JPS61255665A - 人工肝臓用代謝補助装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、人工肝臓用代謝補助装置に関する。さらに具
体的には、異種動物より採取したＭ１１肝細胞を浮遊さ
せている培地と患者血液との間で限外濾過膜を介して物
質交換を行なわせる人工肝臓用代謝補助装置に関する。

〔従来の技術〕

肝臓は重要な臓器であって、その機能はつぎの２つ、す
なわち各種化合物の抱合などのいわゆる解毒能と、糖、
アンモニア、脂質などの物質代謝、さらにはアルブミン
を始めとする血漿タンパクの合成などのいわゆる代謝能
とに大別される。

肝臓のこれら機能が低下した場合には、それを補う人工
的な装置が必要であり、したがって肝機能補助装置がい
ろいろと考案されている。活性炭、イオン交換樹脂など
の吸着剤の中には、いわば解毒能の補助とし、て臨床に
用いられた例もある。

しかし、吸着剤だけでは複雑な代謝能の補助は不可能で
あり、吸着剤の治療成績にも限界がある。そこで、患者
の低下した肝機能を補助するためには、異種動物より採
取した肝細胞の代謝能を利用した代謝補助装置の開発が
不可欠なものと考えられる。この考えのちとに今日まで
に行なわれた研究においては、材料として摘出した動物
肝をそのまま使用するもの、切片として使用するものな
どがある。

しかし、遊離肝細胞を浮遊させて用いるのが、取扱いの
簡便さにおいて最もすぐれている（例えば、特開昭５３
−９４４９６号公報、０ｌｕｎ＋ｉｄｅ、　Ｆ、　ｅｔ
　ａｌ　　：　５ｕｒａ、８２　（５）　。

５９９　（１９７７）、葛西真−はか：人工臓器上４　
（１）、２２８　（１９８５））。

一方、異種動物より採取した肝を用いる代謝補助装置に
おいて、異種動物肝細胞から生成するあるいは遊離する
タンパク質が患者体内に入れば、患者にとって有害な免
疫学的反応をひきおこすことは自明である。

さりとて前述のＯｌｕｍｉｄｅらの如く、キュプロファ
ン膜のように低分子物質だけを通過せしめる膜を患者血
液と肝細胞浮遊培地との間においたのでは、動物肝細胞
の代謝能を十分に利用していないことになり、代謝補助
装置として不満足である。

また、前述の特開昭５３−９４４９６号公報に示された
代謝補助装置においては、濾過材として約０．０１〜０
．５μのボアーサイズの高分子材料からなる膜体から用
いられており、肝細胞浮遊培地はこの膜により濾過され
、得られたか液が患者体内に注入される。

このような条件下では、肝細胞から生成するあるいは遊
離するタンパク質が患者体内に入るおそれがあり、これ
また代謝補助装置として不満足である。

これに対して葛西らは肝細胞における中分子量物質代謝
の重要性に着目している。彼らの考案による代謝補助装
置においては、患者血液又は血漿と肝細胞浮遊培地とが
分画分子量２万から３０万である限外濾過膜を介して接
触し、主として拡散によって両者の間に物質交換が行な
われる（人工臓器上玉（６）。

９４１　（１９８２）：同１３　（２）、６２６（１９
８４）；同上４　（１）、２２８　（１９８５）〕。彼
らはこの代謝補助装置をガラクトサミン投与不全式につ
なげて潅流し、犬の生存時間延長に有効であることを認
めている。

このように葛西らの代謝補助装置はその有効性が実証さ
れているものの、その構造上さまざまの問題点がふくま
れている。すなわち、彼らの装置においては、限外濾過
膜である中空糸が細胞浮遊培養槽の側壁から側壁へ低充
填密度でスダレ状かつ多層に充填されており、ボッティ
ング材により両側壁に固着されている。空気又は酸素の
バブリングにより′上記の中空糸の外側の細胞浮遊培地
から攪拌され、中空糸の内側を流れる血液又は血漿との
間で物質交換が行なわれる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

彼らの装置を用いて動物実験を行なうことは可能である
が、培養槽、限外濾過膜表面積などを拡大して臨床に用
いようとすると、次のいくつかの困難に遭遇する。主な
るものを挙げれば、 １）バブリングによるだけでは細胞浮遊培地の均一循環
は期し難いが、さりとて他の攪拌手段をつけ加えるよう
な設計は困難である。

２）血液ボートのブライミング容積を小さく保つような
設計は困難である。

３）実用機器とするためには中空糸状限外ン濾過膜と細
胞培養槽とをあわせてディスポ化することが必要となり
、量産に適さない。

４）バブリングは肝細胞生存率の維持に有害である。

本発明は上記の困難に解決を与えることを目的とし、細
胞浮遊培地が患者血漿と中空糸状限外ｉ濾過膜を介して
物質交換を営む場所を細胞槽の内部から外部へ移すこと
によって、この目的を達成しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、以下の本発明により達成される。すなわち
、本発明による代謝補助装置は、下記の部分からなるこ
とを特徴とするものである。

ａ）異種動物より採取した遊離肝細胞の浮遊培養槽、 ｂ）分角分子量が２万から３０万、好ましくは６万から
１５万である中空糸状限外濾過膜より構成される筒型モ
ジュール、 Ｃ）血漿分離器、 ｄ）培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とともに
連続的にとり出し、筒型モジュールの中空糸内側を潅流
してから培養槽へ戻すための送液機構、および ｅ）患者からの血液を血漿分離器へ導き、これより得ら
れる血漿を筒型モジュールの中空糸外側を連続的に潅流
してから、血漿分離器より得られる血球成分とともに患
者へ戻すための送液機構。

本発明は培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とと
もにとり出し、中空糸状限外濾過膜より構成される筒型
モジュールを通過させてから培養槽に戻すという操作を
連続的に行なったときに、この操作が肝細胞の生存率（
■１ａｂｉｌｉｔｙ）および生化学的指標に有害な影響
を殆どおよぼさないという新しく発見された知見に基づ
いている。

細胞浮遊培地を中空糸状限外ン濾過膜より構成される筒
型モジュールを通過させるにあたっては、肝細胞をその
培地とともに中空糸状限外濾過膜内側を通過させること
が必要である。もしも、肝ｌ１ｌｌ１１をその培地とと
も中空糸状分離膜外側を潅流すると、筒型モジュールの
構造からいって流れのゆるやかなよどみの箇所に肝細胞
がトラップされる。よどみの箇所は酸素濃度など培養条
件が悪いので、この箇所の肝細胞は結果として死滅し、
培養槽全体の肝細胞の生存率の急激な低下を招来する。

葛西らの代謝補助装置は先はど述べたようにその容量拡
大に際して設計上いくつかの難点を有している。本発明
によればこれらの難点にそれぞれ次のような解決が与え
られる。

１）培養槽設計について自由度が与えられるので、その
材質、形状、撹拌様式、通気方法などを遊離肝細胞浮遊
培養にむけて最適化をはかることができる。

２）血漿分離器としては任意のものを採用し得る。すな
わち、血液ボートのプライミング容積の小さいものを選
択することができるなど、患者の負担を軽減することに
つながる。

３）中空糸状限外濾過膜より構成される筒型モジュール
、血漿分離器および送液機構のうちの配管部分はディス
ポ化することが容易となり、滅菌済のものを量産するこ
とができる。

次に本発明を構成する各部分について具体的な説明を加
える。

ａ）培養槽：培養槽は、異種動物より採取した遊離肝細
胞を培地に浮遊させて培養することのできる任意の培養
槽であり得る。しかし、本発明の効果のひとつは、培養
槽設計について自由度が与えられることであった。よっ
て、培養槽の仕様は、当然のことながら、遊離肝細胞の
生存率を′可能な限り長時間にわたって維持し、また生
化学的指標にて表わされる肝細胞の機能を最大限に発揮
し得るものであり得る。

その−例として、通気方法をあげることができる。槽内
の酸素濃度を保つために、肝細胞の浮遊している培地に
直接酸素あるいは空気をバブリングすることは、肝細胞
生存率に有害である。培地表面からのみの酸素供給に限
るか、肝細胞の浮遊していない培地にバブリングした後
その培地を肝細胞の浮遊している培地に添加すれば、肝
細胞生存率はより長い時間にわたって維持される。よっ
て、このような通気方法によることが好ましい。このよ
うな通気方法は、本発明による代謝補助装置において始
めて採用し得るものである。

中空糸状限外ン濾過膜が培養槽内部に固着されているよ
うな培養槽にあっては、上に述べた通気方法を採用する
ことは困難である。あるいは、可能になったとしも、量
産に適するものではない。

通気方法の例にとどまらず、本発明による代謝補助装置
においては、培養槽の形状、材質、容量についても、代
謝補助装置の使用の目的に応じて任意に選択をなし得る
。

また、適度の撹拌のための装置、保温のための装置、ざ
らにＤＨ，温度、酸素濃度などの培養条件の監視調節装
置などが付設されていることが好ましいことは言うまで
もない。

ここで、培養槽の中に浮遊させる異種動物より採、取し
た遊離肝細胞について述べる。

肝細胞としては、使用の目的に応じてラット、犬、豚、
牛、類人猿などの動物より、ＢｅｒｒｙおよびＦ　ｒｉ
ｅｎｄのコラゲナーゼ潅流法あるいは５ｅＱＩｅｎによ
るその変法などを用いて調製され得る。凍結保存した肝
細胞も用いることができる。使用する培地としては、肝
細胞の生存率をより長い時間にわたって維持し、生化学
的指標にて表わされる肝細胞の機能を最大限に発揮し得
るものが好ましい。一般には、牛胎児血清添加、ＭＥＭ
培地あるいはＷＥ培地などが用いられ得る。インシュリ
ン、デキサメサゾンなどのホルモン、あるいは酸素運搬
剤としてフルオロカーボンなどが好ましく添加される。

近年、市販されている無血清培地も目的に応じて使用さ
れ得る。細胞を浮遊させルｌｌ　ｉ　、！：　Ｌ、　Ｔ
　ハ、１０〜１×１０ｓ箇／ｄの範囲が好ましい。

ｂ）筒型モジュール二筒型モジュールにおいては、中空
糸状限外濾過膜の内側を潅流する肝細胞浮遊培地と中空
糸状限外ン濾過膜の外側を潅流する血漿とが限外ｉ濾過
膜を介して接触し、主として拡散によって両者の間に物
質交換が行なわれる。

限外濾過膜としては、いわゆる人工腎臓でヘモフィルタ
ーあるいは蛋白質リーク膜と呼称されているような、高
透水性の分画分子量２万〜３０万付近、好ましくは分画
分子１６万〜１５万付近の膜モジュールが使用される。

ここで分画分子量とは、分子量（ＭＷ）が明確な指標物
質（Ｉａ　Ｍ　（ＭＷ９６０゜０ＯＯ）、アポフェリチ
ン（ＭＷ４８０゜０００）　、［Ｉ　Ｇ　（ＭＷｌ　６
０．０００＞。

アルブミン（６７，０００）、卵アルブミン（ＭＷ４５
．０００＞　、ペプシン（ＭＷ３５．０００）、イヌリ
ン（ＭＷ５．２００）などの溶液を用いてその透過率を
測定して、透過率（阻止率）とＭＷを軸とするグラフを
描き、透過率１０％（阻止率９０％）を示す分子量であ
る。

さらに、筒型モジュールにおいては、遊離肝Ｉ８胞を中
空糸内側を円滑に通過せしめるために、中空糸内側が平
滑であり、またその内径が１００μ以上あることが好ま
しい。

筒型モジュールの限外濾過膜面積、あるいはその他の形
状・仕様、さらには限外ｉ濾過膜の材質その他について
は、代謝補助装置の使用の目的に応じて任意に選択をな
し得る。材質としては、例えばポリメチルメタクリレー
ト、セルロースアセテート、ポリビニルアルコ−ル ポリスルホンなど生体に安全なものであれば良い。

Ｃ）血漿分離器：血漿分離器においては患者からの血液
のうち一部の血漿がとり出され、筒型モジュールの中空
糸外側へ連続的に潅流される。

血漿分離器としては、血漿分離速度が高く、かつ血漿蛋
白質の透過性が良好ないずれの膜型血漿分離器も使用可
能である。最近多く開発されている中空糸型の分離器は
血液充填量も少なく好ましく使用される。

その膜材質としては例えば、ポリメチルメタクリレート
、セルロースアセテート、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリス
ルホンなど生体に安全なものであればよく、その細孔径
は通常０．０５〜２ミクロン、好ましくは０．１〜１．
０ミクロン程度である。

ｄ）　、ｅ）送液機構：本発明による代謝補助装置にお
いて、送液機構は上に述べた各部分の間を連結して、血
漿および肝細胞浮遊培地を導く配管、ポンプ、およびそ
の他の部品よりなる。

配管としては、いわゆる人工腎臓で使用されている滅菌
された塩化ビニール製血液回路が好ましく使用されるが
、その他のシリコーンなどの素材からなる配管も使用で
きることはいうまでもない。また、配管の内径について
も、代謝補助装置の使用の目的に応じて任意に選択をな
し得る。

培地および血液を送液するためのポンプ、圧力測定器、
加温コイルも人工腎臓や血漿交換（プラズマフエレイシ
ス）で臨床用として開発されている機器が好ましく使用
される。以下、本発明を第１図を参照しながら説明する
。第１図は本発明装置の１例を示すものである。

ポンプ１を備えた回路２により培養槽３から肝細胞浮遊
培地が筒型モジュール４の中空糸内側へ送りこまれる。

この培地はここで患者血漿と中空糸状限外濾過膜を介し
て物質交換を行なった後、回路５を経由して培養槽３へ
戻る。

患者血液はポンプ６の働きにより回路７を経由して血漿
分離器８へ導かれる。一部の血漿が血漿分離器８よりと
り出され、二連ポンプ９の働きにより、回路１０を経由
して筒型モジュール４の中空糸外側を潅流する。その後
、血漿は二連ポンプ９の働きにより回路１１を経て血球
成分と合流し、回路１２にて患者体内へ戻る。

第１図において、圧力測定器１３は１箇示されているの
みであり、また加温コイル、ドリップチェンバーは全く
示されていない。

しかし、これらの付属部品は代謝補助装置使用の目的に
沿って適宜配置され得る。

また、ポンプの配置は第１図に示されたそれに必ずしも
限定されるものではない。

例えば、第１図における回路１０．１１にまたがる二連
ポンプ９は、一連ポンプにすることもできる。そのかわ
りに、回路１２に新たにポンプを配置すれば、これまで
と全く変らない培地および血液の流れを確保できる。こ
のように、培地および血液の流れが確保できるものであ
れば、ポンプの配置は任意に設定できる。

次に、送液機構によって送るべき培地および血液の流量
について述べる。これらは次の条件に合うかぎり任意に
設定することができる。すなわち、肝細胞の生存率の低
下、機能の損害を最小限に抑制すること、患者あるいは
実験動物におよぼす負担を最小限に抑制すること、培地
と血液との間の物質交換を最も効率的に行なうことであ
る。

より具体的に述べれば、筒型モジュールにおける培地流
量の血漿流量に対する比は１より大であることが好まし
い。また、血漿分離器に導かれる血液流量、およびそこ
からひき出される血漿流量は、血漿分離器の性能、およ
び患者への負担を考えた上で設定される。

また、本発明による代謝補助装置において、培養槽に肝
細胞を浮遊せしめると同時に、患者血液の潅流を開始す
る必要は必ずしもない。細胞を培地に浮遊せしめれば、
直ちにその最大限の機能を発揮するものではなく、幾ら
かの培養時間が必要である。

したがって、このような場合、患者の負担を軽減するた
めに、幾らかの培養時間をおいた後、患者血液の潅流を
開始するのが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明の効果をさらに具体的に説
明する。

実施例１ 本発明による代謝補助装置の代謝能を調べるために、患
者血液のかわりにおいた２Ｌハンクス液からのアンモニ
ア除去速度あるいは培養槽の中の肝細胞の生存率の変化
などにつき調べた。

細胞は体重８　Ｋｇのピーグル大から３ｅｇｌｅｎの変
法によるコラゲナーゼ潅流法により採取し、洗滌後２Ｌ
のＭＥＭ培地に４Ｘ１０’箇／ｄの濃度に懸濁した。こ
の培地には、あらかじめ１０％の牛胎児血清、１０”’
　Ｍのインシュリンおよび１０’Ｍのデキサメサゾンを
添加した。培養槽はガラス製で撹拌翼を有しており、３
７℃の恒温槽の中に保持されていた。培養槽気相部には
、流量計にて調節された流速にて酸素および炭酸ガスが
送りこまれた。培地中の溶存酸素分圧は、１００−２ｏ
１００−２ｏｏの範囲、培地中のｐＨは、７．１〜７．
３の範囲に保たれた。

筒型モジュールとしては分画分子量１０万のＰＭＭＡ製
の中空糸状限外濾過膜よりなるものを用いた。その膜面
積は、０．４麓、中空糸内径は３００μであった。

血漿分離器としてはＰＭＭＡＩＪ中空糸よりなる膜面積
０．５Ｔｄの市販のものを用いた。その中空糸内径は３
３０μであった。

内径３．５ｍｍ、外形５．Ｑｍｍの塩化ビニール製血液
回路を用いて、上に述べた各部分の間を連結し、血液ポ
ンプにより次のように送液した。

すなわち、培養槽から肝細胞浮遊培地を１００１００Ｉ
ｄ７にてひき出し、筒型モジュールの中空糸内側を潅流
させてから培養槽へ戻した。患者血液のかわりにおいた
ハンクス液貯槽からは、１２０ａｉ！／ｍｉｎを血漿分
離器へ導き、一部の液を４０ｄ／ｍｉｎで血漿側へひき
出し、筒型モジュールの中空糸外側を潅流させてから残
りのハンクス液とともにハンクス液貯槽へ戻した。

ハンクス液に塩化アンモニウムを２回にわたって添加し
、ハンクス液および肝細胞浮遊培地におけるアンモニア
濃度の変化を測定した。測定は藤井−奥田法変法によっ
た。その結果を第２図に示した。さらに、トリパンブル
ー染色法にて計数した浮遊肝細胞の生存率もあわせて第
２図に示した。

また、ルミノアグリゴメーターを用いて測定した浮遊肝
細胞のＡＴＰ含量の変化を第３図に示した。

肝細胞の生存率については１２時間の培養でありながら
れずかの低下をみたのであった。細胞内ＡＴＰｆｉは培
養開始と同時に増加を始め、７−８時間後に最大に達し
た。１２時間後であってもなお、培養開始時よりも高い
レベルにあった。ハンクス液に添加したアンモニアは、
６時間後であっても培養開始時と全く変らない速度で除
去された。肝細胞浮遊培地側では、アンモニア濃度の増
加はほとんどみられなかった。

卓上より、本発明による代謝補助装置は代謝能を有し、
しかもそれが長時間にわたって安定であるということが
いえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の実施態様の一例を示す概略説明図
である。 第２図は実施例１アンモニア濃度変化および浮遊肝細胞
の生存率を示し、第３図は実施例１の浮遊肝細胞のＡＴ
Ｐ含量変化を示す。 １．６．９　　・・・・・・・・・　ポンプ３　　　　
　・・・・・・・・・　培養槽４　　　　　・・・・・
・・・・　筒型モジュール８　　　　　・・・・・・・
・・　血漿分離器特許出願人　　工　業　技　術　院　
長等々力達

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ａ）異種動物より採取した遊離肝細胞の培養槽、ｂ）分
   画分子量が２万から３０万である中空糸状限外濾過膜よ
   り構成される筒型モジュール、ｃ）血漿分離器、 ｄ）培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とともに
   連続的にとり出し、筒型モジュールの中空糸内側を潅流
   してから培養槽へ戻すための送液機構、および ｅ）患者からの血液を血漿分離器へ導き、これより得ら
   れる血漿を筒型モジュールの中空糸外側を連続的に潅流
   してから、血漿分離器より得られる血球成分とともに患
   者へ戻すための送液機構 を有することを特徴とする人工肝臓用代謝補助装置。