CN109072256A - 用于将核酸引入细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供编码SOCS1的核酸用于增强将至少一种感兴趣的核酸引入细胞的效率的用途；用至少一种感兴趣的核酸重复转染细胞的方法，其包括加入以下的步骤：a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后b)编码至少一种感兴趣的多肽的至少一种感兴趣的核酸，其中至少步骤b)重复至少一次；和用至少一种感兴趣的核酸电穿孔细胞的方法，其包括向所述细胞中加入以下的步骤：a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后b)所述至少一种感兴趣的核酸。所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸可以是mRNA，其中每种所述mRNA在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾。

Description

用于将核酸引入细胞的方法
背景技术
核酸(例如DNA或RNA)的转染在细胞中引发所谓的先天免疫。细胞质蛋白识别非自身核酸并激活信号转导途径，导致特别是细胞因子的产生，并可导致细胞凋亡。被触发的一种信号传导途径是干扰素(IFN)信号转导途径。如果细胞被转染一次，这种效应对于细胞的存活并不重要。但如果细胞必须在几天内被反复转染，则观察到细胞死亡大大增加。通常，这导致转染细胞的细胞死亡。痘苗病毒可溶性α/β干扰素受体(B18R)与细胞表面结合并保护细胞免受IFN的抗病毒作用(Alcami等，2000，Journal of Virology，74：11230-11239)。在重复转染细胞后向细胞培养基中加入蛋白质B18R蛋白导致细胞死亡大大减少，转染基因表达增加。B18R蛋白质例如在每天进行用于通过重编程因子的mRNA将原代分化细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的细胞转染后加入到细胞培养基中(Warren等，2012，SCIENTIFICREPORTS 2：657，DOI：10.1038/srep00657)。B18R作为蛋白质添加到培养基中，因此具有费力且昂贵的生产的缺点。通常纯化的蛋白质仍然被不需要的组分污染，例如内毒素，其不可以与蛋白质分离或只有通过巨大的努力才与之分离。另外，制备用于添加到另一环境例如细胞培养基中的蛋白质经常在估计新环境中的实际浓度时引起麻烦，因为蛋白质通常具有粘附在含有蛋白质的容器壁上的疏水区域。
Poleganov等(Hum Gene Ther 2015，26(11)，751-66)报道了各种病毒mRNA(B18R、E3和K3的痘苗病毒衍生mRNA)的组合，以拯救细胞免受先天免疫激活的不希望的影响。当与重编程相关微小RNA(miRNA)组合时，这产生无饲养iPS细胞产生方法。该方法的缺点是相当复杂的mRNA/miRNA混合物，其是促进重编程所必需的。
在Hong和Carmichael(2013，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，288：16196-16205)中，显示对I型IFN的减弱细胞应答可能是多能人干细胞的一般特征，并且这与细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的高表达相关。
已经描述了细胞内的大多数mRNA具有长度为50至150个核苷酸的聚(A)(Jalkanen，AL等，Semin Cell Dev Biol.2014；34：24-32)。
因此，一般的假设是，对于体外产生的mRNA，应该使用类似于细胞中发现的长度的聚A尾。尽管非常短的聚A尾与更快的降解相关，但已显示mRNA的翻译效率随着聚A长度在15至98个腺苷的范围内增加(Preiss，T等，RNA.1998；4(11)：1321-31)。通常，体外转录的mRNA的聚A尾长度在20至200个核苷酸的范围内。在Poleganov等的上述出版物中，所有mRNA都含有正好120A的聚A尾。
大肠杆菌聚(A)聚合酶是体外针对多聚腺苷酸RNA的最常见的酶，已被描述为产生具有仅20-150个核苷酸的聚A尾。当与Hfq蛋白组合时，已经描述具有至多900个核苷酸(Hajnsdorf E等，Proc Natl Acad Sci USA.2000，15；97(4)：1501-5.)。很少聚(A)聚合酶能够产生更长的聚(A)尾，例如酵母聚(A)聚合酶。
本领域需要一种改进的或替代的方法，用于将感兴趣的核酸分子引入细胞中，其减少细胞的所谓先天免疫的不希望的影响，所述影响可以通过将核酸引入细胞而发生。
发明内容
令人惊讶地，发现可以使用编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA，具有对在细胞中(例如在细胞培养基中)编码感兴趣的多肽的感兴趣的核酸的表达的有益效果，所述感兴趣的核酸与所述编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA共同引入(例如通过转染或电穿孔)。完全预料不到的是，编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA可用于重复转染过程以及用于电穿孔过程，以实现对共同引入的感兴趣的核酸的表达的有益效果。将所述编码SOCS1的核酸引入细胞中减少所谓的细胞先天免疫的影响，从而与其中未共同引入编码SOCS1的核酸的细胞相比，改善细胞存活和/或改善细胞中共同引入的感兴趣的核酸的表达。将所述编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA引入细胞通过由于减弱细胞的I型IFN应答而促进细胞存活，减少了细胞先天免疫的影响。通常，特别是重复核酸转染引发细胞中的先天免疫，其随后可导致细胞凋亡。因此，完全预料不到的是，编码SOCS1的单独核酸例如SOCS1 mRNA用于例如在细胞培养基中重复转染细胞逃脱了这种命运，并且可以帮助共转染的其他核酸在转染细胞中变得表达。同样，转染细胞中SOCS1的表达减弱了通常可能导致细胞凋亡的对I型IFN的细胞应答，从而减少了细胞先天免疫的影响。其他核酸例如单独的B18R mRNA没有显示出这种有益效果，尽管在每天进行用于将原代分化细胞重编程为诱导多能干细胞的细胞转染后将B18R蛋白(作为现有技术中的金标准)加入到细胞培养基中。如上所述，在核酸水平上，迄今为止，仅已显示各种病毒mRNA的组合使细胞免于先天免疫的激活的不希望的作用。令人惊讶的是，我们发现一种核酸，即编码SOCS1的核酸，优选引入细胞的SOCS1 mRNA足以避免或减少先天免疫的激活的影响。
编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA作为转染过程中(例如在细胞培养基中)用于减少在重复转染细胞中的细胞先天免疫的影响的试剂具有作为核酸的益处，其也不具有蛋白质如B18R的上述缺点。特别是，与蛋白质相比，核酸如mRNA的产生及其纯化更容易。与本领域已经显示拯救细胞免受先天免疫的激活的不希望的影响的各种病毒mRNA的组合(“混合物”)相比，编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA作为(例如在细胞培养基中)用于减少在重复转染细胞中的细胞先天免疫的影响的试剂也具有作为仅仅一种核酸的益处。
编码SOCS1的核酸和同时或随后添加到细胞中(例如通过将所述核酸添加到携带待转染细胞的培养基中)的编码感兴趣的多肽的至少一种感兴趣的核酸可以是DNA分子，其转录成mRNA并随后翻译成多肽，因此它们可以发挥上述作用。或者，编码SOCS1的核酸可以是SOCS1 mRNA分子，并且感兴趣的核酸可以是DNA或RNA。优选地，编码SOCS1的核酸和编码感兴趣的多肽的感兴趣的核酸两者可以是mRNA分子。
此外，令人惊讶地，发现mRNA(SOCS1 mRNA和编码感兴趣的多肽的mRNA两者)的聚(A)尾越长，转染效率和/或感兴趣的核酸编码的感兴趣的多肽的表达水平越好。这意味着mRNA的聚(A)尾越长，同一细胞的重复转染越有可能。因此，优选地，本方法中使用的mRNA在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾，更优选至少1500个腺嘌呤，甚至更优选至少2000个腺嘌呤，并且最优选至少4000个腺嘌呤。这种长聚(A)尾可以通过例如酵母聚(A)聚合酶产生。
只要编码SOCS1的核酸存在于转染细胞中(即它被翻译成多肽)，例如通过编码SOCS1的核酸和至少一种感兴趣的核酸的第一共转染实现，则用所述至少一种感兴趣的核酸转染同一细胞足以进行所述细胞的重复转染(或多次重复转染)。
甚至更预料不到地，发现编码SOCS1的核酸和本发明方法中使用的感兴趣的核酸的未修饰或仅略微修饰的mRNA甚至优于所述核酸mRNA的修饰或更大程度修饰的变体(例如100％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶是修饰的核碱基)。这是令人惊讶的，因为通常是感兴趣的基因的更大程度修饰的mRNA用于实现更稳定的mRNA分子用于转染，而先天免疫应答的激活多由未修饰的mRNA突出(Kariko等，Immunity 2005，23(2)，165-175)。
此外，令人惊讶的是，发现编码SOCS1的核酸还可以用于用至少一种感兴趣的核酸(例如在细胞培养基中)电穿孔细胞的方法，导致细胞存活改善和/或导致更多细胞在细胞中表达感兴趣的核酸分子。
附图说明
图1：连续3次每天转染后流式细胞术测定人成纤维细胞中GFP mRNA表达的强度。
图2：比较B18R和SOCS1 mRNA对于使用mRNA转染产生iPSC的影响。
图3：修饰的和未修饰的mRNA对于人新生儿包皮成纤维细胞重编程为iPSC的影响。
图4：聚A尾长度对于成纤维细胞成功重编程为iPSC的影响。
图5：聚A尾长度对于GFP蛋白表达的影响。
图6：SOCS1 mRNA对于eGFP质粒DNA电穿孔到T细胞中之后细胞活力和转染率的影响(图6A，B，C)。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了编码SOCS1的核酸用于增强将至少一种感兴趣的核酸引入细胞的效率和/或改善其中引入至少一种感兴趣的核酸的细胞的存活的用途。
所述编码SOCS1的核酸可以是mRNA并且可以在其3’端具有聚(A)尾，其包含至少200个腺嘌呤，至少500个腺嘌呤，至少1000个腺嘌呤，至少1500个腺嘌呤，至少2000个腺嘌呤，至少2500个腺嘌呤，至少3000个腺嘌呤，至少3500个腺嘌呤，至少4000个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少5000个腺嘌呤，至少5500个腺嘌呤或至少6000个腺嘌呤。
所述至少一种感兴趣的核酸可以是DNA。
所述至少一种感兴趣的核酸可以是mRNA并且可以在其3’端具有聚(A)尾，其包含至少200个腺嘌呤，至少500个腺嘌呤，至少1000个腺嘌呤，至少1500个腺嘌呤，至少2000个腺嘌呤，至少2500个腺嘌呤，至少3000个腺嘌呤，至少3500个腺嘌呤，至少4000个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少5000个腺嘌呤，至少5500个腺嘌呤或至少6000个腺嘌呤。
在以下部分中更详细地公开了所述编码SOCS1的核酸增强将至少一种感兴趣的核酸引入细胞的效率的用途。
在一个方面，本发明提供了用至少一种感兴趣的核酸重复转染细胞的方法，例如在细胞培养基中，其包括向细胞中添加以下的步骤。
a)编码SOCS1的核酸；并且同时或随后
b)编码至少一种感兴趣的多肽的所述至少一种感兴趣的核酸；
其中至少步骤b)重复至少一次。
当重复步骤b)时，也可以每次重复步骤a)，或者当重复步骤b)时，可以至少每两次，每三次，每四次，每五次，每六次，每七次或每八次重复步骤a)。
在本发明的一个实施方式中，当重复步骤b)时也每次重复步骤a)，然后本发明提供了用至少一种感兴趣的核酸重复转染细胞的方法，例如在细胞培养基中，其包括向细胞中加入以下的步骤(或者如果细胞在细胞培养基中，则加入到培养基中)
a)编码SOCS1的核酸；并且同时或随后
b)编码至少一种感兴趣的多肽的所述至少一种感兴趣的核酸；
其中所述步骤在培养所述细胞期间重复至少一次。
所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸可以是mRNA，其中每种所述mRNA可以在其3’端具有聚(A)尾，其包含至少200个腺嘌呤，至少500个腺嘌呤，至少1000个腺嘌呤，至少1500个腺嘌呤，至少2000个腺嘌呤，至少2500个腺嘌呤，至少3000个腺嘌呤，至少3500个腺嘌呤，至少4000个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少5000个腺嘌呤，至少5500个腺嘌呤或至少6000个腺嘌呤。
所述至少步骤b)可重复至少三次，优选五次，其中所述聚(A)尾包含至少2000个腺嘌呤。
所述至少步骤b)可重复至少8次，其中所述聚(A)尾包含至少4000个腺嘌呤。
所述核酸两者可在本方法中作为mRNA提供，或者，编码SOCS1的核酸可以是mRNA，而编码感兴趣的多肽的感兴趣的核酸可以是DNA，反之亦然。
在本方法中使用的每种所述mRNA中，mRNA的0％至50％，优选0％至25％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶可以是修饰的核碱基。
更优选地，本方法中使用的所述mRNA是未修饰的mRNA。
修饰的mRNA已经被描述为减少转染的RNA的先天免疫。取决于给定应用，更高的修饰率被假设为即使在重复转染的情况下也改善细胞的存活。然而，修饰的mRNA的翻译减少，因此如果重复转染可以通过除使用修饰的核苷酸之外的其他方式实现，则未修饰的mRNA将是优选的。
重复步骤a)和步骤b)或至少步骤b)的时间可以是4小时至48小时的一次重复，优选6小时至36小时，更优选6小时至24小时，或者重复可以是每天。
所述细胞可以是原代细胞。所述细胞可以是分化的或体细胞。所述细胞可以是iPS细胞或干细胞。所述细胞可以来自细胞系。
所述至少一种感兴趣的核酸可编码能够将原代细胞或分化细胞重编程为iPSC的至少一种重编程因子。然后，本方法用于将原代细胞或分化细胞重编程为iPS细胞。
所述至少一种重编程因子可选自Oct3/4，c-myc，Sox2，Lin28，Klf4和Nanog。
所述至少一种感兴趣的核酸可以是能够将体细胞转分化为不同细胞类型的分化因子。然后，本方法用于将体细胞转分化为不同细胞类型。
这种分化因子的实例是MyoD，Gata4，Mef2c，Tbx5，Pdx1，Ngn3，MafA，Asc11，Brn2和MytII。
另外，所述至少一种感兴趣的核酸可选自DNA，mRNA，shRNA，siRNA，miRNA。所述感兴趣的核酸可以是DNA，例如编码感兴趣的基因的质粒。所述感兴趣的核酸可以是编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
所述细胞可以是免疫细胞，例如T细胞。
所述方法可以在封闭系统中执行。
在封闭系统中执行的所述方法可以是自动化方法。
封闭系统的一个实例是CliniMACS (Miltenyi Biotec GmbH，德国，WO2009/072003)。
在另一方面，本发明提供了用至少一种感兴趣的核酸电穿孔细胞的方法，例如在细胞培养基中，其包括向所述细胞(或培养基)中加入以下的步骤：
a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后
b)所述至少一种感兴趣的核酸。
所述编码SOCS1的核酸可以是SOCS1 mRNA或DNA，例如编码SOCS1的质粒。优选地，所述编码SOCS1的核酸可以是SOCS1 mRNA。所述编码SOCS1的核酸可以是SOCS1 mRNA，其中在所述mRNA中0％至50％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶可以是修饰的核碱基，优选地，其中在所述mRNA中0％至25％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶可以是修饰的核碱基，更优选其中所述mRNA可以是未修饰的mRNA。
如果所述感兴趣的核酸也是mRNA，则所述mRNA是mRNA，其中在所述mRNA中0％至50％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶可以是修饰的核碱基，优选地，其中在所述mRNA中0％至25％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶的％可以是修饰的核碱基，更优选其中所述mRNA可以是未修饰的mRNA。
所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸可以是mRNA，其中每种所述mRNA可以在其3’端具有聚(A)尾，其包含至少200个腺嘌呤，至少500个腺嘌呤，至少1000个腺嘌呤，至少1500个腺嘌呤，至少2000个腺嘌呤，至少2500个腺嘌呤，至少3000个腺嘌呤，至少3500个腺嘌呤，至少4000个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少4500个腺嘌呤，至少5000个腺嘌呤，至少5500个腺嘌呤或至少6000个腺嘌呤。
核酸两者可在本方法中作为mRNA提供，或者，编码SOCS1的核酸可以是mRNA，而编码感兴趣的多肽的感兴趣的核酸可以是DNA，反之亦然。
另外，所述至少一种感兴趣的核酸可选自DNA，mRNA，shRNA，siRNA，miRNA。所述感兴趣的核酸可以是DNA，例如编码感兴趣的基因的质粒。所述感兴趣的核酸可以是编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
所述细胞可以是免疫细胞，例如T细胞。
所述方法可以在封闭系统中执行。
在封闭系统中执行的所述方法可以是自动化方法。
封闭系统的一个实例是CliniMACS(Miltenyi Biotec GmbH，德国，WO2009/072003)。
SOCS1核酸可以被与SOCS1蛋白相比具有相似性质的SOCS1家族的另一成员替代，例如SOCS3和CIS(Liang等.Eur.J.Immunol.2014.44：1265-1275)，其也抑制JAK/STAT信号传导途径的激活。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“核酸”是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称。核酸(核酸序列)是核苷酸的线性聚合物。每个核苷酸由三个组分组成：嘌呤或嘧啶核碱基(碱基)、戊糖和磷酸基团。由核碱基加糖组成的亚结构称为核苷。核酸类型在糖结构方面的差别在于其核苷酸：DNA含有2'-脱氧核糖，而RNA含有核糖。此外，见于两种核酸类型中的核碱基不同：腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤见于RNA和DNA两者中，而胸腺嘧啶存在于DNA中且尿嘧啶存在于RNA中。
除腺嘌呤(A)，胞嘧啶(c)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)外，DNA和RNA也可含有已被修饰的碱基。在DNA中，最常见的修饰碱基是5-甲基胞嘧啶(m5c)。在RNA中，存在许多修饰的碱基，包括核苷假尿苷(Ψ)，二氢尿苷(D)，肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)中包含的那些。
术语“修饰的核糖核苷”是指除标准鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，胞苷(C)和尿苷(U)核苷之外的核糖核苷。这样的修饰可以天然地发生，例如通过对哺乳动物细胞mRNA的转录后修饰。对于体外转录的mRNA，合成的核苷酸也可用于产生修饰的RNA。
修饰的核苷优选为5'-甲基胞苷和/或假尿苷。可以使用但不限于的其他核苷是N6-甲基腺苷(m6A)，3,2'-O-二甲基尿苷(m4U)，2-硫尿苷(s2U)，2'氟尿苷，2'-O-甲基尿苷(Um)，2'-脱氧尿苷(2'dU)，4-硫尿苷(s4U)，5-甲基尿苷(m5U)，2'-O-甲基腺苷(m6A)，N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)，N6,N6,2'-O-三甲基腺苷(m62Am)，2'-O-甲基胞苷(Cm)，7-甲基鸟苷(m7G)，2'-O-甲基鸟苷(Gm)，N2,7-二甲基鸟苷(m2,7G)，N2,N2,7-三甲基鸟苷(m2,2,7G)和肌苷(I)。
聚腺苷酸化是向RNA，优选信使RNA(mRNA)，添加聚(A)尾。聚(A)尾由多个腺苷一磷酸组成；换句话说，它是一段仅含有腺嘌呤碱基的RNA。在真核生物中，聚腺苷酸化是产生用于翻译的成熟信使RNA(mRNA)的过程的一部分。因此，它构成了更大的基因表达过程的一部分。通常，真核mRNA含有5'帽。这个5'帽(也称为RNA帽，RNA 7-甲基鸟苷帽，或RNA m7G帽)是修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前部”或5’端。5'帽由通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的末端7-甲基鸟苷残基组成。它的存在对于核糖体的识别和针对RNA酶的保护至关重要。本文描述的和用于本发明的mRNA具有5'帽。天然存在的帽结构包含7-甲基鸟苷，其通过三磷酸桥连接至第一个转录的核苷酸的5’-端，产生m7G(5')ppp(5')N的二核苷酸帽，其中N为任何核苷。5’-端核苷通常是鸟苷，并且在与所有其他核苷酸相反的方向上，即G(5')ppp(5')GpNpNp。除了使用酶促反应将CAP结构引入体外转录的RNA之外，CAP类似物可用于在体外转录期间引入已有CAP结构。
这样的CAP类似物可以是所谓的抗反向帽类似物(Anti-Reverse Cap Analogy，“ARCA”)，其中2'或3'OH基团已被-OCH3代替。
术语“编码(encoding)”或“编码(coding for)”可以互换使用。如本文所用，“编码”是指多核苷酸(例如基因，cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的性质，以用作合成其他大分子(例如确定的氨基酸序列)的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。“编码多肽的核酸(序列)”包括是彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
如本文所用的术语“表达”定义为由其启动子在细胞中驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
细胞因子信号传导抑制因子1是人类中由SOCS1基因编码的蛋白质(SOCS1)。该基因编码STAT诱导的STAT抑制剂(SSI)(也称为细胞因子信号传导抑制因子(SOCS))家族的成员。SSI家族成员是细胞因子信号传导的细胞因子可诱导负调节因子。该基因的表达可以由细胞因子的子集诱导，包括IL2，IL3，促红细胞生成素(EPO)，GM-CSF和干扰素-γ(IFN-γ)。由该基因编码的蛋白质在细胞因子受体的下游起作用，并参与负反馈环以减弱细胞因子信号传导。如本文所用的术语“编码SOCS1的核酸”是指当对应于该基因的mRNA的转录和/或翻译在细胞中进行时编码完整SOCS1蛋白或其功能片段的任何核酸(序列)。
已经显示SOCS1肽可以代替功能性SOCS1全长蛋白(He,C等，J Autoimmun.2015)。
编码SOCS1的核酸可以是衍生自哺乳动物(例如人，小鼠，大鼠或绵羊)的核酸序列(例如编码哺乳动物SOCS1的mRNA)，优选地，编码SCOS1的核酸是SOCS1的人序列(例如编码人SOCS1的mRNA)。
如本文所用的术语“感兴趣的核酸”是指任何核酸、核酸序列或核酸聚合物，其旨在与编码SOCS1的核酸一起共同引入细胞中。所述感兴趣的核酸可以是DNA分子，例如感兴趣的基因或RNA分子，例如mRNA，shRNA，siRNA或miRNA。如果感兴趣的核酸是编码感兴趣的多肽的DNA或mRNA，那么本文也可以使用措辞“编码感兴趣的多肽的感兴趣的核酸”。所述多肽可以是全长蛋白质或其功能片段。
如本文所用的术语“共同引入”是指将多种核酸(编码SOCS1的核酸和至少一种感兴趣的核酸)引入细胞的意图。本领域熟知用于将核酸引入细胞的多种物理或化学或生物学方法，例如电穿孔或脂质转染或通过化学化合物进行转染或病毒转导。
只要编码SOCS1的核酸在用感兴趣的核酸进一步转染期间在细胞中存在并翻译成SOCS1蛋白，则在至少一次重复转染(多次转染)的一次转染中将编码SOCS1的核酸与至少一种感兴趣的核酸共同引入细胞是足够的。在本发明的一个实施方式中，核酸在一次转导或转染中引入。在本发明的另一个实施方式中，编码SOCS1的核酸也可以单独引入，例如在将至少一种感兴趣的核酸引入细胞之前或之后，只要至少两种核酸在至少72小时，48小时，36小时，24小时，18小时，12小时，6小时，4小时，2小时或1小时的同一时间内存在于细胞中。在本文公开的方法中将多种核酸加入到培养基中的上下文中，术语“同时”具有与“共同引入”相同的含义，因此将多种核酸连续加入到细胞培养基中(但在一个转导或转染或电穿孔过程中)也包括在术语“同时”中。
转染是有意将核酸引入细胞的过程。如本文所用的术语“重复转染”是指相同细胞(例如在细胞培养基中)转染不止一次。为了在细胞培养过程中重复转染细胞，必须将待转染的核酸重复加入细胞或细胞培养基中。在本文公开的方法中，重复向细胞或细胞培养基中加入以下的步骤的时间(持续时间)：a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后b)编码至少一种感兴趣的多肽的至少一种核酸；其中至少步骤b)重复至少一次，可以是4小时至48小时的一次重复，优选6小时至36小时，更优选6小时至24小时或每天。但通常，可以选择转染过程之间的任何持续时间(或时间)。
多种转染试剂是本领域公知的，并且可以是可商购的，例如Reagent(Thermo Fisher Scientific Inc)或其他。转染试剂包括但不限于聚阳离子化合物(如聚乙烯亚胺(PEI)，聚-L-赖氨酸或DEAE-葡聚糖)，化学化合物如磷酸钙或含有带电脂质和聚合物的脂质体制剂(lipe DOTAP[N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐]，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)及其组合，例如LIPOFECTAMINETM是聚阳离子脂质，2,3-二油氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)和DOPE的3:1(重量/重量)混合物。可以通过使用如上所述的转染试剂或通过使用本领域技术人员已知的并且适于转染细胞的任何转染试剂将编码SOCS1的核酸和至少一种感兴趣的核酸递送到细胞中。
如本文所用的术语转染效率包括感兴趣的核酸的表达水平和/或总细胞存活和/或转染率的方面。
术语电穿孔是向细胞施加电场，从而干扰细胞膜的完整性，并允许诸如核酸的分子进入细胞的过程。丧失细胞膜完整性可以对细胞是致命的，并且必须在转染效率和细胞存活之间平衡电穿孔条件。通过将SOCS1核酸引入细胞改善细胞存活允许获得更高的转染率。
术语增强的效率或增强效率描述了总体细胞存活改善和/或表达水平增强和/或转染率提高的事实。
如本文所用的术语“细胞培养基”包括提供细胞维持所需的化学条件的液体。可以支持细胞扩增的化学条件的实例包括但不限于溶液，缓冲液，血清，血清成分，营养素，维生素，细胞因子和通常在细胞培养基中提供(或可以手工给予)的其他生长因子。适用于培养细胞的培养基和用于特殊应用的那些，例如用于将原代细胞重编程为诱导多能干细胞的特殊培养基，是本领域已知的
如本文所用，术语“培养”包括提供细胞维持所需的化学和物理条件(例如温度，气体)和生长因子。通常培养细胞包括为细胞提供扩增(增殖)条件。可以支持细胞扩增的化学条件的实例包括但不限于缓冲液，血清，营养素，维生素，抗生素，细胞因子和通常在适合细胞扩增的细胞培养基中提供(或可以手工给予)的其他生长因子。用于维持和/或扩增细胞的培养基在本领域中是众所周知的。直接从受试者培养的细胞称为原代细胞。除了一些源自肿瘤的以外，大多数原代细胞培养物具有有限的寿命。
体细胞是形成生物体的身体的任何生物细胞；也就是说，在多细胞生物体中，除配子，生殖细胞，配子体或未分化干细胞之外的任何细胞。
如本文所用的术语“重编程因子”是指作用于细胞以改变转录，并且在表达后将体细胞重编程为不同细胞类型或多能性(multipotency)或多能性(pluripotency)的一种或多种生物活性多肽或编码它们的核酸或小分子。
诱导多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)是可以直接从新生和成体原代细胞产生的一类多能干细胞。通常通过将特定组的多能性相关基因或“重编程因子”引入给定细胞类型而获得iPSC。最初组的重编程因子(也称为Yamanaka因子)是基因Oct4(Pou5fl)，Sox2，cMyc和Klf。虽然这种组合在生产iPSC中是最常规的，但每种因子可以在功能上被相关的转录因子、miRNA、小分子或甚至非相关基因如谱系说明符(lineage specifier)替代。重编程混合物也可以通过更多的重编程因子进行修正，以提高重编程的效率。
分化因子通常是促进更加多能的细胞(如胚胎干细胞或iPSC)分化成更不多能的细胞(例如分化细胞，如纤维母细胞，神经元细胞或心肌细胞)的转录因子。但分化因子也可以是促进从分化细胞分化成另一种细胞分化细胞类型(转分化)的转录因子。
术语“转分化”也称为谱系重编程。这是其中一种成熟体细胞转化成另一种成熟体细胞而不经历中间多能状态或祖细胞类型的过程。
如本文所用的术语“封闭系统”是指任何封闭系统，其在进行培养过程(例如引入新材料)和进行细胞培养步骤(例如增殖，分化，激活，基因修饰和/或分离细胞)的同时降低细胞培养污染的风险。这种系统允许在GMP或类GMP条件(“无菌”)下操作，产生临床上可应用的细胞组合物。
封闭系统的实例是CliniMACS(Miltenyi Biotec GmbH，德国，WO2009/072003)。
本文使用的术语“自动化方法”或“自动化过程”是指通过使用设备和/或计算机和计算机软件而自动化，否则其会由或可由操作员手动执行的任何过程。已经自动化的方法(过程)需要较少的人工干预和较少的人工交付时间。在一些情况下，如果在没有人工支持或干预的情况下执行方法的至少一个步骤，则该方法是自动化的。优选地，如果在没有人工支持或干预的情况下执行方法的所有步骤，则该方法是自动的。
实施方式
在本发明的一个实施方式中，本文公开的方法中使用的感兴趣的核酸是例如编码用于原代分化细胞(例如，但不限于人成纤维细胞，肾上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞)重编程为iPSC的转录因子(例如Oct3/4，c-myc，Sox2，Lin28，Klf4，Nanog)的核酸。感兴趣的核酸作为mRNA提供，并使用适于转染待重编程的细胞的转染试剂递送。向待转染的感兴趣的mRNA添加SOCS1 mRNA可防止由于重复转染mRNA而引起的先天免疫激活导致的大量细胞死亡。SOCS1 mRNA的加入还可以增强引入的mRNA的表达水平，从而提高原代细胞的重编程的效率。SOCS1 mRNA的加入省略了对向培养基中加入其他免疫抑制化合物的需要。优选地，SOCS1 mRNA和感兴趣的mRNA两者具有包含至少1500个，更优选至少2000个腺嘌呤的聚(A)尾。
在本发明的一个实施方式中，如果使用的核酸是mRNA，则本文描述的实施方式中使用的mRNA可以带有修饰的核碱基。在本发明的一个实施方式中，所用mRNA中0％至25％的碱基胞嘧啶/尿嘧啶可以是修饰的胞嘧啶/尿嘧啶。
在本发明的一个实施方式中，本文公开的方法中使用的感兴趣的核酸是例如用于原代分化细胞(例如，但不限于人成纤维细胞，肾上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞)重编程为iPSC的转录因子(例如Oct3/4，c-myc，Sox2，Lin28，Klf4，Nanog)。感兴趣的核酸作为DNA提供，例如在附加型质粒内，并使用适于转染待重编程的细胞的转染试剂递送。在转染过程中加入SOCS1 mRNA可防止由外源加入的DNA引起的先天免疫激活导致的大量细胞死亡。SOCS1 mRNA的加入还可以增强引入的DNA质粒的表达水平，从而提高原代细胞的重编程的效率。SOCS1 mRNA的加入省略了对向培养基中加入其他免疫抑制化合物的需要。优选地，SOCS1 mRNA具有包含至少1500个，更优选至少2000个腺嘌呤的聚(A)尾。
在本发明的一个实施方式中，本文公开的方法中使用的感兴趣的核酸是例如用于原代分化细胞(例如，但不限于人成纤维细胞，肾上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞)重编程为iPSC的转录因子(例如Oct3/4，c-myc，Sox2，Lin28，Klf4，Nanog)。感兴趣的核酸可以作为mRNA或DNA提供，例如在质粒内，并且使用例如适于转染待重编程的细胞的转染试剂递送。在转染过程中加入编码SOCS1的DNA可防止由外源加入的mRNA或DNA引起的先天免疫激活导致的大量细胞死亡。加入编码SOCS1的DNA还可以增强含有感兴趣的核酸的引入的DNA质粒的表达水平，从而提高原代细胞的重编程的效率。加入编码SOCS1的DNA省略了对向培养基中加入其他免疫抑制化合物的需要。当感兴趣的核酸是mRNA时，则优选感兴趣的mRNA具有包含至少1500个，更优选至少2000个腺嘌呤的聚(A)尾。
在本发明的一个实施方式中，感兴趣的核酸是将体细胞转分化成不同细胞类型所必需的一种或多种转录因子，例如用MyoD mRNA或编码MyoD的DNA将成纤维细胞重复转染成骨骼肌细胞。转分化也可以通过使用重复转染实现，并且伴随着先天免疫途径的激活，其通过诱导细胞死亡或激活不需要的细胞信号传导途径而抵消转分化努力。在本领域中，B18R蛋白的添加用于抑制先天免疫途径的激活。在转染过程中加入编码SOCS1的核酸如SOCS1mRNA可防止由于重复转染mRNA引起的先天免疫激活导致的大量细胞死亡。加入编码SOCS1的核酸如SOCS1 mRNA也可以增强引入的mRNA或DNA的表达水平，从而提高体细胞转分化为不同细胞类型的效率。当使用mRNA时，优选地，SOCS1 mRNA和感兴趣的mRNA两者具有包含至少1500个，更优选至少2000个腺嘌呤的聚(A)尾。
在本发明的一个实施方式中，加入如本文所公开的SOCS1 mRNA还可用于增强向细胞(例如成纤维细胞)加入神经元转录因子以通过向所述细胞中引入特定转录因子(例如Ascl1，Brn2，NeuroD1和/或Myt1l)而使细胞转分化为神经元细胞或其祖细胞的作用。SOCS1mRNA还可以通过引入各种转录因子(例如GATA4，Mef2c，Tbx5)而将ta细胞(例如成纤维细胞)转分化为心肌细胞。
在本发明的一个实施方式中，使用本领域已知的电穿孔方法通过电穿孔将感兴趣的核酸递送至细胞。通过将核酸加入到细胞中并施加电场以破坏细胞膜并使核酸能够进入细胞，感兴趣的核酸作为mRNA或DNA与所述SOCS核酸作为mRNA或DNA一起递送。对于具有针对外来核酸的有效先天免疫反应的细胞，SOCS1核酸的使用是优选的。例如，本领域众所周知，在将质粒DNA电穿孔至T细胞后发生大量细胞死亡。
在本发明的一个实施方式中，SOCS1 mRNA的添加用于递送可能对细胞有毒的mRNA，shSNA，miRNA，siRNA或质粒DNA，以增强细胞存活。潜在毒性核酸也可能随后施加至SOCS1核酸，以允许在潜在毒性核酸进入细胞之前翻译SOCS1蛋白或片段和抑制细胞因子分泌。由于重复转染是乏味的并伴有细胞应激。
在优选的实施方式中，电穿孔在封闭系统中进行。
实施例
在下文中，参考实施例更详细地描述本发明，但其并不意图限制本发明。
实施例1：在SOCS1 mRNA存在下的GFP表达
在修饰的核苷酸假尿苷和5-甲基胞苷的存在下，使用T7聚合酶(Miltenyi BiotecGmbH)通过体外转录产生SOCS1和B18R mRNA。使用痘苗病毒加帽酶(New England Biolabs，Inc.)给体外转录的mRNA加帽。使用酵母聚A聚合酶(Affymetrix，Thermo FisherScientific)添加聚A尾。SOCS1和B18R mRNA的聚A尾含有约1500个腺嘌呤碱基。类似地产生GFP mRNA，除了仅使用未修饰的核苷酸进行转录并且聚A尾含有至少3000个核苷酸(nt)。根据供应商的说明，使用StemMACS mRNA转染试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)，在渐增量的B18R或SOCS1 mRNA存在下，用体外转录的GFP转染人新生儿包皮成纤维细胞(BJ)。转染后4小时更换培养基。对于对照，在不加入SOCS1或B18R mRNA并且存在或不存在B18R蛋白(eBioscience)的情况下转染GFP mRNA。
每天转染成纤维细胞3天。在第4天，对单细胞悬浮液进行流式细胞术分析，测定细胞活力(使用碘化丙锭)、GFP表达水平(FITC-平均值)和阳性细胞％(对碘化丙啶阴性细胞设门限(gated on))。
单独用GFP mRNA每日转染导致低GFP表达水平，其可以在SOCS1 mRNA存在下显著增加，但在B18R mRNA存在下不是，虽然存在B18R蛋白(图1)。与用GFP和B18R mRNA共转染并且与仅用GFP mRNA转染的细胞相当的细胞相比，用GFP和SOCS1 mRNA共转染的细胞的MFI更高。只有在B18R蛋白存在下，该MFI与用GFP mRNA转染3次的细胞的MFI接近。
该实验表明，尽管B18R蛋白具有抗病毒活性，但B18R mRNA不能拯救细胞免于先天免疫的激活。先天免疫应答的诱导导致GFP表达水平降低。SOCS1 mRNA能够显著增加GFP表达水平。
实施例2：使用SOCS1 mRNA将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞
将人新生儿包皮成纤维细胞(BJ)以不同的细胞密度接种，并使用含有Oct4：Sox2：Klf：Lin28：c-Myc：Nanog：核eGFP(所有mRNA含有>2000nt的聚A尾)的mRNA混合物转染。使用缩短的重编程方案转染细胞，每天2次转染(6小时间隔)连续5天。在转染前立即更换培养基。在一种情况下，培养基补充有如公布方案中使用的B18R蛋白(200ng/ml)，在另一种条件下，将含有>2000nt的聚A尾的SOCS1 mRNA加入到mRNA的混合物中并同时转染。通过使用作为多能性标志物的Oct3/4对iPSC集落进行细胞内染色，在d14(第一次转染后13天)鉴定产生的iPSC。与使用B18R蛋白相比，在用SOCS1 mRNA转染的细胞的情况下，产生的iPSC的数量和大小更高(参见图2)。
实施例3：使用未修饰的或25％修饰的mRNA将成纤维细胞重编程为诱导多能干细 胞
将人新生儿包皮成纤维细胞接种在Matrigel涂覆的平板上，并用含有聚A尾>2000nt的修饰mRNA(用于体外转录以产生RNA的75％尿苷和25％假尿苷，75％胞苷和25％5-甲基胞苷)或未修饰的mRNA的mRNA混合物转染。两种混合物都含有SOCS1 mRNA。使用新开发的方案产生iPSC集落，每天两次转染5天，每次转染前更换培养基。可以在d10检测到第一集落并在d14染色(第一次转染后13天)。使用Oct3/4作为多能性标志物，通过细胞内染色鉴定集落。
当使用未修饰的mRNA时，iPSC产生效率显著增强(参见图3)。
实施例4：聚(A)长度对重编程效率的影响
将人新生儿包皮成纤维细胞接种在Matrigel涂覆的平板上，并用含有聚(A)尾短于2000nt或长于2000nt的25％修饰mRNA(用于体外转录以产生RNA的75％尿苷和25％假尿苷，75％胞苷和25％5-甲基胞苷)的mRNA混合物转染。向含有重编程因子的mRNA的所有混合物中加入SOCS1 mRNA。使用新开发的方案产生iPSC集落，每天两次转染5天，每次转染前更换培养基。可以在d10检测到第一集落并在d14染色(第一次转染后13天)。使用Oct3/4作为多能性标记物，通过细胞内染色鉴定集落。当转染进行十次时，只有含有聚(A)>2000nt的两种mRNA(重编程因子和SOCS1 mRNA)的混合物产生iPSC集落(参见图4)。
实施例5：聚(A)长度对GFP表达的影响
将HeLa细胞接种并使用TransIT转染试剂(Lifetechnologies)用含有短聚(A)尾(<500nt)或长聚(A)尾(>500nt)的GFP mRNA转染。将细胞培养24小时并收获用于使用流式细胞术评估定量。用具有长聚(A)尾的GFP mRNA转染产生更高百分比的转导细胞和更高的GFP表达水平，如更高的平均荧光指数(MFI)所示(参见图5)。
实施例6：SOCS1 mRNA对eGFP质粒DNA电穿孔到T细胞中之后的细胞活力和转染率 的影响
使用人pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从外周血单核细胞(PBMC)分离人T细胞。将分离的T细胞在0.5ml TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)中以1.9×106个细胞接种于48孔板中，所述培养基补充有Proleukin S(Il2)，终浓度为20ng/ml(ED50为≤0.3ng/mL*对应于≥3.0×106IU/mg(用NIBSC 86/504校准)或≥1×107IU/mg(用校准)的比活)和青霉素-链霉素，终浓度为50至100I.U./ml青霉素和50至100μg/ml链霉素，并在37℃和5％CO2下培养。
在电穿孔前3天，使用GMP TransAct CD3/CD28试剂盒(MiltenyiBiotec)以1:200(MACS GMP TransAct CD3试剂)和1:400(MACS GMP TransAct CD28试剂)的推荐滴度活化T细胞。在37℃和5％CO2下培养3天后，收获T细胞并以300×g离心10分钟。将细胞重悬于PBS中，并再次以300×g离心。将细胞以107细胞/ml重悬于100μl缓冲液M(5mMKCl；15mM MgCl2；120mM Na2HPO4/NaH2PO4pH 7.2；50mM Manitol)中。将细胞悬浮液与2μgeGFP编码质粒混合，不含(对照)或与0.5μg Socs1 mRNA混合，所述Socs1 mRNA包含分别为约1400个核苷酸长度或约4800个核苷酸长度的聚A尾，并立即转移至电穿孔杯中。SOCS1mRNA仅包含未修饰的核苷酸，即腺苷，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶。
使用程序T-023在Nucleofector装置(Lonza)上电穿孔T细胞。电穿孔后，立即将细胞转移到含有0.5ml TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)的48孔板中，该培养基补充有Proleukin S(Il2)，终浓度为20ng/ml(ED50为≤0.3ng/mL*对应于≥3.0×106IU/mg(用NIBSC 86/504校准)或≥1×107IU/mg(用校准)的比活)和青霉素-链霉素，终浓度为50至100I.U./ml青霉素和50至100μg/ml链霉素，并在37℃和5％CO2下培养2天。收获T细胞并以300×g离心10分钟。对于流式细胞术分析，将细胞重悬于40μl PEB(含有EDTA的磷酸盐缓冲盐水)、20μl FCR-Block和50μl抗体染色混合物(CD4-VioBlue，CD8-VioGreen，CD25-PE，CD69-APC，CD3-APC07)中。在4℃在黑暗中温育10分钟后，将细胞以300×g离心10分钟并重悬于0.5ml PEB中。在流式细胞术分析之前立即加入终浓度为1μg/ml的碘化丙啶。在MACS quant流式细胞仪上分析25μl细胞悬浮液。
根据碘化丙锭染色测定T细胞活力，并通过APC通道中的荧光检测监测eGFP表达。没有SOCS1 mRNA的eGFP质粒的对照电穿孔(图6A)产生58％的活细胞，并且55％的活细胞是eGFP阳性。通过eGFP质粒和包含约1400个核苷酸的聚A的SOCS1 mRNA的共电穿孔，68％的细胞是活的，并且51％的活细胞是eGFP阳性(图6B)。令人惊讶的是，通过共电穿孔eGFP质粒和包含约4800个核苷酸聚A的SOCS1 mRNA，细胞活力增加至70％，并且活细胞内eGFP阳性细胞的比例增加至61％(图6c)。
显然，在各自mRNA的电穿孔后SOCS1表达增强了用质粒DNA电穿孔的T细胞的存活。此外，用于电穿孔的SOCS1 mRNA的更长聚A尾增强了转染率，即表达感兴趣的基因的细胞的比例。

Claims (15)

1.编码SOCS1的核酸用于增强将至少一种感兴趣的核酸引入细胞的效率的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述感兴趣的核酸是DNA。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述编码SOCS1的核酸是mRNA并且在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾。
4.一种用至少一种感兴趣的核酸重复转染细胞的方法，其包括向所述细胞中加入以下的步骤
a)编码SOCS1的核酸；并且同时或随后
b)编码至少一种感兴趣的多肽的至少一种感兴趣的核酸；
其中至少步骤b)重复至少一次。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸是mRNA，其中每种所述mRNA在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾。
6.根据权利要求5所述的方法，其中至少步骤b)重复至少三次，并且其中所述聚(A)尾包含至少2000个腺嘌呤。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中在每种所述mRNA中，0％至50％的核碱基尿嘧啶和/或胞嘧啶是修饰的核碱基。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中每种所述mRNA是未修饰的mRNA。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述至少步骤b)的一次重复的时间为4小时至48小时。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
11.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种感兴趣的核酸编码重编程因子。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种感兴趣的核酸编码用于将体细胞转分化为不同细胞类型的分化因子。
14.一种用至少一种感兴趣的核酸电穿孔细胞的方法，其包括向所述细胞中加入以下的步骤
a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后
b)所述至少一种感兴趣的核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸是mRNA，其中每种所述mRNA在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3241905A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-08 Miltenyi Biotec GmbH Method for introducing nucleic acids into a cell

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381742A (zh) * 2008-10-23 2009-03-11 浙江理工大学 晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用
CN101406702A (zh) * 2008-11-25 2009-04-15 中国人民解放军第二军医大学 利用socs1干扰技术增强核酸疫苗免疫活性的方法
US20100273220A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
WO2013003475A1 (en) * 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
CN103502436A (zh) * 2011-03-07 2014-01-08 麻省理工学院 用核酸转染细胞的方法
US20140056939A1 (en) * 2007-09-14 2014-02-27 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and its use in vaccination
CN105940110A (zh) * 2014-01-31 2016-09-14 菲克特生物科学股份有限公司 用于核酸产生和递送的方法和产品
CA3023312A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Miltenyi Biotec Gmbh Method for introducing nucleic acids into a cell

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9012219B2 (en) * 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
DK2520643T3 (da) 2007-12-07 2020-01-20 Miltenyi Biotec Bv & Co Kg Prøvebehandlingssystemer og -fremgangsmåder

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140056939A1 (en) * 2007-09-14 2014-02-27 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and its use in vaccination
CN101381742A (zh) * 2008-10-23 2009-03-11 浙江理工大学 晚期启动子靶向性调控溶瘤腺病毒pCN305载体及其构建方法与应用
CN101406702A (zh) * 2008-11-25 2009-04-15 中国人民解放军第二军医大学 利用socs1干扰技术增强核酸疫苗免疫活性的方法
US20100273220A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
CN103502436A (zh) * 2011-03-07 2014-01-08 麻省理工学院 用核酸转染细胞的方法
WO2013003475A1 (en) * 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
CN105940110A (zh) * 2014-01-31 2016-09-14 菲克特生物科学股份有限公司 用于核酸产生和递送的方法和产品
CA3023312A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Miltenyi Biotec Gmbh Method for introducing nucleic acids into a cell

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FATEMEH MOMEN-HERAVI 等: "Exosome-mediated delivery of functionally active miRNA-155 inhibitor to macrophages", 《NANOMEDICINE》 *
JENNIFER E FENNER 等: "Suppressor of cytokine signaling 1 regulates the immune response to infection by a unique inhibition of type I interferon activity", 《NAT IMMUNOL》 *
MATTHEW ANGLE 等: "Innate Immune Suppression Enables Frequent Transfection with RNA Encoding Reprogramming Proteins", 《PLOS ONE》 *
于鸿 等: "SOCS1-siRNA沉默SOCS1基因表达对脐血树突状细胞生物学活性的影响", 《中国实验诊断学》 *
林贞花 主编: "《分子病理生物学实验技术指南》", 31 May 2005 *
程中乐 等: "SOCS1对α干扰素调节乙肝病毒复制作用的影响", 《安徽医科大学学报》 *

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