JPS61255666A - 代謝補助装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、人工肝臓の代謝補助装置に関する。

さらに、具体的には、異種動物より採取した遊離肝細胞
を浮遊させている培地と患者血液との間で限外濾過膜を
介して物質交換を行なわせる代謝補助装置に関する。

〔従来の技術〕

肝臓は重要な臓器であって、その機能はつぎの二つ、す
なわち各種化合物の抱合などのいわゆる解毒能と、糖、
アンモニア、脂質などの物質代謝、さらにはアルブミン
を始めとする血漿タンパクの合成などのいわゆる代謝能
とに大別される。

肝臓のこれら機能が低下した場合には、それを補なう人
工的な装置が必要であり、したがって肝機能補助装置が
いろいろと考案されている。

活性炭、イオン交換樹脂などの吸着剤の中には、いわば
解毒能の補助として臨床に用いられた例もある。

しかし、吸着剤だけでは複雑な代謝能の補助は不可能で
あり、吸着剤の治療成績にも限界がある。そこで、患者
の低下した肝機能を補助するためには、異種動物より採
取した肝細胞の代謝能を利用した代謝補助装置の開発が
不可欠なものと考えられる。この考えのちとに今日まで
に行われた研究においては、材料として摘出した動物肝
をそのま＼使用するもの、切片として使用するものなど
がある。しかし、遊離肝細胞を浮遊させて用いるのが、
取扱いの簡便さにおいて最もすぐれている〔例えば、特
開昭５３−９４４９６号公報、Ｏｌｕｍｉｄｅ　、、　
Ｆ、ｅｔ　ａｌ二ｓｕｒｇ。

ｕ（５）、５９９（１９７７）　、葛西真−はか：人工
臓器旦（１）　、２２Ｂ（１９８５）　） 一方、異種動物より採取した肝を用いる代謝補助装置に
おいて、異種動物肝細胞から生成するあるいは遊離する
タンパク質が患者体内に入れば、患者にとって有害な免
疫学的反応をひきおこすことは自明である。

さりとて前述のＯｌｕｍｉｄｅらの如く、キュプロファ
ン膜のように低分子物質だけを通過せしめる膜を患者血
液と肝細胞浮遊培地との間においたのでは、動物肝細胞
の代謝能を十分に利用していないことになり、代謝補助
装置として不満足である。

また、前述の特開昭５３−９４４９６号公報に示された
代謝補助装置においては、濾過材として約０．０１〜０
．５μのポアーサイズの高分子材料からなる膜体が用い
られており、肝細胞浮遊培地はこの膜により濾過され、
得られた濾液が患者体内に注入される。このような条件
下では、肝細胞から生成するあるいは遊離するタンパク
質が患者体内に入るおそれがあり、これまた代謝補助装
置として不満足である。

これに対して葛西らは肝細胞における中分子量物質代謝
の重要性に着目している。彼らの考案による代謝補助装
置においては、患者血液又は血漿と肝細胞浮遊培地とが
分画分子量２万から３０万である限外濾過膜を介して接
触し、主として拡散によって両者の間に物質交換が行わ
れる〔人工臓器　１上（６）　、９４１　　（１９８２
）；同上ユ（２）　、６２６　　（１９８４）；同上土
（１）　、２２８　　（１９８５））。彼らはこの代謝
補助装置をガラクトサミン投与不全犬につなげて潅流し
、犬の生存時間延長に有効であることを認めている。

このように葛西らの代謝補助装置はその有効性が実証さ
れているものの、その構造上さまざまの問題点がふくま
れている。すなわち、彼らの装置においては、限外濾過
膜である中空糸が細胞浮遊培養槽の側壁から側壁へ低充
填密度でスダレ状かつ多層に充填されており、ポツティ
ング材により両側壁に固着されている。

空気又は酸素のバブリングにより上記の中空糸の外側の
細胞浮遊培地が攪拌され、中空糸の内側を流れる血液又
は血漿との間で物質交換が行われる。

発明が解決しようとする問題点〕 彼らの装置を用いて動物実験を行うことは可能であるが
、培養槽、限外濾過膜表面積などを拡大して臨床に用い
ようとすると、次のいくつかの困難に遭遇する。主なる
ものを挙げれば、１）バブリングによるだけでは細胞浮
遊培地の均一循環は期し難いが、さりとて他の攪拌手段
をつけ加えるような設計は困難である。

２）血液ボートのブライミング容積を小さく保つような
設計は困難である。

３）実用機器とするためには中空糸状限外濾過膜と細胞
培養槽とをあわせてディスポ化することが必要となり、
量産に適さない。

４）バブリングは肝細胞生存率の維持に有害である。

本発明は上記の困難に解決を与えることを目的とし、細
胞浮遊培地が患者血液と中空糸状限外濾過膜を介して物
質交換を営む場所を細胞槽の内部から外部へ移すことに
よって、この目的を達成しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕 上記目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち、本発明による代謝補助装置は、下記の部分か
らなることを特徴とするものである。

ａ）異種動物より採取した遊離肝細胞の浮遊培養槽、 ｂ）０．０５から２μ、好ましくは０．１から１μの孔
径をもつ中空糸状分離膜より構成される第１筒型モジュ
ール、 Ｃ）分画分子量が２万から３０万、好ましくは６万から
１５万である中空糸状限外濾過膜より構成される第２筒
型モジュール、 ｄ）培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とともに
連続的にとり出し、第１筒型モジュールの中空糸内側へ
送り、分離膜を通過しなかった培地およびそれに浮遊し
ている肝細胞と、分離膜を通過した一部の培地とに分離
し、分離膜を通過しなかった培地およびそれに浮遊して
いる肝細胞をともにそのま＼培養槽へ戻し、分離膜を通
過した一部の培地は第１筒型モジュールの中空糸外側か
らとり出し、第２筒型モジュールの中空糸外側を潅流し
てから培養槽へ戻すための送液機構、およびｅ）患者か
らの血液を第２筒型モジュールの中空糸内側を連続的に
潅流してから患者へ戻すための送液機構。

本発明は培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とと
もにとり出し、一部の培地を中空糸状分離膜を通過させ
て分離し、残りの培地をそれに浮遊している肝細胞とと
もに培養槽に戻すという操作を連続的に行ったときに、
この操作が肝細胞の生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）およ
び生化学的指標に有害な影響を殆んどおよぼさないとい
う新しく発見された知見に基づいている。

細胞浮遊培地の一部を中空糸状分離膜を用いてとり出す
上記の操作を行うにあたっては、肝細胞をその培地とと
も中空糸状分離膜内側を通過させることが必要である。

もしも、肝細胞をその培地ととも中空糸状分離膜外側を
潅流すると、筒型モジュールの構造からいって流れのゆ
るやかなよどみの個所に肝細胞がトラップされる。よど
みの個所は酸素濃度など培養条件が悪いので、この個所
の肝細胞は結果として死滅し、培養槽全体の肝細胞の生
存率の急激な低下を招来する。

また、本発明において患者からの血液を第２筒型モジュ
ールの中空糸内側を潅流すると規定されているが、この
理由も上記と同様である。

すなわち、患者からの血液を中空糸外側を潅流すると、
よどみの個所において溶血乃至は凝固を生じ易いからで
ある。

本発明においては、このように肝細胞および血液に対す
る損傷をさけるために、第１および第２の２本の筒型モ
ジュールの使用が不可欠である。葛西らの代謝補助装置
は先はど述べたようにその容量拡大に際して設計上いく
つかの難点を有している。本発明によればこれらの難点
にそれぞれ次のような解決が与えられる。

１）培養槽設計について自由度が与えられるので、その
材質、形状、攪拌様式、通気方法などを遊離肝細胞浮遊
培養にむけて最適化をはかることができる。

２）血液を潅流する第２筒型モジュールの形状は既存の
中空糸型人工腎臓に類似したものにすることができるの
で、血液ボートのプライミング容積を最少にとどめる設
計をなし得る。

これは患者の負担を軽減することにつながるものである
。

３）第１および第２筒型モジュール、および送液機構の
うちの配管部分はディスポ化することが容易となり、−
画情のものを量産することができる。

次に本発明を構成する各部分について具体的な説明を加
える。

ａ）培養槽：培養槽は、異種動物より採取した遊離肝細
胞を培地に浮遊させて培養することのできる任意の培養
槽であり得る。しかし、本発明の効果のひとつは、培養
槽設計について自由度が与えられることであった。よっ
て、培養槽の仕様は、当然のことながら、遊離肝細胞の
生存率を可能な限り長時間にわたって維持し、また生化
学的指標にて表わされる肝細胞の機能を最大限に発揮し
得るものであり得る。

その−例として、通気方法をあげることができる。槽内
の酸素濃度を保つために、肝細胞の浮遊している培地に
直接酸素あるいは空気をバブリングすることは、肝細胞
生存率に有害である。培地表面からのみの酸素供給に限
るか、肝細胞の浮遊していない培地にバブリングした後
その培地を肝細胞の浮遊している培地に添加すれば、肝
細胞生存率はより長い時間にわたって維持される。よっ
て、このような通気方法によることが好ましい。このよ
うな通気方法は、本発明による代謝補助装置において始
めて採用し得るものである。

中空糸状限外濾過膜が培養槽内部に固着されているよう
な培養槽にあっては、うえに述べた通気方法を採用する
ことは困難である。

あるいは、可能になったとしても、量産に適するもので
はない。

通気方法の例にとどまらず、本発明による代謝補助装置
においては、培養槽の形状、材質、容量についても、代
謝補助装置の使用の目的に応じて任意に選択をなし得る
。

また、適度の攪拌のための装置、保温のための装置、さ
らにｐＨ１温度、酸素濃度などの培養条件の監視調節装
置などが付設されていることが好ましいことは言うまで
もない。

ここで、培養槽の中に浮遊させる異種動物より採取した
遊離肝細胞について述べる。肝細胞としては、使用の目
的に応じてラット、−犬、豚、牛、類人猿などの動物よ
りＢｅｒｒｙおよびＦｒ１ｅｎｄのコラゲナーゼ潅流法
あるいはＳｅｇｌｅｎによるその変法などを用いて調製
され得る。凍結保存した肝細胞も用いることができる。

使用する培地としては、肝細胞の生存率をより長い時間
にわたって維持し、生化学的指標にて表わされる肝細胞
の機能を最大限に発揮し得るものが好ましい。一般には
、牛胎児血清添加ＭＥＭ培地あるいはＷＥ培地などが用
いられ得る。インシュリン、デキサメサゾンなどのホル
モン、あるいは酸素運搬剤としてフルオロカーボンなど
が好ましく添加される。近年、市販されている無血清培
地も目的に応じて使用され得る。細胞を浮遊させる濃度
としては、１０〜ｌＸｌ０’箇７ｍｌの範囲が好ましい
。

ｂ）第１筒型モジュール：第１筒型モジュールにおいて
は、中空糸状分離膜の内側を通る肝細胞浮遊培地の一部
が分離膜を通過して中空糸状分離膜の外側へ送り出され
る。この第一筒型モジュールとしては、最近、市販され
ている中空糸型の血漿分離器が好適に使用できる。

その分離膜の孔径は通常０．０５〜２μ、好ましくは０
．１〜、０μ程度である。

さらに、第１筒型モジュールにおいては、遊離肝細胞を
中空糸内側を円滑に通過せしめるために、中空糸内側が
平滑であり、またその内径が１００μ以上あることが好
ましい。

第１筒型モジュールの分離膜面−積、あるいはその他の
形状、仕様、さらには分離膜の材質その他については、
代謝補助装置の使用の目的に応じて任意に選択をなし得
る。材質としては例えば、ポリメチルメタクリレート、
セルロースアセテート、ポリビニルアルコール、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスル
ホンなど生体に安全なものであれば良い。

Ｃ）第２筒型モジュール：第２筒型モジュールにおいて
は、中空糸状限外濾過膜の内側を潅流する血液と中空糸
状限外濾過膜の外側を潅流する、細胞の浮遊していない
培地とが限外濾過膜を□介して接触し、主として拡散に
よって両者の間に物質交換が行われる。限外濾過膜とし
ては、いわゆる人工腎臓でヘモフィルターあるいは蛋白
質リーク膜と呼称されてい　　□るような、高透水性の
分画分子量２万〜３０万付近、好ましくは分画分子量６
万〜１５万付近の膜モジュールが使用される。

ここで分画分子量とは、分子量（ＭＷ）が明確な指標物
質（Ｉ　ｇＭ　（ＭＷ９６０　、０００）、アポフェリ
チン（ＭＷ４８０，０００）　、ＩｇＧ（朋１６０．０
００）、アルブミン（６７，０００）、卵アルブミン（
ＭＷ４５．０００）、ペプシン（Ｍ匈３５，０００）、
イヌリン（ＭＷ５２００）などの溶液を用いて、その透
過率を測定して、透過率　（阻止率）とＭＷを軸とする
グラフを描き、透過率１０％（阻止率９０％）を示す分
子量である。

限外濾過膜の材質としては例えば、ポリメチルメタクリ
レート、セルロースアセテート、ポリビニルアルコール
、ポリカーボネート、ポリスルホンなど生体に安全なも
のであれば良い。

第２筒型モジュールの中空糸内径、限外濾過膜面積、あ
るいはその他の形状、仕様、さらには限外濾過膜の材質
その他については、代謝補助装置の使用の目的に応じて
任意に選択をなし得る。

ｄ）、ｅ）送液機構：本発明による代謝補助装置におい
て、送液機構は上に述べた各部分の間を連結して、血液
、肝細胞浮遊培地および肝細胞の浮遊していない培地を
導く配管、ポンプ、およびその他の部品よりなる。

配管としては、いわゆる人工腎臓で使用されている滅菌
された塩化ビニール製血液回路が好ましく使用されるが
、その他のシリコーンなどの素材からなる配管も使用で
きることはいうまでもない。

また、配管の内径についても、代謝補助装置の使用の目
的に応じて任意に選択をなし得る。

培地および血液を送液するためのポンプ、圧力測定器、
加温コイルも人工腎臓や血漿交換（プラズマフェレイシ
ス）で臨床用として開発されている機器が好ましく使用
される。

以下、本発明を第１図を参照しながら説明する。

第１図は本発明装置の１例を示すものである。

ポンプ１を備えた回路２により培養槽３から肝細胞浮遊
培地が第１筒型モジュール４の中空糸内側へ送りこまれ
る。ポンプ５の働きにより一部の培地が中空糸状分離膜
を通過して回路６を経由して第２筒型モジュール７の中
空糸外側に到る。この培地はここで患者血液と中空糸状
限外濾過膜を介して物質交換を行なった後、回路８を通
り、回路９にて第１筒型モジュール４の分離膜を通過し
なかった培地およびそれに浮遊している肝細胞と合流し
て培養槽３へ戻る。

患者血液は、ポンプ１０および１１の働きにより回路１
２および第２筒型モジュール７の中空糸内側を潅流した
後、回路１３を経由して体内へ戻る。

第１図において、圧力測定器１３は１箇示されているの
みであり、また加温コイル、ドリップチェンバーは全く
示されていない。しかし、これらの付属部品は代謝補助
装置使用の目的に沿って適宜配置され得る。

また、ポンプの配置は第１図に示されたそれに必ずしも
限定されるものではない。例えば、第１図における回路
１３にあるポンプ１１を廃止して回路８に新たにポンプ
を配置しても全く変らない培地および血液の流れを確保
できる。このように、培地および血液の流れが確保でき
るものであれば、ポンプの配置は任意に設定できる。

次に、送液機構によって送るべき培地および血液の流量
について述べる。これらは次の条件に合うかぎり任意に
設定することができる。すなわち、肝細胞の生存率の低
下、機能の損害を最小限に抑制すること、患者あるいは
実験動物におよぼす負担を最小限に抑制すること、培地
と血液との間の物質交換を最も効率的に行なうことであ
る。

より具体的に述べれば、第２筒型モジュールにお〜ける
培地流量の血液流量に対する比は１より大であることが
好ましい。また、第１筒型モジュールにおいて中空糸状
分離膜外側へとり出される培地の流量は第１筒型モジュ
ールの中空糸内側へ送りこまれる培地流量の１７２以下
であることが好ましい。

また、本発明による代謝補助装置において培養槽に肝細
胞を浮遊さしめると同時に患者血液の潅流を開始する必
要は必ずしもない。

細胞を培地に浮遊せしめれば、直ちにその最大限の機能
を発揮するものではなく、幾らかの培養時間が必要であ
る。したがって、このような場合、患者の負担を軽減す
るために、幾らかの培養時間をおいた後、患者血液の潅
流を開始するのが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明の効果をさらに具体的に説
明する。

実施例１ 本発明による代謝補助装置の代謝能を調べるために、患
者血液のかわりに２！のハンクス液を第２筒型モジュー
ルの中空糸内側を潅流させ、肝細胞の生存率、アンモニ
アの除去速度などについてｉｎ　Ｖｉｔｒｏ試験を行な
った。

細胞は体重８Ｋｇのピーグル犬からＳｅｇｌｅｎの変法
によるコラゲナーゼ潅流法により採取し、洗滌後２１の
ＭＥＭ培地に４Ｘ１０’箇／　ｍ　ｌの濃度に懸濁した
。この培地には、あらかじめ１０％の牛胎児血清、１０
−’Ｍのインシュリンおよび１０−’Ｍのデキサメサゾ
ンを添加した。培養槽はガラス製で攪拌翼を有しており
、３７℃の恒温槽の中に保持されていた。培養槽気相部
には、流量計にて調節された流速にて酸素および炭酸ガ
スが送りこまれた。培地中の溶存酸素分圧は、１００−
１００−２Ｏ０の範囲、培地中のｐＨは、７．１−７．
３の範囲に保たれた。

第１筒型モジュールとしてはＰＭＭＡ製中空糸よりなる
膜面積０．５Ｍの血漿分離器を用いた。この中空糸内径
は３３０μであった。

第２筒型モジュールとしては分画分子量１０万のＰＭｌ
’ｌＡ製中空糸状限外濾過膜よりなるものを用いた。そ
の膜面積は０．４イ、中空糸内径は３００μであった。

内径３．５ｍｍ　、外径６　、　Ｏｎｅｗの塩化ビニー
ル製血液回路を用いて上に述べた各部分の間を連結し血
液ポンプにより次のように送液した。すなわち、培養槽
から肝細胞浮遊培地を５００ｍ　ｌ！　／ｍｉｎにて第
１筒型モジュールの中空糸内側へ送りこんだ。そのうち
１００ｍ　ｌ！　／ｗｉｎの培地を中空糸外側へひき出
し、第２筒型モジュールの中空糸外側を潅流させてから
残りの肝細胞浮遊培地とともに培養槽へ戻した。患者血
液のかわりのハンクス液は第２筒型モジュールの中空糸
内側を５０ｍｆ／ｓｉｎにて潅流した。ハンクス液に塩
化アンモニウムを２回にわたって添加し、ハンクス液お
よび肝細胞浮遊培地におけるアンモニア濃度の変化を測
定した。測定は藤井−奥田法変法によった。

その結果を第２図に示した。さらに、トリパンブルー染
色法にて計数した浮遊肝細胞の生存率もあわせて第２図
に示した。

また、ルミノアグリゴメーターを用いて測定した浮遊肝
細胞のＡＴＰ含量の変化を第３図に示した。

肝細胞の生存率については１２時間の培養でありながら
れずかの低下をみたのみであった。

細胞内ＡＴＰ量は培養開始と同時に増加を始め、７−８
時間後に最大に達した。１２時間後であってもなお、培
養開始時よりも高いレベルにあった。

ハンクス液に添加したアンモニアは、６時間後であって
も培養開始時と全（変らない速度で除去された。肝細胞
浮遊培地側では、アンモニア濃度の増加はほとんどみら
れなかった。

以上より、本発明による代謝補助装置は代謝能を有し、
しかもそれが長時間にわたって安定であるということが
いえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の実施態様の一例を示す概略説明図
である。 第２図は実施例１のアンモニア濃度変化および浮遊肝細
胞の生存率を示し、第３図は実施例１の浮遊肝細胞のＡ
ＴＰ含量変化を示す。 １　、　５　、　１０　、　１１−−−−−−−−−−
−−ポンプ３　　　　　　　−・・・−−−−−−一培
養槽４　　　　　　　　−−−−−−−−−−一第１筒
型モジュール？　　　　　　　　　、−−−−−・−・
−・第２筒型モジュールく　　　　　　　　　　　　　
　　　　　〉ａｍｍｏｎｉａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉ
ｏｎ　（μｙ／ｄ１）　　　　　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　
（％）第　　３　　図 ｔ’ｉｍｅ　（ｈｒ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ａ）異種動物より採取した遊離肝細胞の培養槽；ｂ）０
   ．０５から２μの孔径をもつ中空糸状分離膜より構成さ
   れる第１筒型モジュール； ｃ）分画分子量が２万から３０万である中空糸状限外濾
   過膜より構成される第２筒型モジュール； ｄ）培養槽から浮遊している肝細胞をその培地とともに
   連続的にとり出し、第１筒型モジュールの中空糸内側へ
   送り、分離膜を通過しなかった培地およびそれに浮遊し
   ている肝細胞をともにそのまゝ培養槽へ戻し、分離膜を
   通過した一部の培地は第１筒型モジュールの中空糸外側
   からとり出し、第２筒型モジュールの中空糸外側を潅流
   してから培養槽へ戻すための送液機構；および ｅ）患者からの血液を第２筒型モジュールの中空糸内側
   を連続的に潅流してから患者へ戻すための送液機構； を有することを特徴とする代謝補助装置。