JP2022525407A - 低分子脱落遮断剤 - Google Patents

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Abstract

１００キロダルトン未満であり、細胞の表面上の膜免疫受容体に結合し、免疫受容体のタンパク質分解切断を阻害する薬剤が提供される。また、この薬剤を投与することを含む、がんを治療する方法および免疫療法を改善する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／９５４，８０２号、２０１９年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９４２，２４０号、および２０１９年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８１８，３５１号の優先権の利益を主張し、その内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、免疫調節および免疫療法の分野にある。
適応免疫システムは、主に抗原特異的ヘルパーＣＤ４＋および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を調整することにより、病原体およびがん細胞に対する調節および保護において重要な役割を果たす。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の耐久性のある持続的な活性化には、ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＡＰＣ上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチドとの関与、およびｉｉ）ＡＰＣによっても発現されるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）リガンドに結合するＴ細胞上の共刺激性ＣＤ２８受容体が関連する。ＣＤ２８共刺激の生物学的影響は数多くあり、免疫エフェクター機能を達成するために必要なしきい値を下げることによるＴ細胞周期の制御、拡大、分化、およびＴＣＲ刺激の増幅が含まれる。
活性化共刺激分子ＣＤ２８とは対照的に、構造的相同体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連４（ＣＴＬＡ－４）は、ＣＤ２８のトリガーによって駆動される膜発現を伴う抑制性共刺激受容体である。ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８はどちらも、Ｉ型の膜貫通タンパク質である。それらの細胞外部分は、膜貫通領域に近接するＩｇＶドメインの外側に位置するシステイン残基によってホモ共有結合されている１つのＶセット免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ－Ｖ）ドメインで構成されている。ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２８は、類似しているものの、親和性および四次構造配置の点で異なる。ＣＴＬＡ－４は、Ｂ７分子との結合親和性がより高く、ＣＤ２８とは異なる二量体化モードを有し、共有リガンドとの化学量論的結合が異なることが判明した。ＣＤ２８は一価の結合化学量論を示し、ＣＴＬＡ－４は二価の様式で相互作用する。したがって、ＣＴＬＡ－４はＣＤ２８よりもはるかに高い親和性および結合力でＢ７分子に結合し、その結果、Ｔ細胞応答を下方調節し、抗原特異的寛容の開始に有利となる。
いくつかの共刺激分子はいくつかの生理学的形態を有することが示されている。膜結合型に加えて、ナイーブ免疫細胞で発現する可溶型も報告されており、Ｔ細胞生物学の複雑さが増している。ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）の可溶型は、選択的にスプライシングされた遺伝子産物に起因するとされている。スプライシングイベントの結果、フレームシフトが発生し、翻訳が停止する前に１３７位のグリシンの後に２つのグルタミン酸残基が追加される。最終生成物は膜貫通領域および細胞質領域全体を欠失しており、重要なことに、二量体ＣＤ２８のジスルフィド結合を媒介する１４１位のシステイン残基が欠失している（Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉ Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９）。単量体ＣＤ２８可溶型の生物学的機能およびカウンター受容体結合が調査され（Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）、Ｔ細胞の増殖も阻害することが示された。それでも、二量体ｓＣＤ２８の場合、Ｂ７分子に結合することによりＴ細胞の機能を抑制するための調節的役割を有することが示唆されている（Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｃｅｎｔｒ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４、Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）。驚くべきことに、自己免疫疾患患者の血清中のｓＣＤ２８分子数の増加が報告されている（Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｋ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００５、Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ｋ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００５、Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４、Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４）。ｓＣＤ２８の明確な源は議論の的となっている。自己免疫患者のＴ細胞の持続性炎症状態を反映するＴ細胞活性化のインビトロモデルを使用して、Ｔ細胞活性化のプロセス中に代替の可溶型の転写が抑制され、ＣＤ２８の全長膜形態のみが明らかであり、一方培養中のｓＣＤ２８の量は増加することが示されている（Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）。この現象は、ＣＤ２８の膜形態の活発な脱落が血清中の可溶性分子の上昇の原因であるという提案につながったが、これはまだ証明されていない。Ｔ細胞活性化中の活発な脱落は、接着分子のタンパク質分解による持続的な活性化に対抗する調節メカニズムとして過去に説明されていた。
ＣＴＬＡ－４は初期Ｔ細胞応答の振幅を制限するが、別の阻害性受容体ＰＤ－１は末梢のＴ細胞機能を抑制する。ＰＤ－１の発現はＴ細胞の活性化中に上昇し、その既知のリガンドはＢ７ファミリーホモログ：Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）およびＢ７－Ｈ２（ＰＤ－Ｌ２）である。これらのホモログは、ＡＰＣおよびがん細胞に見られ、活性化されたＴ細胞を細胞アネルギーの状態にして、免疫応答を弱める。したがって、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸に対する標的療法は、様々な種類のがんで臨床活性を示している。最近の研究では、ＣＤ２８のシグナル伝達経路がＰＤ－１によって標的化および抑制されることが示され（Ｈｕｉ，Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７）、同時に、効果的なＰＤ－１療法を行うためには、無傷の活性なＣＤ２８／Ｂ７軸が不可欠であることが示されている（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ，Ａ．Ｏ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７）。
しかしながら、すべての患者がＰＤ－１に基づく免疫療法または一般的な免疫療法に応答するわけではなく、またしばしば再発する。したがって、患者の免疫細胞ががんを攻撃する能力を改善することができる方法および分子が大いに必要とされている。
本発明は、細胞表面上の膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する１００キロダルトン未満の薬剤を提供する。また、薬剤を投与することを含む、がんを処置および予防する方法、ならびにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法も提供される。
第１の態様によれば、細胞の表面上の膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤が提供され、この薬剤は、１００キロダルトン（ｋＤａ）未満である。
別の態様によれば、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルの減少を必要とする対象において、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させる方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様によれば、がんの治療および／または予防を必要とする対象において、がんを治療および／または予防する方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様によれば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法の改善を必要とする対象において、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様によれば、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する方法が提供され、方法は、
ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
ｂ．取得された薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
ｃ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、
ならびに
ｄ．薬剤をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクターを含む宿主細胞を培養すること、
のうちの少なくとも１つを含み、核酸配列が、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
ｉｉ．取得された薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
ｉｉｉ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、によって選択された薬剤の核酸配列であり、
それによって、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する。
別の態様によれば、本発明の方法により生成される薬剤が提供される。
別の態様によれば、医薬組成物が提供され、本発明の薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む。
別の態様によれば、がんを治療および／もしくは予防する、ＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善する、またはｓＣＤ２８レベルを低減することを必要とする対象においてそれを行う方法が提供され、本方法は、本発明の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様によれば、本発明の少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、５０ｋＤａ未満である。
いくつかの実施形態によれば、単一ドメイン抗体は、ラクダ抗体またはサメ抗体である。
いくつかの実施形態によれば、ラクダ抗体は、３つのＣＤＲを含み、
ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３５（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）に示されるアミノ酸配列を含むか、
ＣＤＲ１は、配列番号３６（ＩＮＡＭＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３７（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含むか、または
ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３９（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、ラクダ抗体は、
ａ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３０）、
ｂ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１）、および
ｃ．ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３２）からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１７（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１８（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１９（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２０（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２１（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２２（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ヒト化されている。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストではない。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８アンタゴニストではない。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ｍＣＤ２８を分解することも、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を阻害することもない。
いくつかの実施形態によれば、抗体の抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しない。
一部の実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８のストーク領域内に結合する。
いくつかの実施形態によれば、ストーク領域は、アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）またはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号２７）を含む。
いくつかの実施形態によれば、ストーク領域は、アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼのための切断部位に結合する。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する。
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのプロテアーゼは、少なくとも１つのメタロプロテアーゼである。
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態によれば、対象は、がんに罹患している。
いくつかの実施形態によれば、がんは、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がんおよび結腸直腸がんから選択される。
いくつかの実施形態によれば、がんは、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、および結腸直腸がんから選択される。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない。
いくつかの実施形態によれば、投与前の対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。
いくつかの実施形態によれば、取得することは、５０ｋＤａ未満の薬剤を取得することであり、取得された薬剤は、５０ｋＤａ未満である。
いくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞表面上のｍＣＤ２８のプロテアーゼによる切断を遮断する薬剤の能力を試験することをさらに含む。
いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２およびＭＭＰ－１３から選択される。
いくつかの実施形態によれば、薬剤を取得することは、
ａ．サメまたはラクダ科動物を、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で免疫化し、免疫化された生物から抗体を収集すること、および
ｂ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片への結合について薬剤のライブラリをスクリーニングし、結合する薬剤を選択すること
のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片は、二量体または単量体である。
いくつかの実施形態によれば、
ａ．抗体を収集することが、免疫化されたサメまたはラクダ科動物の脾臓からＢ細胞を抽出することを含むか、または
ｂ．結合する薬剤を選択することが、選択された薬剤を配列決定し、配列から薬剤の組換え形態を生成することを含む。
いくつかの実施形態によれば、本方法は、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。
いくつかの実施形態によれば、キットは、
ａ．抗ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１免疫療法、ならびに
ｂ．本発明の薬剤がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法とともに使用するためのものであることを示すラベル、
のうちの少なくとも１つをさらに含む。
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられると理解すべきである。
ＰＢＭＣの刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成され、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）の添加により中和される。ヒトＣＤ２８ ＥＬＩＳＡで定量化された、ＳＥＢ（０．５ｎｇ／ｍＬ、左側）またはＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ、右側）で刺激されたＰＢＭＣの培養物における可溶性ＣＤ２８の量の棒グラフ（上部パネル）である。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを指示された濃度で加えた。全体的な健康およびエフェクター活性は、インターフェロンγの分泌によって検査された（下のパネル）。 ＰＨＡによるＴ細胞の刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成され、プロテアーゼ阻害剤の添加により中和される。一定濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル（２μＭ）の存在下、増加濃度のＰＨＡ（１～４μｇ／ｍＬ、上のグラフ）で刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞（左上）または単離されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞（右上）の棒グラフである。別のセットアップでは、ＰＨＡ濃度を固定してＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１μｇ／ｍＬ ＰＨＡ、左下）またはヒトＣＤ４ Ｔ細胞（２μｇ／ｍＬ ＰＨＡ、右下）を刺激し、プロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度を調整した（０．５～２μＭ）。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。 特定のＡＤＡＭ－１０およびＡＤＡＭ－１７阻害剤は、ＳＥＢによるヒトＰＢＭＣの活性化中に可溶性ＣＤ２８の蓄積を排除するが、その生存能を妨げない。（３Ａ～Ｂ）様々な濃度（０．０１～１μＭ）の（３Ａ）ＡＤＡＭ－１０特異的阻害剤（ＧＩ２５４０２３Ｘ）および（３Ｂ）ＡＤＡＭ－１７特異的阻害剤（ＴＭＩ－１）の存在下での、ＳＥＢ（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。異なる処理における細胞の生存能を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した（上部パネル）。上清中のヒトＣＤ２８（下のパネル）の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。 ＰＢＭＣの刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成される。（４Ａ）ＣＭＶを含まない（黒い棒）、またはＣＭＶペプチドを含む（暗い灰色の棒）同じドナーからのＣＤ３ Ｔ細胞と１：５の比率で混合された未成熟樹状細胞の棒グラフ。単独またはＣＭＶを使用した各細胞集団の制御は、薄い灰色の棒で表示される。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。（図４Ｂ～図４Ｄ）ＡＤＡＭ－１０およびＡＤＡＭ－１７阻害剤の存在下で、（４Ｂ）ＣＭＶ、または（４Ｃ）ＳＥＢ、または（４Ｄ）のＳＥＢで２４の間刺激され、次いできれいな培養に移されたヒトＰＢＭＣの棒グラフ。図４Ｄの測定値は、細胞を移してから１２０時間後である。 可溶性ＣＤ２８は、エフェクターサイトカインの分泌を阻害する。組換えヒトＣＤ２８を含まない（黒い棒）、または指定濃度で含む（灰色の棒）ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示されている。上清中のヒトＩＦＮガンマの濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。 可溶性ＣＤ２８は、ＩＬ－６サイトカインの分泌を増加させる。組換えヒト可溶性ＣＤ２８を含まない（黒い棒）、または示された濃度で含む（灰色の棒）ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激したヒトＰＢＭＣの棒グラフである。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示されている。上清中のヒトＩＬ－６の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。 （７Ａ）示された濃度の組換えヒト可溶性ＣＤ２８（灰色の三角形）または組換えヒト可溶性ＣＴＬＡ－４（黒色の円）の存在下、ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの折れ線グラフである。上清中のヒトＩＬ－６、ＩＦＮγおよびＩＬ－４の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。上清中のヒトＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ（４０）およびＩＬ－１０の濃度は、Ｍａｇｐｉｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したマルチプレックス分析で定量化された。（７Ｂ）自己単球およびＣＤ３ ＭＬＲからのサイトカイン分泌の棒グラフ。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示されている。ＣＭＶ単独またはＩｇＧ対照を使用した場合は、黒い棒で示される。ｓＣＤ２８の濃度の増加は、濃い灰色のバーで示される。（７Ｃ）組換えヒト可溶性ＣＤ２８の存在下、ＳＥＢで刺激された（灰色の円）、または対照ＩｇＧ（灰色の三角形）で刺激されたヒトＰＢＭＣによるリンパ球のクラスタ形成の線グラフである。（７Ｄ）組換えヒトｓＣＤ２８あり、またはなしで処理された単球からのキヌレニンＥＬＩＳＡキットによって測定された培養物へのＩＤＯ分泌の棒グラフである。（７Ｅ）組換えヒトｓＣＤ２８あり、またはなしで処理された単球におけるＩＤＯの細胞内ＦＡＣＳの散布図である。 可溶性ＣＤ２８は、抗ＰＤ１処置を阻害する。（８Ａ）抗ＰＤ１（ＭＫ３４７５、５μｇ／ｍＬ、黒色の棒）または組換えヒト可溶性ＣＤ２８（２および１０μｇ／ｍＬ、灰色の棒）または両方の組み合わせ（点付きの棒）の存在下で、ＳＥＢ（２００ｎｇ／ｍＬ、左側のグラフ）またはＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ、右側のグラフ）で３日間刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。（８Ｂ）単球ＭＬＲ設定からのサイトカイン分泌の棒グラフである（ナイーブ－白い棒、ＣＭＶのみ－薄い灰色の棒、ｓＣＤ２８－黒色の棒、ＭＫ－３４７５－濃い灰色、ｓＣＤ２８＋ＭＫ－３４７５－格子の棒）。上清中のヒトＩＦＮγ、ＴＧＦβおよびＩＬ－２の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。（８Ｃ）対照およびｓＣＤ２８とのインキュベーション後の単球における表面ＰＤ－Ｌ１（左）およびＰＤ－Ｌ２（右）発現のヒストグラムである。 がん患者における可溶性ＣＤ２８。（９Ａ）可溶性ヒトＣＤ２８の存在について調査された１０のがんの徴候および健康なドナーの各々における２０の血漿試料を示すドットプロット。可溶性ＣＤ２８の含有量が高い試料は、いくつかの希釈係数で繰り返し調査された。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、ヒト血漿試料からの読み取り値に対応するために内部で補正された標準化サンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。（９Ｂ）ｓＣＤ２８、ＭＫ－３４７５およびその２つの組み合わせの存在下で、がん患者（肉腫患者－左上、腎臓がん患者－右上、および２名の異なる頭頸部がん患者－下）のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからサンドイッチＥＬＩＳＡで測定されたＩＮＦγ分泌の棒グラフである。（９Ｃ）単独、ＩＬ－６との併用、単球との共培養または単球およびｓＣＤ２８との共培養における、がん細胞ＳＣＣ－２５の生存能および増殖の棒グラフである。 （１０Ａ）一定のＣＤ８０－Ｆｃレベルおよび可溶性ＣＤ２８滴定の存在下、抗ＣＤ３で刺激された単離されたＣＤ３ Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌の棒グラフである。（１０Ｂ）一定のｓＣＤ２８レベルおよびＣＤ８０－Ｆｃ滴定の存在下、ＣＭＶで刺激された単離されたＰＢＭＣである。 （１１Ａ～図Ｂ）組換えマウスＣＤ２８の投与なし（１１Ａ）および投与あり（１１Ｂ）で、抗ＰＤ－１抗体で処理された免疫適格マウスにおける接種されたＨ２２細胞の腫瘍体積の折れ線グラフである。 （１２Ａ）ＢＳＡ結合ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（右）および組換えヒトＣＤ２８タンパク質（左）へのクローンＭ９の段階希釈による抗原結合を示す折れ線グラフである。抗原は、ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートに固定化された。クローンＭ９の一連の希釈を行い、結合した抗体の検出をロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰおよびＴＭＢによる発色で行った。（１２Ｂ）組換えヒトｓＣＤ２８（左）およびＳＥＢで活性化されたヒトＰＢＭＣから脱落したｓＣＤ２８（右）のＥＬＩＳＡ検出の棒グラフ。ＥＬＩＳＡでは、陽性対照として抗体＃３（２μｇ／ｍＬ、灰色の棒）、陰性対照として無関係な抗体Ｍ３９（１０μｇ／ｍＬ、濃い灰色の棒）、および抗切断抗体Ｍ９（１０μｇ／ｍＬ、黒色の棒）が使用された。組換えＣＤ２８または脱落したＣＤ２８の検出は、ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍＬ）に結合したＥＬＩＳＡキット検出抗体を使用することによって行われた。（１２Ｃ）マウスＨＥＫ２９３細胞で発現されたヒトＣＤ２８への抗体Ｍ９（上）および対照抗体ＣＤ２８．２（下）の、１０μｇ／ｍｌの固定濃度での結合を示すヒストグラム（黒色のヒストグラム）。ポリクローナルマウスＩｇＧを陰性対照として使用し（１０μｇ／ｍｌ）、灰色のヒストグラムに示されている。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ヤギ抗マウスの二次インキュベーションによって検出を行った。 ＥＬＩＳＡによるヒトＣＤ２８ストーク領域配列への結合。異なるＶＨＨクローンの段階希釈による抗原結合の分析。抗原として機能するビオチン結合ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレート上で固定化した。ＶＨＨクローンの段階希釈を行い、結合したＶＨＨの検出を抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰ結合抗体で行い、発色をＴＭＢで行った。 ＶＨＨ＃２Ａ１の、ヒト膜ＣＤ２８への結合。ＦＩＴＣ結合ＶＨＨクローン２Ａ１（５０μｇ／ｍＬ、黒色のヒストグラム）およびＦＩＴＣ結合アイソタイプ対照（ｍＩｇＧ、５０μｇ／ｍＬ、灰色のヒストグラム）を、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞とともにインキュベートした。結合は、ＦＡＣＳ分析によって評価した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローンは、膜ＣＤ２８へのリガンド結合を遮断しない。ヒトＣＤ２８を発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７に結合された二次抗ヒトＦｃ抗体を使用して、ＣＤ８６－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）結合についてフローサイトメトリーによって監視した。抗ＣＤ２８ＶＨＨクローンをＣＤ８６－Ｆｃ（３０μｇ／ｍＬ、黒色のヒストグラム）に添加しても、ＣＤ８６結合の大きさは変化しなかったが、市販の抗体クローンＣＤ２８．２（１０μｇ／ｍＬ、左上のグラフ、黒色のヒストグラム）の添加により、結合が有意に減少した。 抗ＣＤ２８ＶＨＨクローンのアゴニスト効果の評価。ヒト単離ＣＤ３細胞を、陽性対照として機能する抗ＣＤ２８アゴニスト抗体クローン２８．２（２μｇ／ｍＬ、濃い灰色の棒）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨ、または無関係なＶＨＨクローン（２０μｇ／ｍＬ、黒色の棒）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄い灰色の棒）で２日間刺激した。上清中のヒトＩＮＦγの濃度を、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量した。 ＶＨＨクローンによるヒトＣＤ２８ストーク領域のＭＭＰ－２媒介性切断のインビトロ遮断。ｃ－Ｍｙｃ結合およびビオチン化ヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（１μＭ）を、ＭＭＰ－２阻害剤（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ）、様々な濃度（０．４～１０μｇ／ｍＬ）のＭ９ Ｆａｂ、または示されたＶＨＨクローンの存在下で、５０ｎｇのｒｈＭＭＰ－２とともに５時間インキュベートした。混合物を、ニュートラアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートにロードし、続いて十分に洗浄し、抗ｃＭｙｃＨＲＰ結合抗体によってインタクトなペプチドを検出し、ＴＭＢを用いて現像を行った。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞において、ＣＤ２８の脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルは、４８時間のインキュベーション後、ヒトＣＤ２８を安定的に発現するＨＥＫ細胞の培養培地で測定された。ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色の棒）、無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色の棒）、または様々な濃度（３．３～１００μｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ２８ストーク領域のＶＨＨクローン（黒色の棒）の、可溶性ＣＤ２８のレベルに対する効果が示されている。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルは、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、ＰＨＡおよびＩＬ２によって活性化された単離ＣＤ４Ｔ細胞におけるＣＤ２８脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルを、５μｇ／ｍＬのＰＨＡおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（薄い灰色の棒）で刺激された単離されたヒトＣＤ４Ｔ細胞の培養培地で測定した。様々な濃度（０．４～５０μｇ／ｍＬ）の抗体Ｍ９クローン（黒色の棒）のＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色の棒）、無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色の棒）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローンまたはＦａｂフォーマットの異なる処理の、可溶性ＣＤ２８の量に対する効果を示す。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルは、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、スーパー抗原によって活性化されたＰＢＭＣにおけるＣＤ２８脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルを、１ｎｇ／ｍＬ ＳＥＢ（薄い灰色の棒）で刺激された単離ＰＢＭＣの培養培地で測定した。ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色の棒）、様々な濃度（０．４～５０μｇ／ｍＬ）の無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色の棒）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン、またはＭ９クローンのＦａｂフォーマット（黒色の棒）の、可溶性ＣＤ２８の量に対する、異なる処理の効果が示されている。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルは、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ＶＨＨクローンのアンタゴニスト効果の評価。ヒト単離ＣＤ３細胞を、ＣＤ２８共刺激のリガンドとして機能する組換えＣＤ８０－Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ、濃い灰色の棒）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄い灰色の棒）で２４時間刺激した。無関係なＶＨＨクローン（左上のグラフ）または抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨを様々な濃度で添加した（３．７５～３０μｇ／ｍＬ、黒色の棒）。上清中のヒトＩＬ－２の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量した。 ＭＭＰ－１３によるヒトＣＤ２８ストーク領域の切断に対するＶＨＨクローン２Ａ１のインビトロ遮断活性。ｃ－Ｍｙｃおよびビオチン化ヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（１μＭ）を、ＭＭＰｉ（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ、濃い灰色の棒）、様々な濃度（０．６２～１０μｇ／ｍＬ）の無関係なＶＨＨクローン（左のグラフの黒色の棒）、またはＶＨＨクローン２Ａ１（右のグラフの黒色の棒）の存在下で、５０ｎｇのｒｈＭＭＰ－１３（薄い灰色の棒）とともに５時間インキュベートした。混合物を、ニュートラアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートにロードし、続いて十分に洗浄し、抗ｃＭｙｃ－ＨＲＰ結合抗体によってインタクトなペプチドを検出し、ＴＭＢを用いて現像を行った。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１、４Ａ１および４Ａ４は、ヒトＣＤ２８のＭＭＰ切断部位に特異的に結合する。直接ＥＬＩＳＡによる、ヒトＣＤ２８ストーク領域ＷＴ配列またはＬ１４５Ｋ変異配列のいずれかへのＶＨＨクローンの特異的結合の比較。ビオチン結合野生型またはＬ１４５Ｋ ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレート上に固定化した。ＶＨＨクローン（０．２～５μｇ／ｍＬ）および無関係なＶＨＨクローン（左上のグラフ）の一連の希釈を行い、結合したＶＨＨの検出は、抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰ結合抗体を用いて行い、ＴＭＢを用いて現像を行った。
本発明は、いくつかの実施形態において、細胞表面上の膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する、１００キロダルトン（ｋＤａ）未満の薬剤を提供する。また、本発明の薬剤を投与することを含む、対象においてがんを治療し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善し、ｓＣＤ２８レベルを減少させる方法も提供される。本発明の薬剤および方法は、ｍＣＤ２８の切断部位に対する完全長抗体が膜近位領域にアクセスするには大きすぎるため、脱落を阻害することができないという驚くべき発見に基づいている。むしろ、細胞表面上のｍＣＤ２８に対する特異性を有するより小さい薬剤が必要である。さらに、多数のがん患者は、ｓＣＤ２８脱落によって引き起こされるそれらの血流中で上昇したレベルのｓＣＤ２８を有する。このｓＣＤ２８は免疫抑制剤として機能し、したがって、脱落の低減は、ｓＣＤ２８による阻害を減少させ、ｍＣＤ２８シグナル伝達を介して免疫活性化を増加させるという二重の利益を有する。さらに、ｓＣＤ２８がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を阻害し得ることが予想外に発見された。
薬剤
第１の態様によれば、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤が提供される。
いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、細胞表面にある。いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、膜内にある。いくつかの実施形態において、薬剤は、全長抗体ではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＩｇＧではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、１００キロダルトン（ｋＤａ）未満である。いくつかの実施形態において、薬剤は、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５ｋＤａ未満である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、５０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、薬剤は、２５ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、薬剤は、２０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、薬剤は、１５ｋＤａ未満である。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８は、哺乳動物のＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、成熟ＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠失し、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２）を含む。
いくつかの実施形態において、全長ヒトＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号３）を含む。
本明細書で使用される場合、ｓＣＤ２８は、膜貫通ドメインを含まず、したがって膜に組み込むことができない任意のＣＤ２８断片または変異体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、膜結合されていない。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、溶液中にある。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、血液中のＣＤ２８である。いくつかの態様において、ｓＣＤ２８は、ＴＭＥ中のＣＤ２８である。いくつかの態様において、ｓＣＤ２８は、体液中のＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３を欠失している。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングする選択的スプライシングから生じるスプライス変異体である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）からの切断産物である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、短縮型ＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、全長ＣＤ２８の細胞質ドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、二量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、単量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８の選択的スプライシングから生じるスプライス変異体ではない。いくつかの態様において、選択的スプライシングは、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングする。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、配列番号５のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠失し、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、配列番号６のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰ（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、配列番号４８のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠失し、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰ（配列番号４９）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、配列番号４９のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、ヒトｓＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号７）を含む。
免疫細胞に対するｓＣＤ２８の効果は、当技術分野で周知であり、非限定的な例としては、ＩＬ－１０またはＴＧＦβなどの抗炎症誘発性サイトカインの免疫細胞誘導、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の免疫細胞発現、およびＩＬ－２またはＩＦＮ－γなどの炎症誘発性サイトカインの免疫細胞下方制御が挙げられる。いくつかの実施形態において、膜ＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤は、ｓＣＤ２８の生成を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８の生成を阻害することは、免疫細胞に対するｓＣＤ２８の阻害効果を含む。
本明細書で使用される場合、タンパク質分解切断の阻害とは、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断の任意の低減を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の切断の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを維持する。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを増加させる。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫刺激に適切なｍＣＤ２８のレベルを維持する。
いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の低減は、少なくとも１つのプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の低減は、少なくとも１つのメタロプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２またはＭＭＰ－１３である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆａｂ断片である。いくつかの実施形態において、薬剤は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合するペプチドである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆｃドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆｃドメインを欠失した抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ラクダ科動物、サメまたはナノボディである。いくつかの実施形態において、抗体または断片は、別のタンパク質またはタンパク質の断片に融合される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質または断片は、特に血清中での半減期を増加させる。いくつかの実施形態において、半減期延長タンパク質は、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、薬剤は、半減期を向上させる修飾を生成する化学物質によって修飾される。いくつかの実施形態において、修飾はペグ化であり、化学物質はポリエチレングリコールである。当業者には、当技術分野で知られている任意の半減期を延長するタンパク質または化学薬剤、または修飾を使用できることが理解される。
薬剤の例には、抗体、抗体の抗原結合断片、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎから選択される。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびＣＤ２８に特異的に結合するペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ナノボディである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＶＨＨ抗体である。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」および「ＶＨＨ抗体」という用語は同義であり、互換的に使用される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＣＤ２８への特異的結合を有する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８への特異的結合を有するペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨ抗体および抗体模倣物から選択される。本明細書で使用される場合、「抗体模倣物」という用語は、標的抗原に特異的に結合することができる有機化合物を指す。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、構造的に抗体に関連しない。抗体模倣物の例には、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰＳが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、ＤＡＲＰｉｎである。これらの薬剤はすべて当技術分野で周知であり、受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するのに有用であることが知られている。ｍＣＤ２８に結合できる小分子およびタンパク質は、切断部位を遮蔽し得る、またはプロテアーゼの障害をもたらす、もしくはそのアクセスを損ない得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体模倣物である。本明細書で使用される場合、「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を指す。ＤＡＲＰｉｎは、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質であり、一般的にタンパク質標的に非常に特異的である。したがって、ＣＤ２８のＤＡＲＰｉｎは、薬剤の一例である。
いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、約５０ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、１００ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、８０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、７０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、５０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、５０ｋＤａ以下のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、約２５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、５０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、４０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、３０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、２５ｋＤａ以下のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、約１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１０～１７ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１０～１６ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１０～１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１２～１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１２～１６ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１２～１７ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、２０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、１５ｋＤａ以下のサイズを含む。そのサイズが小さく、ＣＤＲがわずか３つであるために、単一ドメイン抗体は、凸状の形状を含み、そのエピトープを一方からのみ結合する。比較すると、Ｆａｂ断片および単鎖抗体は、６つのＣＤＲを含み、少なくとも２つの側からエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、３つのＣＤＲのみでの結合は、６つのＣＤＲでの結合と比較して、ｍＣＤ２８ストーク領域への優れたアクセスを可能にする。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体結合の幾何学的形状は、ｍＣＤ２８ストーク領域へのアクセスに関して優れている。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。抗体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアを含む四量体形態を有し、各ペアは１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、単独または他のアミノ酸配列との組み合わせた、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト、多特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプ、および可溶または結合型で標識できる抗体、ならびに、エピトープ結合断片、その変異体または誘導体を含む断片であってもよい。抗体は、いかなる種からのものであってもよい。抗体という用語には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがそれらに限定されない結合断片も含まれる。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。抗体断片は、Ｆｃ領域またはその断片を含むがそれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてもよく、または融合されなくてもよい。当業者には、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合を含むがそれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることがさらに理解される。
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
自然に発生する抗体構造の基本単位は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成され、非共有結合およびジスルフィド結合の両方で結合されている。各重鎖および軽鎖には、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋もある。５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）が存在し、これらのクラス内の様々なサブクラスは、単一の抗体分子内の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の違い等の構造の違いに基づいて認識される。抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５または５０ｋＤａ未満のサイズを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、５０ｋＤａ未満のサイズを有する。
重鎖および軽鎖のアミノ末端領域は、カルボキシ末端領域よりも配列が多様であり、したがって可変ドメインと呼ばれる。抗体構造のこの部分は、抗体の抗原結合特異性を付与する。重可変（ＶＨ）ドメインおよび軽可変（ＶＬ）ドメインは一緒に単一の抗原結合部位を形成し、したがって基本的な免疫グロブリン単位には２つの抗原結合部位がある。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１－６３（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ４５９２－４５９６）。
重鎖および軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬを形成する。これらのドメインの多様性ははるかに低いが、動物種ごとに違いがあり、さらに同じ個体内でそれぞれ異なる機能を有するいくつかの異なる抗体のアイソタイプがある。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義される超可変領域アミノ酸残基以外の、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
免疫グロブリン可変ドメインは、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析して、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊ６：Ｗ５０３－５０８（２００８）を参照されたい。
Ｃｈｏｔｈｉａらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えて実験データに依存することなく、この「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用すされる場合、「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」とは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ”（１９８９）に記載のナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」および「単鎖可変断片」という用語は同義的に使用され、短いペプチドリンカーによって連結された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、または２０ｋＤａ未満のサイズを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを有する。いくつかの実施形態において、単鎖抗体のリンカーは、１０～２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１～４０、５～４０、１０～４０、１～３５、５～３５、１０～３５、１～３０、５～３０、１０～３０、１～２５、５～２５、または１０～２５個のアミノ酸である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、抗体Ｍ９の重鎖を含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、抗体Ｍ９の軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、単鎖抗体は、抗体Ｍ９のＣＤＲを含む。
本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」、および「ＶＨＨ」という用語は、同義的に使用され、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ラクダ抗体である。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラクダ、アルパカまたはラマである。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラクダである。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、アルパカである。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラマである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、サメ抗体である。
また、本明細書で既に示されたように、ナノボディのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって与えられているＶＨに関する一般的な番号付けに従って番号付けられ、Ｃａｍｅｌｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ Ｊｕｎ．２３；２４０（１－２）：１８５－１９５の論文におけるラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用される。この番号付けによれば、ナノボディのＦＲ１は、１～３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は、３１～３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６～４９位のアミノ酸を含み、ナノボディのＣＤＲ２は、５０～６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は、６６～９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は、９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は、１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。この点では、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変化し得、Ｋａｂａｔ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに留意されたい（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる１つ以上の位置は、実際の配列において占有されていない場合があるか、または実際の配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）。これは、一般に、Ｋａｂａｔによる番号付けが、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応するか、または対応しない場合があることを意味する。しかしながら、一般に、Ｋａｂａｔの番号付けにより、ＣＤＲ内のアミノ酸残基の数に関係なく、Ｋａｂａｔの番号付けによる１位がＦＲ１の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔの番号付けによる３６位がＦＲ２の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔの番号付けによる６６位がＦＲ３の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔの番号付けによる１０３位がＦＲ４の開始に対応し、その逆も同様であると言える。
ＶＨドメインのアミノ酸残基の番号付けのための代替的な方法は、ラクダ科動物由来のＶＨＨドメインおよびナノボディにも同様の方法で適用され得る方法であり、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３（１９８９））、いわゆる「ＡｂＭ定義」およびいわゆる「接触定義」によって記載されている方法である。しかしながら、本説明、態様、および図において、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔによる番号付けは、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによるＶＨＨドメインに適用される。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列がヒト抗体との類似性を高めるように改変されている非ヒト種由来の抗体を指す。ヒト化抗体は、ヒト抗体に類似する配列により囲まれた非ヒト抗体のＣＤＲをコードする組換えＤＮＡの生成により生成され得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化は、本発明のＣＤＲをヒト抗体足場または骨格に挿入することを含む。ヒト化抗体は、当技術分野で周知であり、本発明のＣＤＲを保持するそれらを生成する任意の方法が使用され得る。
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能な変異体を除いて同一であり、および／または同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の調製方法によって生成されると解釈されるべきではない。本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂをインビボ産生で得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスチンで刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入して、高濃度の所望のｍＡｂを含む腹水を産生する。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、かかる腹水から、または培養上清から精製することができる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））、ワンアーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子、抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ、またはタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）－ｓｃＦｖ）、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成され、それぞれ単一の抗原結合部位、および残留「Ｆｃ」断片を有し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、しっかり共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。ＶＨ－ＶＬ二量体の３つの表面はこの構成である。総合的に、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を保持するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを持つＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に区別できるタイプの１つに割り当てることができる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。インタクトな抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、ａ、δ、ｅ、γ、μと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。同じ鎖の２つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディの生成は当技術分野で知られており、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）に記載されている。
「多重特異性抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、ポリエピトープ特異性を有する抗体を包含する。そのような多重特異性抗体には、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合した２つ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合した２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能性抗体、共有結合または非共有結合した抗体断片等の抗体断片が含まれるが、それらに限定されない「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して調製され得る。例としては、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ，ｐｇ．７７－９６ ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）などの様々な技術が挙げられる。
抗体をインビボで産生する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を使用してインビトロで生成され得る。そのような組換え抗体の生成は、従来の抗体生成と比較してはるかに速く、それらは膨大な数の抗原に対して生成され得る。さらに、従来の方法を使用する場合、多くの抗原は非免疫原性または非常に毒性があることが判明しているため、動物での抗体の生成には使用できない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性および特異性の増加）は非常に単純で比較的速い。最後に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体が、１回の選択手順で生成され得る。組換えモノクローナル抗体を生成するには、ディスプレイライブラリに基づく様々な方法を使用して、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールが生成され得る。そのようなライブラリは、いくつかの方法で作製され得る：合成ＣＤＲ３領域を重鎖生殖細胞系列遺伝子のプールにクローニングすることで合成レパートリーを生成することによって、多くの抗体レパートリーを生成し、それから様々な特異性を有する組換え抗体断片を選択することができる。ヒトのリンパ球プールを、抗体ライブラリ構築の出発材料として使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、したがって多様性の高いヒトライブラリを作成することが可能である。この方法は、様々な抗原に対する多数の抗体を選択するために広く成功裏に使用されている。バクテリオファージライブラリの構築および組換え抗体の選択のためのプロトコルは、周知の参考テキストであるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２－２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ １７．１に記載されている。
非ヒト抗体は、当技術分野で知られている任意の方法によってヒト化することができる。１つの方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入される。次いで、抗体フレームワークにさらなる変更を導入して、親和性または免疫原性を調節することができる。
いくつかの実施形態において、抗体およびその一部には、抗体、抗体の断片、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗原結合組換え断片および天然ナノボディが含まれる。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、またはｓｃＦＶ２断片からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合部分をコードする核酸配列を提供する。
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖等の免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）も含む。典型的には、３つの定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびに「ヒンジ」領域を含む。いくつかの状況では、定常領域の存在が望ましい。
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＣＨＩ等の抗原結合抗体断片を含み、ＣＫまたはＣＬドメインは切除されている。ミニボディは従来の抗体よりも小さいため、臨床／診断における使用での組織浸透性が向上するはずであるが、二価であることから、ｄＡｂ等の一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈により別段に示されない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子全体だけでなく、上記で議論したタイプの抗原結合抗体断片も包含する。コードされたポリペプチドに存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。開示されたタンパク質生成物を構成する個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
適切には、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単離および／または精製され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせ、またはそれらの文法上の変形は、当業者によって「自然に発生している」と十分に理解されている、あるいは任意の時点で判定者または行政機関または司法機関によって「自然に発生している」と判断もしくは解釈される、または判断もしくは解釈され得る、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけの条件語である。
別の態様により、３つのＣＤＲを含む薬剤が提供され、ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３５（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様により、３つのＣＤＲを含む薬剤が提供され、ＣＤＲ１は、配列番号３６（ＩＮＡＭＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３７（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様により、３つのＣＤＲを含む薬剤が提供され、ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３９（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ａｂｍ法の番号付けに従って番号付けされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法の番号付けに従って番号付けされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法の番号付けに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１は、配列番号４１（ＩＮＡＭＸ１）に示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＧまたはＡである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ２は、配列番号４２（ＡＩＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＸ４ＴＸ５ＹＡＸ６ＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、ＧまたはＳであり、Ｘ３は、ＧまたはＳであり、Ｘ４は、ＤまたはＳであり、Ｘ５は、ＹまたはＮであり、Ｘ６は、ＤまたはＮである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、配列番号４３（ＤＸ１ＹＧＸ２ＤＹＷＸ３）に示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＥまたはＬであり、Ｘ２は、ＥまたはＳであり、Ｘ３は、ＤまたはＩである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、配列番号４４（ＤＸ１ＹＧＳＤＹＷＸ２）に示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＥまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＩである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＶＨＨ抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ラクダ抗体である。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラマである。いくつかの実施形態において、薬剤は、上記に列挙されるＣＤＲ以外の他のＣＤＲを含まない。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３０）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３２）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨＨ配列は、Ｈｉｓタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヒスチジン残基である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、６個のヒスチジン残基からなる。いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、リンカーを介してＶＨＨに連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニンリピートリンカーである。いくつかの実施形態において、アラニンリピートは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、アラニンリピートリンカーは、３個のアラニン残基からなる。いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、６Ｈｉｓタグである。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ２８のストーク領域に特異的に結合し、Ｈｉｓタグを含むことが見出されるＶＨＨ配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４５、クローン２Ａ１）、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４６、クローン４Ａ４）、およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７、クローン４Ａ１）である。
別の態様により、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含む薬剤が提供され、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１１（ＧＹＴＬＴＮＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１２（ＮＴＹＴＧＫ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１３（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１４（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１５（ＲＡＮＲＬＶＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１６（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。この抗体は、本明細書では、Ｍ９と称される。
いくつかの実施形態において、薬剤は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１７（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１８（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１９（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２０（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２１（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２２（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、薬剤は、アミノ酸配列ＤＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＬＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＦＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＨＷＰＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２３）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号２３を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸配列ＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＣＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２４）によってコードされるポリペプチドを含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号２４からなる。抗体Ｍ９は、配列決定され、配列番号２４からなる重鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号１７～１９である。
いくつかの実施形態において、薬剤は、アミノ酸配列ＱＦＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＭＬＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＤＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＨＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号２５）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の可変領域は、配列番号２５を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸配列ＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡ（配列番号２６）によってコードされるポリペプチドを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号２６からなる。抗体Ｍ９は、配列決定され、配列番号２６からなる軽鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号２０～２２である。
いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ｍＣＤ２８を架橋および／または活性化しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ＣＤ２８の単一分子のみに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体ＣＤ２８に結合する。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アンタゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない。
「アゴニスト」という用語は、一般に、受容体に結合し、受容体を完全にまたは部分的に活性化する分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、アゴニストは、天然リガンドと同じ部位で結合する。いくつかの実施形態において、アゴニストは、天然リガンドの結合部位とは異なるアロステリック部位で結合する。「アンタゴニスト」という用語は、一般に、アゴニストと同じ部位または別の部位で受容体に結合し、受容体を活性化せず、天然リガンドによる受容体の活性化の妨害または遮断、および受容体アゴニストによる受容体の活性化の妨害または遮断の１つ以上を行う分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ｍＣＤ２８に結合するが、受容体を活性化しない、または受容体の活性化を遮断しない。いくつかの実施形態において、それらは、ＣＤ８６による活性化を遮断しない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ｍＣＤ２８に結合しない。
本明細書で使用される場合、「直接アゴニスト／アンタゴニスト」は、受容体（ｍＣＤ２８）に結合し、結合することによってその分子によるシグナル伝達を増加／減少させる分子を指す。ｍＣＤ２８の場合、アゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、結合することによって細胞内のｍＣＤ２８シグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、Ｔ細胞活性化を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、Ｔ細胞増殖を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させる。炎症誘発性サイトカインは、当技術分野で周知であり、活性化Ｔ細胞によって分泌されることが知られている。炎症誘発性サイトカインの例としては、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－２、およびＩＬ－６が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、炎症誘発性サイトカインは、ＩＦＮγである。いくつかの実施形態において、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－２である。ｍＣＤ２８の場合、アンタゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、結合することによって細胞におけるｍＣＤ２８シグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、Ｔ細胞活性化を減少させ、Ｔ細胞増殖を減少させ、および／または炎症誘発性サイトカイン分泌を減少させる。リガンドに接触する、阻害剤に接触する、共受容体に接触する、または受容体シグナル伝達を改変するために問題の受容体以外の分子に接触することによって受容体のシグナル伝達に影響を与える分子は、直接アゴニスト／アンタゴニストとはみなされない。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤は、血清中のｓＣＤ２８と接触し、それにより細胞上のｍＣＤ２８を介したシグナル伝達の増加を可能にする。その結果、ｍＣＤ２８シグナル伝達は増加するが、ｍＣＤ２８への結合は受容体シグナル伝達を増加させないため、抗体はｍＣＤ２８アゴニストまたは直接アゴニストではない。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８のＩｇＶドメインに結合しない、ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、ＩｇＶドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸２８～１３７を含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、アミノ酸配列ＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧ（配列番号８）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８のリガンドへの結合を阻害しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＯＳＬから選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＩＣＯＳＬである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８６は、ＣＤ８６－Ｆｃである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８０は、ＣＤ８０－Ｆｃである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８のストーク領域に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の膜近位領域に結合する。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ｓＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体ｓＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ｓＣＤ２８、二量体ｓＣＤ２８または両方に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ＣＤ２８に結合するが、二量体ＣＤ２８には結合しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８細胞外ドメインの断片は、ストーク領域である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８に結合する薬剤は、ＣＤ２８の切断を防止する。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８に結合する薬剤は、細胞からのＣＤ２８の脱落を防止する。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ストーク領域内の切断部位に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８内の切断部位に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼの切断部位に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＭＭＰ－２の切断部位に結合する。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、切断部位に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、切断部位へのアクセスを隠蔽、遮蔽、または遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼ切断部位に結合、遮断、遮蔽、または隠蔽する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼ切断部位に結合しないが、その部位を遮蔽する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼ切断部位へのアクセスを遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼ切断部位を遮断する立体障害を生成する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼ切断部位に結合しないが、薬剤の結合が、ｍＣＤ２８に対して立体構造の変化を生成し、プロテアーゼ切断部位を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤の結合が、ｍＣＤ２８に対して立体構造の変化を生成し、プロテアーゼ切断部位を遮断する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ－１３である。いくつかの実施形態において、切断部位は、切断モチーフである。いくつかの実施形態において、ＭＭＰ－２切断モチーフは、ＰＸＸ／Ｘであり、最後のＸは、疎水性残基である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８におけるＰＸＸ／Ｘモチーフは、ＰＳＰ／Ｌである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、配列番号１のアミノ酸１４２～１４５（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、配列番号２のアミノ酸１２７～１３０（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸９～１２（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼの切断部位へのアクセスを遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８のストークドメインのＰＳＰＬに結合する。
いくつかの実施形態において、切断部位は、ロイシンの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、バリンの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、ロイシン、バリンおよび／または芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態において、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジンから選択される。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、およびフェニルアラニン１４６のいずれか１つの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、またはフェニルアラニン１４６の前にある。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のロイシン１４５の前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のロイシン１４５の前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号２のロイシン１２７の前にある。
いくつかの実施形態において、薬剤は、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域に結合しない。いくつかの実施形態において、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、プロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態において、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、メタロプロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態において、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態において、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ－２）の基質ではない。いくつかの実施形態において、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ＭＭＰ－１３）の基質ではない。いくつかの実施形態において、変異切断部位は、配列番号１のロイシン１４５の変異である。いくつかの実施形態において、変異切断部位は、配列番号１のロイシン１４５のアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、配列番号１のロイシン１４５のアミノ酸置換は、リジンである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８の機能および／またはシグナル伝達を調節しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８を分解しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８分解につながらない、またはそれを促進しない。いくつかの実施形態において、シグナル伝達は、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化である。いくつかの実施形態において、薬剤は、免疫細胞の活性化を阻害しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８受容体の内部移行または再循環を誘発しない。Ｔ細胞の免疫活性化には、ｍＣＤ２８を介した共刺激が不可欠である。タンパク質分解切断により、ＣＤ２８の細胞外領域にあるリガンド結合ドメインが、膜に残っているタンパク質の膜貫通部分および細胞質部分から除去された。したがって、切断されたＣＤ２８はシグナル伝達することができず、Ｔ細胞の活性化に寄与し得ない。したがって、切断を遮断し、かつアンタゴニストでもある薬剤は、ｍＣＤ２８の活性化を可能にしない。同様に、切断を遮断するがアゴニストでもある薬剤は、異常なＴ細胞活性化、および潜在的に自己免疫応答を誘発する可能性がある。
いくつかの実施形態において、薬剤は、免疫細胞上のｍＣＤ２８の表面レベルを低減しない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の表面レベルを５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、７、５、３、２または１％未満だけ低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態において、細胞への薬剤の結合は、細胞を死滅させない。いくつかの実施形態において、細胞への薬剤の結合は、細胞の死につながらない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体であり、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体の結合によって媒介される細胞死を低減するように突然変異したＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｆｃ受容体結合ドメインを突然変異させる。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは両方を減少させるように操作または突然変異される。Ｆｃ操作は当技術分野で周知であり、抗体媒介性細胞死滅を減少させることが知られている任意の変異またはアミノ酸変化を使用することができる。
いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆｃドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆｃドメインを欠失した抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ラクダ科動物、サメまたはナノボディである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、非抗体タンパク質である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、非抗体足場に基づく。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体模倣物である。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ｋＤａ未満のモル質量を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸アプタマーである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。抗体模倣物の例には、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰＳが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、ＤＡＲＰｉｎである。
いくつかの実施形態において、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、システインプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、スレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、セリン、システインまたはスレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、グルタミン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システインおよびスレオニンプロテアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギンペプチドリアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、シェダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、亜鉛触媒である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、コバルト触媒である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ－１３（ＭＭＰ－１３）である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ－２、および／またはＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、および／またはＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。
使用方法
別の態様により、がんの治療および／または予防を必要とする対象においてがんを治療および／または予防する方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様により、免疫療法の改善を必要とする対象において免疫療法を改善する方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様により、ｓＣＤ２８の減少を必要とする対象において、ｓＣＤ２８を減少させる方法が提供され、本方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、免疫療法は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法は、抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、療法は、ＰＤ－１チェックポイントの遮断を含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、同種、同系、または自己免疫細胞を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫療法を必要とする対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、がんは、ｓＣＤ２８陽性がんである。いくつかの実施形態において、がんは、高ｓＣＤ２８のがんである。いくつかの実施形態において、対象は、がんを発症するリスクを有する。
本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「処置」または「処置すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の低減、またはその進行の阻害を包含する。処置は、疾患、障害、または状態が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な処置であるためには、本明細書における有用な組成物は、疾患、障害、もしくは状態の重症度を軽減する、それに関連する症状の重症度を軽減する、または患者もしくは対象の生活の質の改善を提供するだけでよい。
いくつかの実施形態において、減少させることは、対象に少なくとも１つの本発明の薬剤を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与」等の用語は、健全な医療行為において、活性剤を含む組成物を、治療効果を提供するような様式で対象に送達する任意の方法を指す。本主題の一態様は、治療的有効量の本発明の薬剤の、それを必要とする患者への経口投与を提供する。他の適切な投与経路には、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内が含まれ得る。
別の態様により、本発明の薬剤および治療上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、投与することは、本発明の医薬組成物を投与することである。
本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「アジュバント」という用語は、活性薬剤ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水等の無菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用される他の非毒性適合性物質である。本明細書において担体として役立ち得る物質のいくつかの非限定的な例には、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、粉末化トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、カカオバター（坐剤基剤）、乳化剤、および他の医薬製剤で使用される他の非毒性の医薬適合性物質が含まれる。ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤および滑剤、ならびに着色剤、着香剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。本明細書で企図される組成物を製剤化するために、非毒性、不活性および有効な担体が使用され得る。これに関して、適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）、ｔｈｅ ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）、および“Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ，”Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ） Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔに記載のものがあり、これらすべての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本組成物において有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、およびＤＭＳＯが含まれる。これらの追加の不活性成分、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、標準的な教科書Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）などに記載されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物はまた、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、および血清中のペプチドまたはポリペプチドの半減期を増加させる他のビヒクル等の人工的に作製された構造に含まれてもよい。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。本明細書に記載のペプチドとともに使用するためのリポソームは、中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロール等のステロールを一般に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームのサイズおよび血液中での安定性等の考慮事項によって決定される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより考察されているように、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、また米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号を参照されたい。
担体は、全体で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、または分解につながらない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを低下させない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを維持する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを増加させる。
いくつかの実施形態において、低減は、ｓＣＤ２８の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、低減は、血清ｓＣＤ２８の低減である。いくつかの実施形態において、低減は、ｓＣＤ２８の血中レベルの低減である。いくつかの実施形態において、低減は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるｓＣＤ２８レベルの低減である。
いくつかの実施形態において、対象の血液は、高レベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、高レベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、レベルは、健康な対象のレベルよりも上昇する。いくつかの実施形態において、対象のｓＣＤ２８レベルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％、健康な対象のレベルよりも上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌ血液を超えて上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、レベルは、５ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、レベルは、１０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、レベルは、２０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、減少前の対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、がんは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法で処置され得るがんである。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けている。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に対する非応答者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に対してナイーブである。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法と一緒に行われる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の前に行われる。
いくつかの実施形態において、方法は、対象に別の免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく免疫療法である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－ＮＫである。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、がんワクチンである。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」および「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」という用語は、少なくとも１つの目的のタンパク質（例えば、エピジェネティック修飾剤での処理後に発現が増加した免疫原性タンパク質）に特異性を有し、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞）にグラフトされる操作された受容体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔ細胞から選択される。
ＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ－ＮＫ細胞ならびにそれらのベクターは、当技術分野で周知である。そのような細胞は、受容体が結合するタンパク質を標的とし、細胞傷害性を示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、複数のウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、エピジェネティック修飾剤との接触により発現が増加したウイルスタンパク質を標的とする。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築は、当技術分野で周知である。１つの非限定的な例では、ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製することができ、その後、抗体をコードするベクターが構築される。ベクターはまた、共刺激シグナル領域を含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル領域は、既知のＴ細胞またはＮＫ細胞刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド。いくつかの実施形態において、ベクターはまた、ＣＤ３Ｚシグナル伝達ドメインも含む。次いで、このベクターは、例えばレンチウイルス感染によって、Ｔ細胞にトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、がんは、ｓＣＤ２８レベルが上昇したがんである。いくつかの実施形態において、がんは、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態において、上昇した、および／または高いｓＣＤ２８レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍｌの、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、がんは、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態において、上昇したｓＣＤ２８レベルおよび／または高いｓＣＤ２８レベルは、健康な対象において５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５％のレベル、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんではない。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がんおよび結腸直腸がんから選択される。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、および結腸直腸がんから選択される。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がんまたは結腸直腸がんである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
キット
別の態様により、本発明の少なくとも１つの薬剤、または本発明の医薬組成物を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の薬剤がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法薬とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく治療薬が本発明の抗体または医薬組成物とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む。
別の態様により、本発明の抗体または医薬組成物とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法薬を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、がんの処置に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、診断キットである。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、それを必要とする対象におけるｓＣＤ２８の血清レベルを決定する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本発明の薬剤または医薬組成物で処置される対象の適合性を決定する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、キットは、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法で処置される対象の適合性を決定する際に使用するためのものである。
薬剤生成の方法
別の態様により、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する方法が提供され、
ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
ｂ．取得された薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
ｃ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、
を含み、
それによって、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する。
別の態様により、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する方法が提供され、
ａ．薬剤をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列が、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
ｉｉ．取得された薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
ｉｉｉ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、によって選択された薬剤の核酸配列である、宿主細胞を培養すること、
を含み、
それによって、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する。
いくつかの実施形態において、本方法は、細胞表面上のｍＣＤ２８のプロテアーゼによる切断を遮断する薬剤の能力を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗切断剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、脱落防止剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象におけるｓＣＤ２８の脱落を減少させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の切断を減少させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象におけるｍＣＤ２８の切断を減少させる。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ－１３である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせ。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８の細胞外ドメイン」という用語は、膜貫通ドメインの前に来るＣＤ２８のＮ末端部分を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ａである。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ストークドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８のストークドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、配列ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号２８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、二量体である。いくつかの態様において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、単量体である。いくつかの態様において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、二量体または単量体である。
本明細書で使用される場合、「断片」は、より大きなタンパク質またはタンパク質ドメインの一部を構成する部分ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、断片は、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、断片は、最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインの断片に結合する薬剤を取得することは、ＣＤ２８ストークドメインに特異的に結合する薬剤を取得することである。
いくつかの実施形態において、方法は、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、選択することは、ｍＣＤ２８シグナル伝達に拮抗しない少なくとも１つの薬剤を選択することである。がんの処置のためにＣＤ２８シグナル伝達を刺激することは有害ではないかもしれないが、シグナル伝達に拮抗することは逆効果であることは当業者によって理解されるであろう。
いくつかの実施形態において、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、薬剤の存在下および非存在下において、活性化された免疫細胞の血清中のｓＣＤ２８を測定することを含む。いくつかの実施形態において、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、薬剤、プロテアーゼおよびＣＤ２８の細胞外ドメインまたは切断部位を含むその断片の混合を含む。いくつかの実施形態において、試験することは、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインを配列決定して、短縮および／または切断についてチェックすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、試験することは、切断によるサイズ変化を測定するのに十分な感度を有するゲル上で、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインを泳動することをさらに含む。いくつかの実施形態において、試験することは、薬剤およびプロテアーゼの存在下で、ｍＣＤ２８を発現する細胞からのｓＣＤ２８の生成を測定することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、当該ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片でサメまたはラクダ科動物を免疫化し、当該免疫化された生物から抗体を収集することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片への結合について薬剤のライブラリをスクリーニングし、結合する薬剤を選択することを含む。
いくつかの実施形態において、抗体を収集することは、免疫化されたサメまたはラクダ科動物の脾臓から、Ｂ細胞を抽出することを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞は、メラノーマ細胞と融合されて、ハイブリドーマを生成する。いくつかの実施形態において、抗体は、ハイブリドーマの培養培地から収集される。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で生物を免疫化し、免疫化された生物から抗体を収集することを含む。いくつかの実施形態において、生物は、マウスである。いくつかの実施形態において、生物は、ウサギ、マウス、ラット、サメ、ラクダ科動物、ニワトリ、ヤギおよびファージから選択される。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラクダおよびラマから選択される。いくつかの実施形態において、収集することは、採血を含む。いくつかの実施形態において、収集することは、
ａ．免疫化された生物の脾臓からＢ細胞を抽出すること；
ｂ．抽出されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成すること；および
ｃ．ハイブリドーマから抗体を収集すること
を含む。
いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片への結合について薬剤のライブラリをスクリーニングし、そのように結合する薬剤を選択することを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ファージディスプレイライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、脾臓Ｂ細胞に由来する免疫化ライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ＩｇＧライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、Ｆａｂライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ＶＨＨ抗体のライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、単鎖、単一ドメインまたはナノボディのライブラリである。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、薬剤の組換え形態を生成することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を選択することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を選択することは、薬剤の組換え形態を生成することを含む。いくつかの実施形態において、組換え形態は、薬剤の配列から生成される。いくつかの実施形態において、方法は、薬剤をヒト化することをさらに含む。
細胞内で薬剤をコードする核酸分子を発現させることは、当業者に周知である。それは、多くの方法の中でも、トランスフェクション、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接変更によって実行することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子は、プラスミドまたはウイルスベクター等の発現ベクター中にある。ｐ１６－Ｉｎｋ４ａを含む発現ベクターの１つのそのような例は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能な哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ ｐ１６ ＩＮＫ４Ａである。
ベクター核酸配列は、一般に、少なくとも細胞内での増殖のための複製起点、および任意選択で、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニン配列などの追加のエレメントを含む。
ベクターは、非ウイルス法またはウイルス法により送達されるＤＮＡプラスミドであってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであってもよい。プロモーターは、哺乳動物細胞において活性であってもよい。プロモーターは、ウイルスプロモーターであってもよい。
いくつかの実施形態において、薬剤をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメントに連結されていることを意味することが意図される。
いくつかの実施形態において、ベクターは、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５）に記載されているとおり）、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、いずれか小さなビーズまたは粒子のマトリックス内もしくはその表面上に核酸を含む小さな粒子による高速弾道貫通（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７．７０－７３（１９８７））および／またはそのようなものを含む標準的な方法によって細胞に導入される。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りにクラスタ化した一群の転写制御モジュールを指す。プロモーターは、それぞれ約７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質の１つ以上の認識部位を含む、個別の機能モジュールで構成される。
いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩおよびＰｏｌ ＩＩ）によって転写される。ＲＮＡＰ ＩＩは、真核細胞に見られる酵素である。これは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡの前駆体ならびにほとんどのｓｎＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを合成する。
いくつかの実施形態において、哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶおよびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、レトロウイルス等の真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。いくつかの実施形態において、ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ－１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に効果的であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
いくつかの実施形態において、水平感染および標的特異性等の利点を提供する組換えウイルスベクターが、インビボ発現に使用される。一実施形態において、水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有であり、出芽して隣接細胞に感染する多くの子孫ビリオンを単一の感染細胞が生成するプロセスである。一実施形態において、その結果、その大部分が最初は元のウイルス粒子に感染していなかった広い領域が急速に感染するようになる。一実施形態において、水平方向に広がることができないウイルスベクターが生成される。一実施形態において、この特徴は、所望の目的が特定の遺伝子を局所化された数の標的細胞のみに導入することである場合に有用となり得る。
本発明の発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法が使用され得る。そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に記載されており、例えば、安定的なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。さらに、陽性－陰性選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
（ポリペプチドをコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む以外に、本発明の発現コンストラクトは、発現したポリペプチドの安定性、生成、精製、収量または活性を最適化するように操作された配列も含み得ることが理解される。
別の態様により、本発明の方法によって生成された薬剤が提供される。
別の態様により、本発明の方法によって生成された薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物が提供される。
本明細書で使用される場合、値と組み合わせたときの「約」という用語は、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド」への言及は、１つ以上のポリペプチドおよび当業者に知られているその同等物への言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の引用、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」等の排他的な用語を使用するための先行基準として機能することを意図する。
「Ａ、Ｂ、およびＣ等のうちの少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される事例では、概して、このような構造は、当業者が慣例を理解するであろうという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、ならびにＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に等を有する系を含むがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替的な用語を提示する実質的にいかなる離接的な単語および／または句が、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、またはいずれの用語も含む可能性を企図すると理解されるべきであることは当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできる、ことが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態に関連して説明されている本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、すべてのそのような部分的組み合わせが本明細書で個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。
本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図しない、以下の実施例を検討すると、当業者には明らかになるであろう。追加的に、上記で説明されおよび以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される、本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的裏付けが認められる。
上で説明し、以下の特許請求の範囲で請求する本発明の様々な実施形態および態様に関して、以下の実施例において実験的裏付けが認められる。
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載される方法論、“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい（これらはすべて、参照により組み込まれる）。その他の一般的な参考文献は、本明細書全体に記載されている。
材料および方法
抗体－市販のマウスモノクローナル抗ＣＤ２８クローン＃ＣＤ２８．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０２）およびＦＩＴＣ結合（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０６）。ヤギポリクローナル抗ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＡＦ－３４２－ＰＢ）。ＦＩＴＣ結合抗ヒトＰＤ－Ｌ１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８０６５）。ＡＰＣ結合抗ヒトＰＤ－Ｌ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５５０８）。ＰＥ結合抗ヒトＩＤＯ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＩＣ６０３０Ｐ）。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５３２２）。ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９－６０５－１４９）。ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３５－０７１）。抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３０４）。抗ヒトＰＤ－１ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４５０６）。
ヒトＣＤ２８受容体のストーク領域を標的とするＶＨＨの単離－ナイーブな非免疫化ラマに由来する末梢血Ｂ細胞の遺伝コードを使用して、Ｃ末端Ｈｉｓ６－Ｍｙｃタグを有する融合タンパク質として個々のＶＨＨを発現する粒子からなるファージライブラリを構築した。ナイーブライブラリを使用して、ヒトＣＤ２８のストーク領域に結合する能力を有するナノボディを選択した。スクリーニングは、Ｃ末端にビオチンを付加した「ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）」の配列を有するビオチン化組換えＣＤ２８－Ｆｃキメラまたは酸化二量体ペプチドを用いて行った。各抗原を、脱脂乳でブロッキングしたストレプトアビジン磁気ビーズに結合させた。ファージの溶液内選択は、ファージの入力量および抗原濃度を変化させて、３つの連続した選択ラウンド全体にわたって同じ抗原を使用して実施した。抗原を含まないブロッキングされたビーズを、対照として使用した。結合したファージの溶出を、トリプシンを用いて２０分間行った。溶液内選択中の濃縮比は、ＣＤ２８抗原選択条件から溶出されたファージの数と、抗原選択条件なしから溶出されたファージの数との間の比として計算した。選択された出力の２７９個の個々のファージモノクローンを、ファージまたはペリプラズムのいずれかの形式で、ＥＬＩＳＡによって抗原結合について検証し、フローサイトメトリーによって膜ＣＤ２８への結合について特徴付けた。７２個のクローンは、ペリプラズム形式でストーク領域ペプチドへの特異的結合を示し、２２個は、独自のＣＤＲ配列を有することが証明され、６個のみが、特徴的なＣＤＲ３ファミリーに属することが見出された。ＣＨＯ細胞で、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する６つのＶＨＨを組換えタンパク質として生成し、抗脱落活性および細胞結合について評価した。トランスフェクション－ＣＤ２８ｗｔ（全長ＣＤ２８転写物をコードする）プラスミドを、ＤＮＡ配列をＰＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングすることによって生成した。トランスフェクションは、Ｊｅｔ Ｐｅｉトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓトランスフェクション）を使用して行った。Ｇ４１８含有培地中で、安定したトランスフェクタントを選択した。
ＥＬＩＳＡ－市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトインターフェロン－γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０１０３）、ヒトインターロイキン２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３１８０２）、ヒトインターロイキン６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０５０２）、ヒトインターロイキン１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０６０３）、ヒト腫瘍増殖因子ベータ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３６７０８）、ヒトインターロイキンベータ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３７００４）およびヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＤＹ３４２）の量の定量に使用した。細胞増殖および生存能（ＭＴＴアッセイ）は、製造元（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１４６５００７００１）の指示に従って行った。キヌレニン（ＩＤＯ活性）ＥＬＩＳＡキットは、製造元（ＩｍｍｕＳｍｏｌ、カタログ番号ＢＡ Ｅ－２２００）の指示に従って行った。
ＣＤ２８ストーク領域結合アッセイ－ビオチン結合野生型またはＬ１４５Ｋ ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレート上で固定化した。ＶＨＨクローンの段階希釈（０．２～５μｇ／ｍＬ）を行い、結合したＶＨＨの検出は、抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰ結合抗体を用いて行い、ＴＭＢを用いて現像を行った。
サイトカインマルチプレックス－いくつかのサイトカインの同時評価を、ＰｒｏｃａｒｔａＰＬｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＰＸ－０７－ＭＸＸＧＰＹ２）を使用してＭａｇｐｉｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で行った。
フローサイトメトリー－一般に、細胞はすべてのステップで氷上に保持された。染色する前に、５×１０５個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）中の５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１４５０６）で１５分間ブロッキングした。製造元が推奨する濃度で抗体を使用し、暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、９６ウェルＵ底プレートで１００μＬの容量で行った。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中のＦＡＣＳチューブに移した。Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ＳｏｆｔｗａｒｅのＫａｌｕｚａを使用して、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞を分析した。
細胞株およびヒト免疫細胞の単離－Ｊｕｒｋａｔ白血病性Ｔ細胞リンパ芽球細胞株クローンＥ６．１およびＳＣＣ－２５舌扁平上皮がんを、ＡＴＣＣから取得した。ＰＢＭＣは、標準的なリンパ球分離培地（ＭＢＰ、カタログ番号８５０４９４）を使用して、健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ３細胞は、ＲｏｓｓｅｔｔｅＳＥＰ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１５０６１）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ４細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４ Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９０５９）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。単球は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５２）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。すべての細胞は、１０％ＨＩ－ＦＣＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を添加した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で成長させた。
ＣＤ８６遮断ＦＡＣＳ－ヒトＣＤ２８で安定的にトランスフェクトされた０．５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、２μｇ／ｍＬのＣＤ８６－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４１－Ｂ２）と、抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、１０μｇ／ｍＬ）またはＶＨＨクローン（３０μｇ／ｍＬ）の有無で、室温で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、氷上で２０分間、１：５０００希釈でフルオロフォアに結合した抗ヒト重鎖および軽鎖抗体を使用した二次結合のために採取した。
樹状細胞の分化－単球を、３日目および６日目にリフレッシュした成長因子を含むＲＰＭＩ培地で１×１０６／ｍＬの密度で培養した。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４によって６日間誘導した。必要に応じて、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを４８時間添加することによって、ｉＤＣをさらに成熟樹状細胞へと分化させた。生成された細胞集団は、関連マーカーのＦＡＣＳ分析によって、および特徴的なサイトカインの分泌の分析によって、示された表現型について試験した。
メタロプロテイナーゼ－市販の組換えヒトメタロプロテイナーゼＭＭＰ－２は、Ａｎａｓｐｅｃ（カタログ番号ＡＳ－７２００５）またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号９０２－ＭＰ）からのものの両方を使用した。市販の組換えヒトメタロプロテイナーゼＭＭＰ－１３は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号５１１－ＭＭ）から購入した。Ｐｒｏ－ＭＭＰ２およびＰｒｏ－ＭＭＰ－１３を、製造元のプロトコルに従って、１ｍＭのｐ－アミノフェニル水銀アセテート（ＡＰＭＡ）を用いて、３７℃で１～２時間活性化した。
プロテアーゼ阻害剤－プロテアーゼ阻害剤を、各実験の開始時に示された濃度で添加した。１週間のアッセイでは、３日後に最終濃度でさらなる阻害剤を追加した。使用されたプロテアーゼ阻害剤は、ＴＡＰＩ－１（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号１８５０５）、ＧＭ６００１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ－２０３９７９）、ＴＭＩ－１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＺ０３３６）、およびＧＩ２５４０２３Ｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＭＬ０７８９）である。プロテアーゼカクテルは、言及される場合、ＴＡＰＩ－１およびＧＭ６００１を等モル比で混合したものである。
合成ペプチド－「ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧＧＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４１）－ビオチン」の最終形態を有する基質ペプチドを、Ｎ末端ｃＭｙｃタグ、それに続く５個のグリシン配列と、Ｃ末端ビオチン結合との間のヒトＣＤ２８ストーク領域（Ｈｉｓ１３４～Ｐｒｏ１５２）のアミノ酸配列を含むように設計した。このペプチドは、Ｇｅｎｃｕｓｔ Ｅｕｒｏｐｅによってカスタム合成された。１４１位のシステイン残基を使用して、ジスルフィド結合によって二量体ペプチドを生成した。１４５位のロイシンがリシンに置換された切断部位に変異を有するＣＤ２８ストーク領域ペプチドは、「ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧＧＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＫＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４２）－ビオチン」の最終形態で同様に合成した。
インビトロ切断アッセイ－５０ｎｇのｐｆ精製組換えＭＭＰ－２またはＭＭＰ－１３を、ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ）、様々な濃度（０．４～１０μｇ／ｍＬ）のＭ９ Ｆａｂまたは示されたＶＨＨクローンの存在下もしくは非存在下で、０．１２５μＭの二量体ｃ－Ｍｙｃタグ付きおよびビオチン化された基質ペプチドと５時間インキュベートした。アッセイは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＢｒｉｊ－３５、ｐＨ７．５で行った。５時間後、切断反応混合物を最終１ｎＭ濃度のペプチドに希釈し、ニュートラアビジンプレートにロードして、ペプチドに結合させた。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰに結合した抗ｃＭｙｃ抗体を使用して、未切断ペプチドの検出を行う。
可溶性ＣＤ２８の生成のためのＣＤ４ Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株のＰＨＡ活性化－１×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞またはＣＤ４ Ｔ細胞を、示された濃度のフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）および様々なプロテアーゼ阻害剤とともに、さらに５日間（Ｊｕｒｋａｔ）または７日間（ＣＤ４ Ｔ細胞）インキュベートした。
可溶性ＣＤ２８を生成するためのＰＢＭＣのＳＥＢまたはＣＭＶ活性化－４８ウェルプレートで、０．３×１０６個のＰＢＭＣを、示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤のあり／なしで、０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で、３７℃で５～７日間刺激した。代替として、９６ウェルプレートフォーマットアッセイにおいて、０．１×１０６のＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬ ＳＥＢで刺激した。ＣＭＶ刺激では、９６ウェルプレートで、示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤あり／なしで、０．５×１０６個のＰＢＭＣを、０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－４３５）で、３７℃で２～５日間刺激した。連続脱落実験では、２４ウェルプレートでＰＢＭＣをＳＥＢまたはＣＭＶで２４時間刺激し、細胞を採取し、刺激剤なしのＲＰＭＩで３回洗浄し、９６ウェルプレートに再度播種した。試料は指示された時間に採取し、可溶性ＣＤ２８の検査まで凍結条件下に置いた。
ＶＨＨの抗脱落活性を評価する細胞アッセイ－ＰＢＭＣのＳＥＢ活性化では、９６ウェルプレートで、０．１×１０６個のＰＢＭＣを、示された濃度の様々な処理あり／なしで、２ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で、３７℃で５～７日間刺激した。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞では、９６ウェルプレートで、示された濃度の様々な処置あり／なしで、０．１×１０６個のＣＤ４ Ｔ細胞を、示された濃度のフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）および２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎｅ）で、３７℃で５～７日間刺激した。ＨＥＫ自発的ＣＤ２８脱落アッセイでは、９６ウェルプレートで、０．１×１０５個のＨＥＫ細胞を、示された濃度の様々な処置あり／なしで、３７℃で４８時間インキュベートした。
混合リンパ球反応－１×１０５の未成熟ＤＣを、５×１０５の単離された自己ＣＤ３ Ｔ細胞と６日間混合した。
異所性組換えヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ－４およびヒトＣＤ８０を用いたＳＥＢまたはＣＭＶ刺激アッセイ－ＣＭＶ刺激では、９６ウェルプレートで、０．５×１０６個のＰＢＭＣ（健康またはがん患者のドナー由来）を、０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－４３５）で、示された濃度の組換えヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号３４２－ＣＤ）、ヒトＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３４－ＣＴ）、ヒトＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４０－Ｂ１）のあり／なしで、３７℃で２～５日間刺激した。ＳＥＢ設定では、１×１０５個のＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）濃度で、示された濃度の組換え（ｒｅｃ．）ヒトＣＤ２８の存在下で、７２時間培養した。指定されている場合、抗ＰＤ１またはヒトＩｇＧを、５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。
自己単球ＣＤ３ ＭＬＲ－０．５×１０６のＴ細胞を同じＣＭＶ反応性ドナーからの０．５×１０５の単球と混合し、示された濃度の処置あり／なしで、３７℃で６日間０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーターで刺激しした。
組換えヒトＣＤ２８による単球の刺激－１．５×１０６個の単球を、１００～１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２８５－ＩＦ）を含むＲＰＭＩ培地中で、示された濃度の組換えヒトＣＤ２８の存在下、２４ウェルプレートに４８時間播種した。生成された細胞集団を、関連マーカー（ＩＤＯ、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）のＦＡＣＳ分析によって、および特徴的なサイトカイン（ＩＬ－６）の分泌の分析によって、示された表現型について試験した。
ＯＫＴ３によるＴ細胞刺激－０．１×１０６個の単離されたＣＤ３ Ｔ細胞（健康なドナー由来）を、示された量の抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で、３７℃で４８～７２時間刺激した。開始時に、可溶型の組換えヒトＣＤ８０－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を添加した。ＣＤ２８に対する可溶型の抗体またはＶＨＨを、示された濃度で添加した。
トランスウェルに基づくアッセイにおけるＳＣＣ－２５がん細胞株と単球との共培養－血清を含まない飢餓培地での４日間の指示された処理ありまたはなしで、４×１０４個のＳＣＣ－２５細胞を２４ウェルプレートの底部に播種し、１×１０５個の単球を細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＣＨＴ２４１１４８）上に播種した。
がん患者の血漿中の可溶性ヒトＣＤ２８の検出－１０種類のがんの適応症および健康なドナーのそれぞれの２０の凍結血漿試料を、ＤｘＢｉｏｓａｍｐｌｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。血漿試料を１：２０に希釈し、ＥＬＩＳＡにより可溶性ヒトＣＤ２８について分析した。高ｓＣＤ２８の試料を適切な希釈で再度分析した。
直接ＣＤ２８ ＥＩＡ－特に記載がない限り、Ｃｏｒｎｉｎｇの高結合プレートまたは同等のものをスクリーニングに使用した。各ウェルを、２００～３００ｎｇのヒトＣＤ２８－Ｉｇキメラ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３４２－ＣＤ）、マウスＣＤ２８－Ｉｇキメラ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号４８３－ＣＤ）またはＣＤ２８ストーク領域アミノ酸配列（Ｇｌｙ１３７～Ｐｒｏ１５２）で構成されるＢＳＡ結合二量体ペプチドでコーティングした。ＰＢＳ中の５％ミルクまたは１％カゼインを使用して、プレートを室温（ＲＴ）で１時間遮断した。ＰＢＳＴを使用してプレートを３回洗浄し、１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ Ｆｃ特異的検出後、調査した抗体とインキュベートした。陽性対照は、マウス抗ヒトＣＤ２８クローン２８．２または免疫マウスからのマウス血清である。ハイブリドーマ上清培養物を希釈せずにスクリーニングした。
抗体配列決定。アミノ酸配列決定のために、抗体をＲａｐｉｄ Ｎｏｖｏｒ社に提供した。配列決定は、標準的な方法を使用して行われたが、これには、簡潔には、６つの酵素（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ＬｙｓＣおよびＡｓｐＮ）で酵素消化した後のＬＣ－ＭＳ分析が含まれる。消化は、ジスルフィド還元およびアルキル化を使用して行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用して行った。各抗体の重鎖と軽鎖の両方で、アミノ酸残基の１００％が少なくとも５つのペプチドスキャンでカバーされ、有意なサポート断片イオンが含まれていた。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定した。
実施例１：ヒトＣＤ２８は慢性刺激中にタンパク質分解性脱落を受ける
慢性的に刺激されたヒトＰＢＭＣの培養中で、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）を、ＥＬＩＳＡによって検出した（図１、上のグラフ）。この現象は、刺激物質の性質である人工的（ＳＥＢ）または生理学的（ＣＭＶ）に関係なく明白であり、現象の堅牢性を示していた。ＴＡＰＩ－１およびＧＭ６００１（広域ＭＭＰおよびＡＤＡＭ１７阻害剤）による処理で、用量依存的にｓＣＤ２８の量が減少するため、可溶性ＣＤ２８の起源は膜形態の脱落に由来する（図１、上のグラフ）。脱落したＣＤ２８の細胞源は、図２に見られるようにＴ細胞である。健康なドナーの末梢血からのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株またはヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＰＨＡによる慢性刺激により、用量依存的にｓＣＤ２８が生成される（図２、上のグラフ）。ＴＡＰＩ－１およびＧＭ６００１での処理により、各ＰＨＡ濃度（図２、上のグラフ）で、また固定ＰＨＡ濃度（図２、下のグラフ）で用量依存的に、ｓＣＤ２８の量が減少した。
非常に特異的なＡＤＡＭ－１０阻害剤であるＧＩ２５４０２３Ｘによる処理は、活性化免疫細胞からのｓＣＤ２８放出のほぼ完全な阻害を、用量依存的にもたらした（図３Ａ、下のパネル）。ＡＤＡＭ－１７特異的阻害剤ＴＭＩ－１でも同様の結果が観察された（図３Ｂ、下のパネル）。免疫細胞の生存能をＭＴＴアッセイでモニタリングし、培養中の細胞の代謝活性を確認した。結果は、ＡＤＡＭ阻害剤を使用した場合と使用しない場合の処理に有意差がないことを示し、低いｓＣＤ２８レベルはプロテアーゼ活性の遮断が原因であり、プロテアーゼ阻害剤が原因の細胞死のアーチファクトではないことを示唆していた（図３Ａ－図３Ｂ、上のパネル）。
ｓＣＤ２８の生成は、より生理学的なシステムでも検証した。最初に、単離された自己樹状細胞および抗原提示細胞によるＴ細胞の生理学的刺激を模倣するＣＤ４ Ｔ細胞が利用された。ｓＣＤ２８の上昇は、２つの細胞集団を混合すると明白になり、ＣＭＶを培養物に添加するとさらに顕著になった（図４Ａ）。これは、慢性刺激が行われると、ヒトＣＤ２８タンパク質がタンパク質分解脱落プロセスを経験することを示している。
次に、ヒトＰＢＭＣをＣＭＶペプチド（図４Ｂ）またはＳＥＢ（図４Ｃ）で２４時間刺激した。その後、細胞を洗浄して刺激物質を除去し、刺激信号なしで様々な期間、再び播種した。その後、培地中のｓＣＤ２８の存在を検査した。ｓＣＤ２８の蓄積は、経時的に明確に見える。さらに、蓄積は、図４Ｄに見られるように、ＡＤＡＭ－１０およびＡＤＡＭ－１７の活性に依存する。ＳＥＢ刺激後、特定の阻害剤を異なる濃度で添加すると、１２０時間後に定量化されるｓＣＤ２８の量が減少した。ＣＤ２８の脱落はＴ細胞の一次活性化後に生じ、必ずしも一定または繰り返しの刺激を必要としないため、この研究は患者の血液中の多量の可溶性ＣＤ２８の存在を説明し得る。
実施例２：可溶性ヒトＣＤ２８は免疫抑制活性を有する
図１（下のグラフ）に見られるように、プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用してｓＣＤ２８のレベルを低下させることは、分泌されたＩＦＮγのレベルによって明らかなように、Ｔ細胞活性化の上昇と直接相関しており、ｓＣＤ２８が免疫抑制機能を有することを示唆している。プロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度を増加させると、細胞の培地でのｓＣＤ２８レベルの低下につながり、これらのｓＣＤ２８レベルの低下は、分泌されたＩＦＮγのレベルの増加に逆相関していた。ｓＣＤ２８による免疫抑制をさらに調査するために、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠失した組換えヒトＣＤ２８を、ＣＭＶで刺激されたヒトＰＢＭＣの培養液に追加した。これは、ＩＦＮγ分泌の用量依存的な阻害をもたらした（図５）。この免疫抑制効果は、異なるヒトＰＢＭＣドナーで観察され、ｓＣＤ２８によって遮断されるこのシグナル伝達軸の堅牢性を裏付けている。
並行して、インターロイキン－６の分泌（図６および図７Ａ）およびインターロイキン－１０（図７Ａ）の上昇が明らかであった。これらのサイトカインは、免疫エフェクター活性（ＩＬ－１０）の抑制、ならびにＳＴＡＴ－３シグナル伝達（ＩＬ－６）を介してがんの増殖および血管新生を補助し得る２型免疫応答への免疫系の歪みを示すと報告されている。さらに、可溶性ＣＴＬＡ－４（アバタセプトを模倣－自己免疫障害の登録された治療薬）との比較が行われ、サイトカイン分泌プロファイルに関して、免疫システムに対する全体的に同様の影響が明らかになった（図７Ａ）。
次に、ヒトＰＢＭＣを、組換えヒトＣＤ２８の存在下または非存在下で、ＳＥＢ（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。ヒトＩｇＧを対照として使用した。免疫活性化の顕著な特徴であるリンパ球クラスタ化を、１２時間ごとに撮影した写真で、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３生細胞を用いて監視した。図７Ｃに見られるように、組換えヒトｓＣＤ２８が存在する場合、ＳＥＢは本質的にリンパ球に影響を及ぼさなかった。インビトロ免疫応答の間に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が互いに、および他の細胞型とクラスタ化し、クラスタ化が休止リンパ球の抗原特異的活性化に不可欠であることは、十分に確立されている。可溶性ＣＤ２８は、ＳＥＢ免疫応答中にクラスタ形成の量およびサイズを減少させるようであり、これは、ＡＰＣによるＴ細胞特異的活性化の最初のステップを阻害することを意味する。
単離された自己単球およびＣＤ３ Ｔ細胞を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で共培養すると、同様の結果が観察された。混合細胞を、組換えヒトｓＣＤ２８の濃度を増加させて、または増加させずに、ＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ）で５日間刺激した。ここでも、ｓＣＤ２８は、ＩＦＮγ分泌を阻害すると同時に、ＩＬ－１Ｂ、ＴＧＦβおよびＩＬ－１０の分泌を増加させることが判明した（図７Ｂ）。
ｓＣＤ２８は、単球に対して同様の免疫抑制効果を有していた。酵素インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、必須アミノ酸であるトリプトファンを異化させるその能力により、免疫調節に関与している。それは、様々な免疫細胞および多くのがん細胞でも発現される。トリプトファンの不足はＴリンパ球の成熟および増殖を阻害するが、トリプトファン異化作用の最終産物であるキヌレニンは、様々な生理学的および病態生理学的状態で免疫寛容を促進する免疫抑制代謝産物としても知られている。ＩＤＯに対するｓＣＤ２８の効果を試験するために、分離されたヒト単球を、対照ヒトＩｇＧまたは組換えヒトＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍＬ）で４８時間刺激した。インキュベーション後、単球を、ヒトＩＤＯに対して細胞内染色した（図７Ｅ）。細胞内染色を容易にするために、細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液キットで透過処理した。様々な処理の培養液を、ＩｍｍｕＳｍｏｌ特異的キヌレニンＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＤＯ活性について評価した（図７Ｄ）。ｓＣＤ２８は、単球におけるＩＤＯ発現を強く増強した。
さらに、驚くべきことに、ｓＣＤ２８は、抗ＰＤ１免疫療法の強力な阻害剤であることが判明した。ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブまたはＫｅｙｔｒｕｄａ、Ｍｅｒｃｋ）は、複数のがんの適応症における前例のない効能を備えた承認済みの薬剤である。ＰＭＢＣ培養物への添加により、炎症性サイトカイン分泌（ＩＦＮγおよびＩＬ－２）が増加したが、ｓＣＤ２８の存在により、この免疫活性化効果は完全に無効になった（図８Ａ）。
ＭＬＲ設定でも同様の結果が観察された。ＭＬＲは、ｓＣＤ２８の有無、および抗ＰＤ１抗体（ＭＫ３４７５、５μｇ／ｍＬ）の有無で、以前と同様に行った（図８Ｂ）。予想通り、ＭＫ－３４７５はＩＦＮγ分泌を増加させ、ＴＧＦβ分泌を減少させた。特に、ｓＣＤ２８の存在下では、ＭＫ－３４７５の効果は大幅に低減した。
ｓＣＤ２８が抗ＰＤ－１療法のプロ活性化効果を阻害するメカニズムを解明するために、ｓＣＤ２８の存在下で免疫細胞上のＰＤ－１リガンドの発現を検査した。単離されたヒト単球を、対照ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍＬ）または組換えヒトＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）で４８時間刺激した。インキュベーション後、単球は、ＰＤ－Ｌ１（図８Ｃ、左）およびＰＤ－Ｌ２（図８Ｃ、右）で染色された。両方のリガンドは、ｓＣＤ２８で培養された単球上で上方調節されたが、これはｓＣＤ２８が抗ＰＤ－１免疫療法の効果を回避する１つの可能な方法を示唆している。
実施例３：可溶性ヒトＣＤ２８はがん患者の血漿中に見られる
がんにおけるｓＣＤ２８のレベルは、少数の乳がん患者でのみ示されており、健康な個人で観察されるレベルをわずかに上回っているだけであることが判明した（Ｉｓｉｔｍａｎｇｉｌ，Ｇ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ，２０１６）。著者らは、ｓＣＤ２８が乳がんのマーカーとして使用され得ることを示唆しているが、機能的な関係は示唆されていない。可溶性ＣＤ２８が実際に免疫系のがん回避を強化する可能性があることが分かった今、１０の異なるがんの適応症をカバーする２２０の試料および健康なドナーからの２０の試料の調査を行った。調査では、いくつかのがんで高いｓＣＤ２８レベルが見つかったが、このレベルは、健康な対照または乳がん患者でさえ見られるレベルよりも桁違いに高い場合があった（図９Ａ）。実際、一部の黒色腫、結腸直腸がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ、および頭頸部がん患者に見られるｓＣＤ２８レベルと比較すると、乳がん患者のレベルは健康な個人と同等であるようである。
がんにおけるｓＣＤ２８の役割をさらに解明するために、ＰＢＭＣを異なる適応症を有するがん患者から分離した。細胞を、ＳＥＢ（５ｎｇ／ｍＬ）で３日間、単独で、ＭＫ－３４７５とともに、組換えヒトｓＣＤ２８とともに、または両方の分子の組み合わせとともに刺激した。ＭＫ－３４７５が存在する場合でも、ｓＣＤ２８の存在下では、すべてのドナー由来の細胞からの上清中のヒトＩＦＮγの濃度が大幅に低減された（図９Ｂ）。確かに、ｓＣＤ２８により、ＭＫ－３４７５の効果は存在しなかった。
次に、頭頸部がん細胞株ＳＣＣ－２５の細胞を、トランスウェルアッセイで単独で、または単球とともにインキュベートした。単独で増殖するＳＣＣ－２５細胞に、陽性対照としてのＩＬ－６を投与すると、ＭＴＴ（図９Ｃ、上）で測定した場合、およびコンフルエンス％（図９Ｃ、下）で測定した場合、実際に細胞増殖が上昇した。単球の存在下でがん細胞を成長させると増殖も増加したが、共培養にｓＣＤ２８が含まれる場合は、断然に最大の増加が観察された。このデータは、ｓＣＤ２８が前がん効果を有することをさらに裏付けている。
実施例４：ｓＣＤ２８はＣＤ８０－Ｆｃの有効性を阻害する
ＣＤ８０は、ＣＤ８６とともにｍＣＤ２８の２つの主要なリガンドの１つである。Ｆｃ部分に融合したＣＤ８０の細胞外ドメインは、免疫刺激分子として使用されており、がん治療法として調査されている。ｓＣＤ２８がＣＤ８０－Ｆｃの有効性に及ぼす影響を検査するために、単離されたＣＤ３ヒトＴ細胞を、２μｇ／ｍＬの可溶性組換えヒトＣＤ８０－Ｆｃの存在下で、プレート結合抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ）で刺激した。予想通り、ＣＤ８０－Ｆｃは、ＩＦＮγ分泌を増加させた。しかしながら、ｓＣＤ２８の添加により、ＣＤ８０－Ｆｃの二次的な活性化効果が打ち消された（図１０Ａ）。同様に、単離されたＰＢＭＣを、ＣＭＶペプチドで３日間刺激し、次いでｓＣＤ２８とともにインキュベートした場合、期待される免疫応答を生成するにはＣＤ８０－Ｆｃの量を増やす必要があった（図１０Ｂ）。
実施例５：インビボでのがんに対するｓＣＤ２８の効果
マウスはｍＣＤ２８を切断しないため、マウスモデルではｓＣＤ２８の効果を簡単に検査することができない。最も近い選択肢は、組換えｓＣＤ２８をマウスに投与して、上昇したｓＣＤ２８レベルの状況を模倣することである。これを、Ｈ２２同系マウスモデルで調査した。Ｂａｌｂ／ｃ完全免疫適格マウスに、Ｈ２２肝細胞がん細胞の同種移植を施した。細胞は、完全に免疫適格なマウスでも増殖し、抗ＰＤ－１療法の追加で、腫瘍増殖がほぼ完全に消失した（図１１Ａ）。組換えヒトｓＣＤ２８を添加した場合、抗ＰＤ－１療法の効果は、２匹のマウスでほぼ完全に無効となった（図１１Ｂ）。これは、一部の対象では、ｓＣＤ２８レベルの増加ががんの進行に非常に有害な影響を与える可能性があることを示唆している。
実施例６：抗脱落抗体に基づく薬剤の特徴付け
ヒトＣＤ２８がＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７によるタンパク質分解プロセスを受けるという発見は、タンパク質分解性脱落の潜在的感受性を示す候補領域のそのポリペプチド配列の検査を促した。研究により、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７がＰ１’位のロイシン、バリンおよび芳香族残基を好むことが示唆されている。ヒトＣＤ２８の最も魅力的な配列領域は、球状ＩｇＶドメインを膜貫通領域に接続するヒスチジン１３４からプロリン１５２までの範囲（配列番号１０：ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ）のストーク区間である。この領域は、合計３つのロイシンおよびバリン残基、ならびにフェニルアラニン残基を保持し、プロテアーゼのアクセスを妨げる可能性のある二次構造エレメントがないと予測される。特に、ストーク領域には、ＣＤ２８のホモ二量体化を促進するジスルフィド間結合を形成するシステイン１４１も含まれている。ＣＤ２８ストーク領域に特異的に結合する抗体または抗体断片を生成し、ＣＤ２８オリゴマーの構造および機能の低下を回避しながら脱落したＣＤ２８への異なるプロテアーゼのアクセスを潜在的に遮断する目的で、ＣＤ２８ストーク領域を模倣する二量体ペプチドでＣＤ１マウスを免疫化した。免疫化に使用されたペプチド配列は、配列番号２９、ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＫであり、ヒドラジド化学を使用して、ＫＬＨまたはＢＳＡの結合を可能にする遊離アミノ基を有するように、Ｃ末端リジンを追加した。結合は、ヒドラジド終端ＣＤ２８ペプチドとＳ－４ＦＢ修飾ＢＳＡとの間で行ったが、これにより、部位特異的結合のための遊離アルデヒドが生成される。ペプチドを非変性ゲルで泳動することにより二量体化を確認した。
直接ＣＤ２８ＥＩＡによって測定された、組換えヒトＣＤ２８に対する高い結合親和性を有する抗体が見出された。本抗体は、Ｍ９と称され、本抗体の配列は、上記のとおり提供されている。抗体Ｍ９の段階希釈を使用して、組換えヒトｓＣＤ２８およびストーク領域ペプチドへの特異的結合を確認した（図１２Ａ）。興味深いことに、抗体は、組換えヒトｓＣＤ２８を検出することができたが、実際に免疫細胞から脱落したｓＣＤ２８を検出することができなかった（図１２Ｂ）。これは、抗体が切断部位で結合し、それが結合するデアイソトープが切断形態では不完全であることを強く示唆している。
次に、細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する抗体の能力を調査した。細胞からのｓＣＤ２８の脱落を低減するために、抗体は、溶液中の単なる組換えタンパク質ではなく、タンパク質の膜形態に実際に結合する必要があるであろう。ヒト全長ＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を分析した。マウスＣＤ２８は、可溶型へと切断されないようであるため（活性化されたマウス脾細胞は、ｓＣＤ２８を産生しないようである）、ヒトタンパク質を調査しなければならない。Ｍ９抗体およびＣＤ２８．２抗体を陽性対照として使用して、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。驚くべきことに、Ｍ９は、表面ｍＣＤ２８に結合するようには見えなかった（図１２Ｃ）。これは、膜に隣接している場合、立体障害およびストーク領域へのアクセスの制限に起因する可能性がある。
実施例７：単一ドメイン抗体は、細胞表面からのｓＣＤ２８脱落を阻害する
細胞の表面上のｍＣＤ２８に結合し、ｓＣＤ２８の脱落を遮断することができる小さな薬剤を設計した。全長抗体は、サイズが約１５０ｋＤａであるが、抗体に由来するＦａｂ断片は、サイズが約５０ｋＤａであり、一方、単鎖抗体（単鎖可変断片、ｓｃＦｖとも呼ばれる）は、サイズが約２５ｋＤａであり、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ抗体、ｓｃＦｖ、およびＤＡＲＰｉｎとも呼ばれる）は、サイズがほんの１２～１５ｋＤａである。
単一ドメイン抗体を、ナイーブラマ由来ＶＨＨのファージライブラリを使用して単離した。ライブラリは、ナイーブな非免疫化ラマから採取されたＶＨＨ配列から構成され、すなわち、Ｂ細胞を抽出し、利用可能なＶＨＨのＣＤＲのレパートリー全体を配列決定した。これらのＣＤＲをファージに実装して、ライブラリを生成した。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを使用して、ライブラリを、組換えＣＤ２８細胞外ドメインおよび二量体ストーク領域ペプチドに対してスクリーニングして、ヒトＣＤ２８のストーク領域に特異的に結合する抗体を見つけた。ヒトＣＤ２８のストーク領域に特異的に結合することが見出されたＶＨＨ配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４５、クローン２Ａ１）、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４６、クローン４Ａ４）、およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７、クローン４Ａ１）である。ＣＨＯ細胞で、ＶＨＨを組換えタンパク質として産生し、次いで、以下に記載されるように、細胞結合および抗脱落活性について評価した。Ｃ末端のＨｉｓタグを精製に使用し、トリプルアラニンリピートを介して連結した。表１に、調査した３つのクローンのＣＤＲを提供する。
Figure 2022525407000002
ＶＨＨクローンのヒトＣＤ２８ストーク領域配列への結合は、まず、ＶＨＨクローンの段階希釈を使用してＥＬＩＳＡで確認した（図１３）。細胞レベルでのヒト膜ＣＤ２８への結合は、標識されたＶＨＨクローンおよびＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞を使用して、ＦＡＣＳ分析で確認した（図１４）。膜ＣＤ２８結合は、ＣＤ２８近位膜領域へのアクセスを示す。以前の実験では、ＣＤ２８ストーク領域ペプチドに結合し得る全長抗体が、細胞上でＣＤ２８ストーク領域に結合し得なかったことから、この領域にアクセスするには、薬剤のサイズが重要であることが示された。特に、ＶＨＨクローンは、ＭＭＰ切断部位内に位置するアミノ酸残基１４５においてＬ－Ｋ置換を有するヒトＣＤ２８ストーク領域配列に結合することができなかった（図２３）。
抗脱落活性は、ペプチドレベルおよび細胞レベルの両方で確認された。ＥＬＩＳＡ技術を使用して、インタクトなヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを検出して、ＶＨＨクローンが、ＭＭＰ－２（図１７）およびＭＭＰ－１３（図２２）によるヒトＣＤ２８ストーク領域の切断を遮断することを確認した。一方、Ｍ９ Ｆａｂは、上記のようにＭＭＰ－２によるＣＤ２８ストーク領域ペプチドの切断を遮断する能力を示したが、細胞上のＣＤ２８ストーク領域に結合することはできず、細胞膜からのＣＤ２８の脱落を阻害することはできなかった。細胞レベルでは、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞（図１８）、ＰＨＡおよびＩＬ－２によって活性化された単離ＣＤ４ Ｔ細胞（図１９）、ならびにスーパー抗原によって活性化されたＰＢＭＣ（図２０）の上清中のヒトｓＣＤ２８レベルを測定することによって、ｓＣＤ２８の脱落を阻害するＶＨＨクローンの有効性を確認した。予想通り、Ｍ９ Ｆａｂは上清中のｓＣＤ２８レベルを減少させず、実際に脱落を遮断するその能力に対する遮断剤のサイズおよびアーキテクチャの重要性をさらに強調した。
重要なことに、ＶＨＨクローンは、ヒトＣＤ２８機能を損なわないことが見出された。フローサイトメトリーを使用して、ＶＨＨクローンは、膜ＣＤ２８へのＣＤ８６結合の大きさを変化させないことが見出された（図１５）。標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマの分泌レベルによって測定した場合、ＶＨＨクローンがＣＤ２８を刺激しないことを示した（図１６）。活性化抗体ＣＤ２８．２を、陽性対照として使用した。同様に、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、サイトカインＩＬ－２の分泌レベルによって測定した場合、ＶＨＨクローンが、ＣＤ２８を介してＣＤ８０－Ｆｃ刺激を拮抗しないことを示した（図２１）。
実施例８：細胞表面からのｓＣＤ２８の脱落を阻害するための他の小さな薬剤の設計
Ｆａｂ断片の生成は、市販のキット、または市販のサービスを使用して行われる。抗体Ｍ９のＣＤＲ領域は、適切なデアイソトープに結合することが示されているため、Ｆａｂ生成に使用される。得られたＦａｂ断片の有効性は、まず、組換えヒトＣＤ２８および二量体ストーク領域ペプチドへの結合アッセイによって試験して、この結合が保持されることを確認する。表面ｍＣＤ２８への結合を、ＦＡＣＳによって、ヒトＣＤ２８を発現するマウス細胞およびヒト免疫細胞に対してアッセイする。抗体ＣＤ２８．２は、陽性対照として使用される。ｓＣＤ２８脱落の直接阻害は、刺激後の免疫細胞培養で試験される。細胞がＦａｂ断片の存在下および非存在下にあるときに、培養培地中のｓＣＤ２８を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。脱落阻害作用を有するＦａｂ断片を、ＣＤ２８シグナル伝達に対するそれらの効果についてアッセイする。まず、Ｔ細胞から炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンγ）の分泌を誘導するＦａｂ断片の能力をアッセイすることによって、アゴニズムを試験する。第２に、ＣＤ８０－Ｆｃ（アゴニスト）の結合を遮断する能力を使用して、Ｆａｂ断片の拮抗特性を試験する。
Ｍ９のＣＤＲを使用した単鎖抗体生成は、市販のサービスを使用する標準的な方法によって、またはＣＤＲをｓｃＦｖ骨格に挿入することによって行われる。精製を行い、得られた抗体を、Ｆａｂ断片について記載された同じアッセイによって評価する。
単一ドメイン抗体は、２つの戦略のうちの１つによって産生される。１）ナイーブライブラリ－ナイーブラマ由来ＶＨＨのファージライブラリの使用－ライブラリは、ナイーブラマ脾臓から採取されたＶＨＨ配列から構成され、すなわち、Ｂ細胞を抽出し、ＶＨＨのＣＤＲの利用可能なレパートリー全体を配列決定した。これらのＣＤＲは、ライブラリを生成するためにファージに実装されている。ライブラリを、組換えＣＤ２８細胞外ドメインおよび二量体ストーク領域ペプチドに対してスクリーニングして、ｓＣＤ２８に特異的に結合する抗体を見つける。２）免疫ライブラリ－ＣＤ２８を過剰発現する細胞を用いてラマまたは他のラクダ科動物またはサメを免疫化する。細胞免疫化後、脾臓を抽出し、利用可能なＶＨＨのＣＤＲのレパートリーを配列決定する。ハイブリドーマは、抽出された脾臓Ｂ細胞から作製される。得られた抗体をファージに実装して、ライブラリを生成し、ライブラリを組換えＣＤ２８細胞外ドメインおよび二量体ストーク領域ペプチドに対してスクリーニングして、ｓＣＤ２８に特異的に結合する抗体を見つける。特異的結合を有する単一ドメイン抗体を、Ｆａｂ断片および単鎖抗体について行われるように、脱落の遮断およびアゴニズム／アンタゴニズムについて評価する。
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替物、改変物、および変形物が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に収まるこのような代替物、改変物、および変形物をすべて包含することが意図されている。

Claims (40)

  1. 細胞の表面上の膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤であって、１００キロダルトン（ｋＤａ）未満である、薬剤。
  2. 前記薬剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される、請求項１に記載の薬剤。
  3. 前記薬剤が、５０ｋＤａ未満である、請求項２に記載の薬剤。
  4. 前記単一ドメイン抗体が、ラクダ抗体またはサメ抗体である、請求項３に記載の薬剤。
  5. 前記ラクダ抗体が、３つのＣＤＲを含み、
    ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３５（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）に示されるアミノ酸配列を含むか、
    ＣＤＲ１は、配列番号３６（ＩＮＡＭＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３７（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含むか、または
    ＣＤＲ１は、配列番号３３（ＩＮＡＭＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３９（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）に示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項４に記載の薬剤。
  6. 前記ラクダ抗体が、
    ａ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３０）、
    ｂ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１）、および
    ｃ．ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３２）
    からなる群から選択される配列を含む、請求項５に記載の薬剤。
  7. 前記薬剤が、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、
    ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１７（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１８（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１９（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２０（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２１（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２２（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤。
  8. 前記薬剤が、ヒト化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。
  9. 前記薬剤が、ＣＤ２８アゴニストではない、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤。
  10. 前記薬剤が、ＣＤ２８アンタゴニストではない、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤。
  11. 前記薬剤が、前記ｍＣＤ２８を分解することも、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を阻害することもない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬剤。
  12. 抗体の前記抗原結合断片が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しない、請求項２～１１のいずれか一項に記載の薬剤。
  13. ＣＤ２８のストーク領域内に結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬剤。
  14. 前記ストーク領域が、アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）またはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号２７）を含む、請求項１３に記載の薬剤。
  15. 前記ストーク領域が、アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる、請求項１３または１４に記載の薬剤。
  16. 前記薬剤が、少なくとも１つのプロテアーゼの切断部位に結合する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の薬剤。
  17. 前記薬剤が、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の薬剤。
  18. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、少なくとも１つのメタロプロテアーゼである、請求項１６または１７に記載の薬剤。
  19. 前記少なくとも１つのメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである、請求項１８に記載の薬剤。
  20. 可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルの減少を必要とする対象において、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させる方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬剤を投与することを含む、方法。
  21. がんの治療および／または予防を必要とする対象において、がんを治療および／または予防する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬剤を投与することを含む、方法。
  22. ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法の改善を必要とする対象において、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬剤を投与することを含む、方法。
  23. 前記対象が、がんに罹患している、請求項２０または２２に記載の方法。
  24. 前記がんが、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がん、および結腸直腸がんから選択される、請求項２１または２３に記載の方法。
  25. 前記がんが、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、および結腸直腸がんから選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法が、ｍＣＤ２８を分解しないか、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記投与の前の前記対象の血液が、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する方法であって、
    ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
    ｂ．取得された前記薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
    ｃ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、
    ならびに
    ｄ．薬剤をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクターを含む宿主細胞を培養すること、のうちの少なくとも１つを含み、前記核酸配列が、
    ｉｖ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤であって、１００ｋＤａ未満である、薬剤を取得すること、
    ｖ．取得された前記薬剤の細胞表面上のｍＣＤ２８への結合を試験すること、および
    ｖｉ．細胞表面ｍＣＤ２８に結合する薬剤を選択すること、
    によって選択された薬剤の核酸配列であり、
    それによって、細胞表面上のｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を生成する、方法。
  29. 前記取得することが、５０ｋＤａ未満の薬剤を取得することであり、前記取得された薬剤が、５０ｋＤａ未満である、請求項２８に記載の方法。
  30. 細胞表面上のｍＣＤ２８のプロテアーゼによる切断を遮断する前記薬剤の能力を試験することをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記プロテアーゼが、ＭＭＰ－２およびＭＭＰ－１３から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記薬剤を取得することが、
    ａ．サメまたはラクダ科動物を、前記ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で免疫化し、免疫化された前記生物から抗体を収集すること、および
    ｂ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片への結合について薬剤のライブラリをスクリーニングし、結合する薬剤を選択すること、
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片が、二量体または単量体である、請求項３２に記載の方法。
  34. ａ．前記抗体を収集することが、免疫化された前記サメまたはラクダ科動物の脾臓からＢ細胞を抽出することを含むか、または
    ｂ．前記結合する薬剤を選択することが、選択された前記薬剤を配列決定すること、および前記配列から前記薬剤の組換え形態を生成することを含む、
    請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項２８～２５のいずれか一項に記載の方法により生成される薬剤。
  37. 請求項１～１９および３６のいずれか一項に記載の薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
  38. がんを治療および／もしくは予防する、ＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法を改善する、またはｓＣＤ２８のレベルを低減することを必要とする対象において、それを行う方法であって、請求項３７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  39. 請求項１～１９および３６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの薬剤を含むキット。
  40. ａ．抗ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１免疫療法、ならびに
    ｂ．本発明の前記薬剤がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に基づく免疫療法とともに使用するためのものであることを示すラベル、
    のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項３９に記載のキット。
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