JP2013502906A - 染色体再編成を伴う腫瘍の診断、予後及び治療のためのマイクロrnaに基づいた方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)対照細胞と比べて、好ましくは染色体再編成を有する腫瘍細胞においてその発現が誘導又は増加される1つ以上のmiRの発現又は活性を阻害する1つ以上の作用物質を、細胞に導入すること;及び
(ii)1つ以上の作用物質がmiRの発現又は活性を阻害する条件下に細胞を維持し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害すること
を含む方法に関する。
以下の実施例は、本発明を更に例示するが、本発明の範囲をいかようにも制限するものとして考慮されるべきではない。本明細書に用いられるもののような従来の方法の詳細な記載は、引用文献において見出すことができる(「診断及び治療のメルクマニュアル」(“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”)第17版、Beers及びBerkow編(Merck&Co.,Inc.2003年)も参照すること)。本発明の実施は、特に指示のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換生物学、微生物学、組み換えDNA及び免疫学の従来の技術を用い、それらは当該技術の技能の範囲内である。
本明細書に用いられるもののような従来の方法についての詳細な記載は、引用文献において見出すことができる。
全ての試料は、St.Joseph Stift,Bremen(Germany)の一般及び内臓外科(Department of General and Visceral Surgery)で甲状腺切除術を受けている患者から得た。計画の認可は、地方論理委員会から得て、ヘルシンキ宣言(第25章)に概説されたヒト被験者に関わる医療研究の原則に従った。各腫瘍から1片を細胞培養のためにハンクス液に保存し、第2片を遺伝子発現研究のために液体窒素に保存した。細胞株を甲状腺腺腫細胞から以前に報告されたように誘導した(Belgeら、細胞生物学ジャーナル国際版(J. Cell Biol. Int. Rep.)16、(1992年)339〜347頁)。胎児、胎盤及び精巣組織からの保存RNAを対照として使用した。
組織消化、原発性細胞株の培養及び細胞遺伝学的分析を、以前に記載された方法に従って実施した(Belgeら、癌、遺伝学、細胞遺伝学(Cancer Genet. Cytogenet.)101(1998年)、42〜48頁;Roqueら、癌、遺伝学、細胞遺伝学67(1993年)、1〜6頁)。消化の前に、各試料をスライドと接触させて、FISHスクリーニング用の試料を得た。
全RNAを、Trizol(Invitrogen、Karlsruhe、Germany)試薬又はmirVana(Ambion、Woodward、USA)miRNA単離キットを製造会社の説明書に従って使用して、組織から、並びに固定細胞株から抽出した。miRNA(miR−371−3p、miR−372、miR−373及びmiR−520c)及びRNU6B(RNA、U6核内低分子2;相対的定量化用の内部対照)特異的cDNAを、TaqManマイクロRNA AssaysからのTaqManマイクロRNA RT Kit及び遺伝子特異的RTプライマー(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)を製造会社の説明書に従って使用して、10ngの全RNAから生成した。反応を、サーマルサイクラーにより、16℃で30分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、次に4℃で保存した。全ての逆転写は、テンプレートのない対照及びマイナスRT対照(−RT)を含んだ。リアルタイムPCRは、miRNA及びRNU6B特異的プローブ、並びにTaqMan Universal PCR Master Mixを備えたApplied Biosystems 7300 Fast Real Time PCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)を使用して実施した。反応を、96ウエルプレートにおいて、95で10分間、続いて95℃で15秒間と60℃で1分間の40サイクルによりインキュベートした。全ての反応を3重に実施した。相対的定量化(RQ)は、RQ=2_DDCt 2(−Delta Delta C(T))法(Livakら、方法(Methods)25(2001年)、402〜408頁)に基づいたApplied Biosystems SDSソフトウエアを使用して計算した。Ctデータを内部対照RNU6Bに規準化した(Yuら、癌細胞(Cancer Cell)13(2008年)、48〜57頁)。
3′RACE−PCRを細胞株S40.2で実施した。全RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して単離した。cDNA合成は、オリゴ(dT)プライマー(Invitrogen、Karlsruhe、Germany)をアンカープライマーとして使用し、M−MLV逆転写酵素についての説明書に従って僅かな修飾により実施した。3′RACE−PCR及びネステッド3′RACE−PCRを、条件をGoTaq Flexi DNA Polymerase(Promega、Mannheim、Germany)に適合させ、Gene Racer Kit(Invitrogen、Karlsruhe、Germany)に記載されたように実施した。サザンブロットを、ジゴキシゲニン−11−dUTPで標識されたPUM1特異的プローブ(RocheDiagnostics、Penzberg、Germany)を用いて、Fehrらにより記述されたとおりに実施した(Fehrら、癌、遺伝学、細胞遺伝学ジャーナル(J. Cancer Genet. Cytogenet.)180(2008年)、135〜139頁)。目的のフラグメントを切除し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、Hilden、Germany)で抽出し、次にpGEM−T Easy Vector(Promega、Mannheim、Germany)にクローンした。目的のクローンからプラスミドDNAをQIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen、Hilden、Germany)により単離し、Eurofins MWG、Ebersberg、Germanyで配列決定した。
PUM1特異的プライマー(プライマー(エクソン)配列(5′−3′)):
Ex1_Up(エクソン2) CCCTCAAGAACCAGCTAATCCCAACA
Ex3_Up(エクソン4) TTCCTGGGTGATCAATGGCGAGA
Ex4_Up(エクソン5) TCCCCGGGCGATTCCTGTCT
Ex5_Lo(エクソン6) TCCATCACATCACCCTCCTCCTTCAA
Ex7_Up(エクソン8) ACCTAATGCGCTTGCTGTCCA
Ex8_Up(エクソン9) GCTCCCGCTGCGTTTGTCC
Ex9_Up(エクソン10) CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG
AP2 AAGGATCCGTCGACATC(T)17
オリゴdT GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24
UAP2 CTACTACTACTAAAGGATCCGTCGACATC
Gene Racer 3′ GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG
Gene Racer 3′ネステッド CGCTACGTAACGGCATGACAGTG
1.プライマーEx4_UpとEx5_Loの間の配列
2.プライマーEx3_UpとEx5_Loの間の配列
Ex3_Up(エクソン4)=TTCCTGGGTGATCAATGGCGAGA
Ex4_Up(エクソン5)=TCCCCGGGCGATTCCTGTCT
Ex5_Lo(エクソン6)=TCCATCACATCACCCTCCTCCTTCAA
polyadqプログラム(Tabaskaら、遺伝子(Gene)231(1999年)、77〜86頁)を用いて、C19MCクラスターにおける可能なポリA部位を検出した。すぐ近くにプライマーを設計し、これを後にPUM1特異的プライマーと一緒に使用した。S40.2の全RNAを、以前に記載されたcDNA合成に使用されるTRIzol試薬(Invitrogen、Karlsruhe、Germany)を介して単離した。PCRを、GoTaq Flexi DNAPolymerase(Promega、Mannheim、Germany)により、続いてセミネステッドPCRにより実施した。目的のフラグメントを切除し、上記に記載されたように抽出し、Eurofins MWG、Ebersberg、Germanyで配列決定した。
PUM1−プライマー:Ex8_Up GCTCCCGCTGCGTTTGTCC
PUM1−プライマー:Ex9_Up CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG
#19−プライマー:500−クラスター_ポリA_I CAACCGTTGGGGATTACAAAATAGA
前の結果を、融合転写物内に局在化した異なるプライマーを使用して確認した。PCRを上記に記載されたように実施した。目的の大きさのフラグメントを切除し、抽出し、配列決定した(上記を参照すること)。
#19−プライマー:19_1 GGCTGCCCAGGGAGTTGCT
#19−プライマー:19_2 GCAGAAGCTCCCAGCCAGATCTT
#19−プライマー:19_3 CTAGGGTTCGCTGTCCTCACACTGC
PUM1−プライマー:Ex8_Up GCTCCCGCTGCGTTTGTCC
PUM1−プライマー:Ex9_Up CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG
miR−512−5p、miR−517a及びmiR−519a用のmiRNA特異的プライマーを、Chenらにより記載されたように設計した(Chenら、核酸研究(Nucleic Acids Res.)33(2005年)、e179)。cDNAを、Chenら(2005年)上記に従うが、ステムループプライマー濃度(5nM)における小さな変更、並びにアニーリング温度(68℃)及び持続時間(10秒間)を変更したPCR反応を伴って、1μgの全RNAから生成した。RT−PCRを、GoTaq Flexi DNA−Polymerase(Promega GmbH、Mannheim、Germany)により実施した。伸長を72℃で15秒間実施した。
miR−371−5pループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTC
miR−371−5pループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC
miR−372ループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGCTC
miR−373ループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACCC
miR−512−5pループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAAAGT
miR−517aループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTC
miR−520c−3pループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCTC
miR−520c−5pループプライマー
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGAAA
miR−371−3p順方向 ACCGCTAAGTGCCGCCATCTTTTG
miR−371−5p順方向 GCCGCCACTCAAACTGTGGGG
miR−372順方向 GGTCATAAAGTGCTGCGACATTTG
miR−373順方向 TTCATGAAGTGCTTCGATTTTGG
miR−512−5p順方向 AGTCTACACTCAGCCTTGAGGGCA
miR−517a順方向 CGGCGGATCGTGCATCCCTTTA
miR−519a順方向 CCGGCTAAAGTGCATCCTTTTAG
miR−520c−3p順方向 GCCGCCAAAGTGCTTCCTTTTAG
miR−520c−5p順方向 ACCGCTCTCTAGAGGGAAGCAC
逆方向プライマー GTGCAGGGTCCGAGGT
I−FISH分析を甲状腺腫瘍の接触調製物(touch-preparation)により実施した。19q13.4再編成の検出のために、tbpc19(甲状腺切断点クラスター19q13)と呼ばれる二重色分裂再編成プローブ(dual-color, break-apart rearrangement probe)(PanPath、Budel、Netherlands)を使用した。再編成プローブは、良性甲状腺病巣における19q13.4の共通切断点クラスターの遠位(3′−tbpc19;AlexaFluor 488で標識されている)及び近位(5′−tbpc19;AlexaFluor 555で標識されている)にそれぞれ位置する2つのプローブの混合物である。1枚のスライドにつき10μlの分裂プローブを使用した。同時変性を、Mastercycler勾配(Eppendorf、Hamburg、Germany)により80℃で3分間実施し、続いて加湿チャンバによりハイブリダイゼーションに37℃で一晩付した。後ハイブリダイゼーションを、0.1×SSCにより61℃で5分間実施した。中間期核をDAPI(0.75μg/ml)で対比染色した。スライドを、Axioskop 2+蛍光顕微鏡(Carl Zeiss、Goettingen、Germany)で検査した。画像をAxioCam MRmデジタルカメラにより撮り、AxioVision(Carl Zeiss、Goettingen、Germany)で編集した。それぞれの場合において、重複していない200個の核をスコア付けした。共存シグナル(緑色/赤色)は、非再編成切断点領域を示し、一方、別々の緑色と赤色のシグナルは、染色体領域19q13.4の再編成を示す。S842のtbpc−19における中期FISHを、接触調製物のI−FISHについて上記に記載されたとおりに実施した。中期の処置をKievitsらにより記載されたように実施した(Kievitsら、血球計算(Cytometry)11(1990年)105〜109頁)。染色体1の切断点の決定では、FISHを細胞株S40.2の中期調製物に対して実施した。プローブとして、両方ともPUM1の全ゲノム配列に及んでいる2つの重複クローンRP11−1136E4(AQ707626及びAQ733864)とRP11−201O14(AL356320.8)(imaGenes、Berlin、Germany)を使用した。DNAを、 Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して単離した。1μgの単離プラスミドDNAを、ジゴキシゲニン−11−dUTP(RP11−201O14)又はビオチン−16−dUTP(RP11−1136E4)のいずれかを用いて、ニック翻訳(Roche、Mannheim、Germany)により標識した。中期の処置、続くFISH実験を、上記に記載されたように実施した同時変性及び後ハイブリダイゼーションを除いてKievitsら(1990年)上記により以前に記載されたとおりに実施した。
結果を平均±標準偏差(SE)として表す。統計比較を、非対応スチューデントt検定により実施した。0.05未満のp値を有意であると考慮した。
クローン細胞遺伝学的異常を有する甲状腺腫瘍の約20%が、遺伝子バンド19q13を伴う異常を示す(Belge,G.ら、癌、遺伝学、細胞遺伝学(Cancer Genet. Cytogenet.)101(1998年)42〜48頁)。今まで、位置クローニング及びシリカ分析によって、切断点は、2つのmiRNクラスター、すなわちC19MC及びmiR−371−3をコードする遺伝子に極めて近接して位置している150kb(キロベース)のセグメント内のクラスターにおいて見出されている(Belgeら、細胞遺伝学(Cytogenet. Cell Genet.)93(2001年)、48〜51頁)(図4)。46の縦列反復霊長類特異的miRNA遺伝子を有する100kbの長さのC19MCクラスターは、全ての既知のヒトmiRNA遺伝子の約8%を占め、現在まで発見された最大のヒトmiRNA遺伝子クラスターである(Bortolin−Cavailleら、核酸研究(Nucleic Acids Res.)37(2009年)、3464〜3473頁)。Renら(Renら、トランスレーショナル医療ジャーナル( J. Transl. Med.)7(2009年)、20頁)は、このクラスターに4,691個の標的を予測した。最近の証拠は、miRNAが、主に胎盤に発現している非タンパク質コードPoI−II転写物のイントロンによりコードされることを示唆している(Bortolin−Cavailleら、(2009年)上記)。その大型クラスターと対照的に、miR−371−3クラスターは、5つのmiRNAがコードされる、およそ1,050bpのかなり小さな領域の範囲である。両方のクラスターのmiRNAは、同様のシード配列を共有する大型miRNAファミリーに属する(Laurentら、幹細胞(Stem Cells)26(2008年)、1506〜1516頁)。注目すべきは、近年、幾つかの群が、ヒト胚幹細胞(hESC)においてmiRNAの特徴的な性質を有するC19MCとmiR−371−3のクラスターのメンバーの発現に関連付けられている(Renら、(2009年)上記;Laurentら、(2008年)上記;Liら、細胞生化学ジャーナル(J. Cell. Biochem.)106(2009年)、1020〜1030頁)。miRー373の腫瘍形成の可能性についての最初の証拠は、ヒト精巣生殖細胞腫瘍において得られ、それは野生型p53の存在下で腫瘍発生性増殖を可能にすることを示した(Voorhoeveら、細胞(Cell)124(2006年)、1169〜1181頁)。前立腺腫瘍において、miR−373及びmiR−520cは、下方制御されていることが見出されたが、両方とも、インビトロで移動及び浸襲を刺激した(Yangら、臨床及び実験病理学国際ジャーナル(Int. J. Clin. Exp. Pathol.)2(2009年)、361〜369頁)。最近、Huangら(Huangら、ネイチャー細胞生物学(Nat. Cell Biol.)10(2008年)、202〜120頁)は、miR−373及びmiR−520cが、CD44の抑制によってインビボ及びインビトロで腫瘍浸襲及び転移を促進することを実証することができた。興味深いことに、CD44発現の定常的及び定量的変化は、甲状腺腫瘍の増殖及び予後に関与していた。浸襲挙動が甲状腺腫瘍の異なる診断において極めて重要な意味があるので、実験は、甲状腺腺腫における両方のmiRNAクラスターの可能な上方制御についての疑問に答えるように実施した。
甲状腺腺腫における19q13転座の可能な標的としての2つクラスターのうちのいずれかの役割を評価するために、RT−PCRを使用して、19q13再編成を有する甲状腺腺腫の確立された5つの細胞株及び他のクローン異常を有する腺腫の3つの細胞株において、C19MCクラスターの3つのメンバー、すなわちmiR−512−5p、miR−517a及びmiR−519aの発現を比較した(表2を参照すること)。
19q13再編成がmiR−371−3クラスターの発現も活性化するかを見るために、このクラスターの3つのメンバーの発現を、前に使用した同じ試料において定量化した。19q13再編成を有する全ての腫瘍は、周囲の組織学的に正常な甲状腺組織(p値≦0,02236)の3つの試料及び細胞遺伝学的に正常な腺腫(p値≦0.01428)よりも有意に高いレベルのmiR−371−3p、miR−372及びmiR−373を発現することを示した(図5c)。次にmiR−371−3p、miR−372及びmiR−373の発現を細胞株で定量化して、同等の結果を得た(図5d)。興味深いことに、C19MCクラスターメンバーの発現が不在又は非常に低い細胞株S121は、miR−371−3クラスターの非常に高い発現を示し、したがって、この細胞株ではC19MCクラスターの一部が欠失しているという概念が更に強化された。
miRNAクラスターの活性化に関与する機構を更に理解するために、19q13群のうちの1つの細胞株を更に詳細に調査した。この細胞株は、明らかな平衡転座t(1;19)(1p35.2;q13.4)によりもたらされた染色体バンド19q13の再編成を示す(図6)。適切なBAC(細菌人工染色体)プローブによって、染色体1の切断点が、プミリオホモログ1(PUM1)内の領域まで絞られた(図7オンライン)。PUM1はRNA結合タンパク質をコードし、成人組織において広範囲の発現を示す。22個のエクソンを有し、染色体バンド1q35.2において約150kbに及んでいる(Spassov及びJurecic、遺伝子(Gene)299(2002年)、195〜204頁;Szaboら、ゲノム生物学(Genome Biol.)5(2004年)、R59)。転座によって、PUM1の近位部分はmiRNAクラスターと並列になる(図6)。したがって、3′RACE−PCRを使用して、PUM1の近位部分と染色体19の配列との間の可能性のある融合転写物を検出した。最初に、PUM1のエクソン1−10、続く染色体19の切断点領域の異所性配列からなる融合転写物を検出することが可能であった(ジェンバンクGQ334687に提出した)。この転写物の存在から、この細胞株における染色体切断は、PUM1のイントロン10内に位置することを結論付けることができた。したがって、RT−PCR実験は、エクソン10内の配列を順方向プライマー(プライマー:Ex9_Up(PUM1のエクソン10)CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG及びC19MCの後のプライマー:500−クラスター_ポリA_I CAACCGTTGGGGATTACAAAATAGA)として使用して実施し、それによって、境界がC19MCの遠位境界から明確に伸びている1つの融合転写物の一部を検出することが可能であった(ジェンバンク受入番号GQ334688;図6)。これらの結果から、細胞株S40.2において、両方のクラスターが、PUM1プロモーターにより誘導された大型PoI−II転写物の一部になったことを推定することが妥当であると思われる。異所性PoI−IIプロモーターによる活性化は、一般に、転座が両方のmiRNAクラスターを活性化する機構であり、近年の研究の結果(Bortolin−Cavailleら、核酸研究ジャーナル(J. Nucleic Acids Res.)37、(2009年)3464〜73頁)のように、大型PoI−II誘導転写からのC19MCクラスターのmiRNAの明確な「天然の」世代と一致する機構でありうる。
本明細書において実施された組織学的分析から、定義によると濾胞状癌の診断をもたらす、対応する腫瘍の浸襲性の証拠は見出されなかった。また、19q再編成を有さない腺腫と比較して、他の差は明確ではなかった。19q13.4を伴う平衡転座も、子供の希な良性腫瘍様病巣である肝臓の間葉性過誤腫(mesenchymal hamartoma)(MHL)に記載されており(Spelemanら、癌、遺伝学、細胞遺伝学(Cancer Genet. Cytogenet.)40(1989年)、29〜32頁)、より一般的には、染色体バンド19q13の切断は、多様なヒト新生物(例えば、小型細胞肺癌又は結腸癌)において報告されている。更に、CancerChromosomes/Mitelmanデータベース(NCB)によると、染色体バンド19q13は、まさに、ゲノムの染色体異常により最も頻繁に標的にされている領域に属する。したがって、これらのうちの幾つかが、まさに、本明細書において調査されるmiRNAクラスターの2つのうちいのいずれか又は両方も標的にするかは、依然として決定されていない。しかし、甲状腺上皮内における、数千の潜在的な標的を有する2つの重要な「胚」miRNAクラスターのクローン再発現は、甲状腺腺腫の大きなサブグループの発生に因果的に関連するという豊富な証拠が存在する。単一の標的を有するこれらのmiRNAの個別の効果はヒト腫瘍と関連しているが、機械学的には、観察される効果は、対応するmiRNAの単一標的の調節解除よりも遺伝子発現の網羅的変化によりもたらされる可能性が高い。
全RNAを、製造会社の説明書に従ってQIAGEN miRNEasy Mini Kit(QIAGEN、Hilden、Germany)を使用して、細胞株及び腫瘍組織から単離した。
結果を図8〜11に示す。
全RNAを、製造会社の説明書に従ってQIAGEN miRNEasy Mini Kit(QIAGEN、Hilden、Germany)を使用して、培養絨毛膜絨毛細胞から単離した。
結果を図12〜15に表す。
Claims (23)
- 被験者が、腫瘍を、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍を、有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料において少なくとも1つのマイクロRNA(miR)のレベルを測定することを含み、対照試料における対応するmiRのレベルと比べた試験試料におけるmiRのレベルの存在又は増加が、被験者が前記腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す、方法。
- 染色体再編成が転座である、請求項1記載の方法。
- 染色体再編成が染色体19に存在する、請求項1又は2記載の方法。
- 染色体再編成が染色体バンド19q13を伴う、請求項3記載の方法。
- miRが、切断点領域の近位に位置するmiRクラスターであるか、又はmiRクラスターに属する、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- miRクラスターが、C19MC又はmiR−371−3クラスターである、請求項5記載の方法。
- C19MCクラスターの少なくとも1つのmiR及びmiR−371−3クラスターの少なくとも1つのmiRのレベルが測定される、請求項6記載の方法。
- C19MCクラスターのmiRが、hsa−mir−371; hsa−miR−371−3p; hsa−miR−371−5p; hsa−miR−372; hsa−miR−373; hsa−miR−373*; hsa−mir−512−1; hsa−miR−512−5p; hsa−miR−512−3p; hsa−mir−512−2; hsa−miR−512−5p; hsa−miR−512−3p; hsa−mir−515−1; hsa−miR−515−5p; hsa−miR−515−3p; hsa−mir−515−2; hsa−miR−515−5p; hsa−miR−515−3p; hsa−mir−516a−1; hsa−miR−516a−5p; hsa−miR−516a−3p; hsa−mir−516a−2; hsa−miR−516a−5p; hsa−miR−516a−3p; hsa−mir−516b−1; hsa−miR−516b; hsa−miR−516b*; hsa−mir−518b; hsa−miR−517a; hsa−miR−517*; hsa−miR−517b; hsa−miR−517*; hsa−mir−517c; hsa−miR−517*; hsa−mir−518a−1; hsa−miR−518a−5p; hsa−miR−518a−3p; hsa−mir−518a−2; hsa−miR−518a−5p; hsa−miR−518a−3p; hsa−miR−518b; hsa−miR−518c; hsa−miR−518c*; hsa−mir−518d; hsa−miR−518d−5p; hsa−miR−518d−3p; hsa−miR−518e; hsa−miR−518e*; hsa−mir−518f; hsa−miR−518f*; hsa−mir−519a−1; hsa−miR−519a; hsa−miR−519a*; hsa−mir−519a−2; hsa−mir−519b; hsa−miR−519b−5p; hsa−miR−519b−3p; hsa−mir−519c; hsa−miR−519c−5p; hsa−miR−519c−3p; hsa−miR−519d; hsa−mir−519e; hsa−miR−519e; hsa−miR−519e*; hsa−mir−520a; hsa−miR−520a−5p; hsa−miR−520a−3p; hsa−miR−520b; hsa−mir−520c; hsa−miR−520c−5p; hsa−miR−520c−3p; hsa−mir−520d; hsa−miR−520d−5p; hsa−miR−520d−3p; hsa−mir−520e; hsa−miR−520f; hsa−miR−520g; hsa−miR−520h; hsa−mir−521−1; hsa−mir−521−2; hsa−miR−521; hsa−mir−522; hsa−miR−522*; hsa−mir−523; hsa−miR−523*; hsa−mir−524; hsa−miR−524−5p; hsa−miR−524−3p; hsa−mir−525; hsa−miR−525−5p; hsa−miR−525−3p; hsa−mir−526a−1; hsa−miR−526a; hsa−mir−526a−2; hsa−mir−526b; hsa−miR−526b*;又はhsa−miR−527;(表1も参照すること)である、請求項6又は7記載の方法。
- 腫瘍が、甲状腺の、腫瘍又は新生物(neoplasia)である、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 腫瘍が甲状腺腺腫である、請求項9記載の方法。
- 腫瘍が、被験者における1つ以上の予後マーカーと関連する、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 腫瘍が甲状腺腺腫であり、予後マーカーが7トリソミーである、請求項11記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 請求項8に定義されているmiRNAの発現レベルの増加により特徴付けられる甲状腺腫瘍のサブタイプの検出方法であって、好ましくは、請求項8に定義されているmiRNAの、検出と、場合により定量と、を含む、方法。
- 腫瘍に、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍に罹患している対象を治療するための医薬組成物であって、請求項1〜14のいずれか1項に定義されている少なくとも1つのmiRの発現を阻害すること又はmiRの活性の量若しくはレベルを減少することができる化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 被験者が、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法により診断される、請求項15記載の組成物。
- miRがmiR−373であり、腫瘍が、甲状腺の腫瘍又は新生物である、請求項16記載の組成物。
- 染色体再編成を伴う腫瘍の細胞の増殖を阻害する方法であって、
(i)腫瘍細胞において、好ましくは染色体再編成を有する腫瘍細胞において、対照細胞と比べて、発現が誘導又は増加される1つ以上のmiRの発現又は活性を阻害する1つ以上の作用物質を、細胞に導入すること;及び
(ii)1つ以上の作用物質がmiRの発現又は活性を阻害する条件下に細胞を維持し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害すること
を含む方法。 - 腫瘍に対する抗腫瘍剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供すること、及び染色体再編成を有する腫瘍細胞における発現レベルの増加に関連する少なくとも1つのmiRのレベルを測定することを含み、このとき細胞におけるmiRのレベルが、適切な対照細胞と比べて、減少することが、試験剤が抗腫瘍剤であること示す、方法。
- 腫瘍が、甲状腺の腫瘍又は新生物であり、細胞が甲状腺腺腫細胞である、請求項18又は19記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか1項に定義された1つ以上のmiRを検出するための1つ以上の試薬を含む、請求項1〜13又は18〜20のいずれか1項記載の方法において有用な、キット。
- 1つ以上の試薬が、請求項1〜21のいずれか1項に定義された1つ以上のmiRに特異的なプライマー及び請求項1〜21のいずれか1項に定義された1つ以上のmiRに特異的なプローブを含む群から選択される、請求項21記載のキット。
- 前記少なくとも1つのmiRが、miR−512−5p、miR−517a、miR−519a、miR−520c、miR−371−3p、miR−372及び/又はmiR−373を含む、請求項17〜20のいずれか1項記載の方法、又は請求項21〜22のいずれか1項記載のキット。
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