JPH0459735A - ヘモグロビン含有リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　産業上の利用分野 本発明は、新規なヘモグロビン含有リポソームに関する
。

本発明のヘモグロビン含有リポソームは、緊急時の代用
血液移植臓器の保存液、微小循環系への酸素運搬液、血
液ガス分析等の標準液等として使用される。

（２）従来の技術 血液の代用と成り得る薬剤、いわゆる人工血液の研究開
発は５０年以上の歴史を持ち、その間、ゼラチン分解産
物の溶液・デキストラン溶液等の血漿増量剤が代用血液
（代用血漿）として利用されてきた。しかし、これらの
代用血液は、大量出血等の緊急時に血管内の血漿量を補
充し、循環動態を維持する目的で開発された製剤で、血
液の多種多様な特性と機能を代替することはできない。

近年、こうした血漿増量剤とは異なり、酸素運搬能を保
持する人工血液（人工赤血球）の研究開発が進められて
いる。これらは、大別するとフッ化炭素エマルジョン（
ｐｅｒｆ’１ｕｏｒｏｃｈｅ１ｃａｌ　：　Ｐ　Ｆ　Ｃ
〔通称：　ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ）　）を素材とし
た化学合成品と、天然ヘモグロビンもしくはその誘導体
を素材とした半合成品とに分類される。前者のＰＦＣ製
剤は、炭化水素の水素原子をフッ素原子で置き換えた物
質で、酸素分圧に比例した大きな酸素溶解能力（水の約
２０倍）を持つが酸素運搬機構は水中ニ分散したＰＦＣ
エマルジョンへの酸素の物理的溶解に過ぎず、十分量の
酸素を溶解させるためには吸入酸素濃度を高く維持する
必要かあり、高濃度酸素障害の危険性も危惧される。ま
た、脂溶性の化学合成品でもあるため輸注後の体内蓄積
性等の問題点も指摘されている。

一方、酸素運搬能を持った人工血液として赤血球膜成分
を除去した天然ヘモグロビンを利用てきないかという考
えか古くから有り、いくつかの実験報告もある。しかし
、ヘモグロビンを静脈内に注入すると一部はｈａｐｔｇ
ｌｏｂｉｎやａｌｂｕｍｉｎと結合して存在するが、大
部分は遊離の状態で速やかに腎から排泄され、肝その他
の細網内皮系においても捕獲・代謝されるため急速に体
循環血中から消失する（４時間以内）。また、正常赤血
球中に比較して遊離のヘモグロビンは酸素親和性が増加
する傾向にあり、末梢組織での酸素放出能の低下、血管
外漏出ヘモグロビンに起因した腎肝障害の可能性といっ
た問題点も指摘されている。しかし、ヘモグロビンの酸
素解離曲線はＳ字状を呈しており、ＰＦＣ製剤のような
酸素分子の物理的溶解とは異なる特性を持つ。最近、こ
うしたヘモグロビン水溶液の低い酸素運搬能と短い生体
内半減期を改善した修飾ヘモグロビン（安定化ヘモグロ
ビン・重合ヘモグロビン）やマイクロカプセル化（リポ
ソーム化等）ヘモグロビン、あるいは新規のキレート化
合物を人工血液として用いる開発検討が中心と成りつつ
ある。

（３）発明が解決しようとする課題 前述したヘモグロビンを基調とする人工赤血球の酸素運
搬機能はヘモグロビンと酸素分子との可逆的結合により
生じ、ヘム鉄（プロトヘム■）の原子価が２価の状態（
Ｆｅ２”）でのみ保たれる機能テする。一方、ヘモグロ
ビンはその可逆的酸素化（Ｏｘｙｇｅｎａｔ　１ｏｎ）
の過程で徐々に酸化（Ｏｘ　１ｄａｔ　ｉ　ｏｎ）され
酸素結合能を持たない３価のメトヘモグロビン（Ｆｅ３
＋）に変化する。このため正常赤血球は、種々の酸化的
ストレスに対し、ヘモグロビンが酸化されるのを抑制す
る機構（ラジカルスカベンジャー等）と生成したメトヘ
モグロビンを還元し、もとの生理機能を有するヘモグロ
ビンに戻す修復機構（ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ−メトヘモグロ
ビン還元酵素系等）とか共存し“ｏｘｙｇｃｎａｔ　１
ｏｎ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”のサ
イクルを繰り返しながら酸素運搬体としての機能をダイ
ナミ・ンクに発現しているものと解釈される。

しかし、こうした天然赤血球の持つ酸化的ストレスに対
する抵抗性は、溶血により極端に低下し、ヘモグロビン
水溶液においては前述の酸化抑制機構は消失しており、
４℃保存状態下においてもメトヘモグロビンの占める割
合いは経時的に増加する。このため、天然ヘモグロビン
ならびにその誘導体を医薬品や試薬として使用する場合
には、通常、メト化抑制剤（酸化防止剤もしくは安定化
剤）を添加する必要がある。酸化防止剤として、例えば
、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一
鉄、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム等の物質が知ら
れている。これらの抗酸化作用は確実ではあるが、生体
に対して有害となる。特に臨床においては時に数千ＣＣ
にもおよぶ大量輸血も行われることもあり、代用血液へ
の適用には好ましくない。

還元型グルタチオンやアスコルビン酸等は、生体内でメ
ト化抑制物質として機能することが知られているが、こ
れらのメト化抑制には他の赤血球成分が関与しており、
単独でヘモグロビン水溶液に添加しても十分な効果を得
ることはできない。

特に好気的実験条件下（大気中３７℃）でヘモグロビン
とアスコルビン酸とを共存させた場合、急速なヘモグロ
ビン変性（緑色沈澱物ｅｔｃ、）を生ずる。

また、還元型グルタチオンに関しても前述と同様の条件
下で添加量に依存したメト化抑制効果は得られず、有効
性・安定性等の観９点からいずれもヘモグロビンのメト
化抑制剤として不十分であった。

また、トコフェロール（ビタミンＥ）類は古くから非特
異的抗酸化作用を持ち、生体膜脂質の抗酸化が第一義的
作用であろうと言われ、食品中の不飽和脂肪酸やビタミ
ンＡ・カロチン等の医薬品に酸化防止剤として用いられ
ている。実際、不飽和脂質系リポソームの過酸化な、ら
びに過酸化反応に起因する蛋白質変性を効率良く抑制す
ることができるか、トコフェロール自体は脂溶性物質で
あるため、リポソーム内水相で進行するヘモグロビンの
自動酸化や活性酸素ラジカルによるメト化を十分に抑制
することはできない。

トコフェロールと同様に生体認容性に優れ、輸液剤とし
ても広く使用されている糖類・アミノ酸類もヘモグロビ
ンのメト化抑制作用を持つことが知られている（特公昭
６１−１８２０号公報）。しかし、還元性基を有するグ
ルコース等はヘモグロビンと非酵素的に結合してグルコ
ヘモグロビンを生成し、また、前述の特公昭６１−１６
２０号公報にも記載されているように、十分なメト化抑
制効果を得るためには生体の血糖値に比較して高濃度に
添加する必要がある等、必ずしも生理的であるとは言い
難い。

さらに、従来公知のメト化抑制剤の効果は、ある種の環
境下で生成する反応性の高い活性酸素ラジカル等を消去
することにより得られる予防的抗酸化作用である。した
がって、既に生成したメトヘモグロビン濃度を減少させ
る効果は通常期待できない。

本発明の目的は、種々の環境下で生成するメトヘモグロ
ビンをもとの酸素運搬能を有するヘモグロビンに還元し
、結果として酸化安定性を改善した人工赤血球懸濁液を
提供することにある。

（４）　　課題を解決するための手段 本発明によれば、ヘモグロビン、電子供与体および該電
子供与体から電子を受け取ってメトヘモグロビンをヘモ
グロビンに還元する作用を有する電子伝達体を含む水溶
液を、脂質２分子膜からなるリポソームの内部に封入し
てなるヘモグロビン含有リポソームであって、前記電子
伝達体の前記水溶液中の濃度が０．ＩＸ　１０”〜１μ
Ｍであることを特徴とするヘモグロビン含有リポソーム
が提供される。

リポソーム内部に封入される電子供与体は、ピリジンヌ
クレオチド補酵素類、特にβ−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドおよびβ−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートもしくはこれらの誘導体が好ま
しい。電子供与体のヘモグロビンに対する添加量比は０
．５〜１０　（Ｊ量モル比）が良好な効果を与える。上
記電子供与体から電子を受け取ってメトヘモグロビンを
ヘモグロビンに還元する作用を有する電子伝達体は、メ
チレンブルーが好ましい。電子伝達体の使用量は、前記
水溶液における濃度として、０．１×１０　　〜１μＭ
、好ましくは０．Ｉ　Ｘ　１０”〜０．１μＭである。

前記ヘモグロビン等を含む水溶液はさらに有機リン酸も
しくは、縮合リン酸を含有することもできる。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明のヘモグロビン含有リポソームは酸素運搬体とし
てのヘモグロビンとメトヘモグロビン還元に必要な１種
類以上の電子供与体ならびに電子伝達体を含有する。本
水溶液の主要成分は天然赤血球由来のヘモグロビンであ
り、他の構成成分として、ヘモグロビンの経時的酸化に
よって生成するメトヘモグロビンをヘモグロビンに還元
するための電子供与体ならびに電子伝達体を添加する。

また、ヘモグロビンの酸素運搬能調整を目的として、イ
ノシトールリン酸、ピリドキサールリン酸、アデニンリ
ン酸等の公知の有機リン酸化合物もしくは縮合リン酸化
合物を含んでいてもよい。

ヘモグロビンは原料用血液として正常人赤血球もしくは
期限切れ濃厚赤血球製剤等を用い、すでにストローマ・
フリー・ヘモグロビン（ＳｔｒｏｍａＦｒｅｅ　ＨｅＩ
ｌｌｏｇｌｏｂｉｎ）の調製法として公知の方法を利用
して調製される。以下、各工程の概略を説明する。

■全血の採取 ■全血は、連続遠心機により血漿、白血球・血小板等を
除去し、さらに生理食塩水を用いて遠心洗浄を連続的に
行ない粗洗浄赤血球とする。

■粗洗浄赤血球は引き続き血漿分離器（例えば、孔径０
．４！＋ｕｎのセルロースアセテート膜）により、生理
食塩水を用いて縁り返し洗浄し、血漿・白血球・血小板
等を完全に除去した洗浄赤血球を得る。

■得られた洗浄赤血球に過剰ｊｉ（およそ２〜３倍の容
量）の蒸留水もしくは低張溶液を添加して、赤血球溶血
液とする。

■赤血球溶血液は、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ
７，４に調整した後、連続遠心処理を行ってストローマ
等を除去したヘモグロビン水溶液を回収する。

■このヘモグロビン水溶液は、前述の血漿分離器さらに
血漿成分分離器（例えば、孔径０１即のセルロースアセ
テート膜）を連続的に通過すせて、遠心処理により除去
しきれなかった赤血球膜成分の除去と溶血液の無菌化を
行う。

■上記の操作により得られた溶血液は、低分子量物質（
分画分子量＋　５０，０００以下）の除去ならびに水素
イオン濃度（ｐＨ−７〜８）および電解質濃度の至適化
を目的とした透析処理を行った後、ヘモグロビン濃度が
およそ４０〜５０ｇ／ｄＲの範囲内に成るように限外濾
過を用いて濃縮する。

本発明に使用するヘモグロビン水溶液は、上述の工程で
得られたヘモグロビン分画あるいは限外濾過・カラムク
ロマトグラフィー・塩析等、生化学分野で一般に使用さ
れる公知の方法を用いてさらに精製したヘモグロビン分
画水溶液に１種類以上の電子供与体ならびに電子伝達体
を添加して調製される。また、精製したヘモグロビン分
画中に天然赤血球由来のチトクロームｂ５、ＮＡＤＨチ
トクロームｂ５還元酵素、ＮＡＤＰＨ−フラビン還元酵
素ならびに活性酸素除去に関与するカタラーゼ、スーパ
ーオキシドジスムターゼ、グルタチオンパーオキンダー
ゼ等の物質等を混在させることもてきる。

前記低張緩衝液としては、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩
衝液、ＴＥＳ緩衝液等を用いることができる。

電子供与体としては、ピリジンヌクレオチド補酵素類、
特に好ましくはβ−（還元型）ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドおよびβ−（還元型）ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート、もしくはこれらの
誘導体として知られている３−アセチルピリジンアデニ
ンジヌクレオチド（３−アセチルピリジン−ＤＰＮ）、
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＤＰ
Ｎ）　、３−ピリジンアルデヒドＤＰＮ、ニコチンアミ
ドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノ−ＤＰＮ）
７；、を挙げることかできる。

本発明の目的であるメト化抑制効果を効率良く発現させ
るためには、電子供与体はいずれも還元型として溶液中
に存在する必要がある。そのため、これらの電子供与体
添加は、ヘモグロビン水溶液の最終調製工程（リポソー
ム化直前等）もしくは用時調製とすることが好ましいか
、目的によっては調製初期の段階で添加することもでき
る。この場合には添加後の透析・限外濾過による損失を
考慮し、透析液に同濃度の電子供与体を添加する等の適
当な対応を講する必要がある。

電子供与体の還元型と酸化型の存在比率は溶液の水素イ
オン濃度と密接に関連し、天然赤血球の構成成分てもあ
る還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ートについては、弱アルカリ性条件下（ｐｌ＋−８〜９
）で最も安定と成り、ヘモグロビンの自動酸化速度もｐ
Ｈの上昇と共に減少する。こうした観点から調製の各工
程におけるヘモグロビン水溶液のｐＨは若干高い値に維
持することが好ましい。一方、基本的機能であるヘモグ
ロビン酸素運搬能（酸素放出能）については、ｐＨの増
加に伴い低下する傾向にある。以上の点を考慮すると、
最終調製ロットにおける本溶液のｐＨは７〜８の範囲内
に調整することが好ましい。

ピリジンヌクレオチド類の添加量は、使用する個々の物
質ならびに目的とする効果の持続時間等により若干異な
るが、通常ヘモグロビンに対する重量モル比としては、
およそ０．５〜１０、特に医薬品として大量に調製する
場合には価格等も考慮し、ヘモグロビンに対する重量モ
ル比としては、およそ０．５〜３の範囲内での添加が推
奨できる。

ヘモグロビン水溶液に添加する電子伝達体としては、メ
チレンブルーをあげることができる。ヘモグロビン水溶
液への添加は、電子供与体添加直後が最も効率的である
が、目的により添加時期を遅らせることもできる。例え
ば、上述の電子供与体を添加したヘモグロビン水溶液を
リポソーム化する直前に添加することも可能である。し
かし、当該物質は、電子供与体か存在しない好気的環境
下でヘモグロビンの酸化速度を顕著に増大する。

したがって、この点を考慮して電子供与体と共存状態と
成るように電子伝達体を添加する必要がある。

ヘモグロビン水溶液中の電子伝達体の濃度は（リポソー
ム内水相に封入されるＨｂ水溶液中の濃度に等しい）は
、通常０．ＩＸ　１０”〜１μＭ、より好ましくは０．
ｌＸｌ０”〜ｏ、ｉμＭである。

すなわち電子伝達体は、ピリジンヌクレオチド類と異な
り、ヘモグロビンに与える影響が複雑で濃度変化に対す
る反応性も高く、過剰量の添加はヘモグロビンの酸化・
変性を引き起こす。このため可能な限り添加量を減少さ
せる必要があり、電子伝達体の濃度は通常１．０μＭ以
下に維持する必要がある。特に、本実施例に記載したよ
うな人工酸素運搬体を目的とする場合、電子伝達体濃度
は、０．３μＭ以下に維持することが好ましい。

また、ヘモグロビン水溶液中でのメトヘモグロビン生成
を充分に抑制するために、電子伝達体の濃度は、Ｉ　Ｘ
　１０”μＭ以上であることが好ましい。なお、従来よ
りメトヘモグロビン血症の治療を目的としてメチレンブ
ルー等の電子伝達体を生体内に投与することが行われて
いるがこの方法においては、血液中における拡散・希釈
を考慮して比較的高濃度の電子伝達体を投与しなければ
ならす、安全性が十分であるとはいえず、しかも局所的
に作用させることが難かしいという欠点があった。これ
に対し、本発明におけるヘモグロビン含有リポソームは
リポソーム内にヘモグロビン、電子供与体および電子伝
達体が封入されてなるので電子伝達体の濃度を上述のよ
うな比較的低濃度に設定しても、メトヘモグロビンの生
成を効率よく抑制する作用を有する点で、従来の方法と
は本質的に区別されるべきものである。

電子供与体（還元型）濃度はメトヘモグロビン還元に伴
って低下（酸化型）するため、ヘモグロビン濃度の増減
に伴いピリジンヌクレオチド類の添加量を調整する必要
があるが、電子伝達体の酸化還元対は、電子供与体（Ｎ
ＡＤ　（Ｐ）Ｈ等）ならびに電子受容体（メトヘモグロ
ビン等）存在下で相互に再生・利用することができる。

このため、電子伝達体添加量は、通常ヘモグロビン濃度
に依存して調整する必要はない。

電子供与体ならびに電子伝達体の添加方法は特に限定さ
れず、ヘモグロビン水溶液中に均等に混和できる方法で
あれば、試薬形態（結晶・凍結乾燥品・水溶液等）も０
由に選択することができるが、ヘモグロビンの酸化防止
という観点から４℃以下の低温に維持することが好まし
い。また、同様の目的で従来公知の予防的酸化剤もしく
は安定化剤をヘモグロビン水溶液中に混在させることも
可能である。

ヘモグロビン水溶液には、さらに有機リン酸化合物およ
び／又は縮合リン酸塩を添加しておいてもよい。その代
表例としては、イノシトールヘキサリン酸、ピリドキサ
ールリン酸、グルコース−６−リン酸、アデニントリホ
スフェート、アデニンジホスフェート、グルコース−１
，６−ジリン酸および縮合リン酸塩などを挙げることが
でき、これらをくみあわせて用いることもできる。これ
らはヘモグロビンのアロステリック因子としてヘモグロ
ビンと酸素との親和性を変化させて、末梢組織への酸素
運搬能を増加させる機能を持つ。

次に上述したヘモグロビン等を含有する水溶液を内部液
として用いたリポソームの調製法を説明する。

人工細胞・ドラッグデリバリ−システム（Ｄ、Ｄ、Ｓ、
　）として使用されるリポソームは、形態的に見て３種
類に大別される。脂質膜が幾重にも袋状に成った多重層
リポソーム（ＭＬＶ：ｍｕｌｔｉ−１ａｓｅｌｌａｒ　
ｖｅｓｉｃｌｅ、　ｏｒ　１１ｐｏｓｏｍｅ）−枚の脂
質膜に囲まれ、粒径の小さい小単層リポソーム（Ｓ　Ｕ
　Ｖ　：　ｓｍａｌｌ　ｕｎｉ刊ａｍｅｌｌａｒ　ｖｅ
ｓｊｃｌｅ、　ｏｒＩ　ｌ　ｐｏｓｏ■ｅ）粒径の大き
い大単層リポソーム（Ｌ　Ｕ　Ｖ　：　ｌａｒｇｅ　ｕ
ｎｉ−１ａｓｅｌｌａｒ　ｖｅｓｊｃｌｅ、　ｏｒｌ　
１　ｐｏｓｏａｅ）の３種である。通常、直径０，４−
以下の小単層リポソームが最も適しているが、現時点に
おける技術的制約により、数層（３〜４層程度）の脂質
膜から成る多重層リポソームも含まれる。

リポソームを構成する脂質としては、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイ
ノシトール（ＰＩ）、ガングリオシド（Ｇ）、カルシオ
リピン（ＣＬ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスフ
ァチジルグリセロール（ＰＧ）およびこれらを常法にし
たかって水素添加した物が挙げられる。

上述の脂質成分は、水中で熱力学的に安定なミセルを形
成させるために不可欠な成分てあり、これらの脂質を組
み合わせて使用することもできる。

また、これらの脂質以外にコレステロール（Ｃｈｏｌ）
、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ステアリルアミン
（ＳＡ）等が添加されることもある。コレステロールは
リポソームの形成−膜の安定化を目的として通常添加さ
れるほかに、リポソーム膜の透過性を調節するためにも
使用できる。

同様に、ジセチルホスフェート・ホスファチジン酸（負
荷電）、ステアリルアミン（正荷電）等の電荷付与物質
についても、リポソームの生体内挙動の調節に使用でき
るが、これらはすべてのリポソーム形成に不可欠という
ものではない。

一方、リポソームの形成とは異なる観点から、トコフェ
ロール同族体も添加される。前述したようにトコフェロ
ール（ビタミンＥ）は、非特異的な抗酸化作用を持つ生
体成分て古くから食品類・医薬品類の酸化防止剤として
使用されてきたか、本発明においても酸化防止剤として
、リポソーム膜あるいはヘモグロビンの安定性に寄与す
る。特に、不飽和脂質を含有するリポソームでは、重要
な構成成分と成る。

リポソーム化製剤の調製にあたっては種々の方法が知ら
れており、特に調製方法を限定する必要はないが、リポ
ソームに封入するヘモグロビンは、温度・光・水素イオ
ン・金属イオン（Ｃｕ　２”）溶存ガス等により容易に
酸化・変性することとなる。したがって、この点を考慮
して、すでにり、　Ｄ、　　Ｓ、等の分野で公知の方法
から調製法を選択する必要がある。

例えば、ガラスピーズ撹、拌法、界面活性剤除去法、フ
レンチプレス法、カルシウムイオン融合法、バールポン
ピング法、ワーリングブレンダー（高速撹拌）法、脱水
−再水和法、凍結−融解法等を用いることかできる。

かくして得られるリポソームは、ヘモグロビン、電子供
与体および電子伝達体を含む水溶液を内包しており、人
工赤血球として優れた機能を有する。

本発明においては、上記人工赤血球を生理的電解質液に
懸濁させる。生理的電解質液としては、輸液等に通常使
用されているもの例えば生理食塩水が使用される。懸濁
液中のヘモグロビン濃度は、５　（ｖ／ｖ）％〜１５（
ｖ／ν）％が適当である。

（５）作　用 本発明のヘモグロビン水溶液は天然赤血球由来のヘモグ
ロビンもしくはこれらを基調とするヘモグロビン誘導体
に、少なくとも１種の電子供与体ならびに電子伝達体を
添加して調製される。当該溶液の調製過程で添加した還
元型ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは電子供与体としての機能を持ち
、同じく調製過程で添加したメチレンブルー等の外因性
電子伝達体を担体としてメトヘモグロビンを還元する。

このため、ヘモグロビンの酸化により生じ、生体内で酸
素運搬能を低下させる要因となるメトヘモグロビン濃度
を抑制し、結果的に酸素運搬能を安定化する作用を示す
。また、このヘモグロビン水溶液のリポソーム化は、脂
質２分子膜を疎水性バリアーとしてヘモグロビンの保護
および内部環境を維持する作用を有する。

（６）実施例 以下、本発明の実施例に基づいて具体的に説明する。

なお、特に明示しない場合、調製の各工程は冷蔵状態（
＋４℃）に維持し、無菌的環境下で実施した。また、試
薬・器具類は滅菌処理を行い、重金属イオン、無機イオ
ン等の残留の無い無菌超純水（１５ｓｅｇΩ”Ｃ−ｃｍ
２５℃ｍ２５℃以上口ジエンフリー〕）を調製に使用し
た。

〔実施例−１／ヘモグロビン水溶液の調製〕■　ヘモグ
ロビンの抽出・精製 輸血期限切れ濃厚赤血球１５Ｎ　（２００ｍｌ　Ｘ　７
５ｂａｇｓ）を連続遠心機を用いて生理食塩水で洗浄し
、混在する血小板・白血球等の血漿成分を除去した粗洗
浄赤血球を得た。さらに、孔径０．４５ｔｍの血漿分離
器を用いて生理食塩水洗浄を行い、この洗浄赤血球５ｇ
に対して低張リン酸緩衝液（ｉｏ＋ａＭ、　ｐｎ−７，
４）をＩＯＮ添加して溶血させた。孔径０．４５扉の血
漿分離器および孔径０．１ｍの血漿成分分離器を用いて
赤血球膜成分の除去ならびに無菌濾過を行い、ヘモグロ
ビン濃度８　（ｖ／ｖ）％の赤血球膜除去ヘモグロビン
水溶成約１２Ｎを回収した。

得られた水溶液をホローファイバー型ダイアライザーを
用いて１０ｍＭ　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（ｐＨ−７
，４）に対して透析を行った後、限外濾過により濃縮し
、ヘモグロビン濃度５０（ｙ／ｖ）％の赤血球膜除去ヘ
モグロビン水溶成約１．８１を調製した。

■試薬撚−加 上述の工程を経て調製したヘモグロビン水溶液５０ｍ１
にヘモグロビンに対する重量モル比（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−
Ｎ　ａ　２　／　Ｈｂ）で２倍量相当の還元型β−Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｈ−Ｎ　ａ　２　　（Ｂ　Ｍ　Ｙ　９ｇｒａｄ
ｃｎ　／　９８％凍結乾燥試薬）を電子供与体として、
また、電子伝達体として最終溶液濃度が０．３ＨＭと成
るようにメチレンブルー（Ｃ１６Ｈ１８Ｃ１１Ｎ３Ｓ・
４ＨＯ）を５ｍｌのＨＥＰＥＳ（ネ）緩衝液（ｌｏｍＭ
。

ｐＨ−７，４）に溶解し、ヘモグロビン水溶液中で均一
に成るように添加・混合した。

（＊）　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　：　２−　　Ｃ４−Ｈｙ
ｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）
）　ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｆｃ　ａｃｉｄ〔実施例
−２／ヘモグロビン水溶液の調製〕■ヘモグロビンの抽
出・精製 ヘモグロビン水溶液の基本的調製方法は、実施例−１の
■に準じて行ったが、赤血球溶血操作は洗浄赤血球に対
して４倍容の１０ｇ＋Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加
して行った。また、ヘモグロビン以外の残存微量成分除
去を目的として、分画分子ａｔｏｏ、ｏｏｏの限外濾過
ならびに超純水に対する透析処理（分画分子量：　５０
．０００）を行った。

■試薬添加 上述の方法で得られたヘモグロビン水溶液５０ｍ１に、
ヘモグロビンと重量モル比が等しく成るように還元型β
−ＮＡＤ　Ｐ　Ｈ−Ｎ　ａ　４　　（ＢＭＹ、９８％凍
結乾燥試薬）ならびにイノシトールヘキサリン酸ナトリ
ウム（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｗ、　Ｃｏ、）および５＋＋
＋Ｍ相当のグルコース−６−リン酸ナトリウム（ＳＩＧ
ＭＡＣｈｃ＋ｍ、　Ｃｏ、）と電子伝達体として０．１
ＨＭに相当するメチレンブルー（Ｃ１６Ｈ１８ＣｇＮ３
Ｓ・４ＨＯ）を５ｍｌのＴＥＳ（零＊）緩衝液（１０ａ
Ｍ、ルア、４）に溶解し、ヘモグロビン水溶液中で均一
に成るように添加・混合した。

（Ｈ）　Ｔ　Ｅ　Ｓ　：　Ｎ　−［Ｔｒｉｓ　（ｈｙｄ
ｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）　　　−２−ａ
ｍｌｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆ’ｏｎｉｃ　　ａｃｉｄ
〔実施例−３／リポソームの調製〕 ■　ヘモグロビン水溶液のリポソーム化水素添加率９０
％の精製飽和ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）　、：ｙ
レスチロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチン酸ナトリウム（
ＭＡ）　、）コフエロール（ＴＯＣ）の均一混合粉末（
日本粘化、ブレソーム／ＥＰＣ：　　Ｃｈｏｌ：ＭＡ　
　：　　ＴＯＣ−７：　　７　　二　２．４：０．２８
　（モル比）＞９．Ｏｇと“実施例−１°もしくは“実
施例−２°で調製したヘモグロビン水溶液５０ｍ１をワ
ーリングブレンダ−（ＷＡＩ？１ＮＧＣＯ，。

Ｂｌｅｎｄｅｒ　７０１０Ｓ）で撹拌混合（４℃、１分
間）、冷却（−２０℃、　１５分間）を繰り返し行った
。

この懸濁液はバール細胞破砕器（ＰＡＲＲＣｏ、）に入
れ、ヘリウムガスで１００ｋｇ／ｃ−に加圧して３０分
間放置後、この圧力を維持した状態でパール細胞破砕器
の細隙ノズルから吐出させてリポソーム化を行った。

■ヘモグロビン封入リポソームの精製 上記の処理により得られた溶液を約１０倍容の生理食塩
水を用いて希釈し、懸濁液とした後、高速遠心機（１７
，０００ｒｐｍｘ　３０ｍ１ｎ　ａｔ４℃）を用いて分
離した。効率良くヘモグロビンを封入しているリポソー
ムはこの遠心処理により沈澱物として回収された。リポ
ソーム化されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料
脂質成分を含む上清はデカンテーションで除去した。以
上の洗浄操作を上清が澄明に成るまで繰り返し行った後
、０．４！ｏｚｍのメンブランフィルタ−を用いて濾過
し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的に
生理食塩水を用いてヘモグロビン濃度か１０％と成るよ
うに調整し、人工赤血球懸濁液、約４０ｍ１を回収した
。

〔実施例−４／リポソーム化製剤の調製〕■　ヘモグロ
ビン水溶液のリポソーム化水素添加率９０％の精製飽和
ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、コレステロール（Ｃ
ｈｏｌ）、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、トコフェ
ロール（ＴＯＣ）の均一混合粉末（日本錆化、プレソー
ム／ＥＰＣ：　Ｃｈｏｌ　　：　ＭＡ　：　ＴＯＣ−７
：　７　：２．４　＋　０．２８　Ｃモル比））９．０
ｇに等量の５１１ＩＭトコフェロールリン酸ナトリウム
水溶液を加えて水和・膨潤処理を行った。この原料脂質
に“実施例−１′もしくは“実施例−２″で調製したヘ
モグロビン水溶液５０ｍ１を添加し、ワーリングブレン
ダ−ｆｆＡＲＩＮＧ　Ｃｏ、、　Ｂｌｅｎｄｅｒ　７０
１０Ｓ）を用いて高速撹拌（４℃、１分間）・冷却（−
２０℃、１５分間）を繰り返し、リポソーム化を行った
。

■　ヘモグロビン封入リポソームの精製上記の処理によ
り得られた溶液を約ｌＯ倍容の生理食塩水を用いて祁釈
し、懸濁液とした後、高速遠心機（１７，０００ｒｐｍ
Ｘ　３０ｎ＋ｉｎ　ａｔ＋　４℃）を用いて分離した。

効率良くヘモグロビンを封入しているリポソームはこの
遠心処理により沈澱物として回収された。リポソーム化
されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料脂質成分
を含む上清はデカンテーションで除去した。以上の洗浄
操作を上清か澄明に成るまで繰り返し行った後、０．４
５１１ｆｎのメンブランフィルタ−を用いて濾過し、懸
濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的に生理食
塩水を用いてヘモグロビン濃度が１０％と成るように調
整し、精製人工赤血球懸濁液、約４（１ｍｌを回収した
。

〔ヘモグロビン経時酸化率の測定〕

ヘモグロビンの経時酸化は３７℃インキュベーション開
始時の可視領域（４８０＋ｖ〜７００１１１１＞におけ
る吸収スペクトル（ｏｘｙ　Ｈｂ）を基点（酸化率−０
％）として、一定時間ごとに吸収スペクトルを測定した
。沖Ｊ定終了後にフェリシアン化カリウムもしくは亜硝
酸ナトリウムを添加し、得られた吸収スペクトル（ｍｅ
ｔ　Ｈｂ）を終点（酸化率−１００％）として、ｏｘｙ
　Ｈｂならびに■ｅｔＨｂの特異吸収帯における各測定
時間までの吸光度変化量からヘモグロビン酸化率を算出
した。

結果を表１および第１図に示す。

／ 分析例　１ メトヘモグロビン（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、）
に還元型ＮＡＤＨを添加した溶液を用いて、メトヘモグ
ロビン還元に与える電子伝達体の効果を検討した。

測定は、５０ｎＭ　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（ｐＨ−
７，４，３７℃）中で好気的状態下、０．０７５ｇ／　
５　ｍｌメトヘモグロビン水溶液をコントロールとして
実施した。

試料として、同濃度メトヘモグロビン水溶液に過剰量の
還元型ＮＡＤＨを添加した４サンプルを調製し、この４
サンプルに対して濃度の異なる電子伝達体を添加し、上
述の可視領域における吸収スペクトル変化を１時間間隔
で測定した。電子伝達体としてメチレンブルーを用いて
得られた典型的スペクトル変化を第２図に示した。第２
図（ａ）はメトヘモグロビン水溶液、第２図（ｂ）は還
元型ＮＡＤＨを添加したメトヘモグロビン水溶液、第２
図（ｃ）は還元型ＮＡＤＨおよび０．３μＭ濃度のメチ
レンブルーを添加したメトヘモグロビン水溶液、第２図
（ｄ）は還元型ＮＡＤＨおよび０．６μＭ濃度のメチレ
ンブルーを添加したメトヘモグロビン水溶液、そして第
２図（Ｃ）は還元型ＮＡＤＨおよび０．９μＭ濃度のメ
チレンブルーを添加したメトヘモグロビン水溶液におけ
るメトヘモグロビンの経時的還元による吸収スペクトル
の変化をそれぞれ示すグラフである。過剰量の還元型Ｎ
ＡＤ）ｌの単独添加では、コントロールと同様、はとん
どメトヘモグロビンの還元は進行していないことがわか
る。一方、電子伝達体を添加したサンプルにおいては、
経時的にメトヘモグロビン還元が進行しオキシヘモグロ
ビンのスペクトルに変化していくことが確認できた。さ
らに、１時間間隔で得られたスペクトル変化量は、電子
伝達体添加量に依存して増大する傾向を示していた。

分析例　２ 試薬類未添加のヘモグロビン水溶液をコントロールとし
て、実施例−１に記載した試薬類添加ヘモグロビン溶液
の３７℃、好気的条件下におけるヘモグロビン経時的酸
化率を比較した。結果を第３図に示す。第３図はヘモグ
ロビンの経時的酸化率（％）を示すグラフである。第３
図において、曲線■はヘモグロビン水溶液、曲線■は還
元型ＮＡＤＨおよび０．３μＮ１のメチレンブルーを添
加したヘモグロビン水溶液、曲線■は還元型ＮＡＤＨ，
０，３μＭのメチレンブルーおよび５ＩＩＩＭグルコー
スー６−リン酸ナトリウムを添加したヘモグロビン水溶
液におけるヘモグロビンの経時的酸化率をそれぞれ示す
。第３図に示したように、グルコース−６−リン酸ナト
リウム併用時においても効率の良いメト化抑制効果が得
られた。

分析例　３ 試薬類未添加のヘモグロビン水溶液をコントロールとし
て、実施例−２に記載した試薬類添加ヘモグロビン水溶
液および実施例１−■で調整したヘモグロビン水溶液に
０．４５μＭに相当するメチレンブルーを添加したヘモ
グロビン水溶液の３７℃、好気的条件下におけるヘモグ
ロビン経時的酸化率を比較した。結果を第４図に示す。

第４図はヘモグロビンの経時的酸化率（％）を示すグラ
フである。第４図において、曲線■はヘモグロビン水溶
液、曲線■、■は還元型ＮＡＤＰＨ，０，３μＭのメチ
レンブルー、イノシトールヘキサリン酸ナトリウムおよ
び５ＩｎＭのグルコース−６−リン酸ナトリウムを添加
したヘモグロビン水溶液を添加したヘモグロビン水溶液
におけるヘモグロビンの経時的酸化率をそれぞれ示す。

第４図に示したように、グルコース−６−リン酸ナトリ
ウムおよびイノシトールヘキサリン酸ナトリウムの併用
時においても効率の良いメト化抑制効果が得られた。

また、メチレンブルー非共存状態下における、メチレン
ブルー単独添加が、ヘモグロビン経時酸化に与える影響
を曲線■として示した。過剰量のメチレンブルー添加に
おいてメトヘモグロビンの生成か惹起されることがわか
る。

分析例　４ 試薬類未添加のヘモグロ、ビン封入リポソーム溶液をコ
ントロールとして、実施例−２および実施例−４に記載
した試薬添加ヘモグロビン封入リポソーム溶液を調製し
、３７℃、好気的条件下におけるヘモグロビン経時的酸
化率を比較した。結果を第５図に示す。第５図はヘモグ
ロビンの経時的酸化率（９６）を示すグラフである。第
５図において曲線■はヘモグロビンのみを含む水溶液を
含有するリポソーム、曲線■は還元型ＮＡＤＰＨ５０，
１μＭのメチレンブルー、グルコース−６−リン酸ナト
リウムおよびイノシトールヘキサリン酸ナトリウムを添
加したヘモグロビン水溶液を含有するリポソームにおけ
るヘモグロビンの経時的酸化率をそれぞれ示す。第５図
に示したように、リポソーム化およびグルコース−６−
リン酸ナトリウムならびにイノシトールヘキサリン酸ナ
トリウム併用時においても効率の良いメト化抑制効果が
得られた。

〔ヘモグロビン水溶液ならびに本発明のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の物性値〕

実施例に記載したヘモグロビン水溶液ならびに本発明の
ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の物理・化学的特長
を表２と表３に示した。

得られたヘモグロビン水溶液のメト化率は、通常３％以
下に維持することか可能であった。また、最終的に得ら
れた個々の人工赤血球は２〜７枚の脂質２分子膜構造を
有する゛−１ル均粒径２１Ｏｒ＋＋ｕの閉鎖小球状形態
を持ち、調製した懸濁液の可視吸光度スペクトルから封
入したヘモグロビン水溶液がリポソーム中においてもオ
キシヘモグロビンの状態を保持し、調製直後のメトヘモ
グロビンの占める割合を５％以下に維持することが可能
であった。

表３　本発明の人土赤血球懸＋４１３液の特性値表　２
　　ヘモグロビン水溶液特性値 （＊）：ヘモグロビン濃度を１５％に調整した人工赤血
球懸濁液中の全脂質濃度（Ｉｎｇ／ｍ１）（７）発明の
効果 天然赤血球の基本的機能である酸素運搬能は、ヘモグロ
ビンが酸素と可逆的に結合することにより生ずる。こう
した結合は、ヘム鉄（プロトヘム■）の原子価か２価の
状態（Ｆｅ’：Ｈｌ））でのみ保たれる機能である。

既に述べたように天然赤血球の酸化的ストレスに対する
高い抵抗性は溶血により極端に低下しており、天然赤血
球から従来公知の方法で調製したヘモグロビン水溶液で
は、メトヘモグロビンの占める割合は冷蔵状態（４℃）
においても次第に増加していく。また、ヘモグロビンの
メト化抑制を目的として従来使用されている抗酸化剤は
、予防的酸化防市剤であり、メトヘモグロビン濃度を経
時的に減少させることはできない。

本発明のヘモグロビン水溶液におけるメト化抑制効果は
、調製過程で外部から添加した電子供与体と人工的電子
伝達体との非酵素的還元によって生ずるため、外的な要
因によって生成したメトヘモグロビンを還元し、酸素運
搬能を保持したヘモグロビンに再生する機能も期待され
る。また、非酵素的還元であるため、冷蔵保存（４℃）
状態下においてもヘモグロビンの経時的酸化を効率良く
抑制することができる。

当該ヘモグロビン水溶液中で進行するメトヘモグロビン
還元は非酵素的反応であるが、電子供与体と電子伝達体
共存下で進行し、通常使用される還元剤に比較して、還
元作用が穏やがである。このため、メトヘモグロビンを
直接還元するようなハイドロサルファイド等の還元剤添
加時に見られるヘモグロビン変性等を生ずることか無い
。実際、ハイドロサルファイド等はメトヘモグロビンを
直接還元することができるという点で優れているか、強
い還元力を持つため、過剰量添加が困難であり、長期間
還元作用を安定に維持することができず、生体に対する
安全性も危惧される。これに対し、本発明の電子供与体
として添加するピリジンヌクレオチド類はメトヘモグロ
ビンを直接還元することはできず、適当な中間電子伝達
体を介して還元が進行し、主に電子供与体の増減は効果
の持続時間、電子伝達体濃度は作用強度に影響を与える
。

このことは、ヘモグロビンの経時酸化に対し、長期間安
定な抑制効果を引き出す上で重要な利点となる。

代用血液等の目的で、前記ヘモグロビン水溶液をリポソ
ーム化することなく、直接血管内に投与した場合、調製
過程で添加した電子供与体ならびに電子伝達体は循環血
流中で速やかに希釈される。

このため、電子受容体であるメトヘモグロビンへの電子
移動が阻害され、効率の良い還元能を維持することが困
難となる。さらに、酸素運搬能に直接関与するヘモグロ
ビンも、循環血流中から急速に代謝・排泄されるため、
代用血液としての有用性は臨床上期待できない。こうし
た生体内投与に伴う問題点を改善する上で、リポソーム
化は有用である。リポソームを構成する脂質２分子膜は
、外部環境からヘモグロビンを保護し、同時に非酵素的
還元に必要な電子供与体ならびに電子伝達体濃度等の反
応至適条件を維持することにより、メトヘモグロビンへ
の電子移動を円滑に行うための内部環境を保持し、結果
としてメトヘモグロビン還元能の安定性ならびに効率を
向上させる効果を持つ。

本発明のヘモグロビン含有リポソームは、メトヘモグロ
ビンの還元に必要な電子供与体ならびに電子伝達体を外
部から添加して調製するため、天然赤血球由来の蛋白質
成分をヘモグロビンのみに限定することができる。この
ため、微量の蛋白質が多成分混在するヘモグロビン溶液
における抗原性および生体投与後の免疫系への影響を緩
和する可能性も期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はヘモグロビンの経時的酸化による吸収伝達体の
効果を示すグラフである。 第３図〜第５図はそれぞれヘモグロビンの経時的酸化率
を示すグラフである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘモグロビン、電子供与体および該電子供与体か
   ら電子を受け取ってメトヘモグロビンをヘモグロビンに
   還元する作用を有する電子伝達体を含む水溶液を、脂質
   ２分子膜からなるリポソームの内部に封入してなるヘモ
   グロビン含有リポソーム。
2. （２）前記電子伝達体の前記水溶液中の濃度が０．１×
   １０＾−＾１＾０〜１μＭであることを特徴とする請求
   項１記載のヘモグロビン含有リポソーム。
3. （３）前記電子供与体がピリジンヌクレオチド補酵素類
   である請求項１または２に記載のヘモグロビン含有リポ
   ソーム。
4. （４）前記ピリジンヌクレオチド補酵素類が、β−ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドおよびβ−ニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドホスフェートもしくはこ
   れらの誘導体からなる群から選ばれた１種類または２種
   類以上の組成物である請求項３記載のヘモグロビン含有
   リポソーム。
5. （５）前記電子伝達体が、メチレンブルーである請求項
   １ないし４のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソ
   ーム。
6. （６）前記電子供与体のヘモグロビンに対する添加率が
   ０．５〜１０（重量モル比）である請求項１ないし５の
   いずれかに記載のヘモグロビン含有リポソーム。
7. （７）前記ヘモグロビン内包リポソームの内部には、さ
   らに有機リン酸および／又は縮合リン酸を封入してなる
   請求項１ないし６のいずれかに記載のヘモグロビン含有
   リポソーム。