DE2907303A1 - Verfahren zur einkapselung biologisch aktiver substanzen - Google Patents
Verfahren zur einkapselung biologisch aktiver substanzenInfo
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Description
DR. ING. HANS LICHTI · CII'L.-IMG. HEINER LtCHTI
DIPL.-PHYS. DR. KLAUS LEUTWEIN 2907303
PATENTANWÄLTE
D-7500 KARLSRUHE 41 ICRÖTZINGEN) · DURLACHER STR. 31 (HOCHHAUS)
TELEFON (0721) 48511 · TELEX 7825986 LIPA D
Demetrios P. Papahadjopoulos 4840/79 Lw
3170 Condit Street
Lafayette, Kalifornien 74549 23. Februar 1979
Francis C. Szoka
375 Leroy Avenue
Buffalo, New York
375 Leroy Avenue
Buffalo, New York
Verfahren zur Einkapselung biologisch aktiver Substanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkapselung biologisch aktiver
Substanzen in synthetischen oligolamellaren Lipidbläschen (sog. Liposomen).
Zur Herstellung synthetischer, biologisch aktive Substanzen einkapselnder
Liposome sind verschiedene Verfahren bekannt. So kennt man beispielsweise (vgl. Robinson in: Trans.Faraday Soc. 5_6 : 1260 bis 1264 (1960);
Papahadjopoulos et al. in: Biochim. Biophys. Acta, 135, 639 (1967)).
Ein Verfahren zur Herstellung von Phospholipid-Dispersionen aus einem Äther-Lipid-Wasser-Zweiphasensystem, wobei der Äther dadurch verdampft
wird, daß Stickstoffblasen in die Mischung eingeleitet werden. Dabei ist jedoch nicht versucht worden, dieses be karrte Verfahren zum Einschluß
organischer Substanzen zu verwenden und die Einschlußwirksamkeit ist
nicht im einzelnen untersucht worden. Ferner ist eine ähnliche Verdampfungstechnik
unter Anwendung eines Chloroform-Wasser-Zweiphasensystems (vgl. Chowhan et al. in: Biochim. Biophys. Acta, 266: 320 bis 342 (1972))
Dieses bekannte Verfahren beruht gleichfalls auf der Anwendung der wässr i-
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gen Phase im Überschuß und der langsamen Entfernung der Chloroform-Phase,
um eine gleichförmige Verteilung von Phospholipid-Bläschen
zu erreichen. Versuche, den Einschluß wässrigen Materials zu optimieren,
und Untersuchungen über die Einschlußwirksamkeit dieses Verfahrens sind gleichfalls nicht bekannt geworden.
Weiter sind multilamellare Lipid-Bläschen bekannt geworden (vgl.
Bangham et al. in: J. Mol.Biol., Ϊ3: 238 bis 252 (1965)), die durch
kleines Einschlußvolumen, geringe Einschlußwirksamkeit (von ca. 10 %)
und einem umschlossenen wässrigen Raum (15 bis 35 A) gekennzeichnet
sind.
Bekannt sind weiter (vgl. Biochim. Biophys. Acta, 135: 624 bis 638
(1967)) unilamellare Bläschen, die durch Ultraschalleinwirkung hergestellt
werden. Diese haben sehr kleine Einschlußwirksamkeiten und sind
wegen ihres geringen für die wässrige Phase verfügbaren Volumens zur Einkapselung großer Makromoleküle nicht geeignet.
Weiter sind Lipid-Bläschen beschrieben worden, die hergestellt wurden
durch Injektion der Lipide in einer organischen Phase in eine wässrige Lösung, und zwar unter Verwendung von Äthanol (vgl. Batzri und Korn
in: Biochim. Biophys. Acta, 298: 1015 (1973)) und unter Verwendung von Äther (vgl. Deamer und Bangham in: Biochim. Biophys. Acta, 443:
629 bis 634 (1976)). Nach diesen Verfahren werden zwar unilamellare oder pauci lamellare Bläschen erhalten, jedoch ergeben si ch keine befriedigenden
Einschlußwirksamkeiten. Im Falle der Äthanol-Injektion ist
di ese geringe Wirksamkeit zurückzuführen auf das große Wasser-Volumen,
in dem das Äthanol dispergiert ist sowie auf die geringe Größe der nach diesem Verfahren erzeugten Bläschen. Im Fall der Äther-Injektionstechnik
ist die geringe Wirksamkeit Folge des Zusammenwirkens des grossen
Wasser-Volumens, in das der Äther injiziert wird, der geringen, dabei
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angewandten Li pidmengen und der Art, in der die Bläschen gebildet
werden.
Eine Herstellung von großen uni lamellar en Bläschen ist weiter beschrieben
worden (vgl. Papahadjopoulos et al. in: Biochim. Biophys. Acta, 394: 483 bis 491 (1975)), wobei eine besondere, kalcium-induzierte
Strukturänderung in den Li pid-Bläschen stattfindet, aber diese Technik
ist beschränkt auf ein einziges Phospholipid (Phosphat idyl serine) und
hat außerdem gleichfalls eine verhältnismäßig geringe Einkapselungswirksamkeit
in Folge der dabei angewandten Rekonstitutionsmethode der Bläschen.
Weiter kennt man (vgl. DE-PS 25 32 317) ein Verfahren zur Herstellung
von Li pid-B laschen, wonach eine Lipid-Wasser-Äther-Emulsion in eine
wässrige Phase zentrifugiert wird. Nachteil dieser Technik ist, daß bei hohen Geschwindigkeiten zentrifugiert werden muß und ein großer Anteil
der Li pi d-Wasser- Emulsion an der Grenzfläche eingefangen wird und nicht
in die wässrige Phase eingeht. Das reduziert den Anteil der Substanz-Einschließung.
Es ist weiter bekannt (vgl. US-PS 38 04 776) in Öl bzw. Fett eingekapselte
Aminosäuren oder Polypeptide durch Dispersion des entsprechenden einzukapselnden Materials in eine geschmolzene M ischung des Fetts bzw.
Öls herzustellen, wobei anschließend die geschmolzene Mischung in Wasser
abgegossen wird. Dabei ist das eingekapselte Material im Inneren von
verhältnismäßig großen Lipid-Tröpfchen enthalten, wodurch die Anwendung
auf orale Verabreichung beschränkt wird. Einschränkungen dieser Methode
ergeben sich dadurch, daß sie sich ersichtlich nur zur Einkapselung von pulverförmigen Substanzen eignet und das Lipid keine Doppelschicht bildet.
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Als bekannt ist schließlich zu erwähnen (vgl. US-PS 40 16 100) die
Einschließung gewisser Pharmaceutika in üpid-Bläschen durch Gefrieren
der wässrigen Phospholipid-Dispersion des Pharmaceutikums und des Lipids. Die pharmaceutisehen Verbindungen, die zusammen
mit der Einkapselung nach dieser Methode erwähnt werden, zeigen im allgemeinen einen hohen Verteilungskoeffizienten in eine organische
Phase aus Wasser. Es könnte daher erwartet werden, daß das einzukapselnde
Material in die Phospholipi d-Doppel schichten der hergestellten
Bläschen eindringen würde. Theoretisch würde dies zu einem hohen Einkapselungsgrad
führen, ungelöst bleibt dabei aber die Frage der biologischen Verfügbarkeit des gesamten eingekapselten Materials. Es ist
außerdem zu befürchten, daß verhältnismäßig hohe Einkapselungsraten
sich nicht erreichen lassen, wenn eine derartige Technik angewandt wird zur Einkapselung von Pharmaceutika mit stärker polarem Charakter, für
die Öie Wahrscheinlichkeit des Eindringens in die B laschen-Doppel schicht
geringer ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs beschriebenen
Gattung anzugeben, nach dem oiigolamellare Li pid-B laschen
(synthetische Liposome) schnell, bequem und unter schonenden Bedingungen
mit guter Ausbeute hergestellt werden können. Insbesondere wird
dabei angestrebt, daß ein großer Anteil aus einer breiten Vielfalt biologisch
aktiver Substanzen sich erfassen läßt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Lösung des
Llpid in einem organischen LösiJigsmittel und eine wässrige Zubereitung
der einzukapselnden Substanz gemischt werden, daß die Mischung imulgierl
wird, daß das organische Lösungsmittel entfernt und das dabei entstehende
Gel in Wasser suspendiert wird. Erfindungsgemäß wird damit
zunächst eine Mischung aus einerseits einer Bläschenwandungen bilden-
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den Verbindung in einem organischen Lösungsmittel und andererseits
eine wässrige Mischung des einzukapselnden biologisch aktiven Materials gebildet. Das Verhältnis der organischen zur wässrigen Phase
wird dabei so eingestellt, daß eine Emulsion des Wasser-in-Öl-Typs
entsteht. Aus dieser Mischung wird eine homogene Emulsion gebildet,
beispielsweise durch Ultraschalleinwirkung. Aus dieser Emulsion wird
das organische Lösungsmittel entfernt, wobei eine Mischung resultiert, die einen gelartigen Charakter aufweist. Diese gel artige Mischung wird
schließlich in synthetische, oligolamellare Bläschen umgewandelt, in
denen die biologisch aktive Substanz eingekapselt ist. Gegenstand der Erfindung ist zugleich das als Zwischenstufe entstehende gelartige Material.
Ferner richtet die Erfindung sich auch auf die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen synthetischen Li pid-B laschen, deren Anwendung
sowie auf Trägerzusammensetzungen, die die synthetischen Bläschen als wirksame Komponente enthalten.
Der Ausdruck "biologisch aktive Substanz", wie er im Rahmen der Erfindung
benutzt wird, bezeichnet Verbindungen bzw. Zusammensetzungen, die mit lebenden Zellen und Organismen reagieren bzw. diese beeinflussen,
wenn sie in entsprechender, wirksamer Konzentration anwesend sind.
Der Ausdruck "synthetische, öl igolamellare Li pid-B laschen (Liposome)",
wie er im Rahmen der Erfindung gebraucht wird, bedeutet künstlich im
Labor erzeugte Lipid-Blaschen, die unter anderem dadurch gekennzeichnet
sind, daß di e Bläschenwandungen durch wenige oder nur eine die molekulare
Li pid-Schichten aufgebaut sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, synthetische, oligolamellare
oder unilamellare Li pid-B laschen herzustellen, die ihrerseits in einer großen
Vielzahl von Prozessen eingesetzt werden können. Beispielsweise können
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erfindungsgemäß hergestellte Li pid-B laschen verwendet werden, um
die biologische Verfugbarkeit von Medikationen zu erhöhen, oder um
Enzymzufuhr, orale oder topische Drogengaben zu verstärken. Ferner eignen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Li pid-B laschen
sich auch zur Einkapselung von kosmetischen Präparat ionen, Pestiziden oder Verbindungen, die verzögert freigesetzt werden sollen
urn das Wachstum von Pflanzen od„ dgl. zu beeinflussen.
Als Substanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt
werden können, seien beispielsweise genannt pharmaceutisch wirksame
Verbindungen und Zusammensetzungen aus diesen, Carbohydrate, Nukleotide, Polynukleotide (beide sowohl natürlich auftretend als auch
synthetisch), Pestizide (einschließlich Fungiziden, Insektiziden, Mitiziden,
Nematoziden und Mollusiziden) , wasserlösliche Düngemittel und
landwirtschaftliche Nährstoffe, Peptides Proteine, Enzyme, Viren usw.
Viele dieser Materialien dringen normalerweise nicht in die Plamamembran
von Zellen ein und können daher im Kreislauf in einem lebenden Organismus oder durch Kontakt mit Geweben und Organkulturen inaktiviert
werden. Im Falle von Pestiziden und landwirtschaftlichen Nährstoffen
oder Düngemitteln können diese aus dem Anwendungsgebiet durch Regen oder Bewässerung abgeführt werden. Die Einkapselung derartiger
Substanzen schützt diese vor Inaktivierung oder Abfuhr,, d.h.
erhält deren biologische Verfügbarkeit« Es können auch Bakterienzeülen
wie beispielsweise C.parvum und E.coli od dgl. zwecks Schutz oder
biologischer Verfügbarkeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt werden« Wie bereits erwähnt8 läßt das erfindungsgemäße Verfahren
sich auch für die Einkapselung kosmetischer Präparationen anwenden, die vorzugsweise in der in US-PS 39 57 971 beschriebenen Weise angewandt
werden können.
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Nachfolgend werden im einzelnen zu bevorzugende Ausführungsformen
der Erfindung beschrieben.
In einem allgemeinen Sinn läßt sich sagen, daß das erfindungsgemäße
Verfahren zunächst die Bildung von "invertierten Micellen" in einer organischen Phase und die anschließende Entfernung der organischen
Phase vorsieht. Das System kehrt dann spontan zur einer doppelschichtartigen
Struktur zurück, wobei ein großer Anteil der wässrigen Phase in große oligolamel lare Bläschen eingekapselt wird. Der Vorteil dieses
Verfahrens besteht darin, daß eine hohe Einschlußwirksamkeit der wässrigen Phase erreicht und große, stabile Bläschen erhalten werden. Phospholipide
sind als Moleküle für di e Bildung der "invertierten Micellen" und anschließend der Doppelschicht der Bläschen hervorragend geeignet.
Im einzelnen kann das erfindungsgemäße Verfahren in der im Folgenden
beschriebenen Weise ausgeführt werden.
Der erste Schritt besteht darin, einerseits eine Mischung einer Wandungen
von Li pid-B laschen bildenden Zusammensetzung in einem organischen
Lösungsmittel und andererseits eine wässrige Mischung des in den Bläschen einzukapselnden biologisch aktiven Materials herzustellen.
Bläschenwandungen formende Verbindungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
sind allgemein bekannt. Beispielsweise kann eine beliebige Anzahl von Phospholipiden oder Lipid-Verbindungen für die Bildung der Bläschenwandungen
verwendet werden. Beispiel sweise seien als soche Verbindungen angegeben: Phosphat!dylcholin (PC), sowohl natürlich auftreten
als auch synthetisch hergestellt; Phosphatidsäure (PA), Lysophosphatidylcholin,
Phosphat idyl serin (PF), Phosphatidyläthanolamin (PE), Sphingolipde, Phosphatidylglycerol (PG), Sphingomyelin, Kardiolipin,
Glycolipide, Ganglioside, Cerebroside und dgl., jeweils einzeln oder in Mischung wie beispielsweise in Sojabohnen-Phospholipiden (Asolectin,
assoziierte Konzentrate). Zusätzlich können mit den Phospholipid-Komponenten
andere Lipide gemischt werden wie beispielsweise Steroide,Chole-
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sterol, aUphatisehe Amine wie langkettige aliphatische Amine und
Karboxylsäuren, langkettige Sulfate und Phosphate, D icety I phosphat,
butyliertes Hydroxytoluol, Tocophenol, Re-tinol, und Isopren-Verbindungen,
um den Bläschen gewisse wün-echenswerte und bekannte Eigenschaften
zu verleihen. Zu den oben erwähnten Phospholipiden können zusätzlich
synthetische Phospholipide substituiert oder zugemischt und in dem erfindungsgemäßen Verfahen eingesetzt werden, die entweder alterierte
aliphatische Anteile wie Hydroxylgruppen, verzweigte Karbonketten,
Zycloderivate, aromatische Derivate, Äther, Amide, mehrfachungesättigte
Derivate, halogenierte Derivate enthalten oder alterierte hydrophile Anteile,
di e Carbohydrat, Glycol, Phosphat, Phosphonat, quaternäre Amine, Sulfate,
Sulfonate, Karboxylamine, Sulfhydryl, ImidazoIgruppen und Kombinationen
solcher Gruppen enthalten.
Aus Vorstehendem ist zu ersehen, daß die chemische Zusammensetzung
der Li ρ id-Komponenten der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Bläschen beträchtlich variiert werden kann, ohne nennenswerte Verringerung des eingeschlossenen Anteils, obwohl die Größe der Bläschen
durch die Lipid-Zusammensetzung beeinflußbar ist. Eine besonders vorteilhafte
Mischung, die für die im Rahmen der Erfindung vorzugsweise zu verwendenden Li pid-Mischungen repräsentativ ist, ist zusammengesetzt
aus PS und PC5 oder PG und PC wie vorstehend angegeben, und zwar in
jedem Fall vorzugsweise mit einem Molverhältnis 1 : 4. Die Komponenten PC, PG, PA und PG können aus gereinigtem Eigelbhergestellt werden.
Gesättigtes synthetisches PC und PG, wie Dipalmitoyl sind gleichfalls
verwendbar. Andere amphipaihische Lipide, die verwendet werden können,
vorzugsweise gleichfalls mit PC in einem Molverhältnis von 1 : 4S sind
Gangliosides Globoside, Fettsäuren, Stearyiamme, langkettige Alkohole
und dgl.
Die die Wandung der Liposome bildende Zusammensetzung kann anfänglich
in irgendeinem inerten Lösungsmittel bereitgestellt werden, das, falls er-
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forderlich, aus der Lipid- oder Phosphoiipid-Verbindung entfernt werden
kann. Geeignete, derartige Lösungsmittel sind eine große Vielfalt von Äthern, Estern, Kohlenwasserstoffen (aromatisch sowie aliphatisch,
einschließlich Fluorkohlenwasserstoffen), und Silikone, in denen eine
wässerige Phase keine nennenswerte Löslichkeit aufweist. Die Lösungsmittel können sowohl allein als auch in M ischung verwendet werden.
Für jedes Lösungsmittel bzw. jede Mischung von Lösungsmitteln ist jedoch das optimale Verhältnis von Lipid, Wassermenge und Lösungsmittel
unterschiedlich und muß für den Fall durch entsprechende Versuche bestimmt
werden, was für einen Fachmann keine Schwierigkeiten bereitet. Der Ausdruck "inertes Lösungsmittel" bezeichnet im Rahmen der Erfindung
ein Lösungsmittel für das Lipid bzw. Phospholipid, das die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nachteilig beeinflußt oder mit diesem in sonstiger Weise interferiert.
Das Phospholipid bzw. Lipid sowie alle evtl. lipidlöslichen Zusätze
werden vorzugsweise aus ihrem Lösungsmittel verdampft auf die Wandungen
eines geeigneten Reaktionsgefäßes. Die organische Phase, in der die "Bläschen durch Verdampfung in umgekehrter Phase" ("reversed phase
ev-oiporation vesicles") gemäß der Erfindung gebildet werden, wird anschließend
in das Gefäß eingebracht, d.h. ein in^ertes organisches Lösungsmittel
für die Lipide und Phospholipide, wie oben beschrieben. Unter Durchmischung erfolgt die Auflösung der zuvor auf den Gefäßwänden
niedergeschlagenen Lipidkomponente der herzustel lenden Bläschen. Für die Bildung der organischen Phase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind einige inerte organische Lösungsmittel vorzugsweise zu verwenden, je nach dem welche Bedingungen bei der angewandten Methode
jeweils herrschen. Bei niederen Temperaturen, d.h. wenn die anschließende
Entfernung der organischen Phase bei verhältnismäßig tiefen Temperaturen
erfolgt, erweist sich Diäthyläther als besonders vorteilhaft, obwohl auch
Chloroform oder Tetrahydrofuran gleichfalls gut geeignet sind. Beim Arbeiten bei höheren Temperaturen empfiehlt sich Isopropylather als inertes
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organisches Lösungsmittel, insbesondere wenn die Lipid-Blaschen
gesättige Phospholipide als Lipid-Komponente enthalten. Im Anschluß
an die Auflösung des Phospholipids oder Lipids zur Bildung der organischen
Phase, wird eine wässrige Phase zugegeben, um eine heterogene Zweiphasenmischung zu erhalten. Die wässrige Phase enthält in Lösung
bzw. Suspension die Verbindungen bzw. Zusammensetzungen, di e in den erfindungsgemäß hergestellten synthetischen Li pid-B laschen
eingekapselt werden sollen. Vorzugsweise wird die wässrige Phase durch Pufferung auf einen pH-Wert gebracht, bei dem das einzukapselnde Material
stabil ist. Die lonenstärke der wässrigen Phase ist von Bedeutung für die Einkapselungswirksamkeit, die erfindungsgemäß erreicht wird.
Als allgemeine Regel gilt, daß der Einschließungsanteil umso niedriger
ist, je höher die lonenstärke der wässrigen Phase ist. Beispielsweise lassen sich in Gegenwart von 15 mM Natriumchlorid ca. 60 % der wässrigen
Phase einkapseln, währer/in Gegenwart von 500 mM Natriumchlorid
nur ca. 20 % der wässrigen Phase eingekapselt werden können. Folglich empfiehlt sich die Anwendung eines Puffers von niedriger lonenstärke
(weniger als 0,3), um die Einkapselung von Makromolekülen zu maximieren.
Die Einschluß Wirksamkeit hängt auch zu einem gewissen Grad
von der Konzentration der in dem Zweiphasensystern gegenwärtigen Lipide
oder Phospholipide ab. Vorzugsweise liegt der Anteil der Lipid- oder Phospholipidkomponente
in einem Bereich von ungefährt 0,5 mg bis ungefähr 50 mg je ml des inerten organischen Lösungsmittels. Vorzugsweise liegt
das Volumenverhältnis der organischen Phase zur wässrigen Phase in einem Bereich von ungefähr 2 : 1 bis ungefähr 20 : 1, vorzugsweise ungefähr
4:1, um eine Wasser-in-ÖI-Emulsion zu bilden.
Die heterogene Zweiphasenmischung, die in der beschriebenen Weise erhalten
wird, wird anschließend emulgiert, um eine Emulsion des Typs zu erhalten, wie er etwa durch Ultraschallbestrahlung hervorgebracht wird.
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Vorzugsweise wird dies mit Hilfe einer badartigen Beschallungseinrichtung
durchgeführt, bzw. bei Präparationen großer Mengen in Emulgatoren
von industrieller Größe. Im allgemeinen wird die Zweiphasenmischung
für ungefähr drei bis fünf M inuten beschallt, bzw. bis entweder eine klare Einphasenmischung oder eine homogene Emulsion
gebildet ist. Dies wird dadurch erreicht, daß das Aufnahmegefäß einfach in das Beschallungsbad in geeigneter Höhe eingesetzt wird. Das
Emulgieren kann über einen weiten Temperaturbereich, d.h. von ungefähr
minus 10 bis ungefähr 50 C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 20 C durchgeführt werden. Die optimale/Bedingungen, unter
denen das Emulgieren durchgeführt wird, hängen ab vom Lösungsmittel, vom Phospholipid und von der bei der Präparation eingesetzten Menge
der wässrigen Phase. Die im Einzelfall günstigsten Bedingungen können von einem Fachmann in einfacher Weise durch Versuche ermittelt werden.
Die emulgierte M ischung wird anschließend behandelt, um einen erheblichen
Teil des inerten organischen Lösungsmittels zu entfernen. Dies kann in einfacher Weise durch einen Drehverdampfer, bei Temperaturen
ο ο
von ca. 20 bis 60 C und unter verringertem Druck, d.h. unter Vakuum
(10 mm bis 50 mmHg) erfolgen. Die bei der Verdampfung des organischen Lösungsmittels aus der Emulsion einzuhaltende Temperatur hängt
vom Siedepunkt des jeweiligen organischen Lösungsmittels in der Emulsion
sowie von der Stabilität des eingekapselten biologisch aktiven Materials ab. Bei der Verdampfung entsteht aus der Emulsion zunächst ein
viskoses Gel, das ein Zwischenprodukt darstellt. Dieses Gel ist stabil
und kann in diesem Zustand für einen gewissen Zeitraum, in der Regel bis mindestens zu einer Woche, bei 4 C unter inerter Athmosphäre wie beispielsweise
Stickstoff aufgewahrt werden. Es kann ein geringer Anteil von
Wasser oder Pufferlösung zu dem Gel zugegeben und die resultierende Mischung für einen zusätzlichen Zeitabschnitt (ca. 15 Minuten) verdampft
werden, um die Entfernung von restlichen Spuren des organischen Lösungs-
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mitteis zu fördern sowie um die Umwandlung des Gels in eine homogen
erscheinende Suspension von oligolamellaren Li pid-B laschen zu beschleunigen.
Das Gel kann durch Rühren od. dgl. oder durch Dispersion in einem wässrigen Medium wie etwa einer Pufferlösung umgewandelt werden.
Die dabei erhaltenen Bläschen liegen mit ihrem mittleren Durchmesser in einem Bereich von 2.000 bis 4.000 A . Ein bedeutender Teil
der einzukapselnden Drogen, Chemikalien, Makromoleküle oder anderen
Verbindungen und biologischen Substanzen, die in dem wässrigen Puffer
enthalten sind} wird innerhalb der Li pid-B laschen eingeschlossen (bis
zu ca. 60 %, je nach Anteil des Lipids, Volumen der wässrigen Phase,
Verhältnis von organischer Phase zu wässriger Phase zu Lipid, Art der bzw. des inerten organischen Lösungsmittel (s) und Art des bzw. der
Lipide, die in dem Verfahren eingesetzt werden. Das nicht eingeschlossene wässrige Material kann nötigenfalls durch bekannte geeignete Techniken
etwa durch wiederholtes Zentrifugieren, Säulenchromatographie, Ionenaustausch, Chromatographiedialyse oder ähnliche Verfahren entfernt
und rückgewonnen werden. Die Lipid-Bläschen mit ihrem eingekapselten
Inhalt können anschließend für den Gebrauch in einem geeigneten isotonen
Puffer suspendiert werden. Fall Sterilität erforderlich ist, können die Bläschen
mittels Durchgang durch ein 0,4 Mikron-Fiiter (sog. Nukleopor) sterilisiert
werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einkapsel bare Substanzen und
Verbindungen sind beispielsweise Drogen wie Cytosinarabinosid und dessen
phosphorylierte Derivate, Chemikalien wie zyklisches 3', 51 Adenosinmonophosphat,
Sucrose, Anti-biotika, wie Penicillin und Streptomycin,
Polypeptidhormone wie Insulin, Oxytocin und Vasopressin, Makromoleküle
wie Dextran, Proteine wie beispielsweise Albumin, Ferritin und Immunoglobulin
G, Enzyme wie Alkal iphosphatase, Nukleinsäuren wie Polyadenylsäure
(poly A^ Ribonukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, Viren und
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Bakterien wie C.parvum und ähnliche Materialien.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren unter inerter Atmosphäre
durchgeführt. Der Ausdruck "inerte Atmosphäre" bedeutet dabei eine nicht oxydierende Atmosphäre wie beispielsweise Stickstof fgas, Argon und ähnliche
inerte Gase. Aus den vorstehenden Erläuterungen ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich in verschiedener Hinsicht von bekannten
Verfahren unterscheidet. So sieht die Erfindung beispielsweise vor , daß
das einzukapselnde Material mit dem Lipid in die organische Phase zugegeben
wird, wo es vollständig eingekapselt wirdo Weiter wird die organische
Phase im wesentlichen vollständig entfernt, bevor ein Überschuß an wässriger Phase zugegeben wird. Das Emulgieren der anfänglichen
wässrigen Phase in die organische Phase und die Entfernung der organischen Phase vor der Zugabe irgendeines Überschusses an wässriger Phase
ist wesentlich für die hohe Einschließungswirksamkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens und begründet einen wesentlichen Unterschied zwischen diesem und den eingangs beschriebenen bekannten Methoden. Das erfindungsgemäße
Verfahren führt zu großen oligolamellaren Bläschen, aufgebaut
aus zahlreichen verschiedenen Li pi den jeweils allein oder in Kombination.
Ein Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht weiter darin, daß die Verdampfung der organischen Phase bei mäßigen Temperaturen
und im Vakuum durchgeführt wird, um eine mögliche Inaktivierung der
empfindlichen Moleküle zu vermeiden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele näher
erläutert. Bei diesen im folgenden beschriebenen Ausführungsbeispielen
kann man 0,5 bis 1 Mol eines fluoreszierenden Phospholipids entsprechend
beispielsweise NBD-PE (Avanti Biochemicals) mit der Lipid- oder Phospholipid-Komponente
zu-geben, um die Trennung der Bläschen in einer Säule visuell zu verfolgen.
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Eine 50 ml Rundbodenflasche mit langer Halsverlängerung wird mit
einem 24/40 Verbindungsstück versehen und damit an einen Schnei I-verdampfer angeschlossen. Die Flasche ist außerdem so angeschlossen,
daß mit Stickstoffgas gespült werden kann. Die Flasche wird mit 10 uMol Phosphatidylglycerol, 40 uMol PhosphatidyIchoiin und 50 uMol
Cholesterol gelöst in Chloroform beschickt. Unter Drehverdampfung wird das Lösungsmittel verdampft, wobei eine dünne Lipidschicht an
der Innenwandung der Flasche zurückbleibt. Anschließend wird die Flasche mit Stickstoff gas gespült und werden 5 ml D iäthy lather unter
Rührer zugegeben, um die Lipide zu lösen. Darauf werden 1,5 ml einer wässrigen Mischung von 10 mM auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffertes
Natriumchlorid mit 4 mM Histidin/2-|Ttris (Hydroxymethyl) Methyl J
Amino j Äthan-sulfonsäure (im folgenden kurz als "TES" bezeichnet)
und 10 mg/rn! Alkaliphosphatase zugegeben, um eine heterogene
Zwei phasenmischung zu bilden. Die Mischung wird anschließend durch
Beschallung während 5 Min. bei 0 C in einem badförmigen Ultraschallreiniger
(Modell T 80-80-IRS, Laboratory Supplies, Hicksville, New York)
emulgiert. Die entstehende Emulsion wird anschließend auf einem Drehverdampfer
(Buch i) bei einer Temperatur von 25 C und unter verringertem Druck (ca. 10 bis 50 mmHg) unter Verwendung eines Wasser-Aspirators·,
bis ein viskoses Gel entsteht. Dieses Gel ist ein unmittelbares Vorprodukt für die herzustellenden synthetischen Liposome. Das Gel ist
stabil und kann für einen Zeitraum von mindestens einer Woche bei einer Temperatur von ca» 4 C unter inerter Atmosphäre gelagert werden»
Zu dem in der beschriebenen Weise erhaltenen Gel werden 1,5 ml des
vorstehend beschriebenen Natiumchlorid-/Hi£.tidin-/TES-Puffers zugegeben,
worauf die Flasche leicht geschwenkt wird, um eine wässrige Suspension des Gels zu erhalten. Die entstehende Mischung wird bei 30 C
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unter einem Druck von ca. 10 bis 50 mmHg während weiterer 15 Min.
eingedampft, wobei eine undurchsichtige Suspension von Phospholipid-Bläschen
(synthetischen Liposomen) erhalten wird, die einen mittleren
Durchmesser von 0,2 bis 0,6 M ikron aufweisen. Verlängertes Eimdampfen
ohne Zugabe von zusätzlichem Puffer führt zu ähnlichen Suspensionen.
Die Prüfung unter dem Elektronenmikroskop ergibt, daß es steh bei den
Bläschen um im wesentlichen oligolamellare Bläschen handelt.
Die undurchsichtige Suspension der Bläschen wird durch eine Bio-Gel A
1,5 Agarose-Säule gegeben, um die .oligolamellaren Bläschen von nicht
eingekapselter Alkaliphosphatase-M ischung zu trennen. Der Einkapselungsanteil
ist zu 34 % bestimmt worden. Die abgetrennten Bläschen können in irgendeiner isotonen Pufferlösung suspendiert und als Ausgangsmaterial
für ein Enzym-Reagens verwendet werden.
Wird das im vorstehenden Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren
entsprechend durchgeführt, jedoch die dabei verwendete Alkaliphosphatase
durch 10 mg/ml L-Asparaginase ersetzt, so werden synthetische Bläschen
erhalten, die die L-Asparaginase einkapseln. Diese Bläschen si nd
nützlich, um das Wachstum gewisser Tumoren in Säugetieren zu inhibieren (zu dieser Anwendung vgl. Chang, T., Nature 229, 117-118 (1971)).
Wird das im vorstehenden Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren
entsprechend durchgeführt, die dabei verwendete Alkaliphosphatase aber
durch 10 mg/ml verschiedener Glycosidasen ersetzt, so werden synthetische Bläschen erhalten, in denen diese Enzyme eingekapselt si nd. Diese Bläschen
lassen sich mit Vorteil in der Enzymersatz-Therapie anwenden (vgl. Ta-ger, Hooghwinkel und Daems: "Enzyme therapy in Lysosomal Storage
Diseases", North-Hyllang Publ. Co. (1974)). Wird das im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren entsprechend durchgeführt, die dabei
verwendete Alkaliphosphatase aber durch 84 mg/ml von 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin
ersetzt, so werden synthetische Bläschen erhalten, in denen
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das Arabinofuranosylcatosin* eingekapselt ist und die zur Inhibierung
gewisser Tumore in Säugetieren angewendet werden können (vgl. Mayhew et al.3 Cancer Research, 36: 4406 - 441"!(Dezember 1976)).
In ähnlicher Weise können Nukleosid-Analoge von ara-C, Methotrexat
oder ähnlichen Antimetaboliten für die Anwendung bei der Inhibierung
bestimmter Tumoren in Säugern eingekapselt werden.
Wird das vorstehend im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren
entsprechend durchgeführt, die dabei verwendete Alkaliphosphatase aber
durch 0,6 mg/ml Actinomycin D ersetzt, so wird diese Verbindung eingekapselt.
Actionomycin D, das auf diese Weise eingekapselt ist, kann Patienten verabreicht werden, die unter responsiven Krebserscheinungen
leiden, entsprechend der Methode von Gregoriadis et al. (vgl. Lancet, 29. Juni 1974, Seiten 1313-1316; vgl. auch D. Papahadjopulos et al.,
Cancer Research, 36: 2988-2994, September 1976).
Wird das Verfahren gemäß dem Ausführungsbeispiel 1 entsprechend durchgeführts
die dabei verwendete Phosphatase aber ersetzt durch das Natriumsalz von Heparin, gelöst in phosphatgepufferter Salzlösung, so werden
synthetische Bläschen erhalten, in denen das Heparin eingekapselt ist. Diese Bläschen können in Pufferlösung suspendiert und intravenös Säugern
verabreicht werden als verzögert freigesetztes Antikoagulans, um darauf
ansprechende Zustände zu behandeln.
Ähnliche Drogen wie etwa Megluminantimoniat können nach dem gleichen
Verfahren gemäß Ausführungsbeispiel 1 eingekapselt werden. Nach diesem Verfahren eingekapseltes fvegiuminantirnoniat kann bei Säugern
gegen parasitäre Organismen wie Leishmaniasis angewandt werden.
Wird das im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren entsprechend
angewandt, die dabei verwendete Phosphatase aber durch Metal ichelat-Verbindungen
wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Penicillamin
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od. dgl. ersetzt, so werden synthetische Bläschen erhalten, die zur
Behandlung von Patienten geeignet sind, die unter Met al I Vergiftungen, Metallspeicherschwierigkeiten oder gewissen Anämien lei den (vgl.
US-PS 40 16 290).
Die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Rundbodenflasche wird mit
1OuMoI Phosphatidylglykerol, 40jjMo1 PhosphatidyIcholin und 5OuMoI
Cholesterol, gelöst in Chloroform, beschickt. Der Inhalt wird mit einem Drehverdampfer verdampft, um eine dünne Lipidschicht an der Innenwandung
der Flasche zu bilden. Anschließend wird die Flasche mit Stickstoff gespült und werden 5 ml Diäthyläther unter Rühren zugegeben, um
die Lipide wieder aufzulösen. Sodann werden 1,5 ml einer wässrigen Mischung von auf einem pH-Wert von 7,4 gepuffertem Natriumchlorid
mit 4 mM Histidin/TES und 1 mg/ml Ribonukleinsäure (RNA -entweder als Polyadenylsäure oder 25 S Tetrahymena-Ribosomen -RNA). Die
entstehende Mischung wird emulgiert durch Beschallung für 5 Min. bei einer Temperatur von 0 C in einem badartigen Ultraschallreiniger (Laboratory
Supplies, oben). Die Emulsion wird anschließend bei einer Temperatur von 0 C unter einem Druck von 10 bis 50 mmHg im Schnei I verdampf er eingedampft,
bis ein Gel entsteht. Zu diesem Gel werden 1,5 ml der oben beschriebenen Natriumchlorid/Histidin/TES-Pufferlösung zugegeben, und
die Eindampfung wird für weitere 15 Min. fortgesetzt. Die entstehende undurchsichtige
Suspension besteht aus synthetischen Bläschen, in denen die Ribonukleinsäure eingekapselt ist. Die Suspendion wird für ca. 30 Min. bei
einer Temperatur von 20 C stehengelassen und anschließend bei 100.000 xG
für 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, wobei als Sediment
die synthetischen Bläschen zurückbleiben. Der Anteil der eingekapselten
RNA wird zu 40 bis 43 % bestimmt. Diese Bläschen sind nützlich zur Einführung von RNA durch Zellmembranen.
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In ähnlicher Weise können andere Polyribonukieotide wie Polyinosin-PoIycytosin-Säure
oder andere synthetische Polynukleotide anstelle der im Ausführungsbeispiel 2 verwendeten Ribonukleinsäure verwendet
werden, um synthetische Lipid-bläschen zu ergeben, in denen diese
Verbindungen für die Anwendung als Anti-Viren-Mittei eingekapselt sind. Die Anwendungstechnik derartiger Bläschen ist an sich bekannt.
Dieim Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Rundbodenflasche wird mit
50 uM öl wie Dipalmitoyl Phosphat idylchol in und 50 uMol Cholesterol
in Chloroform beschickt. Der Inhalt wird auf einem Drehverdampfer verdampft, wobei die Li pid-Mischung auf der Innenwandung der Flasche
niedergeschlagen wird. Anschließend wird die Flasche mit Stickstoff
gespült und werden 7,5 ml Isopropylather und 7,5 ml Chloroform unter
Rühren zugegeben, um die Lipide zu lösen. Der Lösung werden 1,5 ml einer wässrigen M ischung von insulin (Bovin, 20 mg/ml in 7 M Harnstoff)
in wässriger Pufferlösung (1OmM Triethylamin-Hydrochlorid,
pH 7,9) zugegeben. Die entstehende Mischung wird emulgiert durch
Beschallung für 5 Min. bei einer Temperatur von 45 C im Beschallungsbad (Laboratory Supplies, vgl. oben). Die Emulsion wird anschließend
ο
bei einer Temperatur von 45 C und unter einem Druck von 10 bis 50 mm Hg auf einem Schnei I verdampf er verdampft, bis ein Gel entsteht. Dem Gel werden 1,5 ml der vorstehend beschriebenen Natriumchlorid/TES-P uff er lösung unter Rühren zugegeben. Anschließend wird die Verdampfung für weitere 15 Min. fortgesetzt. Die entstehende undurchsichtige
bei einer Temperatur von 45 C und unter einem Druck von 10 bis 50 mm Hg auf einem Schnei I verdampf er verdampft, bis ein Gel entsteht. Dem Gel werden 1,5 ml der vorstehend beschriebenen Natriumchlorid/TES-P uff er lösung unter Rühren zugegeben. Anschließend wird die Verdampfung für weitere 15 Min. fortgesetzt. Die entstehende undurchsichtige
Suspension wird für 3 0 Min. bei einer Temperatur von 45 C stehengelassen.
Anschließend wird die Suspension durch eine G-75 Sephadex-Säule bei Raumtemperatur (ca. 26 C) gegeben, um die synthetischen
Li pid- B laschen abzutrennen, in denen die Insulinlösung eingekapselt ist.
Der eingekapselte Anteil des Insulins wird zu 34 % ermittelt. Die Bläschen
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können in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und Patienten,
die unter insulingesteuertem Diabetes leiden, oral oder intramuskulär
unter üblicher Dosierung gegeben werden. Das in diesem Ausführungsbeispi el beschriebene Verfahren kann auch mit tieferen Temperaturen
(0 bis 20 C während Beschallung und Verdampfung durchgeführt werden, wenn für die Bildung der Bläschen flüssige Phospholipide anstelle von
Dipalmitoyphosphatidylcholin verwendet werden.
Wird das in diesem Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren entsprechend
durchgeführt, dabei aber das Insulin durch andere wasserlösliche
Pepidhormone, beispielsweise Vasopressin, Somatostatin oder
deren synthetische Derivate undjlnaloge ersetzt, so werden synthetische
Li pid-B laschen erhalten, in denen die entsprechende Substanz
eingekapselt ist und die für therapeutische Anwendungen gegen darauf
ansprechende Leiden bei Säugern geeignet sind.
Wie oben erwähnt, ist die lonenstärke der für die Einkapselung zubereiteten
wässrigen M ischung ein wichtiger Faktor für den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichten Einkapselungsgrad. Wenn die lonenstärke
sodieser wässrigen Mischung zunimmt, so führt dies wohl zu einer Zunahme
des eingekapselten Anteils als auch zu einer Volumenzunahme des eingekapselten Wasservolumens pro uMol des Phospholipids. Hohe Konzentrationen
von Sukroseglycerol, Harnstoff od. dgl. haben nicht die gleiche Wirkung wie eine Konzentrationserhöhung der Ionischen Spezies in der
einzukapselnden Mischung. Dieser Effekt wird im folgenden Ausführungsbeispiel 5 demonstriert.
Das vorstehend im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren wird sechsmal
wiederholt, wobei jedesmal die im Ausführungsbeispiel 1 vorgesehene
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Alkaliphosphatase ersetzt wird durch 0,84 mg/ml 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin
(ara-C) und wobei der - Anteil von Natriumchlorid bei
jeder Versuchswiederholung geändert wird, um die lonenstärke der einzukapselnden
ara-C-Mischung zu variieren. Der Anteil des jeweils gegenwärtigen
Natriumchlorids und der resultierende Einkapselungsgrad sind nachfolgend in Tabelle 1 wiedergegeben:
Tabelle 1 | Einkapselungsantei I (%)' |
NaCI (Mol) |
15,0 |
0,50 | 37,5 |
0,15 | 42,5 |
0,10 | 47,5 |
0,04 | 62,3 |
0,02 | 62,5 |
0,00 | |
Versuch Nr.
Die Lipid-Konzentration in der Zweiphasenmischung, die emulgiert wird,
hat gleichfalls Einfluß auf den Einkapselungsanteil, der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erreicht wird. So nimmt beispielsweise der ara-C-Einkapselungsanteil
mit abnehmender Lipid-Gesamtkonzentration ab. Dagegen nimmt das eingekapselte Wasservolumen pro Mol Phospholipid zu.
Das eingekapselte Wasservolumen beträgt ungefähr 11,2 1 pro Mol Phosphoiipid,
wenn der gesamte Lipidgehalt ungefähr 100 uMol pro 5 ml Lösungsmittel
beträgt, und nimmt zu auf ungefähr 22,5 I pro Mol Phospholipid, wenn der gesamte Lipidgehjait auf 20 uMol reduziert wird. Der Bereich von
20 bis 100 uMoi / 5 ml ist zu bevorzugen, wobei bei 100 uMol eine erhöhte
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Anzahl von multilamellaren Bläschen erzeugt wird. Das nachfolgende
Ausführungsbeispiel 6 demonstriert den ara-C-Einkapselungsanteil, der
bei unterschiedlichen Lipid-Konzentrationen erhalten wird.
Das vorstehend anhand des Ausführungsbeispiels 1 beschriebene Verfahren
wird fünfmal wiederholt, wobei jedes Mal die Alkaliphosphatase ersetzt
wird durch 84 mg/ml 1-ß-D-Arabinofuranosylcatosin (ara-C) ersetzt und
die gesamte Lipid-Konzentration für jede Versuchswiederholung geändert
wird, wobei jedoch dasselbe Verhältnis von PQ : PC : Cholesterol beibehalten wird. Für die einzelnen Versuche wird nachfolgend in Tabelle 2 der
gesamte Li pid-Anteil und der erhaltene Einkapselungsanteil angegeben.
Tabelle 2 | Einkapselungsantei I (%) |
|
Versuch Nr. |
Gesamt-Li pid (jjMoI) |
15 |
1 | 20 | 25 |
2 | 40 | 30 |
3 | 60 | 31,2 |
4 | 80 | 37,5 |
5 | 100 | |
Die Natur des Lipids bzw. der Lipide, die bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden, scheint nicht kritisch zu sein. M it der Ausnahme
negativ geladener Lipide, wie beispielsweise PS, PG, Kardiolipin
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oder Phosphatidsäure, wenn diese allein eingesetzt werden, haben unterschiedliche
Üpid-Zusammensdzungen bei jeweils entsprechenden Anteilen
von Li pi d/Lösungsmittel/Puffer nur einen geringen Einfluß auf den erhaltenen
Einkapselungsgrad. Dies wird anhand des nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispiels
7 erläutert.
Das vorstehend im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Verfahren witdmehrmals
wiederholt, wobei lediglich die Alkaliphosphatase ersetzt wird durch
0,84 mg/ml ara-C oder 0,01 M Natriumchlorid in 1/10 phosphatgepufferter
Salzlösung nach Dulbecco anstelle von TES verwendet und bei jedem Versuch die Lipid-Komponente geändert wird. Im Versuch Nr. 4 sind 3,5 ml
Diäthyläther und 1,05 ml Dulbecco-Salzlösung (PBS) verwendet worden;
im Versuch Nr. 5 sind 7,5 ml isopropyläther mit 7,5 ml Chloroform anstelle
von Diäthyläther verwendet worden und die zweite Verdampfung wurde bei 45 C durchgeführt. Im Versuch Nr. 6 ist eine M ischung von 7,5 ml Isopropyläther
und 7,5 ml Äthanol anstelle von Diäthyiäther verwendet worden;
in den Versuchen Nr. 7 und 8 ist ei ne Mischung von 5 ml Diäthyläther mit 1 ml Methanol anstelle von Diäthyläther allein verwendet worden. Die jeweils
verwendeten Lipide, die jeweiligen Lipid-Konzentrationen und der erreichte Einkapselungsgrad werden nachfolgend in Tabelle 3 angegeben.
Versuch-Nr. Li pid-Zusammen- Gesamt-Lipide Einkapselungsanteil
Setzung (uMol) ara-C Natrium
1 PG/PC/Chol + (1:4:5)
2 PG/PC (1:4)
3 PS/PCjChol (1:4:5)
4 Stam /^PC/Choi (1/4/3)
5 DPPC
6 Sphingomyeiin
7 PG
8 PS
^bedeutet Cholesterol 909836/0681
bedeutet Stearylamin oo
100 | 62 | 47,5 |
50 | -- | 34,3 |
TOO | 61 | |
56 | -- | 44,6 |
50 | -- | 40,6 |
66 | 24 | |
50 | — | 18,6 |
50 | 22 |
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Bläschen wirken
als Träger für die eingekapselte biologisch aktive Substanz, die dabei biologisch verfügbar bleibt. Die Bläschen-Wandungen sind für die eingekapselte
Substanz undurchlässig, wie sich aus dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel 8 ergibt.
Drei Portionen von jeweils 10 ml der in Ausführungsbeispiel 5, Versuch
Nr. 5 hergestellten Bläschen wurden separiert und über Nacht dialysiert,
um in der Suspension der ara-C-eingekapselten Bläschen gegenwärtiges
nicht eingekapseltes Material zu entfernen. Jede dialysierte Portion wurde anschließend'in einen Dialyse-Behälter eingesetzt und gegen drei nacheinander
folgende Portionen von jeweils 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung nach Dulbecco für jewei Is eine Stunde bei unterschiedlichen Temperaturen
dialysiert. Der Anteil von ara-C, der durch den Dialyse-Behälter pro Stunde hindurchdiffundierte, wurde beobachtet. Die Beobachtungen, zusammen mit
den jeweiligen Temperaturen und der Dialysedauer sind nachfolgend in Tabelle wiedergegeben.
Anteil (in %) des eingeschlossenen Materials, da je Stunde freigesetzt wird.
Zeit Temperatur ( C)
1 Stunde
2 Stunden
3 Stunden
10. | 20 | 37 |
376 | .697 | 1.97 |
221 | .613 | 1.69 |
195 | .649 | 1.54 |
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Die vorstehend im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Rundbodenflasche
wird mit 50 uMol PG:PC (1:4) und 50 Mol Cholesterol, gelöst in Chloroform,
beschickt. Das Lösungsmittel wird unter Drehverdampfung verdampft, wobei ein Film aus der Li pid-Mischung an der Innenwandung der Flasche verbleibt.
Anschließend wird die Flasche mit Stickstoffgas gespült und werden 5 ml Diäthyläther unter Rühren zugegeben, um die Lipide wieder aufzulösen.
Der Lösung werden 1,5 ml einer wässrigen Suspension von durch Wärmeeinwirkung abgetötetem bacterium C.parvum in phosphatgepufferter Salzlösung
nach Dulbecco zugegeben. (Anmerkung: Die phosphatgepufferte Salzlösung nach Dulbecco bestimmt sich folgendermaßen: NaCI, 0,137M; NaHPO ,
8,2 χ 10"3M; KCI , 2,7 χ 1θ"3Ιν1; KHPO 1,9 χ 10~3M; MgCI ,
-3 -3
1,1 χ 10 M; CaCI , 0,9 χ 10 M). Die resultierende Mischung wird
ο emulgiert durch Beschallung für 5 Min. bei 0 C in einer Beschall ungseinrichtung
(Laboratory Supplies, vgl. oben). Die Emulsion wird anschließend
verdampft bei einer Temperatur von 20 C und einem verringerten Druck von 10 - 50 mm Hg mittels eines SchneiIVerdampfers, bis ein Gel entsteht.
Zu diesem Gel werden 1,5 ml der Phosphatgepufferten Salzlösung nach Dulbecco zugegeben, und anschließend wird die Verdampfung für weitere
15 Min. fortgesetzt. Das eingekapselte C.parvum wird durch Zentrifugieren auf einem Sukrose-Gradienten von nicht eingekapseltem C.parvum abgetrennt.
Von dem eingebrachten C.parvum werden 30 % eingekapselt. Die auf diese
Weise erhaltenen Bläschen können als Adjuvans bei der Immunotherapie
gewisser Krebsfeiden verwendet werden (vgl. Seminars Oncol. J_: 367-378
(1974)).
Wird entsprechend dem vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel 9
vorgegangen, dabei aber das dort eingesetzte C.parvum ersetzt durch andere Immunostimulantien wie BCG, intakte Krebszellen oder Reinigungsfraktionen
von diesen, so werden synthetische Bläschen erhalten, in denen diese entsprechenden
Substanzen eingekapselt sind. Diese Bläschen lassen sich
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mit Vorteil für die Immunotherapie einsetzen, wenn sie von einem darauf
ansprechenden Leiden betroffenen Säugern verabreicht werden.
Das Ausführungsbeispiel 9 demonstriert außerdem einen besonderen Vorteil
des erfindungsgemäßen Verfahrens, der darin besteht, daß dadurch nicht nur in Löseng befindliche Substanzen sondern ebenso auch in wässrigen Medien
suspendierte Substanzen eingekapselt werden können. Das einzukapselnde
Material kann,, falls löslich, in der wässrigen Phase gelöst werden. Andererseits
kann das Material in feinverteilter Form in dem wässrigen Medium suspendiert werden oder es können Makromoleküle wie etwa im Fall von
Viren oder ZeIImaterial!en in Suspension gebracht werden. Es erweist sich,
daß wenn in den erzeugten Bläschen nur hinreichend Raum für das Suspendierte Material ist, diese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt
werden kann. Darin besteht ein bedeutender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren, weil nach den meisten der bekannten Verfahren nur gelöste Substanzen
eingekapselt werden können.
Es ist bereits darauf hingewiesen worden, daß den nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellten Bläschen große Volumina, und zwar auch von
verhältnismäßig groß molekularen biologisch aktiven Substanzen eingekapselt
werden können. Entsprechend der Natur der eingekapselten Substanzen haben
die Bläschen einen sehr breiten Anwendungsbereich. Beispi eisweise lassen
sie sich mit eingekapseltem Antibiotika für di e in-vivo- und die in-vitro-Behandlung
von antibiotika-resistenten Keimen, einschließlich der gramnegativen E.coli, H. influenzae, P.aeruginosa und dgl. verwenden. Aus der
Theorie ergibt sich, daß von bakteriellen Organismen entwickelte Drogenresistenz
darauf zurückzuführen ist, daß sich eine Undurchlässigkeit der Zellwände
ausbildet. Die Zufuhr eines geeigneten Antibiotikums zu einem Organismus wird erleichtert, wenn sie mittels Li pid-B laschen erfolgt, da diese,
wie es scheint, die bakteriellen Zellwände leicht durchdringen und das eingekapselte
Antibiotikum im Inneren des patogenen Keims freisetzen.
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In ähnlicher Weise kann man, wie vorstehend bereits kurz angedeutet,
durch Einkapselung von anti parasitären Verbindungen diese dem reticuloendothelialen
System eines Wirtssäugers zuführen. Durch die Lipid-Bläschen kann die Medikation wirkungsvoll und mit geringstem toxischen
Effekt für den Wirtssäuger erfolgen, um den Parasiten zu neutralisieren.
Die Einkapselung von viralen und bakteriel len Wirkstoffen wie beispielsweise
inaktivierten PoIb-Viren oder P.aeruginosa ergibt eine Vaccine,
die Säugern verabreicht werden kann, um eine Immunisierung gegen das
durch den jeweiligen Wirkstoff verursachte Leiden herbeizuführen, wobei
das toxische Potential, das mit derartigen, aber nicht nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren eingekapselten Vaccinen verbunden ist, bedeutend herabgesetzt
wird.
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Claims (34)
1. Verfahren zur Einkapselung biologisch aktiver Substanzen in synthetischen
poligolamellaren Lipidbläschen, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Lösung des Lipids in einem organischen Lösungsmittel und eine
wässrige Zubereitung der einzukapselnden Substanz gemischt werden, daß die Mischung emulgiert wird, daß das organische Lösungsmittel entfernt
und das dabei entstehende Gel in Wasser suspendiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bläschenbildende
Verbindung ein Prospholipid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Phospholipid
Phosphatidylcolin in Mischung mit einem zweiten Phosphilipid und Cholesterol
verwendet wird.
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- 2 - 4848/73
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Phosphatidylcolin
in ei nem Verhältnis von 4 : 1 zu dem zweiten Phosphoiipid steht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bläschenbildende
Verbindung in einem inerten Lösungsmittel gelöst verwendet und durch Verdampfung des inerten Lösungsmittels auf der Wandung
eines Reaktionsgefäßes niedergeschlagen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches
Lösungsmittel ein Lösungsmittel aus der Gruppe Diäthyläther, Chloroform, Tetrahydrofuran und Isopropylather verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige
Mischung auf einem pH-Wert gepuffert wird, bei dem die biologisch aktive Substanz stabil ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer
eine ionische Verbindung mit einer lonenstärke von weniger als 0,3 ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis
der bläschenbildenden Verbindung in einem Bereich von ungefähr 0,5 mg
bis ungefähr 50 mg pro ml des organischen Lösungsmittels liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Emulgieren
durch Ultraschall-Bestrahlung bei einer Temperatur von ca. -10 C bis
ο
ca. 50 C erfolgt.
ca. 50 C erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein
Teil des organischen Lösungsmittels durch Verdampfen entfernt wird, bis
eine geiartige M ischung erhalten wird, daß der gelartigen Mischung Wasser zugesetzt wird in hinreichender Menge, um das Gel zu konvertieren,
und daß anschließend das restliche Lösungsmittel verdampft wird.
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12. Gelartige Mischung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß
Patentanspruch 11.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das der
gelartigen M ischung zugegebene Wasser auf einen pH-Wert gepuffert
wird, bei dem die biologisch aktive Substanz stabil ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es unter
einer inerten Atmosphäre durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dispersion
in Wasser erfolgt, das auf einen pH-Wert gepuffert ist , bei dem
die biologisch aktive Substanz stabil ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oligolamellaren
Bläschen von nicht eingekapselter biologisch aktiver Substanz
abgetrennt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein Enzym ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein Antibiotikum ist.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz eine Nukleinsäure ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß di e Nukleinsäure
eine Deoxyribonukleinsäure ist.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein Pesticid ist.
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22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein Polypeptid ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß als Polypeptid
Insulin verwendet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein bakterieller Organismus ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch
aktive Substanz ein Virus ist.
26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bläschenbildende
Verbindung ei ne Mischung aus Cholesterol, Phosphatidylgiyceroi und Phosphatidylcholin im Gewichtsverhältnis 5:1:4 ist.
27. Pesticid-Zubereitung, bestehend aus einer wässrigen Mischung des
Pesticids, eingekapselt in oligolamellare Lipid-Bläschen.
28. Verfahren zur Bekämpfung von Krankheiten, dadurch gekennzeichnet,
daß an ihrem Entstehungsort eine wirksame Menge eines wirksamen
Pesticids angewandt wird, das in oligolameliare Lipid-Bläschen eingekapselt
ist.
29. Verfahren zur Düngung von landwirtschaftlichen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet,
daß den Pflanzen eine nährwirksame Menge eines Pflanzenernährungsmittels
beigebracht wird, das in oligolamellaren Lipid-Bläschen
eingekapselt ist.
30. In synthetischen, oligolamellaren Lipid-Bläschen eingekapselte
der Biologisch aktive Substanzen hergestellt nach einerry Verfahren 1 bis 29.
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31. Verfahren zur Behandlung von gegen Antibiotika resistenten Infektionen
bei Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß dem Säuger eine wirksame Menge eines geeigneten Antibiotikums verabreicht wird, das in Lipid-Blaschen
eingekapselt ist.
32. Verfahren zur Behandlung von unter durch Parasitenbefall verursachten
Krankheit leidenden Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß den Säugern eine wirksame Menge eines geeigneten antiparasitär wirksamen Mittels
beigebracht wird, das in Li pid-B laschen eingekapselt ist.
33. Verfahren zur Immunisierung gegen Krankheiten, dadurch gekennzeichnet,
daß einem Säuger ein inaktiviertes krankheitsverursachendes Mittel beigebracht
wird, das in Li pid-B laschen eingekapselt ist,
34. Verfahren zur Einbringung von Deoxyribonukleinsäure oder Fragmenten
davon in lebende Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure oder
Fragmente davon in Li pid-B laschen eingekapselt und die Bläschen in
Kontakt mit der zu behandelnden Zelle gebracht werden, wobei die Säure bzw. die Fragmente davon in die Zelle eindringen.
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