은 환자의 혈액으로 장기가 관류될 때 발생하는 조직 손상이 그 중요한 한 가지 원인이라는 가설이 제시된 바 있다.

[8] 이 문제에 대한 대책으로 다양한 인지질을 포함하는 리포솜 조성물을 사용하여 저장하는 동안 일어나는 세포 또는 조직의 세포자멸사(apoptosis)를 막는다는 주장이 제시된 바 있는데, 이는 예를 들어 미국 특허 6,004,579와 6,495,532호에 기재된 대로이다. 그러나 이러한 시도로는 바라는 목표인 저장 장기의 생존능과 수명의 개선에 성공하지 못하였다. 이러한 시도는 또한 조직에서 인지질의 흡수가 불필요하게 많이 일어나는 점 등의 몇 가지 결점을 안고 있다.

[9] 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 정상 혈액 순환이 오랜 동안 끊긴 장기, 조직, 그리고 심지어 세포를 산 채로 생체 내외에서 보존하는 능력을 향상시키고, 추가적으로 조직과 세포의 생존능을 더욱 잘 유지하기 위한 적절한 산소 운반체(carrier)까지 선택적으로 포함하는 조성물과 저장 방법에 대하여 해당 분야에서는 오랜 미해결 과제가 남아 있다.

[10] 본 발명의 하나의 실시양태에서, 세포 생존능을 유지하기 위해 2상 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 영양배지를 포함하는 1상 및 외부의 친지성 코팅과 내부의 친수성 핵을 갖는 나노입자를 포함하는 2상을 포함한다.

여기에서,

a) 1상은 생리학적으로 허용가능한 농도/양의 수용성 또는 분산된 영양소 및 생리학적 염을 포함한다.

b) 2상은 다음 중 하나 이상을 포함하는 나노입자 : 지질, 지방산, 스테로이드, 지방산, 선택적 세포성장인자 및

c) 2상 조성물은 약 300mOsM/kg 이상의 삼투압을 지닌다.

[11] 2상 조성물의 pH는 바람직하게는 약 7.2 내지 약 7.4이다. 그 내핵 부분은 또한 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 에이코사펜탠산, 도코사헥샌산 및 그 혼합물과 같은 지방산을 포함한다. 대안적으로, 친수성 내핵은 헴 단백질(heme protein)과 같이 산소에 결합하고 그 산소를 방출할 수 있는 부위를 갖춘 용액 또는 현탁액(suspension)을 포함할 수 있다. 더 나아가 다른 실시양태에서 , 친수성 내핵은 생물학적으로 활성인 모이어티, 예를 들어 약물 또는 다른 치료제를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 정상적인 신체 체액의 삼투압보다 더 높은 삼투압, 예를 들어 바람직하게는 약 300 이상, 보다 바람직하게는 약 385-425 mOsM/kg일 수 있다.

[12] 본 발명의 대안적인 실시양태에서, 헴 단백질이나 생물학적으로 활성이 있는 부위와 같이 산소에 결합하고 산소를 방출할 수 있는 부위를 포함하는 용액 또는 현탁액을 포함하는 친수성 내핵 및 외부의 친지성 코팅을 갖는 개별 나노입자-포함 조성물과 혼합된 상기 조성물(즉, 2상 조성물)을 포함하는 세 가지 상의 조성물을 제공한다.

[13] 더 나아가 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 2상과 3상 조성물을 준비하는 프로세스 및 생체 외에서 포유류의 조직 또는 기관을 보존하거나 유지하는 방법을 제공한다. 여기에서 조직이나 기관에 상기 조성물의 유효량을 투여한다.

[14] 따라서, 본 발명은 세포, 조직 및 기관을 생체 내, 생체 외 및/또는 시험관 내에서 보존/유지하기 위한 조성물 및 이러한 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 광의로, 본 발명의 조성물은 보조 및/또는 보존 영양소 및 세포, 조직 및/또는 기관이 생체 내외에서 非저체온(non-hypothermic) 범위, 예를 들어 섭씨 30 내지 37도의 온도에서 건강한 상태 또는 생존능을 유지하기 위한 다른 성분을 포함하도록 제형화된 리포좀 및/또는 나노입자를 포함하고 삽입한다. 본 발명의 조성물은 물론 당업계에서 통상적으로 사용되는 저체온 범위, 즉 섭씨 20도 이하에서 약 4도까지에서 사용할 수 있다. 보존된 기관/시료가 보관되는 온도에 상관없이 본 발명의 조성물은 선행 기술과 비교했을 때 향상된 결과를 제공한다. 본 발명의 2상 용액을 사용했을 때, 그러한 바람직한 결과가 관찰되면 적당한 산소 운반체 또는 선택적으로 바람직한 3상 조성물이 조성물의 일부분으로 포함되면 더 유리한 효과가 나타난다.

[15] 특정한 선택적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 산소 운반체, 예를 들어, 헴 모이어티를 포함하는 산소 운반체로 제형화된다. 바람직하게 이는 헤모글로빈 또는 헤모글로빈의 유도체이고 리포좀 및/또는 나노입자로 삽입된다. 당업계의 헤모글로빈 기반 산소 운반체의 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,674,528, 5,843,024, 5,895,810, 5,952,470, 5,955,581, 6,506,725, 6,150,507, 6,271,351에 기재되어 있고 각각의 문헌은 참고문헌으로 삽입된다. 포함되는 헤모글로빈 또는 산소 운반체의 양은 원하는 치료 결과를 수득하기에 유효한 양으로 기술된다. 이는 선택되는 조성물에 따라 다양하나 숙련자의 필요에 따라 가장 좋은 예로, 최종 용액의 약 0.01에서 10% 범위의 양일 수 있다.

[16] 본 발명은 또한 동물 또는 의학상 사망(clinical death)이 일어난 후, 그러나 기증을 위해 제거되기 전의 사람에서 조직이나 기관을 처리하거나 유지하는 방법을 포함한다. 생체내 및 생체외 둘 다에서 최적의 저장과 운송을 위한 삼투압 및 영양공급을 필요로 하는 임의의 기관은 본 발명의 조성물로부터 효과를 얻을 수 있다.

[17] 본 발명의 조성물의 관류(perfusion) 및/또는 접촉에 의해 보존되는 조직 및 기관은 다음을 포함한다: 신장, 간, 폐, 심장, 심장-폐 모두, 이자, 및 소화관, 혈관, 재분비 기관 및 조직 등.

[18] 본 발명은 또한 살아있는 동물 또는 지지요법(supportive treatment)이 필요한 사람의 치료를 위한 방법을 포함한다. 그러므로 단순히 실시예에 의해 본 발명의 조성물은 외상에 의해 급성으로 정상적인 혈액 순환 기관이 불가능한 조직을 위한 국소의 또는 전신의 순환관류보조(circulatory perfusion support), 예를 들어, 손상된 혈관이 수술로 치료될 때까지 부분적으로 손상된 사지 또는 유사한 상태를 지지하기 위한 본 발명의 조성물의 주입 또는 일시적인 순환에 유용하다.

[19] 더 나아가 본 발명은 수술(예를 들어 국소 혈액 순환이 아예 되지 않거나 순환은 되나 정상적이지 않을 때) 중 본래의 조직 및/또는 기관을 보존 및 보호하는 방법을 포함한다. 그러한 상황은 예를 들어 국소 또는 전신의 순환 중단을 필요로 하는 수술과정의 일부로 조직이나 기관의 관류를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 질병이나 사고로 손상된 해부학적 부위의 치료 중 또는 전에 사용될 수 있다고 여겨진다(예를 들어, 순환의 복구 전에 전체 또는 부분적으로 심각한 훼손된 손가락 또는 사지의 보존을 돕는데).

[20] 더 나아가 본 발명의 조성물은 살아있는 세포, 기관 및 다른 배양 기술이 기초 또는 응용 생물의학 연구 및/또는 진단과정(생체외에서 조직의 생존이 요구되는)에 필요한 연구에서 인간과 동물의 세포, 조직 및 기관을 보존하는데 사용된다고 여겨진다.

[21] 본문에 사용되는 “기관이라는 용어는 기관 자체” 예를 들어, 신장, 심장, 간 폐 및 기관의 기능부, 예를 들어, 피부조직, 동맥의 일부, 이식가능한 간엽, 신장, 폐 등을 일컫는다. “조직”이라는 용어는 집합체(aggregate) 형태(예를 들어, 기관의 작은 부분), 분산된 세포(골수세포와 후대세포, 혈액 유래 줄기세포와 후대세포를 포함하여 심근, 간 또는 신장으로부터 분산, 분리 및/또는 자란 세포)의 살아있는 세포 물질 및 달리 특정되지 않으면 다른 다양한 당업계 공지된 혈액 요소를 일컫는다.

[22] 본문에서 사용된 "나노입자"라는 용어는 이중 에멀젼 입자, 바람직하게는 친지성 외층과 친수성 핵을 가진 크기(직경) 약100nm에서 300nm이고 보다 바람직하게는 약 100nm에서 약 200nm인 입자로 정의된다.

[23] 더 나아가, 설명의 편의를 위한 단수 용어의 사용은 의미가 제한적이지는 않다. 그러므로 단순히 예시를 위하여 하나의 나노입자를 포함하는 조성물에 대한 참고문헌은 하나 이상의 나노입자를 포함하는 참고문헌을 포함한다. 예를 들어, 달리 언급되지 않는 한 의도한 목적을 달성하기에 충분한 나노입자의 준비에 대한 것이다.

본 발명의 조성물

[24] 광의로 그리고 본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 2가지 상을 포함한다: 수용성의 기본 영양 배지(base nutritive medium)와 이멀젼 입자(예를 들어, 리포솜 또는 나노입자들). 기본 영양 배지는 아미노산, 염, 미량원소, 비타민, 단순 탄수화물 등을 포함하는 다양한 성분의 혼합물을 포함한다. 이러한 기본 영양 배지는 더 나아가 완충용액, 항산화제, 혈장 부피 팽창제, 에너지 기질, 잔틴 산화효소 억제제 등을 포함할 수 있는 성분의 조합으로 수성의 배지에 첨가, 용해 또는 분산될 수 있다.

[25] 그러므로, 기본 영양 배지는 많은 영양소와 미네랄 성분을 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 정상 체조직에서 발견되는 것과 유사한 농도로 포함한다(이들 중 어떤 것은 천연의 것이 아닐 수도 있다). 예를 들어, 완충용액은 혈액 완충 시스템을 대체하기 위해 존재하고 덱스트란과 만노스는 혈액 단백질 등에 의해 부과되는 것 이상으로 삼투압을 증가시킨다. 글루타치온은 보호물질, 헤파린은 혈액응고를 감소시키고 이스톨라이트(Yeastolite)는 보조 비타민을 제공한다.

[26] 특정한 선택적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 더 나아가 하나 이상의 공지의 항미생물 제제, 예를 들어, 항생제, 항균제, 특이적인 항체 및/또는 기관, 조직 및/또는 세포에서 미생물 오염을 억제할 수 있는 다른 공지의 물질을 포함한다. 당업계에 가장 잘 알려진 항미생물제제가 참고되었고 상세하게는 Goodman & Gilman's, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 10th Edition, McGraw Hill이 본문에 참고문헌으로 삽입되었다(특히 Chapters 43-51이 관련되어 있음).

[27] 특정한 추가의 선택적인 실시양태에서, 본 발명자들은 더 나아가 다음 중 하나 이상을 포함한다:

기관 준비, 저장 및 이식시 응고나 피브린 생성을 억제하는 항응고제, 혈전용해 및 항혈소판 약제, 예를 들어, 헤파린 및 관련 글리고사미노글리칸; 디쿠마롤(dicumarol), 펜프로쿠몬(phenprocoumon), 아세노쿠마롤(acenocoumarol), 에틸 비스쿠마세테이트(ethyl biscoumacetate), 인단다이온(indandione) 및 그의 유도체, 아스피린 및 다이피리다몰 등. 비-스테로이드성 항염제 또한 선택적으로 특정 실시양태에 포함될 수 있다. 예를 들어, 염증 과정은 기관, 조직 또는 세포(예를 들어, 이식물)의 유효 보장 기간을 단축시키는 요인이라고 여겨진다. 상기 모든 제제는 참고문헌으로 삽입된 Goodman & Gilman's, Id.에 보다 상세히 기재되어 있다. 이러한 포함된 화합물의 양은 원하는 치료 결과를 달성하기 위한 유효량으로 기술된다. 이는 선택되는 조성물에 따라 그리고 당업계 숙련자의 필요에 따라 다양할 것이다. 그러나 가장 좋은 예는 최종 용액의 약 0.01 내지 약 10% 로 존재하는 것이다.

[28] 본 발명의 조성물의 2상은 세포막을 가로지르는 친지성 외층와 세포간에 운반되는 친수성 내층을 갖는 입자에 예를 들어, 지질, 지방산, 스테로이드 및 선택적으로 성장 인자 또는 혈관 내피 세포를 포함하는 다른 살아있는 세포의 생존에 필수적이라고 여겨지는 물질을 함유하는 액체-수성 이멀전을 포함한다.

[29] 정의되지 않은 단백질이나 동물 혈청이 없는 많은 상업적으로 이용가능한 세포 또는 조직 배양배지 제품이 기본 영양 배지 또는 본 발명의 조성물을 준비하기 위한 최초 물질로 사용될 수 있고 그러한 배지는 본 발명의 조성물의 특정 필수요소와 허용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 다음의 특징과 요소를 포함하고 이에 덧붙여 상기의 기본 세포 영양 배지를 포함한다:

세포내의 ATP 에너지 풀을 새로 채우고 관류와 보존과정에서 호기성 대사를 위한 에너지 기질;

자유 산화 라디칼로 인한 재관류를 줄이기 위한 항산화제 및/또는 잔틴 산화효소 억제제.

[30] 친지질성 외부 피막과 친수성 내핵을 갖는 지질 이멀전 또는 리포좀 성분 나노 입자는 지질 및/또는 스테롤 외부막과 필수 지방산 및 친수성 내핵을 포함한다. 친수성 내핵은 단백질-유도 성장인자 및 선택적으로 추가적인 성분 예를 들어 ATP 등을 포함한다.

[31] 특정의 선택적인 실시양태에서, 이러한 내핵은 적당한 산소 운반체 예를 들어 헴 단백질 또는 용액 또는 헴 단백질의 서스펜션 예를 들어 천연에서 유도된 헴, 선택적으로 돌연변이되었거나 화학적으로 변형되어 회수된 기관, 조직 및 세포에서 산소 포화 커브가 산소와 이산화탄소를 수송하고 운반하기에 효율적인 재조합 헴 및/또는 인공 수용성 헴 등 여러 가지 형태의 산소 운반체를 포함한다.

[32] 이와 반대로, 본 발명의 조성물은 가장 바람직한 실시양태에서 동물 혈청이나 정의되지 않은 단백질을 포함하지 않는다.

[33] 본 발명의 조성물이 어떻게 작용할 수 있을지에 대해 어떠한 이론이나 가설에 구애됨이 없이, 처리된 세포의 세포막과 접촉할 때, 소수성 외층이 세포막과 융합하여 본 발명의 나노입자의 친수성 핵이 이러한 세포에 의해 세포질로 들어가 생존능-증진 추가 에너지 화합물 및 필수 성장 인자를 전달하게 된다고 여겨지고 있다. 또한 정상 체액의 삼투압과 비교하여 증가된 삼투압이 세포의 팽창을 줄이고 혈관 세포의 온전한 상태의 보존을 용이하게 한다고 여겨지고 있다.

[34] 바람직한 실시양태에서, 기본 영양 배지는 생리학적으로 적합한 농도의 염, 수용성 비타민, 아미노산 및 뉴클레오티드를 포함한다. 이들은 단지 예일 뿐이지 이로 한정되지는 않는다. 아데노신과 그의 인산염, 유리딘(uridine)과 그의 인산염, 다른 뉴클레오티드 및 데옥시뉴클레오티드; 비타민 B 예를 들어, B1, B2, B6, B12, 바이오틴, 이노시톨, 콜린, 폴레이트 등; 비타민 조효소 및 보조인자 예를 들어, 니코틴아미드 및 플라빈 아데닌 다이누클레오타이드 및 그의 대표적인 인산염, 조효소 A 등; 다양한 생리학적 염 및 미량의 미네랄 예를 들어, 나트륨 염, 인, 마크네슘, 칼슘, 구리, 아연 및 철; 필수 아미노산, 자연에 존재하는 20가지 아미노산 및/또는 그의 유도체가 선택적으로 포함된다. 기본 영양 배지 또한 예를 들어 인산염 완충용액 및 HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 완충용액과 같은 pH 완충용액; 단순 글루코스 예를 들어, 글루코스; 삼투압 증가제, 예를 들어 임의의 적당한 덱스트란, 만노스 등; 선택적인 여러 성분, 알로푸리놀(allopurinol), 콘드로이틴, 코카복실라제(cocarboxylase), 생리학적 유기산, 예를 들어, 피루베이트 및 선택적으로, 천연물에서 추출한 영양분 예를 들어, 효모 비타민 추출물 .

[35] 하나의 대안적인 실시양태에서, 비타민 C(아스코르빈 산)는 선택적으로 생리학적 또는 생리학적 농도 이상으로 포함된다.

[36] 조성물의 2상은 리포좀 또는 친지성 외층과 친수성 핵을 가진 나노크기의 입자를 포함하는 지질-수성 이멀전이다. 일반적으로 2상은 외부의 친지성 외층을 형성하고 안정화시킬 수 있는 친지성 성분을 포함한다. 예를 들어, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 비타민 E, 대구 간유(cod liver oil) 등. 추가적인 성분은 리놀레산, 올레산 및 기능적 등가물을 포함하는 지질-기반 에너지원을 포함한다.

[37] 다른 바람직한 실시양태에서, 2상은 또한 하이드로코르티손, 티록신(thyroxine) 또는 그의 유도체 등과 같은 친수성 지지 내분비 인자(supportive endocrine factor)를 포함한다. 더 나아가 지지성분은 예를 들어 세포 성장인자(생리학적으로 허용가능한 양의 혈관 내피 성장인자, 혈소판 유도 내피 성장인자, 상피 성장인자, 간세포 성장인자, 혈소판 유도 내피 성장인자 등을 포함하는 상피 및 내피 성장인자)를 포함할 수 있다. 선택적으로 다른 인자들은 프로스타글란딘(예: 프로스타글란딘 E1)과 같은 세포간 전단물질을 포함하는 2상에 포함되는 것으로 여겨진다. 바람직하게, 생리학적으로 허용가능한 계면활성제 및 분산제(detergent) 또한 포함된다(예: 하나 이상의 수용성 분산제, 바람직하게는 몇 천 달톤의 분자량을 같는 양친매성 블록 공중합체(block copolymer)(예: 폴리프로필렌산화물-폴리에틸렌 산화물(polypropylene oxide-polyethylene oxide) 블록 공중합체 계면활성제(예: Pluronic F-68; BASF社 및/또는 비이온성 계면활성제). 적합한 비이온성 계면활성제에는 예를 들어 소르비톨 에스테르의 폴리옥시에틸렌 유도체가 포함되는데, 그 예로서 TWEEN®(Atlas Chemical Co.)로 시판 중인 모노올레산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 계면활성제가 있다. TWEEN 80®이 특히 바람직하다. 본 발명의 2상 조성물의 핵 부분은 약학적으로 상당한 양의 포스파티드산(phosphatidic acid) 또는 당 또는 리소포스파티드산(lysophosphotidic acid) 또는 당을 포함하지 않는다.

본 발명의 조성물의 준비

[38] 본 발명의 조성물은 일반적으로 2단계 과정에 의해 생산된다. 첫 번째 단계는 최종 산물의 블록을 생성하는데 사용되는 필요한 성분의 특이적 조합을 준비하는 것이다. 첫 단계의 하나의 중요한 부분은 제 1상의 프리믹스(premix)를 준비하는 것으로 이는 상기 기본 영양 배지, 본문에서는 프리믹스-I이다. 이 첫 단계의 마무리 단계는 2상의 프리믹스를 준비하는 것으로 본문에선 프리믹스-II이며, 여기에선 원하는 성분이 프리믹스되어 물에 용해 및/또는 현탁된다. 프리믹스-II 조성물은 미세하게 나뉜 에멀젼(예: 상기 평균 직경이 약 100nm 에서 200nm인 나노입자 에멀젼)을 제공하기에 효과적인 조건하에서 microfluidizer 또는 장치와 같은 유사한 것을 통해 진행된다. 그 결과로 프리믹스-II를 기초로 제조된 에멀젼 조성물은 본 발명의 조성물의 생산을 완수하기위한 다양한 미량 영양소 및 다른 성분을 제공한다.

프리믹스 조성물의 준비

[39] 제형 I: 하기 표 1-4 는 제 1상, 여기서는 바람직한 성분 몇가지와 프리믹스 I 및 프리믹스 II로부터 만들어진 나노입자를 포함하는 2상을 포함하는 하나의 바람직한 실시양태에서 발견되는 성분들에 대한 무게 범위를 요약한 것이다. 표에 나타난 성분들은 모든 과정이 완료되었을 때 최종 조성물 1리터에 포함되는 바람직한 양이다. 성분들은 기관 보존 조성물이 하기 실시예에 의해 준비되는 방식대로 성분들을 그룹으로 나누기 위하여 설명의 편의를 위해 이러한 표로 분류되었다. 달리 표시되지 않는다면 아래 표에 나타난 모든 양은 최종 조성물, 즉 수성의 상과 에멀젼 상을 모두 포함하는 최종 조성물 1 리터당 그램(g)수이다.

[40]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
염산 아데닌	0.00019~0.00021
비타민 B-12	0.00065~0.0007
바이오틴	0.00000038~0.00000042
황산구리(II)	0.00000124~0.00000137
질산철(III)	0.000048~0.000053
황산철(III)	0.00048~0.00053
염산 푸트레신(putrescine HCl)	0.000077~0.000085
염산 피리독신 HCl	0.000029~0.000033
리보플라빈	0.00021~0.000231
티미딘	0.00035~0.00039
황산아연	0.00041~0.000454

[41]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
아데노신	0.950~1.050
5’모노인산아데노신	0.0019~0.0021
삼인산아데노신	0.0019~0.0021
알로푸리놀	0.133~0.147
인산 B-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드	0.038~0.042
B-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드	0.0019~0.0021
염화칼슘	0.152~0.168
염화콜린	0.0085~0.0094
황산콘드로이틴	0.0038~0.0042
코카르복실라제(cocarboxylase)	0.038~0.042
보효소 A(coenzyme A)	0.0095~0.00105
사이클로덱스트린	0.475~0.525
디옥시아데노신	0.038~0.042
디옥시시티딘	0.038~0.042
디옥시구아노신	0.038~0.042
덱스트란 70	33.25~36.75
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드	0.038~0.042
엽산(folic acid)	0.0026~0.0028
포도당	3.8~4.2
글루타티온	0.950~1.050
글리신	0.0179~0.0197

[42]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
헤파린	0.171~0.189
HEPES	3.396~3.753
하이포크산틴	0.002~0.0022
이노시톨	0.0124~0.0137
인슐린	0.0095~0.0105
L-알라닌	0.00428~0.00473
L-아르기닌	0.141~0.155
L-아스파라긴	0.0076~0.0084
L-아스파르트산	0.064~0.070
L-시스테인	0.0297~0.0329
L-시스틴(cystine)	0.0167~0.0185
L-글루탐산	0.007~0.0078
L-글루타민	4.750~5.250
L-히스티딘	0.030~0.033
L-아이소류신	0.052~0.0572
L-류신	0.057~0.063
L-리신	0.0095~0.0105
L-메티오닌	0.019~0.021
L-페닐알라닌	0.0337~0.0373
L-프롤린	0.0164~0.0182
L-세린	0.025~0.0276
L-트레오닌	0.051~0.056

[43]

성분명	조성 비율의 범위 (g/L 또는 명시된 단위)
L-트립토판	0.009~0.0095
L-티로신	0.053~0.059
L-발린	0.050~0.055
염화마그네슘	0.058~0.0643
황산마그네슘	0.0475~0.0525
만노스	3.135~3.465
니아신아미드(niacinamide)	0.0019~0.0021
판토텐산(pantothenic acid)	0.0021~0.0024
염화칼륨	0.296~0.328
염산 피리독살	0.0019~0.0021
피루브산	0.209~0.231
탄산수소나트륨	1.140~1.260
염화나트륨	6.650~7.350
제2인산나트륨(dibasic)	0.0676~0.0748
제1인산나트륨(monobasic)	0.0516~0.0570
티아민	0.0021~0.0023
트랜스페린(transferrin)	0.00475~0.00525
유리딘(uridine)	0.038~0.042
삼인산유리딘	0.038~0.042
글루타티온	0.950~1.050
초여과 이스톨레이트 (yeastolate ultra-filtered)	38~42 mL/L

[44]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
L-시스틴(cystine)	0.0167~0.0185
L-티로신	0.053~0.059

[45]

성분명	조성 비율의 범위 (g/L 또는 명시된 단위)
콜레스테롤	0.00475~0.00525
대구 간유	0.00095~0.00105
상피성장인자	0.00000285~0.00000315
간세포성장인자	0.0000048~0.0000053
하이드로코르티손	0.00095~0.00105
리놀레산	0.00095~0.00105
리놀렌산	0.00095~0.00105
올레산	0.00095~0.00105
포스파티딜콜린	0.6%
플루로닉 F-68(Pluronic F-68)	0.950~1.050
프로스타글란딘 E1	0.000042~0.0000263
삼요오드화-L-티록신 (triiodo-L-thyroxine)	0.00000475~0.0000053
트윈 80(Tween 80®)	0.002375~0.002625
혈관내피성장인자	0.0000046~0.00000525
비타민 E	0.0019~0.0021

[46] 표 1-4에 의해 설명되는 화합물 양은 1리터 전체 일괄 제조 용량(batch volume)에 의거한다. 본 명세서 내에 예시된 바와 같이, 상기 1리터 배치 볼륨은 프리믹스-I 및 프리믹스 II 두 가지 모두가 혼합된 후, 프리믹스 II 가 마이크로단위 또는 나노 단위 에멀젼(emulsion)에서 처리된 후의 종말 볼륨이다. 상기 당업자는 상기에 나타낸 처리 과정들이 즉시 더 작거나 또는 더 큰 배치(batch) 사이즈를 위해 스케일이 커지거나 또는 적어지게 됨을 인식할 것이다.

[47] 본 발명의 조성물의 조제에 사용된 모든 화학물질들은 실제적으로 순수하며, 생화학물질의 수많은 상업적 공급자로부터 이용가능하다. 바람직하게는, USP 등급 또는 이와 동급이 있다. 당업자는 상기에서 이용한 화학물질이 동일한 순도 및 활성을 나타내는 대체적으로 등가인 화학물질(equivalent chemical)에 의해 임의적으로(optionally) 대체될 수 있음을 인식하고 있을 것이다.

[48]

분석용 저울, 톱로딩(top-loading) 방식의 통상적 저울 자기 교반기, 여러 가지 혼합용 용기 WFI^*(주사액 water for injection) 등급의 물, 피펫과 기타 표준 실험 도구 미세유동화 장치 프로세서 모델 HC-5000-Microfluidics社 *WFI 주사액은 미국 약전(USP) 등급이 바람직함.

[49] 부가적인 갖가지 시약들은 다음을 포함한다: pH 적정에 사용되는 5N NaOH, 5N HCl 및 95% 순수 에탄올

프리믹스 -I 제조 과정

[050] 프리믹스-I은 균일하고 깨끗한 수성 조성물을 만드는 한편 바람직하지 못한 반응 또는 불용성 복합체 형성을 피하는 데에 효과적인 순서대로 구성성분들을 용해 또는 분산시킴으로써 제조된다. 이런 이유로, 프리믹스-I의 조성물은 모두 물에 완전히 용해 또는 분산될 때까지 함께 혼합되지 않는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 명세서내에 예시된 바와 같이, 당업자는 이 기본 조성물이 예시된 계획상에서 임의적으로(optionally) 다양하게 제조됨을 인식할 지라도, 표 1, 2A-2C 및 3에 기재된 구성성분들은 각각 3개의 다른 출발 용액으로 처리된다. 각각의 표 1, 2A, 2B, 2C 및 3 구성성분을 기초로 한 출발 용액들은 이때 비-에멀젼(non-emulsion) 기재 영양 배지를 구성하는 프리믹스-I을 제조하기 위하여 혼합된다.

프리믹스 -II 제조 과정

[051] 프리믹스-II은 본 발명의 조성물의 유화제-형성 성분들을 포함한다.

대체로, 상기 성분들은 생성되는 에멀젼 입자의 친수층을 포함하는데, 구성성분들은 본 발명에 따라 처리되는 기관, 조직 또는 세포간에 전달되는 것이 바람직하다 .

프리믹스-II 는 또한 생성되는 에멀젼 입자의 소수층(hydrophobic layer)을 형성하는 구성성분, 예를 들어 생존능을 지원하는 내분비 인자들을 포함된 친수성 내핵 성분의 전달을 위하여 생체 세포막과의 융합을 돕는 친지질성 외부층을 포함하고, 습윤제(들) 및/또는 블록 공중합체 작용제(block copolymer detergent) 등의 에멀젼화(emulsification)를 돕는데 적당한 작용제를 포함하고, 콜레스테롤 및/또는 인함유 지질 유도체(phosphorous derived lipids) 등의 소수성 상(相) 성분 역시 포함하고 있다. 바람직하게, 이것들은 상기 표 4에 기재되어 있으며, 하기 실시예들에 의해 나타낸 바와 같이 혼합된다.

II. 미세유동화( Microfluidation )

[052] 5000 psi 또는 그 이상의 압력에서 행하는 고압 균질화 기술은 선행 기술상에 서 "미세유동화(Microfluidation)"로 알려져있다. 본 과정은 바람직하게는 약 약 100nm 내지 약 300nm, 또한, 더욱 바람직하게는 약 100nm 내지 약 200nm의 평균 직경을 가지는 균일한 크기 분포로 리포좀(liposomes) 또는 나노입자 (nanoparticles)를 만드는데 사용되어왔다. 본 발명의 대안적 측면에서, 상기 입자들은 200nm 이하의 평균 직경을 가진다. 미세유동화와 더불어, 다른 표준 에멀젼화 방법들은 임의적으로 사용되는데, 예를 들면, 음파 파쇄(sonication), 밸브 균질화(valve homogenization) [Thornberg, E. and Lundh, G. (1978) J. Food Sci. 43:1553] 및 칼날 교반(blade stirring)등이 있다. 바람직하게는 수용성 계면활성제, 더욱 바람직하게는 폴리프로필렌 산화물-폴리에틸렌 산화물 블록 공중합체 계면활성제(예, BASF에서 시판하는 Pluronic F-68) 및/또는 TWEEN 80과 같이, 수천 돌턴(Daltons)의 분자량을 가지는 양쪽친매성 블록 공중합체(amphiphilic block copolymer)는 그것들이 형성하는 것과 같은 응집(aggregation)에 대하여 코팅된 입자를 안정화하기 위하여 수성 용액에 첨가된다. 본 방법이 사용될지라도, 본 계면활성제는 또한 초음파 파쇄(ultrasonication)의 효과를 향상시키는데 이용가능하다.

[053] 본 명세서에서 예시된 바와 같은 미세유동화(microfluidation)을 위한 바람직한 장치는 Sullair Solutions (Michigan City, Indiana) 사의 캡슐화된 공기 압축기, 예로서 No. ES-6에 의해 공급되는 압축 공기를 사용하는 Microfluidizer No. HC5000V (Microfluidics Corp., Newton, Massachusetts) 이다.

상기에서 장치는 본 프리믹스- II 조성물을 처리 및 에멀젼화하기 위하여 또한, 바람직한 크기 범위내에서 나노입자를 제공하기 위하여 고압 및 고 절단 균질화(high shear homogenization)를 사용한다.

[054] 요컨대, 본 프리믹스-II 조성물은, Microfluidizer를 사용하여 고압 균질화에 의해 (가공)처리되었다. 본 프리믹스-II는 고 절단(high shear) 스트레스 및 캐비테이션(cavitation) 힘(force)이 고도로 분할된 에멀젼을 형성한, 특별히 디자인된 캐비테이션(cavitation) 또는 상호작용 챔버(interaction chamber)를 통해 연속식으로 microfluidizer 저장고(reservoir)에 부가되었다. 복식 회전(multiple cycles)을 통하여, 평균 방울(droplet) 또는 리포좀 크기, 분포(distribution), 및 원료의 배합은 바람직한 최종 산물을 생산한다.(예, 더욱 바람직한 나노 입자)

[055] 더 상세한 microfluidizer 모델 번호 HC5000V의 작동은 제조자의 작동 매뉴얼에 의해 제공되며, Microfluidics Corporation(Cat. No. 85.0112)으로부터 이용가능하며, 전체로 본 명세서내에 참고문헌으로 포함되어 있다.

[056] 본 발명에 따른 두번째 제형 (Formula II)은 하기 표 6~10에 밝힌 성분(materials)에 근거한다. 상기와 같은 제조방법은 하기 및 실시예들에서 제공된다.

[57]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
대두 가수분해물¹	6.0~10.0
환원된 글루타티온¹	0.008~0.020
아세트산 비타민 A²	0.0002~0.0003
비타민 C(아스코르빈산)¹	0.040~0.060
비타민 E 토코페롤²	0.00002~0.00003
카탈라아제(catalase)¹	0.040~0.060
SOD(superoxide dismutase)¹	0.040~0.060
염산 L-시스테인¹	0.040~0.060
타우린¹	0.025~0.040
메티오닌¹	0.015~0.030
황산아연³	0.0008~0.0009
셀렌(selenium)³	0.000025~0.000035
황산구리³	0.0000045~0.000006
에탄올아민²	0.0025~0.005
메르캅토에탄올²	0.003~0.006

[58] 표 6을 위한 제조 지시사항 (Preparation instructions) :

1. ¹성분들의 무게를 달아 WFI 물에 혼합하여 용해하라.

2. ² 성분들의 무게를 달아 95% EtOH에 용해하라.

3. WFI 물에서 ³성분들의 1000X 농축물을 제조하라.

4. ¹ 성분 및 ²성분들을 함께 혼합하고 상기 용액에 그룹 3의 최종 일괄 제조 용량(batch volume) 리터 당 1ml을 부가하라.

[59]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
글루콘산나트륨(sodium gluconate)	18.500~25.000
인산칼슘	3.000~4.500
황산마그네슘	1.000~1.500
염화칼슘	0.100~0.150
제1인산나트륨	0.250~0.350

[60]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
염산 L-아르기닌	0.065~0.080
L-아스파르트산	0.050~0.065
L-글루탐산	0.100~0.160
L-글루타민	0.300~0.400
글리신	0.045~0.060
염산 L-히스티딘 수화물	0.155~0.170
L-아이소류신	0.025~0.030
L-류신	0.045~0.055
염산 L-리신	0.240~0.300
L-페닐알라닌	0.045~0.055
L-프롤린	0.045~0.055
L-트레오닌	0.065~0.075
L-트립토판	0.035~0.045
L-발린	0.055~0.070
L-시스틴	0.018~0.024
L-티로신	0.050~0.060

[61] 표 7 을 위한 제조 지시사항 (Preparation instructions):

1. 모든 화학물질의 무게를 달아 WFI 물에 혼합하여 용해하라.

2. 표 6에서의 용액에 부가하라.

[62]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
포도당	4.500~6.000
만노스	8.000~12.000

[63] 표 8 을 위한 제조 지시사항 :

2. 표 6에서의 용액에 부가하라

[64]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
바이오틴	0.000015~0.00003
중(重)타타르산콜린(choline bitartarate)	0.40~0.50
엽산	0.00035~0.0005
이노시톨	0.0008~0.002
니아신아미드	0.0008~0.002
판토텐산	0.0008~0.002
피리독신	0.0008~0.002
리보플라빈	0.0008~0.002
티아민	0.0008~0.002
비타민 B-12	0.000015~0.0003
아데노신	0.85~1.50

[65] 표 8 을 위한 제조 지시사항 (Preparation instructions):

1. 그룹 1의 무게를 달아 적은 양의 5 NaOH 및WFI물에 용해하라.

2. 나머지 성분들의 무게를 달아 WFI 물에 혼합하여 용해하라.

3. 그룹 1을 단계 2에서의 용액에 부가하여 혼합하라

4. 표 6에서의 용액에 상기 용액을 부가하라.

[66]

성분명	조성 비율의 범위(g/L)
95% 에탄올	8.00~16.00 mL/L
대두 가수분해물	3~8 mL/L
포스파티딜콜린	0.00095~0.010
아리키돈산(arachidonic acid)	0.0000015~0.00002
리놀레산	0.000095~0.00015
리놀렌산	0.000095~0.00015
미리스트산	0.000095~0.00015
올레산	0.000095~0.00015
팔미트산	0.000095~0.00015
스테아르산	0.000095~0.00015
콜레스테롤	0.002~0.004
비타민 E 토코페롤	0.0006~0.0008
트윈 80	0.020~0.030
플루로닉 F-68	0.010~1.000

[67] 표 9 를 위한 제조 지시사항 (Preparation instructions):

1. 표 9의 내용물(contents)은 제형 I, 프리믹스 II 을 위해 상기에 언급된 상기 미세유동화(microfluidization) 단계를 거쳤다.

2. 표 6에서 용액에 혼합하여 부가하라.

[68]

화학적 조성	리터
덱스트란 70 또는 다른 콜로이드 조성물, 예를 들어 수산화에틸전분(HES), 사람 혈청 알부민, 혈장	45.000~55.000

[69] 표 10 을 위한 제조 지시사항 (Preparation instructions):

1. 화학물질들의 무게를 달아 완전히 용해될 때 까지 WFI 물에 용해하라.

2. 표 6에서의 용액에 부가하라.

3. WFI 증류수를 가하여 최종 일괄 제조 용량에 맞춘 뒤 섞어 주라.

5N NaOH 또는 5N HCl로 pH 7.0 ~ 7.2까지 적정하라.

[70] 하기 실시예들은 본 발명의 더 나은 이해를 돕기 위하여 제공된다.

본 실시예들은 어떠한 경우라도 본 발명의 효과적인 범위를 한정하는 것을 의미하는 것은 아니다. 용액들이 제조된 각 경우에서, 포함된 각 구성성분의 양은 나타낸 각각의 표에서 표현된 범위의 중간점이었다.

실시예 1

프리믹스 -I 제조

[71] 용액 1 제조: 적합한 저울을 사용하여, 상기 표 1에서 기재된 각 성분의 10,000X농축물 (일정 범위의 중간점을 사용하여) 이 제조되었다. 포함된 각 성분의 양은 상기 표에 나타낸 범위의 중간점이었다. 편의상 여러 성분들을 위한 저장용액(stock solution)들이 다음과 같이 미리 제조되었으며, 저장용액의 적합한 양은 용액 1로 혼합되었다.

100,000X 농도에서 황산 구리(Cupric Sulfate) 저장 용액.

[72] 황산구리0.130 g을 계량하여 WFI 등급의 물 1000ml 에 혼합하였다. 필요하다면, 5N HCl은 완전히 용해될 때까지 혼합하여 방울로 추가되었다. 이는 용해될 때까지 혼합되었고, -20°C에서 저장하였다.

10,000X 농도에서 황산제2철 , 질산제2철 및 황산아연 저장 용액

[73] 상기 저장 용액은 1000ml WFI 등급 물에 5.0 g 황산제2철(Ferric Sulfate), 0.5 g 질산제2철(ferric nitrate) 및 4.3 g 황산 아연을 계량하여 제조되었다. 필요하다면, pH는 완전히 용해될 때까지 5N HCl을 방울로 부가함으로써 용해를 도움으로써 감소되었다. 본 용액은 -20°C에서 저장하였다. 배치(최종 산물의 최종 부피)의 리터당 0.1mL가 사용되었다.

100,000X농도에서 바이오틴 저장 용액

[74] 본 바이오틴 저장 용액은 5 ml WFI 등급 물에 0.040 g 바이오틴을 계량하여 제조되었다. 5N HCl은 완전히 용해될 때까지 혼합동안 필요에 따라 방울로 추가되었다. 물을 가하여 최종 부피를 1000ml로 맞추고, -20°C에서 저장하였다. 최종 용액에서 리터당 0.01 mL가 사용되었다.

1000X 에서 비타민 B-12 및 티미딘 ( Thymidine ) 저장 용액 .

[75] 본 저장 용액은 1000ml WFI 등급 물에 0.670 g 비타민 B-12 및 0.370 g 티미딘(thymidine)을 계량하고 완전히 용해될 때까지 혼합하여 제조되었으며, -20 °C에서 저장하였다. 최종 용액에서 리터당 1 ml 이 사용되었다.

[76] 모든 저장 농축물이 만들어지자마자, 리터당 1000x = 1ml 과 같이 그 농도로 부피가 일치되게 용액 2에 부가되었다. 그 부가적인 구성성분들은 이때 WFI 등급 물에 부가되어 완전히 용해될 때까지 자석 교반 플레이트 (magnetic stir plate) 상에서 혼합되었다. 생성된 용액은 하기에 나타낸 바와 같이, 최종 배치 볼륨(최종 산물)의 리터당 0.1ml의 비율로 용액 2에 부가되었다.

[77] 용액 2 제조: 적합한 저울을 사용하여, 표 2A, 2B 및 2C에 기재된 각 성분(일정 범위의 중간점으로 측정된)은 최종 배치 볼륨, 즉 1리터 최종 배치에서 WFI 등급 물 최종 부피의 약 50%로 계량하여 부가되었는데, 용액 2는 WFI 등급 물의 약 500ml로 제조되었다. 이는 완전히 용해될 때까지 혼합하였다.

[78] 용액 3 제조: 적합한 저울을 사용하여, 표 3에 기재된 각 성분들은 계량되어(일정 범위의 중간점을 사용하여) WFI 등급 물 전체 배치 볼륨의 5%를 포함하는 적합한 크기의 혼합 용기(mixing vessel)로 부가되었다. 혼합하는 동안, 5N NaOH는 완전한 용해를 나타내는 표시인, 혼합물이 맑아진 시점까지 적하(滴下)하였다.

[79] 프리믹스-I 은 이때 용액 1을 취하고, 배합된 (1+2) 용액을 형성하기 위해 최종 배치 볼륨(최종 산물)의 리터당 0.1ml의 비율로 혼합하여 용액 2와 함께 이를 혼합함으로써 제조되었다. 따라서, 용액 3의 완전한 배치는 즉시 사용될 수 있거나 또는 저장될 수 있는, 프리믹스-I을 생성하기 위한 (1+2) 용액으로 혼합되었다.

실시예 2

프리믹스 Ⅱ 조제

[80] 프리믹스 II의 구성성분 양은 상기 표 4에서 지정한 범위의 중간 범위로 사용하여 사용 전에 혼합한다. 편의를 위해, 프리믹스-Ⅱ의 구성성분을 먼저 저장 용액(stock solution)으로 준비하고, 프리믹스-Ⅱ의 준비를 위해 적당한 부피를 사용하였다. 저장 용액은 하기와 같다.

내분비 인자 저장 용액(10,000X)

[81] 내분지 인자 저장 용액은 0.052g HGF, 0.050g 삼요오드화 L-티록신(triiodo-L-thyroxine), 0.050g VEGF, 및 0.030g EGF를 정량하고, 완전히 용해될 때까지 1,000 ㎖ WFI 등급 증류수와 혼합한다. 일괄 제조량이 X0.1 ㎖가 되도록 하고, 단계 4/처리 4의 용액에 첨가된다. 상기 저장 용액은 -20℃에서 저장하고, 최종 용액에는 0.1 ㎖/L의 농도로 사용된다.

하이드로코르티손 저장 용액(1,000X)

[82] 하이드로코르티손 저장 용액은 0.95g 하이드로코르티손을 정량하고, 완전히 용해될 때까지 10 ㎖ 95% 에탄올과 혼합한다. 일괄 제조량이 X1 ㎖이 되도록 하고, 저장 용액은 하기 단계 2의 용액에 첨가된다. 상기 저장 용액은 2-8℃에서 저장하고, 최종 용액은 1 ㎖/L의 농도로 사용된다.

프로스타글란딘 E1 저장 용액(" PGE1 ")(1,000X)

[83] 0.034g PGE1을 정량하고, 완전히 용해될 때까지 1.000 ㎖ WFI 등급 증류수와 혼합한다. 일괄 제조량이 X 1 ㎖이 되도록 하고, 하기 단계 4에 첨가된다. 상기 저장 용액은 -20℃에서 저장하고, 최종 용액은 0.01 ㎖/L의 농도로 사용된다.

PDGF 저장 용액(100,000X)

[84] 상기 저장 용액은 0.095g PDGF를 정량하고, 완전히 용해될 때까지 1,000 ㎖ WFI 등급 증류수와 혼합한다. 일괄 제조량이 X0.01 ㎖가 되도록 하고, 하기 단계 4에 첨가된다. 상기 저장 용액은 -20℃에서 저장하고, 최종 용액은 0.01 ㎖/L의 농도로 사용된다

[85] 프리믹스-Ⅱ는 하기 단계와 같이 제조하였다.(상기 표 4에서 지정한 범위의 중간 범위로 계량하였다.)

[86] (1). 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 용액은 1 g 정량하여, WFI 등급 증류수의 총 일괄 제조량의 50% 이하로 제조되었다(최종 생산물의 1리터 기준으로 500 ㎖ 이하). 가열하면서(100℃ 이하) 1시간 가량 혼합하고, 완전히 용해될 때까지 혼합하였다. 상기 액체 조성물은 사용 전에 35-40℃ 정도로 냉각한다.

[87] (2). 95% 에탄올 10 ㎖을 유리 혼합 용기에 담은 후, 자기 교반기(magnetic stirring plate)에 올려놓는다. 표 4 범위의 중간 범위로 정량한 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine)을 상기 용액에 첨가하고 1시간 동안 혼합해 준다.

[88] (3). 콜레스테롤(cholesterol), 리놀레산(linoleic acid), 비타민 E(Vitamin E), TWEEN 80, 간유(cod liver oil), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 올레산(oleic acid)을 표 4 범위의 중간 범위로 정량하였다. 원하는 농도를 맞추기 위해, 바람직하게는 10,000X 농축물 또는 저장 용액으로 제조할 수 있다. 이를 단계 2의 용액에 첨가하여 1시간 동안 혼합하였다.

[89] (4). 단계 2와 단계 3의 용액을 단계 1의 용액에 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 상기 조성물은 불투명하고 흐려진다.

[90] (5). 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor:HGF), 삼요오드화 L-티록신, 프로스타글란딘 E1(prostaglandin E1), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor:VEGF), 내피성장인자(endothelial growth factor:EGF), 혈소판유래내피성장인자(platelet derived endothelial growth factor)의 범위의 중간 범위로 정량하였다. 바람직하게는 상기 화학물의 저장 용액으로 제조한다.

[91] (6). 단계 4의 조성물을 단계 4 용액에 첨가하고, 프리믹스-Ⅱ 액체 조성물 제작을 위해 1시간 동안 혼합하였다.

실시예 3

제형 Ⅰ-미세유동화에 의한 콜레스테롤 기반 나노입자

[92] 제형 Ⅰ은 상시 실시예 1 및 2의 조성물 프리믹스-Ⅰ 및 프리믹스-Ⅱ로 제조 하며 방법은 하기와 같다.

[93] (1) 공기 압축기는 120PSI, 100 CFM로 맞추어 작동시킨다. 압축 공기로 미세유동화장치 압력 챔버에 자동으로 충전된다.

[94] (2) 미세유동화장치 압력은 5,000 PSI로 맞추었다.

[95] (3) 실시예 2에서 제조된 프리믹스-Ⅱ에 기기 장치 저수조에 첨가하였고, 미세유동화장치 조절은 최대 설정으로 맞추었다.

[96] (4) 프리믹스-Ⅱ을 active cavitation chamber을 통해 압축하였고, 수거관으로 나왔다.

[97] (5) 프리믹스-Ⅱ가 모두 가공되고 수거되면, 1 주기가 끝난다.

[98] (6) 단계 1 내지 5를 4회 및/또는 가공된 조성물이 명확한 모양으로 수거관으로 나올 때까지 반복하였다.

[99] (7) 액체 조성물은 0.2 마이크론 막 필터를 통해 무균 여과하였고, 사용하기 전까지 4-8℃에 저장하였다.

[100] (8) 상기 단계 7의 생성물을 실시예 1에서 제조된 프리믹스-Ⅰ과 화학적 조성물의 거품이나 해리를 피하면서 천천히 혼합하였다. 프리믹스의 최종비는 1:1이다.

[101] (9). WFI 등급 증류수를 가하여 표 1~4에 따라 원하는 일관 제조량까지 부피를 맞춘다. 최종 일괄 사용 부피는 1L이며, pH는 7.2±0.2로 조정되었다.

[102] 최종 조성물은 0.2 마이크론 막으로 무균 여과하고, 저장을 위해 멸균 용기에 담았다. 상기 조성물은 미립자 크기의 불투명한 우유빛 백색 용액이다. 소포 크기는 나노입자 분산의 광학적 외향에 큰 영향을 미친다. 상기 용액은 더 작은 입자와 보다 투명한 용액이다.

실시예 4

VIASPAN 에 의한 기관 보존 비교

[103] 실시예 3에서 제조된 제형-Ⅰ의 신장 보존 효능을 "금 본위체"(gold standard) VIASPAN(BarrLaboratories, Inc)와 비교하여 확인 및 평가하였다.

재료 및 방법

[104] 1-2살 사이의 단일 비근교계 수컷 하운드견(single outbred male hound)의 양쪽 신장을 절개하고, 신속하게 국소 마취 하에 안락사 시켰다.

[105] 좌측 신장은 VIASPAN으로 세척하고, 우측 신장은 제형-Ⅰ로 세척하였다. 각각의 신장은 혈액 또는 불순물의 흔적이 남지 않도록, 체액이 선명해질 때까지 100% 세척 용액으로 세척하였다. 각각의 신장은 50 ㎖/kg으로 세척하였다. 각각 신장의 생체 검사는 용액으로 세척한 즉시 수행하였다. 모든 생체 검사는 신장의 외부 피질 쐐기 부분과 큰 곡률 부분에서 수행하였다.

[106] 각각의 신장은 세척시 사용한 동일 용액(VIASPAN 또는 제형-Ⅰ)이 담긴 용기에 넣었다. 각각의 용기는 생체 검사를 위해 개방된 차가운 박스에 담았다.

[107] 각각의 신장을 VIASPAN 또는 제형-Ⅰ에 담근 후 1, 4, 8, 및 24시간에 생체 검사를 수행하였다. 10% 포르말린에 보존한 신장은 조직병리학적 평가를 위해 병리학 협회(division of Charles River Laboratories, Inc)에 보냈다.

결과

[108] 각각의 시간대에서 생체 검사의 현미경 평가 결과는 하기 표 6과 같다.

[109] 표 6

신장 생체 검사의 조직병리학적 평가

생체 표본
	제형-Ⅰ(우측 신장)					VIASPAN 용액(좌측 신장)
	R-BASE	R-1H	R-4H	R-8H	R-24H	L-BASE	L-1H	L-4H	L-8H	L-24H
		N	N	N
단핵성 염증	1)				1＞	1)				1＞
세뇨관변성							1)
급성 염증							1)	1＞	1＞
사구체주위세포섬유증 (peri-glomerular fibrosis										1)
변성된 혈관

코드 ; N:정상, P:존재, 1+:극소, 1):병소, 1>:다중병소, H:시간, R-:우측, L-좌측

[110] 모든 생체 표본은 피질 유래 조직으로 구성되어 있다. 또한, 보우만 공간 비대 및 세뇨관 비대 같은 관류 구조는 우측 신장의 8시간 및 24시간 생체 표본에서 정상 수위로 나타났다. 우측 신장의 4시간 생체 표본 또한 그러나, 다른 시간대의 상기 우측 신장 샘플보다 현저히 감소함을 보였다. 생체 표본의 일부 낮은 변성 및 염증 변화는 비논리적이다. 최소 급성 염증은 좌측 신장의 4시간 및 8시 간 표본에서 나타났다.

요약

[111] 보존 정도는 대조군 및 1시간 표본에서, 신장 표본 양쪽에서 유사했다. 보존은 4,8, 및 24시간대에서, 오른쪽 신장(본 발명의 조성물에 의해 보존)의 표본에서 뛰어난 결과를 보였다.

실시예 5

제형-Ⅱ을 사용한 제형-Ⅰ의 제조

[112] 용액 1의 제조: 아스코르빈산, 카탈라아제(catalase), SOD, L-시스테인, 타우린(taurine) 및 메티오닌을 정량하고 WFI 증류수와 혼합하여 용해시켰다. 비타민 E와 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)은 95% 에탄올에 용해시켰다. 황산아연, 셀렌(selenium) 및 황산구리(cupric sulfate)로 이루어진 조성물의 1,000X 농축으로 제조하였다. 상기 화학물의 첫번째 두 그룹을 혼합하고, 농도의 최종 일괄 제조양이 1 ㎖/L 되도록 용액 1에 첨가해준다. 덱스트란(dextran) 및 HAS를 25 g/L 되도록 용액 1에 첨가해준다. 각각의 성분은 표 6에 나와있는 범위의 중간점으로 정량하였다.

[113] 용액 2의 제조: 저울을 사용하여 표 7A, 7B 및 7C(범위의 중간점)의 각각의 조성물을 정량하고, 각기 표 아래 지시에 따라 혼합한다.

[114] 용액 3의 제조: 저울을 이용하여 표 8(범위의 중간점)의 각각의 조성물을 정 량하고, 표 아래 지시에 따라 혼합한다.

[115] 제형-Ⅰ은 용액 1과 용액 2를 혼합하여, 혼합 용액(1+2)의 최종 일괄 제조량(최송 산물)이 0.1 ㎖/L가 되도록 한다. 이후, 용액 3의 전체 일괄 제조량을 (1+2) 용액과 혼합하여 제형-Ⅰ을 제조한다.

실시예 6

제형-Ⅱ의 제조

[116] 실시예 2 중 표 4의 성분 대신에 표 9의 성분으로 대치하여 과정을 반복한다.

실시예 7

제형-Ⅱ: 마이크로유동화에 의한 콜레스테롤 기본 나노입자

[117] 제형-Ⅱ는 실시예 3 과정 후에,상기 실시예 4 내지 6의 조성물로 프리믹스-Ⅰ 및 프리믹스-Ⅱ로 제조하였다.

실시예 8

제형-Ⅱ의 신장 보존 평가

[118]실시예 7의 용액(제형-Ⅱ)의 효능을 VIASPAN과 비교하였다. 신선한 양의 신장을 사용하여 정적 보존 환경 즉 2-8℃에서 시간차로 수거하여 냉 뇌허혈 손상(cold ischemic damage)을 비교하였다. 신장은 도달된 양에서 신속하게 채취하고 얼음으로 옮겼다. 연구실로 돌아가 신장 주위의 모든 지방 조직을 무균 상태에서 절개하였고, 신장 동맥을 분리하였다. 양쪽 신장을 0 시간에서 무게를 측정하였다. 신장은 색깔, 조직 및 밀도가 정상이었다. 각각의 신장은 혈액 또는 불순물의 흔적이 남지 않도록, 체액이 선명해질 때까지 100% 세척 용액으로 세척하였다. 각각 신장의 생체 검사는 용액으로 세척한 즉시 수행하였다. 모든 생체 검사는 신장의 외부 피질 쐐기 부분과 큰 곡률 부분에서 수행하였다. 각각의 신장(A와 B)을 VIASPAN(신장 A) 또는 제형-Ⅱ(신장 B)용액이 각각 담긴 용기에 옮겼다. 각각의 용기는 생체 검사를 위해 열려진 차가운 박사에 담았다. 각각의 신장을 VIASPAN 또는 제형-Ⅱ에 담근 후 후보존 12, 24, 48, 60, 72 및 96시간대에 생체 검사를 수행하였다. 신장의 생체 표본은 조직병리학적 평가를 위해 10% 포르말린에 보존하였다.

[119] 결과: 두 신장 사이에 유의성있는 조직학적인 차이가 나타났다. 리신(lysine) 에의한 세포 파괴 현상인 자가융해 변화가 VIASPAN를 처리한 신장의 후보존 12 내지 96시간대에서 점차적으로 나타났다. 본 발명의 제형-Ⅱ를 처리한 신장에서는 전보전 36시간대까지 조직학적 변화가 없었다. 저온 보존 기술에서 본 발명의 용액이 선행기술보다 뛰어난 강점을 제공함을 상기 내용을 통해 알 수 있다.

실시예 9

제형-Ⅲ: 헴( heme ) 함유 나노입자

[120] 무지질(無支質, stroma-free) 헤모글로빈(SFH)은 제조업자 또는 본 명세서 내에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허번호. 5,694,528 같이 당업자에게 알려진 방법으로 포장 적혈구에서 분리하는 방법으로 제공되며, 50%(w/v) 농도로 표준화되었다.

[121] 스트로마 프리 헤모글로빈 200 ㎖에 β-NAD(1 mM, 133 mg), D-포도당(100 mm, 3.6 g), ATP-Na(1 mM, 110 mg), 염화마그네슘 6수화물(1 mM, 40 mg), 제2 인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate)(9 mM, 247 mg), 제2인산나트륨(disodium hydrogen phosphate)(11 mM, 310mg), 피트산(phytic acid)(3 mM, 396 mg)에 첨가하고, 추가 헤모글로빈 용액을 형성하도록 시약을 완전히 혼합될 때까지 혼합물을 저어준다.

[122] 90% 수소화된 정제 포스파티딜콜린(phosphatydylcholine), 콜레스테롤, 미리스트산, 비타민 E를 각각 7:7:2:0.28 몰비가 되도록 균일하게 혼합된 가루 45g에 WFI 등급 증류수 45 ㎖을 첨가하고, 팽창을 고려하여 60 내지 80℃ 온도 범위에서 가열한다. 상기 추가 헤모글로빈 용액에 제조된 액체 재료가 첨가되어 15초간 교반해 준다. 상기 제조된 액체-SFH 혼합 용액은 미세자동화장치 5000 (Microfluidics Co.)으로 처리하며, 12,000PSI 압력으로 냉탕기에서 처리하였다.

[123] 상기 켑슐 처리된 헤모글로빈은 식염수, 덱스트란 용액(3%(w/v))과 혼합하고, 생성된 현탁액을 10,000 rpm(13,00 g)로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이를 통해 캡슐 처리된 헤모글로빈과 리포좀(liposome) 또는 나노입자는 회수되었다. 캡슐 처리되지 못한 잔여 자유 헤모글로빈 및/또는 잔여 개시 지질 구성물을 포함하는 상층액은 따라내거나 섹션을 통해 제거하였다. 상기 기술된 세척 과정은 자유 헤모글로빈이 시각적으로 잔여하지 않을 때까지 반복한다. 상기 생성물은 원하는 생성 입자 크기 범위에 따라 0.2 내지 0.45 마이크론 범위의 여과막 싸이즈를 이용하여 여과한다. 정제된 헤모글로빈-켑슐 처리된 리포좀 또는 5%(w/v) 헤모글로빈 농도를 가지는 나노 입자 현탁액 600 ㎖을 생성하기 위하여, 중공 섬유-유형 투석기를 통한 초여과(ultrafiltration)를 통해 여과액을 농축한다.

[124] 제형-Ⅲ을 제공하기 위하여, 상기 생성된 리포좀 또는 나노 입자를 총 부피 1000 부 중 10 부로 하고, 에멀젼은 500 부의 비율로 혼합하여 준다.

[125] 제형-Ⅲ을 제형-Ⅰ과 원하는 비율로 혼합하고, 산소 운반 특성을 가지는 기간 보존 조성물을 제공한다.

실시예 10

세포 배양 배지

[126] 실시예에서, 제형-Ⅰ인 실시예 3의 조성물을 세포 배양 배지에서의 효능을 확인하였다. 인간 신장 세포주를 충분한 양의 제형-Ⅰ 또는 세포 배양배지가 들어있는 배양접시에서 옮기고, 4℃ 및 37℃에서 세포 생존능을 측정하였다. 72시간 후, 생존한 세포는 성장하여 정상적인 모양 및 생존능을 보이는 세포 집단을 형성하였다.

[127] 상기 미국 특허와 출판된 문서 내용은 본 명세서의 참고 문헌에 포함되어 있다.

정상 혈액 순환이 오랜 동안 끊긴 장기, 조직과 심지어 세포를 산 채로 생체 내외에서 보존 기간을 늘리는 일은 해당 분야에서는 오랜 미해결 과제였는데, 본 발명에서 저장 기간과 조직의 생존능을 향상시키고, 추가적으로 조직과 세포의 생존능을 더욱 잘 유지하기 위하여 적절한 산소 운반체(carrier)까지 선택적으로 포함할 수 있는 조성물과 저장 방법을 제공함으로써 장기이식용 기증 장기의 부족 문제를 해결하는 데 도움을 준다.

Claims

기본 영양 배지를 갖추고 있는 제1상(相) 및

지방친화성(lipophilic) 외부 피막(皮膜) 및 친수성 내핵을 포함하는 나노 입자가 포함되어 있는 둘째 상을 포함하고, 이때

a) 상기 제1상은 수용성이거나 분산질이 될 수 있는 영양물질과 생리 염류를 생리적으로 적합한 농도로 포함하며;

b) 상기 둘째 상의 나노 입자는 지질, 지방산, 스테롤과 자유 지방산을 갖추고 있고;

c) 적어도 약 300mOsM/kg의 몰랄 삼투압 효과(osmolality)를 가지는, 세포 생존능을 유지하기 위한 2상(相) 조성물.
제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 몰랄 삼투압 효과는 약 385~425mOsM/kg인 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 pH는 약 7.2에서 7.4인 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 나노 입자는 평균 지름이 약 100nm에서 300nm인 2상 조성물.
제4항에 있어서, 상기 나노 입자는 그 평균 지름이 약 100nm에서 200nm인 2상 조성물.
제1항에 있어서, 세포 성장 인자를 추가적으로 포함하는 2상 조성물.
제6항에 있어서, 상기 세포 성장 인자는 상피성장인자(epithelial growth factor), 내피성장인자(endothelial growth factor), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor), 혈소판 유래 내피성장인자,(platelet derived endothelial growth factor) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 2상 조성물은 제1상과 제2상을 거의 동등한 양으로 포함하는 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 내핵은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 미리스트산(myristic acid), 라우르산(lauric acid), 에이코사펜탠산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥샌산(docosahexaenoic acid) 및 그 조합물로 이루어지는 군에서 선택되는 자유 지방산을 갖춘 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 나노 입자는 그 입자 크기가 약 100nm에서 200nm인 2상 조성물.

제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 조성은 아래 표에 기재된 성분을 포함하는 2상 조성물.

제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 조성은 아래 표에 기재된 성분을 포함하는 2상 조성물.

성분명 조성 비율의 범위(g/L) L-시스틴(cystine) 0.0167~0.0185 L-티로신 0.053~0.059

성분명 조성 비율의 범위(g/L) 대두 가수분해물 6.0~10.0 환원된 글루타티온 0.008~0.020 아세트산 비타민 A 0.0002~0.0003 비타민 C(아스코르빈산) 0.040~0.060 비타민 E 토코페롤 0.00002~0.00003 카탈라아제(catalase) 0.040~0.060 SOD(superoxide dismuatase) 0.040~0.060 염산 L-시스테인 0.040~0.060 타우린 0.025~0.040 메티오닌 0.015~0.030 황산아연 0.0008~0.0009 셀렌(selenium) 0.000025~0.000035 황산구리 0.0000045~0.000006 에탄올아민 0.0025~0.005 메르캅토에탄올 0.003~0.006

제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 조성은 아래 표에 기재된 성분을 포함하는 2상 조성물.

성분명 조성 비율의 범위(g/L) 글루콘산나트륨(sodium gluconate) 18.500~25.000 인산칼슘 3.000~4.500 황산마그네슘 1.000~1.500 염화칼슘 0.100~0.150 제1인산나트륨 0.250~0.350

제1항에 있어서, 상기 2상 조성물의 조성은 아래 표에 기재된 성분을 포함하는 2상 조성물.

성분명 조성 비율의 범위(g/L) 포도당 4.500~6.000 만노스 8.000~12.000

제1항에 있어서, 상기 친수성 내핵은 산소에 결합하고 또 산소를 방출하는 것이 가능한 부위를 갖추고 있는 용액 또는 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는 2상 조성물.
제23항에 있어서, 상기 산소에 결합하고 또 산소를 방출하는 것이 가능한 부위는 헴 단백질인 것을 특징으로 하는 2상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 친수성 내핵은 생물학적 활성을 지닌 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 2상 조성물.
제25항에 있어서, 상기 생물학적 활성을 지닌 부위는 화학요법 제제, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소 및 그 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2상 조성물.
제25항에 있어서, 상기 생물학적 활성을 지닌 부위는 란피르나제(ranpirnase)인 2상 조성물.
제1항의 조성물과;

친지질성 외부 피막 및 산소에 결합하고 또 산소를 방출할 수 있는 부위를 구비한 용액 또는 현탁액을 포함하고 있는 친수성 내핵을 가지는 나노 입자의

혼합물을 포함하는 3상 조성물.
제28항에 있어서, 상기 산소에 결합하고 또 산소를 방출할 수 있는 부위는 헴 단백질인 3상 조성물.
제1항의 조성물과,

친지질성 외부 피막 및 생물학적 활성을 지니는 부위를 갖춘 친수성 내핵을 가지는 나노 입자의

혼합물을 포함하는 3상 조성물.
수용성 또는 분산질이 될 수 있는 영양 물질과 생리 염류를 생리학적으로 적합한 농도로 함유하는 기본 영양 배지를 포함하는 액체 형태의 제1상 및;

친지질성 외부 피복과 친수성 내핵을 갖춘 나노 입자를 포함하는 액체 형태의 둘째 상을;

적어도 300mOsM/kg 이상의 몰랄 삼투압 효과를 가지는 최종 2상 조성물의 제조에 충분한 조건하에서 혼합하는 단계를 포함하는

제1항의 2상 조성물의 제조 공정.
충분한 양의 제1항의 2상 조성물 속에 포유동물 세포 또는 조직을 놓아 두는 단계를 포함하는 포유동물 세포 또는 조직의 보존 방법.
효과적인 양의 제1항의 2상 조성물 속에 장기를 놓아 두는 단계를 포함하는 포유동물 장기의 체외 보존 방법.
제33항에 있어서, 상기 장기는 콩팥, 심장, 간, 허파, 피부, 동맥 및 이들의 기능적인 일부분으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물 장기의 체외 보존 방법.