JPH06321802A - ヘモグロビン含有リポソーム - Google Patents
ヘモグロビン含有リポソームInfo
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- JPH06321802A JPH06321802A JP6045539A JP4553994A JPH06321802A JP H06321802 A JPH06321802 A JP H06321802A JP 6045539 A JP6045539 A JP 6045539A JP 4553994 A JP4553994 A JP 4553994A JP H06321802 A JPH06321802 A JP H06321802A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素
反応基質を添加したヘモグロビン溶液を含有するヘモグ
ロビン含有リポソーム。 【効果】ヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制できる。
（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素
反応基質を添加したヘモグロビン溶液を含有するヘモグ
ロビン含有リポソーム。 【効果】ヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体内に投与するヘモ
グロビン含有リポソームに関する。本発明は、更に詳し
くは生体内に投与したときのヘモグロビンの経時酸化を
著しく抑制したヘモグロビン含有リポソームに関する。
グロビン含有リポソームに関する。本発明は、更に詳し
くは生体内に投与したときのヘモグロビンの経時酸化を
著しく抑制したヘモグロビン含有リポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】血液の代用と成り得る薬剤として、ゼラ
チン分解産物の溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエ
チルスターチ（ＨＥＳ）溶液等の血漿増量剤が使用され
ている。しかし、これらの代用血液は大量出血等の緊急
時に血管内の血漿量を補充し、循環動態を維持する目的
で開発された製剤で、天然赤血球の酸素運搬能を代替え
する事はできない。近年、こうした血漿増量剤とは異な
り、天然赤血球類似の酸素運搬能を保持した代用血液と
して、人工酸素運搬体の研究開発が進められている。当
初の開発段階にあっては、フッ化炭素エマルジョン（pe
rfluorochemical:PFC/ [通称：fluorocarbon])の酸素溶
解能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討され
たが、十分な酸素運搬量の不足や体内蓄積性などの問題
点が危惧されている。
チン分解産物の溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエ
チルスターチ（ＨＥＳ）溶液等の血漿増量剤が使用され
ている。しかし、これらの代用血液は大量出血等の緊急
時に血管内の血漿量を補充し、循環動態を維持する目的
で開発された製剤で、天然赤血球の酸素運搬能を代替え
する事はできない。近年、こうした血漿増量剤とは異な
り、天然赤血球類似の酸素運搬能を保持した代用血液と
して、人工酸素運搬体の研究開発が進められている。当
初の開発段階にあっては、フッ化炭素エマルジョン（pe
rfluorochemical:PFC/ [通称：fluorocarbon])の酸素溶
解能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討され
たが、十分な酸素運搬量の不足や体内蓄積性などの問題
点が危惧されている。
【０００３】一方、酸素運搬体として天然赤血球由来ヘ
モグロビンを利用する試みも行われているが遊離ヘモグ
ロビンの生体内半減期は極端に短く（４時間以内）、末
梢への酸素運搬能も低く、腎毒性等の問題点が指摘され
ており、実用化は難しい。最近、こうした遊離ヘモグロ
ビン溶液の持つ問題点を改善した修飾ヘモグロビン（安
定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビンetc.）やリポソー
ム化ヘモグロビンの開発の検討が中心と成りつつある。
その例として、ヘモグロビンを含有するリポソームとし
て薄膜法により製造されたものがミラー（Miller）らに
よって報告されている（米国特許第4,133,874号）。こ
の方法によればヘモグロビン含有リポソームは、リポソ
ーム形成脂質をクロロホルム等の適当な有機溶媒に溶解
し、得られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜をつく
り、この薄膜に溶血ヘモグロビン水溶液を加え、激しく
攪拌して多重層リポソームを形成し、次にこれを超音波
処理することによって得られる。この方法によれば、ヘ
モグロビンが酸素に触れる時間が少ないのでヘモグロビ
ンの変性が比較的少ない利点がある。
モグロビンを利用する試みも行われているが遊離ヘモグ
ロビンの生体内半減期は極端に短く（４時間以内）、末
梢への酸素運搬能も低く、腎毒性等の問題点が指摘され
ており、実用化は難しい。最近、こうした遊離ヘモグロ
ビン溶液の持つ問題点を改善した修飾ヘモグロビン（安
定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビンetc.）やリポソー
ム化ヘモグロビンの開発の検討が中心と成りつつある。
その例として、ヘモグロビンを含有するリポソームとし
て薄膜法により製造されたものがミラー（Miller）らに
よって報告されている（米国特許第4,133,874号）。こ
の方法によればヘモグロビン含有リポソームは、リポソ
ーム形成脂質をクロロホルム等の適当な有機溶媒に溶解
し、得られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜をつく
り、この薄膜に溶血ヘモグロビン水溶液を加え、激しく
攪拌して多重層リポソームを形成し、次にこれを超音波
処理することによって得られる。この方法によれば、ヘ
モグロビンが酸素に触れる時間が少ないのでヘモグロビ
ンの変性が比較的少ない利点がある。
【０００４】しかしながら、これらヘモグロビンを原料
とした人工赤血球の酸素運搬能はヘモグロビンと酸素分
子との可逆的結合により生じ、ヘム鉄（プロトヘム）の
原子価が２価の状態（Ｆｅ2+）でのみ保たれる機能であ
る。ヘモグロビンはその可逆的酸素化（oxigenation)の
過程で徐々に酸化（oxidation)され酸素結合能を持たな
い３価のメトヘモグロビン（Ｆｅ3+）に変化する。この
ため正常赤血球は、これらの酸化作用に対し、ヘモグロ
ビンが酸化されるのを抑制する機構を持っている。しか
し、こうした天然赤血球の酸化抑制機構は、人工酸素運
搬体として調製されたヘモグロビン溶液においては認め
られず、ヘモグロビン酸化物の占める割合は経時的に増
加する。このため、天然ヘモグロビンならびにその誘導
体を医薬品や試薬として使用する場合には、酸化防止剤
あるいは還元剤を用いる必要があった。亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一鉄、エチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム等の物質が知られているが、生体
に対して有害となる。また、還元型グルタチオン、アス
コルビン酸、トコフェロール類、糖類、アミノ酸類など
も一般に用いられる。しかしながら、これらの添加物の
抑制効果は低く、特に体内投与後の経時的な酸化抑制効
果は不十分であった。
とした人工赤血球の酸素運搬能はヘモグロビンと酸素分
子との可逆的結合により生じ、ヘム鉄（プロトヘム）の
原子価が２価の状態（Ｆｅ2+）でのみ保たれる機能であ
る。ヘモグロビンはその可逆的酸素化（oxigenation)の
過程で徐々に酸化（oxidation)され酸素結合能を持たな
い３価のメトヘモグロビン（Ｆｅ3+）に変化する。この
ため正常赤血球は、これらの酸化作用に対し、ヘモグロ
ビンが酸化されるのを抑制する機構を持っている。しか
し、こうした天然赤血球の酸化抑制機構は、人工酸素運
搬体として調製されたヘモグロビン溶液においては認め
られず、ヘモグロビン酸化物の占める割合は経時的に増
加する。このため、天然ヘモグロビンならびにその誘導
体を医薬品や試薬として使用する場合には、酸化防止剤
あるいは還元剤を用いる必要があった。亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一鉄、エチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム等の物質が知られているが、生体
に対して有害となる。また、還元型グルタチオン、アス
コルビン酸、トコフェロール類、糖類、アミノ酸類など
も一般に用いられる。しかしながら、これらの添加物の
抑制効果は低く、特に体内投与後の経時的な酸化抑制効
果は不十分であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を鑑み以下の課題の少なくとも１つを解決しようとす
るものである。すなわち、ヘモグロビンの経時の酸化が
抑制され、特に、体内に投与した時のヘモグロビンの酸
化が抑制されたヘモグロビン含有リポソームを提供する
ものである。
点を鑑み以下の課題の少なくとも１つを解決しようとす
るものである。すなわち、ヘモグロビンの経時の酸化が
抑制され、特に、体内に投与した時のヘモグロビンの酸
化が抑制されたヘモグロビン含有リポソームを提供する
ものである。
【０００６】
【問題を解決するための手段】この上記課題は下記の構
成からなる、本発明のヘモグロビン含有リポソームによ
り解決される。 （１）脂質からなるリポソーム内に天然赤血球由来およ
び／または酸化還元系の酵素活性を保持したヘモグロビ
ン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソームに
おいて、前記ヘモグロビン溶液内に、還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／また
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質が添加されている
ことを特徴とするヘモグロビン含有リポソーム。ここ
で、酵素反応基質の添加量が、ヘモグロビン１モルに対
し、０．１〜２５モルであるヘモグロビン含有リポソー
ムが好ましい。 （２）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵
素反応基質が有機酸またはその誘導体であることを特徴
とする（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
成からなる、本発明のヘモグロビン含有リポソームによ
り解決される。 （１）脂質からなるリポソーム内に天然赤血球由来およ
び／または酸化還元系の酵素活性を保持したヘモグロビ
ン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソームに
おいて、前記ヘモグロビン溶液内に、還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／また
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質が添加されている
ことを特徴とするヘモグロビン含有リポソーム。ここ
で、酵素反応基質の添加量が、ヘモグロビン１モルに対
し、０．１〜２５モルであるヘモグロビン含有リポソー
ムが好ましい。 （２）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵
素反応基質が有機酸またはその誘導体であることを特徴
とする（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【０００７】（３）上記有機酸またはその誘導体が、リ
ンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−
ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ（補酵素Ａのスクシ
ニル誘導体）、コハク酸、フマル酸、アスパラギン酸、
ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、アセチルＣｏ
Ａ（補酵素Ａのアセチル誘導体）、グルタミン酸である
（１）及び（２）記載のヘモグロビン含有リポソーム。 （４）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）、または還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応
基質が嫌気的解糖系糖代謝中間体であることを特徴とす
る（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。 （５）上記嫌気的解糖系糖代謝中間体が、グルコース、
グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−ジリン
酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤＰ−グルコース、
Ｌ−グロネート、キシリトール、ソルビトール、α−グ
リセロール−リン酸、グリセルアルデヒド−３−リン
酸、ラクテートである（４）記載のヘモグロビン含有リ
ポソーム。 （６）上記ヘモグロビン溶液内に、さらに有機リン酸化
合物が含有されている（１）乃至（５）に記載のヘモグ
ロビン含有リポソーム。ここで有機リン酸化合物の添加
量が、ヘモグロビン１モルに対し、０．０５〜４モルで
あるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。さらに、
有機リン酸化合物が、イノシトールヘキサホスフェート
であるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。 （７）上記脂質中にトコフェロール類またはその誘導体
が含有されている（１）乃至（６）に記載のヘモグロビ
ン含有リポソーム。ここで、トコフェロール類またはそ
の誘導体の添加量が、リポソーム膜の総脂質に対して
０．５〜４．５モル％であるヘモグロビン含有リポソー
ムが好ましい。
ンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−
ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ（補酵素Ａのスクシ
ニル誘導体）、コハク酸、フマル酸、アスパラギン酸、
ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、アセチルＣｏ
Ａ（補酵素Ａのアセチル誘導体）、グルタミン酸である
（１）及び（２）記載のヘモグロビン含有リポソーム。 （４）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）、または還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応
基質が嫌気的解糖系糖代謝中間体であることを特徴とす
る（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。 （５）上記嫌気的解糖系糖代謝中間体が、グルコース、
グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−ジリン
酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤＰ−グルコース、
Ｌ−グロネート、キシリトール、ソルビトール、α−グ
リセロール−リン酸、グリセルアルデヒド−３−リン
酸、ラクテートである（４）記載のヘモグロビン含有リ
ポソーム。 （６）上記ヘモグロビン溶液内に、さらに有機リン酸化
合物が含有されている（１）乃至（５）に記載のヘモグ
ロビン含有リポソーム。ここで有機リン酸化合物の添加
量が、ヘモグロビン１モルに対し、０．０５〜４モルで
あるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。さらに、
有機リン酸化合物が、イノシトールヘキサホスフェート
であるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。 （７）上記脂質中にトコフェロール類またはその誘導体
が含有されている（１）乃至（６）に記載のヘモグロビ
ン含有リポソーム。ここで、トコフェロール類またはそ
の誘導体の添加量が、リポソーム膜の総脂質に対して
０．５〜４．５モル％であるヘモグロビン含有リポソー
ムが好ましい。
【０００８】（８）前記ヘモグロビン溶液内（１）〜
（７）のそれぞれに、さらに還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）お
よび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ）よりなる群から選ばれる少なくとも１つ
が添加されている（１）〜（７）のいずれかに記載のヘ
モグロビン含有リポソーム。 （９）洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３
０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添
加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い
緩和な条件下でリポソーム化することを特徴とする
（１）乃至（８）のいずれかに記載のヘモグロビン含有
リポソームの製法。ここで、ヘモグロビン溶液中の酵素
失活がない緩和な条件が、４０℃以下で、５０〜１８０
０kg/cm2の圧で細隙から１〜数回吐出させることである
ヘモグロビン含有リポソームの製法が好ましい。
（７）のそれぞれに、さらに還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）お
よび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ）よりなる群から選ばれる少なくとも１つ
が添加されている（１）〜（７）のいずれかに記載のヘ
モグロビン含有リポソーム。 （９）洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３
０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添
加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い
緩和な条件下でリポソーム化することを特徴とする
（１）乃至（８）のいずれかに記載のヘモグロビン含有
リポソームの製法。ここで、ヘモグロビン溶液中の酵素
失活がない緩和な条件が、４０℃以下で、５０〜１８０
０kg/cm2の圧で細隙から１〜数回吐出させることである
ヘモグロビン含有リポソームの製法が好ましい。
【０００９】本発明はヘモグロビン含有リポソームの酸
化変性に対する問題を解決するために、還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／ま
たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添加し、経時
的に生成するヘモグロビン酸化物を還元することによ
り、ヘモグロビンの経時酸化に伴う機能低下を防止する
ものである。
化変性に対する問題を解決するために、還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／ま
たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添加し、経時
的に生成するヘモグロビン酸化物を還元することによ
り、ヘモグロビンの経時酸化に伴う機能低下を防止する
ものである。
【００１０】本発明に用いるＮＡＤＨおよび／またはＮ
ＡＤＰＨを生じる酵素反応基質は特に制限されず、生体
内に存在する酵素の単数または複数の組み合わせによる
酵素反応の結果、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じるも
のであればよいが、有機酸またはその誘導体が好まし
く、特に単数の酵素反応によってＮＡＤＨが生じること
からリンゴ酸が好ましいが、オキサロ酢酸、クエン酸、
イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏ
Ａ、コハク酸、フマル酸、アルパラギン酸、ピルビン
酸、ホスホエノールピルビン酸、エタノールピルビン酸
リン酸、アセチルＣｏＡ、グルタミン酸等のクエン酸回
路（トリカルボン酸回路〔ＴＣＡサイクル〕、クレブス
回路ともいう）によってリンゴ酸が生じる有機酸も使用
できる。また、他にも嫌気的解糖系糖代謝中間体であ
る、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルコース
−１，６−ジリン酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤ
Ｐ−グルコース、Ｌ−グロネート、キシリトール、ソル
ビトール、α−グリセロール−リン酸、グリセラルデハ
イド−３−リン酸、ラクテートなども使用でき、つまり
生体内に存在する酵素の単数または複数を組み合わせた
酵素反応の際にＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを生じるも
のであれば使用できる。また、場合によっては複数の基
質を組み合わせて使用してもよい。本発明において、Ｎ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質の量（重
量モル比）はヘモグロビンを１モルとした場合、０．１
〜２５モル、好ましくは１〜２０モル、より好ましくは
４〜１２モルである。０．１より少ないとヘモグロビン
のメト化防止効果が少なく、また２５より多いと溶液の
流動性の問題でリポソーム化効率が低下するのであまり
好ましくはない。
ＡＤＰＨを生じる酵素反応基質は特に制限されず、生体
内に存在する酵素の単数または複数の組み合わせによる
酵素反応の結果、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じるも
のであればよいが、有機酸またはその誘導体が好まし
く、特に単数の酵素反応によってＮＡＤＨが生じること
からリンゴ酸が好ましいが、オキサロ酢酸、クエン酸、
イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏ
Ａ、コハク酸、フマル酸、アルパラギン酸、ピルビン
酸、ホスホエノールピルビン酸、エタノールピルビン酸
リン酸、アセチルＣｏＡ、グルタミン酸等のクエン酸回
路（トリカルボン酸回路〔ＴＣＡサイクル〕、クレブス
回路ともいう）によってリンゴ酸が生じる有機酸も使用
できる。また、他にも嫌気的解糖系糖代謝中間体であ
る、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルコース
−１，６−ジリン酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤ
Ｐ−グルコース、Ｌ−グロネート、キシリトール、ソル
ビトール、α−グリセロール−リン酸、グリセラルデハ
イド−３−リン酸、ラクテートなども使用でき、つまり
生体内に存在する酵素の単数または複数を組み合わせた
酵素反応の際にＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを生じるも
のであれば使用できる。また、場合によっては複数の基
質を組み合わせて使用してもよい。本発明において、Ｎ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質の量（重
量モル比）はヘモグロビンを１モルとした場合、０．１
〜２５モル、好ましくは１〜２０モル、より好ましくは
４〜１２モルである。０．１より少ないとヘモグロビン
のメト化防止効果が少なく、また２５より多いと溶液の
流動性の問題でリポソーム化効率が低下するのであまり
好ましくはない。
【００１１】本発明に用いるリポソームの脂質としては
リポソームが形成できるものであれば特に制限はなく、
天然のもの及び合成のものが利用できる。その例として
は、レシチン（＝ホスファチジルコリン）、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチ
ジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリビ
ン、等、およびこれらを常法に従って水素添加したもの
があげられ、これらを組み合わせて用いることもでき
る。本発明に使用するヘモグロビンは、赤血球を常法に
よって溶血し膜除去した分画分子量１万の膜を使用した
限外濾過により３０％（ｗ／ｖ）以上に濃縮したものが
使用される。ヘモグロビンは水溶液の形態で取り込ま
れ、その濃度は３０〜６０％（ｗ／ｖ）、特には４０〜
５０％（ｗ／ｖ）が好ましい。この濃度とするのは、末
梢組織への酸素運搬量は、リポソーム内のヘモグロビン
量に依存して増大するためリポソーム化が可能な範囲内
で最も高濃度であることが好ましいからである。本発明
において、上記のヘモグロビン溶液内にさらに有機リン
酸化合物が含まれていてもよい。これは、イノシトール
ヘキサホスフェート、テトラポリリン酸、ピリドキサル
−５’−リン酸、ＡＴＰなどのリン化合物を末梢におけ
る酸素放出量を調整するため、好ましくはヘモグロビン
１モルに対し、０．５モル〜１．５モル加えても良い。
この量は使用するリン化合物により、若干、効果に差が
ある。本発明において使用する赤血球は、本発明のヘモ
グロビン含有リポソームをヒトに使用する場合、ヒト由
来のものであれば特に問題はなく、また、新鮮なもの程
良いが、採血後４℃以下で５０日以上保存したものでも
充分に使用できる。本発明において、上述の酵素反応基
質のみならず、これらに加えて還元型ＮＡＤＨ、酸化型
ＮＡＤ、還元型ＮＡＤＰＨ、酸化型ＮＡＤＰ等の酵素を
ヘモグロビン溶液に加えてもよい。その量はヘモグロビ
ン１モルに対して０．１モル〜２５モルとするのが好ま
しい。
リポソームが形成できるものであれば特に制限はなく、
天然のもの及び合成のものが利用できる。その例として
は、レシチン（＝ホスファチジルコリン）、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチ
ジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリビ
ン、等、およびこれらを常法に従って水素添加したもの
があげられ、これらを組み合わせて用いることもでき
る。本発明に使用するヘモグロビンは、赤血球を常法に
よって溶血し膜除去した分画分子量１万の膜を使用した
限外濾過により３０％（ｗ／ｖ）以上に濃縮したものが
使用される。ヘモグロビンは水溶液の形態で取り込ま
れ、その濃度は３０〜６０％（ｗ／ｖ）、特には４０〜
５０％（ｗ／ｖ）が好ましい。この濃度とするのは、末
梢組織への酸素運搬量は、リポソーム内のヘモグロビン
量に依存して増大するためリポソーム化が可能な範囲内
で最も高濃度であることが好ましいからである。本発明
において、上記のヘモグロビン溶液内にさらに有機リン
酸化合物が含まれていてもよい。これは、イノシトール
ヘキサホスフェート、テトラポリリン酸、ピリドキサル
−５’−リン酸、ＡＴＰなどのリン化合物を末梢におけ
る酸素放出量を調整するため、好ましくはヘモグロビン
１モルに対し、０．５モル〜１．５モル加えても良い。
この量は使用するリン化合物により、若干、効果に差が
ある。本発明において使用する赤血球は、本発明のヘモ
グロビン含有リポソームをヒトに使用する場合、ヒト由
来のものであれば特に問題はなく、また、新鮮なもの程
良いが、採血後４℃以下で５０日以上保存したものでも
充分に使用できる。本発明において、上述の酵素反応基
質のみならず、これらに加えて還元型ＮＡＤＨ、酸化型
ＮＡＤ、還元型ＮＡＤＰＨ、酸化型ＮＡＤＰ等の酵素を
ヘモグロビン溶液に加えてもよい。その量はヘモグロビ
ン１モルに対して０．１モル〜２５モルとするのが好ま
しい。
【００１２】本発明において、リポソームにはその酸化
を防止するためにトコフェロール同族体すなわちビタミ
ンＥを添加してもよい。トコフェロールには、α，β，
γ，δの４個の異性体が存在するが、本発明においては
いずれの異性体も使用することができる。また、酢酸ト
コフェロール・トコフェロールリン酸等の公知のトコフ
ェロール誘導体も同様の目的で使用できる。トコフェロ
ールの添加量はリポソーム膜の総脂質に対して０．５〜
４．５モル％、好ましくは１．０〜２．０モル％であ
る。本発明においては、リポソーム膜の構成成分として
所望によりステロール類や脂肪酸等の電荷付与物質を添
加して、膜構造の強化や体内消失時間の調節を図ること
ができる。
を防止するためにトコフェロール同族体すなわちビタミ
ンＥを添加してもよい。トコフェロールには、α，β，
γ，δの４個の異性体が存在するが、本発明においては
いずれの異性体も使用することができる。また、酢酸ト
コフェロール・トコフェロールリン酸等の公知のトコフ
ェロール誘導体も同様の目的で使用できる。トコフェロ
ールの添加量はリポソーム膜の総脂質に対して０．５〜
４．５モル％、好ましくは１．０〜２．０モル％であ
る。本発明においては、リポソーム膜の構成成分として
所望によりステロール類や脂肪酸等の電荷付与物質を添
加して、膜構造の強化や体内消失時間の調節を図ること
ができる。
【００１３】本発明のヘモグロビン含有リポソームは、
洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６
０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、リンゴ酸を
添加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無
い緩和な条件下で、リポソーム化することによって得る
ことができる。なお、前記酵素失活が無い緩和な条件下
とは、高圧吐出処理が好ましく、５０〜１８００kg/c
m2、好ましくは８０〜１２００kg/cm2の圧で細隙から１
回〜数回吐出させることである。また、処理温度は４０
℃以下に保持する。具体的な例としては、高圧吐出型乳
化機に、マイクロフルイダイザー １１０Ｙ[Microflui
dizer 110Y] （マイクロフルイダイザー社[Microfluidi
cs Co.] ）を用いる場合には４８０〜１４５０kg/cm2、
パール細胞破砕器（パール社[Parr Co.]）を用いる場合
には８０〜２００kg/cm2であり、いずれも４０℃以下、
好ましくは４℃〜氷冷下で実施する。
洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６
０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、リンゴ酸を
添加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無
い緩和な条件下で、リポソーム化することによって得る
ことができる。なお、前記酵素失活が無い緩和な条件下
とは、高圧吐出処理が好ましく、５０〜１８００kg/c
m2、好ましくは８０〜１２００kg/cm2の圧で細隙から１
回〜数回吐出させることである。また、処理温度は４０
℃以下に保持する。具体的な例としては、高圧吐出型乳
化機に、マイクロフルイダイザー １１０Ｙ[Microflui
dizer 110Y] （マイクロフルイダイザー社[Microfluidi
cs Co.] ）を用いる場合には４８０〜１４５０kg/cm2、
パール細胞破砕器（パール社[Parr Co.]）を用いる場合
には８０〜２００kg/cm2であり、いずれも４０℃以下、
好ましくは４℃〜氷冷下で実施する。
【００１４】天然赤血球中のヘモグロビンは、経時酸化
によりメトヘモグロビンとなるが、図１に示す赤血球酵
素の作用により元のヘモグロビンへ還元され、可逆的に
ヘモグロビン−メトヘモグロビンの反応が起こってい
る。しかしながら、本発明のようにリポソームに含有さ
せるために天然赤血球外に取り出されたヘモグロビンは
このようなメトヘモグロビン還元機構が働かなくなり、
一度メト化したヘモグロビンは再びヘモグロビンに戻る
ことができず、酸素運搬機能を失ってしまう。これは、
リポソーム化の段階でヘモグロビンにかかる物理的エネ
ルギーあるいは熱によって、酵素が失活してしまうのが
原因と考えられる。本発明者は、リポソーム化処理条件
を検討し、ヘモグロビン溶液中の酵素活性が維持できる
５０〜１６００kg/cm2、好ましくは８０〜１２００kg/c
m2の圧で細隙から１回〜数回吐出させるなどの穏やかな
製造条件を設定してヘモグロビン含有リポソームを製造
した。しかしながら、これらのヘモグロビン含有リポソ
ームでもなお、体内投与後の不可逆的なヘモグロビン経
時酸化は進行した。なお、このような酵素失活がない緩
和な条件下でリポソーム化すると、ヘモグロビン中のＮ
ＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素の活性残存率
が、処理前の７０％以上、好ましくは９０％以上残存す
る。また、リンゴ酸脱水素酵素活性の残存率は、処理前
の５０％以上、好ましくは７０％以上である。
によりメトヘモグロビンとなるが、図１に示す赤血球酵
素の作用により元のヘモグロビンへ還元され、可逆的に
ヘモグロビン−メトヘモグロビンの反応が起こってい
る。しかしながら、本発明のようにリポソームに含有さ
せるために天然赤血球外に取り出されたヘモグロビンは
このようなメトヘモグロビン還元機構が働かなくなり、
一度メト化したヘモグロビンは再びヘモグロビンに戻る
ことができず、酸素運搬機能を失ってしまう。これは、
リポソーム化の段階でヘモグロビンにかかる物理的エネ
ルギーあるいは熱によって、酵素が失活してしまうのが
原因と考えられる。本発明者は、リポソーム化処理条件
を検討し、ヘモグロビン溶液中の酵素活性が維持できる
５０〜１６００kg/cm2、好ましくは８０〜１２００kg/c
m2の圧で細隙から１回〜数回吐出させるなどの穏やかな
製造条件を設定してヘモグロビン含有リポソームを製造
した。しかしながら、これらのヘモグロビン含有リポソ
ームでもなお、体内投与後の不可逆的なヘモグロビン経
時酸化は進行した。なお、このような酵素失活がない緩
和な条件下でリポソーム化すると、ヘモグロビン中のＮ
ＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素の活性残存率
が、処理前の７０％以上、好ましくは９０％以上残存す
る。また、リンゴ酸脱水素酵素活性の残存率は、処理前
の５０％以上、好ましくは７０％以上である。
【００１５】しかし本発明者らはさらに鋭意研究を行っ
た結果、上記のような穏やかな条件で製造するとき、Ｎ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質をヘモグ
ロビン溶液中に共存させることによって、体内投与後の
ヘモグロビンの経時酸化を顕著に抑制できることを発見
した。そのメカニズムは次のように考えられ、リンゴ酸
を例にして説明する。つまり、上記のような穏やかな条
件でリポソーム化を行えば、ヘモグロビン溶液中の酵素
は失活することはないが、天然赤血球から膜成分を除去
し、ヘモグロビンを取り出す過程、または精製、濃縮の
過程で分子量１万以下の酵素基質や補酵素類等の酵素反
応に必要な物質も失われてしまい、結果的にメトヘモグ
ロビン還元酵素反応が消失してしまう。そこで、リンゴ
酸を添加すると、リンゴ酸がメトヘモグロビン還元反応
に必要なＮＡＤＨ再生系の基質となり、つまりリンゴ酸
デヒドロゲナーゼによりオキサロ酢酸になると同時にＮ
ＡＤＨを再生し図２に示したような天然赤血球と同じメ
トヘモグロビン還元反応がおこり、ヘモグロビンの経時
酸化の抑制に寄与しているものと推定される。
た結果、上記のような穏やかな条件で製造するとき、Ｎ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質をヘモグ
ロビン溶液中に共存させることによって、体内投与後の
ヘモグロビンの経時酸化を顕著に抑制できることを発見
した。そのメカニズムは次のように考えられ、リンゴ酸
を例にして説明する。つまり、上記のような穏やかな条
件でリポソーム化を行えば、ヘモグロビン溶液中の酵素
は失活することはないが、天然赤血球から膜成分を除去
し、ヘモグロビンを取り出す過程、または精製、濃縮の
過程で分子量１万以下の酵素基質や補酵素類等の酵素反
応に必要な物質も失われてしまい、結果的にメトヘモグ
ロビン還元酵素反応が消失してしまう。そこで、リンゴ
酸を添加すると、リンゴ酸がメトヘモグロビン還元反応
に必要なＮＡＤＨ再生系の基質となり、つまりリンゴ酸
デヒドロゲナーゼによりオキサロ酢酸になると同時にＮ
ＡＤＨを再生し図２に示したような天然赤血球と同じメ
トヘモグロビン還元反応がおこり、ヘモグロビンの経時
酸化の抑制に寄与しているものと推定される。
【００１６】成熟（天然）赤血球は核もミトコンドリ
ア、リボソームなどの細胞内小器官も持たず、蛋白質や
脂質合成能はない。また、ミトコンドリアを有していな
いためＴＣＡサイクル（クエン酸サイクル）を持たず、
その形態と機能を維持するために必要なエネルギーであ
るＡＴＰ（adenosine triphosphate）産生は主としてエ
ムデン−マイヤーホフ経路（ＥＭＰ、嫌気的解糖系）に
依存している。生理的条件下で、グルコースはヘキソキ
ナーゼによりリン酸化を受け、グルコース−６−リン酸
となり正常状態では９０％がエムデン−マイヤーホフ経
路により代謝される。残りの５〜１０％がヘキソース−
１−リン酸回路(HMS or HMP)により代謝されている。し
かし、後に実施例で詳述するように、本発明者等の調製
した赤血球膜成分を除去したヘモグロビン溶液には、本
来含まれていないとされているＴＣＡサイクルの一部の
酵素が活性を保持した状態で残存していることを確認し
た。本発明者等は、従来、赤血球膜成分を除去したヘモ
グロビン溶液中の不純物としてとらえられていた天然赤
血球由来残存酵素活性を有効に利用し、必要な基質なら
びに補酵素類を補充することにより天然赤血球類似の酵
素的メトヘモグロビン還元能を付与したリポソーム型人
工酸素運搬体である本発明のヘモグロビン含有リポソー
ムを調製した。
ア、リボソームなどの細胞内小器官も持たず、蛋白質や
脂質合成能はない。また、ミトコンドリアを有していな
いためＴＣＡサイクル（クエン酸サイクル）を持たず、
その形態と機能を維持するために必要なエネルギーであ
るＡＴＰ（adenosine triphosphate）産生は主としてエ
ムデン−マイヤーホフ経路（ＥＭＰ、嫌気的解糖系）に
依存している。生理的条件下で、グルコースはヘキソキ
ナーゼによりリン酸化を受け、グルコース−６−リン酸
となり正常状態では９０％がエムデン−マイヤーホフ経
路により代謝される。残りの５〜１０％がヘキソース−
１−リン酸回路(HMS or HMP)により代謝されている。し
かし、後に実施例で詳述するように、本発明者等の調製
した赤血球膜成分を除去したヘモグロビン溶液には、本
来含まれていないとされているＴＣＡサイクルの一部の
酵素が活性を保持した状態で残存していることを確認し
た。本発明者等は、従来、赤血球膜成分を除去したヘモ
グロビン溶液中の不純物としてとらえられていた天然赤
血球由来残存酵素活性を有効に利用し、必要な基質なら
びに補酵素類を補充することにより天然赤血球類似の酵
素的メトヘモグロビン還元能を付与したリポソーム型人
工酸素運搬体である本発明のヘモグロビン含有リポソー
ムを調製した。
【００１７】
【実施例】以下、本発明の実施例に基づいて具体的に説
明する。なお、特に明示しない場合、調製の各工程は冷
蔵状態（４℃）に維持し、無菌的環境下で実施した。ま
た、試薬・器具類は減菌処理を行い、重金属イオン・無
機イオン等の残留の無い無菌超純水（１５meg Ω℃・cm
at ２５℃以上／〔パイロジェンフリー〕）を調製に使
用した。
明する。なお、特に明示しない場合、調製の各工程は冷
蔵状態（４℃）に維持し、無菌的環境下で実施した。ま
た、試薬・器具類は減菌処理を行い、重金属イオン・無
機イオン等の残留の無い無菌超純水（１５meg Ω℃・cm
at ２５℃以上／〔パイロジェンフリー〕）を調製に使
用した。
【００１８】（実施例１）赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）の調製 濃厚赤血球製剤１５Ｌ．（２００ｍｌ×７５バック）
を、連続遠心機を用いて生理食塩水で洗浄し、混在する
血小板・白血球などの血漿成分を除去した粗洗浄赤血球
を得た。さらに、孔径０．４５μｍのフィルターを用い
て生理食塩水洗浄を行い、この洗浄赤血球５Ｌ．に対し
て低張リン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）を１０
Ｌ．添加して溶血させた。孔径０．４５μｍの血漿分離
器および孔径０．１μｍのフィルターを用いて赤血球膜
成分ならびに無菌濾過を行い、ヘモグロビン濃度８％
（ｗ／ｖ）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ溶
液）、約１２Ｌ．を回収した。得られた溶液はホローフ
ァイバー型ダイアライザー（テルモ（株），ＣＬ−Ｃ８
Ｎ）を用いて１０ｍＭ ２−〔４−（２−ヒドロキシエ
チル−１−ピペラジニル）〕エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液（ｐＨ＝７．４）に対して透析を行った
後、限界濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０％
（ｗ／ｖ）の濃縮ＳＦＨ溶液、約１．８Ｌ．を調製し
た。濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 上述の工程を経て調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ中
のヘモグロビンモル数に対するモル比で４倍量相当のＬ
−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium s
alt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])およびヘモグロビンに
対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム（in
ositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/ シグ
マ社[SIGMA Chem. Co.])を４ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液
（６０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解し、この１００ｍｌの
濃縮ＳＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。
を、連続遠心機を用いて生理食塩水で洗浄し、混在する
血小板・白血球などの血漿成分を除去した粗洗浄赤血球
を得た。さらに、孔径０．４５μｍのフィルターを用い
て生理食塩水洗浄を行い、この洗浄赤血球５Ｌ．に対し
て低張リン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）を１０
Ｌ．添加して溶血させた。孔径０．４５μｍの血漿分離
器および孔径０．１μｍのフィルターを用いて赤血球膜
成分ならびに無菌濾過を行い、ヘモグロビン濃度８％
（ｗ／ｖ）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ溶
液）、約１２Ｌ．を回収した。得られた溶液はホローフ
ァイバー型ダイアライザー（テルモ（株），ＣＬ−Ｃ８
Ｎ）を用いて１０ｍＭ ２−〔４−（２−ヒドロキシエ
チル−１−ピペラジニル）〕エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液（ｐＨ＝７．４）に対して透析を行った
後、限界濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０％
（ｗ／ｖ）の濃縮ＳＦＨ溶液、約１．８Ｌ．を調製し
た。濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 上述の工程を経て調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ中
のヘモグロビンモル数に対するモル比で４倍量相当のＬ
−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium s
alt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])およびヘモグロビンに
対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム（in
ositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/ シグ
マ社[SIGMA Chem. Co.])を４ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液
（６０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解し、この１００ｍｌの
濃縮ＳＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。
【００１９】濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末（日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上
記実施例１で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加
え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混
合液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Mi
crofluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐ
ｓｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を
行った。ヘモグロビン含有リポソームの精製 実施例１の処理後に得られた生成物は、等量の生理食
塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸
濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×
３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを
含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物
として回収された。リポソーム化されずに残存する遊離
ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はテカンテ
ーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作
を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくな
るまで繰り返し行った後、孔径０．４５μｍのテュラポ
ア（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルタ
ー（ミリポア社 [Millipore Ltd.,Minitan system]血漿
分離器）を用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子
を除去した。最終的にホローファイバー型ダイアライザ
ー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロ
ビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と成るように生理食塩水で
調整した精製ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液約８０
ｍｌを回収した。
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末（日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上
記実施例１で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加
え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混
合液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Mi
crofluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐ
ｓｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を
行った。ヘモグロビン含有リポソームの精製 実施例１の処理後に得られた生成物は、等量の生理食
塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸
濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×
３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを
含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物
として回収された。リポソーム化されずに残存する遊離
ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はテカンテ
ーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作
を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくな
るまで繰り返し行った後、孔径０．４５μｍのテュラポ
ア（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルタ
ー（ミリポア社 [Millipore Ltd.,Minitan system]血漿
分離器）を用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子
を除去した。最終的にホローファイバー型ダイアライザ
ー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロ
ビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と成るように生理食塩水で
調整した精製ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液約８０
ｍｌを回収した。
【００２０】（実施例２）濃縮ＳＦＨ溶液の調製 実施例１のに準じて濃縮ＳＦＨ溶液の調整を行った。濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 上述の工程を経て調整した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ中
のヘモグロビンモル数に対するモル比で２倍量相当のＬ
−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium s
alt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])、ヘモグロビンモル数
に対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム[i
nositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/SIGM
A Chem. Co.]ならびに０．２相当の酸化型β−ＮＡＤ+
(BMY., Grade II/98%)を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５
０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮Ｓ
ＦＨ溶液中に均一に成るように添加・混合した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、実
施例２で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加え、
攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合
液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Micr
ofluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐｓ
ｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を行
った。
のヘモグロビンモル数に対するモル比で２倍量相当のＬ
−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium s
alt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])、ヘモグロビンモル数
に対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム[i
nositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/SIGM
A Chem. Co.]ならびに０．２相当の酸化型β−ＮＡＤ+
(BMY., Grade II/98%)を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５
０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮Ｓ
ＦＨ溶液中に均一に成るように添加・混合した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、実
施例２で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加え、
攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合
液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Micr
ofluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐｓ
ｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を行
った。
【００２１】ヘモグロビン含有リポソームの精製 上記実施例２の処理後に得られた溶液は、等量の生理
食塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・
懸濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）
×３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビン
を含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱
物として回収された。リポソーム化されずに残存する遊
離ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカン
テーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操
作を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなく
なるまで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア
（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター
（Millipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、
懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホロ
ーファイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−
Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／
ｖ）と成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビ
ン含有リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
食塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・
懸濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）
×３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビン
を含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱
物として回収された。リポソーム化されずに残存する遊
離ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカン
テーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操
作を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなく
なるまで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア
（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター
（Millipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、
懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホロ
ーファイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−
Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／
ｖ）と成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビ
ン含有リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
【００２２】（実施例３）濃縮ＳＦＨ溶液の調製 実施例１のに準じてＳＦＨ溶液の調製を行った。濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 上述の工程を経て調製したヘモグロビン溶液１００ｍｌ
に対するモル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム
（L(-)malic acid, monosodium salt/シグマ社[SIGMA C
hem. Co.])、ヘモグロビンモル数に対するモル比で１．
０相当のフィチン酸ナトリウム[inositol hexaphosphor
ic acid dodecasodium salt/SIGMA Chem. Co.]ならびに
１．０相当のβ−ＮＡＤＰＨ・Ｎａ4 （協和発酵工業）
および５．０相当のグルコース−６−リン酸ナトリウム
（Sigma Chem. Co.)を１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５
０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮Ｓ
ＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上
記実施例３で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ．を
加え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ
混合液をパール細胞破砕器(ParrCo.)に入れ、ヘリウム
ガスで１００kg/cm2に加圧して３０分間放置後、この圧
力を維持した状態で、氷冷下で、パール細胞破砕器の細
隙ノズルから吐出させてリポソーム化を行った。
に対するモル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム
（L(-)malic acid, monosodium salt/シグマ社[SIGMA C
hem. Co.])、ヘモグロビンモル数に対するモル比で１．
０相当のフィチン酸ナトリウム[inositol hexaphosphor
ic acid dodecasodium salt/SIGMA Chem. Co.]ならびに
１．０相当のβ−ＮＡＤＰＨ・Ｎａ4 （協和発酵工業）
および５．０相当のグルコース−６−リン酸ナトリウム
（Sigma Chem. Co.)を１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５
０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮Ｓ
ＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチ
ン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉
末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:
0.28(モル比)])１８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６
０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上
記実施例３で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ．を
加え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ
混合液をパール細胞破砕器(ParrCo.)に入れ、ヘリウム
ガスで１００kg/cm2に加圧して３０分間放置後、この圧
力を維持した状態で、氷冷下で、パール細胞破砕器の細
隙ノズルから吐出させてリポソーム化を行った。
【００２３】ヘモグロビン含有リポソームの精製 実施例３の処理後に得られた溶液は、等量の生理食塩
水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸濁
液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×３
０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを含
有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物と
して回収された。リポソーム化されずに残存する遊離ヘ
モグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカンテー
ションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作を
上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくなる
まで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア（ポ
リビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター（Mi
llipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、懸濁
液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホローフ
ァイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８
Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と
成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビン含有
リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸濁
液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×３
０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを含
有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物と
して回収された。リポソーム化されずに残存する遊離ヘ
モグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカンテー
ションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作を
上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくなる
まで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア（ポ
リビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター（Mi
llipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、懸濁
液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホローフ
ァイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８
Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と
成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビン含有
リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
【００２４】（比較例１）Ｌ−リンゴ酸ナトリウム未添
加の脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をワーリングブレンダー処
理によりリポソーム化した以外は、実施例１と同様の手
法でヘモグロビン含有リポソームを調製した。以下にワ
ーリングブレンダー処理条件を記載する。ワーリングブレンダー条件 (Waring Co., Blender 7010S) ＳＦＨ処理量：２００ｍｌ 脂質量：３６ｇ（同量の無菌精製水を用いて膨潤） 回転数：１５，０００ｒｐｍ 処理時間：３０分間 (1) ３分間処理、（2)１０分間冷却（４℃）を繰り返す
加の脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をワーリングブレンダー処
理によりリポソーム化した以外は、実施例１と同様の手
法でヘモグロビン含有リポソームを調製した。以下にワ
ーリングブレンダー処理条件を記載する。ワーリングブレンダー条件 (Waring Co., Blender 7010S) ＳＦＨ処理量：２００ｍｌ 脂質量：３６ｇ（同量の無菌精製水を用いて膨潤） 回転数：１５，０００ｒｐｍ 処理時間：３０分間 (1) ３分間処理、（2)１０分間冷却（４℃）を繰り返す
【００２５】（実施例４および比較例２）メトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液の調製 実施例１に準じて調製した濃縮ＳＦＨ溶液を３７℃で４
日間加温し、メトヘモグロビン含有率約３５％の濃縮Ｓ
ＦＨ溶液を調製した。このＳＦＨにメトヘモグロビン含
有率２％以下の新鮮な濃縮ＳＦＨ溶液を混合し、メトヘ
モグロビン含有（メトヘモグロビン含有率１７％）濃縮
ＳＦＨ溶液を調製した。メトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 試料として、上述の工程を経て調製したメトヘモグロビ
ン含有濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌに対して、ヘモグロビ
ン（Ｈｂ）の重量モル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナ
トリウム[L(-)malic acid, monosodium salt/SIGMA Che
m. Co.] 、０．８（Ｈｂ重量モル比）相当のフィチン酸
ナトリウム[inositol hexaphosphoric acid dodecasodi
um salt/SIGMA Chem. Co.]および各０．２（Ｈｂ重量モ
ル比）相当の酸化型β−ＮＡＤ+ 〔β-nicotinamide ad
enine dinucleotide, oxidized (grade II, 98%)/BMY]
ならびに還元型β−ＮＡＤＨ〔β-nicotinamide adenin
edinucleotide disodium salt, reduced(grade II, 98
%)/BMY] を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
７．４）に溶解し、１００ｍｌのメトヘモグロビン含有
ＳＦＨ溶液中に均一になるように添加・混合した。一
方、コントロール（比較例２）としてヘモグロビンに対
する重量モル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウムの
みを添加したメトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液を調
製した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 実施例１と同様の条件下でリポソーム化した。メトヘモグロビン含有リポソームの精製 実施例１に記載のヘモグロビン含有リポソームの精製方
法と同様に行った。
日間加温し、メトヘモグロビン含有率約３５％の濃縮Ｓ
ＦＨ溶液を調製した。このＳＦＨにメトヘモグロビン含
有率２％以下の新鮮な濃縮ＳＦＨ溶液を混合し、メトヘ
モグロビン含有（メトヘモグロビン含有率１７％）濃縮
ＳＦＨ溶液を調製した。メトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 試料として、上述の工程を経て調製したメトヘモグロビ
ン含有濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌに対して、ヘモグロビ
ン（Ｈｂ）の重量モル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナ
トリウム[L(-)malic acid, monosodium salt/SIGMA Che
m. Co.] 、０．８（Ｈｂ重量モル比）相当のフィチン酸
ナトリウム[inositol hexaphosphoric acid dodecasodi
um salt/SIGMA Chem. Co.]および各０．２（Ｈｂ重量モ
ル比）相当の酸化型β−ＮＡＤ+ 〔β-nicotinamide ad
enine dinucleotide, oxidized (grade II, 98%)/BMY]
ならびに還元型β−ＮＡＤＨ〔β-nicotinamide adenin
edinucleotide disodium salt, reduced(grade II, 98
%)/BMY] を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
７．４）に溶解し、１００ｍｌのメトヘモグロビン含有
ＳＦＨ溶液中に均一になるように添加・混合した。一
方、コントロール（比較例２）としてヘモグロビンに対
する重量モル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウムの
みを添加したメトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液を調
製した。濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 実施例１と同様の条件下でリポソーム化した。メトヘモグロビン含有リポソームの精製 実施例１に記載のヘモグロビン含有リポソームの精製方
法と同様に行った。
【００２６】（試験１）リポソーム調製後のヘモグロビン酸化率 実施例４および比較例２で調製した調製直後のヘモグロ
ビンの酸化率を後述する多波長分光光度法で測定し、結
果を表１に示した。表１の結果から、リンゴ酸・ＮＡＤ
+ ・ＮＡＤＨをリポソーム調製前に加えてメトヘモグロ
ビン還元機構を付与したヘモグロビン含有リポソーム
は、調製過程でヘモグロビン酸化物の濃度を顕著に減少
させたことがわかる。
ビンの酸化率を後述する多波長分光光度法で測定し、結
果を表１に示した。表１の結果から、リンゴ酸・ＮＡＤ
+ ・ＮＡＤＨをリポソーム調製前に加えてメトヘモグロ
ビン還元機構を付与したヘモグロビン含有リポソーム
は、調製過程でヘモグロビン酸化物の濃度を顕著に減少
させたことがわかる。
【００２７】
【表１】
【００２８】（試験２）ヘモグロビン経時酸化の測定（in vivo) ヘモグロビン含量が５％（ｗ／ｖ）となるように調整し
て上記で得られたヘモグロビン含有リポソーム懸濁液１
ｍｌを、ＩＣＲ系雄性マウス（５週令）の尾静脈から投
与し、２４時間経過後、腹大静脈から全血を回収し、下
記の方法で経時酸化率を算出した。ヘモグロビン含有リ
ポソームは、浸透圧差に対して強く、この特徴を利用し
て天然赤血球と分離した。すなわち、ヘパリン添加全血
に８〜１０倍容の超純水を添加・攪拌し、マウス天然赤
血球を溶血後、18,000ｒｐｍで３０分間（４℃）高速遠
心を行いヘモグロビン含有リポソームを沈澱物として回
収した。この操作を３回繰り返し、完全に血液成分を洗
浄除去した。得られた試料に１０ｗ／ｖ（％）・Triton
X100-HEPES 緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）２．０ｍ
ｌを加えて約１分間激しく攪拌し、さらにフロン（フレ
オンガス溶液）２ｍｌを添加し約１分間攪拌した。この
溶液を3,000 ｒｐｍで１５分間遠心処理後、上澄約１．
８ｍｌにＨＥＰＥＳ緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）を
１ｍｌ加えて調製した試薬の可視領域（４６０ｎｍ〜７
００ｎｍ）における吸収スペクトルを測定し、経時酸化
率を算出した。結果を表２および図３に示す。
て上記で得られたヘモグロビン含有リポソーム懸濁液１
ｍｌを、ＩＣＲ系雄性マウス（５週令）の尾静脈から投
与し、２４時間経過後、腹大静脈から全血を回収し、下
記の方法で経時酸化率を算出した。ヘモグロビン含有リ
ポソームは、浸透圧差に対して強く、この特徴を利用し
て天然赤血球と分離した。すなわち、ヘパリン添加全血
に８〜１０倍容の超純水を添加・攪拌し、マウス天然赤
血球を溶血後、18,000ｒｐｍで３０分間（４℃）高速遠
心を行いヘモグロビン含有リポソームを沈澱物として回
収した。この操作を３回繰り返し、完全に血液成分を洗
浄除去した。得られた試料に１０ｗ／ｖ（％）・Triton
X100-HEPES 緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）２．０ｍ
ｌを加えて約１分間激しく攪拌し、さらにフロン（フレ
オンガス溶液）２ｍｌを添加し約１分間攪拌した。この
溶液を3,000 ｒｐｍで１５分間遠心処理後、上澄約１．
８ｍｌにＨＥＰＥＳ緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）を
１ｍｌ加えて調製した試薬の可視領域（４６０ｎｍ〜７
００ｎｍ）における吸収スペクトルを測定し、経時酸化
率を算出した。結果を表２および図３に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】オキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、
ヘミクロームの各濃度は、ヘモグロビンの吸収曲線で事
前に得られた実測値をもとに多波長分光光度法（７００
ｎｍ，６３０ｎｍ，５７７ｎｍ，５６０ｎｍ）により算
出した（下記に示す）。
ヘミクロームの各濃度は、ヘモグロビンの吸収曲線で事
前に得られた実測値をもとに多波長分光光度法（７００
ｎｍ，６３０ｎｍ，５７７ｎｍ，５６０ｎｍ）により算
出した（下記に示す）。
【００３１】OxyHb（μM)=29.8 ×ΔAbs(577nm)-9.8×
ΔAbs(630nm)-22.2 ×ΔAbs(560nm) metHb（μM)=7×ΔAbs(577nm)+76.8 ×ΔAbs(630nm)-1
3.8 ×Abs(560nm) hemichrome(μM)=-33.2×ΔAbs(577nm)-36 ×ΔAbs(630
nm)+58.2 ×ΔAbs(560nm) ただし、ΔAbs(577nm)=Abs(577nm)-Abs(700nm) ΔAbs(630nm)=Abs(630nm)-Abs(700nm) ΔAbs(560nm)=Abs(560nm)-Abs(700nm)
ΔAbs(630nm)-22.2 ×ΔAbs(560nm) metHb（μM)=7×ΔAbs(577nm)+76.8 ×ΔAbs(630nm)-1
3.8 ×Abs(560nm) hemichrome(μM)=-33.2×ΔAbs(577nm)-36 ×ΔAbs(630
nm)+58.2 ×ΔAbs(560nm) ただし、ΔAbs(577nm)=Abs(577nm)-Abs(700nm) ΔAbs(630nm)=Abs(630nm)-Abs(700nm) ΔAbs(560nm)=Abs(560nm)-Abs(700nm)
【００３２】試験２の結果が示す通り、本発明の実施例
１、実施例２、実施例３で得られたヘモグロビン含有リ
ポソームは、比較例１のリポソームと比べ、ヘモグロビ
ン酸化物の濃度を顕著に減少させ、ヘモグロビンの経時
酸化を著しく抑制した。
１、実施例２、実施例３で得られたヘモグロビン含有リ
ポソームは、比較例１のリポソームと比べ、ヘモグロビ
ン酸化物の濃度を顕著に減少させ、ヘモグロビンの経時
酸化を著しく抑制した。
【００３３】（試験３）実施例１のＳＦＨ溶液のリポ
ソーム化において、脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をマイクロ
フルイダイザーでリポソーム化する前と後とのＳＦＨ溶
液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性
と、リンゴ酸脱水素酵素活性とを、以下の条件で測定し
結果を表３および４に示す。
ソーム化において、脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をマイクロ
フルイダイザーでリポソーム化する前と後とのＳＦＨ溶
液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性
と、リンゴ酸脱水素酵素活性とを、以下の条件で測定し
結果を表３および４に示す。
【００３４】１．ＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元
酵素活性の測定 脂質−濃縮ＳＦＨ混合溶液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモ
グロビン還元酵素活性は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍ
Ｍ．ｐＨ７．４、３７℃）で希釈した溶液を使用し、単
位ヘモグロビン当りの酵素活性値をBeutler(*)の記載し
た方法を用いて算出した。また、ＭＦ処理によって得ら
れたヘモグロビン含有リポソーム内部のＮＡＤＨ依存型
メトヘモグロビン還元酵素活性は、非イオン性界面活性
剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソーム膜を可
溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。 (*) E.Beutler,NADH methemoglobin reductase(NADH-fe
rricyanide reductase)in:E.Beutler(ed.),Red Cell Me
tabolism/A Manual of Biochemical Methods,3rd. ed.,
Grune & Stratton, Inc., Orlando 1984,pp.81-83.
酵素活性の測定 脂質−濃縮ＳＦＨ混合溶液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモ
グロビン還元酵素活性は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍ
Ｍ．ｐＨ７．４、３７℃）で希釈した溶液を使用し、単
位ヘモグロビン当りの酵素活性値をBeutler(*)の記載し
た方法を用いて算出した。また、ＭＦ処理によって得ら
れたヘモグロビン含有リポソーム内部のＮＡＤＨ依存型
メトヘモグロビン還元酵素活性は、非イオン性界面活性
剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソーム膜を可
溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。 (*) E.Beutler,NADH methemoglobin reductase(NADH-fe
rricyanide reductase)in:E.Beutler(ed.),Red Cell Me
tabolism/A Manual of Biochemical Methods,3rd. ed.,
Grune & Stratton, Inc., Orlando 1984,pp.81-83.
【００３５】
【００３６】２．リンゴ酸脱水素酵素活性の測定 脂質−濃縮ＳＦＨ混合溶液中のリンゴ酸脱水素酵素活性
は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．ｐＨ７．４、３７
℃）で希釈した溶液を使用して単位ヘモグロビン当りの
酵素活性値をBergmeyer(*)の記載した方法を用いて算出
した。また、ＭＦ処理によって得られたヘモグロビン含
有リポソーム内のリンゴ酸脱水素酵素活性は非イオン性
界面活性剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソー
ム膜を可溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。 (*)H.U.Bergmeyer,A.F.Smith.E.Bermth, Malate Dehydr
ogenase,in: H.U.Bergmeyer(ed.),Methods of Enzymati
c Analysis,Vol.3,3rd.English ed., Verlag Chemie, W
einheim, 1986,pp163 〜175.
は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．ｐＨ７．４、３７
℃）で希釈した溶液を使用して単位ヘモグロビン当りの
酵素活性値をBergmeyer(*)の記載した方法を用いて算出
した。また、ＭＦ処理によって得られたヘモグロビン含
有リポソーム内のリンゴ酸脱水素酵素活性は非イオン性
界面活性剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソー
ム膜を可溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。 (*)H.U.Bergmeyer,A.F.Smith.E.Bermth, Malate Dehydr
ogenase,in: H.U.Bergmeyer(ed.),Methods of Enzymati
c Analysis,Vol.3,3rd.English ed., Verlag Chemie, W
einheim, 1986,pp163 〜175.
【００３７】
【００３８】なお、比較例１と同様として、ただしWarr
ing Blender （ワーリング ブレンダー）処理を冷却を
行なわずに行なったＮＡＤＨ−メトヘモグロビン還元酵
素の残存率を試験３の条件で測定したところ、１７．９
％であった。表３および表４で示すように、リポソーム
をMicrofluidizer（マイクロフルイダイザー）で製造し
たヘモグロビン含有リポソームのＮＡＤＨ−メトヘモグ
ロビン還元酵素活性は、９９．６％が残存していた。ま
た、ＴＣＡサイクル構成酵素であり、ヘモグロビン含有
リポソーム中の還元型補酵素ＮＡＤの再生系として使用
されるリンゴ酸脱水素酵素についても８１．４％の残存
率を示し、マイクロフルイダイザーによるリポソーム化
の有用性が認められた。
ing Blender （ワーリング ブレンダー）処理を冷却を
行なわずに行なったＮＡＤＨ−メトヘモグロビン還元酵
素の残存率を試験３の条件で測定したところ、１７．９
％であった。表３および表４で示すように、リポソーム
をMicrofluidizer（マイクロフルイダイザー）で製造し
たヘモグロビン含有リポソームのＮＡＤＨ−メトヘモグ
ロビン還元酵素活性は、９９．６％が残存していた。ま
た、ＴＣＡサイクル構成酵素であり、ヘモグロビン含有
リポソーム中の還元型補酵素ＮＡＤの再生系として使用
されるリンゴ酸脱水素酵素についても８１．４％の残存
率を示し、マイクロフルイダイザーによるリポソーム化
の有用性が認められた。
【００３９】
【発明の効果】上述した通り、本発明のヘモグロビン含
有リポソームはヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制で
きる。一般的にヘモグロビン含有リポソームは、それの
製造過程、製品の保存中、特に生体内投与後の循環血流
中でメト型ヘモグロビンに酸化され、酸素運搬能が低減
ないし喪失するが、本発明のヘモグロビン含有リポソー
ムはヘモグロビンが酸化から保護されているために優れ
た酸素運搬能を有する。そのため、人工赤血球として優
れた性質を有している。
有リポソームはヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制で
きる。一般的にヘモグロビン含有リポソームは、それの
製造過程、製品の保存中、特に生体内投与後の循環血流
中でメト型ヘモグロビンに酸化され、酸素運搬能が低減
ないし喪失するが、本発明のヘモグロビン含有リポソー
ムはヘモグロビンが酸化から保護されているために優れ
た酸素運搬能を有する。そのため、人工赤血球として優
れた性質を有している。
【図１】 天然赤血球内におけるヘモグロビンの酸化・
還元サイクルを示す。
還元サイクルを示す。
【図２】 本発明のヘモグロビン含有リポソームにおけ
るヘモグロビンの酸化・還元サイクルを示す。
るヘモグロビンの酸化・還元サイクルを示す。
【図３】 本発明と比較例のヘモグロビン含有リポソー
ムのメト型ヘモグロビン還元効果を示す。
ムのメト型ヘモグロビン還元効果を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有
するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含
有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液内に、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質
が添加されていることを特徴とするヘモグロビン含有リ
ポソーム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04553994A JP3696898B2 (ja) | 1993-03-18 | 1994-03-16 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5906793 | 1993-03-18 | ||
| JP5-59067 | 1993-03-18 | ||
| JP04553994A JP3696898B2 (ja) | 1993-03-18 | 1994-03-16 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06321802A true JPH06321802A (ja) | 1994-11-22 |
| JP3696898B2 JP3696898B2 (ja) | 2005-09-21 |
Family
ID=26385544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04553994A Expired - Lifetime JP3696898B2 (ja) | 1993-03-18 | 1994-03-16 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3696898B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007271388A (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Hidetoshi Tsuchida | 血清または血漿の分離方法および血液分離管 |
| JP2008120760A (ja) * | 2006-11-15 | 2008-05-29 | Terumo Corp | ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液及びその製法 |
| EP2058398A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
| WO2017150637A1 (ja) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | ヘモグロビンのメト化抑制能を有する人工赤血球 |
-
1994
- 1994-03-16 JP JP04553994A patent/JP3696898B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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