CN103502436A - 用核酸转染细胞的方法 - Google Patents

用核酸转染细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103502436A
CN103502436A CN201280021922.XA CN201280021922A CN103502436A CN 103502436 A CN103502436 A CN 103502436A CN 201280021922 A CN201280021922 A CN 201280021922A CN 103502436 A CN103502436 A CN 103502436A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substratum
cell
transfection
target cell
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280021922.XA
Other languages
English (en)
Inventor
默罕默德·费斯·亚尼克
马修·安卓尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of CN103502436A publication Critical patent/CN103502436A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018Culture media for cell or tissue culture
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0696Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20Transition metals
    • C12N2500/24Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/36Lipids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/38Vitamins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70Undefined extracts
    • C12N2500/80Undefined extracts from animals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70Undefined extracts
    • C12N2500/80Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84Undefined extracts from animals from mammals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10Growth factors
    • C12N2501/115Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25Tumour necrosing factors [TNF]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30Hormones
    • C12N2501/38Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39Steroid hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本公开提供了培养基和使用培养基以用核酸分子有效地转染靶细胞的方法。所述培养基能够支持正在进行分化、转分化、和/或去分化的培养中的细胞。

Description

用核酸转染细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年3月7日提交的美国临时专利申请序号61/450116的优先权,该申请通过引用并入本文中。
背景技术
RNA转染是用于在体外和体内表达高水平蛋白质的有效方法,其避免了与基于DNA的方法有关的突变的风险。然而,长的体外转染的RNA分子诱导强力的固有免疫应答,其导致细胞死亡。已经证明抑制靶细胞对用外源RNA(本文与“体外转录的RNA”(ivT-RNA)同义使用)的转染的固有免疫应答有助于用编码多种目标蛋白——包括重编程序蛋白的外源RNA——的频繁的重复转染(参见美国专利申请公布号US2010/0273220,Angel&Yanik(2010)PLoS One5:1-7))。涉及固有免疫应答的蛋白包括例如TP53、TLR3、TLR7、RARRES3、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNK、IFNB1、IL6、TICAM1、TICAM2、MAVS、STAT1、STAT2、EIF2AK2、IRF3、TBK1、CDKN1A、CDKN2A、RNASEL、IFNAR1、IFNAR2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、RB1、ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT2、IFIT3和IFIT5,或其生物学活性片段、类似物或变体。
发明内容
用于去分化细胞的方法对于药物发现和细胞更替疗法(也称为“再生医学”)是很重要的。制药公司利用基于细胞的测定来筛选大的化合物文库以确认新的疗法。然而,目前还没有产生对于这些筛选所需的大量的疾病特异性和组织特异性细胞的方法。因此,使用无限增殖化细胞进行大多数高通量筛选,所述无限增殖化细胞不能准确地在体外重演疾病状态,因为由无限增殖化过程引起的表型异常。除了与用于去分化细胞的其他方法相关的突变风险以外,现有的用于去分化细胞的方法的效率低。因此,有对于能够增加去分化细胞的效率的需求。
多种培养基用于体外细胞的培养。培养基被设计成为细胞提供保持它们生存力所需要的营养物,并且在增殖细胞的情况下,支持它们的生长。已经开发了专用的培养基来支持一些特定细胞类型的生长,包括多能干细胞,并且其他培养基可用于利用病毒或其他基于DNA的方法将体细胞(诸如成纤维细胞)去分化成多能干细胞状态。然而,这些培养基不能用于一些应用,诸如,利用编码重编程序蛋白的外源/ivT-RNA将细胞有效地去分化成多能干细胞状态。这样的应用要求培养基支持体细胞以及去分化的多能干细胞的生长,同时支持用编码重编程序蛋白的ivT-RNA的有效转染,而不刺激去分化细胞或部分去分化细胞的分化。因此,有对满足这些标准并且支持利用外源RNA特别是长ivT-RNA分子的高效率转染的培养基的巨大需求。
本文描述了利用核酸分子转染靶细胞的方法和组合物。在一些实施方式中,提供了用于利用核糖核酸分子转染靶细胞的培养基。在一些实施方式中,提供了用于利用核糖核酸分子转染靶细胞的方法。所述方法包括抑制靶细胞中的固有免疫应答,并且将核糖核酸分子引入至靶细胞中,其中所述靶细胞培养在本文所述的培养基中。
附图说明
图1提供了直方图,其比较了固有免疫相关基因在用修饰的ivT-RNA转染并且在存在或缺少免疫抑制蛋白B18R的条件下培养的细胞中的增量调节。从转染的细胞中提取mRNA,并且通过定量RT-PCR测量基因表达。使用Gapdh作为内参照(loading control)。误差棒指示复制样品(n=2)的标准差。
图2描绘了用1.2ug/孔的编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc(T58A)、Lin28和去稳定核的GFP的修饰的mRNA每天转染持续5天并且在存在或缺少免疫抑制蛋白B18R的条件下培养的MRC-5成纤维细胞。
图3提供的图图示了图2中绘制的细胞的细胞密度随时间的变化。细胞样品在指定的时间被胰蛋白酶化并计数。误差棒指示复制样品(n=4)的标准差。
图4描绘了在用修饰的mRNA重复转染的细胞中GFP的表达。对图2中描绘的细胞进行GFP荧光成像。使用相同的照相机设定和曝光时间来捕捉每个图像。对于每个样品显示两个随机视野(field)。
图5描绘了转染的细胞在第5天时的代表性的图像,显示了仅在与B18R一起培养的细胞中的GFP荧光。
图6描绘了来自含有修饰的核苷酸假尿苷和5-甲基胞苷的修饰的mRNA的蛋白质翻译。MRC-5成纤维细胞用含有利用假尿苷(Ψ)和/或5-甲基胞苷(5mC)的完全替代以及帽(Cap)0或帽1任一的5′帽的Oct4编码的mRNA转染。转染后将细胞固定并染色12小时。使用相同的照相机设定和曝光时间来捕捉每个图像。对于每个样品显示两个随机视野。
图7提供了直方图,其比较了来自含有修饰的核苷酸假尿苷和5-甲基胞苷的多种组合的RNA的相对的蛋白质翻译。如下分析图6中的图像:首先通过获取细胞核外的最大像素强度来确定背景阈值,并从所有像素中减去该值,然后计算平均像素强度。对于所有图像使用相同的阈值。误差棒指示来自两个随机视野的强度的标准差。
图8描绘了用编码多个重编程序蛋白的ivT RNA转染并且培养在含有免疫抑制剂B18R和高浓度(2ng/mL)的TGF-β的培养基中的成纤维细胞。箭头指示开始去分化但之后由于培养基中存在的高浓度TGF-β而停止去分化的细胞区域。
图9描绘了如图8中转染并培养在含有免疫抑制剂B18R但不含有TGF-β且不含有表面活性剂的培养基中的成纤维细胞。
图10描绘了如在图8中转染并培养在含有免疫抑制剂B18R和表面活性剂PluronicF-68两者但不含有TGF-β的培养基中的成纤维细胞中的GFP荧光。
图11描绘了如在图10中转染和培养的BJ(人包皮)成纤维细胞。箭头指示经历去分化的细胞。
具体实施方式
当在本文中使用时,“转染”是指将核酸递送至细胞的任何方法,包括用基于脂质的或基于肽的或基于聚合物的物质预络合核酸,然后将预络合的核酸递送至细胞。
当在本文中使用时,“表面活性剂”是指具有两亲性质的任何分子或降低液体的表面张力、两种液体之间的界面张力或液体和固体之间的界面张力的任何分子。
当在本文中使用时,“培养基”是指能够维持靶细胞在体外或体内生长的任何溶液,或在靶细胞或外源核酸在体外被应用于细胞或应用于患者体内之前与其混合的任何溶液。
当在本文中使用时,“干细胞”是指能够在体外或体内分化成另一细胞类型的任何细胞。
当在本文中使用时,“体细胞”是指非干细胞的任何细胞。
当在本文中使用时,“基本不含TGF-β的”培养基是指缺少TGF-β的培养基,或还没有向所述培养基添加TGF-β的培养基,或仅含有痕量的TGF-β使得TGF-β活性不会负面地影响体细胞去分化的能力的培养基。
用于使人成纤维细胞去分化成多能干细胞状态的方法已有报道(参见,例如,Angel和Yanik的美国专利申请公开号US2010/0273220;Warren等人(2010))。这些方法包括使用含有一种或多种抑制固有免疫应答的药剂的培养基重复递送编码重编程序蛋白的RNA(靶细胞的转染)。
本发明发现当靶细胞与基本不含TGF-β的培养基接触或培养在基本不含TGF-β的培养基中时,可有效地进行使用任何转染方法利用外源RNA的转染。
在一些实施方式中,提供了用于利用核糖核酸分子转染靶细胞的培养基。在一些实施方式中,提供了培养基,其包括DMEM/F12、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、胆固醇、鱼肝油脂肪酸(甲酯)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、D-α-生育酚醋酸酯、L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物和bFGF,其中所述培养基基本不含TGF-β。
在-些实施方式中,提供了主要由下述物质组成的培养基:DMEM/F12、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、胆固醇、鱼肝油脂肪酸(甲酯)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、D-α-生育酚醋酸酯、L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物、和bFGF,其中所述培养基基本不含TGF-β。
在一些实施方式中,所述培养基还包括人血清白蛋白。
在一些实施方式中,所述培养基还包括表面活性剂。在一些方面,所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
非离子表面活性剂包括但不限于根据下式I的化合物:
式I
其中x、y和z是整数。
非离子表面活性剂的实例包括但不限于PLURONIC F-68(也已知为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物;C3H60.C2H4O)x;CAS9003-11-06;Pub Chem Substance ID:24898182;SIGMA目录号P5556)和PLURONIC F-127(SIGMA目录号P2443)。
在一些方面,培养基中表面活性剂的量为约0.01%至约1%。在一个方面,表面活性剂的量是约0.1%。
表面活性剂已经用于大规模细胞培养中以通过减少水动力应力来增加细胞生存力。然而,在小规模细胞培养中,一般不使用表面活性剂,因为在这些系统中产生低的流体力。利用本文所述的含有约0.01%至约1%的量的表面活性剂的培养基,可以增加用编码重编程序蛋白的外源RNA重复转染的靶细胞的去分化效率。参见图10和图11以及实施例5。
在一些实施方式中,在培养基中包括一种或多种免疫抑制药剂(免疫抑制剂)。
在一些实施方式中,免疫抑制药剂是蛋白质。在一些实施方式中,免疫抑制药剂是B18R。
一些实施方式中,免疫抑制药剂是小分子。
在一些实施方式中,小分子是类固醇,包括但不限于地塞米松。
本文所述的培养基支持体细胞的生长、干细胞的生长、和用核糖核酸分子转染的细胞的去分化。
还提供了用核糖核酸分子转染靶细胞的方法。在一些实施方式中,所述方法包括抑制靶细胞中的固有免疫应答;和将所述核糖核酸分子引入至靶细胞中,其中靶细胞培养在如本文所述的培养基中。
在一些实施方式中,核糖核酸分子的引入产生靶细胞中的表型改变。靶细胞中的表型改变可以包括分化、转分化和/或去分化。在一些实施方式中,表型改变是体细胞分化成多重-或多潜能干细胞。
在一些实施方式中,靶细胞是体细胞。在一些实施方式中,细胞是体细胞,且目标蛋白(一种或多种)是重编程序蛋白,其有助于靶细胞分化成期望的表型,或转分化,或可选地所编码的蛋白有助于体细胞去分化成多重或多潜能干细胞。本文已经发现基本不含TGF-β的培养基有助于细胞的去分化。
在一些实施方式中,提供了通过本文所述的方法产生的细胞。所述细胞可以用作例如治疗剂,或用于筛选治疗性化合物的应用中。
在一些实施方式中,通过使靶细胞与编码一种或多种目标蛋白的外源RNA(ivT-RNA)接触之前或同时,使所述靶细胞与含有表面活性剂的培养基接触来提高利用外源核糖核酸分子(RNA)的转染效率。
本文所述的培养基可用于,例如,改进去分化方法,诸如美国专利申请公布号US2010/0273220中公开的方法,其在此通过引用全文并入。使用本文所述的培养基的方法可以用来产生高通量筛选所需的细胞。为了实现此目的,来自患者的细胞首先通过在用ivT RNA转染的同时或之前使它们与包括表面活性剂和优选地免疫抑制药剂的培养基接触来去分化。然后去分化的细胞在使用已建立的方法(Cooper等人(2010))被诱导分化成组织特异性细胞类型之前在培养中扩充数目。因为细胞未被无限增殖化,因此它们更准确地在体外重演疾病状态,并且重要地是,它们还没有被任何潜在危险的病毒或其他外源DNA分子转化。
以丧失确定的细胞群为特征的许多疾病和损伤可通过移植进行治疗,其中来自HLA-匹配的供体的组织从供体中移除,然后移植到受体中。然而,这种过程对于供体和受体两者带来巨大的风险,包括对于供体来说与手术和移除功能组织相关的风险,以及对于受体来说与手术和免疫排斥相关的风险。另外,对大多数组织类型来说,一直存在着供体的短缺。用于分化、转分化和/或去分化靶细胞的方法,包括在美国专利申请公布号US2010/0273220中所公开的那些,通过使用本文所述的培养基而改进。这种改进的方法可以用来产生用于细胞更替疗法的自体细胞和组织。为了实现此目的,来自患者的细胞首先如本文中那样被分化、转分化和/或去分化以获得患者所需要的期望的细胞类型的细胞。这些细胞随后被移植到患者中,单独地或与支架或其他装置组合,其中它们恢复丧失的组织的功能。可以维持正在进行的培养,以便进一步使用。
本文所述的培养基还可用于体外和体内应用,包括但不限于去分化、分化、转分化、神经再生和治疗性蛋白的过表达。用于将核酸递送至体内靶细胞的方法受到与用于将核酸递送至体外细胞的方法相关的相同问题中的许多问题的困扰,包括低转染效率的问题。
通过本文所述的组合物和方法增加用编码任何目标蛋白的外源RNA(或其他核酸)转染细胞的效力。下面的实施例描述了通过本文所述的特定组合物制备和使用培养基的一些示例性方式。应当理解这些实施例仅用于说明性目的且不意在限制本文所述的组合物和方法的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
细胞培养。原代人胎儿肺成纤维细胞(MRC-5),和新生儿皮肤成纤维细胞(BJ)获自ATCC并且培养在DMEM+10%FBS中。免疫抑制剂B18R(eBioscience)以200ng/mL的浓度使用。
体外转录。dsDNA模板如以前所述的进行制备,并且使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆至pCR-Blunt II-TOPO载体中。质粒通过用EcoRI(NEB)消化而线性化,并且使用高保真性聚合酶(KAPA HiFi,Kapa Biosystems)进行10个循环的PCR。扩增的模板在体外转录前进行凝胶纯化。使用mSCRIPT mRNA生产系统(EPICENTRE)合成加帽的poly(A)+RNA。在指示的时候,用假尿苷三磷酸和5-甲基胞苷三磷酸(TRILINK)分别置换UTP和CTP。为了生成含有帽0结构的mRNA,从加帽反应中省略2′-O-甲基转移酶。通过变性甲醛-琼脂糖凝胶电泳在poly(A)加尾之前和之后均分析转录物。用于组装体外转录模板的引物以前已经被公开(Angel&Yanik(2010))。
mRNA转染。根据制造商的说明书进行脂质介导的转染(Lipofectamine RNAiMAX,Invitrogen)。在每次转染后4小时更换培养基。
定量RT-PCR。使用RNEASY试剂盒(QIAGEN)提取RNA。在一步RT-PCR反应(ISCRIPT ONE-STE RT-PCR Kit,BIO-RAD)中使用TAQMAN基因表达测定法(APPLIEDBIOSYSTEMS),所述RT-PCR反应由下列步骤组成:50℃,10min反转录步骤,接着是95℃5min的初步变性步骤,以及95℃15秒和55℃30秒的45个循环。
免疫细胞化学。细胞在TBST中漂洗并在4%多聚甲醛中固定10分钟。然后细胞在0.1%TRITON x-100中透化(permeabilize)10分钟,在l%酪蛋白中封闭30分钟,并且用合适的抗体(Angel&Yanik(2010))温育。
实施例2
修饰的RNA是免疫原性的
体外转录的(ivT)mRNA是用于在体外和体内表达规定蛋白的有力工具,并且避免了与基于DNA载体相关的突变风险。尽管ivT mRNA被细胞快速翻译成高水平的功能蛋白,但如它们对利用RNA病毒的感染发生响应那样,细胞对利用ivT mRNA的重复感染通过以下方式发生响应:使细胞生长停止,增量调节外源RNA的受体,和分泌炎性细胞因子,所述炎性细胞因子使附近的细胞超敏化。最近已经证明对固有免疫系统的两个组成成分,I型干扰素信号传导和蛋白激酶R(PKR)的激活的抑制,挽救细胞免于发生由利用ivT mRNA的频繁转染所导致的细胞死亡(Angel&Yanik(2010))。已经进一步显示重复的ivT mRNA转染能够维持功能蛋白的表达,并且此技术可以用来在原代人成纤维细胞中表达重编程序因子。
已经提议将并入一些修饰的核苷酸作为减少ivT mRNA的免疫原性的方法(Warren等人(2010);Kormann等人(2011))。然而,在本文所讨论的本实验中,已经发现利用修饰的mRNA的单次转染在人成纤维细胞中引发强力的固有免疫应答,所述人成纤维细胞以以下为特征:包括IFIT1、2和3的数种干扰素刺激的基因的>100倍的增量调节,和外源RNA、TLR3和RIG-I的受体的>50倍的增量调节(图1)。随后每天一次的转染导致免疫相关基因的进一步增量调节(图1),消除了所编码的蛋白表达(图4、5),和大量的细胞死亡(图2、3)。向培养基补充I型干扰素信号传导的强力和特异性抑制剂(蛋白B18R)导致免疫相关基因的减少的增量调节(图1)、所编码蛋白的持续的高水平表达(图4、5)和以难区分于伪转染的(mock transfected)对照的速率的增殖(图2、3)。这些结果证明利用修饰的mRNA的转染可以在人成纤维细胞中引发强力固有免疫应答,并且通过并入这些修饰的核苷酸所获得的免疫原性的减小在频繁转染的背景下不会太强烈。
已经证明利用未修饰的mRNA,抑制细胞对外源RNA的固有免疫应答能够使频繁的转染得以实现(Angel(2008);Angel&Yanik(2010)),其中利用B18R——一种牛痘病毒编码的I型干扰素的诱杀型受体——抑制干扰素信号传导并能够使频繁的ivT mRNA转染得以实现(Angel&Yanik(2010);Symons等人(1995);Colamonici等人(1995))。从本文发现的结果看出似乎固有免疫抑制可能对于利用修饰的mRNA诸如含有假尿苷和5-甲基胞苷的修饰的mRNA的频繁转染也是必需的。
尽管其对外源RNA非常敏感,但在任何给定的时间中,典型的哺乳动物细胞可以含有超过100,000mRNA分子,和更多的rRNA和tRNA分子,所有这些分子都逃避细胞的固有免疫系统的检测。已经确认了数种结构特征,其可能促成病毒RNA的免疫原性,包括存在5′三磷酸和二级结构的区域。然而,这些元件对于病毒RNA不是独特的;tRNA含有5′三磷酸和大量的二级结构,而mRNA含有序列元件,在体外所述序列元件促进二级结构的形成,尽管没有很好地理解这些结构在体内实际形成的程度。另外,tRNA经历大量的转录后修饰,包括特定核苷酸的碱基修饰。令人感兴趣的是,尽管mRNA通常不含有修饰的核苷酸,但将tRNA中存在的许多修饰的核苷酸并入至ivT mRNA中可以减少其免疫原性(Kariko等人(2004);Kariko等人(2005))。这可能是tRNA中修饰的核苷酸的存在可能不仅用于稳定其三级结构,而且也可能防止tRNA激活固有免疫系统。
尽管将许多修饰的核苷酸并入至ivT mRNA中已知抑制翻译,但Kariko等人提出假尿苷(Ψ)和5-甲基胞苷(5mC)的并入不抑制翻译,并且假尿苷对尿苷的完全置换产生了具有减少的免疫原性的ivT mRNA,与未修饰的mRNA相比,其在体外和体内都被翻译成显著更多的蛋白(Kariko等人(2008))。最近,这些作者通过显示含有假尿苷的mRNA逃避PKR的检测说明含假尿苷的mRNA的增加翻译潜力(Anderson等人(2005))。
在本文中显示了实验结果,其中用不含修饰、含有假尿苷、5-甲基胞苷或两种修饰的核苷酸的组合的ivT mRNA合成和转染细胞。尽管并入修饰的核苷酸可以减少ivTmRNA的免疫原性,但在实施例3中显示在频繁转染的背景下这种效应可以是可忽略的。显示利用修饰的mRNA的单次转染在原代人成纤维细胞中引发强力的免疫应答,并且固有免疫抑制对于实现所编码蛋白的持续的高水平表达以及挽救细胞免于由利用修饰的mRNA的频繁转染所引起的细胞死亡两者可能均是必不可少的。
在用修饰的mRNA单次转染后,干扰素刺激的基因IFIT1以GAPDH的10%表达,其代表与仅载体对照相比大约100倍的增量调节。还检测到高水平的干扰素刺激的基因OAS1(0.5-1%的GAPDH),而在仅载体对照中没有检测到OAS1的表达。
为了测试5-甲基胞苷并入以增加从含假尿苷的mRNA的蛋白质翻译的能力,合成了含有这些修饰的核苷酸的组合的编码Oct4的RNA。用这些修饰的RNA转染成纤维细胞并且通过免疫细胞化学测量Oct4蛋白的表达。在实施例4中,显示假尿苷的并入增加从ivT mRNA的蛋白质翻译,与之前Kariko等人(2008)的结果一致。
然而,如本文所示,在成纤维细胞中向含假尿苷的mRNA中添加5-甲基胞苷将蛋白质翻译降低至与未修饰的mRNA相当或更少的水平。另外,显示了并入帽1结构的以前发表的mRNA设计与在修饰的以及未修饰的mRNA中均含有标准帽0帽的mRNA相比产生增加的蛋白质翻译。
实施例3
固有免疫抑制能够使利用修饰的RNA的频繁转染得以实现
如Warren等人所述,制备编码Oct4、Sox2、Klf4、肿瘤启动c-Myc T58A突变体(Hermann等人(2005))、Lin28和去稳定核GFP的ivT mRNA的混合物。MRC-5人胎儿肺成纤维细胞以在DMEM+10%FBS中的50,000个细胞/孔的密度平板接种在6孔平板中,6小时后将培养基更换为Nutristem+100ng/mL bFGF或Nutristem+100ng/mL bFGF+200ng/mL B18R。从接下来的一天开始,如作者所述用1.2μg修饰的mRNA每24小时转染细胞持续5天(图2)。每天更换一次培养基(包括补充剂)。在第一次转染后1天(第1天)转染的细胞在形态学上难区分于仅载体对照。然而,在第2天开始,在转染的孔中观察到漂浮/死细胞的数目增加,并且到第3天时转染的孔显示出大量的细胞死亡,这是用未修饰的mRNA重复转染的特征。相反,在含有B18R的孔中,转染的细胞快速增殖,并且在整个实验过程中保持难区分于仅载体对照的密度(图3)。在第1天时在转染的孔中检测到强GFP信号。然而,到第2天时,几乎检测不到GFP表达,除了含有B18R的孔,其中至第5天检测到高水平的GFP。在此实验中不包括饲养层,然而在包括饲养层的实验中已经观察到类似的结果。
为了检验修饰的mRNA的免疫原性,在单次转染后从细胞的样品中提取RNA,并且测量以前发现在用未修饰的mRNA转染后被增量调节的一组基因的表达(图1)。IFIT1和OAS1的表达在以前由其他人(Warren等人)所报道的值的2倍以内,而RIG1的表达比报道值低大约10倍。PKR的表达比报道值高大约30倍,然而在仅载体对照中PKR的表达比报道值高大约10倍,可能反映了PKR在MRC-5和BJ成纤维细胞中的差异性表达。IFNB1的表达为GAPDH的大约0.5%,其代表相对于仅载体对照的大约7倍的增量调节。观察到的两种干扰素刺激的基因IFIT1和OAS1几乎相同的增量调节(并且也由Warren等人报道)以及观察到的RIG-I的较低表达得出以下结论:在本实验中使用的修饰的mRNA与Warren等人的相比没有更多的免疫原性。
除了上述的基因以外,还发现在用修饰的mRNA单次转染后,IFIT2、IFIT3、OAS3和OASL的>100倍的增量调节,和TLR3的>50倍的增量调节。另外,检测到OAS1和OAS2的高水平表达,外源RNA的两种模式识别受体在仅载体对照中没有被表达。事实上,检测到我们的组中的每种基因的>5倍的增量调节,指示利用修饰的mRNA的单次转染在成纤维细胞中已经引发了强烈的固有免疫应答。另外,在第二转染后这些基因中的许多被进一步增量调节。
还测量了在用修饰的mRNA转染但在含有B18R的培养基中培养的细胞中固有免疫相关基因的表达(图1)。发现与未用免疫抑制剂处理的细胞相比,在我们的组中的免疫相关基因的表达减少,并且与仅载体对照相比,在那些细胞中已经显著增量调节的许多基因(IFNB1、TLR3、EIF2AK2、STAT1、STAT2、IFIT5、OAS3、ISG20)增量调节<2倍。事实上,在用修饰的mRNA转染5次并暴露于免疫抑制剂的细胞中该组中的基因的表达低于用修饰的mRNA仅转染一次并且未暴露于免疫抑制剂的细胞中的表达。
实施例4
含有大量修饰的RNA与未修饰的或最小修饰的RNA相比翻译的效率更低
已经确定用修饰的mRNA的转染在人成纤维细胞中引发强力的固有免疫应答,并且固有免疫抑制挽救细胞免于由用修饰的mRNA重复转染所导致的大量细胞死亡,下一步寻求证实将5-甲基胞苷并入至含假尿苷的ivT mRNA中是否会如报道的那样增强所编码蛋白的翻译。为对此进行测试,在体外转录反应中合成了加帽的和加尾的编码Oct4的mRNA,和置换UTP和CTP的Ψ-三磷酸、5mC-三磷酸或Ψ-三磷酸和5mC-三磷酸两者。遵循以前发表的实验方案(Angel&Yanik(2010))来生成含有Cap1结构的RNA,最近已经显示其通过抑制病原体识别受体的IFIT家族成员的限制而减少RNA的免疫原性(Daffis等人(2010))。还合成了含有帽0结构的mRNA,其更接近地类似于由Warren等人所使用的合成帽结构。成纤维细胞以1x105个细胞/孔的密度平板接种在6孔平板中。数小时后,如前面-样用Nutristem+100ng/mL bFGF更换培养基。接下来一天,用0.5ug/孔的编码Oct4的mRNA转染成纤维细胞。转染后4小时更换培养基,并且在转染后12小时将培养平板固定并针对Oct4蛋白进行染色(图6)。
基于之前已经描述的设计的mRNA(未修饰的,帽1)产生了许多具有明染色的(brightly staining)核的细胞(图6)。并入Ψ使所翻译的蛋白的量增加大约4倍,而并入5mC显示可忽略不计的增加(图7)。这些结果与Kariko等人所给出的结果一致,即Ψ增加从ivT mRNA的蛋白质翻译,并且5mC-并入的效应则适度得多。并入Ψ和5mC两者使蛋白质翻译的量相对于未修饰的mRNA降低大约2倍。从独立批次的编码GFP和mCherry并且使用从两个不同的供应商获得的5-甲基胞苷三磷酸的mRNA获得几乎相同的结果。使用合成的具有帽0结构的mRNA也获得类似的结果,尽管以每种核苷酸组合,当与相应的帽1mRNA相比时蛋白质翻译明显减少。
实施例5
开发用于有效核酸转染和去分化的培养基
开发了能够实现细胞的有效去分化的12种培养基制剂(R1-R12)。培养基R1-R6含有表面活性剂(0.1%Pluronic F-68),其可以增加利用核酸的转染效率。尽管以前已经描述了用于培养干细胞的培养基,但这样的制剂含有已知抑制去分化的成分(例如,TGF-β)。图8描绘了使用以前描述的含有TGF-β的培养基去分化细胞的实验结果。白色箭头显示开始去分化但之后由于存在TGF-β而停止去分化的细胞。图9描绘了使用不含TGF-β或表面活性剂的培养基去分化细胞的实验结果。此实验中的细胞没有经历有效的去分化。图10和图11描绘了使用本发明的培养基(不含TGF-β或其他去分化抑制剂,但含有表面活性剂)去分化细胞的实验。此实验中的细胞被有效转染,如由GFP的高水平表达所证明的(图10),并且被有效去分化,如由在仅9天转染后表现出去分化特征的明确的形态学改变所证明(图11)。在本实施例中所述的所有实验中,根据美国专利申请公布号2010/0273220中描述的本发明人的之前公开的方法,通过利用编码重编程序蛋白的RNA的重复转染将细胞去分化。
培养基R1:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
0.1Pluronic F-68
培养基R2:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
0.1Pluronic F-68
0.5%人血清白蛋白
培养基R3:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
0.1Pluronic F-68
培养基R4:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
0.1Pluronic F-68
0.5%人血清白蛋白
培养基R5:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
200nM地塞米松
0.1%Pluronic F-68
培养基R6:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
200nM地塞米松
0.1Pluronic F-68
0.5%人血清白蛋白
培养基R7:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
培养基R8:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
0.5%人血清白蛋白
培养基R9:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
培养基R10:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
0.5%人血清白蛋白
培养基R11:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
200nM地塞米松
培养基R12:
DMEM/F12
2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
5ug/mL胰岛素
5ug/mL转铁蛋白
5ng/mL亚硒酸
4.5ug/mL胆固醇
10ug/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)
25ug/mL聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
2ug/mL D-α-生育酚醋酸酯
1ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物
20ng/mL bFGF
200ng/mL B18R
200nM地塞米松
0.5%人血清白蛋白
参考文献
1.Angel M(2008)Extended Transient Transfection by Repeated Delivery of In Vitro-Transcribed RNA[Master′s Thesis].Cambridge,Massachusetts:Massachusetts Instituteof Technology.56p.
2.Angel M,Yanik MF(2010)Innate immune suppression enables frequent transfectionwith RNA encoding reprogramming proteins.PLoS One5:1-7.
3.Takahashi K,Yamanaka S(2006)Induction of pluripotent stem cells from mouseembryomc and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell126:663-676.
4.Okita K,Ichisaka T,Yamanaka S(2007)Generation of germline-competent inducedpluripotent stem cells.Nature448:313-317.
5.Wernig M,Meissner A,Foreman R,Brambrmk T,Ku M,et al.(2007)In vitroreprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.Nature448:318-324.
6.Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,Ichisaka T,et al.(2007)Induction ofpluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell131:861-872.
7.Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL, et al.(2007)Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science318:1917-1920.
8.Park IH,Zhao R,West JA,Yabuuchi A,Huo H,et al.(2008)Reprogramming of humansomatic cells to pluripotency with defined factors.Nature451:141-146.
9.Lowry WE,Richter L,Yachechko R,Pyle AD,Tchieu J,et al.(2008)Generation ofhuman induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.Proc Natl Acad Sci U SA105:2883-2888.
10.Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,Tian S,Stewart R,et al.(2009)Human induced pluripotentstem cells free of vector and transgene sequences.Science324:797-801.
11.Jia F,Wilson KD,Sun N,Gupta DM,Huang M,et al.A nonviral minicircle vector forderiving human iPS cells.Nat Methods7:197-199.
12.Zhou H,Wu S,Joo JY,Zhu S,Han DW,et al.(2009)Generation of induced pluripotentstem cells using recombinant proteins.Cell Stem Cell4:381-384.
13.Kim D,Kim CH,Moon H,Chung YG,Chang MY,et al.(2009)Generation of humaninduced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.Cell StemCall4:472-476.
14.Yakubov E,Rechavi G,Rozenblatt S,Givol D Reprogramming of human fibroblasts topluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.Biochem Biophys ResCommun394:189-193.
15.Warren L,Manos PD,Ahfeldt T,Loh YH,Li H,et al.(2010)Highly efficientreprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells withsynthetic modified mRNA.Cell Stem Cell7:618-630.
16.LinT,Ambasudhan R,Yuan X,Li W,Hilcove S,et al.(2009)A chemical platform forimproved induction ofhuman iPSCs.Nat Methods6:805-808.
17.Cooper O,Hargus G,Deleidi M,Blak A,Osborn T,et al.(2010)Differentiation ofhuman ES and Parkinson′s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neuronsrequires a high activity form of SHH,FGF8a and specific regionalization by retinoicacid.Mol Cell Neurosci45:258-266.
18.Kormann MS,Hasenpusch G,An eja MK,Nica G,Flemmer AW,et al.(2011)Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.Nat Biotechnol29:154-157.
19.Symons JA,Alcami A,Smith GL(1995)Vaccinia virus encodes a soluble type Iinterferon receptor of novel structure and broad species specificity.Cell81:551-560.
20.Colamonici OR,Domanski P,Sweitzer SM,Larner A,Buller RM(1995)Vaccinia virusB18R gene encodes a type I interferon-binding protein that blocks interferon alphatransmembrane signaling.J Biol Chem270:15974-15978.
21.Yoneyama M,Kikuchi M,Natsukawa T,Shinobu N,ImaizumiT,et al.(2004)TheRNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innateantiviral responses.Nat Immunol5:730-737.
22.Hornung V,Ellegast J,Kim S,Brzozka K,Jung A,et al.(2006)5′-Triphosphate RNAis the ligand for RIG-I.Science314:994-997.
23.Saito T,Owen DM,Jiang F,Marcotrigiano J,Gale M,Jr,(2008)Innate immunityinduced by composition-dependent RIG-I recognition of hepatitis C virus RNA.Nature454:523-527.
24.Takahasi K,Yoneyama M,Nishihori T,Hirai R,Kumeta H,et al.(2008)NonselfRNA-sensing mechanism of RIG-I heliease and activation of antiviral immuneresponses.Mol Cell29:428-440.
25.Yoneyama M,F ujita T(2008)Structural mechanism of RNA recognition by theRIG-I-like receptors.Immunity29:178-181.
26.Schmidt A,Schwerd T,Hamm W,Hellmuth JC,Cui S,et al.(2009)5′-triphosphateRNA requires base-paired structures to activate antiviral signaling via RIG-I.Proc NatlAcad Sci U S A106:12067-12072.
27.Schlee M,Roth A,Hornung V,Hagmann CA,Wimmenauer V,et al.(2009)Recognition of5′triphosphate by RIG-I helicase requires short blunt double-strandedRNA as contained in panhandle of negative-strand virus.Immunity31:25-34.
28.Kariko K,Ni H,Capodici J,Lamphier M,Weissman D(2004)mRNA is an endogenousligand for Toll-like receptor3.J Biol Chem279:12542-12550.
29.Kariko K,Buckstem M,Ni H,Weissman D(2005)Suppression of RNA recognition byTolllike receptors:the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin ofRNA.Immunity23:165-175.
30.Kariko K,Muramatsu H,Welsh FA,Ludwig J,Kato H,et al.(2008)Incorporation ofpseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increasedtranslational capacity and biological stability.Mol Ther16:1833-1840.
31.Anderson BR,Muramatsu H,Nallagatla SR,Bevilacqua PC,Sansing LH,et al.(2010)Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKRactivation.Nucleic Acids Res.
32.Hemann MT,Bric A,Teruya-Feldstem J,Herbst A,Nilsson JA,et al.(2005)Evasion ofthe p53tumour surveillance network by tumour-derived MYC mutants.Nature436:807-811.
33.Daffis S,Szretter KJ,Schriewer J,Li J,Youn S,et al.(2010)2′-O methylation oftheviral mRNA cap evades host restriction by IFIT family members.Nature468:452-456.

Claims (13)

1.一种用于用核糖核酸分子转染靶细胞的培养基,所述培养基包括DMEM/F12、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、胆固醇、鱼肝油脂肪酸(甲酯)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、D-α-生育酚醋酸酯、L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物和bFGF,其中所述培养基基本上不含TGF-β。
2.根据权利要求1所述的培养基进一步包括人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的培养基进一步包括表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的培养基,其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
5.根据权利要求1所述的培养基进一步包括免疫抑制剂。
6.根据权利要求5所述的培养基,其中所述免疫抑制剂是B18R。
7.根据权利要求5所述的培养基,其中所述免疫抑制剂是地塞米松。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的培养基,其中所述培养基支持体细胞的生长、干细胞的生长和用核糖核酸分子转染的细胞的去分化。
9.一种用核糖核酸分子转染靶细胞的方法,所述方法包括:
抑制所述靶细胞中的固有免疫应答;以及
将所述核糖核酸分子引入至所述靶细胞中,其中所述靶细胞在根据权利要求1-8中任一项所述的培养基中培养。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述核糖核酸分子的引入在所述靶细胞中产生表型改变。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述靶细胞中的表型改变是分化、转分化或去分化。
12.根据权利要求9所述的方法,其中所述靶细胞是体细胞。
13.一种通过权利要求9-12中任一项所述的方法产生的细胞。
CN201280021922.XA 2011-03-07 2012-03-07 用核酸转染细胞的方法 Pending CN103502436A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161450116P 2011-03-07 2011-03-07
US61/450,116 2011-03-07
PCT/US2012/028146 WO2012122318A2 (en) 2011-03-07 2012-03-07 Methods for transfecting cells with nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103502436A true CN103502436A (zh) 2014-01-08

Family

ID=46798783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280021922.XA Pending CN103502436A (zh) 2011-03-07 2012-03-07 用核酸转染细胞的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20140073053A1 (zh)
EP (1) EP2683812A4 (zh)
CN (1) CN103502436A (zh)
AU (1) AU2012225497A1 (zh)
CA (1) CA2832807A1 (zh)
WO (1) WO2012122318A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072256A (zh) * 2016-05-06 2018-12-21 美天旎生物技术有限公司 用于将核酸引入细胞的方法

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10837020B2 (en) 2009-04-22 2020-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
HRP20220796T1 (hr) 2010-10-01 2022-10-14 ModernaTX, Inc. Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracil i njihove uporabe
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
EP2788033B1 (en) 2011-12-05 2017-05-31 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
RU2019143431A (ru) 2012-11-01 2020-04-28 Фэктор Байосайенс Инк. Способы и продукты для экспрессии белков в клетках
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
MX2016009771A (es) 2014-01-31 2016-11-14 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para la produccion y administracion de acido nucleico.
WO2016007644A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 The Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating diabetes
EP3543339A1 (en) 2015-02-13 2019-09-25 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
CN116115629A (zh) 2016-08-17 2023-05-16 菲克特生物科学股份有限公司 核酸产品及其施用方法
AU2019319911A1 (en) * 2018-08-09 2021-03-18 Kernal Biologics, Inc. Precisely engineered stealthy messenger RNAs and other polynucleotides
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1668324A (zh) * 2002-05-28 2005-09-14 诺沃塞尔公司 用于胰岛素产生细胞的方法、组合物及生长与分化因子
CN1784142A (zh) * 2003-05-09 2006-06-07 生命血液医学公司 用于维持器官和细胞生存能力的组合物
CN1867666A (zh) * 2003-10-16 2006-11-22 爱丁堡大学管理处 改进对es细胞自我更新和谱系特化的控制以及用于此目的的培养基

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9625175D0 (en) * 1996-12-04 1997-01-22 Medi Cult As Serum-free cell culture media
GB0003231D0 (en) * 2000-02-11 2000-04-05 Medi Cult As Cell culture media
EP2421563B1 (en) * 2009-04-22 2017-04-12 Massachusetts Institute of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
EP2424877A4 (en) * 2009-04-28 2013-01-02 Harvard College SUPERCHARGED PROTEINS FOR CELL PENETRATION
EP2788033B1 (en) * 2011-12-05 2017-05-31 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1668324A (zh) * 2002-05-28 2005-09-14 诺沃塞尔公司 用于胰岛素产生细胞的方法、组合物及生长与分化因子
CN1784142A (zh) * 2003-05-09 2006-06-07 生命血液医学公司 用于维持器官和细胞生存能力的组合物
CN1867666A (zh) * 2003-10-16 2006-11-22 爱丁堡大学管理处 改进对es细胞自我更新和谱系特化的控制以及用于此目的的培养基

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. VAN DER VALK等: "Optimization of chemically defined cell culture media – Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods", 《TOXICOLOGY IN VITRO》 *
LUIGI WARREN等: "Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA", 《CELL STEM CELL》 *
李景红等: "转化生长因子-β1和胰岛素对人鼻中隔软骨细胞增殖和分化影响的研究", 《耳鼻咽喉-头颈外科》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072256A (zh) * 2016-05-06 2018-12-21 美天旎生物技术有限公司 用于将核酸引入细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2683812A4 (en) 2014-12-03
WO2012122318A3 (en) 2012-12-20
US20140073053A1 (en) 2014-03-13
EP2683812A2 (en) 2014-01-15
WO2012122318A2 (en) 2012-09-13
AU2012225497A1 (en) 2013-10-24
CA2832807A1 (en) 2012-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103502436A (zh) 用核酸转染细胞的方法
EP2423302B1 (en) New serum-free medium for inducing pluripotent stem cells quickly with high efficiency and method using thereof
ES2549155T3 (es) Células iPS obtenidas a partir de células NKT y células NKT obtenidas a partir de las mismas
US10435711B2 (en) Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA
ES2951822T3 (es) Derivación sin alimentadores de células madre pluripotentes inducidas humanas con ARN mensajero sintético
CN102190731B (zh) 用人工转录因子诱导产生多能干细胞
EP3904504A1 (en) Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger rna
JP7554670B2 (ja) 一時的かつ一過性プラスミドベクター発現システムを用いる細胞のリプログラミング
JP2021019592A (ja) より未分化状態への細胞の誘導方法
US11859168B2 (en) Electroporation, developmentally-activated cells, pluripotent-like cells, cell reprogramming and regenerative medicine
CN101684455B (zh) 抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用
JP2022534395A (ja) 細胞リプログラミングのための組成物および方法
JP2018082639A (ja) 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地
JP7050696B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための方法
KR102361849B1 (ko) 합성 메신저 rna를 사용한 인간-유도된 만능 줄기 세포의 무-피더 유래
JP2019170405A (ja) 合成メッセンジャーrnaによるヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導
KR102418500B1 (ko) 넙치 지느러미 유래 신규 세포주 kts 및 이의 용도
Carpio et al. Direct comparison of DNA versus mRNA on the efficiency of induced pluripotent stem cells generation from human primary fibroblasts

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C05 Deemed withdrawal (patent law before 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140108