DE2650502C3 - Herstellung von Liposomen welche Arzneistoffe enthalten - Google Patents

Description

Liposome sind kleinste Fetttröpfchen mit wäßrigen oder lipophoben Lösungen in ihrem Zentrum, denen Arzneistoffe zugesetzt sein können. Mittels ihres Lipoidmantels können die Liposome durch die Zeliwand dringen und ihr Inhalt intrazellulär wirksam werden. Bisher wurden Liposome in wäßrigen Suspensionen intravenös als Träger für Chelatbildner, zytotoxische, zytolytische und zytostatische Substanzen und auch für Enzyme und Eiweißlösungen verwendet Sie wurden jedoch bisher auch für den Transport von Nukleinsäuren und deren Untereinheiten gebraucht VergL beispielsweise TIBS, Sept 1976, S. 203 ff und FEBS Letters, Febr. 1976. Der Nachteil der Applikation von Liposomen war bisher hauptsächlich darin zu sehen, daß der Transport im Organismus völlig unspezifisch verläuft und die Arzneistoffe nur unvollständig an die Zielorgane gelangten. Dieser wird jedoch überraschender Weise durch die Bereitstellung des im Anspruch bezeichneten Verfahrens beseitigt Vorliegendes Verfahren ermöglicht es aber auch, die Liposome als Vehikel zu bestimmten Targetzellen, z. B. Organzellen oder Tumorzellen, zu verwenden. Dabei wird die äußere Schicht der Lipoidmembran der Liposome durch adsorptive oder kovalente Bindung mit Molekülen besetzt, die einen selektiven Tropismus zu den entsprechenden Faktoren der Zellmembran der Targetzellen besitzen. Im Prinzip wird hier also eine Art Trägerreaktion, wie sie in der immunologischen Diagnostik angewandt wird, für den gezielten Arzneimitteltransport verwendet, wobei die Liposome als Trägerpartikel dienen, die die Arzneimittellösungen und Nukleinsäuren transportieren, ähnlich wie dies unter pathologischem Vorzeichen durch Viren, Phagen und Plasmiden geschieht. Im Gegensatz dazu werden hier jedoch Stoffe mit erwünschten und bekannten biologischen Eigenschaften verwendet.

Der Tropismus zu Targetzellen wird erreicht, indem man bei der Herstellung der Liposome in die Lipoidphase lipophile Moleküle mit einem entsprechenden Zelltropismus einbringt, oder aber in dem die fertigen Liposome in ähnlicher Weise wie die bei Trägerreaktionen in der Immunologie verwendeten Träger mit geeigneten Molekülen durch adsorptive oder kovalente Bindung gekuppelt werden (vergi. Allgemeine und Experimentelle Immunologie und Immunpathologie: Carl STEFFEN: Georg Thieffie Verlag Stuttgart S. 599 u.f.). Es können dazu Immunglobuline gegen Membranbestandteile der Targetzellen, wie auch Faktoren aus Zeil- und Gewebeextrakten bzw. aus daraus isolierten Zellmembranen und deren molekularen Untereinheiten, die den Targetzellen entsprechen, verwendet werden.

Die Herstellung der Liposome erfolgt nach bekann

ten Verfahren: HEYDON und TAYLOR: J. THEORET Biol.4, 281 (1963); MUELLER, RU-DIN, TITIEN, WESTCOTT: Nature 194, 979 (1962); GREGORIADIS: FEBS Letters 36,3 (1973), BANGHAM: Progr. Biophys. Mol. Biol. 18,19 (1968) und RAHMAN; ROSENTHAL u. CERNY: Science 180, 300 (1973); ]. Lab.KIin.Med. 83, 640 (1974); Procedings of the Society for experimental biology and Medicine 146,1173-1176 (1974).

An die Liposomenmembran adsorbieren sich direkt ohne Bindeglied natürlich vorkommende Lipopolysaccharide. Polysaccharide werden auf synthetischem Wege vorher mit einer begrenzten Anzahl von Fettsäureresten substituiert Bei anderen Stoffen kann die Bindung adsorptiv mit Tannin (Boyden-Technik), kovalent mit bisdiazotiertem Benzidin bzw. durch direkte Kupplung von diazotierbaren Molekülen, wie auch durch noch nicht näher untersuchte Bindungen, die über einen Lipidrest gebildet werden, erfolgen. Auch andere bekannte Methoden, wie sie bei der Konjugation von Antigenen und Haptenen verwendet werden, sind möglich.

Die jeweils optimale Methode ist sowohl von der Art der Liposomemembran wie auch von der jeweils anzukuppelnden Substanz abhängig.

Zur Erleichterung der Erkennung und der Endozytose der Liposome können auch Enzyme an die Liposomenmembran gebunden werden, wie z. B. Neuraminidase.
Der Tropismus der Immunglobuline beruht auf einer Antigen-Antikörperreaktion, während der Tropismus von Molekülen denjenigen der Membranmoleküle der Targetzellen entsprechen und den daraus gewonnenen Untereinheiten auf Stereospezifität beruht die eine Erkennung bzw. Aggregation ermöglicht.

J5 Die Gewinnung von molekularen Untereinheiten von Makromolekülen, wie Proteinen, Proteiden, Polysacchariden, Lipopolysacchariden und Lipiden kann enzymatisch oder nach einem Verfahren zum gesteuerten chemischen Aufschluß von biologischen Geweben für therapeutische Zwecke erfolgen, vergl. beispielsweise DE-OS 10 90 821.

Beispiel 1 Es sollen Liposome mit inkorporierten Nukleinsäuren

■t5 aus gesunden homologen Geweben von nicht krebskranken Spendern und einem Tropismus zu den Zellen eines bestimmten malignen Tumors gewonnen werden. Dabei werden zunächst nach bekannten Verfahren die Nukleinsäuren isoliert und mit Phospholipiden zu Liposomen verarbeitet. Vorher werdeh aus dem durch Exzission gewonnenen Präparat der Krebsgeschwulst des zu behandelnden Patienten nach bekannten immunologischen und biochemischen Verfahren tumorassozierte Membran-Antigene isoliert. Die Markierung

v-, der Liposome erfolgt nun durch Kombination der natürlichen Adsorption mit der kovalenten Bindung mittels bisdiazotierten Benzidin, wobei zunächst ein Teil der Tumorantigene diazotiert und dann mit den Liposomen konjugiert werden. Danach werden die so

f>o vorbehandelten Liposome gewaschen und der andere Teil der Tumorantigene als wäßrige Lösung in 8 mM CaCb zur Injektion zugesetzt.

Sofern es möglich ist aus den Tumorantigenen Lipopolysaccharide oder Polysaccharide zu isolieren, können diese künstlich mit Fettsäureresten substituiert werden, bevor man sie mit den Liposomen inkubiert. Tumorspezifische Lipide können zusammen mit den Phospholipiden, aus denen die Liposome hergestellt

werden, zu Liposomen verarbeitet werden, ebenso auch andere lipophile Moleküle. Bei der Markierung der Liposome kann auch Neuraminidase mitverwendet werden.

Um die Liposome für verschiedene Tumorarten wirksam zu machen, können auch Mischungen von Membranstoffen aus verschiedenen Tumorarten Verwendung finden. Anstatt der Nukleinsäuren können proteolytische Fermente oder zytotoxische bzw. zytostatisch wirkende Substanzen in die Liposome einkorporiert werden.

Beispiel 2

Es sollen Liposome mit einem Tropismus zu Tumorzellen wie im Beispiel 1 hergestellt werden. Dabei werden Immunglobuline gegen tumorassozierte

Membranantigene und bzw. oder entsprechende Fraktionen eines Extraktes aus T-Lymphozyten, die gegen Tumorzellen sensibilisiert sind (Killerzellen) an die Liposomenmembran angekoppelt.

Beispiel 3

Es sollen Liposome zur Behandlung von Herzmuskelerkrankungcn gewonnen werden. Dabei werden Herzmuskelextrakte die nach dem im Patentanspr .ich beschriebenen Verfahren der wasserfreien Vakuum-Säuredampflyse bei Normaltemperatur gewonnen wurden, zu Liposomen verarbeitet Die Oberflächenmembran wird durch Immunglobuline, die gegen Herzmuskelzellen gerichtet sind, oder aber mit den organspezifischen Faktoren aus dem verwendeten Herzmuskelextrakt wie beschrieben markiert.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Herstellung von Liposomen, welche Arzneistoffe enthalten, mit Zeiltropismus und verbesserter Permeabilität bei der Applikation, gekennzeichnet durch die kovalente oder adsorptive Ankopplung von Enzymen, sowie von zellspezifischen Immunglobulinen oder von spezifischen Faktoren, die den Targetzellen entsprechen, aus Zeil- und Gewebeextrakten bzw. daraus isolierten Membranen an die Liposomenmembran.