JPS62265232A

JPS62265232A - 脂質置換治療法

Info

Publication number: JPS62265232A
Application number: JP62041263A
Authority: JP
Inventors: イエッケズケル　バレンホルツ; エリシャロム　イエチェル
Original assignee: Hadassah Medical Organization
Current assignee: Hadassah Medical Organization
Priority date: 1986-02-24
Filing date: 1987-02-24
Publication date: 1987-11-18
Anticipated expiration: 2013-05-06
Also published as: ATE133332T1; US4812314A; DE3751680D1; EP0234919A3; EP0234919A2; EP0234919B1; JPH09315978A; JP2746287B2; US6348213B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、心筋組織の脂肪組成の年齢に応じる変化、お
よび他の年鎚に応しる生理学的性質の回復の方法に関す
る。

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２９、　　　Ｙｅｃｈｉｅｌ、　Ｅ、　　ら、　Ｊ　Ｂ
ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６０（１６）　：９１３１　　
（１９８５ｂ）。

（従来の技術）老化により生ずる生化学的変化のひとつに膜の脂質組成
の変化がある。哺乳類の細胞膜においては、主な変化は
フォスファチジルコリン（ＰＣ；年齢と共に低下する）
、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）およびコレステロ
ール（年齢と共に増加する）、の相対組成について起こ
る（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ）。

ＰＣとＳＭとの相対量の変化はリン脂質の代謝回転の低
いＭｉ織で特に大きい。例えば、大動脈および動脈に関
連する細胞膜は老化とともにＰＣ／ＳＭ比が６倍低下す
る。Ｓ旧よまた動脈硬化を含むいくつかの病気において
増大する。この５Ｍ含量は大動脈の障害が進行すると総
リン脂質の７０〜８０％と高くなる（Ｂａｒｅｎｈｏｌ
ｚ　１９８２．１９８４）。

生体膜に由来するｐｃとＳＭとの最も顕著な差は。

（ａ）脂質の相転移温度、および（ｂ）脂質二重層中の
２つの脂質の水素結合特性である。大部分のスフィンゴ
ミエリンは３０℃と４０℃の間の範囲の生理学的温度に
転移温度があり、これに対して、大部分の天然のフォス
ファチジルコリンは転移温度が３７℃より充分に高い（
Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ　１９Ｂ０．１９８２．１９８４＞
。

水素結合に関しては、これら２つの脂質の極性領域の差
がＳＭを水素結合における水素の供与体および受容体の
両者にさせ得、一方ＰＣは水素供与体のみになり得る。

これらの差に関連しているか否かは別として。

哺乳動物の細胞膜のｐｃのＳＨに対する相対含量は細胞
機能に重大に影響すると思われる。本発明者および共同
研究者は最近９時間の超過した培養での脂質組成および
一次ラット　ミオサイトの活性の変化について報告した
。細胞のＰＣおよび５Ｍ含量の測定によれば、培養の最
初の３日間では、　ＰＣ／ＳＭ比が５から約２に、そし
て、培養の次の１４日間にわたっては２から約１に低下
するのが示された。

脂質組成の変化は、培養細胞の搏速度で測定したところ
、心臓細胞活性の劇的な変化を伴っていた。

培養の７日〜１２日の間において、搏数／分は約１６０
から約２０へ低下し、そしてＶｍａｘ／ＤＮＡで表され
る。

少なくとも７つの酵素の活性の顕著な増大もまた観察さ
れた。これらの酵素の１つはクレアチンホスホキナーゼ
（ＣＰＫ）であり、これはミトコンドリアからミオフィ
ブリルへの細胞内エネルギーの輸送とエネルギー利用に
連結したエネルギー生産の調節とに大きな役割を果たし
ている（Ｙｅｃｈｉｅｌ　１９８５ａ。

１９８５ｂ）。

コレステロールのリン脂質に対する比もまた。

生体膜の性質を調節する重要な決定因子であるらしい（
、Ｃｏｏｐｅｒ　１９７７）。いくつかの研究により、
生体膜のある性質はコレステロールの増大または減少に
より変化し得ることが示された（Ｂｏｒｏｃｈｏｖ＋Ｃ
ｏｏｐｅｒ　１９７８＋　Ｈａｓｉｎ）　＊一般に、＠
乳類の細胞膜ではＳＭおよびコレステロールレベルの変
化に強い正の相関がある。つまり、一方の含量の変化に
他方の変化が伴う（Ｗａｌｌａｃｈ＋　Ｂａｒｅｎｈｏ
ｌｚ　１９８２＋　１９８４）。

いかに細胞がその異なった膜で種々の脂質組成を維持す
るのか、または、なぜ脂質組成が老化により変化するの
かは明らかでない。理論的には。

脂質の組成の変化は、特異的脂質成分の合成または分解
の速度の変化、もしくは血清および細胞膜間での脂質の
交換または輸送の速度の変化の結果であり得る。後者の
機構については、培養生物細胞の脂質交換のインビトロ
実験に関して強い関心が払われた。多くの研究において
、生体膜と人工の脂質二重層小胞またはリボソームとの
間での脂質交換が示された（Ｐａｇａｎｏ、　Ｍａｒｔ
ｉｎ、　Ｃｏｏｐｅｒ　１９７７＋Ｆｒａｎｋ）。一般
に、細胞およびリボソーム間のリン脂質の交換は、高お
よび低密度血清アポリポタンパクを含む種々のリン脂質
輸送タンパクの存在により促進される（Ｗｉｒｔｚ、　
Ｋａｄｅｒ）。生体膜およびリボソーム、および／また
は血清リポタンパク粒子間のコレステロール交換もまた
。よく知られている（ｔ（ａｓｉｎ、　Ｇｒｕｎｚｅ、
Ｐａ１）。

脂質交換により生体膜の脂質組成を変化させ得ることは
、細胞機能に対する脂質変化の効果を研究する手段を提
供する。例えば、上述のミオサイト培養系（時間の超過
した培養でＰＣ／ＳＭ比の低下が博頻度の低下を伴う）
において、（ａ）細胞のもとの脂質組成が脂質交換によ
り回復され得るか；そして（ｂ）もしそうであれば、も
との細胞機能、つまり最初の搏速度、ちまた回復するか
、を問うことができる。本発明者および共同研究者−よ
、小車一層ｐｃリボソームを細胞との脂質交換用の小胞
として用い、この問題の研究を行った（Ｙｅｃｈｉｅｌ
　１９８５ａ。

１９８５ｂ）。この研究により、脂質交換がＰＣ／ＳＭ
およびＰＣ／コレステロール比の両者を増大させ、そし
て時間の超過した培養細胞において正常な脂質組成への
変化を回復させることが示された。興味深いことに、脂
質交換はまた。細胞をＰＣリボソームに接触させた１日
以内に搏頻度が約２０から１６０へ上昇するというよう
に、細胞の搏頻度をそのもとのレベルに回復させた。脂
質交換はまた。培養の経過と共に通常増大するＣＰＫの
ような細胞酵素を減少させた。

（発明の背景）本発明の重要な観点によれば、ＰＣに冨んだリボソーム
が、消化管外の（非経口）投与により該リボソームを与
えられた動物の心筋細胞の脂質組成の年齢に関する変化
を回復させ得ることが見い出された。このリボソーム処
理の１つの重要な利点は２通常年齢とともに漸減する（
う７）では約１５ケ月を越える年齢で始まる）呼吸スト
レスに抵抗する能力が有意に改善されることである。さ
らに。

脂質交換とそれに付随する呼吸耐久力の改善は。

最初のリボソーム投与から数日以内に現れる。この方法
は家畜動物とヒトとの両方に適用し得る。

本発明の他の観点によれば、心筋脂質交換におけるリボ
ソーム処理の効果は、多くの生理学的変化に反映される
。この変化は、処理した個体（家畜動物またはヒト）の
血清サンプルで容易に観察できる。これらの変化の１つ
は、血清クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の相対的
に若い動物の特性であるレベルへの低下である。典型的
には、相対的に老齢の動物の血清ＣＰＫは、リボソーム
投与を始めた後数日で５０％またはそれ以上低下する。

処理動物で容易に見られる他の変化は浸透圧ショックに
対する赤血球細胞の大きな耐性である。繰り返して述べ
れば、この変化はより老齢の動物で最も強く見られ、処
理した個体の細胞はより若年のその動物の特性である浸
透圧的強度を示す。浸透圧的強度の変化はおそらく、リ
ボソーム処理の結果、赤血球細胞においてＰＣ／ＳＭお
よび／またはリン脂質／コレステロール比がより太き（
なることによるものである。

本性を実施するには、はぼ同年齢の個体の心臓組織に特
徴的に見られるものより実質的により多いＰＣと実質的
により少ない罪とを含むリボソームの懸濁液が提供され
る。ある好ましい実施態様においては、このリボソーム
は、主として０．０２〜０．０８ミクロンのサイズを有
する小さい単層小胞（Ｓｔ′、Ｖｓ）であり、主として
またはもっばら、卵ＰＣのような精製ＰＣからなる。こ
のリボソーム懸濁液は、少なくとも数日間にわたり、処
理動物の血清ＣＰＫのレベルを実質的に低下させるのに
有効な量で投与される。処理の経過は、血中ＣＰＫ、ま
たは血液細胞の脂質組成または浸透圧的強度変化を監視
することにより追跡され得る。

リボソーム処理法の他の重要な利用は、処理個体の寿命
の増大についてである。実験動物での研究により、比較
的老齢の動物を長期間にわたりリボソームで処理すると
動物の寿命が、平均約３６％延びることが示された。

末法のさらに他の重要な利用は、オスの生殖能力の増強
に対してである。本発明による比較的老齢の実験動物の
リボソームでの処理は、より老齢のオスの動物で通常見
られるほぼ完全な能力の消失を回復させた。この方法は
より老齢の育種動物の処理に特に有用である。

従って１本発明の一般的な目的は、動物の呼吸ストレス
への抵抗能力を有意に高める方法で老齢個体を処理する
方法を提供することである。

本発明の関連した目的は、心筋細胞の年齢に関係した脂
質組成の変化を回復させるような方法を提供することで
ある。

本発明の他の目的は、処理の経過が血清酵素レベルまた
は赤血球細胞特性の変化により容易に監視できるような
方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、老齢の個体により長い寿命
や性機能を含む質的な利点をもたらす方法を提供するこ
とにある。

本発明のこれらおよび他の目的、そして特徴は。

次の本発明の要旨によりさらに充分に理解されるであろ
う。

（発明の要旨）本発明はひとつの局面においては、器官やｕＨＮ（例え
ば心筋細胞および血球細胞）の脂質組成の年齢に関連し
た変化を、脂質交換により回復させるために１個体（家
畜動物またはヒト）へ非経口的にリボソームを投与する
ことを包含する。心筋の老化過程には、ＰＣの低下およ
び付随したＳＭおよびコレステロールの上昇という特徴
がある。そのため、該リボソームは、リボソームから心
臓細胞膜へのＰＣの交換、および心筋からリボソームへ
のＳＭの交換を促進するように設計される。このリボソ
ームはまた。好ましくは器官および組織（例えば、心筋
細胞および赤血球細胞）からリボソームへのコレステロ
ールの交換を促進するように設計される。

所望の脂質交換を促進するために、処理される個体の心
臓組織の値（つまり、同年齢１種、および性の個体に特
徴的なＰＣおよび針のレベル）よりリボソームＰＣのモ
ル％は実質的に高く、そしてリボソームＳＭのモル％は
実質的に低い。好ましくは。

このリボソームは処理される個体の心筋細胞より。

少な（とも約２５モル％高いＰＣと少なくとも約１０モ
ル％低いＳＭとを含有する。実施例■〜■に述ぺられ、
そして使用されるひとつの好ましいリボソーム標品にお
いては、該リボソームは実質的に純粋なＰＣで形成され
る。これらのリボソームは、実施例■で見られるように
、心臓細胞のＰＣ／ＳＭ比を増大させ、そしてコレステ
ロールレベルを低下させるように作用する。コレステロ
ール減少の程度は。

コレステロール量をＯから処理個体の心筋細胞中の量に
相当するモル％にまで増大させることにより、最大の減
少から事実上減少しないところまで変えることができる
。

リボソーム脂質の選択において他に考慮する重要な事柄
は、リン脂質のアシル鎖組成である。上述のように２年
齢と共に起こるＰＣからＳＭへのリン脂質のシフトはま
た。膜リン脂質のアシル鎖部分の飽和度と鎖長との全体
的な増大を伴う。従って。

脂質のｐｃ成分は、少なくとも遷移温度に関しては。

より若い年齢の動物の心臓細胞のアシルｆｔｉ　Ｍｌ成
の特徴であるアシル鎖組成を有することが望ましい。

ひとつの好ましい組成は卵ＰＣであり、これは主に１−
バルミトイル、２−オレイルＰＣと１−バルミトイル、
２−リルイルＰＣを含む。

このリボソームは、免疫源とならずそしてリボソームと
心筋細胞間の所望の脂質交換を阻害しない限り、他の脂
質成分を含み得る。付加的な成分には、ホスファチジル
グリセロール（ＰＧ）またはホスファチジルセリン（Ｐ
Ｓ）のような、負荷電の脂質が含有され得る。もちろん
、これらの脂質のモルパーセントはＰＣに対し相対的に
低くなければならない。α−トコフェロール（α−下）
、α−トコフェロール酢酸、またはα−トコフェ口−ル
コハク酸のような脂質保護剤もまた。遊離ラジカル損傷
に対し該脂質成分を保護するために、リボソームを形成
する脂質に包含され得る（Ｌｅｖｉｄａ）。

典型的には、そのような試薬は約０．５％〜２％の間の
モルパーセントで含まれる、リボソーム中のビタミンＥ
とポリ不飽和脂質量のバランスを保つために、リボソー
ムにα−下を加えることは有利である。

リボソーム形成の種々の方法が利用でき、そしてこれら
は詳細に総説中で述べられている（Ｓｚｏｋａ１９８０
）。一般にこれらの方法は、約０．０２から１０ミクロ
ンまたはそれ以上の不均一なサイズのリボソームを生じ
る。後述のように、比較的小さく、そしてサイズが決ま
ったリボソームが本発明の実施には好ましいので、サイ
ズと不均一性を下げるためのリボソーム懸濁液の第２の
処理段階が通常要求される。

第１のリボソーム懸濁液を形成するひとつの好ましい方
法においては、小胞を形成する脂質を適当な有機溶媒系
にとり、そして真空でまたは不活性ガス下で、容器内に
脂質膜を形成するように乾燥させる。滅菌食塩水のよう
な水性懸濁媒体をこの膜に加え、そして容器を脂質が完
全に水和するまで、典型的には１〜２時間の間攪拌する
。加えられる水性媒体の量は、好ましくはｌｏｏ＋＋＋
Ｎ当たり約１０〜３０ｇの脂質を含むリボソーム懸濁液
が生成するような量である。

この脂質は水和し、そのサイズが約０．５ミクロン−約
１０ミクロンまたはそれ以上の多層小胞（ＭＬいを形成
する。一般に、　　ＭＬＶのサイズ分布は、さらに激し
い振盪条件下での脂質の水和によりわずかにより小さい
サイズに移行する。実施例１は、リボソームのサイズを
減じるために超音波照射で肚Ｖを処理するのに先立つ、
卵ＰＣＭＬＶの調製を述べる。

リボソーム形成に用いられる水性媒体は、リボソームの
保存時の安定性を増す１種もしくはそれ以上の水溶性試
薬を含んでもよい。ひとつの好ましい安定化剤は、デス
フェリオキサミンのような鉄特異的トリヒドロキサミン
キレート化剤である。

脂質の過酸化と薬剤含有リボソームの遊離ラジカル損傷
を減じるだめのこの化合物の使用は、　１９８５年１２
月６日出願の“リボソーム／アントラキノン薬剤組成物
および方法”という米国特許出願で報告されている。簡
単に述べれば、α−下のような親油性の遊離ラジカル捕
捉剤と水溶性キレート化剤との組み合わせは、どちらか
一方の保護剤のみの場合より、脂質の過酸化損傷に対し
、実質的に優れた保護効果をもたらすことが示された。

このキレート化剤は媒体中の遊離鉄の量より過剰なモル
数で水性媒体に含まれる。典型的には、約１０〜５０μ
門のキレート他剤濃度で充分である。

Ｂ、リボソームのサイズの言。

リボソーム懸、濁液は、小胞の選択的なサイズ分布を達
成するために、約１ミクロン未満、好ましくは約０．２
〜０．３ミクロン未満の範囲となるように、サイズ調整
を行ってもよい。このサイズの範囲にあるリボソームは
、デプス　フィルター（ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｅｒ）での
濾過によって、容易に滅菌され得る。

より小さい小胞は、また、保存中に集合する傾向が小さ
い。従って、該組成物が非経口投与される場合、血管の
閉塞という深刻な問題を潜在的に減少させる。最終的に
サブミクロンの範囲にサイズを小さくしたリボソームは
、均一な生物学的分布および薬剤除去特性を示す。

リボソームのサイズ、およびサイズの不均一さを減少さ
せるのに２本発明に適したいくつかの手法が有効である
。バスまたはプローブソニケーションによりリボソーム
懸濁液に超音波照射することにより、顕著なサイズの減
少をおこし、約０．０２〜０．０８ミクロンの間のサイ
ズの小さい単一層小胞（ＳＩＩＶ）が生じる。ＳＵＶを
調製するのに使用する超音波手法は実施例１に示される
。ホモジナイザーシヨンは、剪断エネルギーにより、大
きなリボソーム断片をより小さなものにするもう一つの
方法である。典型的なホモジナイゼーション法において
。

ＭＬＶは、標準的なエマルジョンホモジナイザーにより
２選択したボリームサイズ（典型的な場合。

およそ０．１〜０．５ミクロンの間）が観察されるまで
、再循環される。いずれの方法においても７粒子のサイ
ズの分布は９通常のレーザービーム粒子サイズ判別装置
によって監視され得る。

小孔ポリカーボネート膜を通してのリボソームの押出は
、リボソームのサイズを、比較的良く特定されたサイズ
分布（膜孔のサイズに依存して。

平均約０．０３と１ミクロンの間の範囲にある）にまで
減少させるための効果的な方法である。典型的には、所
望のリボソームのサイズ分布が得られるまで、ｊＱ濁液
を膜を通して数回循環させる、リボソームのサイズを段
階的に減少させるために、リボソームは孔が連続的に小
さくなっている膜を通して押出され得る。

より最近では、１ミクロンを越えるおよび１ミクロンを
下まわる不均一なサイズのリボソームの懸濁液を、非対
称セラミックフィルターを通過させることにより、効率
的にサイズ調整され得ることが発見された。好ましいセ
ラミックフィルターは、セラフロー　ミクロフィルター
（ＣｅｒａｆｌｏｗＭｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ）であり、
０．２〜１μの内部表面小孔サイズを有する。ツートン
社（Ｎｏｒｔｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ　；Ｗｏｒｃｅｓｔ
ｅｒ、　ＭＡ）より市販品が入手され得、これは。

マルチフィルターカートリッジタイプ濾過器として供給
されている。このサイズ調整の方法は、米国特許出願に
“リボソーム押出法”として記述され、　１９８６年２
月１３日に出願されている。

１ミクロンより小さい選択された闇値を下まわるサイズ
の粒子を有するリボソーム懸濁液を、生成するのに用い
られる他の方法として、遠心分離および分子ふるいクロ
マトグラフィーがあげられる。

これらの２つの方法は、大きな粒子を小さな粒子へ変化
させるというよりはむしろ、より大きなリボソームを優
先的に取り除くということを包含する。従ってリボソー
ム収量は低下する。

サイズ調整したリボソーム懸濁液は９通常の０．２２ミ
クロン　デプス　メンブレンフィルターのような、約０
．２ミクロンの粒子識別サイズを持つ除菌膜を通過さす
ことにより容易に滅菌し得る。所望であれば、リボソー
ム懸濁液は、貯蔵のため凍結乾燥でき、使用直前に再調
製しうる。

■、九　　法および′七− Ａ、ユ」ツ二つ弓λ文与１つの処理方法では、心筋細胞の脂質組成に所望の変化
がおこるまで、リボソーム懸濁液を１回（ｄｏｓｅ）ま
たはそれ以上非経口投与する。心筋細胞の脂質組成の変
化は、血清ｃｐにおよび赤血球の性質の変化を伴い、そ
の処理の過程は血液のサンプリングによって容易に追跡
し得る。

このリボソームは連続して９Ｍ便に投与でき。

少なくとも数日間にわたって与えることができ。

そして好ましくは処理を受けている個体の生涯にわたっ
て、１〜数ケ月の間隔での連続して投与し続けられる。

各投与におけるリボソームの投与量は２体重１　ｋｇあ
たり約０．０１〜１．０ｇの間が好ましく、実質的には
それより少な（てもよい。８０ｋｇの個体に対する典型
的な用量は、脂質約４０〜８０ｇであり、これは２０％
までのリボソーム？ｊ！、？ｒｆＪ液２００−〜４００
　ｄに相当する。投与は静脈注射により行われ得る。し
かし、投与する部位の組織および血液の損傷を最小にす
るため、少なくとも約１時間をかける静脈点滴によって
投与するのが好ましい。このリボソームは、滅菌食塩水
、またはブドウ糖／食塩培地のような栄養分を含むもし
くは薬剤を含む媒質に懸濁し、リボソーム療法を他の非
経口投与療法と組み合わせてもよい。

最初の投与の前に、血清酵素および／または血球の特徴
を決定するために血液のサンプルを採取する。この特徴
は、リボソーム処理の過程において監視される。以下に
考察するように、リボソーム処理は血清ＣＰＫレベルの
容易に測定できる低下を引きおこし、そのレベルをより
若い年齢の個体に特徴的なレベルにまで低下させる。こ
のＣＰＫの低下は、おそらく筋肉細胞における年齢と関
係した脂質組成の逆転を反映しており、それについては
、実施例■および■でそれぞれ述べる、リボソーム処理
は、少なくとも約２５％、好ましくは５０％もしくはそ
れ以上の血清ＣＰにの低下が観察されるまで続けられる
。実施例２における実験では、血清ＣＰＫレベルは、処
理後９日間で処理前の約１５％に減少した。

リボソーム処理はまた。赤血球の脂質組成および浸透圧
強度の容易に観察できる変化を与える。

これらの変化は後の実施例１ｖおよび■で述べられる。

一連の狭い範囲で勾配をつけた食塩水のひとつに充填し
た細胞を懸濁するときに遊離するヘモグロビンの百分率
を測定する筒車な分光光度技術を用いて、浸透圧に対す
る強度が決定され得る。

その方法は実施例■で述べられる。

（以下余白）赤血球の脂質組成の変化は、まず赤血球の脂質を抽出し
２次いで、既存のクロマトグラフィー法により２選択さ
れた脂質成分を分離することにより決定され得る。ＰＣ
／ＳＭ比の決定のために、ＰＣとＳＭとは、薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）により。

実施例Ｉおよび■に記述のように容易に分離され得る、
リボソーム処理の経過を監視するために。

赤血球ＰＣ／ＳＭ比の変化を追跡することの利点は。

比較的大きなＰＣ／ＳＭ変化が観察されることにある。

例えば、実施例■に記述の９日間処理において。

１日ケ月齢のラットの赤血球のＰＣ／ＳｔＩ比は、はと
んど７倍まで増加する。

この処理用のリボソームは、心ｆａＭｉ繊細胞のような
組織や器官からリボソームへのコレステロールの交換を
促進する（リボソーム中の低コレステロール含量によっ
て）ために設計される場合にも。

処理の経過は、コレステロール含量の変化をたどること
により、追跡され得る。膜コレステロールの変化を測定
し表示する方法は、実施例■および■に詳述する、リボ
ソーム処理中の赤血球におけるリン脂質組成の変化は、
一般にＰＣ／ＳＭの変化よりおだやかである。

この最初のリボソーム投与に続き、血清ＣＰＫ　（また
は赤血球の特性）のレベルを測定する。そして、第２の
リボソーム用量を、典型的には、この最初の投与の２〜
７日後に与える。測定される血清の特性がプラトーにな
り始めるまで、さらに２〜７日の間隔で同じように投与
されてもよい。その後２例えば１〜２ケ月ごとの周期的
なリボソーム処理を続けることにより９個体は所望の脂
質組成の状態が維持され得る。実施例■は、実験動物を
初めに１週間あけて２回のリボソーム投与で処理し１次
いで、２ケ月ごとに１回リボソームを注射し続ける処理
様式について例示する。この動物は。

未処理の動物より少なくとも３６％長生きした。

Ｂ、生止学前唄来上記のリボソーム処理を実験動物で試験し、心筋細胞の
うちの年齢に関係した脂質組成の変化を回復させ、呼吸
ストレスに対する耐性を増加させる効果を決定した。一
連の試験において、１日ケ月齢のラットを、３回のリボ
ソーム用量で処理した。

この処理は、３日おきに行い、６日間投与した（３回注
射）。最後の注射の３日後に、この動物を実験に供した
。心筋細胞のＰＣ／ＳＭおよびコレステロール含量を、
実施例Ｈに詳述したように決定した。得られた値を、比
較的若い動物（３ヶ月齢）および処理していない１日ケ
月齢の動物がら得られた値と比較した。その結果は９通
常３ケ月から１日ヶ月の年齢の間でおこるＰＣ／ＳＭ比
の１７２以上の減少、コレステロール含量の３倍以上の
増加が、このリボソーム処理によって完全に回復したご
とを示す。

この３つの動物群で、実施例■に記述のように。

その心筋ＣＰＫレベルおよび血清ＣＰＫ　レベルも試験
した。ラットにおいて３ヶ月齢の動物と１日ケ月齢の動
物との間で通常おこる脂質組成の変化は、心筋細胞ＣＰ
Ｋおよび血清ＣＰＫの約３倍の増加を伴う。

リボソーム処理の９日後、心臓細胞ＣＰＫは通常３ヶ月
齢の動物にみられるレベルまで、約１７３に減少する。

また、血清ｃｐには実質的に３ケ月イ動物より著しく低
いレベルまで、約１７８に減少する。

それゆえ、処理された動物の血清ＣＰＫの劇的な減少は
、リボソーム処理中におこる心臓脂質変化の感度の高い
指標になる。処理中に同時におこる心筋ＣＰＫの減少は
、心筋ＣＰＫのレベルの低下が部分的に血清ＣＰＫの減
少に起因することを示す。

上記した心臓細胞の脂を組成の変化を心臓全体のホモジ
ネートで調べた。従って、この変化は。

心筋（心Ｒ）細胞および結合繊維芽細胞の両方から脂質
が寄与されることを示す。この観察された脂質組成の変
化が心筋細胞での変化をも反映することを確認するため
、３ヶ月齢および１８ケ月齢の動物から心臓細胞を単離
し、心筋の再集合を生じる条件下で培養し２次いで、卵
ＰＣリボソームとの脂質交換を試験した。この方法およ
び結果は実施例■に詳述する。この再集合物は、３ヶ月
齢および１８ケ月齢の動物からの細胞と比較すると、　
ＰＣ／ＳＭ比の減少およびコレステロールレベルの増加
を示した。また、それらの年齢に関係した変化は。

この卵ＰＣリボソームとのインキュベーションにより、
実質的に回復した。この結果は、インビボで心臓組織中
に見られる脂質の効果が、少なくとも部分的には、心筋
膜脂質の変化によることを示す。

この３つの各動物群からの赤血球で、赤血球中での脂質
組成の変化および浸透圧耐性の変化を試験した。この結
果は、上記および実施例■および■で論じる。簡単に言
えば、リボソームは、　ＰＣ／ＳＭ比オヨびコレステロ
ールレベルの年齢に関連した変化（通常３ヶ月齢と１８
ケ月齢との間でおこる。

３ヶ月齢の動物からの心筋では、　ＰＣ／ＳＭ比が増加
しかつコレステロールレベルが減少する）をより太き（
回復させる。脂１を組成におこる変化は、より大きな浸
透圧耐性に反映されている。

本発明の重要な治療上の応用は、心臓ストレスへの患者
の耐性を増加させることにある。この応用は、心筋梗塞
のような心臓損傷（ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒａｕｍａ）を
患っている人、または、心臓損傷の危険性の高い人に対
し有益である。いずれのケースにおいても、酸素要求の
増加または血圧の上昇という形の心臓へのストレスが加
わると、心臓の不全または。

心臓への重大な損傷を引きおこす。

この処理の効用は、実験動物で示された。ここでは、処
理前後の動物の心臓ストレスに対する耐性を、標準的な
実験室方法により測定した。この方法では、容量の正確
に規定された小室内に動物をおく。この小室は外部との
ガス交換ができない。

試験の経過中、酸素の消耗および二酸化炭素の蓄積によ
り、動物の血圧を徐々に、θ近くのレベルまで減少させ
る。この小室内で、動物の血圧低下がほとんどＯになる
前に、呼吸ストレスに対する耐性を測定する。この試験
の結果は、実施例■で報告する。３回のリボソーム処理
後、および最初の処理の９日後に、１８ケ月齢のラット
は、未処理のラットより、約５０％長（血圧を維持でき
た。この処理したラットは、また、未処理のラットより
。

血清ＣＰＫの増加速度がずっと遅いことが示された。

この試験期間中を通じた血液の追跡により、処理動物お
よび未処理の動物の両方が、類似の血中酸素レベルおよ
び二酸化炭素レベルを維持することが示された。このこ
とは、処理した動物のより良好な能力が、単に血液−ガ
ス含量の効果ではなかったことを示す。

発明者およびその共同研究者は、脱脂１ｔ′ｉＪｉ成と
。

培地中でのラット筋細胞の多くの生物学的特性との間の
関係を研究した。この生物学的特性は、多数の酵素のレ
ベル変化、細胞形態、および心臓筋細胞の鼓動速度を含
む。上に述べた研究では、この細胞のＰＣ／ＳＭ比が、
１４日間の培養期間中に１７７に減少し、コレステロー
ル含量／ＤＮＡが、同じ期間において、約１．６倍に増
加することが示された。

この培地にＰＣＳＵＶを加えると、この細胞内の年齢と
関連した変化の全てが回復した。この変化には。

膜脂質組成、酵素レベル、細胞形態、および心臓活性（
これは鼓動の頻度として測定される）が含まれる。特に
、リボソーム添加による細胞の鼓動初速度の迅速な回復
は、脂質組成が、心筋細胞の能力の決定的な因子である
ことを示唆している。

従って、リボソーム処理した動物で見られる呼吸ショッ
クに対する耐性の増加は、少なくとも部分的には、心臓
の能力が高められたためと思われる。

この処理法は、一般に、上に概説したリボソーム投与様
式に従う。この方法では９個体に、好ましくは体重１　
ｋｇあたり約０．５〜２ｇの脂質の初期用量を投与し、
その後５次の用量を１回またはそれ以上、２〜７日ごと
に、約０．００１〜１ｇ脂質／動物重ｆｆｉ　（ｋｇ）
　／日の長期間の用量割合で投与する。１〜２ケ月ごと
に投与される約０．１〜１ｇ脂質／　ｋｇの持続用量が
採用されてもよい。処理に用いたリボソームは、このリ
ボソームから心臓細胞へのＰＣの脂質交換、および上記
のように、この反対方向での罪の交換を促進するように
処方されている。このリボソームは、また、好ましくは
、この細胞からリボソームへのコレステロールの交換を
促進するべく処方される。そして、あるより好ましいリ
ボソーム処方は純粋な卵ＰＣから構成される。しかし、
長期間の処理では、このリボソームにコレステロールを
含ませ、この赤血球中のあまりに大きなコレステロール
の消耗を防ぐのが望ましい。

心臓の脂質組成の生化学的な変化は、上に述べたように
、関連する血清ＣＰＫの変化および／または赤血球の脂
質組成の変化、または浸透圧に対する強度の変化を測定
することにより、監視される。

心臓の機能は、治療期間中では、従来のＥＫＧにより監
視され得る。

Ｂ１分立夏青倉勿延長本発明のもう１つの観点によれば、上に記述のように、
リボソーム処理をうけた実験動物は、処理を受けていな
い動物よりも、実質的に長生きすることが発見された。

オスの実験用ラットの寿命に関する研究の結果を実施例
■に記述する。簡単に言えば、Ｂ０ケ月齢のラットに、
リボソームの初期注射を与え、１週間後に第２の注射を
行う。さらに２ケ月ごとに持続注射を行う。ある未処理
ラット群は、３２〜３８ケ月齢の間で死に、平均死亡年
齢は約３４ケ月であった。処理した動物の群では。

４２〜４８ケ月齢の間で、死んだ。

比較的年齢が高くなるまで、すなわち、その動物が通常
死ぬであろう時期の数ケ月以内になるまで、処理を始め
なかった場合でさえ、処理した動物では寿命が延びたこ
とに注目するのは、興味深い。この結果は９年齢が高く
ても、リボソームが。

脂質組成の年齢に関連した変化を回復させるのに効果的
なことを示している。約３６％の寿命の延長は、リボソ
ーム処理により生じる脂質組成の変化が、寿命に関係す
る広範囲の生理的恩恵（多分２心臓の能力の増加を含む
）を与えることを示す。

達成できるその寿命の延長は１人間に投影した結果から
評価できる。人間の寿命の平均して約２年が、実験用ラ
ットの１ケ月に相当すると仮定すると、リボソーム治療
は、寿命を大きく延長するだろう。

Ｃ，オスの生殖２　の１■ リボソーム処理によって与えられるもう１つの恩恵は、
処理したオスの生殖能力の明らかな増加である。実施例
■に報告されている研究では、Ｂ０ヶ月齢およびそれ以
上の高齢の実験用ラットに。

６日間にわたり３回リボソーム用量を投与した。

通常、この年齢のオスのラットは、若い生殖力のあるメ
スのラットと同じかごに入れたとき、子を生ますことが
できない。例えば、１０匹の処理していないこの齢のラ
ットを、各３匹の平均５〜６ケ月齢のメスのラットと飼
育したとき、３０匹のメスのうち２匹だけが妊娠した。

各場合では、そのひと腹の子は、より若いオスが生ませ
る通常ひと腹１０〜１３匹の子より少なかった。処理し
たラットは。

対照的に、正常のオスの生殖力を示した。このラットは
全て３匹のメスをいずれも妊娠させ、いずれのひと腹の
子の数も、正常な１０〜１４匹だった。

動物での処理様式では、つがいにする前に、数日〜数週
間にわたり一連のリボソーム注射を行う。

処理の経過は、先に論じたように、血清ＣＰＫの変化、
または赤血球の変化を監視することにより。

上述のごと（追うことができる。この処理は、特に、馬
、牛の飼育に有用であると期待される。この場合２選択
された動物の飼育寿命の延長は有益である。

以下の実施例で２本発明の種々の局面および使用につい
て例示する。しかし、その範囲を限定するつもりは全（
ない。

（以下余白）林料卵のホスファチジルコリン（卵ＰＣ）とウシの脳のスフ
ィンゴミエリン（ＳＭ）は、既知の方法（Ｓｈｉｎｔｓ
ｋｙ、　Ｂａ５ｅｎｈｏｌｚ　１９７６）に従って調製
した。

両脂質はｆｉｖ層クロマトグラフィー分析によると９９
％以上純枠であった。この卯ｐｃの脂肪酸組成は。

既に報告されている組成（Ｉｌｅｒｔｚ）と同様であっ
た。

この調製物の主要なＰＣは、１−バルミトイル、２−オ
レイルＰＣおよび１−バルミトイル、２−リルイルＰＣ
であった。およそ９９％純枠なコレステロールはシグマ
（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、１０）から得た。

０．２５シリカゲルＩＩＲおよび０・、０２４　シリカ
ゲルの薄層クロマトグラフィー板は、それぞれメルヒ（
Ｍｅｒｃｈ。

ダムルスタント、ドイツ）とアナルテッヒ（＾ｎａｌｔ
ｅｃｈ。

ニューアーク、　ＤＥ）から得た。

クロロホルムに溶かした卵ＰＣを１ｏｏｍｘの容器に入
れ、窒素存在下で乾燥して薄膜にした。滅菌生理食塩水
を最終温度約１００■／　ｍｌ程度に脂質膜に加え、こ
の脂質膜を攪拌しながら水和した。次いで、生じた多重
層小胞（ＭＬＶ）懸濁液は、ヒートシステムソニケータ
ー、モデル３７５Ｗを最高出力の４０〜５０％で１時間
使用して音波処理された。この懸濁液の温度は、音波処
理中にて窒素存在下で約４℃に維持された。この音波処
理された懸濁液を１００．０００　ｇで１時間の超遠心
により、大きい小胞から分離した。約１００■／−濃度
のＳＵＶの懸濁液を滅菌濾過した。

オスのウィスターラットの心筋細胞の脂質組成を、３ヶ
月齢、　１８ケ月齢およびリボソーム処理した１８ケ月
齢について調べた。この３つの群はそれぞれ６匹の動物
を含む。この動物には滅菌生理食塩水（３ヶ月齢および
１８ケ月齢の未処理の群）かまたは実施例■のＳＵＶ懸
濁液のいずれかが静脈末端から注射された。この処理さ
れた動物には、１匹あたり０．５〜１ｇ脂質が３日毎に
６日間（総計３回用量）注射された。未処理の動物には
同期間で同量の滅菌生理食塩水が与えられた。最後の注
射後３日目（最初の注射から９日目）にラットを採血に
より殺し、さらにその血液を分析した。

この心臓を取り出し、冷生理食塩水（０，１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１）で洗浄し、細片した後すぐにホモジネートするか
。

またはホモジネートするまで一７０℃で凍結させた。

この細片した組織は、ガラスホモゲナイザー中にてテフ
ロンピストンを使用し、約１０倍容量の冷生理食塩水中
にて約５０ストロークでホモゲナイズさせた。

このホモジネートの一部から脂質を抽出しくＦｏｌｃｋ
）　。

全リン脂質およびコレステロールを、既に記述のように
（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、　Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ　１９７Ｂ
）　、クロロホルムに冨む下層について測定した。この
ＰＣおよび５Ｍ含量を、既報の方法（Ｙｅｃｈｉｌ　１
９８５ａ、　Ｙａｖｉｎ）に従って、シリカゲルＩＩＲ
板の１次元クロマトグラフィーまたはシリカゲル板の２
次元クロマトグラフィーのいずれかによる薄層クロマト
グラフィー（ＴＬＣ）によって測定した。

この脂質組成データを以下の表■に示す。このＰＣ／Ｓ
Ｍ比は５Ｍ１モル当りのＰＣのモル数で表し、このコレ
ステロール量は、標準法（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）によって
決定されたＤＮＡ　　ｌμｇ当りのナノモル数として表
す。ホモジネートの単位体積当りの全ＤＮＡ含量は１時
間やリボソーム処理にかかわらず相対的に一定であった
。全てのデータは６匹のラットの平均値を表す。

表Ｉ年齢（月）　　　５ｔｌＶｓ　　　ＰＣ／ＳＭ　　　Ｃ
ｈｏｌ。

この脂質組成のデータから、３ヶ月齢から１８ケ月齢の
間でＰＣ／ＳＭ＆よ半分以上減少し、コレステロールは
３倍以上増加していることがわかる。この年齢に関連し
た変化は、リボソーム処理の９日後にて、１８ケ月齢の
ラットでは完全に回復した。そして事実このＰＣ／ＳＭ
は３ヶ月齢ラットにみられる通常の比よりも著しく高か
った。

実施１頂ｙ１１ｊ皺よで−ごＣＰＫに・する　島およびＳＵｖ
実施例■の３つの群の動物（３ヶ月齢、１８ケ月齢、　
　ＳＵＶ処理した１８ケ月齢）からの血液試料を低速遠
心し、血液細胞を除去した。生じた血清分画。

および実施例■で調製した各心臓細胞ホモジネートのＣ
ＰＫ活性を分析した。この酵素は、シグマ技術報告（Ｓ
ｉｇｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　
ｆｌｈ４５−ＵＶに記述のように、シグマ（Ｓｉｇｍａ
、セントルイス、　ＭＯ）から得たＣＰＫ分析キットを
用いて測定した。この結果を表■に示す。ここで、心臓
細胞の酵素活性は３心臓細胞ＤＮＡ　１μｇ当りのｍＵ
を示し、血清の酵素活性は血清１　ｍｉ中のｍｕで示す
。

表■ このデータから、心臓細胞ＣＰＫおよび血清ＣＰＫ（こ
れは主に筋肉組織から遊離した酵素を示す）は、３ヶ月
齢から１８ケ月齢までに２〜３倍に増加していることが
わかる。この増加は、リボソーム処理の９日後の心筋で
完全に回復しており、そして血清ではＣＰＸ活性が約８
倍低下していた。

実施例■の血液細胞ペレットを冷生理食塩水に再ｊ＝　
Ｓし、１１０００Ｘで５分間遠心し、リンパ球の淡黄色
のコー１〜を除去し、赤血球細胞の両分を得た。この両
分を冷生理食塩水で２度洗浄し、さらに白血球細胞と血
清混入物を除去した。次いで。

この細胞を冷生理食塩水中でゆるやかにホモジネートし
、この赤血球の細胞膜を２０，０ＯＯＸ　ｇで２０分間
遠心して上澄みから分画した。この細胞膜ペレット区分
から脂質を抽出し、全リン脂質、コレステロール、およ
びＰＣと罪を実施例Ｈに記述のように測定した。異なる
３つの動物群に対するＰＣモル／ＳＭモルで表示したＰ
Ｃ／ＳＭ比、および１μｌ　ＤＮＡ含量当りのコレステ
ロールのμモルで表示したコレステロール含量を、以下
の表■に示す。表１−１１と同様に１表■のデータ値は
６匹のラットの平均値を示す。

表■ 年齢（月）　　　５ＵＶｓ　　　ＰＣ／ＳＭ　　　Ｃｈ
ｏｌ。

これをみると、赤血球は、３ヶ月齢から１８ケ月齢の間
にＰＣ／ＳＭが約２倍低下し、そして１８ケ月齢でＰＣ
ＳＵＶ処理すると、この比はほとんど７倍に増加した。

同時にコレステロールは３ヶ月齢から１８ケ月齢の間に
約３０％増加し、そしてリボソーム処理の９日後に約２
倍低下した。

実施例■で得た赤血球ｌｌ１１胞試料の浸透圧耐性を標
準的な方法に従って測定した。簡単に言えば。

洗浄し充填された赤血球細胞約５μｌを１０本のチュー
ブに各々加えた。この一部を遠心によりペレット化し、
上澄みを除去した。このペレット化した各細胞に、１５
〜１５０ｍＭの塩濃度の冷生理食塩水３　ｍｌを１５ｍ
Ｍずつ増やしつつ加えた。このペレット化した細胞を、
加えた生理食塩水中で渦流をつ（って速やかに再懸濁し
た。損傷のない細胞を除去するべく遠心した後、この上
ずみ画分を分光光度計にかけ、遊離ヘモグロビン量を測
定した。このｔ１離率は、細胞の洗浄剤による溶解によ
って遊離した全ヘモグロビン量の画分として計算した。

各塩濃度での溶血率を表■に示す。

表■ 未処理の３ヶ月齢の動物からの細胞は、約７５ｍＭで５
０％溶解し、約６０ｍＭでほぼ完全に溶解した。未処理
の１８ケ月齢の動物からの細胞は、浸透圧耐性がより小
さく、９０ｍＭ以上の塩濃度で５０％溶血し。

７５ｍＭ以上で完全に溶血した、リボソーム処理された
１８ケ月齢の動物からの赤血球は、７５〜１５０ｍＭの
間の塩濃度で、若い動物（３ヶ月齢）とほぼ同じ浸透圧
作用を示した。より低い濃度では、このリボソーム処理
された細胞は３ヶ月齢のラットの細胞より高い浸透圧耐
性を示し、これは、この処理された細胞のＰＣ／ＳＭ比
が高い（表■）ことをおそらく反映している。

（以下余白）ス」１舛ｙ− 心臓細胞の脂質組成の変化が実際に心筋細胞で起こって
いることを確認するため、培養された再集合心筋細胞に
対するリボソーム処理の効果もまた調べた。この細胞が
解離するまで、細片化された心＋ｆａｍ織をタンパク質
分解酵素（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼ）で
分解し１次いで。

心筋細胞が再集合するまで、この細胞を数日間培養する
ことにより、培養再集合体が形成され得る（ｎａｒａｒ
ｙ）。

本研究では、心臓は以下の各年齢のオスのウィスターラ
ットから得た：３日齢の新生児；３ヶ月齢および１８ケ
月齢。次いで、各年齢群の心臓を公知方法（Ｊｏｕｒｄ
ｏｎ）に従って処理し、解離した心筋細胞懸濁液を得た
。２５ｍＡ培養フラスコにｌ　Ｑ　ｍｌの細胞懸、濁液
（約５Ｘ１０”細胞／−）を入れて、集合体が形成され
るまで１８〜２４時間、３７℃で回転振盪機にてインキ
ュベートすることにより、細胞再集合体を形成した。こ
の細胞を次にエーレンマイヤ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）
フラスコに移し、新鮮培地を加えた。各年齢群に対し、
細胞培養物の半分は処理せず、半分を実施例！のように
調製されたＰＣＳＵＶで処理した。細胞は、最終濃度約
１〜５ｍＭの脂質濃度にて、第２の培地にＳＵｖを加え
ることにより。

リボソームで処理された。この細胞を２回転振の機で３
７℃に妃　リボソーム存在下または非存在下のいずれか
でさらに４日間培養した、リボソームを含む培地を２４
時間ごとに交換した。

６日間のインキュベート期間の最後に、実施例■に記述
のように、細胞をｉめ、冷生理食塩水で数回洗浄し、そ
して冷生理食塩水中にホモジナイズした。ｒ’ｃ／ＳＭ
比およびコレステロールを測定するために、実施例■に
記述のように、この細胞ホモジネートの一部から脂質を
抽出し、その残りから実施例■に記述のようにＣＰＫ活
性およびＤＮＡ含量を調べた。その結果を以下の表■に
示す。ここでＣＰＫを１μｇ　ＤＮＡ当たりの活性ｉ１
１位で表し；１μｇ　ＤＮ八へたりのμモルでコレステ
ロールを、そしてＰＣモル／ＳＭモルでＰＣ／ＳＭ比を
表す。

表■ 年齢５ＵＶｓ　　ＣＰＫ　　Ｃｈｏｌ　ＰＣ／ＳＭこの
データから、インビボのリボソーム処理で認められる傾
向と同じような、脂質組成およびＣＰにが年齢とリボソ
ーム処理に相関する一般的傾向がわかる。ＣＰＫ活性は
、動物の年齢が増しても、リボソーム処理により著しく
減少する。３ヶ月齢がう１８ケ月齢の間に起こるコレス
テロールの約２倍の増加は、３ヶ月齢から１８ケ月齢の
間に起こるＰＣ／ＳＭが約２分の１に低下することと同
様に、リボソーム処理により事実上回復した。

■ 動物が密閉した部屋にいると２部屋の中の空気中の酸素
がしだいに呼吸により吐き出された二酸化炭素にかわり
、動物が漸進的に呼吸ストレス下におかれ、脈拍および
呼吸割合が上がり、血液中のｐＨが上昇し、血圧が下が
る。動物がこのようなストレスに耐え得る（正の血圧を
維持できる）時間は、動物の呼吸ストレス耐性を測定す
る１つの標阜的な方法である。当然のことながら、この
試験では若い動物はど一般的にストレス耐性が大きい。

本実施例では、１５〜１８ケ月齢の３匹のオスのサブラ
ラソ；−を、実施例Ｈの手順、即ち６日間に３回の注射
に従って、　ｐｃ　ｓｕｖで処理した。同齢の他の３匹
のラットには同量の滅菌生理食塩水を注射した。最初の
注射の９日後に、密閉した６００ｄの室でこの動物の呼
吸機能を調べた。この動物に麻酔をかけ、ポンプを使っ
て１分間に１５回“強制”呼吸をさせた。試験中に動物
の血圧（１木の外肢の）、心電図（ＥＣＧ）を追跡し、
血中酸素レベルおよび二酸化炭素レベル、　ＣＰＫレヘ
レベおよヒｐＨノ分析のために、動脈の血液試料を５分
ごとに採取した。動物の血圧が０になると実験をやめ１
通常の空気で呼吸させた。

未処理の動物の血圧が０になるのに要する平均時間は、
約３５〜４５分間であった。処理した動物の平均耐久性
は約５５〜６５分であった。それゆえ、リボソーム処理
により、酸素の減少や二酸化炭素の蓄積による呼吸スト
レスに耐える動物の能力が約５０〜６０％高められた。

未処理の動物は、約２５分間にわたって基礎となる血中
ｃＰＫレベルを維持した後、試験終了まで酸素活性が急
激に増加した。処理された動物では、血中ＣＰＫは最初
の４０〜４５分間実質的に変化しなかった。その後、血
中ＣＰＫは未処理動物の血中ＣＩ”Ｋの約１０分の１の
割合で、残りの試験期間にわたって徐々に増加した。

試験期間の関数として、血中の酸素レベル、二酸化炭素
レベル、およびｐｌ＋のレベルは２両動物群では同しで
あり、このことは、処理動物で見られた呼吸ストレス耐
性の増加が血中の酵素レベル。

二酸化炭素レベルの違いによるものではなかったことを
示す。

この研究では、動物の寿命に対するリボソーム処理の効
果を調べる。試験したラットは３０ケ月跡のオスのスプ
ラギューーダウレイラソトであった。

スプラギューーダウレイラソトは通常約２４〜３０ケ月
齢で死ぬので、このラットはすでに寿命に達している。

６匹のラットの試験群のそれぞれに、実施例１のように
調製したｐｃ　ｓｕｖをリボソーム脂質０．５〜１ｇの
用量で静脈末端から注射し、１週間後に同様に投与し、
それ以後実験動物が自然死するまで２ケ月ごとに与えた
。この処理期間中、実験動物に任意にえさを与え、動物
の召集を避けるために１通常の予防措置をおこなった。

同齢のオスのラットの第２対照群に同じ投与計画で同様
にして滅菌生理食塩水を注射した。

この対照群の６匹の動物のうち、２匹は３２ケ月（処理
を始めて２ケ月）で死亡、３匹は３４ケ月。

そして１匹は４０ケ月で死に、平均寿命は約３４ケ月で
あった。この処理ラットのうち、２匹は４４ケ月。

１匹は４５ケ月、そして３匹は４８ケ月で死に、平均寿
命は４６ケ月であった。

オスのラットの生殖機能は年とともに減退することが知
られている。もし３０ケ月齢かそれ以上の年齢のオスと
若くて繁殖力のあるメスとを一緒に飼育するならば、同
じメスが比較的若いラットと一緒に飼育されたときより
も、生まれてくる子の数も子を生むメスの数も、少ない
。

生殖機能に対するリボソーム処理の効果を調べるために
、３４〜３６ケ月齢の各１０匹のラット群を。

実施例■に記述の卵ｐｃ　ｓｕｖで処理した。対照群は
同じように滅菌生理食塩水で処理した。この最初の注射
から９日後に、この動物を５〜６ケ月齢のメスのスプラ
ギューーダウレイラット３匹とかごの中に入れた。オス
１匹とメス３匹とを１週間。

３週間、または約７週間にわたって一緒に飼育した。１
週間で未処理のオスと接触した３匹のメスのうち約１匹
だけが子をつくった。７週間後、この割合は、未処理の
オスと接触した３匹のメスのうち約２匹に増加した。い
ずれの場合でも、子の数は１０匹に達しなかった。処理
したオスでは、１週間の接触で３匹のメスのうち約２匹
が子をつくり、実際には、３週間の接触ですべてのメス
が子をつくった。子の数は通常１０−１４匹であった。

本発明の種々の実施態様をここに記述するものの１本発
明からはずれることなく、様々な変更や修正がなされ得
ることは明らかである。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、心筋細胞膜の脂質組成および動物の呼吸ストレスに
対する抵抗能における年齢に関する変化を回復させるた
めに相対的に老齢の個体を処理する方法であって、該方
法は、心臓組織に見い出されるよりも実質的に多い量のホスフ
ァチジルコリンと実質的に少ない量のスフィンゴミエリ
ンとを含むリボソーム懸濁液を供給する工程、および該懸濁液を少なくとも数日間にわたり、該処理動物の血
清クレアチンホスホキナーゼのレベルを実質的に低下さ
せるのに効果的な量で投与する工程を包含する、相対的に老齢の個体の処理方法。２、前記リボソームが、少なくとも約７５％精製の卵ホ
スファチジルコリンまたはその成分から構成される特許
請求の範囲第１項に記載の方法。３、前記リボソームが、主として０．０２〜０．０８ミ
クロンのサイズの範囲の単層小胞である特許請求の範囲
第１項に記載の方法。４、前記リボソームが、少なくとも約７５％精製の卵ホ
スファチジルコリンを含有し、そして実質的にスフィン
ゴミエリンを含まない特許請求の範囲第３項に記載の方
法。５、心筋細胞のコレステロールレベルを実質的に低下さ
せる特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、該方
法においては、前記リボソームが約１０モル％を下まわ
る割合でコレステロールを含有する。６、該リボソームが、２回またはそれ以上の回数で少な
くとも約２日間隔で、そして１日当り体重１ｋｇに対し
約０．１〜１グラムの脂質に相当する量で投与される特
許請求の範囲第１項に記載の方法。７、前記投与が。１日当り体重１ｋｇに対し約０．００１〜１グラムの間
に相当する量でリボソームの非経口投与を行う工程、リボソーム投与後、血清クレアチンホスホキナーゼの変
化の試験する工程、および該投与および試験段階を該血清クレアチンホスホキナー
ゼレベルが少なくとも約５０％だけ低下するまで繰り返
す工程、を包含する特許請求の範囲第６項に記載の方法。８、寿命をのばすために相対的に老齢の個体を処理する
方法であって、該方法は、該個体の心臓組織に見られるよりも実質的に多い量のホ
スファチジルコリンおよび実質的に少ない量のスフィン
ゴミエリンを含有するリボソーム組成物の懸濁液を供給
する工程。該懸濁液を少なくとも数日間にわたり、該処理動物の血
清クレアチンホスホキナーゼのレベルを実質的に低下さ
せる量で投与する工程、および該投与工程を、血清ＣＰ
Ｋを実質的に低下したレベルに維持するのに効果的な間
隔で反復する工程、を包含する相対的に老齢の個体を処
理する方法。９、前記リボソームが、少なくとも約７５モル％精製の
卵ホスファチジルコリンまたはその成分から成り、そし
て約２０モル％を下まわるコレステロールを含有する特
許請求の範囲第８項に記載の方法。１０、育種動物のオスの生殖能力を増大させる方法であ
って、該方法は、ほぼ同年齢の動物の心臓組織に見られるより実質的に多
い量のホスファチジルコリンと実質的に少ない量のスフ
ィンゴミエリンとを含有するリボソーム懸濁液を供給す
る工程、および該懸濁液を少なくとも数日間にわたり、該処理動物の血
清クレアチンホスホキナーゼのレベルを実質的に低下さ
せるのに効果的な量で該動物へ投与する工程、を包含する生殖能力増大法。