JP2002161047A

JP2002161047A - ヘモグロビン溶液およびヘモグロビン含有リポソーム

Info

Publication number: JP2002161047A
Application number: JP2000361082A
Authority: JP
Inventors: Tetsuhiro Kimura; 哲寛木村; Shinichi Kaneda; 伸一金田
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2002-06-04

Abstract

(57)【要約】【課題】ウイルス感染リスクが低減され、安全性が高
く、かつヘモグロビンのメト化進行の抑制作用を有し、
人工赤血球および人工酸素運搬体として有用なヘモグロ
ビン溶液およびヘモグロビン含有リポソームの提供。【解決手段】ウイルス除去処理されたストローマフリー
ヘモグロビン溶液と、（Ａ）酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および／または還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と、
（Ｂ）イノシン、イノシン酸、グアノシンおよびリボー
ス-1- リン酸からなる群より選ばれる少なくとも１つと
からなるヘモグロビン溶液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、人工赤血球または
人工酸素運搬体として生体内に投与するためのウイルス
除去処理されたヘモグロビン溶液およびヘモグロビン溶
液含有リポソームに関する。

【０００２】

【従来の技術】外科手術、出血性ショック等の輸血を必
要とする病態あるいは脳、心筋等の虚血性疾患のような
局所への酸素供給を必要とする病態における血液代替物
もしくは治療薬として、安全でかつ効果的な酸素供給源
であるヘモグロビン（Ｈｂ）の利用が検討されている。
動物あるいはヒトの赤血球から赤血球膜を除去して得ら
れるストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）は、この
遊離ヘモグロビンを化学的に修飾して架橋型ヘモグロビ
ンおよび重合ヘモグロビンなどのいわゆる人工赤血球と
して、さらにはこれらのようなヘモグロビン溶液を脂質
リポソームに内包させカプセル化したヘモグロビン含有
リポソーム（人工酸素運搬体）とすることが検討されて
きた。特にリポソームに内包されたヘモグロビンは変性
が少なく、生体内半減期が遊離ヘモグロビンに比して長
く、かつ末梢への酸素運搬能に優れることから、開発の
主流となりつつある。

【０００３】上記ヘモグロビンの酸素運搬能は、ヘモグ
ロビンと酸素分子との可逆的結合によるものである。ヘ
モグロビンはヘム鉄（Ｆｅ²⁺）が２価で保たれる場合に
酸素結合能を有しているが、その可逆的酸素化（oxigen
ation ）の過程で徐々に酸化（oxidation ）される。Ｆ
ｅ³⁺に酸化（メト化）されたメトヘモグロビン（ metＨ
ｂ：オキシヘモグロビン）は酸素結合能を有さない。天
然赤血球は、この酸化作用によりヘモグロビンが酸化さ
れるのを抑制する機構を持っている。しかしこうした天
然赤血球の酸化抑制機構は、人工酸素運搬体として精製
されたヘモグロビンにおいては認められず、ヘモグロビ
ン酸化物の占める割合は経時的に増加する。このため、
天然ヘモグロビンならびにその誘導体を医薬品あるいは
試薬として使用する場合には、酸化防止剤あるいは還元
剤を用いる必要があった。

【０００４】この酸化防止剤としては、亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一鉄、エチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム等が一般的に知られているが、こ
れらは生体に対して有害である。生体に使用しうる酸化
防止剤あるいは還元剤としては、還元型グルタチオン、
アスコルビン酸、トコフェロール類、糖類、アミノ酸類
などが知られている。しかしながら、これらの酸化抑制
効果は低く、特に体内投与後の経時的な酸化抑制効果は
不十分であった。

【０００５】このような課題を解決するものとして、本
出願人は、生体（赤血球）由来の代謝酵素系の活性を損
なわない緩和な条件下でヘモグロビンをリポソームに内
包して調製するとともに、天然赤血球から膜成分を除去
し、ヘモグロビンを取り出す過程または精製、濃縮の過
程で消失したメトヘモグロビン還元酵素反応系の物質を
含ませれば、解糖系の作動で生じた還元型ニコチンアミ
ドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）のメトヘモグロビ
ン還元機構によりヘモグロビンのメト化を抑制すること
ができることを先に提案した。

【０００６】具体的にたとえば、解糖系酵素の基質とし
て、リンゴ酸などの有機酸またはその誘導体をリポソー
ム内に含ませることを開示した（特開平６−３２１８０
２号）。これらリンゴ酸などの基質は、生体由来酵素の
反応により、上記ＮＡＤＨまたはそのリン酸化物（ＮＡ
ＤＰＨ）の補酵素を生じる。また基質としてのグルコー
スと、アデニン、イノシンおよびアデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）から選ばれる添加剤とをリポソーム内に含ま
せることを開示した（特開平８−３０６２号）。さらに
これらに加えて、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはその
リン酸化物（ＮＡＤＰ）を含ませてもよいことも開示し
た。

【０００７】ところで一方、天然赤血球由来の血液製剤
の生体内投与では、原料由来の感染リスクがあり、本質
的に安全性について留意する必要があるが、近年、特に
ウイルスの除去あるいは不活性化の重要性が認識されて
いる。ウイルス除去方法としは、分画分子量１００〜３
００ｋＤ程度の限外ろ過膜などのウイルス除去膜の使用
が効果的であることが知られており、ヘモグロビン溶液
についてもウイルス除去膜の適用が望まれる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ところがウイルス除去
膜によるウイルス除去処理を加えた場合には、上記のよ
うな酵素活性を損なわない緩和な条件下で調製し、これ
に解糖系酵素反応基質、補酵素等を含ませた調製したヘ
モグロビン溶液あるいはヘモグロビン含有リポソームで
あっても、メト化抑制効果が充分に発現されなくなると
いう新たな問題を生じることがわかった。このためウイ
ルス除去処理が加えられてもメト化抑制効果を有するヘ
モグロビン溶液およびヘモグロビン含有リポソームの出
現が望まれる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく検討したところ、分画分子量１００〜３００
ｋＤ程度の限外ろ過膜を用いるウイルス除去処理では、
ウイルスとともに比較的高分子量（分子量約１５万以
上）の酵素も除去されてしまい、ウイルス除去処理後の
ヘモグロビン溶液は、赤血球由来の解糖系酵素群のうち
の主要な解糖系酵素群（たとえばホスホフルクトキナー
ゼ：40万、アルドラーゼ：15.8万、ピルベートキナー
ゼ：24万など）をほとんど失っていることを見出した。
つまりウイルス除去処理後のヘモグロビン溶液は、実質
的に解糖系代謝機構が働かず、これに基質となるグルコ
ースを加えてもほとんど代謝されない。したがって赤血
球由来のメトヘモグロビン還元機構は機能せず、ヘモグ
ロビンの酸化は抑制できず、ヘモグロビン溶液およびヘ
モグロビン含有リポソームの酸素運搬効率の低下を生じ
ることが判明した。

【００１０】上記知見に基づいて検討を続け、赤血球由
来の主要な解糖系をほとんど含まず実質的に解糖系が機
能しないヘモグロビン溶液であっても、これに補酵素の
うちの酸化型（ＮＡＤ）および／または還元型（ＮＡＤ
Ｈ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと、ヌクレ
オチド代謝系中間体である特定の基質群から選ばれる添
加剤とを組合わせて添加することにより、ウイルス除去
膜によるウイルス除去処理が加えられてもメト化抑制効
果を有するヘモグロビン溶液およびヘモグロビン含有リ
ポソームを得ることができることを見出した。さらにた
とえば解糖系基質のグルコースを含ませる必要がないの
で、脂質膜形成を良好に行わせることができ、これによ
り高収率でヘモグロビン含有リポソームを得ることがで
きることも見出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち本発明のヘモグロビン溶液は、上
記分子量１５０ｋＤ以上の成分が除去された赤血球由来
のストローマフリーヘモグロビン溶液と、（Ａ）酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およ
び／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）と、（Ｂ）イノシン、イノシン酸、グア
ノシンおよびリボース-1- リン酸からなる群より選ばれ
る少なくとも１つとからなる。本発明では、上記成分
（Ｂ）は（Ｂ’）リボース-1- リン酸または代謝系で最
終的にリボース-1- リン酸となりうる物質からなる群よ
り選ばれる少なくとも１つであってもよい。

【００１２】上記ストローマフリーヘモグロビン溶液
は、分子量１５万以上の解糖系酵素を実質的に含まな
い。したがってストローマフリーヘモグロビン溶液は、
実質的に解糖系が機能していない。上記ヘモグロビン溶
液はヘモグロビンを３０〜６０重量％の濃度で含有する
ことが望ましい。上記ヘモグロビン溶液のｐＨは７．０
〜８．５であることが望ましい。本発明に係るヘモグロ
ビン含有リポソームは、上記のようなヘモグロビン溶液
がリポソームに内包されてなる。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のヘモグロビン溶液は、赤血球由来のストローマ
フリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）から調製される。ヘ
モグロビン溶液の原料として、ヒトまたは動物血液由来
の天然赤血球が用いられる。本発明で用いられるストロ
ーマフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）は、赤血球膜成
分を除去した後、分子量１５０ｋＤ（１５万）以上の成
分を除去したものである。赤血球から膜成分の除去は常
法に従って溶血させ、遠心分離により行うことができ
る。分子量１５０ｋＤ以上の成分の除去は、ウイルス除
去のための処理であり、ヒトあるいは動物血液から混入
されると予想されるウイルスを除去し、安全性を向上す
るために行われる。したがってウイルス除去効果のある
ものであれば、その種類は特に限定されないが、通常、
限外ろ過膜を用いたろ過が行われ、たとえば分画分子量
が１０−３０万程度の限外ろ過膜あるいは市販のウイル
ス除去膜（旭化成ＢＭＭ−１５，−３５等）などを用い
ることができる。

【００１４】上記のような膜を用いた分子量１５０ｋＤ
以上の成分の除去処理により、ウイルス除去とともにヘ
モグロビン精製効果も得られる。同時に、原料赤血球由
来の解糖系酵素群のうち、ホスホフルクトキナーゼ（分
子量４０万）、アルドラーゼ（分子量１５．８万）、ピ
ルベートキナーゼ（分子量２４万）などの主要な解糖系
酵素群も除去ないしは著しく減量される。つまり膜処理
で得られたストローマフリーヘモグロビン溶液は、分子
量１５万以上の解糖系酵素を実質的に含まず、したがっ
て実質的に解糖系が機能していない。

【００１５】本発明では、このようなストローマフリー
ヘモグロビン溶液にメトヘモグロビンの還元機構を構築
する。ここに添加される成分として、解糖系、ペントー
スリン酸回路等の糖代謝系中間体あるいはヌクレオチド
代謝系中間体が考えらえるが、本発明では、特に（Ａ）
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤＨ）と、（Ｂ）イノシン、イノシン
酸、グアノシンおよびリボース-1- リン酸からなる群よ
り選ばれる少なくとも１つとを組合わせて用い、ウイル
ス除去膜処理後にも保持されている代謝経路のうちヌク
レオチド代謝経路を有効的に利用してメトヘモグロビン
の還元機構を構築する。

【００１６】上記成分（Ａ）および（Ｂ）は、ヘモグロ
ビン濃度および用いられる物質などによってその使用量
も異なるが、通常、ヘモグロビンに対する量比で用いら
れる。たとえばヘモグロビン７ミリモル（ヘモグロビン
７ミリモル／Ｌ＝４５％ヘモグロビン溶液）に対して、
補酵素（Ａ）は、通常０．０５−１．０ミリモル好まし
くは０．１−０．２ミリモルの量で用いることが望まし
い。また成分（Ｂ）は、ヘモグロビン７ミリモルに対し
て、通常２−１２ミリモル好ましくは４−８ミリモルの
量で用いることが望ましい。

【００１７】上記成分（Ａ）とともに（Ｂ）を添加する
ことにより、ウイルス除去膜処理にも保持されている代
謝経路を有効的に利用することができ、補酵素（Ａ）の
うちＮＡＤをＮＡＤＨに還元するかまたはＮＡＤＨを保
持させ、ＮＡＤＨの働きによるメトヘモグロビン還元機
構を機能させ、ヘモグロビンのメト化進行を抑制でき
る。上記過程では、成分（Ｂ）のたとえばイノシン酸
（ＩＭＰ）はヌクレオチド代謝系でイノシンに変換さ
れ、イノシンはヒポキサンチンへの変換過程でリボース
-1- リン酸（Ｒ−１−Ｐ）を生成し、これが代謝されて
ＮＡＤＨを供給する。グアノシンもＲ−１−Ｐを生成す
る。すなわち本発明では、ウイルス除去処理後も保持さ
れている代謝経路、たとえばヌクレオチド代謝経路を利
用してＮＡＤ還元機構を構築するものである。したがっ
て本発明では、上記（Ｂ）は (Ｂ’）リボース-1- リン
酸または代謝系で最終的にリボース-1- リン酸となりう
る物質からなる群より選ばれる少なくとも１つであって
もよい。このような (Ｂ’）には、 (Ｂ）として例示し
たものに加え、さらにアデノシンなどを挙げることがで
きる。

【００１８】なお天然赤血球由来の解糖系を含むヘモグ
ロビン溶液は、グルコースを基質として解糖系代謝回路
を動かし、ＮＡＤからＮＡＤＨへの変換を行う。この系
はメト化還元能に優れるが、一方リポソーム内に乳酸が
蓄積し、ｐＨの低下を招き、上記ヘモグロビン溶液中の
酵素活性が低下する可能性がある。本発明では、グルコ
ースなどの解糖系基質を特に必要としないので、メトヘ
モグロビン還元機構において乳酸は生成されない。この
ような本発明のヘモグロビン溶液は経時的なｐＨの低下
がほとんどない。また本発明ではヘモグロビン溶液は、
ｐＨ７．０〜８．５で調製することが望ましい。このよ
うなｐＨであると、後述のように長時間にわたってヘモ
グロビンのメト化を抑制できる。ヘモグロビンをリポソ
ームにカプセル化する際、高収率でヘモグロビン含有リ
ポソームを得ることができる。なおｐＨが高くなると、
ヘモグロビンを変性させてしまうおそれがあることか
ら、ｐＨ８．５以下とすることが望ましい。

【００１９】なお乳酸を生成する解糖系基質であっても
本発明の目的を損なわない範囲であれば添加してもよ
く、その際には該基質はＮＡＤをＮＡＤＨに変換しうる
ものが好ましい。たとえばグルセルアルデヒド-3- リン
酸は、解糖経路で1,3-ビスホスホグリセリン酸に変換さ
れ、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する。この系ではグルセル
アルデヒド-3- リン酸の酸化と、ピルビン酸の還元との
共役により乳酸を生成する。

【００２０】また本発明のヘモグロビン溶液は、たとえ
ばイノシトールヘキサリン酸（ＩＨＰ）などのアロステ
リックエフェクターなどを含んでいてもよい。本発明で
は、ヘモグロビン溶液を人工赤血球またはリポソームに
内包させた人工酸素運搬体として使用するに際しては、
ヘモグロビン濃度を、通常３０％〜６０％好ましくは４
５％〜５０％とすることが望ましい。たとえばダイアラ
イザーでの濃縮などにより濃度調整することができる。

【００２１】本発明のヘモグロビン含有リポソームは、
上記のようなヘモグロビン溶液を脂質層からなるリポソ
ームに取り込んだリポソームカプセル型ヘモグロビンで
ある。その製法は、上記ヘモグロビン溶液を用いること
以外は特に限定されず、一般的にリポソームカプセル化
として知られている技術を適用することができる。リポ
ソーム膜形成脂質は特に制限はなく、リポソームを形成
するものであれば天然または合成の脂質が使用可能であ
るが、特に飽和のリン脂質が好適に使用される。その例
としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタ
ノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリ
セロール、スフィンゴミエリン等を常法に従って水素添
加したものが挙げられ、これらを組み合わせて使用する
こともできる。特に水素添加率５０％以上の卵黄あるい
は大豆由来の水素添加リン脂質が好ましく用いられる。
膜安定化剤として、コレステロール、コレスタノール類
のステロール類、荷電物質としてホスファチジン酸、ホ
スファチジルグリセロール、ジセチルホスフェート、脂
肪酸を含んでいてもよい。

【００２２】

【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお特に断りのない限り、人工酸素運搬体調製の各工程
は室温室内（１０℃以下）、無菌的環境下で操作した。
また試薬、器具類は、全て滅菌処理して使用し、各溶液
の調製には、重金属イオン、パイロジェンフリーの超純
水を用いた。

【００２３】（試験例１）添加基質の効果の検証＜ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）の調製＞生
理食塩水で洗浄した赤血球を、ヘモグロビン濃度が５％
になるよう蒸留水を加えて溶血し、遠心分離して赤血球
膜を除去した後、孔径０．２μｍのフィルターでろ過
し、微粒子除去を行った。次いで分画分子量１００ｋＤ
の限外ろ過フィルターによりウイルス除去処理を行い、
ダイアライザーにて濃縮し、ヘモグロビン濃度４５％の
ストローマフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）を得た。
このＳＦＨのｐＨは６．８−７．２であった。ここに、
イノシトールヘキサリン酸（ＩＨＰ）をヘモグロビンと
等モル比になるよう添加した。

【００２４】＜ヘモグロビン溶液の調製＞上記で得ら
れた濃縮ＳＦＨ（ヘモグロビンＨｂ濃度４５％）に、所
定の基質を添加し、ヘモグロビン溶液（ａ）〜（ｃ）を
調製した。ヘモグロビン７ミリモルに対し、ＮＡＤ（１
００ミリモル／Ｌ) を０．１ミリモルになるよう添加
し、これに基質として、グルコース（４モル／Ｌ) 、ア
デニン（１６０ミリモル／Ｌ）、イノシン（１６０ミリ
モル／Ｌ）を以下のような量（ヘモグロビン７ミリモル
に対する量）でそれぞれ添加した。 (ａ）グルコースを１００ミリモル、アデニンを２ミリ
モルを添加した系、およびこの系にさらにイノシンを
０．５、１、２または４ミリモル添加した系。（ｂ）グルコースを１００ミリモル、イノシンを２ミリ
モルを添加した系、およびこの系にさらにアデニンを
０．５、１、２または４ミリモル添加した系。 (ｃ）イノシンを２ミリモル、アデニンを２ミリモルを
添加した系、およびこの系にさらにグルコースを２５、
５０、１００または００ミリモル添加した系。

【００２５】＜加速試験＞体温下（３７℃）におけるヘ
モグロビン劣化の指標として、上記で調製されたヘモグ
ロビン溶液（ａ）〜（ｃ）を、３７℃のインキュベーシ
ョン下でメト化加速試験し、２４時間後のメト化率を測
定した。メト化率は、以下に示すような可視光分光法に
よりメトヘモグロビン量を測定して求めた。インキュベ
ーション終了後、各ヘモグロビン溶液を２０ミリモルの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて約０．２５％ヘモグロ
ビン濃度になるよう希釈し、（Ａ）、（Ｂ）２つのキュ
ベットそれぞれに３ｍｌずつ分けた。（Ａ）のキュベッ
トは、２０ミリモルリン酸緩衝液 (ｐＨ７．２) を対照
として波長６３０ｎｍの吸光度を測定した。（Ｂ）のキ
ュベットは、５％Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆をサンプル３ｍｌ
あたり３０μｌ添加し、直ちに攪拌し、５分後に波長６
３０ｎｍの吸光度を測定した（ここで得られた測定値
を、それぞれＡ₁、Ｂ₁とする）。次に（Ａ）、（Ｂ）
両方のキュベットに５％ＫＣＮを、ヘモグロビン溶液３
ｍｌあたり３０μｌ添加し、直ちに攪拌する。２分後に
波長６３０ｎｍの吸光度を測定した（ここで得られた測
定値を、それぞれＡ₂、Ｂ₂とする）。得られたＡ₁、
Ｂ₁、Ａ₂、Ｂ₂の値から、メト化率（ MetＨｂ％）を
下式（１）にて算出した。 MetＨｂ（％）＝｛（Ａ₁−Ａ₂）／（Ｂ₁−Ｂ₂）｝×１００ …（１）

【００２６】上記で測定されたメト化率から、メト化の
進行に対する各添加基質の抑制効果を検証した。結果を
図１〜３に示す。これにより、イノシン添加量を検討し
た系 (ａ）では、ウイルス除去処理を行ったヘモグロビ
ンのメト化抑制効果が確認された。一方、アデニン添加
量を検討した系 (ｂ）およびグルコース添加量を検討し
た系（ｃ）では、ウイルス除去処理を行ったヘモグロビ
ンのメト化抑制に無効ないしは効果が弱いことが確認さ
れた。

【００２７】（実施例１）試験例１と同様に、１００ｋ
Ｄの限外ろ過フィルター処理を行って調製したストロー
マフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）に、ヘモグロビン
７ミリモル当りイノシンを６ミリモル添加し、ここにヘ
モグロビン７ミリモル当りＮＡＤを０．１、０．２、
０．４または０．６ミリモル添加したヘモグロビン溶液
を調製した。試験例１と同様に３７℃のインキュベーシ
ョン下でメト化加速試験を行ない、イノシン（６ミリ）
共存下でのＮＡＤのメト化進行に対する抑制効果を検証
した。結果を図４に示す。

【００２８】（比較例１）ＮＡＤを添加しなかった以外
は実施例１と同様にしてヘモグロビン溶液を調製し、メ
ト化加速試験を行なった。結果を図４に示す。図４から
明らかなように、実施例１のヘモグロビン溶液は、イノ
シン共存下、ＮＡＤ添加量（／Ｈｂ７ミリモル）０．０
５ミリモル以上でほぼ一定のメト化抑制効果を示した。
特に０．１ないし０．４ミリモルで高い効果を示す傾向
が認められた。

【００２９】（実施例２）試験例１と同様に、１００ｋ
Ｄの限外ろ過フィルター処理を行って調製したストロー
マフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）に、イノシン（Ｉ
Ｎ）またはイノシン酸（ＩＭＰ）を、ヘモグロビン７ミ
リモル当たり３、６または１２ミリモルの各量で添加
し、ヘモグロビン７ミリモル当たり０．１ミリモルのＮ
ＡＤ共存下、試験例１と同様に３７℃のインキュベーシ
ョン下でメト化加速試験を行ない、メト化の進行に対す
る抑制効果を検証した。結果を図５に示す。また上記イ
ノシン６ミリモル添加ヘモグロビン溶液の３７℃インキ
ュベーション下メト化加速試験でのメト化進行に対する
経時的な抑制効果を表１に示す。

【００３０】（比較例２）イノシン（ＩＮ）またはイノ
シン酸（ＩＭＰ）を添加しなかった以外は実施例２と同
様にしてヘモグロビン溶液を調製し、メト化加速試験を
行なった。結果を図５に示す。また上記ヘモグロビン溶
液のメト化加速試験でのメト化進行に対する経時的な抑
制効果を表１に示す。図５から明らかなように、ＮＡＤ
共存下、イノシンまたはイノシン酸添加によりメト化が
大幅に抑制され、両者はほぼ同様のメト化抑制効果を示
した。いずれもヘモグロビン７ミリモルに対し３ないし
１２ミリモル範囲の量での添加では、ほぼ一定の効果が
認められた。

【００３１】（実施例３）試験例１と同様に、１００ｋ
Ｄの限外ろ過フィルター処理を行って調製され、０．１
ミリモルＮＡＤ／７ミリモルＨｂ共存下のストローマフ
リーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）に、グアノシンを、ヘ
モグロビン７ミリモル当り５ミリモルの量で添加し、ヘ
モグロビン溶液を調製した。このヘモグロビン溶液を、
試験例１と同様に３７℃のインキュベーション下でメト
化加速試験を行ない、メト化の進行に対する抑制効果を
経時的に検証した。結果を表１に示す。

【００３２】（実施例４）実施例３において、グアノシ
ンに代えてリボース-1- リン酸（Ｒ−１−Ｐ）を、３ま
たは６ミリモルの濃度で添加したヘモグロビン溶液を調
製し、実施例３と同様にメト化加速試験を行ない、メト
化の進行に対する抑制効果を経時的に検証した。結果を
表１に示す。

【００３３】表１から明らかなように、グアノシン、Ｒ−１−Ｐ添加
によりメト化が抑制され、その効果は同濃度のイノシン
添加時にほぼ等しいものであった。

【００３４】（実施例５）試験例１と同様に、１００ｋ
Ｄの限外ろ過フィルター処理を行って調製したストロー
マフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）に、ヘモグロビン
７ミリモル当りＮＡＤ０．１ミリモル、イノシン（Ｉ
Ｎ）６ミリモルを添加し、ｐＨを６．６から８．２の範
囲で変化させた各９検体のヘモグロビン溶液を調製し
た。これらを試験例１と同様に３７℃のインキュベーシ
ョン下でメト化加速試験を行い、メト化の進行に対する
ｐＨの影響を検証した。結果を図６に示す。

【００３５】図６から明らかなように、ｐＨ７．０以上
でのメト化抑制効果は、リポソーム内包時の生体内半減
期（およそ２４時間）の期間に相当するまで持続し、延
長されていることが認められた（図中太線グラフ）。図
６より、短時間（６時間程度）のメト化抑制効果は、ｐ
Ｈ６．６−８．２の全域で認められ、特にｐＨ６．８−
７．８の範囲では還元が進行した。しかし、２４時間後
には、ｐＨ７以下でメト化が進行していたことから、Ｓ
ＦＨのｐＨ調整の範囲はｐＨ７．０を下限とするのが望
ましいことが示された。

【００３６】（実施例６および比較例３）＜ヘモグロビン含有リポソームの調製＞試験例１と同様
に赤血球を溶血、遠心分離し、０．２μｍのフィルター
でろ過した後、分画分子量１００ｋＤの限外ろ過フィル
ターによる処理を行った、ヘモグロビン溶液を、ダイア
ライザーで濃縮し、ヘモグロビン濃度４５％のストロー
マフリーヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）を調製した。この
ＳＦＨに、イノシトールヘキサリン酸（ＩＨＰ）をヘモ
グロビンと等モル比になるよう添加し、リポソーム型酸
素運搬体の製造に供した。

【００３７】水素添加大豆レシチン、コレステロール、
ミリスチン酸の均一混合脂質粉末に、予めＮａＯＨ水溶
液（０．５〜２．０Ｎ）を加えて中和膨潤液を調製し、
膨潤水量が脂質と等量となるように蒸留水を加えて８０
℃、３０分の水和処理を行った。ＳＦＨはＩＨＰのみ添
加のもの（比較例３）と、ＮＡＤ、イノシンを添加した
もの（実施例６）とを用意し、各々を得られた水和脂質
に対して重量比にして４：１で添加し、高速攪拌機（ワ
ーリングブレンダー：ワーリング社製）に投入し、攪拌
処理を行った。得られたリポソームの懸濁液を生理食塩
水で１０倍に希釈して、高速遠心機により遠心し、リポ
ソームに取り込まれなかったヘモグロビンおよび微小粒
子を除去した。さらに上澄みにヘモグロビンが検出され
なくなるまで生理食塩水で遠心洗浄を繰り返し、その
後、０．４５μｍのフィルターを用いて、ろ過滅菌及び
粒子制御を行った。最終的にヘモグロビン濃度が６％に
なるよう限外ろ過膜により濃縮した。得られた人工酸素
運搬体は、試験例１と同様にメト化加速試験を実施し
た。

【００３８】酸素運搬体４２００μｌを、１０％Triton
X-100を含む２０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ７．２)
８．０ｍｌに懸濁し、フレオン２．０ｍｌ添加、懸濁後
３０００rpm で１０分間遠心し、上清を得た。この上清
を (Ａ) 、（Ｂ）２つに分け、試験例１と同様にメト化
を測定した。その結果、ＩＨＰ以外の添加物を加えずに
製造された酸素運搬体（比較例３）では、２４時間後の
ヘモグロビンのメト化率が３０％であったのに対して、
ＮＡＤ、イノシンを加えて製造した酸素運搬体（実施例
６）では１８％と低い値を示し、これらの添加効果が確
認された。

【００３９】

【発明の効果】ヘモグロビン溶液の調製過程にウイルス
除去工程を導入することによりウイルス感染リスクを低
減し、より安全な人工酸素運搬体の提供が可能となる。
さらに、ヘモグロビン溶液に適切な添加物質を加えるこ
とにより、人工赤血球およびリポソーム型人工酸素運搬
体の保存時および生体内投与時のメトヘモグロビン生成
を抑制することができ、その機能が維持される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＡＤ共存下でのイノシン添加効果を示す図
である。

【図２】ＮＡＤ共存下でのアデニン添加効果を示す図
である。

【図３】ＮＡＤ共存下でのグルコース添加効果を示す
図である。

【図４】イノシン共存下でのＮＡＤの添加効果を示す
図である。

【図５】ＮＡＤ共存下でのイノシン、イノシン酸添加
効果を示す図である。

【図６】実施例で検証したメト化の進行に対するｐＨ
の影響を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分子量１５０ｋＤ以上の成分が除去された
赤血球由来のストローマフリーヘモグロビン溶液と、
（Ａ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）および／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と、（Ｂ）イノシン、イ
ノシン酸、グアノシンおよびリボース-1- リン酸からな
る群より選ばれる少なくとも１つとからなるヘモグロビ
ン溶液。
【請求項２】分子量１５０ｋＤ以上の成分が除去された
赤血球由来のストローマフリーヘモグロビン溶液と、
（Ａ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）および／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と、（Ｂ’）リボース-1
- リン酸または代謝系で最終的にリボース-1- リン酸と
なりうる物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと
からなるヘモグロビン溶液。
【請求項３】前記ストローマフリーヘモグロビン溶液
は、分子量１５万以上の解糖系酵素を実質的に含まない
請求項１または２に記載のヘモグロビン溶液。
【請求項４】前記ヘモグロビン溶液がヘモグロビンを３
０〜６０重量％の濃度で含有する請求項１〜３のいずれ
かに記載のヘモグロビン溶液。
【請求項５】前記ヘモグロビン溶液のｐＨが７．０〜
８．５である請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロ
ビン溶液。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のヘモグロ
ビン溶液がリポソームに内包されてなるヘモグロビン含
有リポソーム。