JPH1146759A - 細胞培養液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】酸素運搬能、酸素利用効率に優れた細胞培養液
を提供する。 【解決手段】ヘモグロビン及び／又はヘム錯体を酸素運
搬体として含有し、望ましくは前言己ヘモグロビン及び
／又はヘム錯体がポソームに内包されていることを特徴
とする細胞培養液により解決される。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞培養にお
いて培養細胞へ酸素を供給するための酸素運搬体を含有
する動物細胞培養液に関する。 【０００２】 【従来の技術】動物細胞培養において、呼吸を化学量諭
的に考えるとグルコースの完全酸化であるといえる。す
なわち１モルのグルコースを完全酸化するためには、酸
素が６モル必要となる。しかし、酸素の溶解度は、グル
コースの１／６０００にすぎない。このため、酸素供給
は動物細胞の酸素要求量に見合った量だけ連続的に供給
することが必要となる。そこで、動物細胞を培養する
際、空気と培養液の接触表面積を広くしたり、培養時の
酸索分圧を高くし、通気および攪拌により細胞の酸素要
求量を充足させている。しかしながら、動物細胞等を培
養する際は、微生物培養で見られるような培地中への直
接的な酸索の通気攪拌は、細胞へのダメージが大きく、
行われていないのが現状である。また、培地中への酸素
供給力を高める方法として、ガス透過性の良いシリコン
チューブを培地中に入れ、高純度の酸素を供給する方法
が実施されているが、装置の大型化や、酸素要求量が大
きい初代培養細胞への酸素供給という点において間題が
ある。 【０００３】このように従来の方法では、酸素供給が律
速となり、培養細胞の細胞密度を高くすることができな
かった。また、近年、研究、開発が盛んに行われるよう
になってきているハイブリッド型人工臓器への酸素供給
方法において、従釆の方法では、細胞への酸素供給が十
分に行われているとは言い難い。したがって、ハイブリ
ッド型人工臓器が十分機能するための細胞収容量を装置
に組み込めなかったり、酸素供給のためのリザーバーが
装置に必要となり、循環動体への負荷が大きくなるとい
う間題があった。さらに動物細胞を用いた物質生産にお
いても酸素供給が律速となり、生産効率が十分行われて
いなかった。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の間題
点に鑑みてなされたものであって、細胞培養液が動物細
胞を増殖、若しくは、維持するのに十分な酸素運搬能を
備え、かつ十分な栄養素を含んだ細胞培養液を供給する
ことを目的とする。 【０００５】 【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めの、本発明は以下のとおりである。 （１）ヘモグロビン及び／又はヘム錯体を酸素運搬体と
して含有することを特徴とする細胞培養液である。 （２）前記ヘモグビン及び／又はヘム錯体が、リポソー
ムに内包されていることを特徴とする上記（１）記載の
細胞培養液である。 （３）ヘモグロビン及び／又はヘム錯体の濃度が１〜１
２、より好ましくは３〜９重量％であることを特徴とす
る上記（１）乃至（２）に記載の細胞培養液である。 【０００６】本発明に用いるヘモグロビンは、ヒト、あ
るいは動物、特に哺乳類で具体的には牛、ブタ等、由来
の物が使用される。ヘム錯体としては、前記ヘモグロビ
ン由釆の物の他、合成した物等が使用される。これらヘ
モグロビン及び／又はヘム錯体は細胞への毒性低下のた
め、リポソームやエマルジョンに内包されたり、巨大分
子、微集合体、微粒子、微小球およびナノ小球等の形態
から構成されても良く、特にリポソームに内包すること
が望ましい。 【０００７】 【発明の実施の形態】本発明に使用するヘモグロビン
は、特に限定せず、ヒトあるいは動物の赤血球や濃縮赤
血球製剤を原料として公知の方法によって得ることがで
きる。具体的な方法を以下に示す。全血は連続遠心機
により血漿、白血球、血小板等を除去し、さらに生理食
塩水を用いて遠心洗浄を連続的に行い粗洗浄赤血球とす
る。粗洗浄赤血球は引き続き血漿分離機（例えば、孔
径０．４５μｍのセルロースアセテート膜）により、生
理食塩水を用いて繰り返し洗浄し、血漿、白血球、血小
板等を完全に除去した洗浄赤血球を得る。得られた洗
浄赤血球に過剰量（約２〜３倍量の容量）の蒸留水もし
くは低張緩衝溶液（例えばＰＨ＝７．４前後）を添加し
て洗浄赤血球溶血液とする。この洗浄赤血球溶血液
は、上述した血漿分離機、さらに血漿成分分離機（例え
ぱ、孔径０．１μｍのセルロースアセテート膜）を連続
的に通過させて赤血球膜残渣の除去と溶血液の無菌化を
行う。上述した操作により得られた溶血液は、低分子
量物質（分画分子量：１万以下）の除去ならびに水素イ
オン濃度（ｐＨ７．２〜８．５）および電解質濃度の至
適化を目的とした透析処理を行った後、ヘモグロビン濃
度がおよそ４０〜６０ｇ／デシリットルの範囲内になる
ように限外濾過（分画分子量：１万以下）を用いて濃縮
し、ヘモグロビン溶液として使用する。 【０００８】なお得られたヘモグロビン溶液には、メト
化抑制剤を配合することが好ましく、例えば嫌気性解糖
系を構成する糖類、メト化抑制前駆物質などがあげられ
る。具体的には嫌気性解糖系を構成する糖類としてはリ
ンゴ酸、メト化抑制前駆物質としてはチトクロムｂ５，
ＮＡＤＨ−チトクロムｂ５還元酵素、ＮＡＤＨ−フラビ
ン還元酵素ならびに、カタララーゼ、スーパーオキシド
ジスムターゼ、グルタチオンパーオキシターゼなどの活
性酵素除去物質も含まれている。上記低張緩衝溶液とし
ては、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液。ＴＥＳ緩衝液
などを用いることができる。 【０００９】さらにヘモグロビン溶液には有機リン酸化
合物を添加しておいても良い。例えば、イノシトールヘ
キサリン酸、グルコース−６−リン酸、アデニントリホ
スフェート、アデニンジホスフェートなどをあげること
ができ、これらはヘモグロビンのアロステリック因子と
してヘモグロビンと酸素の親和性を変化させて、末梢組
織への酸素運搬能を増加させる機能を持つ。 【００１０】本発明に使用するヘム錯体は、特に限定し
ないが、プロトポルフィリン鉄錯塩と構造類似のヘム錯
体を使用することができる。また、化学合成したヘムに
４本の長鎖アルカンリン酸コリン基を結合して得られた
合成ヘム錯体（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ、７３４：２７４（１９８３））等を使用すること
ができる。 【００１１】さらに本発明のヘモグロビン及び／又はヘ
ム錯体は、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコー
ルなどと緒合し又はグルタルアルデヒド、ビス（３，５
−ジブロモサリシル）フマレート等を架橋剤として修飾
されていても良く、具体的には、ヘモグロビンのアルフ
ァ鎖同士を選択結合した修飾ヘモグロビン、ヘム緒合ア
ルブミン等の形態で使用しても良い。 【００１２】次に上述したヘモグロビン及び／又はヘム
錯体をリポソームで内包する場合について説明する。生
体膜モデルやドラッグデリバリーシステム（Ｄ．Ｄ．
Ｓ．）として使用されるリポソームは形態的にみて大き
く３種類に分けられる、脂質の膜が幾重にも袋状になっ
ている多重層リポソーム（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ
ＬｉＰｏｓｏｍｅ ｏｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＭＬ
Ｖ））、単層からなる小さいリポソーム（Ｓｉｎｇｌｅ
Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｏｒＳ
ｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ
（ＳＵＶ））、単層からなる大きいリポソーム（Ｌａｒ
ｇｅ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＬＵ
Ｖ））の３種類である。本発明においては、直径０．１
〜１．０μｍの単層リポソームを使用するのが良い。 【００１３】リポソームを構成する脂質としては、ホス
ファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（Ｐ
Ｓ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホス
ファチジルイノシトール（ＰＩ）、リゾホスファチジル
コリン（ＬＰＣ）、ガングリオシド（Ｇ）、ガルジオリ
ピン（ＣＬ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリスト
イルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイ
ルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジン
酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およ
びこれらを常法にしたがって水素添加したものがあげら
られる。 【００１４】これらの脂質以外にコレステロール（ＣＨ
ＯＬ）、ジセチルホスフェイト（ＤＣＰ）、ステアリル
アミン（ＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等
が添加されることもある。コレステロールはリポソーム
の形成、膜の安定化を目的として通常添加される他に、
リポソーム膜の透過度を調節するためにも使用できる。
同様にジセチルホスフェイト（−）、スセテアリルアミ
ン（十）等の電荷付与物質についても、リポソームと細
胞との接触の調節に使用でき、ボリエチレングリコール
はリポソーム間の凝集防止のために使用できるが、これ
らはすべてのリポソーム形成に不可欠というものではな
い。 【００１５】一方、リポソームの形成とは異なる観点か
ら、トコフェロール同族体も添加される。トコフェロー
ル（ビタミンＥ）は非特異的な抗酸化作用を持つ生体成
分で古くから食品中の不飽和脂肪酸やビタミンＡ、カロ
チンなどの酸化防止剤として使用されてきたが、本発明
においても酸化防止剤して、リポソーム膜あるいはヘモ
グロビンの安定性に寄与する。特に、不飽和脂質を含有
するリポソームでは重要な構成成分となる。 【００１６】リポソームの調製にあたっては、特に限定
されず常法によって行うことができるが、内包するヘモ
グロビンは、温度、光、水素イオン濃度、溶存ガス、金
属イオン等により容易に酸素運搬機能の少ないメトヘモ
グロビンに酸化されるため、この点に留意して、例え
ば、ガラスビーズ攪拌法、コール酸除去法、逆相蒸発
法、フレンチプレス法、Ｃａ２＋融合法、パールポンビ
ング法、脱水−再水和法等を使用することができる。 【００１７】本発明の細胞培養液に含まれる他の成分と
しては、特に限定はなく細胞を増殖、若しくは維持する
ものであれば種々公知のものが用いられる。具体的に
は、栄養物質、つまり細胞に取り込まれて代謝の基質に
なるか補酵素として利用されるもので、例えばグルコー
スに代表される糖類、Ｆｅ，Ｚｎ，Ｓｅ，Ｃｕ，Ｍｎ、
Ｍｏ，Ｖのような微量必須金属、必須アミノ酸、セリ
ン、グリシン等の非必須アミノ酸、水溶性ビタミンなど
があげられる。さらにＥＧＦ，ＨＧＦ、インスリン等の
増殖因子、ホルモン等があげられる。 【００１８】なお本発明の細胞培養液は培養する細胞の
種類により異なるが、最終的なヘモグロビン及び／又は
ヘム錯体の濃度が１〜１２、より好ましくは３〜９重量
％であり、ｐＨは可能な限り７．２〜７．４の範囲、晶
質浸透圧は、２５０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に調
整されていることが望ましい。 【００１９】本発明の細胞培養液は、大気圧下において
も既に多くの酸素を保持しているため、初代培養細胞、
特に生体から分離した直後の肝実質細胞、血管内皮細
胞、骨細胞、骨髄細胞等を培養する際に使用することが
出来る。つまり、生体から分離した直後の細胞は、大き
なダメージを受けており、培養初期段階においてより多
くの酸素を必要とすることから本発明の細胞培養液の使
用が適している。また、肝実質細胞によるハイブリッド
型人工肝臓のような人工臓器において、本発明の細胞培
養液を人工臓器設定の際の初期培養液として利用するこ
とが出来る。例えば、ヒト若しくは、ブタから分離した
肝実質細胞を人工臓器へ組み込む際、細胞が安定化する
までの培養液として利用できる。さらにハイブリッド型
人工臓器に組み込まれた状態の細胞は、高密度な状態に
あるため、この人工臓器への酸素供給方法の一つとして
本発明の細胞培養液を利用することが出来る。具体的に
は、モジュール型のハイブリッド型人工臓器においてモ
ジュールの外側に充填した細胞に本発明の細胞培養液を
循環し、オンライン上に設けたガス交換装置により酸素
分圧を高くした状態で、本発明の細胞培養液を還流する
方法等があげられる。 【００２０】 【実施例】次に実施例および比較例を示して本発明をさ
らに詳細に説明する。 （実施例）水素添加大豆レシチン、コレステロール、ミ
リスチン酸の均一混合凍結乾燥脂質粉末（プレソーム、
日本精化）５０ｇに等量の蒸留水を加えて６０℃、３０
分の水和処理を行った。得られた水和脂質にへモグロビ
ン濃度４５％（ｗ／ｗ）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶
液２００ｍ１を加え、高速攪拌機（ワーリングブレンダ
ー：ワーリング社製）に投入し、攪拌処理を行った。得
られたリポソームの懸濁液を生理食塩水で１０倍に希釈
して、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過滅菌およ
び粒子制御を行った、得られた濾液は、高速遠心機によ
り遠心し、リポソームに取り込まれなかったヘモグロビ
ンおよび微少粒子を除去した。さらに濾液にヘモグロビ
ンが検出されなくなるまで生理食塩水で遠心洗浄を繰り
返し、最終的に細胞培養用培地（ウィリアムＥ培地、ラ
イフテックオリエンタル（株）製）でヘモグロビン濃度
が５％となるよう調整し、本発明の細胞培養液を得た。
得られた細胞培養液の容量は、１７００ｍ１、リポソー
ムの平均粒径は、２５０ｎｍであった。また、細胞培養
液の酸素解離曲線は、ヒルプロットからＹ＝７．７８×
１０−３×Ｐ２．５２／（１＋７．７８×１０−３×Ｐ
２．５２）（Ｙ：酸素飽和度、Ｐ：酸素分圧）で近似的
に表わせられる。 【００２１】（試験例１）ＳＤ系雄性ラット２００ｇか
ら灌流法により肝細胞を分離した。その時の肝細胞の生
存率は、９０％以上、比呼吸速度は、静的方法により
２．７×１０−９ｍｍｏｌ／ｃｅｌｌ・ｈであった。密
閉できる容器に、実施例の細胞培養液に１０％ＦＢＳを
添加した細胞培養液を５５ｍｌ入れ、攪拌子で緩やかに
攪拌（１００ｒｐｍ）しながら、酸素電極（ＹＳＩ Ｍ
ＯＤＥＬ５３００）で経時的に溶存酸素濃度の変化を記
録した。酸素電極が２０％と安定したとき、上記方法で
分離した肝細胞を１×１０６個／ｍｌの細胞密度になる
よう添加し、完全に容器を閉した。その結果、この本発
明の細胞培養液においては、肝細胞を播種後、容器内の
酸素がすべてなくなるまでに４６分要した。一方、比較
例としてヘモグロビンを含まない以外は上記同様の１０
％ＦＢＳを添加したウィリアムＥ培地を使用し、同様な
方法により容器内の溶存酸素濃度の変化を記録したとこ
ろ、容器内の酸素がすべてなくなるのに５分要した。 【００２２】（試験例２）試験例１と同様に分離した肝
細胞を通気可能な培養容器に１×１０６個／ｍｌの細胞
密度になるよう播種した。この培養容器は、ｋＬａが、
０．１ｍｉｎ−１、培地量６０ｍｌで、細胞培養時に
は、攪拌子で穏やかに攪拌（１００ｒｐｍ）された。ま
た、培養開始時から５％二酸化炭素、９５％空気の混合
ガスを毎分６００ｍｌヘッドスペースに通気した。また
使用した本発明の細胞培養液は、１０％ＦＢＳを添加し
た。比較例として試験例１と同様の１０％ＦＢＳ添加ウ
ィリアムＥ培地を使用した。その結果、本発明の細胞培
養液においては、肝細胞を播種後、臨界溶存酸素濃度を
下回ることなく、６０分後に酸素供給と酸素消費が平衡
に達した。一方、比較例として用いた１０％ＦＢＳ添加
ウィリアムＥ培地では、およそ４分間で臨界溶存酸素濃
度を下回り、その後、肝細胞の比呼吸速度が１／２以下
に下がった。 【００２３】 【発明の効果】本発明の細胞培養液は、ヘモグロビン及
び／又はヘム錯体を酸素運搬体として含有し、細胞を培
養する際に酸素をより多く供給できるため、高密度培養
や培養装置の小型化が可能である。また、栄養成分を共
に配合することにより細胞培養を効果的に行うことがで
きる。さらに本発明の細胞培養液は、細胞毒性が少なく
なく、酸素供給が穏やかに行われるため、従来の酸素供
給方法による培養方法に比べ酸素利用効率の向上を図る
ことができる。そのため本発明の細胞培養液は、細胞の
培養の他にハイブリッド型人工臓器の灌流液などとして
有効に利用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【講求項１】ヘモグロビン及び／又はヘム錯体を酸素運
   搬体として含有することを特徴とする細胞培養液。 【請求項２】前記ヘモグビン及び／又はヘム錯体が、リ
   ポソームに内包されていることを特徴とする講求項１記
   載の細胞培養液。 【請求項３】ヘモグロビン及び／又はヘム錯体の濃度が
   １〜１２重量％であることを特徴とする請求項１乃至２
   に記載の細胞培養液。