JP2004508821A - バイオリアクター装置 - Google Patents
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Abstract
本発明はバイオリアクター装置および生細胞の培養方法を提供する。内部に生細胞が付着固定されている多孔性発泡体材料のマトリックスを含有する保持容器と保持容器中に含有された液体を含む装置。前記液体は酸素キャリヤーであり、マトリックスに行き渡り、合成または半合成の成分を含む。本発明の方法によれば、酸素キャリヤー液がマトリックスを通って灌流することにより細胞に酸素を届け細胞から二酸化炭素を吸収する。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオリアクター装置に関する。本発明はまた生細胞を培養する方法に関する。
【０００２】
【課題を解決する手段】
本発明によれば、連続気泡発泡体材料（ｏｐｅｎ−ｃｅｌｌ ｆｏａｍ ｍａｔｅｒｉａｌ）の三次元マトリックスを収容する保持容器を備えたバイオリアクター装置であって、発泡体材料は多孔性の内部を有しておりその多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含み、さらに保持容器内に液体を含有し、前記液体は酸素のキャリヤーであって、マトリックスに浸透し行き渡り、かつ少なくとも部分的に合成または半合成の酸素担持成分を含有するバイオリアクター装置が提供される。
【０００３】
合成とは酸素担持成分が生物学的プロセスではなく人工的プロセスにより作られることを意味しており、半合成とはその成分が生物学的に生産された出発物質から人工的に合成されることを意味している。
【０００４】
連続気泡発泡体材料は生体適合性かつ生体安定性であるような重合体発泡体材料であればよい。従って、発泡体材料は、ポリウレタンポリマー、ポリ塩化ビニルポリマー、ポリエチレンポリマー、ポリプロピレンポリマー、ポリスチレンポリマー、これらの共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）ポリマー、ポリアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレン）アジポアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレンセバカミド）ポリマー、ポリカプロラクトンポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリマー、ポリ（ブチレンテレフタレート）ポリマー、ポリカーボネートポリマー、ポリアセタールポリマー、ポリビニルアルコールポリマー、尿素ホルムアルデヒドポリマー、フッ素含有ポリマー、シリコン含有ポリマーおよび前記ポリマーおよび共重合体の混合物からなる群から選択されるポリマーの発泡体等である。
【０００５】
マトリックスは、発泡体粒子の充填層としてもよいし流動層としてもよい。しかし、好ましくは、マトリックスは単一または一体的な発泡体材料の連続塊とする。
【０００６】
生細胞は動物細胞、特に哺乳動物細胞であり、酸素キャリヤー液は二酸化炭素担体としても機能する血液代替物を形成する。使用に際しては、以下に詳述するように、酸素キャリヤー液をバイオリアクター装置およびこの装置中のマトリックスを通して灌流し、そこで生細胞が酸素キャリヤー液から酸素を吸収し、かつ酸素キャリヤー液が細胞で作られた二酸化炭素を吸収する。このように酸素キャリヤー液は酸素を運ぶという重要な機能を有しているものの、これは唯一の機能ではなく、二酸化炭素担体としても作用し、また、後述するようにその他の機能も有している。一層詳しく言えば、酸素キャリヤー液は水性液体からなり、酸素キャリヤー液は合成または半合成の酸素担持成分として、無細胞ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、リポソーム被包ヘモグロビンおよびペルフルオロカーボン、好ましくはペルフルオロカーボンからなる群から選択される少なくとも一種を有してもよい。合成または半合成の成分はペルフルオロカーボン等であり、酸素キャリヤー液は有機相と水性相とのエマルジョンであり、有機相が前記ペルフルオロカーボンを含み、典型的には、有機相がエマルジョンの分散相で水性相がエマルジョンの連続相であり、典型的には水性相は血漿を含むものである。あるいは、合成または半合成の成分は血漿などの水性液体に溶解された無細胞ヘモグロビンでもよい。あるいはまた、合成または半合成の成分は、血漿などの水性液体中に懸濁液として懸濁させたリポゾーム被包ヘモグロビンでもよい。このように、酸素キャリヤー液という用語は、これらのエマルジョン、溶液および懸濁液を含むものとして用いており、合成または半合成の成分は血漿などの水性液体中に乳化、溶解または懸濁によって分散させたものである。
【０００７】
保持容器は、高い位置に酸素キャリヤー液入口を有し低い位置に酸素キャリヤー液出口を有する反応槽または容器が適している。すなわち、酸素キャリヤー液出口は酸素キャリヤー液入口よりも低い位置にあって低位酸素キャリヤー液の排出口となる。保持容器はマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節するための温度調節装置（例えば、水などの加熱／冷却液のための入口と出口を有する加熱／冷却ジャケット）を備えていてもよい。この装置は温度調節液を保持容器に対し送りまたこれから取り出して循環させる温度調節液回路の一部をなすものである。この場合、保持容器は保持容器用温度調節装置（内部が空洞の温度調節ジャケットの形態を取る。）を備えており、ジャケットは温度調節液用の入口および出口を有しており、温度調節回路は、温度調節液を温度調節回路を通って回るように循環させるための液体循環装置、サーモスタット、および保持容器から離れた場所にあってサーモスタットからの信号に反応して作動し温度調節液の温度制御を行ないマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節する伝熱装置を含む。あるいは、装置ないし設備全体を温度調節された環境の中に収容してもよい。
【０００８】
バイオリアクター装置は、携帯用器具の一部としてもよいし固定設備の一部としてもよく、こうした器具や設備も本発明の範囲に含まれる。このような器具や設備において、バイオリアクター装置は、酸素キャリヤー液を保持容器中へ、例えばその入口を通して送り込み、生細胞が固定されているマトリックスを通り、そして保持容器から、例えばその出口を通して循環させるように構成された酸素キャリヤー液循環回路の一部としてもよい。この装置や設備はまた、必要に応じて吸収カラムまたはイオン交換ユニットなどの毒素除去装置を具備してもよい。
【０００９】
酸素キャリヤー液循環回路は、酸素キャリヤー液を回路を通って循環させるためのポンプなどの液体循環装置、保持容器から流出する酸素キャリヤー液からバイオマスを除去するためのフィルターなどのバイオマス除去装置、酸素キャリヤー液中の合成または半合成成分をその他の成分から分離するための分離装置、二酸化炭素を酸素キャリヤー液から除去するための二酸化炭素除去装置、酸素キャリヤー液を酸素化するための酸素化装置および酸素キャリヤー液を脱気するための脱気装置から構成される群から選択される少なくとも一個の装置を有することができる。特に具体例を挙げれば、循環回路は前記群の複数の装置を含み、これらの装置は保持容器で始まり、１つのバイオマス除去装置、１つの分離装置、１つの二酸化炭素除去装置、１つの酸素化装置、１つの脱気装置および１つの液体循環装置の順で配置され、液体循環装置に続けて前記保持容器を設けることにより回路が無限回路または閉回路となるように構成することができる。液体循環装置は、前記群の各装置がこの順序で連なるような方向に酸素キャリヤー液を回路を通って循環させるように構成すればよい。このような場合において酸素キャリヤー液がその合成成分として血漿などの水性液体で乳化されたのようなペルフルオロカーボンを含有しているエマルジョンであるときは、ペルフルオロカーボンは血漿から、また何らかの増殖培地が含まれる場合にはそれから、必要であればエマルジョンを破壊した後に、分離装置によって物理的に、例えば遠心分離または濾過により分離する。しかし、他の合成成分、例えば無細胞ヘモグロビンまたはリポソーム被包ヘモグロビンを用いてもよいし、対象とする合成酸素キャリヤー成分に適したその他の分離技術を用いることもできる。この分離装置のさらなる機能はそれが血漿循環回路の液体貯槽として機能し得る点である。前に示したように、血漿循環回路は上に挙げた装置のすべてを含んでおり、この場合、各装置は回路の流れに沿って上記の順序で続き、さらに、バイオリアクター装置のすぐ上流にポンプが、バイオリアクター装置のすぐ下流にバイオマスフィルターが配置される。すなわち、前記流れの方向に沿って見ると、バイオリアクター装置から始まって順にバイオマス除去装置、分離装置、二酸化炭素除去装置、酸素化装置、脱気装置およびポンプを含む順であり、バイオリアクター装置はポンプの後に続く。二酸化炭素除去装置および酸素化装置は場合によっては単一の装置にしてもよい。
【００１０】
上述のように、本発明の装置または設備は、加熱／冷却液を加熱／冷却ジャケットを通って循環させるための加熱／冷却液回路を含んでおり、この回路は必要に応じてポンプなどそれ自体の液体循環装置を有してもよい。また、ジャケット中にサーモスタットを設けてもよく、さらに、バイオリアクター装置から離れてかつサーモスタットからの信号に反応して作用する液体加熱／冷却手段を含んでもよい。サーモスタットは熱電対にプログラム制御可能な論理コントローラーを接続してなるものが適当である。
【００１１】
本発明の器具または装置は、例えばヒト患者または動物から血液を受け入れあるいは取り出して、血液を血漿循環回路に接触するように循環させ血漿などの血液成分を酸素キャリヤー液に送達したり、酸素キャリヤー液などの水性成分を受け入れあるいは取り出してからそれらを患者に戻すための血液循環回路を有してもよい。この血液循環回路は、血液および血液成分を血液循環回路を通って回るように循環させるためのポンプなどの液体循環装置；患者からの血液を血液細胞を含まない血漿分画と血液細胞および血漿の残部を含有する血液細胞含有分画とに分けるための血漿分離装置；および脱気装置を含んでもよい。血漿分離装置は必要に応じて血液フィルターのような装置をさらに含んでもよい。血液循環回路の部分を形成する装置の配列は、回路を通って回る液体の流れの方向に沿って上記の順序となるようにする。このように患者から発し、最初の装置としてポンプが、次いで順に血漿分離装置および脱気装置が続き、前記脱気装置の後に患者に続く。すなわち、酸素キャリヤー液循環回路は血液循環回路に連結し、後者は血液を酸素キャリヤー液循環回路中で酸素キャリヤー液に接触するように循環させ、細胞を含まない血液成分を酸素キャリヤー液回路に届け、そして酸素キャリヤー液回路から細胞を含まない酸素キャリヤー液の水性成分を受け入れあるいは取り出すためのものであり、血液を血液循環回路を通って回るように循環させるための血液循環装置、血液循環回路を通って循環する血液を無細胞血漿分画と血液細胞と若干の血漿を含有している血液細胞含有分画に分離するための血漿分離装置、および血液循環回路を通って循環する血液を脱気するための脱気装置を含んでいる。上に示したように、血液循環回路における装置類は、血液循環装置から順に血漿分離装置および脱気装置が続く順に配されており、血液循環装置は、血液循環回路の装置類が前記順に連なる方向に血液を血液循環回路を通って循環させるべく構成されている。
【００１２】
血漿分離装置は、血漿分離装置が患者の血液を血漿循環回路に、好ましくは血漿循環回路の脱気装置の下流、かつポンプとバイオリアクター装置の上流位置でつながるように血漿循環回路に連結され、血漿循環回路の分離装置は、分離装置が酸素キャリヤー液から血液循環回路へと分離して送られた水性液体を好ましくは血漿分離装置の下流および血液循環回路の脱気装置の上流で供給するように血液循環回路に連結してもよい。すなわち、酸素液循環回路と血液循環回路間の結合は酸素キャリヤー液循環回路と血液循環回路の血漿分離装置との間の結合とすることができる。
【００１３】
本発明の器具または装置は、好ましくは１つ以上の栄養分補充フローライン、酸素キャリヤー液補充フローラインおよび酸素供給ライン（この酸素供給ラインは酸素または酸素と二酸化炭素などの他のガスの混合物を供給するためである）を含んでもよい。これらはそれぞれ血漿循環回路の酸素化装置に供給ラインとして接続する。また、本発明の器具または装置は、二酸化炭素除去装置から、かつこれと連結して二酸化炭素を回収するための１以上の真空ラインと、バイオマス除去装置により酸素キャリヤー液から除去されたバイオマスを廃棄すべく放出するためにバイオマス除去装置に連結したバイオマスフローラインを含んでいる。この装置はまた、血液調整物質を血漿回路中に供給して、例えばｐＨを制御したり他の化学的な不均衡を是正する血液調整供給ラインを含んでもよく、これは好ましくは酸素化装置への供給ラインとして接続する。
【００１４】
本発明は生細胞を培養する方法も含む。この方法は、合成または半合成の酸素担持成分を少なくとも部分的に含む酸素キャリヤーである液体を、多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含む連続気泡発泡体材料のマトリックスを通して灌流させることを含む。ここで、細胞は液体から酸素と栄養分を吸収し、液体は細胞から二酸化炭素と他の代謝産物を吸収する。
【００１５】
本発明のバイオリアクター装置は、より詳しくは前述した通りであり、酸素キャリヤー液については本発明の器具または装置に関連して前述した通りである。もちろん、生細胞は栄養分などの酸素以外の酸素キャリヤー液の成分を吸収するであろうし、酸素キャリヤー液は二酸化炭素以外の細胞の代謝産物を吸収するであろう。
【００１６】
本発明のバイオリアクター装置は、ここに記載したような器具または装置の一部とし、保持容器内のマトリックスを通って液体を血漿循環回路に循環させることによりマトリックスを通して液体の灌流を行なってもよい。本発明の方法は、バイオリアクター装置の保持容器内のマトリックスと内部の温度を監視し、かつ適当な流速と温度で加熱／冷却液を加熱／冷却液回路に沿って循環させることにより、保持容器内のマトリックスと内部の温度を所望範囲内の値に維持制御する工程；
バイオマスフィルターにより酸素キャリヤー液からバイオマスを濾過し、そしてそれをバイオマスフローラインに沿って廃棄すべく放出する工程；
分離装置中で酸素キャリヤー液を血漿相などの水性相と有機ポリフルオロカーボン相などの合成成分含有相に分離する一方で、分離された合成成分含有相を血漿循環回路に沿って供給し、かつ分離された水性相を血液循環回路中に供給する工程；
二酸化炭素を二酸化炭素除去装置により酸素キャリヤー液から除去し、除去した二酸化炭素は真空ラインに沿って二酸化炭素除去装置から取り出す工程；および
酸素化装置中で酸素キャリヤー液を酸素化し、そして必要であれば酸素化装置中で栄養分補給、酸素キャリヤー液補給を行なうとともに血液調整物質を酸素キャリヤー液中に供給する工程の中から１以上を必要に応じて含み、血漿循環回路中の脱気装置で酸素キャリヤー液を脱気し、酸素キャリヤー液をポンプにより血漿循環回路を通って回るように循環させる方法である。
【００１７】
特に、酸素キャリヤー液は血漿の形で水性成分からなるものでもよい。この場合、液体を酸素キャリヤー液循環回路に沿って、かつマトリックスを通って循環させることによりマトリックスを通って液体を灌流させることができる。また、本発明の方法は、マトリックスと酸素キャリヤー液の温度を調節する工程を含みマトリックスと酸素キャリヤー液の温度を所望範囲の値に維持している。さらに、この例では、本発明の方法は酸素キャリヤー液循環回路を通って循環している酸素キャリヤー液からバイオマスを除去し、かつ除去したバイオマスを廃棄すべく放出する工程を含んでもよい。本発明の方法はまた、酸素キャリヤー液回路を通って循環している酸素キャリヤー液を水性相と半合成または合成の酸素担持成分含有相に分離する工程を含んでもよい。水性相は実質的に前記酸素担持成分を含んでおらず、本発明の方法は分離された半合成または合成の成分含有相を酸素キャリヤー液循環回路に保持し、そして分離された水性相を酸素キャリヤー液循環回路に連結した血液循環回路中に供給することを含んでいる。
【００１８】
本発明の方法は患者の血液を処理することを含んでおり、そのために以下の１以上の工程を含んでもよい。
患者から血液、特に静脈血を取り出す工程；
血液を血漿分画と細胞含有分画に分離し、血漿分画は血漿循環回路の酸素キャリヤー液中に供給する一方、細胞含有分画は患者に（以下に述べるように血漿循環回路から分離された血漿相と共に）戻す工程；
細胞含有分画を患者に戻す前に脱気する工程；および
血漿循環回路の分離装置により酸素キャリヤー液から分離された血漿相などの水性相を、好ましくは細胞含有分画について脱気を行なう前に細胞含有分画中に供給することにより患者に供給する工程の中から１以上を含む。
【００１９】
従って、本発明の方法は特に人血の処理方法をも包含し、本発明の方法は血液循環回路から血液を血漿分画と細胞含有分画に分離する工程を含み、血漿分画は酸素キャリヤー液循環回路の酸素キャリヤー液に供給され、そして細胞含有分画は血液循環回路に保持される。この場合、血漿分画と細胞含有分画を互いに分離する操作は、血漿分画は通過するが血液細胞は通過しない半透性障壁により行なうことができる。
【００２０】
本発明の具体的な実施態様、生細胞は肝細胞、例えばヒトまたはブタの肝細胞等である。すなわち、細胞としては初代細胞培養で得られるブタ肝細胞、または肝細胞はＨＵＨ７細胞系または好ましくはＨＥＰ−Ｇ２細胞系などの悪性のまたは変性した細胞系から得られたヒト肝細胞等であり、細胞は必要であれば実質細胞と共培養する。このように、肝細胞としては特にブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ヒヒ肝細胞およびこれらの混合物からなる群から選択することができ、これらの細胞が血液に対し人工的な肝機能を果たすことにより血液を処理できる。
【００２１】
器具および装置が患者に連結した血液循環回路を具備し、かつバイオリアクター装置が生細胞を含む場合、バイオリアクター装置の肝細胞は、好ましくは患者に必要な基本的肝機能の少なくとも２０％、そしてさらに好ましくは少なくとも３０％、そして好ましくはそれ以上を実現し得る量とすべきである。さらに、好ましくは、患者における肝臓の再生や移植を可能にする充分な期間、例えば１４日以上、細胞生存能力および細胞代謝活性を維持するのに適した割合で、酸素および栄養分を肝細胞に供給し二酸化炭素を除去すべきである。特に患者に連結する場合は、器具または装置は好ましくは生体適合的かつ生体安定性であり、好ましくは患者におけるいかなる免疫反応をも最小にすべきである。この点で、本発明のバイオリアクター装置は人工臓器、すなわち患者の正常な肝機能（未知の機能を含み得る）を模倣的に再現できる人工肝臓として機能することが理解されるであろう。一般に、酸素キャリヤー液の灌流を行なうマトリックス中の肝細胞量は、成人に必要な基本的肝機能の少なくとも２０％、好ましくは３０％で実施可能であり、マトリックスを通る酸素キャリヤー液の灌流によって、少なくとも３日、好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも１４日間、細胞の生存能力と代謝活性を維持するのに充分な割合で、酸素化装置により酸素キャリヤー液に酸素を供給し、血漿により栄養分を酸素キャリヤー液に供給し、酸素化装置により酸素キャリヤー液から二酸化炭素を除去し、血漿により酸素キャリヤー液から細胞代謝産物を除去する。
【００２２】
人工肝臓として使用する場合、バイオリアクタ装置内の生細胞に対しては、とりわけ酸素と栄養分を供給し、二酸化酸素およびその他の代謝副産物を生細胞から除去する必要がある。また同時に、生細胞を血液あるいは血漿分画などの分離された血液分画に接触させて、これらから神経毒素および肝毒素を除去したり、向神経性因子および向肝性因子の生産および肝特異性凝固因子の生産など意図した代謝機能を実行させる。この点を考慮して、血漿分離装置は、無細胞液は酸素キャリヤー液中に通過させるが血液由来の細胞が酸素キャリヤー液中に通過することを防ぐような、例えば膜などの半透性障壁を備えてもよい。血漿循環回路のバイオマスフィルターと分離装置についても同様に考えることができ、例えば、酸素キャリヤー液の合成成分の大半を分離した後に水性無細胞液を血液循環回路に再度加える半透性障壁を備えてもよい。もちろん、これらの代わりに遠心分離機などの他の分離装置を使用することもできる。
【００２３】
肝細胞などの肝臓細胞は適当な三次元マトリックスに接着固定することによりその成長と細胞分裂が促進され、かつ代謝性肝機能に関してそれらの機能性を高めるという点で付着依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）である。本発明の連続気泡発泡体マトリックスは、三次元マトリックスにおいて、それに許容可能なかたちで細胞が接着し固定されるために適当な領域を提供し、接着固定は細胞自体によってなされる。しかし、もし細胞をその場所に適当に固定することができず、あるいは付着固定性が改善されるべき場合は、細胞を多孔性または透過性の重合体コーティングで被包し、このコーティングをマトリックスと接着させるかまたはこれと一体化してもよい。あるいは、発泡体自体をコラーゲンなど接着固定性を高める物質でコーティングしてもよい。
【実施例】
【００２４】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施例によって説明するが、これは本発明を限定するものではない。なお、添付図面は１図面であるが、これは本発明に基づく装置の模式的な流れ図である。
【００２５】
図中、参照番号１０は本発明に基づく非携帯型の装置を概括的に示している。装置１０の主要部はバイオリアクター装置１２であり、これは加熱／冷却ジャケット１６を備え、生体適合性かつ生体安定性である連続気泡発泡体ポリウレタンフォームマトリックス（符号１８で指示する網掛け部分）を含む反応容器またはタンク１４の形状の保持容器を有している。発泡体はそのセル内に約２．５×１０１１個の細胞、すなわち平均的成人の肝臓の細胞数の２０〜３０％の標準量のヒト肝細胞（図示せず）を含んでいる。ジャケット１６は水を加熱／冷却するため、低い位置の加熱／冷却水入口フローライン２０と高い位置の出口フローライン２２を有することが示される。フローライン２０と２２は、加熱／冷却水供給部（図示せず）に連結しており、この加熱／冷却水はポンプ（図示せず）により一定の速度および／または温度でジャケット１６を通って循環しており、容器１４に付設するかその内部に設けたサーモスタット（これも図示せず）により制御され、これにより容器１４内の温度を望ましい値（すなわちヒト肝臓では３７℃）に維持する。
【００２６】
バイオリアクター装置１２は、高い位置に液体入口を有しており、６００ｍｌ／分、好ましくは１００〜２５０ｍｌ／分の流速でフローライン２６に沿ってポンプ２４の送出作用により液体が供給されている。また、装置１２は低い位置に液出口を有し、これはフローライン２８に沿ってバイオマスフィルター３０に通じている。バイオマスフィルター３０は、フィルター膜３２およびバイオマスフローライン３２に廃棄物を送るバイオマス出口、および濾液フローライン３６に沿って分離装置３８に濾液を送る濾液出口を有する。装置３８は、後述するようにペルフルオロカーボン合成酸素キャリヤー液成分が用いられる場合に、エマルジョンの液相を互いに、すなわちペルフルオロカーボン液相から水性液体相を分離するためのものである。無細胞ヘモグロビンを溶解させたりあるいはリポソーム被包ヘモグロビンを懸濁させるなど他の合成酸素キャリヤー液成分を用いる場合には、当然ながら他の分離技術を用いた分離装置が使用されることになる。
【００２７】
分離装置３８は相分離膜４０を有しており、一対の出口、すなわちペルフルオロカーボンフローライン４２（これは二酸化炭素除去装置４４につながる）に続くペルフルオロカーボン相出口および水性または血漿相フローライン４６（これはペルフルオロカーボン脱気装置４８につながる）に続く水性または血漿相出口を有している。装置４４は、液体フローライン５０（これは酸素化装置５２につながる）に続く液出口および二酸化炭素真空フローライン５４（これは真空ポンプ（図示せず）につながる）に続く二酸化炭素ガス出口を有している。
【００２８】
酸素化装置５２は栄養分溶液供給ライン５６と有機相補充フローライン５８から供給を受け、また、酸素ガス供給ライン６０からも供給を受ける。装置５２は液体フローライン６２に続く液出口を有しており、液体フローライン６２は脱気装置６４につながり、これはフローライン６６に続く液出口を有する。また、フローライン６６はポンプ２４の入口につながっている。装置５２には血液調整供給ライン（図示せず）が接続してもよく、これは血液調整物質の供給を受けて装置内の液体に加えることができる。
【００２９】
ポンプ２４、バイオリアクター１２、フィルター３０、分離装置３８、二酸化炭素除去装置４４、酸素化装置５２および脱気装置６４およびこれらに互いに連結しているフローラインは全体で血漿循環回路を形成している。
【００３０】
装置１０はさらに半透膜７０を有する血漿分離装置６８を含む。装置６８は、分離装置３８と脱気装置４８の間に、血漿フローライン７２（これはライン６６につながる）に続く血漿出口と液体フローライン７４（これはライン４６につながる）に続く細胞含有全血液出口を有する。血漿分離装置６８はライン７８に沿ってポンプ７６からの供給を受ける。
【００３１】
最後に、血液供給ライン８０はポンプ７６の入口に続くことが示されている。一方、脱気装置４８は血液復帰ライン８２に続く出口を有することが示されており、ライン８０およびライン８２はそれぞれ患者（図示せず）の静脈系から、また、患者の静脈系に連結している。ポンプ７６、分離装置６８および脱気装置４８は、患者およびこれらに互いに連結しているフローラインは全体で血液循環回路を形成している。
【００３２】
本発明の方法によれば、ライン８０に沿ってポンプ７６により＜４００ｍｌ／分、好ましくは１５０〜２５０ｍｌ／分の流速で患者から連続的に静脈血を取り出し、ライン７８に沿って分離装置６８にポンプで送出し、そこで全血液分画と血漿分画に分離する。血漿分画は８４においてライン６６と会合するライン７２に沿って＜２００ｍｌ／分、好ましくは５０〜１５０ｍｌ／分の流速で装置６８から流出し、全血液分画は８６においてライン４６と会合するライン７４に沿って＜２００ｍｌ／分、好ましくは５０〜１５０ｍｌ／分の流速で流出する。装置６４を離れたライン６６は好適なペルフルオロカーボン、すなわちペルフルオロオクチルブロミドを含むペルフルオロカーボン相を１０〜６０％の容積濃度で含有する。装置６８から出た血漿は、装置６４からライン６６に流出するペルフルオロカーボンを含む事前に調製されたエマルジョンと混合する。このエマルジョンは乳化剤として卵黄レシチンを含み、その分散相としてペルフルオロカーボンを有しており、かつこのエマルジョンは容器１４の頂部に入れる。
【００３３】
容器１４において、エマルジョンはマトリックス１８を通ってマトリックス中をその内部に固定された生肝細胞と接触しながら下降灌流する。ジャケット１６へのライン２０およびジャケット１６からのライン２２を通る水流は、マトリックス中のエマルジョンの温度を実質的に３７℃に制御する。肝細胞はエマルジョンから酸素と栄養分を吸収し、そしてエマルジョンは肝細胞から二酸化炭素と他の代謝産物を吸収する。エマルジョンは装置１２を出てライン２８に沿ってバイオマスフィルター３０に流れる。
【００３４】
フィルター３０において、エマルジョンはこれからバイオマスを除去するために濾過され、濾過されたバイオマスはライン３４に沿ってフィルター３０から流出して廃棄される。濾過されたエマルジョンはフィルター３０からライン３６に沿って分離装置３８に流出し、そこでエマルジョンは水性相または血漿相とペルフルオロカーボン相に分離される。ペルフルオロカーボン相は装置３８からフローライン４２に沿って二酸化炭素除去装置４４に向かい、水性相または血漿相は装置３８からフローライン４６に沿って脱気装置４８に向かう。水性相または血漿相は装置４８の上流８６においてライン７４からの全血を受け入れる。前記全血および前記水性相または血漿相からなる血液は脱気装置４８中で脱気し、ライン８２を通して患者の静脈系に戻す。
【００３５】
装置４４において、二酸化炭素を真空下に除去し、ライン５４を通して放出され、ペルフルオロカーボン相は装置４４からライン５０に沿って酸素化装置５２に向かう。もちろん、二酸化炭素は他の技術によって除去してもよい。
【００３６】
酸素化装置５２において、ペルフルオロカーボン相は、ライン５６を通じて栄養分を、ライン５８を通じてペルフルオロカーボンの補充を受け、ライン６０を通じて酸素が供給される。ペルフルオロカーボン相は装置５２からライン６２に沿って装置６４に向かい、そこで脱気される。また、ｐＨ調整物質のような血液調整物質をそのための供給ライン（図示せず）から装置５２のペルフルオロカーボン相に供給してもよい。
【００３７】
分離装置６８は免疫担当血液細胞が酸素キャリヤー液に混入するのを防止するように機能し、患者からの免疫担当細胞がバイオリアクターシステム中の異種細胞と接触した際に免疫が活性化される可能性を減少させる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の一つの特徴は、血液循環回路から血漿担体循環回路を分離することにより、患者から血液を連続的に取り出す速度よりも速い速度で、酸素キャリヤー液をバイオリアクター装置内に循環できるようにした点である。この点で、分離装置３８は酸素キャリヤー液用の貯槽としても機能し得る。別の特徴としては、各種装置やフローラインを適切に断熱し、あるいは適当な加熱および／または冷却により温度調節することにより、装置内の液体を始めから終わりまでできる限り３７℃に近い温度に維持する点である。
【００３９】
特に図面を参照して例示し説明したように、本発明による有利な特徴の一つは、肝細胞をその代謝活性を維持しつつ１４日以上もの間生存可能とした点にある。細胞は、向神経性因子、向肝性因子および肝臓特異性凝固因子を生産しながら、かつその他の肝代謝活性を果たしながら、神経毒素と肝毒素を患者の血液から除去することができる。装置が充分な数の肝細胞、例えば患者の肝臓中における同種の細胞数の２０％以上を含有していれば、患者の肝臓が再生するかまたは肝臓移植ができるまでのつなぎ期間、患者を存命させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に基づく装置の模式的な流れ図。
【符号の簡単な説明】
１０ 装置
１２ バイオリアクター装置
１４ 容器
１６ 冷却ジャケット
１８ マトリックス
２０ 冷却水入口フローライン
２２ 出口フローライン
２４ ポンプ
２６、２８ フローライン
３０ バイオマスフィルター
３２ バイオマスフローライン
３４、３６ ライン
３８ 分離装置
４０ 相分離膜
４２ ペルフルオロカーボンフローライン
４４ 二酸化炭素除去装置
４６ 血漿相フローライン
４８ ペルフルオロカーボン脱気装置
５０ 液体フローライン
５２ 酸素化装置
５４ 二酸化炭素真空フローライン
５６ 栄養分溶液供給ライン
５８ 有機相補充フローライン
６０ 酸素ガス供給ライン
６２ 液体フローライン
６４ 脱気装置
６６ フローライン
６８ 血漿分離装置
７０ 半透膜
７２ 血漿フローライン
７４ 液体フローライン
７６ ポンプ
７８ ライン
８０ 血液供給ライン
８２ 血液復帰ライン
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオリアクター装置に関する。本発明はまた生細胞を培養する方法に関する。
【０００２】
【課題を解決する手段】
本発明によれば、連続気泡発泡体材料（ｏｐｅｎ−ｃｅｌｌ ｆｏａｍ ｍａｔｅｒｉａｌ）の三次元マトリックスを収容する保持容器を備えたバイオリアクター装置であって、発泡体材料は多孔性の内部を有しておりその多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含み、さらに保持容器内に液体を含有し、前記液体は酸素のキャリヤーであって、マトリックスに浸透し行き渡り、かつ少なくとも部分的に合成または半合成の酸素担持成分を含有するバイオリアクター装置が提供される。
【０００３】
合成とは酸素担持成分が生物学的プロセスではなく人工的プロセスにより作られることを意味しており、半合成とはその成分が生物学的に生産された出発物質から人工的に合成されることを意味している。
【０００４】
連続気泡発泡体材料は生体適合性かつ生体安定性であるような重合体発泡体材料であればよい。従って、発泡体材料は、ポリウレタンポリマー、ポリ塩化ビニルポリマー、ポリエチレンポリマー、ポリプロピレンポリマー、ポリスチレンポリマー、これらの共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）ポリマー、ポリアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレン）アジポアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレンセバカミド）ポリマー、ポリカプロラクトンポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリマー、ポリ（ブチレンテレフタレート）ポリマー、ポリカーボネートポリマー、ポリアセタールポリマー、ポリビニルアルコールポリマー、尿素ホルムアルデヒドポリマー、フッ素含有ポリマー、シリコン含有ポリマーおよび前記ポリマーおよび共重合体の混合物からなる群から選択されるポリマーの発泡体等である。
【０００５】
マトリックスは、発泡体粒子の充填層としてもよいし流動層としてもよい。しかし、好ましくは、マトリックスは単一または一体的な発泡体材料の連続塊とする。
【０００６】
生細胞は動物細胞、特に哺乳動物細胞であり、酸素キャリヤー液は二酸化炭素担体としても機能する血液代替物を形成する。使用に際しては、以下に詳述するように、酸素キャリヤー液をバイオリアクター装置およびこの装置中のマトリックスを通して灌流し、そこで生細胞が酸素キャリヤー液から酸素を吸収し、かつ酸素キャリヤー液が細胞で作られた二酸化炭素を吸収する。このように酸素キャリヤー液は酸素を運ぶという重要な機能を有しているものの、これは唯一の機能ではなく、二酸化炭素担体としても作用し、また、後述するようにその他の機能も有している。一層詳しく言えば、酸素キャリヤー液は水性液体からなり、酸素キャリヤー液は合成または半合成の酸素担持成分として、無細胞ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、リポソーム被包ヘモグロビンおよびペルフルオロカーボン、好ましくはペルフルオロカーボンからなる群から選択される少なくとも一種を有してもよい。合成または半合成の成分はペルフルオロカーボン等であり、酸素キャリヤー液は有機相と水性相とのエマルジョンであり、有機相が前記ペルフルオロカーボンを含み、典型的には、有機相がエマルジョンの分散相で水性相がエマルジョンの連続相であり、典型的には水性相は血漿を含むものである。あるいは、合成または半合成の成分は血漿などの水性液体に溶解された無細胞ヘモグロビンでもよい。あるいはまた、合成または半合成の成分は、血漿などの水性液体中に懸濁液として懸濁させたリポゾーム被包ヘモグロビンでもよい。このように、酸素キャリヤー液という用語は、これらのエマルジョン、溶液および懸濁液を含むものとして用いており、合成または半合成の成分は血漿などの水性液体中に乳化、溶解または懸濁によって分散させたものである。
【０００７】
保持容器は、高い位置に酸素キャリヤー液入口を有し低い位置に酸素キャリヤー液出口を有する反応槽または容器が適している。すなわち、酸素キャリヤー液出口は酸素キャリヤー液入口よりも低い位置にあって低位酸素キャリヤー液の排出口となる。保持容器はマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節するための温度調節装置（例えば、水などの加熱／冷却液のための入口と出口を有する加熱／冷却ジャケット）を備えていてもよい。この装置は温度調節液を保持容器に対し送りまたこれから取り出して循環させる温度調節液回路の一部をなすものである。この場合、保持容器は保持容器用温度調節装置（内部が空洞の温度調節ジャケットの形態を取る。）を備えており、ジャケットは温度調節液用の入口および出口を有しており、温度調節回路は、温度調節液を温度調節回路を通って回るように循環させるための液体循環装置、サーモスタット、および保持容器から離れた場所にあってサーモスタットからの信号に反応して作動し温度調節液の温度制御を行ないマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節する伝熱装置を含む。あるいは、装置ないし設備全体を温度調節された環境の中に収容してもよい。
【０００８】
バイオリアクター装置は、携帯用器具の一部としてもよいし固定設備の一部としてもよく、こうした器具や設備も本発明の範囲に含まれる。このような器具や設備において、バイオリアクター装置は、酸素キャリヤー液を保持容器中へ、例えばその入口を通して送り込み、生細胞が固定されているマトリックスを通り、そして保持容器から、例えばその出口を通して循環させるように構成された酸素キャリヤー液循環回路の一部としてもよい。この装置や設備はまた、必要に応じて吸収カラムまたはイオン交換ユニットなどの毒素除去装置を具備してもよい。
【０００９】
酸素キャリヤー液循環回路は、酸素キャリヤー液を回路を通って循環させるためのポンプなどの液体循環装置、保持容器から流出する酸素キャリヤー液からバイオマスを除去するためのフィルターなどのバイオマス除去装置、酸素キャリヤー液中の合成または半合成成分をその他の成分から分離するための分離装置、二酸化炭素を酸素キャリヤー液から除去するための二酸化炭素除去装置、酸素キャリヤー液を酸素化するための酸素化装置および酸素キャリヤー液を脱気するための脱気装置から構成される群から選択される少なくとも一個の装置を有することができる。特に具体例を挙げれば、循環回路は前記群の複数の装置を含み、これらの装置は保持容器で始まり、１つのバイオマス除去装置、１つの分離装置、１つの二酸化炭素除去装置、１つの酸素化装置、１つの脱気装置および１つの液体循環装置の順で配置され、液体循環装置に続けて前記保持容器を設けることにより回路が無限回路または閉回路となるように構成することができる。液体循環装置は、前記群の各装置がこの順序で連なるような方向に酸素キャリヤー液を回路を通って循環させるように構成すればよい。このような場合において酸素キャリヤー液がその合成成分として血漿などの水性液体で乳化されたのようなペルフルオロカーボンを含有しているエマルジョンであるときは、ペルフルオロカーボンは血漿から、また何らかの増殖培地が含まれる場合にはそれから、必要であればエマルジョンを破壊した後に、分離装置によって物理的に、例えば遠心分離または濾過により分離する。しかし、他の合成成分、例えば無細胞ヘモグロビンまたはリポソーム被包ヘモグロビンを用いてもよいし、対象とする合成酸素キャリヤー成分に適したその他の分離技術を用いることもできる。この分離装置のさらなる機能はそれが血漿循環回路の液体貯槽として機能し得る点である。前に示したように、血漿循環回路は上に挙げた装置のすべてを含んでおり、この場合、各装置は回路の流れに沿って上記の順序で続き、さらに、バイオリアクター装置のすぐ上流にポンプが、バイオリアクター装置のすぐ下流にバイオマスフィルターが配置される。すなわち、前記流れの方向に沿って見ると、バイオリアクター装置から始まって順にバイオマス除去装置、分離装置、二酸化炭素除去装置、酸素化装置、脱気装置およびポンプを含む順であり、バイオリアクター装置はポンプの後に続く。二酸化炭素除去装置および酸素化装置は場合によっては単一の装置にしてもよい。
【００１０】
上述のように、本発明の装置または設備は、加熱／冷却液を加熱／冷却ジャケットを通って循環させるための加熱／冷却液回路を含んでおり、この回路は必要に応じてポンプなどそれ自体の液体循環装置を有してもよい。また、ジャケット中にサーモスタットを設けてもよく、さらに、バイオリアクター装置から離れてかつサーモスタットからの信号に反応して作用する液体加熱／冷却手段を含んでもよい。サーモスタットは熱電対にプログラム制御可能な論理コントローラーを接続してなるものが適当である。
【００１１】
本発明の器具または装置は、例えばヒト患者または動物から血液を受け入れあるいは取り出して、血液を血漿循環回路に接触するように循環させ血漿などの血液成分を酸素キャリヤー液に送達したり、酸素キャリヤー液などの水性成分を受け入れあるいは取り出してからそれらを患者に戻すための血液循環回路を有してもよい。この血液循環回路は、血液および血液成分を血液循環回路を通って回るように循環させるためのポンプなどの液体循環装置；患者からの血液を血液細胞を含まない血漿分画と血液細胞および血漿の残部を含有する血液細胞含有分画とに分けるための血漿分離装置；および脱気装置を含んでもよい。血漿分離装置は必要に応じて血液フィルターのような装置をさらに含んでもよい。血液循環回路の部分を形成する装置の配列は、回路を通って回る液体の流れの方向に沿って上記の順序となるようにする。このように患者から発し、最初の装置としてポンプが、次いで順に血漿分離装置および脱気装置が続き、前記脱気装置の後に患者に続く。すなわち、酸素キャリヤー液循環回路は血液循環回路に連結し、後者は血液を酸素キャリヤー液循環回路中で酸素キャリヤー液に接触するように循環させ、細胞を含まない血液成分を酸素キャリヤー液回路に届け、そして酸素キャリヤー液回路から細胞を含まない酸素キャリヤー液の水性成分を受け入れあるいは取り出すためのものであり、血液を血液循環回路を通って回るように循環させるための血液循環装置、血液循環回路を通って循環する血液を無細胞血漿分画と血液細胞と若干の血漿を含有している血液細胞含有分画に分離するための血漿分離装置、および血液循環回路を通って循環する血液を脱気するための脱気装置を含んでいる。上に示したように、血液循環回路における装置類は、血液循環装置から順に血漿分離装置および脱気装置が続く順に配されており、血液循環装置は、血液循環回路の装置類が前記順に連なる方向に血液を血液循環回路を通って循環させるべく構成されている。
【００１２】
血漿分離装置は、血漿分離装置が患者の血液を血漿循環回路に、好ましくは血漿循環回路の脱気装置の下流、かつポンプとバイオリアクター装置の上流位置でつながるように血漿循環回路に連結され、血漿循環回路の分離装置は、分離装置が酸素キャリヤー液から血液循環回路へと分離して送られた水性液体を好ましくは血漿分離装置の下流および血液循環回路の脱気装置の上流で供給するように血液循環回路に連結してもよい。すなわち、酸素液循環回路と血液循環回路間の結合は酸素キャリヤー液循環回路と血液循環回路の血漿分離装置との間の結合とすることができる。
【００１３】
本発明の器具または装置は、好ましくは１つ以上の栄養分補充フローライン、酸素キャリヤー液補充フローラインおよび酸素供給ライン（この酸素供給ラインは酸素または酸素と二酸化炭素などの他のガスの混合物を供給するためである）を含んでもよい。これらはそれぞれ血漿循環回路の酸素化装置に供給ラインとして接続する。また、本発明の器具または装置は、二酸化炭素除去装置から、かつこれと連結して二酸化炭素を回収するための１以上の真空ラインと、バイオマス除去装置により酸素キャリヤー液から除去されたバイオマスを廃棄すべく放出するためにバイオマス除去装置に連結したバイオマスフローラインを含んでいる。この装置はまた、血液調整物質を血漿回路中に供給して、例えばｐＨを制御したり他の化学的な不均衡を是正する血液調整供給ラインを含んでもよく、これは好ましくは酸素化装置への供給ラインとして接続する。
【００１４】
本発明は生細胞を培養する方法も含む。この方法は、合成または半合成の酸素担持成分を少なくとも部分的に含む酸素キャリヤーである液体を、多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含む連続気泡発泡体材料のマトリックスを通して灌流させることを含む。ここで、細胞は液体から酸素と栄養分を吸収し、液体は細胞から二酸化炭素と他の代謝産物を吸収する。
【００１５】
本発明のバイオリアクター装置は、より詳しくは前述した通りであり、酸素キャリヤー液については本発明の器具または装置に関連して前述した通りである。もちろん、生細胞は栄養分などの酸素以外の酸素キャリヤー液の成分を吸収するであろうし、酸素キャリヤー液は二酸化炭素以外の細胞の代謝産物を吸収するであろう。
【００１６】
本発明のバイオリアクター装置は、ここに記載したような器具または装置の一部とし、保持容器内のマトリックスを通って液体を血漿循環回路に循環させることによりマトリックスを通して液体の灌流を行なってもよい。本発明の方法は、バイオリアクター装置の保持容器内のマトリックスと内部の温度を監視し、かつ適当な流速と温度で加熱／冷却液を加熱／冷却液回路に沿って循環させることにより、保持容器内のマトリックスと内部の温度を所望範囲内の値に維持制御する工程；
バイオマスフィルターにより酸素キャリヤー液からバイオマスを濾過し、そしてそれをバイオマスフローラインに沿って廃棄すべく放出する工程；
分離装置中で酸素キャリヤー液を血漿相などの水性相と有機ポリフルオロカーボン相などの合成成分含有相に分離する一方で、分離された合成成分含有相を血漿循環回路に沿って供給し、かつ分離された水性相を血液循環回路中に供給する工程；
二酸化炭素を二酸化炭素除去装置により酸素キャリヤー液から除去し、除去した二酸化炭素は真空ラインに沿って二酸化炭素除去装置から取り出す工程；および
酸素化装置中で酸素キャリヤー液を酸素化し、そして必要であれば酸素化装置中で栄養分補給、酸素キャリヤー液補給を行なうとともに血液調整物質を酸素キャリヤー液中に供給する工程の中から１以上を必要に応じて含み、血漿循環回路中の脱気装置で酸素キャリヤー液を脱気し、酸素キャリヤー液をポンプにより血漿循環回路を通って回るように循環させる方法である。
【００１７】
特に、酸素キャリヤー液は血漿の形で水性成分からなるものでもよい。この場合、液体を酸素キャリヤー液循環回路に沿って、かつマトリックスを通って循環させることによりマトリックスを通って液体を灌流させることができる。また、本発明の方法は、マトリックスと酸素キャリヤー液の温度を調節する工程を含みマトリックスと酸素キャリヤー液の温度を所望範囲の値に維持している。さらに、この例では、本発明の方法は酸素キャリヤー液循環回路を通って循環している酸素キャリヤー液からバイオマスを除去し、かつ除去したバイオマスを廃棄すべく放出する工程を含んでもよい。本発明の方法はまた、酸素キャリヤー液回路を通って循環している酸素キャリヤー液を水性相と半合成または合成の酸素担持成分含有相に分離する工程を含んでもよい。水性相は実質的に前記酸素担持成分を含んでおらず、本発明の方法は分離された半合成または合成の成分含有相を酸素キャリヤー液循環回路に保持し、そして分離された水性相を酸素キャリヤー液循環回路に連結した血液循環回路中に供給することを含んでいる。
【００１８】
本発明の方法は患者の血液を処理することを含んでおり、そのために以下の１以上の工程を含んでもよい。
患者から血液、特に静脈血を取り出す工程；
血液を血漿分画と細胞含有分画に分離し、血漿分画は血漿循環回路の酸素キャリヤー液中に供給する一方、細胞含有分画は患者に（以下に述べるように血漿循環回路から分離された血漿相と共に）戻す工程；
細胞含有分画を患者に戻す前に脱気する工程；および
血漿循環回路の分離装置により酸素キャリヤー液から分離された血漿相などの水性相を、好ましくは細胞含有分画について脱気を行なう前に細胞含有分画中に供給することにより患者に供給する工程の中から１以上を含む。
【００１９】
従って、本発明の方法は特に人血の処理方法をも包含し、本発明の方法は血液循環回路から血液を血漿分画と細胞含有分画に分離する工程を含み、血漿分画は酸素キャリヤー液循環回路の酸素キャリヤー液に供給され、そして細胞含有分画は血液循環回路に保持される。この場合、血漿分画と細胞含有分画を互いに分離する操作は、血漿分画は通過するが血液細胞は通過しない半透性障壁により行なうことができる。
【００２０】
本発明の具体的な実施態様、生細胞は肝細胞、例えばヒトまたはブタの肝細胞等である。すなわち、細胞としては初代細胞培養で得られるブタ肝細胞、または肝細胞はＨＵＨ７細胞系または好ましくはＨＥＰ−Ｇ２細胞系などの悪性のまたは変性した細胞系から得られたヒト肝細胞等であり、細胞は必要であれば実質細胞と共培養する。このように、肝細胞としては特にブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ヒヒ肝細胞およびこれらの混合物からなる群から選択することができ、これらの細胞が血液に対し人工的な肝機能を果たすことにより血液を処理できる。
【００２１】
器具および装置が患者に連結した血液循環回路を具備し、かつバイオリアクター装置が生細胞を含む場合、バイオリアクター装置の肝細胞は、好ましくは患者に必要な基本的肝機能の少なくとも２０％、そしてさらに好ましくは少なくとも３０％、そして好ましくはそれ以上を実現し得る量とすべきである。さらに、好ましくは、患者における肝臓の再生や移植を可能にする充分な期間、例えば１４日以上、細胞生存能力および細胞代謝活性を維持するのに適した割合で、酸素および栄養分を肝細胞に供給し二酸化炭素を除去すべきである。特に患者に連結する場合は、器具または装置は好ましくは生体適合的かつ生体安定性であり、好ましくは患者におけるいかなる免疫反応をも最小にすべきである。この点で、本発明のバイオリアクター装置は人工臓器、すなわち患者の正常な肝機能（未知の機能を含み得る）を模倣的に再現できる人工肝臓として機能することが理解されるであろう。一般に、酸素キャリヤー液の灌流を行なうマトリックス中の肝細胞量は、成人に必要な基本的肝機能の少なくとも２０％、好ましくは３０％で実施可能であり、マトリックスを通る酸素キャリヤー液の灌流によって、少なくとも３日、好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも１４日間、細胞の生存能力と代謝活性を維持するのに充分な割合で、酸素化装置により酸素キャリヤー液に酸素を供給し、血漿により栄養分を酸素キャリヤー液に供給し、酸素化装置により酸素キャリヤー液から二酸化炭素を除去し、血漿により酸素キャリヤー液から細胞代謝産物を除去する。
【００２２】
人工肝臓として使用する場合、バイオリアクタ装置内の生細胞に対しては、とりわけ酸素と栄養分を供給し、二酸化酸素およびその他の代謝副産物を生細胞から除去する必要がある。また同時に、生細胞を血液あるいは血漿分画などの分離された血液分画に接触させて、これらから神経毒素および肝毒素を除去したり、向神経性因子および向肝性因子の生産および肝特異性凝固因子の生産など意図した代謝機能を実行させる。この点を考慮して、血漿分離装置は、無細胞液は酸素キャリヤー液中に通過させるが血液由来の細胞が酸素キャリヤー液中に通過することを防ぐような、例えば膜などの半透性障壁を備えてもよい。血漿循環回路のバイオマスフィルターと分離装置についても同様に考えることができ、例えば、酸素キャリヤー液の合成成分の大半を分離した後に水性無細胞液を血液循環回路に再度加える半透性障壁を備えてもよい。もちろん、これらの代わりに遠心分離機などの他の分離装置を使用することもできる。
【００２３】
肝細胞などの肝臓細胞は適当な三次元マトリックスに接着固定することによりその成長と細胞分裂が促進され、かつ代謝性肝機能に関してそれらの機能性を高めるという点で付着依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）である。本発明の連続気泡発泡体マトリックスは、三次元マトリックスにおいて、それに許容可能なかたちで細胞が接着し固定されるために適当な領域を提供し、接着固定は細胞自体によってなされる。しかし、もし細胞をその場所に適当に固定することができず、あるいは付着固定性が改善されるべき場合は、細胞を多孔性または透過性の重合体コーティングで被包し、このコーティングをマトリックスと接着させるかまたはこれと一体化してもよい。あるいは、発泡体自体をコラーゲンなど接着固定性を高める物質でコーティングしてもよい。
【実施例】
【００２４】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施例によって説明するが、これは本発明を限定するものではない。なお、添付図面は１図面であるが、これは本発明に基づく装置の模式的な流れ図である。
【００２５】
図中、参照番号１０は本発明に基づく非携帯型の装置を概括的に示している。装置１０の主要部はバイオリアクター装置１２であり、これは加熱／冷却ジャケット１６を備え、生体適合性かつ生体安定性である連続気泡発泡体ポリウレタンフォームマトリックス（符号１８で指示する網掛け部分）を含む反応容器またはタンク１４の形状の保持容器を有している。発泡体はそのセル内に約２．５×１０１１個の細胞、すなわち平均的成人の肝臓の細胞数の２０〜３０％の標準量のヒト肝細胞（図示せず）を含んでいる。ジャケット１６は水を加熱／冷却するため、低い位置の加熱／冷却水入口フローライン２０と高い位置の出口フローライン２２を有することが示される。フローライン２０と２２は、加熱／冷却水供給部（図示せず）に連結しており、この加熱／冷却水はポンプ（図示せず）により一定の速度および／または温度でジャケット１６を通って循環しており、容器１４に付設するかその内部に設けたサーモスタット（これも図示せず）により制御され、これにより容器１４内の温度を望ましい値（すなわちヒト肝臓では３７℃）に維持する。
【００２６】
バイオリアクター装置１２は、高い位置に液体入口を有しており、６００ｍｌ／分、好ましくは１００〜２５０ｍｌ／分の流速でフローライン２６に沿ってポンプ２４の送出作用により液体が供給されている。また、装置１２は低い位置に液出口を有し、これはフローライン２８に沿ってバイオマスフィルター３０に通じている。バイオマスフィルター３０は、フィルター膜３２およびバイオマスフローライン３２に廃棄物を送るバイオマス出口、および濾液フローライン３６に沿って分離装置３８に濾液を送る濾液出口を有する。装置３８は、後述するようにペルフルオロカーボン合成酸素キャリヤー液成分が用いられる場合に、エマルジョンの液相を互いに、すなわちペルフルオロカーボン液相から水性液体相を分離するためのものである。無細胞ヘモグロビンを溶解させたりあるいはリポソーム被包ヘモグロビンを懸濁させるなど他の合成酸素キャリヤー液成分を用いる場合には、当然ながら他の分離技術を用いた分離装置が使用されることになる。
【００２７】
分離装置３８は相分離膜４０を有しており、一対の出口、すなわちペルフルオロカーボンフローライン４２（これは二酸化炭素除去装置４４につながる）に続くペルフルオロカーボン相出口および水性または血漿相フローライン４６（これはペルフルオロカーボン脱気装置４８につながる）に続く水性または血漿相出口を有している。装置４４は、液体フローライン５０（これは酸素化装置５２につながる）に続く液出口および二酸化炭素真空フローライン５４（これは真空ポンプ（図示せず）につながる）に続く二酸化炭素ガス出口を有している。
【００２８】
酸素化装置５２は栄養分溶液供給ライン５６と有機相補充フローライン５８から供給を受け、また、酸素ガス供給ライン６０からも供給を受ける。装置５２は液体フローライン６２に続く液出口を有しており、液体フローライン６２は脱気装置６４につながり、これはフローライン６６に続く液出口を有する。また、フローライン６６はポンプ２４の入口につながっている。装置５２には血液調整供給ライン（図示せず）が接続してもよく、これは血液調整物質の供給を受けて装置内の液体に加えることができる。
【００２９】
ポンプ２４、バイオリアクター１２、フィルター３０、分離装置３８、二酸化炭素除去装置４４、酸素化装置５２および脱気装置６４およびこれらに互いに連結しているフローラインは全体で血漿循環回路を形成している。
【００３０】
装置１０はさらに半透膜７０を有する血漿分離装置６８を含む。装置６８は、分離装置３８と脱気装置４８の間に、血漿フローライン７２（これはライン６６につながる）に続く血漿出口と液体フローライン７４（これはライン４６につながる）に続く細胞含有全血液出口を有する。血漿分離装置６８はライン７８に沿ってポンプ７６からの供給を受ける。
【００３１】
最後に、血液供給ライン８０はポンプ７６の入口に続くことが示されている。一方、脱気装置４８は血液復帰ライン８２に続く出口を有することが示されており、ライン８０およびライン８２はそれぞれ患者（図示せず）の静脈系から、また、患者の静脈系に連結している。ポンプ７６、分離装置６８および脱気装置４８は、患者およびこれらに互いに連結しているフローラインは全体で血液循環回路を形成している。
【００３２】
本発明の方法によれば、ライン８０に沿ってポンプ７６により＜４００ｍｌ／分、好ましくは１５０〜２５０ｍｌ／分の流速で患者から連続的に静脈血を取り出し、ライン７８に沿って分離装置６８にポンプで送出し、そこで全血液分画と血漿分画に分離する。血漿分画は８４においてライン６６と会合するライン７２に沿って＜２００ｍｌ／分、好ましくは５０〜１５０ｍｌ／分の流速で装置６８から流出し、全血液分画は８６においてライン４６と会合するライン７４に沿って＜２００ｍｌ／分、好ましくは５０〜１５０ｍｌ／分の流速で流出する。装置６４を離れたライン６６は好適なペルフルオロカーボン、すなわちペルフルオロオクチルブロミドを含むペルフルオロカーボン相を１０〜６０％の容積濃度で含有する。装置６８から出た血漿は、装置６４からライン６６に流出するペルフルオロカーボンを含む事前に調製されたエマルジョンと混合する。このエマルジョンは乳化剤として卵黄レシチンを含み、その分散相としてペルフルオロカーボンを有しており、かつこのエマルジョンは容器１４の頂部に入れる。
【００３３】
容器１４において、エマルジョンはマトリックス１８を通ってマトリックス中をその内部に固定された生肝細胞と接触しながら下降灌流する。ジャケット１６へのライン２０およびジャケット１６からのライン２２を通る水流は、マトリックス中のエマルジョンの温度を実質的に３７℃に制御する。肝細胞はエマルジョンから酸素と栄養分を吸収し、そしてエマルジョンは肝細胞から二酸化炭素と他の代謝産物を吸収する。エマルジョンは装置１２を出てライン２８に沿ってバイオマスフィルター３０に流れる。
【００３４】
フィルター３０において、エマルジョンはこれからバイオマスを除去するために濾過され、濾過されたバイオマスはライン３４に沿ってフィルター３０から流出して廃棄される。濾過されたエマルジョンはフィルター３０からライン３６に沿って分離装置３８に流出し、そこでエマルジョンは水性相または血漿相とペルフルオロカーボン相に分離される。ペルフルオロカーボン相は装置３８からフローライン４２に沿って二酸化炭素除去装置４４に向かい、水性相または血漿相は装置３８からフローライン４６に沿って脱気装置４８に向かう。水性相または血漿相は装置４８の上流８６においてライン７４からの全血を受け入れる。前記全血および前記水性相または血漿相からなる血液は脱気装置４８中で脱気し、ライン８２を通して患者の静脈系に戻す。
【００３５】
装置４４において、二酸化炭素を真空下に除去し、ライン５４を通して放出され、ペルフルオロカーボン相は装置４４からライン５０に沿って酸素化装置５２に向かう。もちろん、二酸化炭素は他の技術によって除去してもよい。
【００３６】
酸素化装置５２において、ペルフルオロカーボン相は、ライン５６を通じて栄養分を、ライン５８を通じてペルフルオロカーボンの補充を受け、ライン６０を通じて酸素が供給される。ペルフルオロカーボン相は装置５２からライン６２に沿って装置６４に向かい、そこで脱気される。また、ｐＨ調整物質のような血液調整物質をそのための供給ライン（図示せず）から装置５２のペルフルオロカーボン相に供給してもよい。
【００３７】
分離装置６８は免疫担当血液細胞が酸素キャリヤー液に混入するのを防止するように機能し、患者からの免疫担当細胞がバイオリアクターシステム中の異種細胞と接触した際に免疫が活性化される可能性を減少させる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の一つの特徴は、血液循環回路から血漿担体循環回路を分離することにより、患者から血液を連続的に取り出す速度よりも速い速度で、酸素キャリヤー液をバイオリアクター装置内に循環できるようにした点である。この点で、分離装置３８は酸素キャリヤー液用の貯槽としても機能し得る。別の特徴としては、各種装置やフローラインを適切に断熱し、あるいは適当な加熱および／または冷却により温度調節することにより、装置内の液体を始めから終わりまでできる限り３７℃に近い温度に維持する点である。
【００３９】
特に図面を参照して例示し説明したように、本発明による有利な特徴の一つは、肝細胞をその代謝活性を維持しつつ１４日以上もの間生存可能とした点にある。細胞は、向神経性因子、向肝性因子および肝臓特異性凝固因子を生産しながら、かつその他の肝代謝活性を果たしながら、神経毒素と肝毒素を患者の血液から除去することができる。装置が充分な数の肝細胞、例えば患者の肝臓中における同種の細胞数の２０％以上を含有していれば、患者の肝臓が再生するかまたは肝臓移植ができるまでのつなぎ期間、患者を存命させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に基づく装置の模式的な流れ図。
【符号の簡単な説明】
１０ 装置
１２ バイオリアクター装置
１４ 容器
１６ 冷却ジャケット
１８ マトリックス
２０ 冷却水入口フローライン
２２ 出口フローライン
２４ ポンプ
２６、２８ フローライン
３０ バイオマスフィルター
３２ バイオマスフローライン
３４、３６ ライン
３８ 分離装置
４０ 相分離膜
４２ ペルフルオロカーボンフローライン
４４ 二酸化炭素除去装置
４６ 血漿相フローライン
４８ ペルフルオロカーボン脱気装置
５０ 液体フローライン
５２ 酸素化装置
５４ 二酸化炭素真空フローライン
５６ 栄養分溶液供給ライン
５８ 有機相補充フローライン
６０ 酸素ガス供給ライン
６２ 液体フローライン
６４ 脱気装置
６６ フローライン
６８ 血漿分離装置
７０ 半透膜
７２ 血漿フローライン
７４ 液体フローライン
７６ ポンプ
７８ ライン
８０ 血液供給ライン
８２ 血液復帰ライン
Claims (25)
- 連続気泡発泡体材料の三次元マトリックスを収容する保持容器を備えたバイオリアクター装置であって、発泡体材料は多孔性の内部を有しておりその多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含み、さらに保持容器内に液体を含有し、前記液体は酸素のキャリヤーであって、マトリックスに浸透し行き渡り、かつ少なくとも部分的に合成または半合成の酸素担持成分を含有するバイオリアクター装置。
- 連続気泡発泡体材料が、生体適合的かつ生体安定的であり、重合体発泡体材料である請求項１に記載の装置。
- 発泡体材料がポリウレタンポリマー、ポリ塩化ビニルポリマー、ポリエチレンポリマー、ポリプロピレンポリマー、ポリスチレンポリマー、これらの共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）ポリマー、ポリアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレン）アジポアミドポリマー、ポリ（ヘキサメチレンセバカミド）ポリマー、ポリカプロラクトンポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリマー、ポリ（ブチレンテレフタレート）ポリマー、ポリカーボネートポリマー、ポリアセタールポリマー、ポリビニルアルコールポリマー、尿素ホルムアルデヒドポリマー、フッ素含有ポリマー、シリコン含有ポリマーおよび前記ポリマーおよび共重合体の混合物からなる群から選択される重合体発泡体材料である請求項２に記載の装置。
- マトリックスが単一または一体的な発泡体材料の連続塊である請求項１乃至３のいずれかに記載の装置。
- 生細胞が哺乳動物細胞であり、酸素キャリヤー液が二酸化炭素担体としても機能する血液代替物を形成する前記請求項のいずれかに記載の装置。
- 酸素キャリヤー液が水性液体であり、合成または半合成の酸素担持成分として無細胞ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、リポソーム被包ヘモグロビンおよびペルフルオロカーボンからなる群から選択される少なくとも１種類を含有する前記請求項のいずれかに記載の装置。
- 合成または半合成の酸素担持成分が合成ペルフルオロカーボンであり、酸素キャリヤー液が有機相および水性相からなるエマルジョンであり、有機相が前記ペルフルオロカーボンを含むエマルジョンの分散相であり、水性相がエマルジョンの連続相であって水性液体を含む請求項６に記載の装置。
- 合成または半合成の成分が無細胞ヘモグロビンであり、無細胞ヘモグロビンが水性液体に溶解しており、水性液体が血漿である請求項６または７に記載の装置。
- 合成または半合成の成分がリポソーム被包ヘモグロビンであり、リポソーム被包ヘモグロビンは水性液体中に懸濁液として懸濁されており、水性液体が血漿である請求項６乃至８のいずれかに記載の装置。
- 保持容器が酸素キャリヤー液入口と酸素キャリヤー液出口を有しており、酸素キャリヤー液出口は酸素キャリヤー液入口よりも低い位置にあって酸素キャリヤー液排出口を形成し、保持容器（１４）がマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調整するための温度調節装置を具備している前記請求項のいずれかに記載の装置。
- 前記装置が保持容器に対しおよびこれを通して温度調節液を循環させるための温度循環液回路の一部を形成するものであり、保持容器が中空の保持容器用温度調節ジャケットの形態を取る温度調節装置を備え、ジャケットが温度調節液用の入口と出口を有し、温度調節回路が、温度調節回路を通って回る温度調節液を循環させるための液体循環装置、サーモスタット、および保持容器から離れた位置に設けられ、かつ温度調節液の温度を制御するべくサーモスタットからの信号に反応して作動しマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節する伝熱装置を含む前記請求項のいずれかに記載の装置。
- 保持容器内に入り生細胞が付着固定されているマトリックスを通って保持容器外に出るように酸素キャリヤー液を循環させる酸素キャリヤー液循環回路の一部を形成する前記請求項のいずれかに記載の装置。
- 酸素キャリヤー液循環回路が、回路を通って回る酸素キャリヤー液を循環させるための液体循環装置、保持容器から流出する酸素キャリヤー液からバイオマスを除去するためのバイオマス除去装置、酸素キャリヤー液中の合成または半合成成分を担体液の他の成分から分離するための分離装置、酸素キャリヤー液から二酸化炭素を除去する二酸化炭素除去装置、酸素キャリヤー液を酸素化するための酸素化装置および酸素キャリヤー液を脱気するための脱気装置からなる群から選択される少なくとも１つの装置を含む請求項１２に記載の装置。
- 循環回路が、保持容器で始まり、１つのバイオマス除去装置、１つの分離装置、１つの二酸化炭素除去装置、１つの酸素化装置、１つの脱気装置および１つの液体循環装置の順に配置された前記群に属する複数の装置を含み、液体循環装置に続けて前記保持容器を設けることにより回路が無限回路または閉回路を形成するものであり、液体循環装置が、前記群の各装置が前記順で連なる方向に酸素キャリヤー液を回路を通って回るように循環させる請求項１３に記載の装置。
- 酸素キャリヤー液循環回路が血液循環回路に接続しており、血液循環回路が血液を酸素キャリヤー液循環回路の酸素キャリヤー液に接触させるように循環させ、細胞を含まない血液成分を酸素キャリヤー液回路に供給し、酸素キャリヤー液回路から細胞を含まない酸素キャリヤー液の水性成分を受け入れあるいは取り出すためのものであって、血液を血液循環回路を通って循環させるための血液循環装置、血液循環回路を通って循環する血液を無細胞血漿分画と血液細胞と若干の血漿を含有する血液細胞含有分画に分離するための血漿分離装置、および血液循環回路を通って循環する血液を脱気するための脱気装置を含む請求項１２乃至１４のいずれかに記載の装置。
- 血液循環回路における装置類が、血液循環装置から順に血漿分離装置および脱気装置が続く順に配されており、血液循環装置が、血液循環回路の装置類が前記順に連なる方向に血液を血液循環回路を通って循環させるように構成されている請求項１５に記載の装置。
- 酸素液循環回路と血液循環回路間の結合が酸素キャリヤー液循環回路と血液循環回路の血漿分離装置との間の結合である請求項１５または１６に記載の装置。
- 合成または半合成の酸素担持成分を少なくとも部分的に含む酸素キャリヤーである液体を、多孔性の内部に生細胞を付着固定させて含む連続気泡発泡体材料のマトリックスを通して灌流し、細胞が液体から酸素と栄養分を吸収し、液体が細胞から二酸化炭素とその他の代謝産物を吸収する生細胞を培養する方法。
- 酸素キャリヤー液が、液体を酸素キャリヤー液循環回路を通って、かつマトリックスを通って循環させることによりマトリックスを通して灌流させる血漿形態の水性成分からなり、所望範囲内の値にマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を維持するようにマトリックスおよび酸素キャリヤー液の温度を調節する工程を含む前記請求項１８に記載の方法。
- 酸素キャリヤー液回路を通って循環する酸素キャリヤー液からバイオマスを除去し、除去したバイオマスを廃棄すべく放出する工程を含む請求項１９に記載の方法。
- 酸素キャリヤー液回路を通って循環する酸素キャリヤー液を、水性相が前記酸素担持成分を実質的に含まないように水性相と半合成または合成の酸素担持成分含有相とに分離し、分離した半合成または合成の成分含有相を酸素キャリヤー液循環回路中に保持し、分離した水性相を酸素キャリヤー液循環回路に接続した血液循環回路中に供給する工程を含む前記請求項１９または２０に記載の方法。
- 人血を処理する工程、血液循環回路からの血液を血漿分画と細胞含有分画に分離する工程を含み、前記血漿分画を酸素キャリヤー液循環回路中の酸素キャリヤー液中に供給し、細胞含有分画を血液循環回路に保持する請求項２１に記載の方法。
- 血漿分画と細胞含有分画とを互いに分離する工程が、血漿分画を通過させかつ血液細胞の通過を防ぐ半透性障壁によって行なわれる請求項２２に記載の方法。
- 生細胞がブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ヒヒ肝細胞およびこれらの混合物からなる群から選択され、これらの細胞が血液に対し人工肝機能を及ぼすことにより血液を処理する請求項１８乃至２３のいずれかに記載の方法。
- 酸素キャリヤー液が灌流されるマトリックス中の肝細胞量が成人に必要な基本的肝機能の少なくとも２０％を遂行し得る量であり、酸素が酸素化装置により酸素キャリヤー液に供給され、栄養分が血漿により酸素キャリヤー液に供給され、二酸化炭素が酸素化装置により酸素キャリヤー液から除去され、細胞代謝産物が血漿により酸素キャリヤー液から除去され、酸素キャリヤー液によるマトリックス灌流が細胞の生存能力と代謝活性を少なくとも３日間維持させるのに充分な割合でこれを行なう請求項２４に記載の方法。
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