CN113710704A - 小脱落阻断剂 - Google Patents

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Abstract

提供了小于100千道尔顿的试剂，其结合细胞表面上的膜免疫受体并抑制该免疫受体的蛋白酶剪切。还提供了治疗癌症并提高免疫疗法的方法，包括施用所述试剂。

Description

小脱落阻断剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月30日提交的美国临时专利申请号62/954,802、2019年12月2日提交的美国临时专利申请号62/942,240和2019年3月14日提交的美国临时专利申请号62/818,351的优先权权益，其全部内容通过引用以其全部并入本文。
技术领域
本发明属于免疫调节和免疫疗法领域。
背景技术
适应性免疫系统在针对病原体和癌细胞的调节和保护中起关键作用，主要通过协调结合抗原特异性辅助CD4+和细胞毒性CD8+T细胞的刺激。抗原呈递细胞(APC)持久且连续地活化T细胞包括i)T细胞受体(TCR)与APC上主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽的接合；以及ii)结合也由APC表达的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)配体的T细胞上的共刺激性CD28受体。CD28共刺激的生物学后果很多，并包括通过降低实现免疫效应功能所需的阈值来控制T细胞周期、扩增、分化以及TCR刺激的放大。
与活化性共刺激分子CD28不同，结构同系物，细胞毒性T淋巴细胞相关4(CTLA-4)，是一种抑制性共刺激受体，其膜表达由CD28的触发驱动。CTLA-4和CD28都是I型跨膜蛋白。它们的胞外部分由一个V组免疫球蛋白超家族(Ig-V)结构域组成，该结构域由位于IgV结构域外靠近跨膜区的半胱氨酸残基同源共价连接。尽管相似，CTLA-4和CD28在亲和力和四级结构排列方面有所不同。CTLA-4被发现对B7分子具有更高的结合亲和力，并且与CD28不同的二聚化模式导致与共享配体不同的化学计量结合。CD28表现出单价结合化学计量，而CTLA-4以二价方式相互作用。因此，CTLA-4以比CD28高得多的亲和力和抗体亲抗源性结合B7分子，并从而下调T细胞反应并助于抗原特异性耐受的起始。
已经表明一些共刺激分子具有几种生理形式。除了膜结合形式，已经描述了在稚免疫细胞中表达的可溶性形式，增加了T细胞生物学的复杂性。CD28的可溶性形式(sCD28)已被归因于交替剪接的基因产物。剪接事件导致移码，结果是在翻译终止前在第137位甘氨酸后添加了两个谷氨酸残基。最终产物缺乏整个跨膜和细胞质区域，并且重要的是缺乏位置141处的半胱氨酸残基，其介导二聚体CD28的二硫键(Magistrelli G.,BiochemBiophyRes Commun,1999)。检查了单体CD28可溶性形式的生物学功能和反受体结合(Hebbar，M.,Clin Exp Immunol,2004)并且显示也抑制T细胞增殖。同样，在二聚体sCD28的情况中，建议了具有通过结合至B7分子抑制T细胞功能的调节作用(Sun,Z.,Centr Eur JImmunol,2014；Hebbar,M.,Clin Exp Immunol,2004)。值得注意的是，已有报道了具有自身免疫性障碍的患者血清中sCD28分子数量增加(Wong,C.K.,Rheumatol,2005；Hamzaoui,K.,Clin Exp Rheumatol,2005；Hebbar,M.,Clin Exp Immunol,2004；Sun,Z.,Clin Immunol,2014)。sCD28的确切来源存在争议。使用T细胞活化的体外模型，反映了自身免疫患者的T细胞的持久炎症状态，其已经显示，在T细胞活化过程中，可选的可溶性形式的转录受到抑制，且只有CD28的全长膜形式明显，而培养物中sCD28的量升高(Hebbar,M.,Clin ExpImmunol,2004)。这种现象导致建议：CD28的膜形式的有效脱落是血清中可溶性分子升高的原因，然而，这还有待证实。过去，T细胞活化过程中的有效脱落被描述为通过粘附分子的蛋白水解来抵消连续活化的调节机制。
虽然CTLA-4限制了早期T细胞反应的幅度，但另一种抑制性受体，PD-1，抑制外周中T细胞功能。PD-1的表达在T细胞活化过程中升高，并且其已知配体是B7家族同系物：B7-H1(PD-L1)和B7-H2(PD-L2)。这些同系物存在于APC和癌细胞上，并驱动活化的T细胞进入细胞无反应性状态，导致免疫反应减弱。因此，针对CTLA-4和PD-1/PD-L1轴的靶向疗法已在多种癌症类型中显示出临床活性。最近，研究表明CD28的信号传导通路被PD-1靶向和抑制(Hui,E.,Science,2017)并且伴随地对于有效的PD-1疗法的进行，完整的活性CD28/B7轴是必不可少的(Kamphorst,A.O.,Science,2017)。
然而，并非所有患者都对基于PD-1的免疫疗法或一般免疫疗法有反应，并且那些患者确实经常复发。因此，非常需要能够提高患者免疫细胞攻击癌症能力的方法和分子。
发明内容
本发明提供小于100千道尔顿的试剂，其结合细胞表面上的膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切。还提供了治疗和预防癌症并改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法的方法，其包括施用所述试剂。
根据第一方面，提供了结合细胞表面上的膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂，其中试剂小于100千道尔顿(kDa)。
根据另一方面，提供了降低有需要的受试者中可溶性CD28(sCD28)水平的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
根据另一方面，提供了治疗和/或预防有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
根据另一方面，提供了在有需要的受试者中改善基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
根据另一方面，提供了产生抑制细胞表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂的方法，其包括以下步骤中至少一步：
a.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中所述试剂小于100kDa；
b.测试获得的试剂与细胞表面上mCD28的结合；和
c.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
和
d.培养包括一种或多种载体的宿主细胞，所述一种或多种载体包括编码试剂的核酸序列，其中所述核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
i.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中所述试剂小于100kDa；
ii.测试获得的试剂与细胞表面上mCD28的结合；和
iii.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
由此产生抑制细胞表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
根据另一方面，提供了通过本发明的方法生产的试剂。
根据另一方面，提供了包括本发明的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂的药物组合物。
根据另一方面，提供了在需要的受试者中治疗和/或预防癌症、改善基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法或降低sCD28水平的方法，所述方法包括施用本发明的药物组合物。
根据另一方面，提供了包括本发明的至少一种试剂的试剂盒。
根据一些实施方式，试剂选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合至CD28的肽。
根据一些实施方式，试剂小于50kDa。
根据一些实施方式，单结构域抗体是骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。
根据一些实施方式，骆驼科动物抗体包括三个CDR，其中：
CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:34(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:35(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列；
CDR1包括SEQ ID NO:36(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:37(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:38(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列；或
CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:39(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:40(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
根据一些实施方式，骆驼科动物抗体包括选自以下的序列：
a.EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:30)；
b.EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:31)；和
c.QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:32)。
根据一些实施方式，试剂包括包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包括SEQ ID NO:17(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQID NO:18(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:19(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:20(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:21(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:22(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。
根据一些实施方式，试剂是人源化的。
根据一些实施方式，试剂不是CD28激动剂。
根据一些实施方式，试剂不是CD28拮抗剂。
根据一些实施方式，试剂既不降解mCD28也不抑制mCD28-介导的免疫细胞活化。
根据一些实施方式，抗体的抗原结合片段不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或互补依赖性细胞毒性(CDC)。
根据一些实施方式，试剂结合CD28的茎区域内。
根据一些实施方式，茎区域包括氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:27)。
根据一些实施方式，茎区域由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成。
根据一些实施方式，试剂在剪切位点结合至少一种蛋白酶。
根据一些实施方式，试剂通过至少一种蛋白酶抑制蛋白酶剪切。
根据一些实施方式，至少一种蛋白酶是至少一种金属蛋白酶。
根据一些实施方式，至少一种金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13或其组合。
根据一些实施方式，受试者患有癌症。
根据一些实施方式，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结肠直肠癌。
根据一些实施方式，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
根据一些实施方式，方法不降低mCD28或降低mCD28介导的免疫细胞活化。
根据一些实施方式，施用之前受试者血液包括至少5ng/ml sCD28。
根据一些实施方式，获得是获得小于50kDa的试剂，和其中获得的试剂小于50kDa。
根据一些实施方式，方法进一步包括测试试剂通过细胞表面上mCD8的蛋白酶阻断剪切的能力。
根据一些实施方式，蛋白酶选自MMP-2和MMP-13。
根据一些实施方式，获得试剂包括以下步骤中至少一步：
a.利用CD28胞外结构域或其片段免疫鲨鱼或骆驼科动物，并从免疫生物收集抗体；和
b.筛选与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂文库并选择结合的试剂。
根据一些实施方式，CD28胞外结构域或其片段是二聚体的或单体的。
根据一些实施方式，
a.收集抗体包括从免疫的鲨鱼或骆驼科动物的脾提取B细胞；或
b.选择结合的试剂包括对选择的试剂进行测序并从序列产生试剂的重组形式。
根据一些实施方式，方法进一步包括在获得的试剂存在的情况下测定mCD28下游信号传导和选择既不实质激动也不实质拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。
根据一些实施方式，试剂盒进一步包括以下至少一种：
a.抗-PD-1和/或PD-L1免疫疗法；和
b.叙述本发明的试剂用于基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的标签。
从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，该详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅作为说明给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1.在PBMC刺激期间产生可溶性CD28，并通过添加蛋白酶抑制剂(PI)来抵消。用SEB(0.5ng/mL，左侧)或CMV肽(0.5μg/mL，右侧)刺激的PBMC的培养物中可溶性CD28的量的条形图通过人CD28 ELISA(上图)定量。以指示浓度添加蛋白酶抑制剂的混合物。通过干扰素γ的分泌检查整体健康和效应子活性(下图)。
图2.在通过PHA刺激T细胞期间产生可溶性CD28，并通过添加蛋白酶抑制剂来抵 消。在蛋白酶抑制剂混合物以固定浓度(2μM)存在的情况下用增加浓度的PHA(1-4μg/mL，上图)刺激Jurkat细胞(左上)或分离的人CD4 T细胞(右上)的条形图。在另一设置中，固定PHA浓度来刺激Jurkat T细胞(1μg/mL PHA，左下)或人CD4 T细胞(2μg/mL PHA，右下)，并滴定蛋白酶抑制剂混合物的浓度(0.5-2μM)。用标准夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度。
图3A-3B.在通过SEB活化人PBMC期间，特异性ADAM-10和ADAM-17抑制剂消除可溶 性CD28的积聚，但不隐蔽它们的生存力。(3A-B)在(3A)ADAM-10特异性抑制剂(GI254023X)和(3B)ADAM-17特异性抑制剂(TMI-1)以各种浓度(0.01-1μM)存在的情况下用SEB(1ng/mL)刺激的人PMBC的条形图。使用MTT测定评估不同处理中细胞的生存力(上图)。利用标准夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度(下图)。
图4A-4D.在PBMC刺激期间产生可溶性CD28。(4A)未成熟树突状细胞与来自同一供体的CD3 T细胞以1:5的比例混合的条形图，没有CMV肽(黑色条)或具有CMV肽(深灰色条)。单独或具有CMV的每个细胞群的对照为浅灰色条。用标准夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度。(4B-D)在ADAM-10和ADAM-17抑制剂存在的情况下用(4B)CMV或(4C)SEB或(4D)SEB刺激人PBMC持续24然后转移至清洁培养物的条形图。图4D中的测量是在细胞转移后120小时。
图5.可溶性CD28抑制效应细胞因子分泌。用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的条形图，不具有重组人CD28(黑色条)或具有指示浓度的重组人CD28(灰色条)。没有CMV刺激的首次用于实验的样品由浅灰色条指示。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IFNγ的浓度。
图6.可溶性CD28增加IL-6细胞因子分泌。用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的条形图，不具有重组人可溶性CD28(黑色条)或具有指示浓度的重组人可溶性CD28(灰色条)。没有CMV刺激的首次用于实验的样品由浅灰色条指示。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IL-6的浓度。
图7A-7E.(7A)在指示浓度下重组人可溶性CD28(灰色三角)或重组人可溶性CTLA-4(黑色圆环)存在的情况下用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的线图。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IL-6、IFNγ和IL-4的浓度。使用Magpix系统(Millipore)利用多重分析定量上清液中人IL-8、IL-12p(40)和IL-10的浓度。(7B)自体单核细胞和CD3MLR的细胞因子分泌的条形图。没有CMV刺激的首次用于实验的样品由浅灰色条指示。单独或具有IgG对照的CMV利用黑色条指示。sCD28的增加浓度利用深灰色条指示。(7C)在重组人可溶性CD28(灰色圆环)存在的情况下用SEB刺激或用对照IgG(灰色三角)刺激的人PBMC的淋巴细胞簇形成的线图。(7D)用犬尿氨酸ELISA试剂盒从用和不用重组人sCD28处理的单核细胞中测量的IDO分泌到培养物中的条形图。(7E)用和不用重组人sCD28处理的单核细胞中IDO的细胞内FACS的散点图。
图8A-8C.可溶性CD28妨碍抗-PD1处理。(8A)在抗-PD1(MK3475，5μg/mL，黑色条)或重组人可溶性CD28(2和10μg/mL，灰色条)或两者的组合(虚线条)存在的情况下，用SEB(200ng/mL，左侧条)或CMV肽(0.5μg/mL，右侧条)刺激人PBMC3天的条形图。(8B)单核细胞MLR设置的细胞因子分泌的条形图，首次用于实验的-白色条，CMV单独-浅灰色条，sCD28-黑色条，MK-3475-深灰色条，sCD28+MK-3475-格条纹。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IFNγ、TGFβ和IL-2的浓度。(8C)利用对照和sCD28温育后单核细胞中表面PD-L1(左)和PD-L2(右)表达的直方图。
图9A-9C.癌症患者中的可溶性CD28。(9A)显示用于调查可溶性人CD28的存在的10个癌症适应症和健康供体中每一个中的20个血浆样品的点图。用多种稀释因子重复检查含有高含量可溶性CD28的样品。利用标准化夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度，内部校准以适应人血浆样品的读数。(9B)在sCD28、MK-3475和两者的组合存在的情况下，通过夹心ELISA所测量的来自癌症患者的SEB刺激的PBMC的IFNγ分泌的条形图(肉瘤患者-左上，肾癌患者-右上，和两种不同的头颈癌患者-下)。(9C)癌细胞SCC-25生存力和增殖单独、与IL-6、与单核细胞共培养或与单核细胞和sCD28共培养的条形图。
图10A-10B.(10A)在恒定的CD80-Fc水平和滴定可溶性CD28存在的情况下用抗-CD3刺激的分离的CD3 T细胞的IFNγ的条形图。(10B)在恒定的sCD28水平和CD80-Fc滴定存在的情况下用CMV刺激的分离的PBMC。
图11A-11B.(11A-B)用抗-PD-1抗体处理的免疫活性的小鼠中接种的H22细胞的肿瘤体积的线图，不施用重组小鼠CD28(11A)和施用重组小鼠CD28(11B)。
图12A-12C.(12A)显示通过系列稀释克隆M9与BSA缀合的CD28茎区域二聚体肽(右)和重组人CD28蛋白(左)结合的抗原的线图。抗原被固定在maxisorp ELISA平板上。进行克隆M9的稀释系列，并使用驴抗小鼠IgG(H&L)-HRP检测结合的抗体，并使用TMB进行显影。(12B)重组人sCD28(左)和从用SEB活化的人PBMC脱落的sCD28(右)的ELISA检测的条形图。ELISA使用抗体#3作为阳性对照(2μg/mL，灰色条)，无关抗体M39作为阴性对照(10μg/mL，深灰色条)，和抗-剪切抗体M9(10μg/mL，黑色条)。通过使用缀合至HRP(0.5μg/mL)的ELISA试剂盒检测抗体进行重组CD28或脱落的CD28的检测。(12C)显示抗体M9(上)和对照抗体CD28.2(下)以10μg/ml(黑色直方图)的固定浓度至在小鼠HEK293细胞中表达的人CD28的结合的直方图。多克隆小鼠IgG用作阴性对照(10μg/ml)并在灰色直方图中描绘。通过AlexaFluor 647–缀合的山羊抗-小鼠的二次温育完成检测。
图13.通过ELISA与人CD28茎区域序列的结合。通过不同VHH克隆的系列稀释分析抗原结合。用作抗原的生物素缀合的CD28茎区域二聚体肽固定在中性抗生物素蛋白(neutravidin)涂覆的ELISA maxi-sorb平板上。进行VHH克隆的系列稀释，并使用抗His标签-HRP缀合抗体检测结合的VHH，并使用TMB进行显影。
图14.VHH#2A1与膜人CD28的结合。用过表达人CD28的HEK细胞温育FITC缀合的VHH克隆2A1(50μg/mL，黑色直方图)和FITC缀合的同种型对照(mIgG，50μg/mL，灰色直方图)。通过FACS分析评估结合。
图15.抗CD28茎区域VHH克隆不阻断结合至膜CD28的配体。使用与AlexaFlour 647缀合的二级抗人Fc抗体，对于CD86-Fc(2μg/mL)结合，通过流式细胞术监测过表达人CD28的HEK293细胞。向CD86-Fc添加抗CD28 VHH克隆(30μg/mL，黑色直方图)不改变CD86结合的尺寸，而添加商业抗体克隆CD28.2(10μg/mL，左上图，黑色直方图)显著减少结合。
图16.抗-CD28 VHH克隆的激动剂作用评估。在用作阳性对照的抗-CD28激动剂抗体克隆28.2(2μg/mL，深灰色)、抗-CD28茎区域VHH或无关VHH克隆(20μg/mL，黑色条)存在的情况下用平板结合的抗-CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)刺激人分离的CD3细胞2天。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量分泌到清液中的人IFNγ的浓度。
图17.通过VHH克隆体外阻断人CD28茎区域的MMP-2介导的剪切。c-Myc缀合的和生物素化的人CD28茎区域二聚体肽(1μM)在MMP-2抑制剂(TMI-1，50nM)M9 Fab或指示的VHH克隆以各种浓度(0.4-10μg/mL)存在的情况下用50ng rhMMP-2进行温育5小时。在中性抗生物素蛋白涂覆的ELISA maxi-sorb平板上加载混合物，随后通过抗cMyc-HRP缀合的抗体广泛洗涤并检测完整肽，并用TMB进行显影。
图18.抗-CD28茎区域VHH克隆2A1和4A4抑制过表达人CD28的HEK细胞中CD28脱落。48小时温育后在稳定表达人CD28的HEK细胞的培养基中测量可溶性CD28的水平。描绘了各种浓度(3.3-100μg/mL)下MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、无关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)或抗-CD28茎区域VHH克隆(黑色条)的不同处理对可溶性CD28的量的影响。利用标准夹心ELISA(R&D系统)定量上清液中可溶性人CD28的水平。
图19.抗-CD28茎区域VHH克隆2A1和4A4抑制通过PHA和IL2活化的分离的CD4T细胞中CD28脱落。在用5μg/mL PHA和200IU/mL IL-2刺激的分离的人CD4 T细胞的培养基中测量可溶性CD28的水平(浅灰色条)。描绘了各种浓度(0.4-50μg/mL)下MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、无关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)、抗-CD28茎区域VHH克隆或抗体M9克隆的Fab格式(黑色条)的不同处理对可溶性CD28的量的影响。利用标准夹心ELISA(R&D系统)定量上清液中可溶性人CD28的水平。
图20.抗-CD28茎区域VHH克隆2A1和4A4抑制通过超级抗原活化的PBMC中的CD28脱落。在用1ng/mL SEB刺激的分离的PBMC的培养基中测量可溶性CD28的水平(浅灰色条)。描绘了各种浓度(0.4-50μg/mL)下MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、无关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)、抗-CD28茎区域VHH克隆或M9克隆的Fab格式(黑色条)的不同处理对可溶性CD28的量的影响。利用标准夹心ELISA(R&D系统)定量上清液中可溶性人CD28的水平。
图21.抗-CD28 VHH克隆的拮抗剂作用评估。在用作配体进行CD28共刺激的重组CD80-Fc蛋白(5μg/mL，深灰色条)存在的情况下，用平板结合的抗-CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)刺激人分离的CD3细胞24小时。以各种浓度(3.75-30μg/mL，黑色条)添加无关VHH克隆(左上图)或抗-CD28茎区域VHH。利用标准夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IL-2的浓度。
图22.VHH克隆2A1对通过MMP-13的人CD28茎区域剪切的体外阻断活性。c-Myc和生物素化的人CD28茎区域二聚体肽(1μM)在MMPi(TMI-1，50nM，深灰色条)、无关VHH克隆(左图中的黑色条)、或VHH克隆2A1(右图中的黑色条)以各种浓度(0.62-10μg/mL)存在的情况下用50ng rhMMP-13(浅灰色条)进行温育5小时。在中性抗生物素蛋白涂覆的ELISA maxi-sorb平板上加载混合物，随后通过抗cMyc-HRP缀合的抗体广泛洗涤并检测完整肽，并用TMB进行显影。
图23.抗CD28茎区域VHH克隆2A1、4A1和4A4特异性结合至人CD28的MMP剪切位点。通过直接ELISA进行的VHH克隆与人CD28茎区域WT序列或与L145突变的序列特异性结合的比较。生物素缀合的野生型或L145K CD28茎区域二聚体肽固定在中性抗生物素蛋白涂覆的ELISA maxi-sorb平板上。进行VHH克隆(0.2-5μg/mL)和无关VHH克隆(左上图)的系列稀释，并使用抗His标签-HRP缀合抗体检测结合的VHH，并使用TMB进行显影。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明提供了小于100千道尔顿(kDa)的试剂，其结合细胞表面上的膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切。还提供了在受试者中治疗癌症、改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法、和降低sCD28水平的方法，包括施用本发明的试剂。本发明的试剂和方法基于以下令人惊讶的发现：针对mCD28的剪切位点的全尺寸抗体太大而无法接近膜近侧区域，并因此无法抑制脱落。而是，需要对细胞表面上的mCD28具有特异性的较小试剂。进一步，大量癌症患者在其血流中具有升高的sCD28水平，其由sCD28脱落引起。该sCD28起到免疫抑制剂的作用，并且因此脱落的减少具有通过sCD28降低抑制和通过mCD28信号传导增加免疫活化的双重益处。进一步，预料不到地发现，sCD28可抑制基于PD-1/PD-L1的免疫疗法。
试剂
根据第一方面，提供了结合膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
在一些实施方式中，mCD28在细胞表面上。在一些实施方式中，mCD28在膜中。在一些实施方式中，试剂不是全尺寸抗体。在一些实施方式中，试剂不是IgG。在一些实施方式中，试剂小于100千道尔顿(kDa)。在一些实施方式中，试剂小于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20或15kDa。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂小于50kDa。在一些实施方式中，试剂小于25kDa。在一些实施方式中，试剂小于20kDa。在一些实施方式中，试剂小于15kDa。
在一些实施方式中，CD28是哺乳动物CD28。在一些实施方式中，CD28是人CD28。在一些实施方式中，人CD28包括或由以下氨基酸序列组成：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，成熟CD28缺少信号肽并且包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，编码全长人CD28的DNA编码序列包括序列：ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:3)。
如本文所使用，sCD28是指不包括跨膜结构域并因此不能在膜中整合的任何CD28片段或变体。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包括氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，sCD28不是膜结合的。在一些实施方式中，sCD28在溶液中。在一些实施方式中，sCD28是血液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是TME中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是体液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28是由剪接掉CD28的外显子3的交替剪接产生的剪接变体。在一些实施方式中，sCD28是来自膜CD28(mCD28)的剪切产物。在一些实施方式中，sCD28是截短的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少全长CD28的胞质结构域。在一些实施方式中，sCD28是二聚体sCD28。在一些实施方式中，sCD28是单体sCD28。在一些实施方式中，sCD28不是由交替剪接CD28产生的剪接变体。在一些实施方式中，交替剪接剪接掉CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28包括氨基酸序列：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28缺少信号肽并包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28包括氨基酸序列：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP(SEQ IDNO:48)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28缺少信号肽并包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，编码人sCD28的DNA编码序列包括序列：ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:7)。
sCD28对免疫细胞的作用是本领域众所周知的，并且作为非限制性实例包括抗炎症细胞因子诸如IL-10或TGFβ的免疫细胞诱导，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的免疫细胞表达，以及促炎细胞因子诸如IL-2或IFN-γ的免疫细胞下调。在一些实施方式中，试剂抑制膜CD28的蛋白酶剪切包括抑制sCD28的产生。在一些实施方式中，抑制sCD28的产生包括抑制sCD28对免疫细胞的作用。
如本文所使用，抑制蛋白酶剪切是指mCD28的蛋白酶剪切的任意减少。在一些实施方式中，抑制是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的剪切减少。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切保持mCD28对免疫细胞的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切增加mCD28对免疫细胞的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切保持足以免疫刺激的mCD28水平。
在一些实施方式中，蛋白酶剪切的减少是至少一种蛋白酶的剪切减少。在一些实施方式中，蛋白酶剪切的减少是至少一种金属蛋白酶的剪切减少。在一些实施方式中，金属蛋白酶MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17、MMP-13或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2或MMP-13。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13或其组合。
在一些实施方式中，试剂选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合至CD28的肽。在一些实施方式中，试剂是Fab片段。在一些实施方式中，试剂是单链抗体。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是特异性结合至CD28的肽。
在一些实施方式中，试剂缺失Fc结构域。在一些实施方式中，试剂是缺少Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，试剂是骆驼科动物抗体、鲨鱼抗体或纳米抗体。在一些实施方式中，抗体或片段融合至另一蛋白或蛋白的片段。在一些实施方式中，第二蛋白或片段增加半衰期，特别是血清中。在一些实施方式中，半衰期延长蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方式中，试剂通过产生增强半衰期的修饰的化学物质进行修饰。在一些实施方式中，修饰是PEG化和化学物质是聚乙二醇。本领域技术人员将认识到，可以使用任何半衰期延长蛋白或化学剂，或本领域已知的修饰。
试剂的实例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和与CD28特异性结合的肽。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是纳米抗体。在一些实施方式中，试剂是VHH抗体。如本文所使用，术语“单结构域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”是同义词并可互换使用。在一些实施方式中，肽具有结合至CD28的特异性。在一些实施方式中，试剂是特异性结合至CD28的肽。在一些实施方式中，肽选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、纳米抗体、VHH抗体和抗体模拟物。如本文所使用，术语“抗体模拟物”是指可以特异性结合至靶抗原的有机化合物。在一些实施方式中，抗体模拟物与抗体在结构上不相关。抗体模拟物的实例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体(alphabodies)、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体(monobodies)、和纳米CLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。所有这些试剂在本领域是已知的并且已知用于阻断受体与其配体之间的相互作用。可以结合mCD28的小分子和蛋白可以堵塞剪切位点或可能引起隐蔽或损害蛋白酶的接近。在一些实施方式中，蛋白是抗体模拟物。如本文所使用，术语“DARPin”是指设计的锚蛋白重复蛋白。DARPins通常是工程化的抗体模拟物蛋白，其通常对于其蛋白靶具有高度特异性。因此，CD28的DARPin可以是试剂的实例。
在一些实施方式中，Fab片段包括约50kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于100kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于80kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于70kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于50kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括50kDa或更小的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括约25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于50kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于40kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于30kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括25kDa或更小的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括约15kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-17kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-16kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-15kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-15kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-16kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-17kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于20kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于15kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括15kDa或更小的尺寸。由于其小尺寸，且仅有3个CDR，单结构域抗体包括凸形，且仅从一侧结合其表位。相比之下，Fab片段和单链抗体包含6个CDR并从至少2个侧面结合表位。在一些实施方式中，与6个CDR结合相比，仅与3个CDR结合允许更好地接近mCD28茎区域。在一些实施方式中，单结构域抗体结合的几何形状更优于接近mCD28茎区域。
如本文所使用，术语“抗体”是指包含至少一个结合结构域的多肽或一组多肽，所述结合结构域由具有三维结合空间的多肽链折叠形成，所述三维结合空间具有与抗原决定簇的特征互补的内表面形状和电荷分布。抗体通常具有四聚体形式，包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。抗体可以是寡克隆、多克隆、单克隆、嵌合、骆驼科化、CDR移植、多特异性、双特异性、催化、人源化、全人、抗独特型和可以以可溶或结合形式标记的抗体以及片段(包括表位结合片段)、其变体或衍生物，单独或与其他氨基酸序列组合。抗体可以来自任何物种。术语抗体还包括结合片段，包括，单不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab')2单链抗体(scFv)、二聚可变区(Diabody)和二硫键可变区(dsFv)。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。抗体片段可以融合或不融合到另一免疫球蛋白结构域，包括但不限于，Fc区或其片段。本领域技术人员将进一步认识到，可以产生其他融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合、可变区(例如VL和VH)～Fc融合和scFv-scFv-Fc融合。
免疫球蛋白分子可以拥有任何类型(如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。
天然存在的抗体结构的基本单元是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成，通过非共价缔合和通过二硫键连接在一起。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在五种人抗体类别(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并且在这些类别内，基于结构差异鉴定各种亚类，诸如单个抗体分子中免疫球蛋白单元的数量，个体单元的二硫键结构，以及链长和序列的差异。抗体的类别和亚类是其同种型。在一些实施方式中，Fab片段具有小于100、90、80、75、70、65、60、55、或50kDa的尺寸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，Fab片段具有小于50kDa的尺寸。
重链和轻链的氨基末端区在序列上比羧基末端区更加多样性，因此被称为可变域。抗体结构的这部分赋予抗体的抗原结合特异性。重可变(VH)结构域和轻可变(VL)结构域一起形成单个抗原结合位点，因此，基本免疫球蛋白单元具有两个抗原结合位点。特定氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Chothia et al.,J.Mol.Biol.186,651-63(1985)；Novotny和Haber,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824592-4596)。
重链和轻链的羧基末端部分形成恒定结构域，即CH1、CH2、CH3、CL。虽然在这些结构域中存在更少多样性，但是动物物种之间存在差异，并且进一步，在相同的个体内，存在若干抗体的不同同种型，每个具有不同的功能。
术语“框架区”或“FR”是指抗体的可变结构域中的氨基酸残基，其不同于本文定义的高变区氨基酸残基。本文使用的术语“高变区”指抗体的可变结构域中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。CDR主要负责结合至抗原的表位。FR和CDR的范围已经被精确定义(参见，Kabat等人)。
免疫球蛋白可变结构域还可以使用IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(
Figure BDA0003303058480000141
/V-Quest)进行分析以鉴定可变区段，包括CDR。参见，如，Brochet,X.et al,Nucl.Acids Res.J6:W503-508(2008)。
Chothia等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域技术人员可以明确地将这种“Chothia编号”系统分配给任何可变结构域序列，而无需依赖序列本身以外的任何实验数据。如本文所使用，“Chothia编号”是指由Chothia等人Journalof Molecular Biology,"Canonical Structures for the Hypervariable regions ofimmunoglobulins"(1987)和Chothia的人Nature,“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”(1989)提出的编号系统。
如本文所使用，术语“单链抗体”和“单链可变片段”同义使用，并且是指由短肽接头连接的免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合蛋白。在一些实施方式中，单链抗体具有小于50、45、40、35、30、25、或20kDa的尺寸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，单链抗体具有小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体的接头在10和25个氨基酸之间。在一些实施方式中，接头在1-40、5-40、10-40、1-35、5-35、10-35、1-30、5-30、10-30、1-25、5-25或10-25个氨基酸之间。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的重链。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的轻链。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的CDR。
如本文所使用，术语“单结构域抗体”、“纳米抗体”和“VHH”同义使用，并且是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体是骆驼科动物抗体。在一些实施方式中，骆驼科动物是骆驼、羊驼或美洲驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是骆驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是羊驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是美洲驼。在一些实施方式中，单结构域抗体是鲨鱼抗体。
还有，本文已经指示，纳米抗体的氨基酸残基根据Kabat等人给出的VH一般编号进行编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public HealthServices,NIH Bethesda,Md.,Publication No.91)，在Riechmann和Muyldermans的文章中应用于骆驼科动物的VHH结构域，J.Immunol.Methods 2000Jun.23；240(1-2):185-195；或本文提及。根据该编号，纳米抗体的FR1包括在位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括在位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括在位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括在位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括在位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括在位置95-102的氨基酸残基，和纳米抗体的FR4包括在位置103-113的氨基酸残基。在这方面，应当注意到——如本领域熟知的VH结构域和VHH结构域——每个CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，并且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能不被占据，或实际序列可能包含比Kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，一般地，根据Kabat的编号可以或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。一般地，然而，可以说，根据Kabat的编号，且不考虑CDR的氨基酸残基数，根据Kabat编号的1位对应FR1的起始位置，反之亦然，根据Kabat编号的36位对应FR2的开始，反之亦然，根据Kabat编号的66位对应FR3的开始，反之亦然，以及根据Kabat编号的103位对应FR4的开始，反之亦然。
对VH结构域的氨基酸残基进行编号的可选方法(该方法也可以以类似的方式适用于来自骆驼科动物抗体和纳米抗体的VHH结构域)是Chothia等人描述的方法。(Nature342,877-883(1989))，所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。然而，在本说明书、方面和图中，除非另有说明，否则将遵循Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
如本文所使用，术语“人源化抗体”是指来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人抗体的相似性。人源化抗体可以通过产生编码被类似人抗体的序列包围的非人抗体的CDR的重组DNA来产生。在一些实施方式中，人源化抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，人源化包括将本发明的CDR插入到人抗体支架或骨架中。人源化抗体在本领域中是众所周知的，并且可以使用任何产生保留本发明的CDR的人源化抗体的方法。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同型的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，但在单克隆抗体的生产过程中可能出现的变体除外，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同型的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应被解释为通过任何具体制备方法生产。根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人(Nature256:495(1975))首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人(Nature352：624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.222:581-597(1991))描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本发明的mAb可以是任何免疫球蛋白类别，其包括IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。可以在体外或体内培养产生mAb的杂交瘤。在体内生产中可以获得高滴度的mAb，其中来自单个杂交瘤的细胞被腹膜内注射到pristine-primed Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度所需mAb的腹水。同种型IgM或IgG的mAb可以使用本领域技术人员公知的柱色谱法从这些腹水液或培养物上清液中纯化。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于，Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFv)4-Fc、di-scFv、bi-scFv、或串联(di,tri)-scFv)；和双特异性T细胞接合器(BiTE)。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。VH-VL二聚体的三个表面正是在这种配置中。总的来说，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括三个对抗原特异的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有至少一个游离硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被归为称为κ和λ的两种明显不同的类型中的一种。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以被分配到不同的类别。完整抗体存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为a、δ、e、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的子单元结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，请参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体生产是本领域已知的，并且在Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中描述。
术语“多特异性抗体”以最广泛的意义使用，并且特别涵盖具有多表位特异性的抗体。这种多特异性抗体包括，但不限于，包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体——其中VHVL单元具有多表位特异性、具有两个或多个VL和VH结构域的抗体——其中每个VHVL单元结合至不同表位、具有两个或多个单个可变结构域的抗体——其中每个单个可变结构域结合至不同表位、全长抗体、抗体片段(比如Fab、Fv、dsFv、scFv)、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指与相同或不同靶标(一个或多个)上的两个或多个不同表位特异性结合的能力。
可以使用本领域公知的方法制备单克隆抗体。实例包括各种技术，比如Kohler,G.和Milstein,C,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor et al,Immunology Today 4:72(1983)；Cole et al,pg.77-96in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.(1985)中的那些。
除了在体内产生抗体的常规方法之外，还可以使用噬菌体展示技术在体外产生抗体。与常规抗体生产相比，这种重组抗体的生产要快得多，并且可以针对大量抗原产生重组抗体。此外，当使用常规方法时，许多抗原被证明是非免疫原性或剧毒的，因此不能用于在动物中产生抗体。此外，重组抗体的亲和力成熟(即，增加亲和力和特异性)非常简单且相对快速。最后，在一个选择程序中可以产生大量针对特定抗原的不同抗体。为了产生重组单克隆抗体，人们可以使用各种基于展示文库的方法来产生大量具有不同抗原识别位点的抗体。这种文库可以通过多种方式构建：可以通过在重链种系基因文库中克隆合成CDR3区域来生成合成文库，从而生成大抗体文库，从中可以选择具有各种特异性的重组抗体片段。人们可以使用人类的淋巴细胞文库作为构建抗体文库的起始材料。可以构建人类IgM抗体的原始文库，从而创建一个具有广泛多样性的人类文库。该方法已被广泛成功地用于选择大量针对不同抗原的抗体。噬菌体文库构建和重组抗体选择的方案在众所周知的参考文本Current Protocols in Immunology,Colligan et al(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.(1992-2000),第17章,第17.1节中提供。
非人抗体可以通过本领域已知的任何方法人源化。在一种方法中，将非人互补决定区(CDR)插入到人抗体或共有抗体框架序列中。然后可以将进一步的变化引入抗疫框架以调节亲和力或免疫原性。
在一些实施方式中，抗体及其部分包括：抗体、抗体片段、Fab和F(ab')2、单结构域抗原结合重组片段和天然纳米抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab')2、scFV或scFV2片段。
在一些实施方式中，本发明提供了编码本发明的抗体或抗原结合部分的核酸序列。
例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完全的重链不仅包括重链可变区(VH)还包括重链恒定区(CH)，其通常包括三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3；以及“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是期望的。
可由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，诸如单结构域抗体(“dAbs”)、Fv、scFv、Fab'和CHI并且CK或CL结构域已被切除。由于微型抗体比常规抗体小，所有它们在临床/诊断使用中应该实现更好的组织渗透，但是二价的它们应该比单价抗体片段诸如dAbs保留更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，本文使用的术语“抗体”不仅包括整个抗体分子，还包括以上讨论的类型的抗原结合抗体片段。编码的多肽中存在的每个框架区可包含相对于相应的人受体框架的至少一个氨基酸取代。因此，例如，框架区可总共包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一、十二、十三、十四或十五个相对于受体框架区的氨基酸取代。鉴于包含所公开的蛋白产物的个体氨基酸的特性，本领域技术人员将认识到一些合理的取代。氨基酸取代，即“保守取代”，可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行。
适当地，本文描述的多核苷酸可以是分离的和/或纯化的。在一些实施方式中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
如本文所使用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合，或其任何语法变体，是条件术语，其明确排除但仅排除本领域普通技术人员熟知为“天然存在的”或者在任何时间可能被法官、行政或司法机构确定或解释为“天然存在的”的物质、组合物、实体和/或物质、组合物、实体的组合的那些形式。
通过另一方面，提供给了试剂，其包括三个CDR，其中CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:34(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:35(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列。
通过另一方面，提供了试剂，其包括三个CDR，其中CDR1包括SEQ ID NO:36(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:37(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:38(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列。
通过另一方面，提供了试剂，其包括三个CDR，其中CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:39(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:40(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CDR根据Abm编号方法进行编号。在一些实施方式中，CDR根据Chothia编号方法进行编号。在一些实施方式中，CDR根据Kabat编号方法进行编号。
在一些实施方式中，CDR1包括SEQ ID NO:41(INAMX1)中叙述的氨基酸序列，其中X1是G或A。在一些实施方式中，CDR2包括SEQ ID NO:42(AIX1X2X3GX4TX5YAX6SVKG)中叙述的氨基酸序列，其中X1是S或T，X2是G或S，X3是G或S，X4是D或S，X5是Y或N，和X6是D或N。在一些实施方式中，CDR3包括SEQ ID NO:43(DX1YGX2DYWX3)中叙述的氨基酸序列，其中X1是E或L，X2是E或S，和X3是D或I。在一些实施方式中，CDR3包括SEQ ID NO:44(DX1YGSDYWX2)中叙述的氨基酸序列，其中X1是E或L，和X2是D或I。
在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是VHH抗体。在一些实施方式中，试剂是骆驼科动物抗体。在一些实施方式中，骆驼科动物是美洲驼。在一些实施方式中，试剂除了上文叙述的CDR外不包括其他CDR。
在一些实施方式中，试剂包括包含以下和/或由其组成的序列EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:30)。
在一些实施方式中，试剂包括包含以下和/或由其组成的序列EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:31)。
在一些实施方式中，试剂包括包含以下和/或由其组成的序列QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一些实施方式中，VHH序列进一步包括His标签。在一些实施方式中，His标签是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个组氨酸残基。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，His标签由6个组氨酸残基组成。在一些实施方式中，His标签通过接头连接至VHH。在一些实施方式中，接头是肽接头。在一些实施方式中，接头是丙氨酸重复接头。在一些实施方式中，丙氨酸重复包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个丙氨酸残基。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，丙氨酸重复接头由3个丙氨酸残基组成。在一些实施方式中，His-标签是六个His标签。
在一些实施方式中，发现特异性结合人CD28的茎区域并包括His标签的VHH序列是：EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:45，克隆2A1)；EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:46，克隆4A4)；和QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:47，克隆4A1)。
通过另一方面，提供了试剂，其包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包括SEQ ID NO:11(GYTLTNY)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQ ID NO:12(NTYTGK)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:13(GDANQQFAY)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:14(KASQDINSYLS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:15(RANRLVD)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:16(LQYDEFPPT)中叙述的氨基酸序列。该抗体在本文中被称为M9。
在一些实施方式中，试剂包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包括SEQ ID NO:17(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQ ID NO:18(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:19(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:20(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:21(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:22(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，试剂包括包含如下氨基酸序列的重链：DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCVASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGDNTYYAGTVTGRFTISRDFAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCARIHWPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:23)。在一些实施方式中，重链的可变区包括SEQID NO:23和/或由其组成。在一些实施方式中，试剂包括包含由如下核酸序列编码的多肽的重链：GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATAAGTGATGGTGGTGATAACACCTACTACGCAGGCACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGACCTCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATTCATTGGCCTTACTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:24)。在一些实施方式中，重链由SEQ ID NO:24组成。对抗体M9进行测序并发现具有由SEQ ID NO:24组成的重链。如使用Chothia方案所确定的该重链的CDR是SEQ ID NO:17-19。
在一些实施方式中，试剂包括包含如下氨基酸序列的轻链：QFVLSQSPAILSASPGEMLTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:25)。在一些实施方式中，轻链的可变区包括SEQ ID NO:25或由其组成。在一些实施方式中，试剂包括包含由以下核酸序列编码的多肽的轻链：CAATTTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCCGGGGAGATGCTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCGACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGA(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:26组成。抗体M9被测序并发现具有由SEQ ID NO:26组成的轻链。如使用Chothia方案所确定的该轻链的CDR是SEQ IDNO:20-22。
在一些实施方式中，试剂结合作为单体。在一些实施方式中，试剂结合作为二聚体。在一些实施方式中，试剂结合作为单体和/或二聚体。在一些实施方式中，试剂结合作为二聚体，但不交联和/或活化mCD28。在一些实施方式中，试剂结合作为二聚体，但仅结合CD28的单个分子。在一些实施方式中，试剂结合单体CD28。在一些实施方式中，试剂结合二聚体CD28。在一些实施方式中，试剂结合单体和/或二聚体CD28。
在一些实施方式中，试剂不是CD28激动剂。在一些实施方式中，试剂不是CD28拮抗剂。在一些实施方式中，试剂既不是CD28激动剂也不是拮抗剂。
术语“激动剂”通常是指与受体结合并完全或部分活化受体的分子、化合物或试剂。在一些实施方式中，激动剂在与天然配体相同的位点结合。在一些实施方式中，激动剂在不同于天然配体的结合位点的变构位点结合。术语“拮抗剂”通常是指在与激动剂相同的位点或另一位点结合至受体，不活化受体，并且执行以下一项或多项操作的分子、化合物或试剂：干扰或阻断天然配体对受体的活化、和干扰或阻断受体激动剂对受体的活化。在一些实施方式中，本发明的抗体结合至mCD28但不活化或阻断受体的活化。在一些实施方式中，它们不阻断通过CD86的活化。在一些实施方式中，本发明的抗体不结合mCD28。
如本文所使用，“直接激动剂/拮抗剂”是指与受体(mCD28)结合并且通过结合增加/减少该分子的信号传导的分子。在mCD28的情况下，激动剂将结合mCD28并通过结合增加细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞活化。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞增殖。在一些实施方式中，激动剂增加促炎细胞因子分泌。促炎细胞因子是本领域公知的并且已知由活化的T细胞分泌。促炎细胞因子的实例包括，但不限于，TNFα、IFNγ、IL-1B、IL-2和IL-6。在一些实施方式中，促炎细胞因子是IFNγ。在一些实施方式中，促炎细胞因子是IL-2。在mCD28的情况下，拮抗剂将结合mCD28并通过结合减少细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，拮抗剂降低T细胞活化、降低T细胞增殖和/或降低促炎细胞因子分泌。通过接触其配体、接触抑制剂、接触共受体或接触除所讨论的受体以外的任何分子来影响受体信号传导以改变受体信号传导的分子不被视为直接激动剂/拮抗剂。在一些实施方式中，本发明的试剂接触血清中的sCD28，并从而允许增加通过细胞上的mCD28的信号传导。尽管结果是mCD28信号传导增加，但抗体不是mCD28激动剂或直接激动剂，因为它与mCD28的结合不增加受体信号传导。
在一些实施方式中，试剂不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂不隐蔽或阻断接近配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂不结合、隐蔽或阻断接近sCD28的IgV结构域。在一些实施方式中，IgV结构域是配体结合结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包括SEQ ID NO:1的氨基酸28-137。在一些实施方式中，配体结合结构域包括以下氨基酸序列或由其组成：MLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG(SEQ ID NO:8)。在一些实施方式中，试剂不抑制sCD28与配体的结合。在一些实施方式中，CD28配体选自：CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方式中，CD28配体是CD86。在一些实施方式中，CD28配体是CD80。在一些实施方式中，CD28配体是ICOSL。在一些实施方式中，CD86是CD86-Fc。在一些实施方式中，CD80是CD80-Fc。
在一些实施方式中，试剂结合CD28的茎区域。在一些实施方式中，试剂结合mCD28的膜近侧区。在一些实施方式中，茎区域包括序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，茎区域包括序列KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，茎区域包括序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)或由其组成。在一些实施方式中，试剂结合单体sCD28。在一些实施方式中，试剂结合二聚体sCD28。在一些实施方式中，试剂结合单体sCD28、二聚体sCD28或两者。在一些实施方式中，试剂结合单体CD28但不结合二聚体CD28。在一些实施方式中，CD28胞外结构域的片段是茎区域。在一些实施方式中，结合至CD28的试剂阻止CD28的剪切。在一些实施方式中，结合至CD28的试剂阻止CD28从细胞脱落。
在一些实施方式中，试剂在茎区域中的剪切位点结合。在一些实施方式中，试剂在mCD28内剪切位点处结合。在一些实施方式中，试剂在至少一个蛋白酶的剪切位点处结合。在一些实施方式中，试剂在MMP-2的剪切位点处结合。
在一些实施方式中，试剂不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂不隐蔽或阻断接近配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂在剪切位点处结合。在一些实施方式中，试剂隐蔽、阻塞或阻断接近剪切位点。在一些实施方式中，试剂结合、阻断、阻塞或隐蔽蛋白酶剪切位点。在一些实施方式中，试剂不结合蛋白酶剪切位点但阻塞该位点。在一些实施方式中，试剂阻断接近蛋白酶剪切位点。在一些实施方式中，试剂产生阻断蛋白酶剪切位点的位阻。在一些实施方式中，试剂不结合蛋白酶剪切位点，但试剂的结合产生与阻断蛋白酶剪切位点的mCD28的构象变化。在一些实施方式中，试剂的结合产生阻断蛋白酶剪切位点的mCD28的构象变化。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-13。在一些实施方式中，剪切位点是剪切基序。在一些实施方式中，MMP-2剪切基序是PXX/X，其中最后的X是疏水残基。在一些实施方式中，CD28中的PXX/X基序是PSP/L。在一些实施方式中，蛋白酶剪切位点是SEQ ID NO:1的氨基酸142-145(PSPL)。在一些实施方式中，蛋白酶剪切位点是SEQ ID NO:2的氨基酸127-130(PSPL)。在一些实施方式中，蛋白酶剪切位点是SEQ ID NO:10的氨基酸9-12(PSPL)。在一些实施方式中，试剂阻断蛋白酶接近剪切位点。在一些实施方式中，试剂结合至mCD28的茎结构域中的PSPL。
在一些实施方式中，剪切位点在亮氨酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在缬氨酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在芳香氨基酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在亮氨酸、缬氨酸和/或芳香氨基酸之前。在一些实施方式中芳香氨基酸选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145和苯丙氨酸146中的任一种之前。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145、或苯丙氨酸146之前。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的亮氨酸145之前。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的亮氨酸145之前。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:2的亮氨酸127之前。
在一些实施方式中，试剂不结合具有突变的剪切位点的CD28的茎区域。在一些实施方式中，具有突变的剪切位点的CD28的茎区域不是蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的剪切位点的CD28的茎区域不是金属蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的剪切位点的CD28的茎区域不是基质金属蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的剪切位点的CD28的茎区域不是基质金属蛋白酶2(MMP-2)的底物。在一些实施方式中，具有突变的剪切位点的CD28的茎区域不是基质金属蛋白酶13(MMP-13)的底物。在一些实施方式中，突变的剪切位点是SEQ ID NO:1的亮氨酸145的突变。在一些实施方式中，突变的剪切位点是SEQ ID NO:1的亮氨酸145的氨基酸取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1的亮氨酸145的氨基酸取代是赖氨酸。
在一些实施方式中，试剂不调节CD28功能和/或信号传导。在一些实施方式中，试剂不降解mCD28。在一些实施方式中，试剂不导致或促进mCD28降解。在一些实施方式中，信号传导是mCD28-介导的免疫细胞活化。在一些实施方式中，试剂不抑制免疫细胞活化。在一些实施方式中，试剂不诱导CD28受体内化或循环。通过mCD28的共刺激对T细胞的免疫活化是关键的。蛋白酶剪切从保留在膜中的蛋白的跨膜和胞质部分去除CD28的胞外区中的配体结合结构域。因此，剪切的CD28不能传导信号并且不能贡献于T细胞活化。因此，阻断剪切并且也是拮抗剂的试剂不允许mCD28活化。类似地，阻断剪切但也是激动剂的试剂可诱导异常T细胞活化，并潜在地自身免疫反应。
在一些实施方式中，试剂不减少免疫细胞上的mCD28的表面水平。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，试剂减少mCD28的表面水平小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、7％、5％、3％、2％或1％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不杀伤细胞。在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不导致细胞的死亡。在一些实施方式中，试剂不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方式中，试剂不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，试剂不诱导ADCC和/或CDC。在一些实施方式中，试剂是抗体并且包括IgG2或IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG2结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG1或IgG3，其被突变以减少通过抗体的结合介导的细胞死亡。在一些实施方式中，突变使Fc受体结合结构域突变。在一些实施方式中，抗体的Fc结构域被工程化或突变以减少CDC、ADCC或两者。Fc工程化在本领域内是众所周知的，并且可以使用已知减少抗体介导的细胞杀伤的任何突变或氨基酸改变。
在一些实施方式中，试剂缺少Fc结构域。在一些实施方式中，试剂是缺少Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是骆驼科抗体、鲨鱼抗体或纳米抗体。
在一些实施方式中，试剂是非抗体蛋白。在一些实施方式中，试剂是小分子。在一些实施方式中，试剂是核酸分子。在一些实施方式中，试剂是合成肽。在一些实施方式中，试剂是合成结合蛋白。在一些实施方式中，合成肽基于非抗体支架。在一些实施方式中，试剂是抗体模拟物。在一些实施方式中，抗体模拟物的摩尔质量小于100、90、80、70、60、50、40、30或20kDa。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂是核酸适配体。在一些实施方式中，适配体是DNA。在一些实施方式中，适配体是RNA。在一些实施方式中，适配体是DNA或RNA。抗体模拟物的实例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体、和纳米CLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。
在一些实施方式中，试剂通过至少一个蛋白酶抑制蛋白酶剪切。在一些实施方式中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是基质金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是谷氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬酰胺肽裂解酶。在一些实施方式中，蛋白酶是脱落酶(sheddase)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶或内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是锌催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是钴催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10、MMP-2、和/或ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10、MMP-2、MMP-13和/或ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13、ADAM10、ADAM17或其组合。
使用方法
通过另一方面，提供了治疗和/或预防有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
通过另一方面，提供了改善有需要的受试者中免疫疗法的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
通过另一方面，提供了减少有需要的受试者中sCD28的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
在一些实施方式中，免疫疗法是基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，基于PD-1/PD-L1的免疫疗法包括施用抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在一些实施方式中，疗法包括PD-1限制点的阻断。在一些实施方式中，免疫疗法包括向受试者施用异源、同基因或自体免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，需要免疫疗法的受试者患有癌症。在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，癌症是sCD28阳性癌症。在一些实施方式中，癌症是sCD28高癌症。在一些实施方式中，受试者处于发展癌症的风险下。
如本文所使用，术语“治疗”(treatment、treating)疾病、紊乱或病症包括其至少一种症状的缓解、其严重性的降低或其进展的抑制。治疗不一定意味着疾病、紊乱或病症完全治愈。作为有效的治疗，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、紊乱或病症的严重性，降低与其相关的症状的严重性，或改善患者或受试者的生活质量即可。
在一些实施方式中，降低包括向受试者施用至少一种本发明的试剂。如本文所用，术语“施用(administering、administration)”和类似术语是指在合理的医学实践中以提供治疗效果的方式向受试者递送含有活性剂的组合物的任何方法。本主题的一方面提供向需要其的患者口服施用治疗有效量的本发明的试剂。其他合适的施用途径可以包括肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内。
通过另一方面，提供了包括本发明的试剂和药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，施用是使用本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“载体”、“赋形剂”或“佐剂”是指不是活性剂的药物组合物的任何组分。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无毒、惰性固体、半固体液体填充剂、稀释剂、包封材料、任何类型的制剂助剂，或仅仅是无菌水性介质，比如盐水。可作为药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖类(比如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉类(比如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)；黄蓍胶粉；麦芽、明胶、滑石粉；赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；油类比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、豆油等；多元醇类，比如甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇等；酯类，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁、氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水，林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。本文中可用作载体的物质的一些非限制性实例包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、粉状黄蓍胶、麦芽、明胶、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、多元醇、褐藻酸、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲溶液、可可脂(栓剂基质)、乳化剂以及用于其他药物制剂的其他无毒药学相容物质。还可能存在润湿剂和润滑剂比如十二烷基硫酸钠、以及着色剂、调味剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。可以使用任何无毒、惰性和有效的载体来配制本文所考虑的组合物。在这方面合适的药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂是本领域技术人员众所周知的，比如在The Merck Index,第十三版,Budavari et al.,Eds.,Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.(2001)；the CTFA(Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association)International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,第十版(2004)；和“Inactive Ingredient Guide,”U.S.Food and Drug Administration(FDA)Center forDrug Evaluation and Research(CDER)Office of Management中描述的那些，其全部内容在此通过引用以其整体并入。可用于本组合物的药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的实例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、汉克氏溶液和DMSO。这些另外的非活性成分以及有效的制剂和施用程序是本领域众所周知的，并在标准教科书中描述，比如Goodman和Gillman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Gilmanet al.Eds.Pergamon Press(1990)；Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)；以及Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)，每篇文献均通过引用以其整体并入本文。目前描述的组合物也可以包括在人工产生的结构中，比如脂质体、ISCOMS、缓释颗粒和其他增加血清中肽或多肽半衰期的载体。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。与目前描述的肽一起使用的脂质体由标准的囊泡形成脂质形成，这些脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，比如胆固醇。脂质的选择通常由比如脂质体尺寸和血液中的稳定性等考虑因素决定。多种方法可用于制备脂质体，例如Coligan,J.E.et al,Current Protocols in Protein Science,1999,John Wiley&Sons,Inc.,New York，并且也可参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
载体可总共占本文呈现的药物组合物重量的约0.1％至约99.99999％。
在一些实施方式中，本发明的方法不降解或导致mCD28的降解。在一些实施方式中，本发明的方法不减少免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法不减少mCD28-介导的免疫细胞活化。在一些实施方式中，本发明的方法维持受试者中免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法增加受试者中免疫细胞上的mCD28水平。
在一些实施方式中，减少是sCD28的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％减少。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是在血清sCD28方面。在一些实施方式中，减少是在sCD28的血液水平方面。在一些实施方式中，减少是在肿瘤微环境(TME)中的sCD28水平方面。
在一些实施方式中，受试者血液包括升高的sCD28水平。在一些实施方式中，降低前受试者血液包括升高的sCD28水平。在一些实施方式中，水平升高至健康受试者的水平以上。在一些实施方式中，受试者的sCD28水平升高至健康受试者水平之上至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、或1000％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至血液的5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng/ml之上。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至5ng/ml之上。在一些实施方式中，水平升高至10ng/ml之上。在一些实施方式中，水平升高至20ng/ml之上。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28/ml血液。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28/ml血液。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少5ng/ml sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少10ng/ml sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少20ng/ml sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少5ng/ml sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少10ng/ml sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少20ng/ml sCD28。
在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，癌症是可以用PD-1/PD-L1疗法治疗的癌症。在一些实施方式中，受试者已经经历PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，受试者是对PD-1/PD-L1疗法无反应者。在一些实施方式中，受试者未进行PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，本发明的方法与PD-1/PD-L1疗法一起进行。在一些实施方式中，本发明的方法在PD-1/PD-L1疗法之前进行。
在一些实施方式中，方法进一步包括向受试者施用另一免疫疗法。在一些实施方式中，方法进一步包括施用基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，另一免疫疗法是限制点抑制剂。在一些实施方式中，限制点抑制剂是PD-1和/或PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，限制点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，另一免疫疗法是基于嵌合抗原受体(CAR)的免疫疗法。在一些实施方式中，CAR是CAR-T。在一些实施方式中，CAR是CAR-NK。在一些实施方式中，另一免疫疗法是癌症疫苗。
如本文所使用，术语“CAR-T细胞”和“CAR-NK细胞”是指对至少一种目标蛋白具有特异性(例如，在用外遗传修饰剂后具有增加表达的免疫源蛋白)并且被移植到免疫效应细胞上(T细胞或NK细胞)的工程化受体。在一些实施方式中，CAR-T细胞具有移植到T细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，CAR-NK细胞具有移植到NK-细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞和调节T细胞。
CAR-T和CAR-NK细胞以及其载体在本领域是众所周知的。这类细胞靶向受体结合的蛋白并对其是细胞毒性的。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向至少一种病毒蛋白。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向多种病毒蛋白。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向由于与外遗传修饰剂接触而具有增加表达的病毒蛋白。
CAR-T细胞的构建是本领域众所周知的。在一个非限制性实例中，可以制造病毒蛋白的单克隆抗体，然后将构造编码抗体的载体。载体将也包括共刺激信号区。在一些实施方式中，共刺激信号区包括已知T细胞或NK细胞刺激分子的胞内结构域。在一些实施方式中，胞内结构域选自以下中的至少一种：CD3Z、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD 7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方式中，载体还包括CD3Z信号传导结构域。然后例如通过慢病毒感染将该载体转染至T细胞中。
在一些实施方式中，癌症是具有sCD28水平的癌症。在一些实施方式中，癌症包括高sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高sCD28水平是处于和/或高于5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100ng/ml的水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症包括高sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高sCD28水平是处于和/或高于健康受试者中水平的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％的水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症不是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结肠直肠癌。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、和结肠直肠癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌或结肠直肠癌。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
试剂盒
通过另一方面，提供了包括本发明的至少一种试剂或本发明的药物组合物的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂。在一些实施方式中，试剂盒包括说明本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂一起使用的标签。在一些实施方式中，试剂盒包括说明基于PD-1和/或PD-L1的治疗剂与本发明的抗体或药物组合物一起使用的标签。
通过另一方面，提供了包括基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂的试剂盒，其包括说明基于PD-1和/或PD-L1的治疗剂与本发明的抗体或药物组合物一起使用的标签。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于治疗癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于确定有需要的受试者中sCD28的血清水平。在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于确定将用本发明的试剂或药物组合物治疗的受试者的适合性。在一些实施方式中，试剂盒用于确定将用基于抗-PD-1/PD-L1的免疫疗法治疗的受试者的适合性。
试剂产生的方法
通过另一方面，提供了产生抑制细胞的表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂的方法，其包括：
a.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中试剂小于100kDa；
b.测试获得的试剂与细胞表面上的mCD28的结合；和
c.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
由此产生抑制细胞的表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
通过另一方面，提供了产生抑制细胞的表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂的方法，其包括：
d.培养包括一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包括编码试剂的核酸序列，其中所述核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
i.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中试剂小于100kDa；
ii.测试获得的试剂与细胞表面上的mCD28的结合；和
iii.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
由此产生抑制细胞的表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括测试阻断细胞表面上的mCD28的蛋白酶的剪切的能力。在一些实施方式中，试剂是抗-剪切剂。在一些实施方式中，试剂是抗-脱落剂。在一些实施方式中，试剂减少受试者中sCD28的脱落。在一些实施方式中，试剂减少mCD28的剪切。在一些实施方式中，试剂减少受试者中mCD28的剪切。
在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-13。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM10。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。MMP-2、MMP-13、ADAM10、ADAM17或其组合。
如本文所使用，术语“CD28的胞外结构域”是指跨膜结构域之前到达的CD28的N末端部分。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是sCD28。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28a。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28茎结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包括CD28的茎结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包括以下序列或由其组成：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQID NO:28)。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是单体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体的或单体的。
如本文所使用，“片段”是指构成较大蛋白或蛋白结构域的一部分的部分多肽。在一些实施方式中，片段包括至少10、20、30、40或50个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，片段包括至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，获得结合CD28的胞外结构域的片段的试剂是获得特异性结合至CD28茎结构域的试剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括在获得的试剂存在的情况下测定mCD28下游信号传导，并选择既不实质激动也不实质拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。在一些实施方式中，选择是选择不拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。本领域技术人员将理解，对于癌症治疗，激动CD28信号传导可能没有害处，但拮抗信号传导会适得其反。
在一些实施方式中，测试试剂阻断剪切的能力包括测量在试剂存在或不存在的情况下活化的免疫细胞的血清中的sCD28。在一些实施方式中，测试试剂阻断剪切的能力包括混合试剂、蛋白酶和包括剪切位点的CD28的胞外结构域或其片段。在一些实施方式中，测试进一步包括为CD28的胞外结构域或其片段测序，以检查截短和/或剪切。在一些实施方式中，测试进一步包括在足够灵敏的凝胶上运行CD28的胞外结构域或其片段，以测量由于剪切引起的尺寸变化。在一些实施方式中，测试进一步包括测量在试剂和蛋白酶存在的情况下从表达mCD28的细胞产生sCD28。
在一些实施方式中，获得试剂包括用所述CD28胞外结构域或其片段免疫鲨鱼或骆驼科动物，并从所述免疫的生物收集抗体。在一些实施方式中，获得试剂包括筛选结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂文库和选择结合的试剂。
在一些实施方式中，收集抗体包括从免疫的鲨鱼或骆驼科动物的脾中提取B细胞。在一些实施方式中，B细胞与黑色素细胞融合产生杂交瘤。在一些实施方式中，从杂交瘤的培养基中收集抗体。在一些实施方式中，获得试剂包括用CD28胞外结构域或其片段免疫生物，并从免疫的生物收集抗体。在一些实施方式中，生物是小鼠。在一些实施方式中，生物选自兔、小鼠、大鼠、鲨鱼、骆驼科动物、鸡、山羊和噬菌体。在一些实施方式中，骆驼科动物选自骆驼和美洲驼。在一些实施方式中，收集包括抽血。在一些实施方式中，收集包括：
e.从免疫生物的脾脏中提取B细胞；
f.将提取的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤；和
g.从杂交瘤中收集抗体。
在一些实施方式中，获得试剂包括筛选结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂文库和选择如此结合的试剂。在一些实施方式中，文库是噬菌体展示文库。在一些实施方式中，文库是源自脾B细胞的免疫文库。在一些实施方式中，文库是IgG文库。在一些实施方式中，文库是Fab文库。在一些实施方式中，文库是VHH抗体文库。在一些实施方式中，文库是单链、单结构域或纳米抗体文库。在一些实施方式中，获得试剂包括为试剂测序。在一些实施方式中，获得试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，选择试剂包括为试剂测序。在一些实施方式中，选择试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，从试剂的序列产生重组形式。在一些实施方式中，方法进一步包括人源化试剂。
在细胞内表达编码试剂的核酸分子是本领域技术人员众所周知的。它可以通过转染、病毒感染或细胞基因组的直接改变等许多方法进行。在一些实施方式中，基因存在于表达载体中，诸如质粒或病毒载体。包含p16-Ink4a的表达载体的一个此类实例是可从Addgene获得的哺乳动物表达载体pCMV p16 INK4A。
载体核酸序列一般至少包含用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的附加元件，诸如异源多核苷酸序列、表达控制元件(如，启动子、增强子)、可选择标记(如，抗生素抗性)，聚腺嘌呤序列。
载体可以是通过非病毒方法或病毒方法递送的DNA质粒。病毒载体可以是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。启动子可以在哺乳动物细胞中有活性。启动子可以是病毒启动子。
在一些实施方式中，编码试剂的核酸序列与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在表示目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式(如，在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中，当载体被引入宿主细胞时)连接到一个或多个调控元件。
在一些实施方式中，通过标准方法将载体引入细胞，包括电穿孔(如，如From等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985)中所描述)，热休克，病毒载体感染，小颗粒与核酸在小珠或颗粒的基质内或表面上的高速弹道穿透(Klein等人，Nature 327.70-73(1987))和/或类似方法。
如本文所使用，术语“启动子”是指一组转录控制模块，它们聚集在RNA聚合酶即RNA聚合酶II的起始位点周围。启动子由离散的功能模块组成，每个模块由约7-20bp DNA组成，并包含一个或多个转录活化剂或阻遏蛋白的识别位点。
在一些实施方式中，转录序列是由RNA聚合酶II(RNAP II和Pol II)转录的。RNAPII是存在于真核细胞中的酶。它催化DNA的转录以合成mRNA和大部分snRNA和microRNA的前体。
在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，其可获得自Invitrogen；pCI，其可获得自Promega；pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，其可获得自Strategene；pTRES，其可获得自Clontech，和它们的衍生物。
在一些实施方式中，本发明使用含有来自真核病毒诸如逆转录病毒的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，和衍生自E-B病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、和允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中表达有效的启动子指导下表达蛋白的任何其他载体。
在一些实施方式中，重组病毒载体，具有侧向感染、靶向特异性等优点，用于体内表达。在一个实施方式中，侧向感染是，例如，逆转录病毒的生命周期中所固有的，是单个受感染细胞产生许多子代病毒体的过程，这些子代病毒体萌芽并感染邻近细胞。在一个实施方式中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初没有被原始病毒颗粒感染。在一个实施方式中，产生无法侧向传播的病毒载体。在一个实施方式中，如果期望的目的是将特定基因仅引入局部数量的靶细胞，则此特征可能很有用。
可以使用多种方法将本发明的表达载体引入细胞中。此类方法一般描述于Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory,New York(1989，1992)，Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1989)，Chang等人,Somatic GeneTherapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)，Vega等人,Gene Targeting,CRC Press,AnnArbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等人,[Biotechniques 4(6):504-512，1986]，并包括，例如，重组病毒载体的稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和感染。另外，关于阳性-阴性选择方法，参见U.S美国专利号5,464,764和5,487,992。
应当理解，除了包含插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括工程化以优化表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或活性的序列。
通过另一方面，提供了通过本发明的方法生产的试剂。
通过另一方面，提供了一种药物组合物，其包括通过本发明的方法生产的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
如本文所使用，当与值组合时，术语“约”是指参考值的正负10％。例如，约1,000纳米(nm)的长度是指1,000+-100nm的长度。
注意，如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“多核苷酸”包括多个这种多核苷酸，并且提及“多肽”包括提及一个或多个多肽及其本领域技术人员已知的等效物，等等。进一步注意，权利要求可以被撰写为排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关联的比如“仅(solely)”、“仅仅(only)”等专有术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
在其中使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的那些情况下，一般而言，这种构造旨在在本领域技术人员将理解该约定的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有以下的系统：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，呈现两个或多个替代术语的基本上任何转折词和/或短语都应理解为考虑包括其中一个术语、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都具体地包括在本发明中，并且在本文中被公开，就好像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方式的所有子组合及其要素也被本发明具体地包括并且在本文中被公开，就好像每个这种子组合在本文中被单独和明确地公开一样。
通过检查以下实施例，本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，这些实施例并非旨在进行限制。此外，如上所述的和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中均找到实验支持。
上文所述的和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"CurrentProtocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入本文。本文件中还提供了其他一般参考资料。
材料和方法
抗体–商业小鼠单克隆抗-CD28克隆#CD28.2(Biolegend，Cat.No.302902)和FITC缀合的(Biolegend，Cat.No.302906)。山羊多克隆抗-CD28(R&D system，Cat.No.AF-342-PB)。FITC缀合的抗-人PD-L1(BD bioscience，Cat.No.558065)。APC缀合的抗-人PD-L2(Biolegend，Cat.No.345508)。PE缀合的抗-人IDO(R&D system，Cat.No.IC6030P)。山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647(Biolegend，Cat.No.405322)。驴抗人IgG(H+L)Alexa Fluor647(Jackson immune research，Cat.No.709-605-149)。山羊抗小鼠IgG HRP(Jacksonimmune research，Cat.No.115-035-071)。抗-人CD3克隆OKT3(Biolegend，Cat.No.317304)。抗-人PD-1帕博利珠单抗(MK-3475)。人IgG(Sigma，Cat.No.I4506)。
靶向人CD28受体的茎区域的VHH的分离-外周血B细胞遗传密码，来源于首次用于实验的非免疫Llama，用于构建噬菌体文库，该文库由表达个体VHH的颗粒组成，VHH作为具有C末端His6-Myc标签的融合蛋白。首次用于实验的文库被用于选择具有与人CD28的茎区域结合能力的纳米抗体。筛选生物素化的重组CD28-Fc嵌合体或具有“HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)”的序列的氧化的二聚体肽，其中在C末端处具有生物素添加。每个抗原被结合至链霉亲和素磁珠，其被脱脂奶封闭。在三个连续的选择轮中使用相同的抗原，改变噬菌体输入量和抗原浓度，进行噬菌体的溶液中选择。没有抗原的封闭珠用作对照。结合的噬菌体的洗脱用胰蛋白酶进行20分钟。溶液中选择过程中的富集率计算为从CD28抗原选择条件洗脱的噬菌体数量与从无抗原选择条件洗脱的噬菌体数量之间的比率。279个选定输出的个体噬菌体单克隆，以噬菌体或周质形式，通过ELISA验证抗原结合，并通过流式细胞术表征与膜CD28的结合。72个克隆显示与周质形式的茎区域肽特异性结合，22个被证明具有独特的CDR序列，而只有6个被发现属于独特的CDR3家族。6个VHH作为重组蛋白在CHO细胞中产生，具有c末端His标签，并评估其抗脱落活性和细胞结合。转染–通过将DNA序列克隆到PCDNA3.1载体中产生CD28wt(编码全长CD28转录物)质粒。使用Jet Pei转染试剂进行转染(PolyPlus转染)。在含有G418的培养基中选择稳定的转染剂。
ELISA–商业ELISA试剂盒用于定量以下的量：干扰素-γ(Biolegend，Cat.No.430103)，人白细胞介素2(Biolegend，Cat.No.431802)，人白细胞介素6(Biolegend，Cat.No.430502)，人白细胞介素10(Biolegend，Cat.No.430603)，人肿瘤生长因子β1(Biolegend，Cat.No.436708)，人白细胞介素β1(Biolegend，Cat.No.437004)和人CD28(R&Dsystem，Cat.No.DY342)。根据制造商的说明进行细胞增殖和生存力(MTT测定)(Roche，Cat.No.11465007001)。根据制造商的说明进行犬尿氨酸(IDO活性)ELISA试剂盒(ImmuSmol，Cat.No.BA E-2200)。
CD28茎区域结合测定-生物素缀合的野生型或L145K CD28茎区域二聚体肽固定在中性抗生物素蛋白涂覆的ELISA maxi-sorb平板上。对VHH克隆进行系列稀释(0.2-5μg/mL)，并使用抗His标签-HRP缀合的抗体检测结合的VHH，并使用TMB进行显影。
细胞因子多倍体(multiplex)–在Magpix系统(Millipore)上使用ProcartaPlex(Invitrogen，Cat.No.PPX-07-MXXGPY2)同时评估多种细胞因子。
流式细胞术–一般地，在所有步骤中将细胞保持在冰上。染色前，用FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中50μg/mL人IgG(Sigma，Cat.No.I4506)封闭5×105个细胞15min。以制造商推荐的浓度使用抗体并在黑暗中温育30min。在96孔U底板中以100μL的体积进行温育。用200μL的FACS缓冲液洗涤细胞两次并转移至150μL的FACS缓冲液中的FACS管，进行分析。使用Kaluza for Gallios流式细胞仪采集软件在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析细胞。
细胞系和人免疫细胞的分离–从ATCC获得Jurkat白血病T-细胞淋巴母细胞系克隆E6.1和SCC-25舌鳞状细胞癌。使用标准淋巴细胞分离培养基(MBP，Cat.No.850494)从健康供体的新鲜血液样本中分离PBMC。通过阴性选择方法使用RossetteSEPTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.15061)从健康供体的新鲜血液样本中分离CD3细胞。通过阴性选择方法使用RossetteSepTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.19059)从健康供体的新鲜血液样本中分离CD4细胞。通过阴性选择方法使用RossetteSepTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.17952)从健康供体的新鲜血液样本中分离单核细胞。所有细胞都在补充有10％HI-FCS和pen/strep混合物的完全RPMI-1640培养基中生长。
CD86阻断FACS-在室温下，用人CD28稳定转染的0.5×106个HEK293细胞用不具有或具有抗CD28抗体(CD28.2，10μg/mL)或VHH克隆(30μg/mL)的2μg/mL CD86-Fc(R&Dsystems，Cat.No.141-B2)温育30min。洗涤细胞并使用与荧光团结合的抗人重链和轻链抗体以1:5000稀释，在冰上进行二次结合20分钟。
树突细胞分化–单核细胞在RPMI培养基中以1×106/mL的密度培养，其中生长因子在第3天和第6天补充。50ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4诱导未成熟树突细胞(iDC)持续6天。当需要时，通过添加100ng/mL LPS 48小时，iDC进一步分化为成熟的树突细胞。通过相关标记物的FACS分析和特征细胞因子的分泌分析，对生成的细胞群进行了指定表型测试。
金属蛋白酶–使用来自Anaspec(Cat.No.AS-72005)或R&D system(Cat.No.902-MP)的商业重组人金属蛋白酶MMP-2。从R&D system(Cat.No.511-MM)购买商业重组人金属蛋白酶MMP-13。根据制造商方案在37℃下用1mM氨基苯乙酸汞(APMA)活化Pro-MMP2和Pro-MMP-13持续1-2小时。
蛋白酶抑制剂–在每个实验开始时添加指定浓度的蛋白酶抑制剂。在为期一周的试验中，3天后以最终浓度加入另一部分抑制剂。使用的蛋白酶抑制剂是TAPI-1(Cayman，Cat.No.18505)、GM6001(Santa Cruz，Cat.No.SC-203979)、TMI-1(Sigma，Cat.No.PZ0336)和GI254023X(Sigma，Cat.No.SML0789)。其中提到的蛋白酶混合物是由等摩尔比的TAPI-1和GM6001的混合物组成的。
合成肽–设计最终形式为“DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:41)-生物素”的底物肽，以包括后跟随5个甘氨酸序列的N-末端cMyc标签和C-末端生物素缀合之间的人CD28茎区域(His134-Pro152)的氨基酸序列。肽由Gencust Europe定制合成。第141位处的半胱氨酸残基被用于通过二硫键产生二聚体肽。类似地合成在剪切位点处具有突变的CD28茎区域肽，在第145位处的亮氨酸至赖氨酸的取代，其具有最终形式“DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPKFPGPSKP(SEQ ID NO:42)-生物素”。
体外剪切测定–在MMP抑制剂(TMI-1，50nM)、M9 Fab或指定的VHH克隆以各种浓度(0.4-10μg/mL)存在或不存在的情况下，用0.125μM二聚体c-Myc-标记的和生物素化的底物肽温育50ng纯化的重组MMP-2或MMP-13，持续5小时。在50mM Tris、10mM CaCl2、150mMNaCl、0.05％Brij-35、pH 7.5中进行测定。5小时后，将剪切反应混合物稀释至最终1nM的肽浓度并加载在中性抗生物素蛋白平板上以结合肽。在室温下温育1小时后，洗涤平板，并使用缀合至HRP的抗-cMyc抗体进行未剪切肽的检测。
CD4 T细胞或Jurkat T细胞系的PHA活化用于产生可溶性CD28–1×105个Jurkat细胞或CD4 T细胞用指定浓度的植物血凝素(Sigma，Cat.No.L8902)进行温育并用各种蛋白酶抑制剂进行温育另外的5天(Jurkat)或7天(CD4 T细胞)。
PBMC的SEB或CMV活化用于产生可溶性CD28–在37℃下在48孔平板中在具有/不具有指定浓度的各种蛋白酶抑制剂下用0.5ng/mL SEB(Sigma，Cat.No.S4881)刺激0.3×106PBMC持续5-7天。可选地，在96孔平板格式测定中用0.5ng/mL SEB刺激0.1×106PBMCs。对于CMV刺激，在37℃下在96孔平板中在具有/不具有指定浓度的各种蛋白酶抑制剂下用0.5μg/mL CMV肽活化剂(peptivator)(Milteny Biotec，Cat.No.130-093-435)刺激0.5×106PBMC持续2-5天。对于连续脱落实验，在24孔平板中用SEB或CMV刺激PBMC持续24小时，取细胞并在没有刺激剂下用RPMI洗涤三次，并再次平板接种在96孔平板中。在指定时间取样品并放在冷冻条件下直到进行可溶性CD28检查。
评估VHH的抗脱落活性的细胞测定–对于PBMC的SEB活化，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的各种处理下用2ng/mL SEB(Sigma，Cat.No.S4881)刺激0.1×106PBMC持续5-7天。对于PHA活化的T细胞，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的各种处理下用指定浓度的植物血凝素(Sigma，Cat.No.L8902)和200IU/mL的IL-2(Proleukine)温育0.1×106个CD4 T细胞5-7天。对于HEK自发CD28脱落测定，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的各种处理下温育0.1×105HEK细胞48小时。
混合的淋巴细胞反应–1×105个未成熟DC与5×105个分离的自体CD3 T细胞混合6天。
用异位重组人CD28、人CTLA-4和人CD80进行的SEB或CMV刺激测定–对于CMV刺激，在37℃下在96孔平板中在具有/不具有指定浓度的重组人CD28(R&D system，Cat.No.342-CD)、人CTLA-4(R&D system，Cat.No.434-CT)、人CD80(R&D system，Cat.No.140-B1)下用0.5μg/mL CMV肽活化剂(Milteny Biotec，Cat.No.130-093-435)刺激0.5×106PBMC(来自健康或癌症患者供体)持续2-5天。对于SEB设置，在存在指定浓度的rec.人CD28存在的情况下，用0.5ng/mL葡萄球菌肠毒素B(SEB)(Sigma，Cat.No.S4881)培养1×105PBMC持续72小时。如有规定，以5μg/mL的最终浓度添加抗-PD1或人IgG。
自体单核细胞CD3 MLR-0.5×106T细胞与来自相同CMV反应性供体的0.5×105单核细胞混合并在37℃下进行/不进行指定浓度的处理下用0.5μg/mL CMV肽活化剂刺激6天。
用重组人CD28刺激单核细胞–在指定浓度下重组人CD28存在的情况下在具有100-100U/ml IFNγ的RPMI培养基(R&D system，Cat.No.285-IF)中在24孔平板处平板接种1.5×106单核细胞48小时。通过相关标记物(IDO、PD-L1和PD-L2)的FACS分析和通过分析特征细胞因子(IL-6)的分泌测试产生的细胞群的指定表型。
用OKT3进行T细胞刺激–在37℃下用指定量的抗-CD3克隆OKT3刺激0.1×106分离的CD3 T细胞(来自健康供体)持续48-72小时。陈述时，以可溶形式添加重组人CD80-Fc(2μg/mL，R&D system)。以可溶形式以指定浓度将抗体或VHH添加至CD28或对照。
SCC-25癌细胞系与单核细胞在基于跨孔的测定中的共培养–将4×104个SCC-25细胞平板接种于具有置于细胞培养插件(Millipore，Cat.No.MCHT241148)上的1×105个单核细胞的24孔平板底部，其中在无血清饥饿培养基中进行或不进行指定处理持续4天。
癌症患者的血浆中可溶性人CD28的检测–从DxBiosamples(San Diego，CA，USA)购买了10种不同癌症适应症和健康供体中每一种的20个冷冻血浆样本。血浆样品按1:20稀释并通过ELISA分析可溶性人CD28。以适当稀释再次分析具有高CD28的样品。
直接CD28 EIA-除非另有讨论，使用康宁高结合平板或等效板进行筛选。每孔涂覆200-300ng的人CD28-Ig嵌合体(R&D，Cat.No.342-CD)、小鼠CD28-Ig嵌合体(R&D，Cat.No.483-CD)或由CD28茎区域氨基酸序列(Gly137-Pro152)组成的BSA缀合的二聚体肽。室温下(RT)用PBS中5％牛奶或1％酪蛋白封闭平板1小时。使用PBST洗涤平板3次，并在用1:5000特异性稀释的山羊抗老鼠HRP Fc检测后与研究抗体一起温育。阳性对照是小鼠抗人CD28克隆28.2或免疫小鼠的小鼠血清。未稀释筛选的杂交瘤上清培养物。
抗体测序。抗体被提供给Rapid Novor公司进行氨基酸测序。使用标准方法进行测序，其中简要包括用六种酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Lys C和AspN)进行酶消化后进行的LC-MS分析。用二硫化物还原和烷基化进行消化。使用Thermo-Fisher Q-exactive质谱仪进行LC-MS/MS分析。在每个抗体的重链和轻链中，至少5次肽扫描覆盖了100％的氨基酸残基，具有显著的支持片段离子。使用Chothia方案确定CDR。
实施例1:人CD28在慢性刺激过程中经历蛋白水解脱落
通过ELISA在慢性刺激的人PBMC的培养物中检测到可溶性CD28(sCD28)(图1，上图)。无论刺激剂的性质，人工(SEB)还是生理(CMV)，该现象均是明显，表明该现象的稳健性。TAPI-1和GM6001(广MMP和ADAM17抑制剂)处理以剂量依赖性方式减少sCD28的量，所以可溶性CD28的来源是膜形式的脱落(图1，上图)。图2中可见，脱落的CD28的细胞来源是T细胞。用PHA慢性刺激Jurkat T细胞系或来自健康供体外周血的人CD4 T细胞，导致sCD28以剂量依赖性方式产生(图2，上图)。用TAPI-1和GM6001处理在每个PHA浓度(图2，上图)下以及在固定PHA浓度(图2，下图)下以剂量依赖性方式减少了sCD28量。
用GI254023X(高特异性ADAM-10抑制剂)处理导致sCD28从活化的免疫细胞并以剂量依赖性方式释放的几乎完全抑制(图3A，下图)。使用ADAM-17特异性抑制剂TMI-1观察到类似的结果(图3B，下图)。通过MTT测定，检查培养物中细胞的代谢活性来监测免疫细胞的生存力。结果显示，使用和不使用任何一种ADAM抑制剂的治疗之间没有显著差异，这意味着低sCD28水平是通过阻断蛋白酶活性引起而不是由蛋白酶抑制剂引起的细胞死亡的假象(图3A-B，上图)。
sCD28的产生也在更多生理系统中得到验证。首先，利用模拟抗原呈递细胞对T细胞的生理刺激的分离的自体树突细胞和CD4 T细胞。当混合两种细胞群时，sCD28的升高是明显的，并且当将CMV添加到培养物中时变得更加突出(图4A)。这表明当慢性刺激发生时，人CD28蛋白经历了蛋白水解脱落过程。
接下来，用CMV肽(图4B)或SEB(图4C)刺激人PBMC持续24小时。然后，洗涤细胞以去除刺激剂并在没有任何刺激下再次平板接种持续各种时间段。随后进行检查培养基中sCD28的存在。随着时间的推移，sCD28的积累清晰可见。此外，积累取决于ADAM-10和ADAM-17的活性，如图4D中可见。添加不同浓度的特定抑制剂，在SEB刺激后，导致120小时后量化的sCD28的量减少。该研究可以解释患者血液中存在高量的可溶性CCD28，因为CD28脱落发生在T细胞的初级活化时，并且不一定需要持续或反复的刺激。
实施例2:可溶性人CD28具有免疫抑制活性
如图1(下图)中可见，使用蛋白酶抑制剂混合物降低sCD28的水平与T细胞活化的升高直接相关，如分泌的IFNγ水平所示，表明sCD28具有免疫抑制功能。增加蛋白酶抑制混合物的浓度导致细胞培养基中sCD28水平较低，而这些较低水平的sCD28与较高水平的分泌的IFMγ呈负相关。为了进一步探索sCD28的免疫抑制作用，在CMV刺激的人PBMC培养物中加入缺乏跨膜和胞质结构域的重组人CD28。这导致IFNγ分泌的剂量依赖性抑制(图5)。在不同的人PBMC供体中观察到了这种免疫抑制作用，证实了被sCD28阻断的该信号传导轴的稳健性。
同时，白介素-6分泌(图6和7A)和白介素-10(图7A)的升高是明显的。据报道，这些细胞因子表现出对免疫效应子活性(IL-10)的抑制，并使免疫系统向2型免疫反应倾斜，后者可以通过STAT-3信号传导(IL-6)支持癌症增殖和血管生成。此外，还进行了与可溶性CTLA-4(模仿阿巴西普-一种针对自身免疫性障碍的注册疗法)的比较，并揭示了在细胞因子分泌曲线方面对免疫系统的总体相似的影响(图7A)。
接下来，用SEB(1ng/mL)在没有重组人CD28或在重组人CD28存在的情况下刺激人PBMC。人IgG用作对照。淋巴细胞聚集，使用
Figure BDA0003303058480000381
S3 Live-Cell监测免疫活化的标志，并每12小时拍摄一次图片。如图7C中可见，SEB在重组人sCD28存在时对淋巴细胞基本上没有影响。众所周知，在体外免疫反应期间，抗原呈递细胞(APC)会彼此聚集并与其他细胞类型聚集，并且聚集对于静息淋巴细胞的抗原特异性活化来说是必不可少的。在SEB免疫反应期间，可溶性CD28似乎减少了聚集形成的量和尺寸，意味着它抑制了APC对T细胞特异性活化的第一步。
当分离的自体单核细胞和CD3 T细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中共培养时，观察到类似的结果。混合细胞用CMV肽(0.5μg/mL)在具有或不具有增加浓度的重组人sCD28的情况下刺激5天。再次发现sCD28抑制IFNγ分泌，同时增加IL-1B、TGFβ和IL-10的分泌(图7B)。
sCD28对单核细胞具有类似的免疫抑制作用。吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)已通过其分解代谢必需氨基酸色氨酸的能力参与免疫调节。它由不同的免疫细胞表达，也由许多癌细胞表达。色氨酸缺乏会抑制T淋巴细胞的成熟和增殖，而犬尿氨酸，色氨酸分解代谢的终产物，也被称为免疫抑制代谢物，其在各种生理和病理条件中促进免疫耐受。为了测试sCD28对IDO的影响，在对照人IgG或重组人CD28(10μg/mL)存在的情况下，用IFNγ(1000U/mL)刺激分离的人单核细胞48小时。温育后，单核细胞被细胞内染色用于人IDO(图7E)。为了促进细胞内染色，用BD Cytofix/Cytoperm Buffer Kit固定和透化细胞。使用ImmuSmol特异性犬尿氨酸ELISA试剂盒评估不同处理的培养基的IDO活性(图7D)。sCD28强烈增强单核细胞中的IDO表达。
此外，令人惊讶地发现sCD28是抗PD1免疫疗法的有效抑制剂。MK-3475(帕博利珠单抗或可瑞达，Merck)是一种获批的药物，在多种癌症适应症中具有前所未有的疗效。它加入到PMBC培养中增加促炎细胞因子分泌(IFNγ和IL-2)，但是sCD28的存在完全消除了这种免疫激活作用(图8A)。
在MLR设置中再次观察到类似的结果。MLR仅在有和没有sCD28以及有和没有抗PD1抗体(MK3475，5μg/mL)的情况下如前运行(图8B)。正如预期的那样，MK-3475增加IFNγ分泌并减少TGFβ分泌。值得注意的是，在sCD28的存在下，MK-3475的作用显著降低。
为了阐明sCD28抑制抗PD-1疗法的促活化作用的机制，检查了在sCD28存在下免疫细胞上PD-1配体的表达。在对照人IgG(10μg/mL)或重组人CD28(10μg/mL)存在下，用IFNγ(1000U/mL)刺激分离的人单核细胞持续48小时。温育后，对PD-L1(图8C，左)和PD-L2(图8C，右)进行单核细胞染色。两种配体在用sCD28培养的单核细胞上均上调，表明了sCD28可能规避抗-PD-1免疫疗法的效果的一种可能方式。
实施例3:癌症患者的血浆中发现人CD28可溶性
癌症中sCD28的水平仅在少数乳腺癌患者中显示，并且发现仅略高于在健康个体中观察到的水平((Isitmangil,G.,In vivo,2016)。尽管作者建议sCD28可被用作乳腺癌的标志物，但没有建议功能关系。现在知道了可溶性CD28实际上可能增强免疫系统的癌症逃避，对涵盖10种不同癌症适应症的220个样本和来自健康供体的20个样本进行了调查。调查在几种癌症中发现高sCD28水平，有时比健康对照甚至乳腺癌患者中见到的水平高几个数量级(图9A)。事实上，当与某些黑色素、直肠癌、非小细胞肺癌和头颈癌患者中发现的sCD28水平相比时，乳腺癌患者的水平似乎与健康个体不相上下。
为了进一步阐明sCD28在癌症中的作用，从具有不同适应症的癌症患者中分离PBMC。单独地用SEB(5ng/mL)，或与MK-3475一起、与重组人sCD28一起、或与两种分子的组合一起刺激细胞3天。在sCD28存在的情况下，来自所有供体细胞上清液中人IFNγ的浓度大大降低，即使在存在MK-3475时(图9B)。事实上，sCD28使MK-3475的效果不存在。
接下来，在跨孔测定中将头颈癌细胞系SCC-25的细胞单独或与单核细胞一起温育。单独生长的SCC-25细胞被施用IL-6作为阳性对照，并且确实细胞增殖增加，如通过MTT测量(图9C，上)和通过％汇合度测量(图9C，下)。在单核细胞存在的情况下使癌细胞生长也增加了增殖，但迄今为止观察到的最大增加是包括sCD28的共培养。这个数据进一步支持sCD28具有促癌作用。
实施例4:sCD28抑制CD80-Fc功效
CD80是与CD86一起的mCD28的两个主要配体之一。CD80与Fc部分融合的胞外结构域已被用作免疫刺激分子并且作为癌症疗法正在研究。为了检查CD28对CD80-Fc功效的影响，在2μg/mL可溶性重组人CD80-Fc存在下，用平板结合的抗-CD3抗体(OKT3，2μg/mL)刺激分离的CD3人T细胞。正如预期的那样，CD80-Fc增加IFNγ分泌。然而，sCD28的添加抵消了CD80-Fc的二次活化作用(图10A)。类似地，当用CMV肽刺激分离的PBMC持续3天，然后与sCD28温育时，需要增加CD80-Fc的量以产生预期的免疫反应(图10B)。
实施例5:体内sCD28对癌症的影响
因为小鼠不剪切mCD28，所以不能在小鼠模型中容易地检查sCD28的作用。最接近的选择是向小鼠施用重组sCD28以模拟sCD28水平升高的情况。这在H22同基因小鼠模型中进行了研究。Balb/c完全免疫活性的小鼠接受了H22肝细胞癌细胞的同种异体移植。细胞甚至在完全免疫活性的小鼠中生长，而添加抗-PD-1疗法几乎完全消除了肿瘤生长(图11A)。当添加重组人sCD28时，抗-PD-1疗法的作用在两只小鼠中几乎完全消失(图11B)。这表明在某些受试者中，sCD28水平的增加会对癌症进展产生高度有害的影响。
实施例6:基于抗脱落抗体的试剂的表征
人CD28通过ADAM10和ADAM17经历蛋白水解过程的发现促使检查其多肽序列的候选区域，显示出对蛋白水解脱落的潜在易感性。研究表明ADAM10和ADAM17更喜欢P1'位点的亮氨酸、缬氨酸和芳香族残基。人CD28中最吸引人的序列区域是茎段，范围从组氨酸134到脯氨酸152(SEQ ID NO:10(HVKGKHLCPSPLFPGPSKP))，将球状IgV结构域连接至跨膜区。该区域含有总共3个亮氨酸和缬氨酸残基，以及苯丙氨酸残基，并预计没有任何可能阻碍蛋白酶进入的二级结构元件。值得注意的是，茎区域还包含半胱氨酸141，它形成促进CD28的同二聚化的间二硫键。为了产生特异性结合CD28茎区域并可能阻断不同蛋白酶进入脱落的CD28的抗体或抗体片段，同时避免任何损害CD28寡聚结构和功能，用模拟CD28茎区域的二聚肽对CD1小鼠进行免疫。用于免疫的肽序列为SEQ ID NO:29，GKHLCPSPLFPGPSKPK，添加C-末端赖氨酸以具有游离氨基以允许使用酰肼化学的KLH或BSA缀合。在酰肼终止的CD28肽和S-4FB修饰的BSA之间进行缀合，其产生用于位点特异性缀合的游离醛。通过在非变性凝胶上运行肽来确认二聚化。
发现了通过直接CD28 EIA测量的对重组人CD28具有高结合亲和力的抗体。该抗体被命名为M9并且该抗体的序列在上文中提供。抗体M9的系列稀释用于确认其与重组人sCD28和茎区域肽的特异性结合(图12A)。有趣的是，虽然抗体能够检测重组人sCD28，但它无法检测到从免疫细胞中实际脱落的sCD28(图12B)。这强烈表明抗体在剪切位点结合，并且它所结合的去同位素在剪切形式中是不完整的。
接下来研究了抗体结合细胞表面上的mCD28的能力。为了减少sCD28从细胞中的脱落，抗体需要实际在蛋白的膜形式上结合而不仅仅是溶液中的重组蛋白。分析过表达人全长CD28的HEK293细胞。小鼠CD28似乎没有被剪切成可溶形式(活化的鼠脾细胞似乎不会产生sCD28)，并因此必须研究人蛋白。使用M9抗体和作为阳性对照的CD28.2抗体通过流式细胞术分析细胞。令人惊讶的是，M9似乎没有与表面mCD28结合(图12C)。这可能是由于空间位阻和当它与膜相邻时对茎区域的有限进入。
实施例7:单结构域抗体抑制sCD28从细胞表面的脱落
设计了能够结合细胞表面上的mCD28并阻断sCD28的脱落的小试剂。虽然全尺寸抗体的尺寸约为150kDa，但衍生自抗体的Fab片段具有约50kDa的尺寸，而单链抗体(也称为单链可变片段，scFvs)具有约25kDa的尺寸，以及单结构域抗体(也称为VHH抗体，scFvs，和DARPins)的尺寸仅为12-15kDa。
使用首次用于实验的美洲驼来源的VHH的噬菌体文库分离单结构域抗体。文库由VHH序列组成，其取自首次用于实验的非免疫美洲驼，即，提取B细胞并对VHH CDR的整个可用库(repertoire)进行测序。这些CDR被导入噬菌体中以产生文库。使用ELISA和流式细胞术，针对重组CD28胞外结构域和二聚体茎区域筛选文库，以发现特异性结合人C28的茎区域的抗体。发现特异性结合人CD28的茎区域的VHH序列是：EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:45，克隆2A1)；EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:46，克隆4A4)；和QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:47，克隆4A1)。VHH作为重组蛋白在CHO细胞中产生，然后如下所述评估细胞结合和抗脱落活性。C-末端的His-标签用于纯化并通过三重丙氨酸重复连接。表1中提供了三个研究的克隆的CDR。
表1
VHH克隆 CDR1(SEQ ID) CDR2(SEQ ID) CDR3(SEQ ID)
2A1 INAMG(33) AISGGGDTYYADSVKG(34) DLYGSDYWD(35)
4A4 INAMA (36) AITSSGSTNYANSVKG(37) DEYGSDYWI(38)
4A1 INAMG(33) AITSGGSTNYADSVKG(39) DLYGEDYWI(40)
VHH克隆与人CD28茎区域序列的结合首先通过ELISA使用VHH克隆的系列稀释来确认(图13)。通过FACS分析，使用标记的VHH克隆和过表达CD28的HEK细胞确认膜人CD28在细胞水平上的结合(图14)。膜CD28结合证明进入CD28膜近侧区域。先前的实验表明试剂的尺寸对于进入该区域是至关重要，因为可以与CD28茎区域肽结合的全尺寸抗体无法与细胞上的CD28茎区域结合。值得注意的是，VHH克隆不能结合位于MMP剪切位点内在氨基酸残基145处有L-K取代的人CD28茎区域序列(图23)。
在肽和细胞水平上均证实了抗-脱落活性。ELISA技术用于检测完整的人CD28茎区域二聚体肽以确认VHH克隆阻断MMP-2(图17)和MMP-13(图22)对人CD28茎区域的剪切。虽然M9 Fab表现出阻断MMP-2剪切CD28茎区域肽的能力，但如上所述它不能结合细胞上的CD28茎区域，也不能抑制细胞膜上的CD28脱落。在细胞水平上，标准夹心ELISA被用于通过测量过表达人CD28的HEK细胞上清液中人sCD28的水平(图18)、PHA和IL-2活化的分离的CD4 T细胞(图19)和超抗原活化的PBMC(图20)来确认VHH克隆在抑制sCD28脱落中的功效。正如预期的那样，M9 Fab没有降低上清液中的sCD28水平，进一步强调了阻断剂的尺寸和架构对其实际阻断脱落能力的重要性。
至关重要的是，发现VHH克隆不会损害人CD28功能性。使用流式细胞术，发现VHH克隆不会改变CD86与膜CD28结合的幅度(图15.)。标准夹心ELISA用于显示VHH克隆不激动CD28，如通过炎性细胞因子干扰素γ的分泌水平所测量的(图16)。活化抗体CD28.2用作阳性对照。类似地，标准夹心ELISA用于显示VHH克隆不通过CD28拮抗CD80-Fc刺激，如通过细胞因子IL-2的分泌水平所测量(图21)。
实施例8:设计其他小试剂以抑制细胞表面的sCD28脱落
Fab片段生成使用商业试剂盒或商业服务进行。抗体M9的CDR区用于Fab生成，因为它们已显示与合适的去同位素结合。首先通过与重组人CD28和二聚体茎区域肽的结合测定测试所得Fab片段的功效以确认这种结合被保留。通过FACS测定与表达人CD28的小鼠细胞和人免疫细胞的表面mCD28的结合。抗体CD28.2用作阳性对照。刺激后在免疫细胞培养物中测试sCD28脱落的直接抑制。当细胞存在和不存在Fab片段时通过夹心ELISA测量培养基中的sCD28。测定具有脱落抑制作用的Fab片段对CD28信号传导的影响。首先，通过测定Fab片段诱导来自T细胞的促炎细胞因子(如，干扰素γ)分泌的能力来测试激动作用。其次，阻断CD80-Fc(激动剂)结合的能力被用于测试Fab片段的抗抗性质。
通过标准方法，使用商业服务，或通过将CDR插入scFV骨架，进行使用M9 CDR的单链抗体产生。进行纯化，并通过与Fab片段所述相同的测定评估所得抗体。
通过以下两种策略之一产生单结构域抗体。1)首次用于实验的文库–使用首次用于实验的美洲驼来源VHH的噬菌体文库–该文库由取自首次用于实验的美洲驼脾的VHH序列组成，即，提取B细胞和并对VHH CDR的整个可用库进行测序。将这些CDR导入噬菌体中以产生文库。针对重组CD28胞外结构域和二聚体茎区域筛选文库，以发现特异性结合sCD28的抗体。2)免疫文库–用过表达CD28的细胞免疫美洲驼或其他动物科动物或鲨鱼。在细胞免疫后，提取脾脏并对VHH CDR的可用库进行测序。将提取的脾B细胞制成杂交瘤。将所得抗体导入噬菌体以产生文库，并针对重组CD28胞外域和二聚体茎区域肽筛选文库，以寻找特异性结合sCD28的抗体。评估具有特异性结合的单结构域抗体的脱落阻断和激动作用/拮抗作用，如针对Fab片段和单链抗体所做的那样。
虽然已经结合其特定实施方式描述了本发明，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，意图包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。
序列表
<110> 比昂生物制剂公司
<120> 小脱落阻断剂
<130> BDB-P-008-PCT
<150> 62/954802
<151> 2019-12-30
<150> 62/942,240
<151> 2019-12-02
<150> 62/818351
<151> 2019-03-14
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
1 5
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
gacgtgaagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cactttcagt agctattaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcgacc ataagtgatg gtggtgataa cacctactac 180
gcaggcactg tgacgggccg attcaccatc tccagagact ttgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgac ctctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagaattcat 300
tggccttact attttgactc ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Gln Phe Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Met Leu Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 26
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
caatttgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctcccgggga gatgctcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tatatgaact ggtatcagca gaagccagga 120
tcttccccca aaccctggat ttatgccaca tccgacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtcacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaga 318
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro
130
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 33
Ile Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 34
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 35
Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 36
Ile Asn Ala Met Ala
1 5
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 37
Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 38
Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 39
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 40
Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile
1 5
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是G或A
<400> 41
Ile Asn Ala Met Xaa
1 5
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X是S或T
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X是G或S
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是G或S
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X是D或S
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X是Y或N
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X是D或N
<400> 42
Ala Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Xaa Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X是E或L
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是E或S
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X是D或I
<400> 43
Asp Xaa Tyr Gly Xaa Asp Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X是E或L
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X是D或I
<400> 44
Asp Xaa Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 45
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 46
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 48
<211> 145
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu
145
<210> 49
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
115 120 125

Claims (40)

1.一种试剂，其结合细胞表面上的膜CD28(mCD28)并抑制所述mCD28的蛋白酶剪切，其中所述试剂小于100千道尔顿(kDa)。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、特异性结合至CD28的小分子和肽。
3.根据权利要求2所述的试剂，其中所述试剂小于50kDa。
4.根据权利要求3所述的试剂，其中所述单结构域抗体是骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂，其中所述骆驼科动物抗体包括三个CDR，其中：
CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:34(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:35(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列；
CDR1包括SEQ ID NO:36(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:37(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:38(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列；或
CDR1包括SEQ ID NO:33(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:39(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:40(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的试剂，其中所述骆驼科动物抗体包括选自以下的序列：
a.EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:30)；
b.EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:31)；和
c.QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:32)。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂，其中所述试剂包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包括SEQ ID NO:17(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQ IDNO:18(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:19(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:20(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:21(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:22(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂，其中所述试剂是人源化的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂，其中所述试剂不是CD28激动剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂，其中所述试剂不是CD28拮抗剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的试剂，其中所述试剂既不降解所述mCD28也不抑制mCD28介导的免疫细胞活化。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的试剂，其中抗体的所述抗原结合片段不诱导抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)或互补依赖性细胞毒性(CDC)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂，其中所述试剂结合CD28的茎区域内。
14.根据权利要求13所述的试剂，其中所述茎区域包括氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:27)。
15.根据权利要求13或14所述的试剂，其中所述茎区域由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的试剂，其中所述试剂在剪切位点结合至少一种蛋白酶。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的试剂，其中所述试剂通过至少一种蛋白酶抑制蛋白酶剪切。
18.根据权利要求16或17所述的试剂，其中所述至少一种蛋白酶是至少一种金属蛋白酶。
19.根据权利要求18所述的试剂，其中所述至少一种金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13或其组合。
20.一种降低有需要的受试者中可溶性CD28(sCD28)水平的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的试剂。
21.一种治疗和/或预防有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的试剂。
22.一种改善有需要的受试者的基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的试剂。
23.根据权利要求20或22所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
24.根据权利要求21或23所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结肠直肠癌。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、和结肠直肠癌。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述方法不降解mCD28或减少mCD28介导的免疫细胞活化。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中在所述施用之前所述受试者血液包括至少5ng/ml sCD28。
28.一种产生抑制细胞表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂的方法，所述方法包括以下中至少一项：
a.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中所述试剂小于100kDa；
b.测试所述获得的试剂与细胞表面上mCD28的结合；和
c.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
和
d.培养包括一种或多种载体的宿主细胞，所述一种或多种载体包括编码试剂的核酸序列，其中所述核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
iv.获得结合至CD28胞外结构域或其片段的试剂，其中所述试剂小于100kDa；
v.测试所述获得的试剂与细胞表面上mCD28的结合；和
vi.选择结合细胞表面mCD28的试剂；
由此产生抑制细胞表面上的mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述获得是获得小于50kDa的试剂，和其中所述获得的试剂小于50kDa。
30.根据权利要求28或29所述的方法，进一步包括测试所述试剂通过细胞表面上mCD8的蛋白酶阻断剪切的能力。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述蛋白酶选自MMP-2和MMP-13。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述获得试剂包括以下步骤中至少一个：
a.利用所述CD28胞外结构域或其片段免疫鲨鱼或骆驼科动物，并从所述免疫生物收集抗体；和
b.筛选与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂文库并选择结合的试剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述CD28胞外结构域或其片段是二聚体的或单体的。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中
a.所述收集抗体包括从所述免疫的鲨鱼或骆驼科动物的脾提取B细胞；或
b.所述选择结合的试剂包括对所述选择的试剂进行测序并从所述序列产生所述试剂的重组形式。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，进一步包括在所述获得的试剂存在的情况下测定mCD28下游信号传导和选择既不实质激动也不实质拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。
36.一种根据权利要求28至35中任一项所述的方法产生的试剂。
37.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至19和36中任一项所述的试剂，和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
38.一种在有需要的受试中治疗和/或预防癌症、改善基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法、或降低sCD28水平的方法，所述方法包括施用权利要求37所述的药物组合物。
39.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至19和36中任一项所述的试剂。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，进一步包括以下中的至少一项：
a.抗-PD-1和/或PD-L1免疫疗法；和
b.叙述本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法一起使用的标签。
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