WO2021230261A1

WO2021230261A1 - 刺激に応答して酸素を放出する系

Info

Publication number: WO2021230261A1
Application number: PCT/JP2021/017959
Authority: WO
Inventors: 典弥松▲崎▼; 博貴中辻; 芳樹澤; 繁宮川
Original assignee: 国立大学法人大阪大学
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-11-18

Abstract

刺激に応答して酸素を放出する系、その系を含む細胞培養容器または人工三次元組織、およびその系を用いる細胞培養方法または人工三次元組織の製造方法を提供する。

Description

刺激に応答して酸素を放出する系

　本発明は、刺激に応答して酸素を放出する系、その系を含む細胞培養容器または人工三次元組織、およびその系を用いる細胞培養方法または人工三次元組織の製造方法に関する。

　再生医療において、生体外での三次元組織の構築は大きな課題がある。特に、２００μｍ以上の厚さを有する組織を構築することは未だ困難である。その原因として、組織内部への酸素や栄養素の供給不足があげられる（非特許文献１）。近年、酸素を徐放する足場が注目されており、例えば過酸化カルシウムを含有する足場などが報告されている（非特許文献２）。

Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．２００６，２０，７０８Ｋ．Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０１８，１８２，２３４

　しかしながら、従来の酸素を放出する系は、組織内部への酸素の供給不足の問題が存在する。また、従来の酸素を放出する系は、酸素を徐放することが困難である。そのため、組織内部へ酸素を供給するおよび酸素を徐放する系が必要とされている。十分な酸素を供給することができれば、従来よりも厚い組織を構築することができると期待される。

　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を組み合わせたところ、刺激に応答して酸素を放出する系を構築できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む、刺激に応答して酸素を放出する系。
［２］ヘム構造を有するタンパク質がミオグロビンまたはヘモグロビンである、［１］記載の系。
［３］還元剤が生体適合性を有するものである、［１］または［２］記載の系。
［４］還元剤がアスコルビン酸、トコフェロール、システイン、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨである、［３］記載の系。
［５］刺激が生体組織に受容可能なものである、［１］~［３］のいずれかに記載の系。
［６］刺激が温度変化、光照射、ｐＨ変化または薬剤によるものである、［１］~［５］のいずれかに記載の系。
［７］［１］~［６］のいずれかに記載の系を含む細胞培養容器。
［８］［１］~［６］のいずれかに記載の系を含む人工三次元組織。
［９］［１］~［６］のいずれかに記載の系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、細胞培養方法。
［１０］［１］~［６］のいずれかに記載の系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、人工三次元組織の製造方法。

　本発明によれば、刺激によって酸素を放出することができるため、刺激をおこなうタイミングおよび刺激の強度によって、酸素を放出する位置または時間を制御すること、放出する酸素の量を制御すること、および／または酸素を徐放することができる。本発明の酸素放出系を用いることで、従来よりも厚い組織を構築することができ、より良い細胞培養の環境を作出することができる。

図１は、Ｍｂ溶液の吸光度の測定結果を示す。図２は、Ｍｂ溶液の吸光度とｏｘｙＭｂ溶液の吸光度との吸光度変化を示す。図３は、アスコルビン酸添加後のｏｘｙＭｂ溶液の酸素分圧変化を示す。図４は、２０℃、３７℃および４５℃下での、ｏｘｙＭｂ溶液の経時的な溶存酸素量を示す。図５は、２０℃、３７℃および４５℃下での、ｏｘｙＭｂ溶液のＭｂとＡＡの吸光度の変化を示す。図６は、ミオグロビン（Ｍｂ）溶液とＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ）溶液に交互に浸漬して作製された各ＬＢＬ（ｌａｙｅｒ　ｂｙ　ｌａｙｅｒ）ナノ薄膜の振動数変化（−ΔＦ（Ｈｚ））の測定結果を示す。図７は、ＬＢＬナノ薄膜の非存在下および存在下における蛍光酸素プローブの蛍光スペクトルを示す。図８は、ＬＢＬナノ薄膜の非存在下および存在下における細胞生存率を示す。図９は、ｏｘｙＭｂ溶液にＮＡＤＨの添加の４、２４、４８、および７２時間後のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。図１０は、４℃または３７℃での、リン酸緩衝生理食塩水にＮＡＤＨの添加の０、２、４、８、２４、４８、７２時間後のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。図１１は、Ｍｂ　ｍｉｃｒｏｇｅｌ下、Ｍｂを含まないｍｉｃｒｏｇｅｌ下およびｍｉｃｒｏｇｅｌを含まないサンプル下における細胞生存率を示す。

　本発明は、ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む、刺激に応答して酸素を放出する系を提供する。

　ヘム構造は、中心金属として金属原子、例えば鉄または銅を有するポルフィリン錯体を含む構造を指すが、ポルフィリン錯体と類似した錯体を含む構造であってもよい。一般的に、ヘム構造は、二価の鉄とＩＸ型プロトポルフィリンからなるプロトヘムであるフェロヘムのことを指すが、フェリヘムやヘモクロム、ヘミン、ヘマチンなど、その他のポルフィリンの鉄錯体およびそれと類似した構造も含まれる。ヘム構造は、例えば、酸化および／または還元反応によってヘム構造中の鉄が二価および三価となることができる機能を有する。ヘム構造は、例えば、ヘム構造中の金属原子、例えば鉄または銅に酸素分子が結合し、酸素分子を貯蔵および放出する能力を有する。

　ヘム構造を有するタンパク質は、１以上のヘム構造を有するタンパク質を指す。ヘム構造を有するタンパク質は、天然由来のタンパク質であっても、変異体または人工物であってもよい。ヘム構造を有するタンパク質は、ミオグロビン、ヘモグロビン、ヘモシアニン、クロロクルオリン、エリスロクルオリンまたはヘムエリスリンであってよい。ヘム構造を有するタンパク質は、酸化状態や還元状態であってもよい。例えば、ミオグロビンは、オキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）、メトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）やデオキシミオグロビン（ｄｅｏｘｙＭｂ）を含む。ヘム構造を有するタンパク質は、ヒト由来のヘム構造を有するタンパク質であってよく、またはヒト以外の動物由来のヘム構造を有するタンパク質であってもよい。動物は、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類である。動物は、例えば、カエル、ニワトリ、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウスまたはウサギである。ヘム構造を有するタンパク質は、好ましくは、生体組織に受容可能なヘム構造を有するタンパク質、特に、細胞毒性または細胞挙動阻害性を有さないか、または細胞毒性または細胞挙動阻害性が低いヘム構造を有するタンパク質である。本発明において好ましく用いられるヘム構造を有するタンパク質の例としては、ミオグロビンおよびヘモグロビンなどが挙げられる。

　還元剤は、還元力を有し、かつ刺激に応答して還元力を低下または消失する機能を有するあらゆる物質を指す。還元力は、還元剤自ら酸化されると同時に相手物質を還元する能力である。本発明において、還元剤は、ヘム構造を有するタンパク質の金属原子、例えば鉄または銅を還元し、還元された金属原子、例えば鉄または銅に酸素分子が結合する。還元剤は、ヘム構造を有するタンパク質の金属原子、例えば鉄または銅への酸素分子の結合性などに応じて適宜選択されうる。還元剤は、アスコルビン酸類（アスコルビン酸（ビタミンＣ）またはエリソルビン酸など）、フェノール類（トコフェロール（ビタミンＥ）または２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）など）、システイン類（グルタチオンなど）、亜硫酸塩類（亜ジチオ酸など）、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）またはこれらの任意の塩（ナトリウム塩、カルシウム塩または塩酸塩など）であってよい。還元剤は、好ましくは、生体適合性を有する還元剤、特に、細胞毒性または細胞挙動阻害性を有さないか、または細胞毒性または細胞挙動阻害性が低い還元剤である。本発明において好ましく用いられる還元剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェロール、システイン、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなどが挙げられる。

　還元剤の還元力が十分である間は、ヘム構造を有するタンパク質の金属原子、例えば鉄または銅への酸素分子の結合が維持される。還元剤が刺激を受けてその還元力を低下または消失させると、ヘム構造を有するタンパク質の金属原子、例えば鉄または銅が自動酸化され、金属原子、例えば鉄または銅から酸素が放出される。

　刺激は、還元剤の還元力を低下または消失させることができるあらゆる刺激であってよい。還元剤は、刺激を受けることによってその構造を変化させ、あるいはそれ自体が分解されるものであってもよい。刺激は、様々な刺激、例えば時間の経過、物理的刺激、例えば温度変化、光照射、ＵＶ照射、超音波照射または圧力変化、あるいは化学的刺激、例えばｐＨ変化または薬剤添加であってよい。刺激は、例えば２０℃~５０℃、２５℃~５０℃、２５℃~４５℃、３０℃~４５℃、３７℃~４５℃、３７℃または４５℃の温度であってよい。刺激は、好ましくは、生体組織に受容可能な刺激、特に、細胞毒性または細胞挙動阻害性を有さないか、または細胞毒性または細胞挙動阻害性が低い刺激である。本発明において好ましい刺激は、温度変化、光照射、ｐＨ変化および薬剤などが挙げられる。

　低下は、レベルの減少、下方制御または抑制などを指す。例えば、還元力の低下は、還元剤の還元力の１００％、９５％以上、９０％以上、８０％以上、７０％以上、６０％以上、５０％以上、４０％以上、３０％以上、２０％以上または１０％以上の低下を指す。

　消失は、レベルの完全な喪失または実質的に完全な喪失を指す。例えば、還元力の消失は、還元剤の還元力の１００％、９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上または９０％以上の低下を指す。

　本発明による系は、ヘム構造を有するタンパク質および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む、刺激に応答して酸素を放出するシステム、体系または機構を包含する。

　一実施形態において、本発明による系は、ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む、刺激に応答して酸素を放出する物、例えば、素材または材料などであってよい。また、本発明による系は、当該物、当該素材または当該材料を含む物、例えば、溶液、容器、培地、培養容器、組織、器官または臓器などであってもよい。

　本発明による系の形状は、液体、半固体、固体であってよい。例えば本発明による系は、溶液、ゲル、ペースト、フィルム、プレート、スティック、ブロック、粉末、顆粒、ペレットなどであってもよい。本発明による系の具体例としては、細胞培養培地（本発明による系が含まれている培地）、培地添加剤（液剤、ペースト、粉末、顆粒、ペレットなど）、細胞培養容器の内面に足場として設置されるもの（ゲル、シートなど）、人工組織製造用の足場（ゲル、シートなど）、人工組織（例えば臓器、血管、血液など−その中に本発明による系が含まれている）などが挙げられるがこれらに限定されない。

　一実施形態において、本発明による系は、ゼラチンまたはコラーゲンなどの足場材料（基板）とヘム構造を有するタンパク質を組み合わせて、例えばゼラチンまたはコラーゲンなどの足場材料（基板）上にヘム構造を有するタンパク質を被覆することによって、本発明による系を有する足場（スキャフォールド）を形成してもよい。足場（スキャフォールド）は、血管を模すように製造されてよい。当業者は、本発明による系の使用に応じて、足場材料（基板）を適宜選択することができる。

　本発明による系は、刺激によって酸素を放出することができる。したがって、本発明による系による刺激をおこなうタイミングおよび刺激の強度は、用途、使用場所、細胞の種類、組織の種類などに応じて適宜調節されうる。

　本発明による系による酸素の放出は、徐放性であってよい。例えば、本発明による系は、１０分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、５時間以上、８時間以上、１０時間以上、２０時間以上、２４時間以上、３０時間以上、４０時間以上、４８時間以上、５０時間以上、７２時間以上、１００時間以上またはそれ以上の時間、酸素を放出することができる。また、刺激を停止または一時的に中断することによって、酸素の放出を停止または一時的に中断させてもよい。

　一実施形態において、本発明による系は、細胞培養または人工三次元組織に関して使用されてよい。

　本発明による系を細胞培養に用いて、より良い培養環境を作出することが出来る。本発明による系から十分な量の酸素を培地に放出させて、細胞に十分な量の酸素を取り込ませることができる。その結果、細胞のバイアビリティが向上し、細胞収量が向上する。

　例えば本発明による系を、培養容器内面にコーティングしてもよい。あるいは本発明による系を培地に添加してもよい。一実施形態において、本発明による系は、ゼラチンまたはコラーゲンなどの足場材料（基板）とヘム構造を有するタンパク質を組み合わせることによって、例えば足場材料（基板）上にヘム構造を有するタンパク質を被覆することによって、あるいは足場材料（基板）中にヘム構造を有するタンパク質を添加することによって足場を形成し、足場に接する環境（例えば培地）中または足場自体に還元剤を添加することによって、本発明の系を構築してもよい。当業者は、本発明による系の使用態様に応じて足場材料（基盤）を適宜選択することができる。

　細胞は、ヒト由来の細胞であってよく、またはヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。動物は、例えば、昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類である。動物は、例えば、カエル、ニワトリ、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウスまたはウサギである。動物は、例えばヒトである。細胞は、例えば、間葉系幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞等の由来の細胞である。細胞は、例えば、健常細胞または非健常細胞由来の細胞である。細胞は、培養細胞であってもよい。培養細胞としては、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。また、細胞は、あらゆる組織由来の細胞であってよい。細胞は、例えば皮膚線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞、筋細胞または筋芽細胞である。細胞は、例えば筋組織または筋肉組織由来のあらゆる細胞、例えば骨格筋、内臓筋、横紋筋、随意筋、不随意筋、平滑筋または心筋由来の細胞である。細胞は、例えば心筋細胞である。

　本発明による系を人工三次元組織の構築のために用いてもよい。人工三次元組織の構築開始時点で、あるいは構築途中で、本発明による系を人工三次元組織中に導入することができる。例えば本発明による系を、ゼラチンやフィブロネクチンを含む細胞外マトリックスに添加してもよい。あるいは本発明による系を、細胞外マトリックスを培養するための培地に添加してもよい。あるいは上で説明した足場（基板）上で人工三次元組織を構築してもよい。あるいは物質透過性のある材料でできたチューブ（例えば血管を模したもの）の内面および／または外面にヘム構造を有するタンパク質を固定化して人工三次元組織中に通し、チューブ内面および／またはチューブ外面に接触するように還元剤を配置してもよい。チューブ内に還元剤を含む栄養液を充填あるいは流してもよい。

　人工三次元組織は、例えば、培養された細胞と細胞外マトリックスとを含む細胞の集合体である。三次元組織は、例えば、成熟された組織または臓器である。人工三次元組織は、あらゆる組織であってよく、例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織である。人工三次元組織は、例えば上皮組織、筋組織である。人工三次元組織は、また、あらゆる臓器であってよく、例えば、腸、胃、肝臓、膵臓、肺、心臓、脳である。人工三次元組織は、本発明による系と一体となっていてもよい。

　一実施形態において、本発明による系は、酸素以外の任意のさらなる物質も放出するように適宜調節されてもよい。本発明による系が細胞培養または人工三次元組織に関して使用されるとき、さらなる物質は、例えば細胞または組織の分化誘導促進成分、培養成分または栄養分、例えばタンパク質、脂肪、グルコースを含む炭水化物、ビタミン、ミネラル、繊維、パルミチン酸を含む脂肪酸またはアミノ酸であってよい。当業者は、本発明による系の使用に応じて、さらなる物質を適宜選択することができる。

　上で説明したように、細胞培養系または人工三次元組織構築系中に本発明の系を構築することができる。したがって、本発明は以下のものを提供する。

　本発明は、一実施形態において、本発明による系を含む細胞培養容器を提供する。例えば、細胞培養容器は、シャーレ、フラスコ、マイクロプレート、バイオプリント用容器などのあらゆる容器でありうる。

　本発明は、一実施態様において、本発明による系を含む人工三次元組織を提供する。

　本発明は、一実施形態において、上記系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、細胞培養方法を提供する。

　本発明は、一実施形態において、上記系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、人工三次元組織の製造方法を提供する。さらに、製造された人工三次元組織から、例えば上記系が使用される足場（スキャフォールド）を取り除く工程を含んでもよい。

　本発明は、さらなる態様において、以下のものを提供する：
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む素材であって、刺激に応答して酸素を放出する素材。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む培地であって、刺激に応答して酸素を放出する培地。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む培養容器であって、刺激に応答して酸素を放出する培養容器。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む細胞培養用足場であって、刺激に応答して酸素を放出する足場。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む人工三次元組織であって、刺激に応答して酸素を放出する人工三次元組織。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む人工三次元組織培養用培地であって、刺激に応答して酸素を放出する人工三次元組織培養用培地。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む人工三次元組織培養用足場であって、刺激に応答して酸素を放出する人工三次元組織培養用足場。
　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む人工三次元組織培養用培養容器であって、刺激に応答して酸素を放出する人工三次元組織培養用培養容器。

　以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると解すべきではない。

実施例１
　（Ｉ）　リン酸緩衝生理食塩水を用いて２００μＭのミオグロビン（Ｍｂ）溶液を調製した。調製されたＭｂ溶液の吸光度を測定した（図１）。この溶液中のＭｂは酸化状態のメトミオグロビンである。

　（ＩＩ）　（Ｉ）上で調製されたＭｂ溶液に２ｍＭのアスコルビン酸（ＡＡ）を加えて、酸素吸着状態のオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）溶液を調製した。アスコルビン酸添加の１分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分および１２０分後に、ｏｘｙＭｂ溶液の吸光度を測定した。（Ｉ）で測定されたＭｂ溶液の吸光度とｏｘｙＭｂ溶液の吸光度を図２に示す。アスコルビン酸添加の１分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分および１２０分後のｏｘｙＭｂ溶液の酸素分圧変化を図３に示す。アスコルビン酸によるミオグロビンの還元およびミオグロビンへの酸素吸着が確認された。

　（ＩＩＩ）　２０℃、３７℃および４５℃下での、（ＩＩ）で調製されたｏｘｙＭｂ溶液の経時的な溶存酸素量と吸光度の変化を測定した。溶存酸素量を図４に示す。吸光度を図５に示す。
　図４に示されるとおり、２０℃で保持された場合、溶存酸素量は時間経過と共に増加しなかったが、３７℃および４５℃で保持された場合、溶存酸素量は時間経過と共に増加した。また、図５に示されるとおり、２０℃の場合、吸収スペクトルの変化が見られなかったが、３７℃および４５℃の場合、吸収スペクトルのピークの減少が観察された。図５におけるｏｘｙＭｂ溶液の吸収スペクトルのピークの減少は、ｏｘｙＭｂからの酸素の放出を示す。図５に示されるＡＡの吸収スペクトルのピークの減少は、アスコルビン酸の分解を示す。
　したがって、温度上昇によってＡＡの還元力が低下または消失され、ｏｘｙＭｂに吸着していた酸素が徐放されたと考察される。

実施例２
　（Ｉ）　水晶子マイクロバランス（ＱＣＭ）チップをピラニア溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素＝３：１）に１分間浸漬し、ミリＱで洗浄した。この作業を２回行い、ＱＣＭチップを２０℃のミオグロビン（Ｍｂ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０）とＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ）溶液（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に交互に１５分ずつ浸漬した。各ステップ間で、ＱＣＭチップは１／５０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。各溶液への浸漬は５回ずつ行い、各ステップでの振動数変化（−ΔＦ（Ｈｚ））を測定した。実験結果を図６に示す。膜厚約２０ｎｍのＬＢＬ（ｌａｙｅｒ　ｂｙ　ｌａｙｅｒ）ナノ薄膜の形成が確認された。

　（ＩＩ）　ｐＨ５．０のリン酸緩衝生理食塩水にＭｂを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、２０当量のアスコルビン酸を加えて２０℃で３時間静置した。蛍光用石英セルをピラニア溶液で２回洗浄した後、調整したＭｂ溶液とＣｏｌ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を２０℃で交互に１５分ずつ浸漬した。各ステップ間で石英セルはミリＱで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。Ｍｂ溶液６回目の浸漬を行った後、蛍光酸素プローブを含むリン酸緩衝生理食塩水を石英セルに加えた。酸素の拡散を防ぐため、溶液はミネラルオイルを用いて蓋をした。遮光下３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光酸素プローブの蛍光スペクトルを測定した。また、薄膜がない場合においても同様に蛍光酸素プローブの蛍光スペクトルを測定した。実験結果を図７に示す。ＬＢＬナノ薄膜から０．７１ｎｍｏｌの酸素徐放が確認された。

　（ＩＩＩ）　ｐＨ５．０のリン酸緩衝生理食塩水にＭｂを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、２０当量のアスコルビン酸を加えて２０℃で３時間静置した。室温において、調整したＭｂ溶液とＣｏｌ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を３５ｍｍの培養皿に交互に１５分ずつ浸漬した。各ステップ間で培養皿はミリＱで洗浄し、Ｍｂ溶液を計１１回、Ｃｏｌ溶液を計１０回浸漬した。
　ナノ薄膜をコーティングした培養皿とコーティングしていない培養皿に１×１０^５の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を加えた。培養皿と酸素ガス吸着パックを密閉容器内に入れ、３７℃で２４時間培養した。このとき、密閉容器内の酸素濃度を測定すると２％であった。低酸素条件における培養後、各培養皿の細胞についてＷＳＴ　ａｓｓａｙを行った。また、コーティングしていない培養皿に１×１０^５のＮＨＤＦを播種し、通常酸素分圧条件で２４時間培養したものについても同様にＷＳＴ　ａｓｓａｙを行い、その吸光度から細胞生存率を計算した。実験結果を図８に示す。図８において、１００％細胞生存率は、通常の酸素条件下で非ＬＢＬ培養皿に播種した細胞から定義した。ＬＢＬナノ薄膜は低酸素条件下で細胞の生存率を向上させた。

実施例３
　（Ｉ）　リン酸緩衝生理食塩水にＭｂを５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、２０当量のアスコルビン酸を加えて４℃で４８時間静置した。得られたアスコルビン酸を含むｏｘｙＭｂ溶液を分画分子量３５００の透析膜を用いて４℃で４８時間透析し、ｏｘｙＭｂ溶液からアスコルビン酸を取り除いた。２００μＭのｏｘｙＭｂ溶液に２ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を加え、３７℃で７２時間インキュベートし、０、２、４、８、２４、４８、７２時間後のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを測定した。実験結果を図９に示す。ＮＡＤＨによって４８時間以上にわたる長期的なミオグロビンの自動酸化反応が確認された。

　（ＩＩ）　リン酸緩衝生理食塩水にＮＡＤＨを２ｍＭの濃度で溶解し、４℃または３７℃でインキュベートした。０、２、４、８、２４、４８、７２時間後、ＮＡＤＨ溶液の一部を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水で濃度を５倍に希釈してＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトル測定を行った。実験結果を図１０に示す。ＮＡＤＨは３７℃で時間依存的に分解した。

実施例４
　（Ｉ）　１ｗｔ％のＣｏｌ溶液にＭｂを５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、２０等量のアスコルビン酸を加えた。４℃で２時間静置した後、溶液に２．５ｍＭの白金イオンを添加し、８００ｒｐｍで攪拌したオリーブオイルに滴下して４℃で２時間攪拌した。４℃で７２時間静置した後、ヘキサンを用いてオリーブオイルを３回洗浄し、空気中で１時間乾燥させてＭｂマイクロゲル粒子（Ｍｂ　ｍｉｃｒｏｇｅｌ）を得た。
　５．０×１０^６のｉＰＳ由来ヒト心筋細胞と２．５×１０^４個のＭｂ　ｍｉｃｒｏｇｅｌを１０％血清入りＤＭＥＭ培地２００μＬに懸濁させ、懸濁液をインサートに播種した。インサートに１０％血清入りＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で３日間培養した。また、コントロールとしてＭｂを含まないｍｉｃｒｏｇｅｌ、ｍｉｃｒｏｇｅｌを含まないサンプルも同様にインサート内に作成し、各サンプルにおいてＷＳＴ　ａｓｓａｙを行った。実験結果を図１１に示す。Ｍｂ　ｍｉｃｒｏｇｅｌを用いた場合、Ｍｂを含まないｍｉｃｒｏｇｅｌ（Ｍｉｃｒｏｇｅｌ（ｗ／ｏ　Ｍｂ））やｍｉｃｒｏｇｅｌを含まないサンプル（Ｃｅｌｌ　ｏｎｌｙ）と比較して、高い細胞生存が確認された。

Claims

　ヘム構造を有するタンパク質、および刺激に応答して還元力を低下または消失する還元剤を含む、刺激に応答して酸素を放出する系。
　ヘム構造を有するタンパク質がミオグロビンまたはヘモグロビンである、請求項１記載の系。
　還元剤が生体適合性を有するものである、請求項１または２記載の系。
　還元剤がアスコルビン酸、トコフェロール、システイン、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨである、請求項３記載の系。
　刺激が生体組織に受容可能なものである、請求項１~３のいずれか１項記載の系。
　刺激が温度変化、光照射、ｐＨ変化または薬剤によるものである、請求項１~５のいずれか１項記載の系。
　請求項１~６のいずれか１項記載の系を含む細胞培養容器。
　請求項１~６のいずれか１項記載の系を含む人工三次元組織。
　請求項１~６のいずれか１項記載の系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、細胞培養方法。
　請求項１~６のいずれか１項記載の系に刺激を与えて酸素を放出させることを含む、人工三次元組織の製造方法。