JP2021019592A - より未分化状態への細胞の誘導方法 - Google Patents
より未分化状態への細胞の誘導方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021019592A JP2021019592A JP2020156867A JP2020156867A JP2021019592A JP 2021019592 A JP2021019592 A JP 2021019592A JP 2020156867 A JP2020156867 A JP 2020156867A JP 2020156867 A JP2020156867 A JP 2020156867A JP 2021019592 A JP2021019592 A JP 2021019592A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- muc1
- protein
- cell
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 711
- 101000979629 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase A Proteins 0.000 claims abstract description 220
- 102100023252 Nucleoside diphosphate kinase A Human genes 0.000 claims abstract description 219
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 138
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 134
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 101001128732 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase 7 Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102100032115 Nucleoside diphosphate kinase 7 Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 52
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 38
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 493
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 492
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 251
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 110
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 106
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 54
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 49
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 44
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims description 43
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 claims description 41
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 claims description 41
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims description 41
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 37
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 34
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 30
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 28
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 claims description 21
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 claims description 21
- -1 NANOG Proteins 0.000 claims description 20
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 15
- 101001128739 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase 6 Proteins 0.000 claims description 14
- 102100032113 Nucleoside diphosphate kinase 6 Human genes 0.000 claims description 14
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 102100030200 Matrix metalloproteinase-16 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100030216 Matrix metalloproteinase-14 Human genes 0.000 claims description 12
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 10
- 101001011906 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-14 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001011886 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-16 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 108010076557 Matrix Metalloproteinase 14 Proteins 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 claims description 5
- 101001139146 Homo sapiens Krueppel-like factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100020675 Krueppel-like factor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000561 Matrix metalloproteinase-16 Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 claims description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 claims description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 2
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 185
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 87
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 32
- 101150069263 tra gene Proteins 0.000 description 31
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 25
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 20
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 20
- 101150047114 osk gene Proteins 0.000 description 19
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 18
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 18
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 18
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 16
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 15
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 10
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 10
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 10
- 102100031942 Oncostatin-M Human genes 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000009844 basic oxygen steelmaking Methods 0.000 description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 10
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 8
- 101000979623 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase B Proteins 0.000 description 7
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 7
- 102100023258 Nucleoside diphosphate kinase B Human genes 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 7
- 102000043279 ADAM17 Human genes 0.000 description 6
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 6
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 6
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 4
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 4
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101100346929 Homo sapiens MUC1 gene Proteins 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 102000057860 human MUC1 Human genes 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000976618 Mus musculus Zinc finger protein 42 Proteins 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 3
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 102100032291 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 16 Human genes 0.000 description 2
- 101710108710 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 16 Proteins 0.000 description 2
- IKYJCHYORFJFRR-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 350 Chemical compound O=C1OC=2C=C(N)C(S(O)(=O)=O)=CC=2C(C)=C1CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O IKYJCHYORFJFRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100031116 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 19 Human genes 0.000 description 2
- 101710121160 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 19 Proteins 0.000 description 2
- 102100022820 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 28 Human genes 0.000 description 2
- 101710121068 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 28 Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 2
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000577874 Homo sapiens Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000942966 Mus musculus Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102000013901 Nucleoside diphosphate kinase Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 101710100179 UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 2
- 101710119674 UMP-CMP kinase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 102000052983 human POU5F1 Human genes 0.000 description 2
- 102000047444 human SOX2 Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009682 proliferation pathway Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b,9,9a-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-1,1a,1b,4,4a,7a,7b,8,9,9a-decahydro-5H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-5-one Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(O)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N 0.000 description 1
- ZZUZYEMRHCMVTB-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethynesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C#CC1=CC=CC=C1 ZZUZYEMRHCMVTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 101710150820 Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100023078 Early endosome antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150094793 Hes3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001050162 Homo sapiens Early endosome antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001128748 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 101150013204 MPS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150114927 MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 1
- 108091028684 Mir-145 Proteins 0.000 description 1
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800001322 Mucin-1 subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102400001154 Mucin-1 subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100011750 Mus musculus Hsp90b1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100510267 Mus musculus Klf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032209 Nucleoside diphosphate kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000052119 human NME1 Human genes 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940118537 p53 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N phorbol Natural products C[C@@H]1[C@@H](O)[C@]2(O)[C@H]([C@H]3C=C(CO)C[C@@]4(O)[C@H](C=C(C)C4=O)[C@@]13O)C2(C)C QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N taxol® Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(CC(C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3(C21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 101150117196 tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
- C12Y207/04006—Nucleoside-diphosphate kinase (2.7.4.6)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
疾病或は老化によって誘導された損傷を修復する細胞及び組織を生成するために、患者自身の皮膚細胞に由来した幹細胞を使用することができるので、誘導化多分化能幹(iPS)細胞の作製は、真に個別化された再生医療(山中(2007年); Jaenishおよびヤング、2008年)の実現のための大きな希望となった。
転写調節因子の組合せの強制的な発現(Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc又はOct4、Sox2、NanogおよびLin28)は、成熟した細胞を多分化能の状態に戻らせることが示された。
多数のベクターの使用は、多数の複合化した影響のために問題をおこした。それは、腫瘍形成性(高橋および山中、2006年; 葵ら、2008年)の増加した危険に結びつく可能性がある。研究者は、単一のベクター・システム(ソメル、2009年ら)、分離可能なベクター(梶ら、2009年; Soldnerら、2009年; Woltjenら、2009年)、非統合ベクター(Stadtfeldら、2009年; Yuら、2009年)および一時的なトランスフェクション(Okita、2009年ら)の使用により、この問題を克服しようとした。しかしながら、これらの方法は後成的な再プログラムの達成で非常に非能率的であった。
1) タンパク質遺伝子産物は、遺伝子の必要性に取って代わることができる;
2) 遺伝子をアップレギュレートする小分子は、遺伝子の必要性を代替えすることができる;
3)そして、同じ制御経路の遺伝子(あるいは遺伝子産物)は互いの代わりになることができる。
(i) 細胞におけるMUC1かNMEタンパク質の量の増加;
(ii) 細胞における発現MUC1かNMEタンパク質の増加;
あるいは、
(iii) MUC1かNMEタンパク質の活性の増加。
(i)出発細胞を、より少ない成熟状態に戻るかあるいはより少ない成熟状態に維持するように導くように、上記の方法を実行すること、
(ii)より少ない成熟細胞を分化させること。
MUC1*関連因子とは、制限なしで、MUC1*受容体の二量化、MUC1*の増加した生産、MUC1受容体の開裂を導くことに影響する物質と、さらなる開裂と二量化である、MUC1受容体のより高い転写発現によるMUC1*活性を増加させる物質を意味する。
これらの細胞が分化するとともに、それらはCD34+/CD38-からCD34-/CD38+に変化する。万一、1つがより少ない成熟状態に戻るためにCD34-/CD38+細胞をもたらしたら、細胞はCD34の発現を回復する。分化形質転換は出発細胞をより少ない成熟状態に戻ることを含み、そこでは細胞が不安定になり、たとえ、出発細胞が結果細胞として同じ相対的なレベルの分化状態にあったとしても、より分化細胞タイプに分化する方向に向く(Iedeら、2010;Efeら、2011)。例えば、心臓繊維芽細胞は、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCの簡潔な異所性発現によって、より少ない成熟状態にもどり、この不安定状態から心筋細胞へ分化した。
この発明のポリヌクレオチド・ベクターとは、制限なく、いくつかの形式のうちのどれにでもあてはめることが可能である。RNA、DNA、レトロウイルスのコートに包み込まれたRNA、アデノウイルスのコートに包み込まれたDNA、別のウイルスあるいはウイルス様形式(単純疱疹およびアデノ関連性ウイルス(AAV)のような)で包まれたDNA、リポソームに包み込まれたDNA、ポリリシンとの複合体DNA、合成のポリカチオン性分子との複合体DNA、分子を免疫学的にマスクするため及び/または半減期の延長のためにポリエチレングリコール(PEG)のような合成物との複合体DNA、あるいは非ウィルス性蛋白質へ結合したDNAが例示される。好適には、ポリヌクレオチドはDNAである。本願明細書の記述において使用されるように、「DNA」は、塩基A、T、CおよびGだけでなく、これら塩基の類似もしくは修飾形態のものも含み、メチル化されたヌクレオチド、非荷電リンケージとチオエート(thioates)ようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、およびポリアミドのような修飾及び/または互換的主鎖構造が例示される。
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA
ASANL (SEQ ID NO: 1) 全長MUC1受容体(ムチン1前駆体(Genbank登録番号): P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT (SEQID NO: 2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA (SEQID NO: 3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG (SEQID NO: 4)
SEQ ID NOS:2、3および4は、MUC1受容体志向性N末端MUC-1シグナリング配列。細胞膜表面にトランケートされたアイソフォーム。3つまでのアミノ酸残基が、SEQ ID NOS:2,3,4のバリアントによって示されるようなC末端で欠失することが可能である。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKN(SEQ ID NO:5)
そのN-末端でnat-PSMGFRを持っているトランケートされたMUC1受容体アイソフォームであり、全長MUC1受容体の膜貫通性の細胞質内の配列を含む。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO: 6)
MUC1成長因子受容体(nat-PSMGFR -「PSMGFR」の例)のネイティブ一次配列。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO: 7)
SEQ ID NO6のN-末端で単一のアミノ酸欠失を持つMUC1成長因子受容体(nat-PSMGFR -「PSMGFR」の例)のネイティブ一次配列。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO: 8)
増強された安定性を持っているMUC1成長因子受容体のネイティブ一次配列の「SPY」の機能的なバリアント(var-PSMGFR -「PSMGFR」の例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO: 9)
SEQ ID NO8のC末端で単一のアミノ酸欠失を持ち、増強された安定を持っているMUC1成長因子受容体のネイティブ一次配列の「SPY」の機能的なバリアント(var-PSMGFR -「PSMGFR」の例)。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQID NO: 10)
MUC1の細胞質のドメインヌクレオチド配列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 11)
MUC1の細胞質のドメインアミノ酸配列について記述する。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaac、cagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatg、cagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQID NO: 12)
NME7ヌクレオチド配列(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQID NO: 13)
NME7アミノ酸配列 (NME7: GENBANKACCESSION AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggag、gggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQID NO: 14)
NM23-H1ヌクレオチド配列(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)
NM23-H1のアミノ酸配列(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggag、gggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQID NO: 16)
NM23-H1 S120G突然変異体ヌクレオチド配列(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQID NO: 17)
NM23-H1 S120G突然変異体アミノ酸配列(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)。
atg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc
ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga aaaccaagac
gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga cctacatgaa
cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct cacacatgtg
a (SEQ ID NO: 18)
ヒトSOX2ヌクレオチド配列(SOX2:GENBANK ACCESSION NM_003106)。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM(SEQID NO: 19)
人のSOX2アミノ酸配列(SOX2:GENBANK ACCESSION NM_003106)。
atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggag、agcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtg、gaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtccttt、cctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga(SEQID NO: 20)
人Oct4のヌクレオチド配列。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQID NO: 21)
人Oct4のアミノ酸配列。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccatt、cgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQID NO: 22)
NM23-H2ヌクレオチド配列(NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQID NO: 23)
NM23-H2アミノ酸配列(NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448)。
atggctgtcagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctg、acccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcag、ccgcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgtcacgaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtctt、gaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaaacct、taccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt(SEQID NO: 24)
KLF4ヌクレオチド配列(KLF4:GENBANK ACCESSION AF022184)。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPAGPYDLAAATVATDLESAGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF(SEQID NO: 25)
KLF4アミノ酸配列(KLF4: GENBANKACCESSION AF022184)。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgctgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgctcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggt、ggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtg、gtcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactggtcctc、aagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagctaaaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagccacagca、tacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcggaaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcg(SEQID NO: 26)
c-Mycヌクレオチド配列(c-Myc:GENBANKACCESSION BC000917)。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQID NO: 27)
c-Mycアミノ酸配列(c-Myc: GENBANKACCESSION BC000917)。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgaggaggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagtggttcaacgtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagtggatgtctttgtgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggagttcacctttaagaagtcagccaagggtctg、gaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattgggagtgagaggcggccaaaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtggaggtctagatcatcatgccaaggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatcagccatatggtagcctcatgtccgctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcgagaggaagaagaagaaatccacagccctaccctgctcccggaggcacag、aat(SEQ ID NO: 28)
LIN28ヌクレオチド配列(LIN28:GENBANK ACCESSION AF521099)。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNVRMGFGFLSMTARAGVALDPPVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSAKGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGGLDHHAKECKLPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLPEAQN(SEQID NO: 29)
LIN28アミノ酸配列(LIN28: GENBANKACCESSION AF521099)。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgctccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcctccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccggggacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacggcttgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccagacaagtttggggctgagatcaag、gccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacataatgaaatcactttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaaggcgttccgcgtgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccatgagaagcaggccgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgagggcggcttcctggcccatgcctacttcccaggccccaac、attggaggagacacccactttgactctgccgagccttggactgtcaggaatgaggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctggggctcgagcattccagtgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgctgcccgatgatgaccgccggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccctcaacccaggactacctcccggccttctgttcctgataaacccaaaaacccc、acctatgggcccaacatctgtgacgggaactttgacaccgtggccatgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgaggaataaccaagtgatggatggatacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaacactgcctacgagaggaaggatggcaaattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccctggaacctggctaccccaagcacattaaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgat、gctgctctcttctggatgcccaatggaaagacctacttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggcagtggatagcgagtaccccaagaacatcaaagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgggcagcgatgaagtcttcacttacttctacaaggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtagaaccgggctaccccaagtcagccctgagggactggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggggactgaggag、gagacggaggtgatcatcattgaggtggacgaggagggcggcggggcggtgagcgcggctgccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggtgggccttgcagtcttcttcttcagacgccatgggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggacaaggtc(SEQID NO: 30)
MMP14ヌクレオチド配列(MMP14:GENBANK ACCESSION BC064803)。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGDLRTHTQRSPQSLSAAIAAMQKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGAEIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLAHAYFPGPNIGGDTHFDSAEPWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIMAPFYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFWRGLPASINTAYERKDGKFVFFKGDKHWVFDEASLEPGYPKHIKELGRGLPTDKIDAALFWMPNGKTYFFRGNKYYRFNEELRAVDSEYPKNIKVWEGIPESPRGSFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEGTEEETEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV(SEQID NO: 31)
MMP14アミノ酸配列(MMP14: GENBANKACCESSION BC064803)。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttgcaaaccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaaagtacggctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagctgccatgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccccgatgcggtgtacct、gaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggacagaaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattagaaaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatggagagggaggatttttggcacat、gcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgagccatggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctctgggattggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaaactacctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacctctaccgacagtgcccccacaccgctctatt、cctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggcctccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattcttcgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggatacccaatgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgtgttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggat、acaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacccttggaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttcaagggagacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctggaaagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaaggagtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctgga、catccaagatccatcctcaaggattttatgggctgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactggacaacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggtttacactgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggtg(SEQID NO: 32)
MMP16ヌクレオチド配列(MMP16:GENBANKACCESSION AB009303)。
が記述するMILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVWLQKYGYLPPTDPRMSVLRSAETMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDWMKKPRCGVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFLAHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGPPDKIPPPTRPLPTVPPHRSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFKDQWFWRVRNNRVMDGYPMQITYFWRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYWVFKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDSAIWWEDVGKTYFFKGDRYWRYSEEMKTMDPGYPKPITVWKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYWKFNNQILKVEPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV(SEQID NO: 33)
MMP 16アミノ酸配列(MMP16:GENBANKACCESSION AB009303)。
NME7-ABヌクレオチド配列。
NME7-ABアミノ酸配列。
人MUC1受容体の膜近位部。
「N-10」、PSMGFRのN-末端10日目アミノ酸を欠失。
SEQ ID NO37のアミノ酸配列のN-末端の隣接した部分を包むアミノの配列。
MUC1の自己凝集ドメイン。
無関係のペプチド。
ヒトMUC1の膜近位部分は、以下の配列である;
N-GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAC。(SEQ ID、No:36)
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO: 37)
を含んでいるMUC1*の部分に、MUC1*活性化リガンドNM23が結合することを以前に示した。MUC1のこの部分は、58%の同一性を持ち、ヒトとマウスの間で72%相同である。
配列
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ IDNO: 38)
を含んでいる、N-末端の隣接した部分は、47%の配列同一性を持ち、ヒトとマウスの間で71%相同である。自己会合ドメイン
GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQ ID NO: 39)
であることを以前に本願発明者らが示したMUC1の部分は、69%の同一性を持ち、ヒトとマウスの間で85%相同である。
Oct4とSOX2は、MUC1プロモーターおよびさらにその開裂酵素MMP-14のプロモーターに結合する。SOX2とNANOGは、NM23プロモーターに結合する。MUC1*が、hESCsのメンテナンスに重要で、重要な多分化能遺伝子の標的であるとすれば、本願発明者らは、次のことを明らかにする。MUC1*、あるいは、活性化リガンドNM23と共に、MUC1*形式へのMUC1の開裂を増加させる物質の導入は、iPS細胞の生成を導くか増強する以前に同定された多分化能を導く因子のうちのいくつかあるいはすべての、代替のために使用することができる。
NM23は、MUC1*成長因子受容体を活性化するネイティブ状態で、あるいはc-MYC発現を導く細胞と核への移行を促進するために、ポリ・アルギニン領域と、外生的に加えられる。
NM23(NME)は、コード化核酸として、あるいは細胞への移行を促進する修飾のある若しくはその修飾のない発現されたタンパク質として、加えられることが可能である。NME-H1あるいはNME-H6は、それらのネイティブ状態で、あるいはS120G変異体のような二量体の状態を好む突然変異体形式で使用することができる。NME7は、単量体の蛋白質として、選択的に、AとBのドメインをコードするが、Mリーダー配列が欠けている構成物から発現されるヒト組換え型タンパク質として、使用される。本願発明者らは、それをNME7-AB(SEQ ID NOS: 34-35)と呼ぶ。
これらのMUC1かMUC1*の相互作用タンパク質が加えられる細胞は、自然に発生している細胞、あるいは幹細胞状の特性を導くために遺伝子が加えられたようなものか、既に分化プロセスにはいったようなものか、幹細胞であることが可能である。
MUC1*は、タンパク質自体を外生的に加えることにより、あるいはポリ・アルギニン領域で選択的に修飾されるMUC1*タンパク質を加えることにより、あるいは細胞に該遺伝子を挿入することで導入される。
細胞は、体細胞的、分化されたか多少分化されたかでありえ、細胞が出発細胞より少ない成熟状態である所望の状態に戻るまで、数日から数週間の間、培地で接触を受ける。好ましい具体例では、MUC1*リガンドは二量体の形式でNME1である。もっと好ましい具体例では、MUC1*リガンドは、モノマーのNME7である。それは「M」リーダー配列(NME7-AB)が欠けていることが可能である。細胞をMUC1*リガンドだけと接触させることは、細胞をより少ない成熟状態に戻らせるのに十分である。好ましい具体例では、より少ない成熟状態に戻らせられる細胞は、2つの異なるタイプのMUC1*リガンドと接触を受ける:1つは、抗MUC1*抗体のような表面への、細胞接着を可能にする。他は、二量体のNM23-H1あるいはNME7のような、溶液あるいは培地において、リガンドフリーである。選択的に、ロー・キナーゼ抑制剤も、細胞培養培地に加えることができる。細胞をMUC1*リガンドと接触させることにより、より少ない成熟状態に戻る細胞の証拠は、図7 A、B、図9、図13、図15、図17および図26で確認できる。
図8は、さらに4日目における以下を示す。それらがNM23培地(AとB)において培養される場合のみ、4つの山中の遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc(OSKM)のすべてでトランスフェクトされた繊維芽細胞は、クラスタ状の形態およびコロニー状の形態においてより著しい変化を示した。標準プロトコールの繊維芽細胞培地で培養された場合は、変化はみられなかった(C)。
標準手順によれば、細胞は、5日目に、プラスチック板から移され、不活性化されたヒトかマウス・フィーダー細胞上に移され、その後、2日後の7日目に維芽細胞培地から標準のbFGF培地に変えられる。
図9は、11日目の以下の細胞の写真を示す。それらは、いずれの遺伝子でもトランスフェクトされなかったケースで、NM23無血清培地で培養され、そして被覆されていないプラスチック上にのこされた細胞(A)、不活性化されたマウス・フィーダー細胞(MEF)に移動された細胞(B)、抗MUC1* MN-C3抗体(C)で覆われたプラスチックに移された細胞(C)、該抗体で表面を被覆されたものに移されたが、そこではロー・キナーゼ抑制剤が培養培地に加えられた細胞(D)である。写真で見ることができるように、細胞のクラスタおよびコロニーは、プラスチック表面を浮き上がり、繊維芽細胞がプラスチックにとてもよく付着するのに反して、幹細胞が非付着性であるので、それらが幹様になったという考えと一致している。フィーダー細胞に移された細胞は、それらの幹様形態を失った。しかし、いずれの遺伝子でもトランスフェクトされなかったケースで、NM23培地中で培養し、そして抗MUC1*抗体(図9、C、D)で覆われた表面(VitaTM プレート)へ移された細胞は、表面へ付着し、幹様コロニーにみえる。これらの結果は、NM23の存在下で細胞を培養することが、MUC1の開裂形の発現を増加させ、細胞を同系統の抗体で覆われた表面に付着させる、という考えと一致している。遺伝子でトランスフェクトされなかったが、繊維芽細胞培地において培養され、その後、不活性化されたフィーダー細胞に移され、bFGFを含んでいる培地に切り替えられた相応する細胞は、マウス・フィーダー細胞(A)あるいはヒトフィーダー細胞(B)に移されたとしても、幹様形態(図10)のサインを示さない(11日目)。
11日目における、以下の細胞の写真をえた(図11)。多分化能遺伝子の4つすべてでトランスフェクトされ、実験の最初からNM23培地で培養した細胞(MM−Aの“A”は”常時の”の意味)(パネルAおよびB)、又は7日目まで繊維芽細胞培地において培養され、その後NM23培地で培養に移された細胞〔 MM−Rの“R”は、”置き換わり”(replaced)の意味〕(パネルCとD)。図は、NM23において培養され、その後抗MUC1*抗体表面に移された(A)及び当該細胞がヒトフィーダー細胞の表面へ移されるとき(C)における、OSKMトランスフェクト細胞の幹様コロニー形成を示す。
図12は、ヒトフィーダー細胞上に移された細胞のこの同じ有利性を反映する。図12 A は、bFGF培地で培養され、5日目にヒトHS27フィーダー細胞上に移された、OSKMトランスフェクト細胞の幹様形態を示す。Bは、それほど多くの細胞がマウス・フィーダー細胞に移されなかった場合である。
図13は、トランスフェクトされずNM23培地において培養され、その後、MN-C3抗体で覆われたプラスチックに移された細胞は、細胞が低密度(B)より高密度(A)でおかれた時、より展開する幹様コロニーを持っている。細胞が、マウス・フィーダー細胞に移された後、何らコロニーは目視されなかった(C)。しかし、ヒトフィーダー細胞に移された細胞は、小さな幹様コロニーが目視された(D)。
繊維芽細胞培地において培養され、その後7日目にNM23培地に切り替えられ、そして非被覆プラスチック上におかれた、トランスフェクトされていない細胞は、何ら幹様コロニーは現れなかった(図14 A)。あるいは、bFGF培地において培養され、マウス・フィーダー細胞に移された(B)、又はヒトフィーダー細胞に移された(C)、トランスフェクトされていない細胞は、何ら幹様コロニーは現れなかった
図15は、4つの多分化能遺伝子OSKMすべてでトランスフェクトされ、そして最初からNM23中で培養された細胞は、抗MUC1*抗体MN-C3で覆われたプラスチック上におかれた時、大きな幹様コロニーを形成した(A)、ことを示す。しかし非被覆プラスチック上におかれた同じ細胞ではそうではなかった(B)。しかしながら、細胞がフィーダー細胞に移された時、14日目までに、大きな幹様コロニーが現われた(図15C; 図16 A-D)。そこでは細胞は、NM23培地(A、B)であるいはbFGF培地(C、D)において培養された。
図17は、何ら異所的に発現した遺伝子がない状態でさえ、19日目までに、NM23が、体細胞を、幹様状態への回帰を誘導したことを、示す。10倍の拡大は、NM23において連続的に培養された細胞の繊維芽細胞形態の完全な消失を示し、細胞質に対してさらに大きな比率の核を持っている、幹細胞の特徴的な玉石パターンを示す。
細胞が、bFGF培地において培養された模擬のトランスフェクションの場合、より少ない成熟状態へのこのような変化を観察することはできない (図18 A、B)。
NM23培地中の連続培養と7日目でのNM23培地での繊維芽細胞培地の置き換えの場合の比較(図19)は、OSKMでトランスフェクトされた細胞が、NM23培地において連続的に培養された時(A、B)、最も幹様状態に戻ったことを示す。
19日目までに、OSKMでトランスフェクトされ、bFGF培地中で培養され、そして5日目後に、フィーダー細胞上で、培養された細胞は、また、幹様コロニーの形成を示した(図20 A、B)。
上述された多分化能実験の誘導では、多分化能マーカーの発現に増加があった場合は、常に、MUC1、MUC1*およびMUC1*リガンドNME7の発現に、関連する増加があることが確認された。図21は、4日目(A)又は20日目(B)に行なわれたRT-PCR実験のグラフを示し、このポイントを図示する。ヒト線維芽細胞は、多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycの3あるいは4のいずれかで、トランスフェクトされた。MUC1*細胞外ドメインを二量化させるMUC1*リガンドである、NM23-H1二量体において培養されたトランスフェクトされた細胞は、4日目までに、多分化能マーカーOct4、NANOGおよびKLF4の増加した量を発現し、一方、繊維芽細胞培地中で培養した同じ細胞は、4日目までに、OCT4の適度の増加のみを示した。したがって、MUC1*リガンドNM23は、多分化能遺伝子単独でのトランスフェクションによる場合よりはるかにこえて、多分化能を導くか、より少ない成熟状態への細胞の回帰をさせることを結論付けられた。同時に、注目すべきは、より少ない成熟状態に戻るように誘導された細胞は、MUC1およびNME7(MUC1*リガンド)の発現もまた、増加させた (図21 A)。
MUC1は、翻訳後に開裂し、MUC1*を産出するので、RT-PCRが核酸を検知することから、RT-PCR分析が、MUC1とMUC1*を区別できないことは留意がいる。20日目(図21 B)までに、多分化能誘導のための標準法を受け、7日目にFGF培地が繊維芽細胞培地(含血清)に変えられた細胞は、MUC1の発現の劇的増加、およびNME7発現のおよそ2倍の増加と同様に、多分化能マーカーOct4、NANOGおよびKLF4の増加した発現を示す。これらのデータは、多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycが、MUC1およびMUC1*リガンドの発現を導くことを示す。本願発明者らの初期の仕事(Hikitaら)および本願明細書の図2から、多分化能性幹細胞上で、本質的にMUC1のすべてが、MUC1*形式に開裂される。したがって、多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycは、MUC1*の発現を導く。トランスフェクタントが、NM23二量体において培養された条件は、MUC1およびNME7の最も高い量と同様に、最も高い量の多分化能マーカーOct4、NANOG、KLF4を有した。さらに、これらのデータは、MUC1および特にMUC1*が、多分化能マーカーであると証明する。RT-PCR実験は数回行なわれた。各実験のために、各条件あたり、3つの別々のサンプルの各々に、3回の繰り返し測定をした。GAPDHは内在的なコントロールとし、データは、コントロールである、繊維芽細胞培地において培養された非トランスフェクトヒト線維芽細胞に対し、標準化されたフォールドチャンジ(fold-change)(重ね合わせ)として、プロットされる。
1)NM23-H1二量体、あるいはNME7中での細胞の培養は、多分化能遺伝子の2つ以上が異所的に発現されたiPS生成の効率を増加させた;
2)NM23-H1二量体あるいはNME7中で細胞の培養をすると、繊維芽細胞を、多分化能遺伝子の異所的発現のない幹様状態に戻させる;
3)NM23-H1二量体あるいはNME7中の細胞を培養すると、細胞が発現したMUC1かMUC1*の量の増加を誘導した;
そして、
4) 多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4および/またはc-Mycの強制発現は、当該細胞が発現するMUC1かMUC1*の量の増加をもたらした。
以下の実施例は、本願発明を制限するものではなく、本発明の例証として記述される。
1) MUC1に関連する因子は、多分化能でない細胞の多分化能化を導く;
2) MUC1に関連する因子は、iPS生成の効率を増加させる;
3) MUC1に関連する因子は、現在多分化能を導くことに必要であると思われる1つ以上の遺伝子の要素の代替をする。NM23は、MUC1*のリガンドであり、MUC1*に関連する因子である。
MUC1*は成長および細胞死抵抗を促進する。
抗MUC1*Fabは、trastuzumab(HERCEPTIN登録商標)-耐性細胞(1μg/ml HERCEPTINにおける培養によって抵抗性がもたらされた)において、TAXOL登録商標による細胞死に対する抵抗性を阻止した。Fesslerら、2009は、HERCEPTIN登録商標抵抗性細胞は、TAXOL登録商標、ドクソルビシン、及びシクロフォスファミドへの抵抗性をもつことを報告した。報告されるように、これらの耐薬性の癌細胞は、MUC1*を過剰発現することによって、抵抗性を達成する。次の実験は、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFR部分のブロックは、癌細胞の獲得した薬物耐性を元に戻すことを示した。親 (BT474)或いは抵抗性(BTRes1)細胞が、96ウェルプレートに、10,000細胞/ウェルの密度で植えられた(4ウェル/条件)。翌日、抗MUC1*Fab、コントロールFab、或いはFabなしが、TAXOL登録商標の存在又は不存在状態で、細胞へ加えられた (パクリタクセル・シグマT7191)。2日後に、細胞は50μlトリプシン中で再懸濁され、トリパンブルーの存在によってカウントされられた。細胞死パーセントは、トリパンブルー取得パーセントとして計算された。BT474細胞は、各条件で、TAXOL登録商標に応じて細胞死をうけ、そして、BTRes1細胞のみが、MUC1*抗体の存在下で細胞死をうけた(図1B)。
MUC1*は成長因子受容体として働き、人工的な(抗MUC1*抗体)あるいはその天然リガンドNM23(NME)を使い、その細胞外のドメインの二量化によって活性化される。MUC1*陽性のZR-75-30細胞6000/ウェル、あるいはコントロール(MUC1陰性)HEK293細胞4000/ウェルが、96ウェルプレートに植え付けられた。翌日、ゼロ時刻細胞計数がされ、そして、抗MUC1*抗体あるいはFabの異なる濃度が、24時間あるいは48時間ごとに、低い(0.1%)血清含有ミディアムに加えられた。インキュベーションの数日後に、細胞はトリプシン中で再懸濁されカウントされ、標準化された成長パーセントが計算された。ベルシェープ曲線として示された、ZR-75-30細胞の刺激が、リガンド誘導成長刺激を実証するが、HEK293細胞ではなかった(図1C)。 同様の実験で、MUC1をターゲットとするsiRNA、或いはコントロールsiRNAで、安定してトランスフェクトされたMUC1*陽性T47D乳癌細胞を使用すると、成長の刺激が、単にコントロール−トランスフェクト細胞でおこり、さらに抗体の特異性を示した(図1D)。同一の結果は、MUC1*の天然リガンドNM23において実証された(図1E)。
NM23は、MUC1*細胞外ドメインを本質的に含むPSMGFRペプチドに特異的に結合する。結合は、Biacore3000装置およびBiaEvaluationソフトウェアを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定された。ヒスチジンタグを付けられたMUC1*1110-ecd(SEQID NO: 5)あるいは無関係のペプチド(HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS- SEQ ID NO: 40)が、Mahantaら2008に記述されるように本願発明者らの研究所で準備された、5.7%のNTA-Ni++ SAM被覆SPRチップの分離されたフロー・チャンネル上に固定された。精製牛又は組み替えヒトのNM23の35μLプラグが、5μL/分の一定の流れ中に注入され、センサーグラムが記録された。牛の肝臓から精製されたNM23 (シグマN-2635)が、PBSだけで薄められた。親和性は、1:1ラングミュア・モデルを使用して、広範囲の濃度に関して測定された。実際の親和性は、第1のオーダー動力学が、適当にこのシステムを記述できないように、変わることが可能である(図1F)。
MUC1*成長因子受容体およびそのリガンドNM23は、分化されたhESCではなく、未分化のhESC上にある。未分化の(多分化能)状態、あるいは新しく分化する状態のヒト胚性幹細胞が、免疫細胞化学(ICC)によって分析された。ヒト胚性幹細胞(hESCs)が、手で切り離され、マトリゲルであらかじめ覆われた、8ウェルのチャンバースライド(Nunc)に、植え付けられた。未分化細胞については、細胞は、植え付け5-7日後に固定した。分化した細胞については、bFGFが、植え付け後培養培地から除去され、そして細胞は固定前14日間分化させられた。細胞は、4℃15分の0.1Mカコジル酸塩バッファー中の4%のパラホルムアルデヒドによる定着前に、PBSで洗われた。 細胞は、1%のBSA及びPBS中の1%のロバあるいはヤギ血清で、1時間ブロックされた。0.1%のNP-40が、細胞内の抗原に対する抗体と共に使用された。一次抗体はブロック内で希釈され、4℃1時間細胞とインキュベートされた。
次のタンパク質用の一次抗体が使用された:
OCT4 (Santa Cruz,Clone Clones H-134 and C-10, 1:100 dilution),
全長 MUC1 (VU4H5, Santa Cruz Biotechnology,1:50 dilution),
MUC1* (Minerva, 1:250 dilution),又は
NM23 (Santa Cruz, Clone NM301, 1:100dilution)
細胞は、次の二次抗体との30分のインキュベーションに先立って、5分間PBSで3回洗われた:
AlexaFluor 488 Goat anti-rabbit IgG,
AlexaFluor 555 Goat anti-mouse IgG,
AlexaFluor 350 Goat anti-rabbit IgG(Invitrogen, 1:200);
Goat anti-mouse IgM-TR (Santa Cruz, 1:100)
細胞は、抗Fade MountingMedium(Biomedia)を使い、overslip mounting前5分間、PBSで3回洗われた。核は5分間、DAPI染色(1μg/ml)によって視覚化された。免疫染色された細胞は、オリンパスBX-51上級蛍光顕微鏡上で視覚化された。これらの実験の結果は、MUC1*が、未分化細胞(多分化能性幹細胞)の表面上にある(図2A、3B、3C)が、分化したhESCs上にはない(図2 D)ことを示す。図3は、MUC1*のリガンド(NM23)が、MUC1*と共局在することを示す(図3A-D)。MUC1*およびそのリガンドNM23は、多分化能性幹細胞(Oct4 -陽性の細胞)上でのみ発現され、分化したものにはなかった(図3Cおよび3F(OCT4-陰性細胞のDAPI染色核)。
MUC1*は、多分化能性幹細胞の成長を仲介する。
多分化能性幹細胞の成長を増強するために、MUC1*を刺激する結果は、量的Calcein分析において直接測定された。ヒト胚性幹細胞(hESCs)が、手で解離され、1.9x 104細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレートのmatrigel被覆ウェル上で成長させた。培養培地は、30%のHs27調整培地および4ng/mlのbFGFで補われたhESC培地を含んだ。抗体は、二価の抗MUC1*について1μg/mlおよび1価の抗MUC1*について100μg/mlの終濃度で加えられた。実験は3回繰り返して行なわれた。抗体処理後41時間で、メーカー指示書に従い、生存および死細胞の量が、LIVE/DEAD/viability細胞毒性キット(MolecularProbes)で計られた。蛍光は、Victor3Vプレート・リーダ(パーキン・エルマー)を使用して測定された。図5の棒グラフは、二量化するリガンド(抗MUC1*)をつかってのMUC1*の刺激は、幹細胞成長を促進することを示し、一方、Fab抗MUC1*と共に、MUC1*の細胞外のドメインをブロックすることは、全幹細胞死に帰着する。
長期的な幹細胞成長実験が、二価の抗MUC1*抗体、NM23、NM23突然変異体あるいはbFGFを使用して、幹細胞の成長を刺激する結果を比較するためになされた。hESCsは、トリプシンで解離され、8.2x104細胞/ウェルの細胞密度でMatrigelであらかじめ被覆された8−ウェルチャンバーに植え付けられた。培地は変更され、また、抗体あるいは野生タイプまたは突然変異NM23タンパク質が、以下の終濃度で、一日おきに加えられた;抗MUC1*抗体の80ng/ml、野生型組み換え体NM23か突然変異体(S120G)NM23の1nM、あるいは「最小の幹細胞ミディアム」(フィーダー調整培地のないhESC培地)中に4ng/mlの終濃度の組み換えbFGF。細胞は、又、Hs27繊維芽細胞からの30%調整培地および4ng/mlの組み換えbFGF(Peprotech#100-18B)をもつ最小幹細胞ミディアム中で、コントロールとして育てられた。この実験の結果は、MUC1*リガンドは、マトリゲル上でこれらの細胞の通常の成長培地である、bFGF含有調整培地の結果より、多分化能のコロニーの最少培地中での成長の刺激についてよりよい仕事をもたらすことを示した。表1は結果を詳述する。
MUC1*は、細胞の核へ、転位置させる(MUC1* translocates to nucleus of cells)。
抗MUC1*の単クローンAbは、アレクサ555染料で生体外でラベルされ、4℃の冷たいPBSで洗われた、MUC1*でトランスフェクトされたHCT-116細胞(MUC1陰性)に4℃で結合された。20分後、細胞は、冷たいPBSで2度洗われ、そして、細胞は、4%のパラホルムアルデヒドに固定されるか、或いは、あらかじめ暖められた成長ミディアムで培養された。細胞は、40分の後に洗われ、5分間、4%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、PBS中2.5%BSA、2.5%FBSおよび0.1%NP-40でブロックされ透過処理された。核内体が、抗EEA1抗体(Cell Signaling Technologies, 2411S)およびアレクサ488(Invitrogen 1:200)を使用して染色された(図6)。
500mLsあたり:
435mL DMEM(ATCC#30-2002 Manassas VA)、50mLウシ胎児血清(FBS、#35-011-cv、Mediatech、Manassas VA)、100XストックGlutamax(#35050061、LifeTechnologies、Carlsbad CA)の5mL、5mLの100Xの非必須アミノ酸(#11140050、LifeTechnologies)、5mL 100Xペニシリン/ストレプトマイシン(#17-602E、Lonza、Allendale、NJ)。
500 mLsあたり:
400mL DMEM/F12(#10565-042)、100mLノックアウト血清代替「KOSR」(#10828-028)、5mLの100Xの非必須アミノ酸(#11140050)、0.9mL 100Xストック2-メルカプトエタノール(#21985-023)、LifeTechnologiesからのすべて、および2ug bFGF(#100-18B、Peprotech、Rocky Hill NJ)。
500 mLsあたり:
400mL DMEM/F12(#10565-042)、100mLノックアウト血清代替「KOSR」(#10828-028)、5mLの100Xの非必須アミノ酸(#11140050)、0.9mL 100Xストック2-メルカプトエタノール(#21985-023)、LifeTechnologiesからのすべて、および8nM NM23dimer(Minerva Waltham MA)。
より少ない成熟しているか多分化能の状態に戻るために細胞を導くことについて、NM23またはNME7を使用する結果
多分化能遺伝子の3つのみが、レンチウィルス・システムを使ってトランスフェクトされた、iPS生成に対するNM23の効果。
この実験では、本願発明者らは、、多分化能遺伝子のうちの1つを省く結果をテストした。ヒト線維芽細胞(hFFn)は、4つの多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc、「OSKM」あるいは3つ(OSKまたはOSM)でトランスフェクトされた。多分化能を示す、遺伝子の遺伝子発現レベルが、RT-PCR技術および免疫細胞化学を使用して、4日目、および20日目に評価された。これらの実験において使用されるプライマーは、それらが異所的に発現している遺伝子を増幅しないように、設計されていることに注目する。RT-PCRは、多分化能の指標である、Oct4、Nanog、Klf4遺伝子の発現レベルの量を計るために使用された。
MUC1の発現もまた測定された。
実験は、MUC1*リガンド(二量体型のNM23-S120G)中で、培養されたトランスフェクタントが、細胞がFGF培地において培養された標準法より、多分化能マーカーの発現において、早くより明白な増加を示した。さらに、実験は、多分化能遺伝子の3つが、トランスフェクタントがNM23培地において培養された場合、多分化能を導くことに必要十分だったことを示した(図22)。しかし、FGF培地中で培養された場合はそうではなかった。免疫細胞化学実験は、さらに実験の10日目に行なわれた。そこでは細胞は、多分化能マーカーTra 1-60の発現について分析された。4つの多分化能遺伝子(OSKM)あるいは3つのみのOSKすべてでトランスフェクトされ、NM23培地中で培養された細胞の場合は、FGF培地中で培養された同じ細胞の場合(図25)をこえて、Tra 1-60の発現において、おおきな増加を示した(図23および図24)。OSKでトランスフェクトされ、FGF培地中で培養された細胞の条件で、10日目に、なんらTra1-60陽性細胞は見出されなかった。
NM23培地の使用は、少なくとも4つの多分化能遺伝子の1つの不使用を可能にした。
哺乳動物中のMUC1近辺領域の大きな保存性のために、本願発明者らは、成長因子としてNM23の使用に対して、成長因子LIFを含む標準培地でのマウス幹細胞の成長を比較した。
マウスES細胞は、成長因子としてLIFを含んでいる標準培地中で培養されたマウス万能細胞より、NM23-MMにおいて、同等以上に良く成長した。図34は、多分化能の基準としてSSEA4を使用して、NM23において培養された細胞が、LIFにおいて培養された細胞より、よりSSEA4陽性細胞(つまり、多分化能性細胞)を生産したことを示す。さらに、これらの細胞が、ヒトMUC1*配列(PSMGFR)に対する抗体で染色された時、本願発明者らは、NM23中での成長が、細胞が発現するMUC1*の量を増加させることを見出した(図25)。これら得られた結果は、マウス幹細胞を含む他の哺乳類細胞が、従来のマウスES成長因子LIFではなく、NM23において培養しうることを示した。さらに、それらの細胞のより多くの物が、MUC1*抗体を認識したという事実は、NM23中での幹細胞の培養が、MUC1*発現を増加させることを証明する。
4度繰り返された、上記実施例10-12で得られた細胞は、多分化能の表面マーカーを発現した多分化能誘導方法で処理された細胞のパーセンテージを決定するために、FACS分析で処理された。FACS分析は、より少ない成熟状態、および多分化能の状態に戻るように、誘導されたヒト線維芽細胞を示す。iPS細胞を生成するための標準法は、当業者によく知られている多分化能マーカーの発現によって証拠づけられるように、多分化能であるクローンを分化させるために約3-4週間処理した。例えば、これらの実験において出発細胞は、繊維芽細胞であった。CD13は、繊維芽細胞マーカーであって、有効に多分化能の状態に戻り始めた細胞は、CD13陰性である。多分化能の細胞が、多分化能マーカーOct4、KLF4、NANOG、REX-1他に、陽性であることは当該技術分野で知られている。細胞質のマーカーあるいは核マーカーは、上述されるようにRT-PCRによってしばしば検知される。一方、他の表面のマーカーは、蛍光活性化細胞分類(FACS)によって生細胞を検出するかソートするのに便利である。18日目および19日目で、繊維芽細胞が4つの「山中」多分化能遺伝子のうちのいくつかあるいはすべてでトランスフェクトされた後、得られた細胞は、多分化能表面蛋白SSEA4およびTra 1-60の存在についてFACSによって分析された; 細胞は、CD13について染色され、その結果、繊維芽細胞マーカーに陽性なままだったあらゆる細胞を除外するために、ゲートを、選ぶことができる。結果は図33-39に示される。図35および36は、その細胞を示す。4つの多分化能遺伝子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc(OSKM)のすべてで、同時に、トランスフェクトされ、しかし標準FGF培地の代わりにNM23二量体培地中で培養された、細胞は、多分化能マーカーTra 1-60に陽性である細胞の数を、3倍を超えて生産された、ことを示した。図37は、NM23二量体培地又は標準FGF培地を使用して、18日間培養された、多分化能遺伝子の、3つあるいは4のいずれかで、トランスフェクトされた細胞のFACSスキャンを示す。この場合、細胞は、CD13、SSEA4およびTra 1-60について染色された。図38の表は、3つの多分化能遺伝子OSKだけでトランスフェクトされ、NM23二量体培地中で培養した細胞は、4つの遺伝子すべてでトランスフェクトされたFGF培養細胞より、多分化能マーカーTra 1-60について陽性に染色された15倍以上の細胞を生産した、ことを示す。FGF培養細胞は、単にOSKまたはOSMでトランスフェクトされた時、多分化能を導くことができなかった。図39の表は、OSKでトランスフェクトされ、NM23二量体培地中で培養された細胞が、4つの遺伝子すべてでトランスフェクトされ、FGF培地中で培養された細胞より、多分化能マーカーTra 1-60に陽性に染色された細胞を、20〜30倍生産したことを、示す。
MUC1*リガンドは、MUC1*の発現を増加させる。
実験は、ヒト胚幹(ES)細胞と同様に市販のヒト誘導多分化能幹(iPS)細胞でおこなわれ、そこで、より少ない成熟(より多分化能)状態に戻るために細胞の誘導能と同様に、MUC1*リガンドのMUC1*の発現か活性を増加させる能力もテストした。システムズBiosciences社からえたSC101A-iPSCのヒトiPS細胞は、MEF上でFGF(4-8ng/mL)培地で、あるいは抗MUC1*抗体MN-C3でコートされた表面にNME7(MUC1*リガンド-8-16nM)培地において(又、VitaTMプレート上にコートされたMUC1*リガンド-12.5 μg/mLでも)、培養された。成長因子FGFあるいはNME7を除いて、基礎培地は同一で、「最少培地」と上記される。得られた細胞は、多分化能マーカー陽性を染色した細胞の程度を決定するために、免疫細胞化学によって分析された。結果は、細胞をMUC1*リガンドNME7と接触させると、MUC1*の発現の増加をおこし、それは多分化能マーカー陽性を染色した細胞のパーセンテージの増加と一致した。
核染色法(DAPI)は、細胞がFGFにおいて培養された場合、多分化能マーカーによって染色されない多くの核を示した。図40は、MEFs(A-C)の層上でいずれかのFGF培地中で培養されたか、抗MUC1*抗体の層上でNME7培地中で培養された、ヒト誘導多分化能幹(iPS)細胞株の写真を示し、そして、MUC1*(A、D)および多分化能マーカーRex-1(B、E)およびTra 1-60(C、F)の存在のために免疫細胞化学によって分析された。同じ実験はBiotime社からのHES-3ヒト胚性幹細胞で行なわれ、同じ結果が得られた。図41は、MEFs(A-C)の層上でいずれかのFGF培地中で培養されたか、抗MUC1*抗体の層上でNME7培地中で培養された、ヒト胚幹(ES)細胞株の写真を示し、そして、MUC1*(A、D)および多分化能マーカーRex-1(B、E)およびTra 1-60(C、F)の存在のために免疫細胞化学によって分析された。同様の実験は行なわれた。しかし、成長因子としてNME7を使用する代わりに、突然変異体NM23-H1 S120G(16nM)が使用され、そこでは、NM23がリフォールドされFPLCで精製され、二量体の純粋の群であった。ここで、このNM23は、NM23培地、NM23二量体培地あるいはNM23-S120Gと略して呼ばれる。結果は、NM23培地中の単一パッセージの後、発現されたMUC1*の量に、膨大な増加があったということであった。本願発明者らは、単クローン抗体MN-C3のみが、開裂MUC1*を認識し、全長MUC1に結合しないことを指摘する。図42は、MEFs(A-C)の層上で、いずれかのFGF培地中で培養されたか、あるいは、抗MUC1*抗体(D-F)の層上でNM23-S120G二量体培地中で培養された、ヒトiPS細胞株の写真を示し、そして、MUC1*(A、D)、核染色DAPI(B、E)およびマージされたイメージ(C、F)の存在のために、免疫細胞化学によって分析された。細胞は、又、多分化能マーカーTra 1-60および核染色DAPIについて染色された。各場合では、MUC1*リガンド(二量体のNM23)中で培養された細胞は、細胞をより少ない成熟状態に戻らせるMUC1*の増加した発現を導いた。細胞が、多分化能マーカーの発現を失う場合、それらは多分化能の状態からはずれて分化した。図43の合併されたイメージ(C、F、I、L)の検討は、MUC1*リガンドによる処理の後、すべての核が、多分化能マーカーおよびMUC1*の染色に関係していることを示す。図43は、MEFs(A−F)の層上でいずれかのFGF培地中で培養されたか、あるいは、抗MUC1*抗体(G-L)の層上で、NM23-S120G二量体培地中で培養された、ヒトiPS細胞株の写真を示し、MUC1*(A、G)、多分化能マーカーTra 1-60(D、J)、核染色DAPI(B、E、H、K)およびマージされたイメージ(C、F、I、L)の存在について、免疫細胞化学法によって分析された。細胞は、付加的に、別のMUC1リガンド、NME7の存在について染色された。図44は、抗MUC1*抗体の層上で、NM23-S120G二量体培地中で培養され、NME7(A、B、C)および核染色DAPI(C)の存在について、免疫細胞化学法によって分析されたヒトiPS細胞株の写真を示す。。
References
1. Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, et al. (2008)Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.pp. 699-702.
2. Boyer LA, Lee TI, Cole MF,Johnstone SE, Levine SS, et al. (2005) Core transcriptional regulatorycircuitry in human embryonic stem cells. Cell 122: 947-956.
3. Dexheimer TS, Carey SS,Zuohe S, Gokhale VM, Hu X, et al. (2009) NM23-H2 may play an indirect role intranscriptional activation of c-myc gene expression but does not cleave thenuclease hypersensitive element III(1). Mol Cancer Ther 8: 1363-1377.
4. Efe JA, Hilcove S, Kim J,Zhou H, Ouyang K, et al. (2011) Conversion of mouse fibroblasts intocardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat Cell Biol 13:215-222.
5. Fessler SP, Wotkowicz MT,Mahanta SK, Bamdad C (2009) MUC1* is a determinant of trastuzumab (Herceptin)resistance in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 118: 113-124.
6. Foster KW, Liu Z, Nail CD,Li X, Fitzgerald TJ, et al. (2005 ) Induction of KLF4 in basal keratinocytesblocks the proliferation-differentiation switch and initiates squamousepithelial dysplasia. Oncogene 24: 1491-1500.
7. Hanna J, Cheng AW, Saha K,Kim J, Lengner CJ, et al. (2010) Human embryonic stem cells with biological andepigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proc Natl Acad Sci US A 107: 9222-9227.
8. Hanna JH, Saha K, Jaenisch R(2010) Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolvedissues. Cell 143: 508-525.
9. Hikita ST, Kosik KS, CleggDO, Bamdad C (2008) MUC1* mediates the growth of human pluripotent stem cells.PLoS One 3: e3312.
10. Huang L, Chen D, Liu D, YinL, Kharbanda S, et al. (2005) MUC1 oncoprotein blocks glycogen synthase kinase3beta-mediated phosphorylation and degradation of beta-catenin. Cancer Res 65:10413-10422.
11. Huangfu D, Maehr R, Guo W,Eijkelenboom A, Snitow M, et al. (2008) Induction of pluripotent stem cells bydefined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol26: 795-797.
12. Huangfu D, Osafune K, MaehrR, Guo W, Eijkelenboom A, et al. (2008) Induction of pluripotent stem cellsfrom primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol 26:1269-1275.
13. Ieda M, Fu JD,Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, et al. (2010) Direct reprogramming offibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 142:375-386.
14. Jaenisch R, Young R (2008)Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming.Cell 132: 567-582.
15. Kaji K, Norrby K, Paca A,Mileikovsky M, Mohseni P, et al. (2009) Virus-free induction of pluripotencyand subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458: 771-775.
16. Kawamura T, Suzuki J, WangYV, Menendez S, Morera LB, et al. (2009) Linking the p53 tumour suppressorpathway to somatic cell reprogramming. Nature 460: 1140-1144.
17. Kim YI, Park S, Jeoung DI,Lee H (2003) Point mutations affecting the oligomeric structure of Nm23-H1abrogates its inhibitory activity on colonization and invasion of prostatecancer cells. Biochem Biophys Res Commun 307: 281-289.
18. Komarov PG, Komarova EA,Kondratov RV, Christov-Tselkov K, Coon JS, et al. (1999) A chemical inhibitorof p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy. Science 285:1733-1737.
19. Lin T, Chao C, Saito S,Mazur SJ, Murphy ME, et al. (2005) p53 induces differentiation of mouseembryonic stem cells by suppressing Nanog expression. Nat Cell Biol 7: 165-171.
20. Lowry WE, Richter L,Yachechko R, Pyle AD, Tchieu J, et al. (2008) Generation of human inducedpluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 105:2883-2888.
21. Lyssiotis CA, Foreman RK,Staerk J, Garcia M, Mathur D, et al. (2009) Reprogramming of murine fibroblaststo induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4. ProcNatl Acad Sci U S A 106: 8912-8917.
22. Mahanta S, Fessler SP, ParkJ, Bamdad C (2008) A minimal fragment of MUC1 mediates growth of cancer cells.PLoS One 3: e2054.
23. Maherali N, Sridharan R,Xie W, Utikal J, Eminli S, et al. (2007) Directly reprogrammed fibroblasts showglobal epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell1: 55-70.
24. Maimets T, Neganova I,Armstrong L, Lako M (2008) Activation of p53 by nutlin leads to rapid differentiationof human embryonic stem cells. Oncogene 27: 5277-5287.
25. Nakagawa M, Koyanagi M,Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, et al. (2008) Generation of inducedpluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. NatBiotechnol 26: 101-106.
26. Okita K, Ichisaka T,Yamanaka S (2007) Generation of germline-competent induced pluripotent stemcells. Nature 448: 313-317.
27. Okita K, Nakagawa M,Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S (2008) Generation of mouse inducedpluripotent stem cells without viral vectors. Science 322: 949-953.
28. Park IH, Zhao R, West JA,Yabuuchi A, Huo H, et al. ( 2008) Reprogramming of human somatic cells topluripotency with defined factors. Nature 451: 141-146.
29. Raina D, Ahmad R, Joshi MD,Yin L, Wu Z, et al. (2009) Direct targeting of the mucin 1 oncoprotein blockssurvival and tumorigenicity of human breast carcinoma cells. Cancer Res 69:5133-5141.
30. Smagghe BJ, Stewart AK,Carter MG, Shelton LM, Bernier KJ, et al. (2013) MUC1* ligand, NM23-H1, is a novelgrowth factor that maintains human stem cells in a more naive state. PLoS One8: e58601.
31. Soldner F, Hockemeyer D,Beard C, Gao Q, Bell GW, et al. (2009) Parkinson's disease patient-derivedinduced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 136:964-977.
32. Sommer CA, Stadtfeld M,Murphy GJ, Hochedlinger K, Kotton DN, et al. (2009) Induced pluripotent stemcell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells 27:543-549.
33. Stadtfeld M, Nagaya M,Utikal J, Weir G, Hochedlinger K (2008) Induced pluripotent stem cellsgenerated without viral integration. Science 322: 945-949.
34. Strom E, Sathe S, KomarovPG, Chernova OB, Pavlovska I, et al. (2006) Small-molecule inhibitor of p53binding to mitochondria protects mice from gamma radiation. Nat Chem Biol 2:474-479.
35. Takahashi K, Tanabe K,Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, et al. (2007) Induction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872.
36. Takahashi K, Yamanaka S(2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676.
37. Thathiah A, Blobel CP,Carson DD (2003) Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme/ADAM 17 mediatesMUC1 shedding. J Biol Chem 278.
38. Vassilev LT, Vu BT, GravesB, Carvajal D, Podlaski F, et al. (2004) In vivo activation of the p53 pathwayby small-molecule antagonists of MDM2. Science 303: 844-848.
39. Wei X, Xu H, Kufe D (2007)Human mucin 1 oncoprotein represses transcription of the p53 tumor suppressorgene. Cancer Res 67: 1853-1858.
40. Wernig M, Meissner A,Cassady JP, Jaenisch R (2008) c-Myc is dispensable for direct reprogramming ofmouse fibroblasts. 2: 10-12.
41. Wernig M, Meissner A,Foreman R, Brambrink T, Ku M, et al. (2007) In vitro reprogramming offibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448: 318-324.
42. Woltjen K, Michael IP,Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, et al. (2009) piggyBac transpositionreprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 458: 766-770.
43. Yamanaka S (2007)Strategies and new developments in the generation of patient-specificpluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1: 39-49.
44. Yu J, Hu K, Smuga-Otto K,Tian S, Stewart R, et al. (2009) Human induced pluripotent stem cells free ofvector and transgene sequences. Science 324: 797-801.
45. Yu J, Vodyanik MA,Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, et al. (2007) Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318:1917-1920.
46. Zhou H, Wu S, Joo JY, ZhuS, Han DW, et al. (2009 ) Generation of induced pluripotent stem cells usingrecombinant proteins. Cell Stem Cell 4: 381-384.
47. Zou X, Cong F, Coutts M,Cattoretti G, Goff SP, et al. (2000) p53 deficiency increases transformation byv-Abl and rescues the ability of a C-terminally truncated v-Abl mutant toinduce pre-B lymphoma in vivo. Mol Cell Biol 20: 628-633.
そのような等価物は、本願請求項の範囲で包含されることが意図される。
Claims (16)
- 出発細胞、若しくは哺乳類由来出発細胞、若しくはヒト由来出発細胞、若しくは多分化能性幹細胞、多能な幹細胞および最終分化細胞を含むグループから選ばれる出発細胞、若しくは多分化能性幹細胞であって刺激された状態である出発細胞、若しくは多能な幹細胞であって造血性細胞、骨髄細胞あるいはニューロンの細胞である出発細胞、若しくは最終分化細胞であって、繊維芽細胞、皮膚芽細胞、血球あるいはニューロン細胞である出発細胞をより少ない成熟状態に戻ることを誘導する若しく誘導を生体外で実行することを含む、出発細胞から、より少ない成熟細胞の生成の方法であって、以下から選ばれる生物学的物質若しくは化学物質と出発細胞との接触を含む方法;
(i-1) 細胞において、MUC1あるいはNMEタンパク質の量を増加させる物質;
(i-2) 細胞において、MUC1あるいはNMEタンパク質の量を増加させる物質であってMUC1またはNMEの量を増加させる生物学的種が、MUC1、MUC1*、NME1あるいはNME7をコードする核酸あるいはそれのバリアントである。
(ii) 細胞において、MUC1あるいはNMEタンパク質の発現を増加させる物質;
あるいは、
(iii) MUC1あるいはNMEタンパク質の活性を増加させる物質。 - 以下から選ばれる接触である、請求項1に記載の方法;
(1−1)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含む。
(1−2)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸が、MUC1をコードする。
(1−3)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸が、MUC1*をコードする。
(1−4)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸が、核酸が、MUC1*のリガンドをコードする。
(1−5)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸が、核酸が、MUC1*のリガンドをコードし、リガンドが、MUC1*抗体あるいはNMEタンパク質である。
(2)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、NMEタンパク質が、NME7あるいはNME7バリアントである。
(3)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、NMEタンパク質が、NME1あるいはNME1バリアントである。
(4)直接又は間接的に、MUC1あるいはNMEタンパク質の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、MUC1が、MUC1*である。
(5)直接又は間接的に、MUC1開裂酵素の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含む。
(6)直接又は間接的に、MUC1開裂酵素の、量、発現又は活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることを含み、開裂酵素が、MMP-16、MMP-14あるいはADAM-17である。
(7)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質である。
(8)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、NMEタンパク質又はそのバリアントである。
(9)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、NMEタンパク質であって、NMEタンパク質が、NME7である。
(10)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、NMEタンパク質であって、NMEタンパク質が、NME1である。
(11)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、MUC1あるいはMUC1の一部である。
(12)接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、細胞に入る能力を増強するモエティーあるいは配列で修飾される。
(13)接触させる化学物質の化学的種が、直接又は間接的に、NME7、NME1、MUC1、MUC1*、MMP16、MMP14またはADAM17の、量、発現又は活性における増加を、起こす。 - 生物学的物質若しくは化学物質と出発細胞との接触を含み、直接若しくは間接的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、あるいはNanogの、量、発現若しくは活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、
又は
生物学的物質若しくは化学物質と出発細胞との接触を含み、直接若しくは間接的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、あるいはNanogの、量、発現若しくは活性における増加を起こす化学種と出発細胞を接触することをさらに含む、
又は
生物学的物質若しくは化学物質と出発細胞との接触を含み、直接若しくは間接的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、あるいはNanogの、量、発現若しくは活性における増加を起こすペプチドかタンパク質と出発細胞を接触することをさらに含む、
又は
接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、NMEタンパク質又はそのバリアントであって、直接若しくは間接的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、あるいはNanogの、量、発現若しくは活性における増加を起こすペプチド又は蛋白質と出発細胞を接触することをさらに含む、
又は
接触させる生物学的物質の生物学的種が、ペプチドかタンパク質であって、該ペプチド又は該タンパク質が、NMEタンパク質又はそのバリアントであって、直接若しくは間接的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28またはNanogの、量、発現若しくは活性における増加を起こす核酸で出発細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - より少ない成熟状態が、OCT4、SOX2、KLF4、KLF2、NANOG、LIN28、MUC1、NME1あるいはNME7の少なくとも1つの発現の増加によって特徴づけられる、又はより少ない成熟状態が、OCT4、SOX2、KLF4、KLF2、NANOG、LIN28、MUC1、NME1あるいはNME7の少なくとも1つの発現の増加によって特徴づけられ、多分化能の状態で特徴づけられる請求項1〜3のいずれか1に記載の方法。
- 生物学的物質がタンパク質であり、タンパク質が以下から選択される請求項1に記載の方法;
(1)MUC1*リガンドである、
(2)タンパク質が、MUC1*リガンドであり、該リガンドが、MUC1*を二量化させる、
(3)タンパク質が、MUC1*リガンドであり、該リガンドが、NMEファミリーである、
(4)タンパク質が、MUC1*リガンドであり、該リガンドが、NMEファミリーであり、該NMEファミリーが、NME1、NME6あるいはNME7である、
(5)タンパク質が、MUC1*リガンドであり、該リガンドが、NMEファミリーであり、該NMEファミリーが、NME1、NME6あるいはNME7であり、該NME1と該NME6が、二量体の形式であり、該NME7が、モノマーの形式である。
(6)MUC1*のPSMGFR配列を認識する抗体である。 - 化学物質が、化学的種であり、該化学的種が、以下から選ばれる請求項1に記載の方法;
(1)低分子物質である。
(2)低分子物質であって、該低分子物質が、MUC1の転写、MUC1開裂酵素の転写あるいはNMEファミリーメンバーの転写を増強する。
(3)低分子物質であって、該低分子物質が、MUC1の転写、MUC1開裂酵素の転写あるいはNMEファミリーメンバーの転写を増強すし、該開裂酵素が、MMP-16、MMP-14あるいはADAM-17である。
(4)低分子物質であって、該低分子物質が、MUC1の開裂を増強する。
(5)低分子物質であって、該低分子物質が、MUC1の開裂を増強し、ホルボールエステルである。 - 出発細胞を、以下から選ばれる一と接触させることをさらに含む請求項1に記載の方法;
(1)多分化能を導く遺伝子産物の発現を増加させる分子。
(2)多分化能を導く遺伝子産物の発現を増加させる分子であって、該分子は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4あるいはLIN28の発現を増加する。
(3)多分化能を導く遺伝子産物の発現を増加させる分子であって、該分子は、OCT4およびSOX2の発現を増加させる。 - 細胞が、哺乳類由来若しくはヒト由来である請求項1に記載の方法。
- 以下のいずれかの工程を含む、出発細胞、若しくは哺乳類由来出発細胞、若しくはヒト由来出発細胞、若しくは多分化能性幹細胞、多能な幹細胞および最終分化細胞を含むグループから選ばれる出発細胞、若しくは多分化能性幹細胞であって刺激された状態である出発細胞、若しくは多能な幹細胞であって造血性細胞、骨髄細胞あるいはニューロンの細胞である出発細胞、若しくは最終分化細胞であって、繊維芽細胞、皮膚芽細胞、血球あるいはニューロン細胞である出発細胞をより少ない成熟細胞への戻りを誘導する若しく誘導を生体外で実行することを含む出発細胞からより少ない成熟細胞の生成方法;
(1)出発細胞を、細胞においてMUC1またはNMEの量を増加させる生物学的又は化学的物質と、接触させること、そして、さらに、出発細胞を、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4またはLIN28の1つ以上の量を増加させる生物学的又は化学的種と接触させること。
(2)出発細胞を、細胞においてMUC1またはNMEの量を増加させる生物学的又は化学的物質と、接触させること、そして、さらに、出発細胞を、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4またはLIN28の1つ以上の量を増加させる生物学的又は化学的種と接触させることであって、MUC1またはNMEの量を増加させる生物学的種が、MUC1、MUC1*、NME1あるいはNME7をコードする核酸あるいはそれのバリアントである。
(3)出発細胞を、細胞においてMUC1またはNMEの量を増加させる生物学的又は化学的物質と、接触させること、そして、さらに、出発細胞を、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4またはLIN28の1つ以上の量を増加させる生物学的又は化学的種と接触させることであって、出発細胞が、哺乳類である。 - 生成された細胞が、その後分化される、若しくは生体外で分化される、若しくは生体内で分化される請求項1〜9のいずれか1に記載の方法。
- 生成された細胞を分化することを含み、それの必要のある患者へ当該分化された細胞を投与する、又はそれの必要のある患者への生成された細胞若しくは患者由来の生成された細胞若しくはドナー由来の生成された細胞を投与する、又は請求項1〜9の方法によって生成された細胞若しくは当該生成された細胞の分化された細胞からなる医薬。
- 以下を含む幹細胞を分化する方法;
(i)請求項1〜9のいずれか1に記載の方法を実行することを含む、出発細胞を、より少ない成熟状態へ戻すこと又はより少ない成熟状態に維持することを誘導すること、及び
(ii)より少ない成熟状態を、分化をさせること。 - 細胞が、外胚葉、中胚葉、又は内胚葉細胞へ分化される請求項12に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1に記載の方法によって作られた誘導多分化能細胞の、対象への注入方法。
- 以下から選ばれる剤の有効量をそれの必要のある人に投与又は注入、移植あるいは局所適用によって投与することを含む傷のサイトで、幹細胞の誘導又は維持によって処置される、疾病または傷の治療剤;
多分化能誘発剤、MUC1*活性剤又はNME。 - ある細胞をNMEと接触させることを含む以下の目的での利用;
退化した幹細胞を救う方法、又は細胞の多分化能の誘導の効率を増加させる方法、又は細胞若しくは幹細胞においてMUC1又はMUC1*の発現を増加させる方法、又は出発細胞を、bFGFがない状態で、NMEと接触させることを含む、誘導多分化能性幹細胞を生成する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022052652A JP7501824B2 (ja) | 2012-07-13 | 2022-03-28 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Applications Claiming Priority (22)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261671588P | 2012-07-13 | 2012-07-13 | |
US201261671558P | 2012-07-13 | 2012-07-13 | |
US61/671,558 | 2012-07-13 | ||
US61/671,588 | 2012-07-13 | ||
US201261673617P | 2012-07-19 | 2012-07-19 | |
US61/673,617 | 2012-07-19 | ||
US201261675292P | 2012-07-24 | 2012-07-24 | |
US201261675264P | 2012-07-24 | 2012-07-24 | |
US61/675,264 | 2012-07-24 | ||
US61/675,292 | 2012-07-24 | ||
US201261677442P | 2012-07-30 | 2012-07-30 | |
US61/677,442 | 2012-07-30 | ||
US201261679021P | 2012-08-02 | 2012-08-02 | |
US61/679,021 | 2012-08-02 | ||
US201261683155P | 2012-08-14 | 2012-08-14 | |
US61/683,155 | 2012-08-14 | ||
US201261684654P | 2012-08-17 | 2012-08-17 | |
US61/684,654 | 2012-08-17 | ||
US201261693712P | 2012-08-27 | 2012-08-27 | |
US61/693,712 | 2012-08-27 | ||
PCT/US2012/060684 WO2013059373A2 (en) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Media for stem cell proliferation and induction |
USPCT/US2012/060684 | 2012-10-17 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018206988A Division JP2019030329A (ja) | 2012-07-13 | 2018-11-02 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022052652A Division JP7501824B2 (ja) | 2012-07-13 | 2022-03-28 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021019592A true JP2021019592A (ja) | 2021-02-18 |
Family
ID=49916717
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015521887A Active JP6748430B2 (ja) | 2012-07-13 | 2013-07-15 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
JP2018206988A Pending JP2019030329A (ja) | 2012-07-13 | 2018-11-02 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
JP2020156867A Pending JP2021019592A (ja) | 2012-07-13 | 2020-09-18 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
JP2022052652A Active JP7501824B2 (ja) | 2012-07-13 | 2022-03-28 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015521887A Active JP6748430B2 (ja) | 2012-07-13 | 2013-07-15 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
JP2018206988A Pending JP2019030329A (ja) | 2012-07-13 | 2018-11-02 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022052652A Active JP7501824B2 (ja) | 2012-07-13 | 2022-03-28 | より未分化状態への細胞の誘導方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150320840A1 (ja) |
EP (1) | EP2872636A4 (ja) |
JP (4) | JP6748430B2 (ja) |
CN (1) | CN105164249A (ja) |
AU (3) | AU2013289913A1 (ja) |
CA (1) | CA2879111A1 (ja) |
IL (1) | IL236692B (ja) |
WO (1) | WO2014012115A2 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2852244C (en) | 2011-10-17 | 2023-10-17 | Minerva Biotechnologies Corporation | Media for stem cell proliferation and induction |
CN111849874A (zh) * | 2012-07-24 | 2020-10-30 | 米纳瓦生物技术公司 | Nme变体物种表达和抑制 |
EP3316682A4 (en) * | 2015-07-01 | 2019-01-23 | Minerva Biotechnologies Corporation | PROCESS FOR STRAIN CELL BASED ORGAN AND TISSUE AGENCY |
US11149249B2 (en) * | 2015-09-25 | 2021-10-19 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Base material for cell culture and cell culture method using same, cell culture container, and use as base material |
US20200385687A1 (en) * | 2017-02-24 | 2020-12-10 | Koji Tanabe | Production method for artificial pluripotent stem cells |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012008302A1 (ja) * | 2010-07-12 | 2012-01-19 | 国立大学法人鳥取大学 | miRNA導入による新規hiPSC作製法 |
JP2012505636A (ja) * | 2008-10-09 | 2012-03-08 | ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション | 細胞において多能性を誘導する方法 |
WO2012051515A2 (en) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Cardiac induced pluripotent stem cells and methods of use in repair and regeneration of myocardium |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008543276A (ja) * | 2005-03-30 | 2008-12-04 | ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション | Muc1発現細胞の増殖 |
WO2006131599A2 (en) * | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Suomen Punainen Risti, Veripalvelu | Method of profiling a cell population |
US20090075926A1 (en) * | 2006-12-06 | 2009-03-19 | Bamdad Cynthia C | Method for identifying and manipulating cells |
US9144584B2 (en) * | 2008-06-11 | 2015-09-29 | Cell4Vet Corporation | Adipose tissue-derived stem cells for veterinary use |
WO2010042562A2 (en) * | 2008-10-06 | 2010-04-15 | Minerva Biotechnologies Corporation | Muc1* antibodies |
EP2414510A4 (en) * | 2009-04-03 | 2013-04-17 | Mclean Hospital Corp | INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS |
WO2010124143A1 (en) * | 2009-04-23 | 2010-10-28 | Nevada Cancer Institute | Reprogramming of somatic cells with purified proteins |
MY157524A (en) * | 2009-06-11 | 2016-06-15 | Minerva Biotechnologies Corp | Culturing embryonic stem cells, embryonic stem-like cells, or induced pluripotent stem cells with a muc1 or muc1* ligand |
WO2011159960A2 (en) * | 2010-06-16 | 2011-12-22 | Minerva Biotechnologies Corporation | Reprogramming cancer cells |
CA2852244C (en) * | 2011-10-17 | 2023-10-17 | Minerva Biotechnologies Corporation | Media for stem cell proliferation and induction |
-
2013
- 2013-07-15 WO PCT/US2013/050563 patent/WO2014012115A2/en active Application Filing
- 2013-07-15 CA CA2879111A patent/CA2879111A1/en active Pending
- 2013-07-15 CN CN201380047947.1A patent/CN105164249A/zh active Pending
- 2013-07-15 JP JP2015521887A patent/JP6748430B2/ja active Active
- 2013-07-15 EP EP13816444.7A patent/EP2872636A4/en active Pending
- 2013-07-15 AU AU2013289913A patent/AU2013289913A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-01-13 IL IL236692A patent/IL236692B/en active IP Right Grant
- 2015-01-13 US US14/596,051 patent/US20150320840A1/en active Pending
-
2018
- 2018-11-02 JP JP2018206988A patent/JP2019030329A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-02 AU AU2019203097A patent/AU2019203097A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-09-18 JP JP2020156867A patent/JP2021019592A/ja active Pending
-
2021
- 2021-09-27 AU AU2021240117A patent/AU2021240117A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-03-28 JP JP2022052652A patent/JP7501824B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012505636A (ja) * | 2008-10-09 | 2012-03-08 | ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション | 細胞において多能性を誘導する方法 |
WO2012008302A1 (ja) * | 2010-07-12 | 2012-01-19 | 国立大学法人鳥取大学 | miRNA導入による新規hiPSC作製法 |
WO2012051515A2 (en) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Cardiac induced pluripotent stem cells and methods of use in repair and regeneration of myocardium |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PLOS ONE, vol. Vol.3, No.10, E3312, JPN6017027649, 2008, pages 1 - 13, ISSN: 0004601537 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL236692B (en) | 2021-03-25 |
JP6748430B2 (ja) | 2020-09-02 |
AU2019203097A1 (en) | 2019-05-23 |
JP2019030329A (ja) | 2019-02-28 |
WO2014012115A2 (en) | 2014-01-16 |
CA2879111A1 (en) | 2014-01-16 |
WO2014012115A3 (en) | 2015-04-16 |
EP2872636A4 (en) | 2016-08-17 |
CN105164249A (zh) | 2015-12-16 |
AU2021240117A1 (en) | 2021-10-28 |
JP2016502399A (ja) | 2016-01-28 |
JP2022101564A (ja) | 2022-07-06 |
EP2872636A2 (en) | 2015-05-20 |
JP7501824B2 (ja) | 2024-06-18 |
AU2013289913A1 (en) | 2015-03-05 |
IL236692A0 (en) | 2015-02-26 |
US20150320840A1 (en) | 2015-11-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11898160B2 (en) | Method for maintaining pluripotency in cells | |
JP7501824B2 (ja) | より未分化状態への細胞の誘導方法 | |
US8962331B2 (en) | Method of making induced pluripotent stem cell from adipose stem cells using minicircle DNA vectors | |
US20100330677A1 (en) | Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained | |
KR101861171B1 (ko) | 투석된 혈청이 있는 심근세포 배지 | |
CN103998598A (zh) | 用于干细胞增殖和诱导的培养基 | |
WO2019107576A1 (ja) | 始原生殖細胞/始原生殖細胞様細胞の維持増幅及び分化誘導方法 | |
JP5751548B2 (ja) | イヌiPS細胞及びその製造方法 | |
Alvarez et al. | Nanog overexpression allows human mesenchymal stem cells to differentiate into neural cells——Nanog transdifferentiates mesenchymal stem cells | |
EP2501803B1 (en) | Methods of enhancing pluripotentcy | |
JP2018082639A (ja) | 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地 | |
CA2991125A1 (en) | Method of stem cell-based organ and tissue generation | |
JP2014217351A (ja) | メタボリックシンドロームモデルラット誘導多能性幹細胞及び製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200918 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200918 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210928 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20211104 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211213 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220215 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220525 |