JPS5967965A - 人工肝臓装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 口〕発明の背景 技術分野 本発明は、生物学的人工肝臓装置に関する。さらに具体
的には、本発明は、肝細胞を収容した反応器およびこの
反応器を組込んだハイブリッド型人工肝臓装置に関する
。

先行技術 肝臓は重要な臓器であって、その機能としては生体内で
の解毒作用、すなわちアンモニア処理、薬物代謝および
抱合能なと、および種々の物質の合成、たとえばアルブ
ミン、グロブリン、血液凝固因子などの合成、が知られ
ている。

肝臓のこのような機能が低下した場合には、それを補な
う人工的な装置が必要であり、従って人工肝臓装置がい
ろいろと考案されているところである。

人工肝臓装置は、非生物学的なものと生物学的なものと
に大別することができる。しかし非生物学的人工肝臓装
置は、肝機能の一部である解毒作用を代行する程度のも
のしか考案されていないのが現状なので、前記の複雑な
肝機能をできるだけ代行させるだめには生物学的人工肝
臓装置に頼らざるを得ないことになる。

その生物学的人工肝臓装置の中でも、浮遊肝細胞全利用
した装置が注目を浴びている〔例えば、０ｂｓｔ、里、
　２１　、　（１９７６）　、高橋郁夫二人工臓器ヱ、
（６）、　１０７４．　（１９７８）、同９　（２）、
　３９４．　（１９７８）および同１０　（２）　、　
５３７．　（１９７８））。これらの装置開発と並行し
て肝細胞の培養法も考案されていて、単層静置培養、浮
遊培養法、ビーズ状微粒子担体による細胞培養法［水戸
辿部：日本消化器病学会誌７８　、４３７　（１９８１
）’］などがある。

しかしながら、本来浮遊肝細胞は一般に自己融解が速（
て死細胞が増加し、分離直後の細胞は細°胞異常がある
ので、肝機能維持が難しいものであり、また大量培養の
必要性の問題がある。すなわち前記の従来の培養方法で
は単層静置培養法は大量培養に適さず、浮遊培養法は肝
細胞死亡率が高（て長期間の肝細胞機能維持が困難であ
り、−一ズ担体による方法はこれら三者の短所を補なっ
てはいるが担体への接着性および培養条件に改善の余地
がある、といった難点を指摘することができる。

［ｎ’１発明の概要 本発明は上記の点に解決を与えること全目的とし、ビー
ズに肝細胞を接着させてこれをカラムに充填したものか
らなる反応器によってこの目的全達成しようとするもの
である。

従って、本発明による人工肝臓装置用反応器は、肝細胞
を接着させたビーズを充填したカラムからなること、を
特徴とするものである。

また、本発明による人工肝臓装置は、下記の機器からな
るこ、と、全特徴とするものである。

（Ａ）　　肝細胞を接着させたビーズを充填したカラム
からなる反応器。

（Ｂ）　　患者からの血液の受入部および処理済血液の
送出部を具えた血液透析器。

−（Ｃ）透析液に対する酸素供給器。

（Ｄ）＊ＭＦ器（Ｂ）からの透析液を、酸素供給器（Ｃ
）経本発明は、ビーズに肝細胞を接着させてこれをカラ
ムに充填したものが長期にわたって安定したような問題
点が避は難かったことからすれば、この発見は思いがけ
なかったことというべ（、またビーズに肝細胞を効率よ
く接着させる方法およびその大量培養法を提供すること
とあいまって、本発明は医療領域で有意義な貢献をなす
ものといえよう。

１、反応器 本発明による反応器は、肝細胞を接着させたビーズを充
填したカラムからなるものである。

１）　ビーズ 肝細胞の担体となるビーズは、その上に肝細胞の接着が
可能な各種の素材からなるものでありうる。

そのような素材の代表例は、組織培養用のデキス各ｔ−
ダ系のもの、アガロース系、ポリスチレン系、その他で
ある。

ビーズの大きさは、所定容積のカラム内で所定量の肝細
胞相持のだめの表面積が得られる限り任意である。一般
的にいえば、ビーズの大きさは、ωメツシュ篩（タイラ
ー）通過から２００メツシュ篩残留程度であることが好
ましい。ビーズは、ビーズとして製作されたものであっ
ても、それ全磨砕してたとえば１５０メツシュ篩通過／
　２００メッシユ篩残留程度の大きさにしたものでもよ
い。

砕物（上記程度）である。

このようなビーズは、肝細胞の接着を良好にするため、
適当なコーティング全施したものであることが好ましい
。コーティング剤としては、コラーゲン、フィブロネク
チン、その他があるが、前者が好ましい。従って、本発
明で使用する好ましいビーズは、デキストラン系の組織
培養用ビーズまたはその磨砕物にコラーゲンコーチイン
３／′金施したものである。なお、コラーゲンコーティ
ング法自身は公知である（例えば、Ｆｍｐｅｒｉｒｎｅ
ｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌＲｅｓｅａｒｃｈ　９４．７０．　
（１，９７５）参照）。

肝細胞は、犬、豚、牛、類人猿あるいはヒトの肝臓由来
のものが使用可能であるが、免疫学的等の見地からヒト
由来のものが好ましい。

２）肝細胞の接着 肝細胞の接着は、合目的的な任意の方法で行なうことが
できる。好ましい方法は、浮遊肝細胞を、ビーズと共に
培養することからなるものである。

特に好まドアい肝細胞接着ビーズの製造法は、浮遊肝細
胞をビーズと共に培養ビン中でビンの静置および回転か
らなる操作全反復しながら培養することからなるもので
ある。ここで「回転」とは、培養ビンがそのある軸を中
心に０．５回転以上動（ことを意味する。

３）カラム 上記のようにして肝細胞を接着させたビーズは、好まし
くは遊離ないし非接着肝細胞全除去してから、また必要
に応じて粒状希釈剤（たとえば、肝細胞全接着してない
デキストランビーズその他）と共に、カラムに充填する
。

カラムの犬ぎさは、たとえば１．６０ｍｍ径×５００薗
長さ程度のビーズ床が形成される程度であるのがふつう
である。ビーズ床のカラム゛入口側および出口倶ｊは、
適当なフィルターでビーズの逸出を防止するようにすべ
きであることはいうまでもない。

２、ハイブリッド型人工肝臓装置 １）構成 本発明によるハイブリッド型人工肝臓装置は、下記の機
器からなるものである。

（１）反応器（Ａ） 反応器（Ａ）は、上記した通りのものである。

液全流し、他方の側に透析液を流して、血液と透析液と
の間の濃度差によって毒性物質を除去したり、血液中の
不足物質を補給したりすることができる任意の装置であ
りうる。

このような装置は肝臓疾患のある患者の血液透析に慣用
されているものであり、その具体的構造は、たとえば、
ｉ層平板型、中空糸型等があって、その詳細は「医学の
あゆみ、１０５巻、第５号、４９７　（１９７８）Ｊに
記載されている。透析膜の具体例は、たとえば、ポリア
クリロニトリル（ＰＡＮ）膜等である。

（３）酸素供給器（Ｃ） 酸素供給器（Ｃ）は、透析液の溶存酸素濃度をあげて、
肝細胞を長期間生存させる目的をもつ装置であって、基
本的には人工肺等に用いられている気泡型、模型、フィ
ルム型等のガス交換の構造をもつものである。

このような装置の具体例は、たとえば、「人工臓器資料
集成（ライフサイエンスセンター刊）（１９７６）、ｐ
３７１Ｊに記載されている。

（４）送液機構 送液機構（Ｄ）は、上記各機器間を透析液が輸送される
ように連結する配管およびポンプ機構からなる。

配管は透析液および肝細胞に対して無害な素材からなる
接液表面を持つべきであり、具体的には、たとえば、シ
リコーンゴムチューブ、゛その他がある。

ポンプ機構も透析液および肝細胞に対して無害な素材か
らなる接液表面金持つべきである。ポンプの送液原理も
、透析液または血液の管内輸送に慣用されている任意の
ものでありうる。

ポンプの具体例は、たとえば「人工臓器貸料集成（ライ
フサイエンスセンター刊）　（１９７６）、ｐ１６５Ｊ
に記載されている。

（５）透析液 透析液は人工肝臓装置の部材とはいえないかも知れない
が、この装置を作動させるためにば重要な要素である。

本発明で使用する透析液は、前記した透析器の機能を実
現するだめの組成を持つものであるとともに、肝細胞に
対して無害であるうえその生育を維持する組成のもので
なければならない。

本発明で使用するのに適した透析液の一例は、無機塩（
ＮａＣ１、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩、
ＮａＨＣＯ３およびＫＣＩ等）やアミノ酸およびビタミ
ン（正常の血清成分と同一濃度のもの）全含有し、血液
と等張でかつｐＨ７，４のもの、である。

２）機能 第１図は、上記のハイブリッド型人工肝臓装置の一例に
ついてその機能を示￥概略図である。

患者（ヒトがふつうであるが、肝機能低下な℃・Ｉ７障
簀ヲおこしている動物を一般に意味するものとする）１
からの血液は、管路２から透析装置３に入って、透析さ
れる。この液は透析液流出管４によって酸素供給器５へ
送られ、ポンプ６によって反応器７へ送られる。ポンプ
の能力は、透析液の反応器通過線速度が０．３〜Ｑｊｔ
ｂとえばＱ、５ｃｍ／分前後、となるようなものが適当
である。

反応器７を通過した透析液は、透析液流入管８で透析器
３に戻る。解毒洗滌された血液は、血流流出管９によっ
て、患者に戻される。

図示の装置は、種々の改変が可能である。たとえば、ポ
ンプ６は、３−５−７−３の閉回路の任意の位置に任意
の基数金膜けることができ、機器３．５および７は複数
基を直列または並列に設けて能力の増大または補修の容
易化を計ることができる。運転自動化のための計装を行
なうことができることもいうまでもない。

実施例 １）培養条件の検討 実験に使用した肝細胞の調製はＢｅｒｒｙおよびＦｒ１
ｅｎｄのコラゲナーゼ潅流法ＣＢｅｒｒｙ、　Ｍ、Ｗ、
、Ｆｒ１ｅｎｄ、　Ｄ、Ｓ、：　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、　４３．５０６、（１９６９）　’］に準じて行な
い、培地は１０％のＤＭＥ培地（Ｄｕｌｂｅ−ｃｃｏ’
ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　
）　　と１９９培地を１＝１で用い、これに１０チの割
合で胎児牛血清と１０−６Ｍの割合でインシュリンおよ
び１０−５Ｍの割合でデキサメサゾンを添加して使用し
た。検討を行なった培養器および培養条件を第１表に示
す。なお、ビーズは「サイトテックス」（ファルマシテ
社）を用いた。ビーズの調整は、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルス・エイ・ビーの「マイクロキャリアー・
セル・カルチャー・テクニカルノート」に準じて行なっ
た。なお、「サイトテックス１」はＤＥＡＥデキストラ
ンであるといわれて℃するものである。

第１表 なお、各培養器は、第２図で示されたものであるように
した自作膜の培養ビンである。

第２図Ｂは、培養ビンの中心軸が底と接し、攪拌子とそ
の効率を高めるために攪拌板を有するもので市販品であ
る。

第２図Ｃは一般に用いられている細口ビンを培養ビンと
して用いたものである。

ビーズに接着した細胞数の測定は、下記の通りに行なっ
た。すなわち、櫂、拌培養の場合ノは攪拌を止めてから
、また回転培養ビンは壁についているビーズをかき落し
て静置させてから、下に沈んでいるビーズ全培養液とと
もに０．５　ｍｌ　　サンプリングした。試料は自然沈
降させ、上清を取って”ＢＳ（＋）　’ＣＯ８９ｍｌ　
入れた後、ビーズ全スライドグラスにのせてＰＢＳ（＋
）ｉ滴下し、浮遊している細胞を極力取り除いて、顕微
鏡下（Ｘ　２００　）でビーズおよび接着している細胞
をカウントした。ビーズは１試料あたり約刃個を数え、
平均表面積を１．１９×１０４ｃＩｎ２　として１個の
ビーズ当りの接着細胞数を計算し、１α２当りの接着細
胞数金求めた。

この結果を第２表に示した。

第２表 この表に示した数値は■’ｅ　１００　％としたときの
肝細胞の接着ノミ−セントラ示す。この表から培養条件
は■の回転ビンによる培養で３０分静置後手で半回私行
なう方法がよかった。

なお、３０分静置後１５〜２Ｏｒｐｍで０．５回転以上
させても■と同様の結果？得た。

′　−、ｔ、　　　　−一°１ ２　″　・　　　−′、　　　　　−’−−ｈ。

。　　　゛、　　　　　１′　、 ２）ビーズの選択およびコラーゲンコーティング効果の
検討 肝細胞の調製は実験１）と同様であった。培養器として
は、１２０　ｍｌ　　用の細口ビンを用いた。培養条件
は、（９）分静置後、２Ｏｒｐｍで半回転、肝細胞はＩ
　ＸＩＯｖｌａｂｌｅｃｅｌｌｓ　　（平均生存率９３
．６％）、培養液は１０ｍ１　　、で行なった。ビーズ
としては、「サイトデックスＩＪ、Ｈ砕した「サイトデ
ックスＩＪおよび「バイオシロン」（ヌンク社）Ｋｌい
、いずれもビーズ表面積が１ｏｏＣｒＩＬ２　　になる
ように入れた。

（１）摩砕した「サイトデックス１」の調製「サイトデ
ックス１」適量を乳鉢に入れてＰＢＳ（−）で膨潤させ
、乳棒で摩砕し、これ’ｃ　１５０〜２００メツシユの
篩（タイラー）に通し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、篩上に
残ったビーズを取り上記α）培養条件検討の項）の「サ
イトデックス１」の調整方法に従った。

（２）バイオシロンの調整 「バイオシロン」（ヌンク社）はホリスチレン製で、特
殊表面処理に１〜だものである。ビーズ１ｇは表面積２
５５α２で２Ｘ１０”個、比重は１．０５、平均粒子径
は２３０μｍである。本実験では０．３９２ｇ、表面積
１００Ｃｒ＋Ｉ”ｅ用い、調整は「バイオシロン％１」
の「カルテペーション・プリンシプルズ・アンド・ワー
キング・プロセデュア」（ヌンク社）に従った。

（３）　　コラーゲンのコーティング法「サイトデツク
ス１」および「バイオシロン」の重量を各々測定してシ
リコナイズした試験管に入れたものを、また、摩砕ｔま
た「ザイトデツクス１」は水で数回遠心洗浄し、シリカ
ゲルの入ったデシケータ中、減圧下で各々濃縮させたも
のをそれぞれビーズとして使用して、下記の方法に従っ
てコラーゲンコーティングを行なった。すなわち、ビー
ズ体積と同量のコラーゲン溶液を入れ、続いてこの溶液
の８分の１容のイーグルＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　
Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　）　１０倍濃度を
入れ、液の色が橙色から赤色になるまで０．１規定の水
酸化ナトリウムを加えた。その後、３７℃で２〜３時間
放置すると、コラーゲンゲルが生成した。ゲルが形成し
たのち、試験管を振盪させゲルをこわし、次にＰＢＳ（
−）ｉ添加してから遠心にかけて（２０００ｒｐｍ、５
分間）上清およびコラーゲングルの断片全除去したもの
を培地で１回洗浄した。

コラーゲン乾燥コーティング法は、下記の通りに行なっ
た。すなわちシャーレにビーズを入れ、続いてコラーゲ
ン浴液を、「サイトデックス１」ノ場合はこれが膨潤す
るまで、「バイオシロン」の場合はその表面が濡れるま
で加えてデシケータ中、減圧下、５℃以下で完全に乾燥
させた。その後、ＰＢＳ（−）で２回、培地で１回、洗
浄した。

接着肝細胞数の測定は「サイトデックス１」については
実験１）と同じ方法で行ない、「バイオシロン」ハヌン
ク社の「バイオシロン％１、カルチベーション・プリン
シプルズ・アンド・ワーキング・プロセデュア」に従っ
て行なった。

以上の結果を第３表に示した。

第３表 第３表のデータは、培養時間３〜５時間について、コラ
ーゲンコーティングをしていない「サイトデツクス１」
全使用した場合の接着肝細胞数音１００として他のビー
ズの場合の接着肝細胞数を相対値として示したものであ
る。この結果より、摩砕したサイトデツクス１」にコラ
ーゲンコーティングを施したビーズが肝細胞を接着させ
る担体として好ましいことがわかる。

（１）および（２）の結果より、ビーズとしては摩砕し
た「サイトデツクス１」を用い、培養条件としては加分
静置後、１５〜２Ｏｒｐｍで１８０°〜２７０°回転操
作することで効率よく肝細胞を接着培養することができ
るといえる。

３）反応器の安定性 次に上記の方法で作成ｌまたカラム反応器の安定性およ
び解毒能を調べた。

第３図に示すような装置を使用した。この装置は、リザ
ーバー１、ポンプ２およびカラノ・反応器３（内径１．
６　ｃｍ）　ｉ具備している。リザーバーは送気口ａ、
試料採集口すおよびスターラーｃｆ具備しており、送気
口は５　％　ＣＯ２，５０％０゜および４５％Ｎ２　か
らなる気体を送り込むだめのもので、試料採集口は透析
液全採集するだめのものであり、スターラーは酸素供給
効率を向上させて溶液を均一にするためのものである。

なおここで用いた透析液はＢＭＥ　（Ｂａ５ａｌ　Ｆ、
４ｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ　）培養液に１０−６Ｍのイ
ンスリン、１０−５Ｍデキサメサゾン（Ｄｅｘａｍｅ−
ｔｈａｚｏｎｅ　）、１００Ｕ／ｍ］ペニシリン、１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、　０．２５μｇ／ｍ
ｌファンギゾン、′　および１０％牛脂児血清を添加し
たものであり流速は１分間に１ｍｌとした。

このカラム反応器の安定性を調べるため、浮遊肝細胞お
よびビーズ接着肝細胞についてＧＯＴ　（グルタミン酸
・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ）の漏出を調べた。

ＧＯＴは、一般に肝細胞が損傷をうけたときに細胞内部
より漏出する酵素であって、肝細胞の安定性の指標とし
て通常用いられるものである。

なお、「浮遊肝細胞」のＧＯＴは、単離肝細胞溶液を組
織培養用フラスコに入れ、気相に酸素９５％および二酸
化炭素５チを流しながら、３７℃恒温槽で浮遊培養した
ものの培養液を、「ビーズ接着肝細胞」のＧＯＴは上記
の装置（第３図）の試料採集口からの透析液を採集後、
各ｋ　１０００　ｒｐｍで５分間遠心した際の上清をそ
れぞれ試料とし、カーメン（Ｋａｒｍｅｎ　）、法を用
いて測定した。その結果を第４図に示した。この図より
、浮遊肝細胞のＧＯＴは４時間で全体の２０％漏出した
のに対し、ビーズ接着肝細胞のＧＯＴは４時間で全体の
２係漏出したに過ぎなかった。この結果より、カラムに
詰めたビーズ接着肝細胞は安定であるとり・える。

４ン　カラム反応器の解毒能 反応器のｗｆ毒能′ｆｒ：ｌ１Ｍ１べるため、第３図の
採集口より０，１２．２４．３６．４８時時間区採集し
た透析液ヲ（１）と同様に調製し、この溶液に対し最終
濃度が０．２５ｍＭになるようにアンモニアを添加し、
生成する尿素全ジアセチルモノオキシム法ＣＦｅａｒｏ
ｎ。

Ｗ、Ｒｏ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　３３．９０２　
（１９３９）　’）で測定した。

尿素合成能は肝機能を代表すべき機能であってＭ毒能の
指標となるものである。その結果を第５図に示した。

尿素合成能は、合成速度が０〜１２時間で２．２μモル
／時、４８〜６０時間で１．３μモル／時、と落ちては
きているが、（ト）時間目までは尿素合成能が保持され
ていた。

以上より、カラム反応器は解毒能を有していて、しかも
比較的安定であるということがいえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ノ・イブリツｌ？型人工肝臓装置の杉斃會に
を示す概略図である。 ５・・・酸素供給器 ６・・ポンプ ７・・・反応器 第２図は、実験に使用した培養器を示す一部９ノ欠説明
図である。 第３図は、カラム反応器の安全性および解毒肯ヒを調べ
るだめのモデル系を示す。 １・・・リザーバー（ａ：送気口、ｂ：試料採集口、Ｃ
ニスクーラー） ２・・・ポンプ ３・・・カラム反応器 第４図は、反応器の安定性を示すグラフである。 縦軸は、反応器から漏出する全体のＧＯＴ’ｋｌＯＯと
し、各時間のＧＯＴ　ｉ％出をノソーセントで示したも
のである。 １・・・浮遊肝細胞 ２・・・ビーズ接着肝細胞 第５図は、反応器の解毒能を示すグラフである。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 漂 庚 汽４　図 社逼咋間（時間） 乞５　図 仕遍吋間（時開）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、肝細胞全接着させたビーズを充填したカラムからな
   ることを特徴とする、人工肝臓装置用反応器。 ２、ビーズが、デキスチーー≠系の組織培養用ビーズま
   たはその磨砕物にコラーゲンコーティングを施したもの
   である、特許請求の範囲第１項記載の反応器。 ３、肝細胞を接着させたビーズが、浮遊肝細胞をビーズ
   と共に培養ビン中でビンの静置および回転からなる操作
   を反復しながら培養することによってつ（つたものであ
   る、特許請求の範囲第１〜２項のいずれかに記載の反応
   器。 ４、下記の機器からなることを特徴とする、人工肝臓装
   置。 （Ａ）肝細胞を接着させたビーズを充填したカラムから
   なる反応器。 （Ｂ）　　患者からの血液の受入部および処理済血液の
   送出部を具えた血液透析器。