CN112074539A - 降低可溶性免疫受体cd28的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了治疗癌症和改善免疫疗法的方法，所述方法包括降低可溶性免疫受体水平。还提供了结合膜免疫受体并抑制该受体的蛋白酶剪切的试剂和结合可溶性免疫受体并且既非受体激动剂也非拮抗剂的试剂，以及产生这些试剂的方法。

Description

降低可溶性免疫受体CD28的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2018年3月15日的美国临时专利申请号62/643,334、2018年3月15日的美国临时专利申请号62/643,355和2018年12月2日的美国临时专利申请号62/774,254(其通过引用以其全部内容并入本文)的优先权的权益。
技术领域
本发明属于免疫调节和免疫疗法领域。
背景技术
适应性免疫系统主要通过协调刺激抗原特异性辅助因子CD4+和细胞毒性CD8+ T细胞，在调节和防卫病原体和癌细胞方面发挥关键作用。抗原呈递细胞(APC)对T细胞的持久且持续的激活涉及：i)T细胞受体(TCR)与APC上的主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽结相互作用(engagement)；ii)T细胞上的共刺激CD28受体与也由APC表达的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)配体结合。CD28共刺激的生物学后果是多种多样的，并且包括控制T细胞周期、扩增、分化以及通过降低实现免疫效应子功能所需的阈值来放大TCR刺激。
与激活性共刺激分子CD28相反，结构上的同源物——细胞毒性T淋巴细胞相关4(CTLA-4)是一种抑制性共刺激受体，其膜表达由CD28的触发来驱动。CTLA-4和CD28均为I型跨膜蛋白。它们的细胞外部分由一个V-set免疫球蛋白超家族(Ig-V)结构域构成，该结构域由位于IgV结构域外部，邻近跨膜区域的半胱氨酸残基同共价(homo-covalently)连接。尽管有相似之处，但CTLA-4和CD28在亲和力和四级结构布置方面有所不同。发现CTLA-4对B7分子具有更高的结合亲和力，并且具有与CD28不同的二聚化模式，导致与共享配体的化学计量结合不同。CD28表现出单价结合化学计量，而CTLA-4以二价方式相互作用。因此，CTLA-4以比CD28高得多的亲和力和亲合力结合B7分子，因此使T细胞响应下调并有利于抗原特异性耐受的起始。
已经表明某些共刺激分子具有几种生理形式。除膜结合形式外，还描述了在幼稚免疫细胞中表达的可溶形式，这增加了T细胞生物学的复杂性。CD28的可溶性形式(sCD28)已被归因于选择性剪接的基因产物。剪接事件导致移码，其结果是：在翻译终止之前，在第137位的甘氨酸后添加了两个谷氨酸残基。最终产物缺少整个跨膜和胞质区域，并且重要的是在第141位缺少介导(促成，mediates)二聚体CD28的二硫键的半胱氨酸残基(Magistrelli G.,Biochem Biophy Res Commun,1999)。单体CD28可溶形式的生物学功能和反受体结合受到检查(Hebbar,M.,Clin Exp Immunol,2004)并且显示也抑制T细胞增殖。然而，在二聚体sCD28的情况下，已经表明具有通过与B7分子结合来抑制T细胞功能性的调节作用(Sun,Z.,Centr Eur J Immunol,2014；Hebbar,M.,Clin Exp Immunol,2004)。值得注意的是，已经报道了患有自身免疫性障碍的患者的血清中sCD28分子数量的升高(Wong,CK,Rheumatol,2005；Hamzaoui,K.,Clin Exp Rheumatol,2005；Hebbar,M.,Clin ExpImmunol,2004；Sun,Z.,Clin Immunol,2014)。sCD28的确切来源尚有争议。利用T细胞激活的体外模型，反映自身免疫患者中T细胞的持久炎症状态，已表明在T细胞激活过程中，可选的可溶形式的转录被抑制，并且只有CD28的全长膜形式是明显的，而培养物中sCD28的量升高(Hebbar,M.,Clin Exp Immunol,2004)。这种现象导致人们提出这样的主张：CD28的膜形式的主动脱落(shedding)是血清中可溶性分子升高的原因，但是，这尚未得到证实。过去将T细胞激活过程中的主动脱落描述为一种调节机理，通过粘附分子的蛋白水解作用抵消持续激活。
尽管CTLA-4限制早期T细胞响应的幅度，但另一种抑制性受体——PD-1抑制外周T细胞功能。PD-1的表达在T细胞的激活期间升高，并且其已知的配体是B7家族的同源物：B7-H1(PD-L1)和B7-H2(PD-L2)。这些同源物经发现是在APC和癌细胞上，并且驱使激活的T细胞进入细胞无反应状态，导致免疫响应减弱。因此，有关CTLA-4和PD-1/PD-L1轴的靶向疗法已显示出在广泛多种癌症类型中的临床活性。最近，研究表明，CD28的信号传导途径受PD-1靶向和抑制(Hui,E.,Science,2017)，而同时要进行有效的PD-1疗法，完整的活性CD28/B7轴必不可少(Kamphorst,A.O.,Science,2017)。
然而，并非所有患者一般都会对基于PD-1的免疫疗法或免疫疗法有反应，还有那些确实经常复发的患者。因此，迫切需要能够提高患者的免疫细胞攻击癌症的能力的方法和分子。
发明内容
本发明提供了治疗癌症和改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括降低可溶性CD28水平。还提供了结合膜CD28并抑制mCD28蛋白酶剪切(proteolyticcleavage)的试剂(药剂，agent)和结合可溶性CD28并且既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂的试剂，以及产生这些试剂的方法。
根据第一方面，提供了治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括降低对象中的可溶性CD28(sCD28)水平。
根据另一方面，提供了改善对其需要的对象中的基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括降低对象中的sCD28水平。
根据另一方面，提供了结合可溶性CD28(sCD28)并且既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂的试剂。
根据一些实施方式，需要免疫疗法的对象患有癌症。根据一些实施方式，对象对基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法不响应或响应低。
根据一些实施方式，降低发生在对象的血液、外周血或肿瘤微环境中。根据一些实施方式，降低包括以下中的至少一项：
a.给予对象与sCD28结合的试剂，并且其中所述试剂在结合后降解sCD28或靶向sCD28以降解；
b.给予对象抑制性核酸分子，其中所述分子与编码sCD28的mRNA结合而不与编码膜CD28(mCD28)的mRNA结合；
c.给予对象结合mCD28并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂；
d.给予对象包含人CD28的茎部区域(stalk region)的二聚体肽(dimericpeptide)；
e.给予对象抑制能够剪切mCD28的蛋白酶的试剂，和
f.从对象中抽血，降低血液中sCD28的量并将血液返回对象。
根据一些实施方式，茎部区域，
a.包含氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ IDNO:36)；
b.由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成；或
c.(a)和(b)两者。
根据一些实施方式，所述方法不降解mCD28或不降低mCD28介导的免疫细胞激活。
根据一些实施方式，在降低之前，对象的血液包含至少5ng/ml的sCD28。
根据一些实施方式，癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结直肠癌。根据一些实施方式，癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌。
根据一些实施方式，本发明的方法进一步包括给予对象另一种免疫疗法。根据一些实施方式，免疫疗法选自：
a.检查点抑制剂；
b.基于嵌合抗原受体(CAR)的疗法；和
c.癌症疫苗。
根据一些实施方式，检查点抑制剂是基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。
根据另一方面，提供了结合膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
根据一些实施方式，试剂既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂。根据一些实施方式，试剂既不降解mCD28也不抑制mCD28介导的免疫细胞激活。
根据一些实施方式，试剂
a.不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)；
b.包含IgG2或IgG4；
c.包含经改造以降低CDC、ADCC或两者的Fc结构域；
d.缺少Fc结构域；
e.是Fab片段；
f.是单链抗体；
g.是单结构域抗体；
h.是小分子；
i.是与mCD28特异性结合的肽；或
j.其组合。
根据一些实施方式，试剂结合在CD28的茎部区域内。根据一些实施方式，茎部区域
a.包含氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ IDNO:36)；
b.由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成；或
c.(a)和(b)两者。
根据一些实施方式，试剂抑制至少一种蛋白酶的蛋白酶剪切。根据一些实施方式，至少一种蛋白酶是至少一种金属蛋白酶。根据一些实施方式，至少一种金属蛋白酶选自ADAM 10和ADAM 17。
根据一些实施方式，试剂是抗体或其抗原结合片段，并且包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:30(GFTFSSYYMS)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ IDNO:31(TISDGGDNTYYAGTVTG)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:32(IHWPYYFDS)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:33(RASSSVSYMN)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:34(ATSDLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:35(QQWSSHPPT)中所示的氨基酸序列。
根据一些实施方式，本发明的试剂包含以下中的至少一个
a.重链，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
b.轻链，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
根据一些实施方式，试剂不结合膜CD28(mCD28)。
根据一些实施方式，试剂选自与sCD28特异性结合的抗体或其抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和肽。
根据一些实施方式，试剂与有机体中的sCD28结合导致以下中的至少一项：
a.所结合的sCD28的降解；
b.从血液中去除sCD28；和
c.将所结合的sCD28转运至溶酶体、内体、蛋白酶体或其组合。
根据一些实施方式，试剂不抑制sCD28与配体的结合。根据一些实施方式，试剂结合二聚体sCD28、单体sCD28或两者。根据一些实施方式，试剂结合在sCD28的IgV结构域外部。
根据一些实施方式，试剂是抗体或其抗原结合片段，并且包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GYTLTNY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ IDNO:13(NTYTGK)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:14(GDANQQFAY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:15(KASQDINSYLS)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ IDNO:16(RANRLVD)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:17(LQYDEFPPT)中所示的氨基酸序列；
CDR-H1包含SEQ ID NO:18(GYTFTSY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ IDNO:19(YPGDGD)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:20(NYRYSSFGY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:21(KSSQSLLNSGNQKNYLT)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:22(WASTRES)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:23(QSDYSYPLT)中所示的氨基酸序列；或
CDR-H1包含SEQ ID NO:24(GYTFTDY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ IDNO:25(NPNYDS)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:26(SSPYYDSNHFDY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:27(SARSSINYMH)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQID NO:28(DTSKLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:29(HQRNSYPFT)中所示的氨基酸序列。
根据一些实施方式，本发明的试剂包括以下中的至少一种
a.重链，包含选自SEQ ID NO:41、45或49的氨基酸序列；和
b.轻链，包含选自SEQ ID NO:43、47或51的氨基酸序列。
根据一些实施方式，抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab')2、scFV或scFV2片段。
根据一些实施方式，试剂是人源化的。
根据一些实施方式，试剂不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据另一方面，提供了用于产生本发明的试剂的方法，所述方法包括：
获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂，测试试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力，并选择至少一种阻断蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；或
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中核酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.测试试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力；和
iii.选择至少一种阻断蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；
从而产生本发明的试剂。
根据另一方面，提供了用于产生本发明的试剂的方法，所述方法包括：
获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂，在所获得的试剂的存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅(substantially)激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；或
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中核酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.在所获得的试剂存在下测定mCD28下游信号传导；和
iii.选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；
从而产生本发明的试剂。
根据一些实施方式，蛋白酶选自ADAM 10和ADAM 17。
根据一些实施方式，获得与CD28胞外结构域或其片段特异性结合的试剂是获得与CD28茎部结构域特异性结合的试剂。
根据一些实施方式，本发明的方法进一步包括在所获得的试剂存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂。
根据一些实施方式，本发明的方法进一步包括以下中的至少一项：
a.测试所获得的试剂与mCD28的结合，并选择至少一种不结合mCD28的试剂；和
b.测试所获得的试剂与来自癌症患者的sCD28的结合，并选择至少一种与来自癌症患者的sCD28结合的试剂。
根据一些实施方式，获得试剂包括以下至少中的至少一项：
a.用CD28胞外结构域或其片段免疫有机体，并从所免疫的有机体中收集抗体；
b.筛选与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂库，并选择结合的试剂。
根据一些实施方式，CD28胞外结构域或其片段是二聚体或单体的。
根据一些实施方式，有机体选自兔子、小鼠、大鼠、鲨鱼、骆驼科动物(camelid)、鸡、山羊和噬菌体。
根据一些实施方式，收集抗体包括：
a.从所免疫的有机体的脾脏中提取B细胞；
b.将所提取的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤；和
c.从杂交瘤中收集抗体。
根据一些实施方式，选择结合的试剂包括对所选择的试剂进行测序并从该序列产生试剂的重组形式。
根据另一方面，提供了通过本发明的方法产生的试剂。
根据另一方面，提供了药物组合物，其包含本发明的试剂以及药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。
根据另一方面，提供了治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症或改善对其需要的对象中的基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括给予对象本发明的药物组合物。
根据另一方面，提供了确定待通过本发明的方法治疗的对象的适合性的方法，包括从对象获得样品并测定样品中的sCD28水平，其中5ng/ml以上的sCD28水平表示对象适合本发明的治疗方法。
根据另一方面，提供了试剂盒，其包含至少一种本发明的试剂。
根据一些实施方式，本发明的试剂盒进一步包含以下中的至少一个：
a.抗PD-1和/或PD-L1免疫疗法；
b.声明本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法联用的标签；和
c.第二检测分子，用于检测权利要求15-37和49中任一项的至少一种试剂。
根据下文给出的详细描述，本发明的其它实施方式和可适用的所有范围将变得显而易见。然而，应该理解，详细说明和具体示例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅是通过示例说明的方式给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于从此详细说明出发的本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1.可溶性CD28在PBMC的刺激期间产生，并通过添加蛋白酶抑制剂(PI)抵消。通过人CD28 ELISA定量的用SEB(0.5ng/mL，左侧)或CMV肽(0.5μg/mL，右侧)刺激的PBMC培养物中可溶性CD28的量的条形图。以指示浓度添加蛋白酶抑制剂混合物。通过干扰素γ的分泌来检查总体健康和效应子活性(下图)。
图2.可溶性CD28在PHA对T细胞进行刺激期间产生，并通过添加蛋白酶抑制剂来抵 消。在固定浓度(2μM)的蛋白酶抑制剂混合物存在下，用浓度增加的PHA(1-4μg/mL，上图)刺激的Jurkat细胞(左上)或分离的人CD4 T细胞(右上)的条形图。在另一背景(setting)下，固定PHA浓度以刺激Jurkat T细胞(1μg/mL PHA，左下)或人CD4 T细胞(2μg/mL PHA，右下)，并滴定(tittered)蛋白酶抑制剂混合物的浓度(0.5-2μM)。用标准化夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度。
图3A-B.具体的ADAM-10和ADAM-17抑制剂消除可溶性CD28在SEB对人PBMC的激活 期间的积累，同时不妨碍其存活(viability)。(3A-B)在各种浓度(0.01-1μM)的(3A)ADAM-10特异性抑制剂(GI254023X)和(3B)ADAM-17特异性抑制剂(TMI-1)的存在下，用SEB(1ng/mL)刺激的人PBMC的条形图。利用MTT试验(上图)评估不同处理中的细胞的存活。用标准化夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度(下图)。
图4A-D.在PBMC刺激期间产生可溶性CD28。(4A)在不含CMV肽(黑色条)或含有CMV肽(深灰色条)的情况下，以1:5的比与来自同一供体的CD3 T细胞混合的未成熟树突细胞的条形图。单独的每个细胞群的对照或与CMV一起的每个细胞群的对照以浅灰色条表示。用标准化夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度。(4B-D)在ADAM-10和ADAM-17抑制剂的存在下，用(4B)CMV或(4C)SEB或(4D)SEB刺激24天，然后转移到清洁的培养物中的人PBMC的条形图。图4D中的测量是在细胞转移后120小时。
图5.CD28可溶性剪接变体在激活的细胞中被下调。凝胶的照片显示了在未刺激的PBMC(泳道4)和CD4(泳道6)、受刺激的PBMC(泳道5)和CD4细胞(泳道7)中通过PCR扩增的人CD28的编码序列。将扩增的片段在1％琼脂糖凝胶上进行大小分离，并通过溴化乙锭可视化。扩增GADPH cDNA作为对照(下图)。用于Sanger测序的条带由S1(PHA激活的CD4—650bp)和S2(幼稚的CD4—550bp条带)标记。
图6.可溶性CD28抑制效应细胞因子的分泌。在指示浓度的重组人CD28不存在(黑色条)或存在(灰色条)下，用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的条形图。未经CMV刺激的幼稚样品(
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samples)用浅灰色条表示。用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IFNγ的浓度。
图7.可溶性CD28增加IL-6细胞因子的分泌。在指示浓度的重组人可溶性CD28不存在(黑色条)或存在(灰色条)下，用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的条形图。未经CMV刺激的幼稚样品用浅灰色条表示。用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IL-6的浓度。
图8A-E.(8A)在指示浓度的重组人可溶性CD28(灰色三角形)或重组人可溶性CTLA-4(黑色圆圈)存在下，用CMV(0.5μg/mL)刺激的人PBMC的线图。用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IL-6、IFNγ和IL-4的浓度。使用Magpix系统(Millipore)，用多重分析定量上清液中人IL-8、IL-12p(40)和IL-10的浓度。(8B)细胞因子从自体单核细胞和CD3 MLR分泌的条形图。未经CMV刺激的幼稚样品用浅灰色条表示。单独的CMV对照或与IgG一起的CMV对照用黑色条表示。增加的浓度sCD28用深灰色条表示。(8C)在重组人可溶性CD28(灰色圆圈)的存在下用SEB，或用SEB与对照IgG一起(灰色三角形)刺激的人PBMC导致淋巴细胞簇形成的线图。(8D)通过犬尿氨酸ELISA试剂盒，从用重组人sCD28处理和未用重组人sCD28处理的单核细胞测量的IDO分泌到培养物中的条形图。(8E)用重组人sCD28处理和未用重组人sCD28处理的单核细胞中IDO的细胞内FACS的散点图。
图9A-C.可溶性CD28阻碍抗PD1治疗。(9A)在抗PD1(MK3475，5μg/g，黑色条)或重组人可溶性CD28(2和10μg/mL，灰色条)或两者的组合(虚线条)的存在下，用SEB(200ng/mL，左侧图)或CMV肽(0.5μg/mL，右侧图)刺激3天的人PBMC的条形图。(9B)单核细胞MLR背景下的细胞因子分泌的条形图，幼稚—白色条，单独的CMV—浅灰色条，sCD28—黑色条，MK-3475—深灰色条，sCD28+MK-3475—格子条。用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量上清液中人IFNγ、TGFβ和IL-2的浓度。(9C)与对照和sCD28温育后单核细胞中表面PD-L1(左)和PD-L2(右)表达的直方图。
图10A-D.癌症患者中的可溶性CD28。(10A)点图显示了10种癌症适应症和健康供体的每一个中的20个血浆样品用于调查可溶性人CD28的存在。用几种稀释因子反复检查了可溶性CD28含量高的样品。用内部校准以适应(accommodate)来自人血浆样品的读数的标准化夹心ELISA定量上清液中人CD28的浓度。(10B)使用本发明的抗体#1与#3和可商购的CD28 ELISA试剂盒，从20个黑素瘤患者样品中ELISA检测sCD28的条形图*—测量量超过150ng/ml。(10C)在sCD28、MK-3475和这两者的组合存在的情况下，通过夹心ELISA，从癌症患者(肉瘤患者—左上，肾癌患者—右上，以及两名不同的头颈癌患者—下方)的SEB刺激的PBMC测量的IFNγ分泌的条形图。(10D)单独地、与IL-6一起、与单核细胞共培养、或与单核细胞和sCD28共培养的癌细胞SCC-25的存活和增殖的条形图。
图11A-B.(11A)IFNγ从在恒定CD80-Fc水平和可溶性CD28滴定的存在下，用抗CD3刺激的分离的CD3 T细胞分泌的条形图。(11B)在恒定sCD28水平和CD80-Fc滴定的存在下，用CMV刺激的分离的PBMC。
图12A-B.(12A-B)在不给予重组小鼠CD28的情况下(12A)和给予重组小鼠CD28的情况下(12B)，用抗PD-1抗体处理的免疫活性小鼠中接种的H22细胞的肿瘤体积的线图。
图13A-C.(13A)线图显示了通过克隆M9的连续稀释，抗原与BSA缀合的CD28茎部区域二聚体肽(右)和重组人CD28蛋白(左)的结合。将抗原固定在maxisorp ELISA板上。进行克隆M9的稀释系列，并用驴抗小鼠IgG(H&L)-HRP检测结合的抗体，并用TMB展开。(13B)对重组人sCD28(左)和从用SEB激活的人PBMC中脱落的sCD28(右)的ELISA检测的条形图。ELISA使用抗体#3作为阳性对照(2μg/mL，灰色条)，不相关的抗体M39作为阴性对照(10μg/mL，深灰色条)和抗剪切抗体M9(10μg/mL，黑色条)。通过使用与HRP(0.5μg/mL)缀合的ELISA试剂盒检测抗体来检测重组CD28或脱落的CD28。(13C)就可商购的MAB342——克隆37407，对浓度增加的重组人CD28-Fc、重组人CD28a、重组小鼠CD28和二聚体人CD28茎部区域肽的ELISA试验的结果的线图。
图14A-E.(14A-B)条形图显示了来自用PHA刺激的人CD4+ T细胞(14A)和用SEB刺激的人PBMC(14B)的上清液中的sCD28水平。(14C)就抗体#1和#2以及可商购的CD28.2，对浓度增加的人sCD28的ELISA试验的结果的线图。(14D)就抗体#1、#2和#3中的每一种，对浓度增加的人sCD28的ELISA试验的结果的线图。(14E)就抗体#1、#2和#3中的每一种，对浓度增加的小鼠sCD28的ELISA试验的结果的线图。
图15A-I.(15A-D)FACS直方图显示了在仅添加CD86(红色线)或添加CD86和(15A)CD28.2、CD86和(15B)抗体#1、CD86和(15C)#2抗体、CD86和(15D)抗体#3、以及CD86和(15E)mIgG对照(绿色线)后，CD86与表达mCD28的细胞结合。仅添加第二抗体以显示未染色的细胞(黑色线)。(15F-G)条形图显示了干扰素γ(IFNγ)从：(15F)在用2μg/mL抗CD3，以及CD28.2(2.0μg/mL)或不同稀释度的抗体#1-3(0.1-10μg/mL，黑色条)处理后的T细胞、(15G)在SEB刺激和用CD28.2(2.0μg/mL)或不同稀释度的抗体#1-3(0.1-10μg/mL，黑色条)处理后的PBMC、和(15H)在浓度变化和浓度不变化的抗体#1-3的情况下用CD80-Fc处理后的T细胞的分泌。(15I)抗体#1-3与幼稚CD3阳性T细胞结合的直方图。
图16A-G.(16A-B)条形图显示了在和与不同量的(16A)抗体#1和(16B)抗体#2缀合的珠子混合后，来自癌症患者的血液中留存的sCD28。(16C-G)条形图显示了在和与抗体#1、CD80、CD86和ICOSL缀合的珠混合后，来自(16C)结直肠癌患者、(16D-E)黑素瘤患者、(16F)卵巢癌患者和(16G)健康患者的血液中留存的sCD28。
具体实施方式
本发明在一些实施方式中提供了结合膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂和结合可溶性CD28(sCD28)并且既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂的试剂。本发明进一步提供了在结合后降解sCD28或导致sCD28的降解，或导致其从循环、组织和/或肿瘤微环境(TME)中清除的试剂。在某些情况下，所述试剂可以执行多于一个的这些任务。还提供了治疗癌症和改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括降低可溶性CD28(sCD28)水平。本发明的试剂和方法基于令人惊讶的发现，即大量癌症患者在他们的血流中具有升高的sCD28水平。sCD28是已知的免疫调节剂，其有时在自身免疫性疾病中过度表达。然而，到目前为止，尚未在广泛多种癌症中报道过高度升高的水平。此外，出乎意料地发现sCD28可以抑制基于PD-1/PD-L1的免疫疗法。因此，对象的血流中sCD28的减少导致sCD28对对象抗癌能力和免疫疗法有效性的有害作用的减少。
本发明的抗剪切分子具有双重益处。通过阻断mCD28的蛋白酶剪切，它们可以保持T细胞的细胞表面上高的CD28含量。这允许快速和有效的T细胞激活，如果表面CD28的水平由于剪切而下降，T细胞激活则会被削弱。此外，剪切的减少导致对象的血流中sCD28的减少，因而减少sCD28对对象抗癌能力和免疫疗法有效性的有害作用。
结合sCD28
第一方面，提供了结合可溶性CD28(sCD28)并且既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂的试剂。
在一些实施方式中，CD28是哺乳动物CD28。在一些实施方式中，CD28是人CD28。在一些实施方式中，人CD28包含以下氨基酸序列或以下由氨基酸序列组成：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，成熟的CD28缺少信号肽并且包含序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，编码全长人CD28的DNA编码序列包含序列：ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:3)。
如本文所用，sCD28是指不包含跨膜结构域并因此不能整合在膜中的任何CD28片段或变体。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，sCD28不是膜结合的。在一些实施方式中，sCD28处于溶液中。在一些实施方式中，sCD28是血液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是TME中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是体液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28是源自剪接掉CD28的外显子3的可选择剪接的剪接变体。在一些实施方式中，sCD28是来自膜CD28(mCD28)的剪切产物。在一些实施方式中，sCD28是截短的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少全长CD28的细胞质结构域。在一些实施方式中，sCD28是二聚体sCD28。在一些实施方式中，sCD28是单体sCD28。在一些实施方式中，sCD28不是源自CD28的可选择剪接的剪接变体。在一些实施方式中，可选择剪接剪接掉CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28包含氨基酸序列：
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQID NO:5)。在一些实施方式中，sCD28缺少信号肽并且包含序列：
NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方式中，编码人sCD28的DNA编码序列包含序列：
ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方式中，试剂结合sCD28和mCD28，并且仅导致或引起sCD28的降解或清除。在一些实施方式中，试剂不结合膜CD28(mCD28)。如本文所用，mCD28是指包含跨膜结构域并因此可以整合在膜中的任何CD28。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，mCD28在膜中。在一些实施方式中，mCD28已从ER经过，并通过高尔基体进入细胞的质膜。在一些实施方式中，mCD28在免疫细胞的质膜中。在一些实施方式中，mCD28在T细胞的质膜中。
在一些实施方式中，试剂不是CD28激动剂。在一些实施方式中，试剂不是CD28拮抗剂。在一些实施方式中，试剂既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂。在一些实施方式中，sCD28结合剂也是mCD28激动剂。
术语“激动剂”通常是指与受体结合并完全或部分激活受体的分子、化合物或试剂。在一些实施方式中，激动剂在与天然配体相同的位点处结合。在一些实施方式中，激动剂在不同于天然配体的结合位点的变构位点处结合。术语“拮抗剂”通常是指这样的分子、化合物或试剂：在与激动剂相同的位点或另一位点处与受体结合，不激活受体并且进行以下中的一项或多项：干扰或阻断天然配体对受体的激活，和干扰或阻断受体激动剂对受体的激活。在一些实施方式中，本发明的抗体结合mCD28，但不激活或阻断受体的激活。在一些实施方式中，它们不阻断CD86激活。在一些实施方式中，本发明的抗体不结合mCD28。
如本文所用，“直接激动剂/拮抗剂”是指与受体(mCD28)结合并且通过结合来增加/减少该分子的信号传导的分子。在mCD28的情况下，激动剂将结合mCD28并通过结合来增加细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞激活。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞增殖。在一些实施方式中，激动剂增加促炎细胞因子的分泌。促炎细胞因子是本领域公知的，并且已知由激活的T细胞分泌。促炎细胞因子的示例包括但不限于TNFα、IFNγ、IL-1B和IL-6。在一些实施方式中，促炎细胞因子是IFNγ。在mCD28的情况下，拮抗剂将结合mCD28并通过结合来降低细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，拮抗剂降低T细胞激活、降低T细胞增殖和/或降低促炎细胞因子分泌。这样的分子不被认为是直接的激动剂/拮抗剂：通过接触其配体、接触抑制剂、接触辅助受体(co-receptor)或接触除所讨论的受体以外的任何其它分子以修饰受体信号传导来影响受体的信号传导的分子。在一些实施方式中，本发明的试剂接触血清中的sCD28，从而允许在细胞上通过mCD28增加信号传导。尽管结果增加了mCD28信号传导，但抗体不是mCD28激动剂或直接激动剂，因为它与mCD28的结合不会增加受体信号传导。
在一些实施方式中，试剂不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂不妨碍(obscure)或阻止对配体结合结构域的进入。在一些实施方式中，试剂不结合、妨碍或阻止对sCD28的IgV结构域的进入。在一些实施方式中，IgV结构域是配体结合结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸28-137。在一些实施方式中，配体结合结构域包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：MLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG(SEQ ID NO:8)。在一些实施方式中，试剂不抑制sCD28与配体的结合。在一些实施方式中，CD28配体选自：CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方式中，CD28配体是CD86。在一些实施方式中，CD28配体是CD80。在一些实施方式中，CD28配体是ICOSL。在一些实施方式中，CD86是CD86-Fc。在一些实施方式中，CD80是CD80-Fc。
在一些实施方式中，试剂结合CD28的茎部区域。在一些实施方式中，试剂结合mCD28的膜近侧区域。在一些实施方式中，茎部区域包含序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ IDNO:9)。在一些实施方式中，茎部区域包含序列KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:36)。在一些实施方式中，茎部区域包含以下序列或由以下序列组成：HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)。在一些实施方式中，试剂结合单体sCD28。在一些实施方式中，试剂结合二聚体sCD28。在一些实施方式中，试剂结合单体sCD28、二聚体sCD28或两者。在一些实施方式中，试剂结合单体CD28但不结合二聚体CD28。由于功能性mCD28是二聚体的，因此可利用仅结合CD28单体以确保试剂不结合mCD28。
试剂的示例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子、以及与CD28特异性结合的肽。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是纳米抗体。在一些实施方式中，试剂是VHH抗体。如本文所用，术语“单结构域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”是同义词并且可互换使用。在一些实施方式中，肽与CD28特异性结合。在一些实施方式中，试剂是对CD28具有特异性结合的肽。在一些实施方式中，肽选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、纳米抗体、VHH抗体和抗体模拟物(mimetic)。如本文所用，术语“抗体模拟物”是指可以特异性结合靶抗原的有机化合物。在一些实施方式中，抗体模拟物在结构上与抗体不相关。抗体模拟物的示例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体和纳米CLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。所有这些试剂在本领域中都是公知的，并且已知可用于阻断受体及其配体之间的相互作用。可以结合mCD28的小分子和蛋白质可以堵塞剪切位点，或者可以使蛋白酶的进入受阻碍或削弱(impair)。在一些实施方式中，所述蛋白质是抗体模拟物。如本文所用，术语“DARPin”是指经设计的锚蛋白重复蛋白。DARPin是基因改造的抗体模拟蛋白，通常对其蛋白质靶标具有高度特异性。因此，用于CD28的DARPin可以是试剂的示例。
在一些实施方式中，结合sCD28的试剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，针对sCD28的抗体是单结构域抗体。在一些实施方式中，针对sCD28的抗体缺少Fc结构域。在一些实施方式中，结合sCD28的试剂是缺少Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，结合sCD28的试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，结合sCD28的试剂是骆驼科动物、鲨鱼或纳米抗体。在一些实施方式中，抗体或片段与另一蛋白质或蛋白质的片段融合。在一些实施方式中，第二蛋白质或片段增加半衰期，特别是血清中的半衰期。在一些实施方式中，延长半衰期的蛋白质是人血清白蛋白。在一些实施方式中，试剂由产生提高半衰期的修饰的化学品修饰。在一些实施方式中，修饰是PEG化，并且化学品是聚乙二醇。技术人员将理解，可以使用任何延长半衰期的蛋白质或化学试剂或本领域已知的修饰。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个结合结构域的多肽或多肽组，所述结合结构域由具有三维结合空间的多肽链折叠形成，所述三维结合空间的内部表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特征互补。抗体通常具有四聚体形式，包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。抗体可以是寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、骆驼化(camelised)抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、人源化抗体、完全人抗体、抗独特型抗体以及可以以可溶性形式或结合形式标记的抗体以及片段，包括单独地或与其它氨基酸序列组合的表位结合片段、其变体或衍生物。抗体可以来自任何物种。术语抗体还包括结合片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab')2单链抗体(svFC)、二聚体可变区(双抗体)和二硫化物连接的可变区(dsFv)。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子。抗体片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域融合，所述另一个免疫球蛋白结构域包括但不限于Fc区或其片段。技术人员将进一步理解，可以产生其它融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合、可变区(例如，VL和VH)～Fc融合和scFv-scFv-Fc融合。
免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。在一些实施方式中，抗体包含IgG2或IgG4。在一些实施方式中，抗体包含IgG2。在一些实施方式中，抗体包含IgG4。
天然存在的抗体结构的基本单位是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成，通过非共价键缔合和通过二硫键两者连接在一起。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。存在五种人抗体类别(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并且在这些类别中，根据结构上的差异(如单个抗体分子中免疫球蛋白单位的数量、独立单位的二硫键结构、以及链长和序列的差异)认识到了各种亚类。抗体的类别和亚类是其同种型。
重链和轻链的氨基末端区域在序列上比羧基末端区域更具多样性，因此被称为可变结构域。抗体结构的这部分赋予抗体的抗原结合特异性。重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域一起形成单个抗原结合位点，因此，基础的免疫球蛋白单位具有两个抗原结合位点。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人,J.Mol.Biol.186,651-63(1985)；Novotny和Haber,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA824592-4596)。
重链和轻链的羧基末端部分形成恒定结构域，即CH1、CH2、CH3、CL。尽管这些结构域的多样性要少得多，但一种动物种属与另一种却有所不同，此外，在同一个体内，存在若干种不同的抗体同种型，每种同种型都具有不同的功能。
术语“构架区”或“FR”是指抗体的可变结构域中不同于本文所定义的高变区氨基酸残基的氨基酸残基。如本文所用，术语“高变区”是指抗体的可变结构域中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。CDR主要负责与抗原的表位结合。FR和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat等人)。
免疫球蛋白可变结构域也可以使用IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(
Figure BDA0002755381420000151
/V-Quest)进行分析，以识别可变区区段，包括CDR。参见，例如，Brochet,X.等人,Nucl.Acids Res.J6:W503-508(2008)。
Chothia等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地使“Chothia编号”系统对任何可变结构域序列赋值(指定，assign)，而无需依序赖列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Chothia编号”是指由Chothia等人,Journal of Molecular Biology,“Canonical Structures for the Hypervariableregions of immunoglobulins”(1987)和Chothia等人,Nature,“Conformations ofImmunoglobulin Hypervariable Regions”(1989)提出的编号系统。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指来自非人种属的抗体，其蛋白质序列已被修饰以提高与人抗体的相似性。人源化抗体可以通过产生编码被类似于人抗体的序列包围的非人抗体的CDR的重组DNA来产生。在一些实施方式中，人源化抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，人源化包括将本发明的CDR插入人抗体支架或骨架中。人源化抗体是本领域公知的，并且可以使用保留本发明CDR的产生这些抗体的任意方法。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了在单克隆抗体的产生过程中可出现的可能的变体以外，这种变体通常少量存在，构成所述群体的各个抗体都是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对(directed against)不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外部，单克隆抗体的优点在于它们不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上均质的抗体群体获得的，并且不应解释为通过任何特定的制备方法产生。根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人，Nature 256:495(1975)最先描述的杂交瘤法来制备，或者可以通过重组DNA法来制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。还可以使用例如Clackson等人，Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本发明的mAh可以是包括IgG、IgM、IgD、IgE或IgA的任意免疫球蛋白类别。产生mAh的杂交瘤可以在体外或体内培养。可以在体内产生中获得高滴度的mAb，在体内产生中将来自单独的杂交瘤的细胞腹膜内注射到降植烷致敏的(pristine-primed)Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度所需mAb的腹水。可以使用本领域技术人员公知的柱色谱法，从这样的腹水或从培养物上清液中纯化同种型IgM或IgG的mAb。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；和单臂(one-armed)抗体、单可变结构域抗体、微型抗体(minibodies)、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、di-scFv、bi-scFv、或串联(双、三)-scFv)；和双特异的T细胞衔接子(BiTE)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点，以及一个残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理获得具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最微型抗体片段。此区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的以紧密方式的二聚体(非共价缔合)构成。正是在这种构型中，VH-VL二聚体的三个表面。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，其亲和力也低于整个结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称(designation)，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有至少一个游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初是以成对的Fab'片段产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
根据抗体的恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物种属的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”指定为被称为kappa和lambda的两种明显不同的类型中的一个。
根据抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体指定为不同的类别。完整抗体有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别被称为α、δ、e、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含使scFv能够形成所需的抗原结合结构的多肽连接体。有关scFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的微型抗体片段，所述片段包含与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对的连接体，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体产生是本领域已知的，并且在Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有所描述。
术语“多特异性抗体”以最广义使用，并且尤其涵盖具有多表位特异性的抗体。这样的多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单位具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，其每个VHVL单位都与不同的表位结合；具有两个或更多个单可变结构域的抗体，其每个单可变结构域都与不同的表位结合；全长抗体；抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。
可以使用本领域公知的方法来制备本发明的单克隆抗体。示例包括各种技术，诸如Kohler,G.和Milstein,C,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等人,Immunology Today4:72(1983)；Cole等人,pg.77-96in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.(1985)中的那些技术。
除了在体内产生抗体的常规方法外，还可以使用噬菌体展示技术在体外产生抗体。与常规抗体产生相比，这种重组抗体的产生要快得多，并且可以针对大量抗原产生这种重组抗体。此外，当使用常规方法时，许多抗原被证明是非免疫原性或极具毒性的，因此不能用于在动物中产生抗体。此外，重组抗体的亲和力成熟(即，提高亲和力和特异性)非常简单并且相对较快。最后，可以在一种选择程序中产生针对特异性抗原的大量不同的抗体。为了产生重组单克隆抗体，人们可以使用全都基于展示文库的各种方法来产生大量具有不同抗原识别位点的抗体。这样的文库可以用几种方法来制备：人们可以通过在重链种系基因库中克隆合成的CDR3区来产生合成的库，从而产生大量的抗体库，从中可以选择具有各种特异性的重组抗体片段。人们可以使用人的淋巴细胞库作为构建抗体文库的起始材料。可以构建人IgM抗体的幼稚库(naive repertoires)，从而创建多样性很大的人类文库。此方法已被广泛成功地用于选择大量针对不同抗原的抗体。噬菌体文库构建和重组抗体选择的方案在公知的参考文献文本Current Protocols in Immunology,Colligan等人(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.(1992-2000),第17章,第17.1节中提供。
非人抗体可以通过本领域已知的任何方法人源化。在一种方法中，将非人互补决定区(CDR)插入人抗体或共有抗体构架序列中。然后可以将进一步的改变引入抗体构架以调节亲和力或免疫原性。
在一些实施方式中，抗体及其部分包括：抗体、抗体的片段、Fab和F(ab')2、单结构域抗原结合重组片段和天然纳米抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab')2、scFV或sc FV2片段。
在一些实施方式中，本发明提供了编码本发明的抗体或抗原结合部分的核酸序列。
例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，如轻链或重链。完全的重链不仅包括重链可变区(VH)，还包括重链恒定区(CH)，重链恒定区通常将包含三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3；和“铰链”区。在某些情况下，期望存在恒定区。
可以由多核苷酸编码的其它多肽包括抗原结合抗体片段，如单结构域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab'和CHI以及CK或CL结构域已被切除。由于微型抗体比常规抗体小，因此它们在临床/诊断应用中应达到更好的组织渗透性，但由于是二价的，因此与单价抗体片段(如dAb)相比，它们应保留更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有指示，否则本文所用的术语“抗体”不仅涵盖完整的抗体分子，而且涵盖上面讨论的类型的抗原结合抗体片段。相对于相应的人受体构架，存在于编码的多肽中的每个构架区可包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体构架区，构架区可总共包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。考虑到构成所公开的蛋白质产物的各个氨基酸的特性，本领域技术人员将认识到一些合理的取代。可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行氨基酸取代，即“保守取代”。
适合地，本文所述的多核苷酸可以被分离和/或纯化。在一些实施方式中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
如本文所用，术语“非天然存在的”物质、成分、实体和/或物质、成分、或实体的任意组合、或其任意的语法上的变体是条件术语，明确地排除但也仅排除那些本领域普通技术人员熟知为“天然存在”的，或是由法官或行政或司法机构确定或解释为可能在任何时间都“天然存在”的物质、成分、实体和/或物质、成分或实体的任意组合的形式。
在一些实施方式中，试剂是抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GYTLTNY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:13(NTYTGK)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:14(GDANQQFAY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:15(KASQDINSYLS)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:16(RANRLVD)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ IDNO:17(LQYDEFPPT)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，试剂是抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:18(GYTFTSY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:19(YPGDGD)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:20(NYRYSSFGY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:21(KSSQSLLNSGNQKNYLT)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:22(WASTRES)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:23(QSDYSYPLT)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，试剂是抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:24(GYTFTDY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:25(NPNYDS)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:26(SSPYYDSNHFDY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:27(SARSSINYMH)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:28(DTSKLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQID NO:29(HQRNSYPFT)中所示的氨基酸序列。
另一方面，提供了抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GYTLTNY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:13(NTYTGK)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:14(GDANQQFAY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:15(KASQDINSYLS)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:16(RANRLVD)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:17(LQYDEFPPT)中所示的氨基酸序列。
另一方面，提供了抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和那三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:18(GYTFTSY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:19(YPGDGD)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:20(NYRYSSFGY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:21(KSSQSLLNSGNQKNYLT)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:22(WASTRES)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:23(QSDYSYPLT)中所示的氨基酸序列。
另一方面，提供了抗体或其抗原结合部分，包含三条重链CDR(CDR-H)和那三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:24(GYTFTDY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:25(NPNYDS)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:26(SSPYYDSNHFDY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:27(SARSSINYMH)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:28(DTSKLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:29(HQRNSYPFT)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTLTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGKPTYVDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGDANQQFAYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO:41)。在一些实施方式中，重链的可变区包含SEQ ID NO:41和/或由SEQ ID NO:41组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTLTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGKPTYVDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGDANQQFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:42)。在一些实施方式中，重链由SEQ ID NO:42组成。对如本申请中所指的抗体#1进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:42组成的重链。使用Chothia方案确定的此重链的CDR是SEQ ID NO:12-14。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYDDMGIYYCLQYDEFPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:43)。在一些实施方式中，轻链的可变区包含SEQ ID NO:43和/或由SEQ ID NO:43组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYDDMGIYYCLQYDEFPPTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:44)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:44组成。对如本申请中所指的抗体#1进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:44组成的轻链。使用Chothia方案确定的此轻链的CDR是SEQ ID NO:15-17。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWIKKRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLASEDSAVYFCARNYRYSSFGYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:45)。在一些实施方式中，重链的可变区包含SEQ ID NO:45和/或由SEQ ID NO:45组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWIKKRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLASEDSAVYFCARNYRYSSFGYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(SEQ ID NO:46)。在一些实施方式中，重链由SEQID NO:46组成。对如本申请中所指的抗体#2进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:46组成的轻链。使用Chothia方案确定的此重链的CDR是SEQ ID NO:18-20。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTLSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPQLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQSDYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，轻链的可变区包含SEQ ID NO:47和/或由SEQ ID NO:47组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTLSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPQLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQSDYSYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:48)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:48组成。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:48组成。对如本申请中所指的抗体#2进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:48组成的轻链。使用Chothia方案确定的此轻链的CDR是SEQ IDNO:21-23。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有一些氨基酸序列的重链：EVQLQQFGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTAYNQKFMGKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARSSPYYDSNHFDYWGQGTSLTVSS(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，重链的可变区包含SEQ ID NO:49和/或由SEQ ID NO:49组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：EVQLQQFGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTAYNQKFMGKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARSSPYYDSNHFDYWGQGTSLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:50)。在一些实施方式中，重链由SEQ ID NO:50组成。对如本申请中所指的抗体#3进行测序，并发现其重链由SEQ ID NO:50组成。使用Chothia方案确定的此重链的CDR是SEQ ID NO:24-26。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSARSSINYMHWFQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCHQRNSYPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:51)。在一些实施方式中，轻链的可变区包含SEQ ID NO:51和/或由SEQ ID NO:51组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSARSSINYMHWFQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCHQRNSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:52)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:52组成。对如本申请中所指的抗体#3进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:52组成的轻链。使用Chothia方案确定的此轻链的CDR是SEQ ID NO:27-29。
在一些实施方式中，试剂作为单体结合。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合。在一些实施方式中，试剂作为单体和/或二聚体结合。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合，但不结合mCD28。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合，但不交联和/或激活mCD28。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合，但是仅结合CD28的单个分子。在一些实施方式中，试剂结合单体CD28。在一些实施方式中，试剂结合二聚体CD28。在一些实施方式中，试剂结合单体和/或二聚体CD28。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是抗CD28抗体。在一些实施方式中，抗体的靶抗原是CD28、sCD28、二聚体CD28和/或二聚体sCD28。在一些实施方式中，抗体的靶抗原是CD28、sCD28、单体CD28和/或单体sCD28。在一些实施方式中，抗体的靶抗原是CD28、sCD28、单体CD28、单体sCD28、二聚体CD28和/或二聚体sCD28。在一些实施方式中，sCD28或CD28是单体的。在一些实施方式中，sCD28或CD28是二聚体的。在一些实施方式中，CD28或sCD28是单体的或二聚体的。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是抗可溶性CD28(sCD28)抗体。“抗CD28抗体”、“识别CD28的抗体”或“抵抗CD28的抗体”是以足够的亲和力和特异性结合CD28的抗体。在一些实施方式中，抗体提高了与CD28或sCD28的结合。在一些实施方式中，与膜mCD28相比，抗体提高了与sCD28的结合。在一些实施方式中，与可商购的CD28抗体相比，抗体提高了与sCD28的结合。在一些实施方式中，可商购的CD28抗体是CD28.2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段对CD28或sCD28具有特异性结合亲和力。
如本文所用，术语“提高的结合亲和力”和“更大的结合亲和力”是可互换的。在一些施方式中，与mCD28相比，本发明的抗体或其抗原结合部分对sCD28具有更大的结合亲和力。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大10％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大30％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大50％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大75％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大100％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大150％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大250％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大500％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力大1,000％。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是1.5倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是2倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是5倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是10倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是50倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是100倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是500倍。在一个实施方式中，本文所用的更大的亲和力是1000倍。
“抗原”是能够引发抗体形成并被抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或多于一个的表位。上面提到的特异性反应是指抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不与可由其它抗原诱发的多种其它抗体反应。
根据本发明的术语“抗原决定簇”或“表位”是指与特定抗体特异性反应的抗原分子的区域。可以使用本领域已知的方法，将衍生自表位的肽序列单独地或与载剂部分结合地使用，以免疫动物并产生另外的多克隆或单克隆抗体。
在一些实施方式中，抗体在重链的N304处包含N-连接的糖基化。
在一些实施方式中，试剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗原结合片段是Fab片段。在一些实施方式中，抗体是单结构域抗体。在一些实施方式中，抗体缺少Fc结构域。在一些实施方式中，试剂是缺少Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是骆驼科动物、鲨鱼或纳米抗体。在一些实施方式中，抗体或片段与另一蛋白质或蛋白质的片段融合。在一些实施方式中，第二蛋白质或片段增加半衰期，特别是血清中的半衰期。在一些实施方式中，延长半衰期的蛋白质是人血清白蛋白。在一些实施方式中，试剂由产生提高半衰期的修饰的化学品修饰。在一些实施方式中，修饰是PEG化，并且化学品是聚乙二醇。技术人员将理解，可以使用任何延长半衰期的蛋白质或化学试剂或本领域已知的修饰。
在一些实施方式中，试剂与sCD28的结合降解sCD28。在一些实施方式中，试剂与sCD28的结合导致或致使sCD28降解。在一些实施方式中，当结合是在有机体内时，降解发生。在一些实施方式中，当结合是在有机体的血流中时，降解发生。在一些实施方式中，当结合是在有机体的TME中时，降解发生。在一些实施方式中，降解包括从血液中去除sCD28。在一些实施方式中，降解包括将结合的sCD28转运至溶酶体、内体、蛋白酶体或其组合。每种可性都代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致从血液中去除sCD28。在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致sCD28从血液中清除(sweeping)。在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致sCD28从TME中去除。在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致sCD28从TME清除。在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致sCD28从血液、TME或两者中去除。在一些实施方式中，试剂与有机体中sCD28的结合导致sCD28从血液、TME或两者中清除。在一些实施方式中，sCD28不被降解，但从血液、TME或两者中去除。在一些实施方式中，结合的sCD28是免疫复合物。
存在多种已知的从血流中去除结合的抗原的机理。这些机理包括但不限于补体介导的去除、单核细胞和巨噬细胞的吞噬作用、调理作用、蛋白质水解、被动扩散和主动运输。在一些实施方式中，主动运输是通过红细胞进行的。在一些实施方式中，结合的抗原被转运至吞噬细胞。在一些实施方式中，结合的抗原被转运至溶酶体。在一些实施方式中，结合的抗原被转运至溶酶体、内体、蛋白酶体、或其组合。可诱导去除结合的sCD28复合物的任何试剂都可以用于本发明。
在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97或99％。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至健康个体的水平。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂将sCD28血液水平降低至至多5ng/ml。在一些实施方式中，试剂将sCD28血液水平降低至至多10ng/ml。在一些实施方式中，试剂将sCD28血液水平降低至至多20ng/ml。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至健康个体的水平。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至低于1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至低于5ng/ml。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至低于10ng/ml。在一些实施方式中，试剂将sCD28水平降低至低于20ng/ml。在一些实施方式中，减少或降低发生在对象的血液、外周血或TME中。在一些实施方式中，减少或降低发生在血液中。
在一些实施方式中，sCD28水平是通过ELISA测量的。在一些实施方式中，ELISA是夹心ELISA。在一些实施方式中，ELISA是标准化夹心ELISA。在一些实施方式中，ELISA是Bender MedSystems ELISA。在一些实施方式中，ELISA是Bender MedSystems ELISA试剂盒BMS290。在一些实施方式中，用本发明的试剂进行ELISA。
在一些实施方式中，试剂是清除抗体。如本文所用，术语“清除抗体”是指降低来自溶液的可溶性组分的量的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，清除抗体不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方式中，清除抗体不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，清除抗体不诱导ADCC和/或CDC。在一些实施方式中，清除抗体包含IgG2或IgG4结构域。在一些实施方式中，清除抗体包含IgG2结构域。在一些实施方式中，清除抗体包含IgG4结构域。在一些实施方式中，清除抗体包含经突变以降低由抗体结合介导的细胞死亡的IgG1或IgG3。在一些实施方式中，突变使Fc受体结合结构域突变。在一些实施方式中，抗体的Fc结构域被改造或突变以降低CDC、ADCC或两者。Fc改造是本领域公知的，并且可以使用已知降低抗体介导的细胞杀伤的任何突变或氨基酸改变。
在一些实施方式中，抗体不包含IgG1和/或IgG3。在一些实施方式中，抗体不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方式中，抗体不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，抗体包括含有减少由抗体的结合所诱导的ADCC、CDC或两者的突变的IgG1或IgG3。在一些实施方式中，突变使ADCC、CDC或两者均减少至无。ADCC和CDC已得到很好的表征，并且允许诱导这些细胞毒性途径的抗体序列是公知的。突变，诸如作为非限制性示例，IgG1或IgG3突变成IgG2或IgG4是公知的。任何此类突变均可用于本发明的抗体的骨架。
在一些实施方式中，抗体的Fc结构域是人Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域包含减少ADCC、CDC或两者的突变。在一些实施方式中，抗体包含在低pH下增加抗体或其抗原结合部分与sCD28的解离的突变。在一些实施方式中，低pH是等于或低于6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.5、4、3.5或3的pH。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，低pH是6或低于6的pH。在一些实施方式中，低pH是在人内体中发现的pH。在一些实施方式中，低pH是在人溶酶体中发现的pH。在一些实施方式中，抗体包含在低钙浓度下增加抗体或其抗原结合部分与sCD28的解离的突变。在一些实施方式中，低钙浓度是等于或低于1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.07、0.05、0.03或0.01mM的钙浓度。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，低钙浓度是在人内体中发现的钙浓度。在一些实施方式中，增加解离的突变是CDR中的突变。在一些实施方式中，抗体包含在内体和/或溶酶体中增加抗体与sCD28的解离的突变。
在一些实施方式中，突变在FcRn结合区域中。在一些实施方式中，突变在FcγRIIb结合区域中。在一些实施方式中，突变增加了与Fc受体的结合。在一些实施方式中，Fc受体是FcRn。在一些实施方式中，Fc受体是FcγRIIb。在一些实施方式中，突变增加了在中性pH下和/或血清中Fc受体结合。在一些实施方式中，突变增加了在低pH下Fc受体结合。在一些实施方式中，突变选自重链的氨基酸27、重链的氨基酸31、轻链的氨基酸32和轻链的氨基酸53突变成组氨酸。在一些实施方式中，突变增加抗体及其结合的抗原到细胞内的摄取。
在低pH下增加Fc受体结合、增加到细胞中的摄取、增加解离，和/或用于产生清除抗体的突变的示例是本领域公知的。这样的示例可以在例如Schroter等人,A genericapproach to engineer antibody pH-switches using combinatorial histidinescanning libraries and yeast display,mAbs,2015；Yang等人,Maximizing in vivotarget clearance by design of pH-dependent target binding antibodies withaltered affinity to FcRn,mAbs,2017；和Igawa等人,Sweeping antibody as a noveltherapeutic antibody modality capable of eliminating soluble antigens fromcirculation,Immunological Reviews,2016(其均通过引用以其全部内容并入本文)中找到。其中还提供了产生此类抗体以及测试其功效的方法。在一些实施方式中，突变是人Fc结构域的突变，并且选自组氨酸268突变成谷氨酰胺、缬氨酸309突变成亮氨酸、丙氨酸330突变成丝氨酸和脯氨酸331突变成丝氨酸。提供的编号是针对IgG1的，但是可以在其它IgG中进行诸如可以由技术人员确定的相当的突变。此外，可以通过在各种pH的培养基中进行结合/解离试验来检查此类抗体的功效。还可以在模型有机体(如小鼠和猴子)中进行测试，其中在添加抗体之前和之后测量sCD28的血清水平。任选地，可以将表达人sCD28的肿瘤异种移植至动物以确保血清sCD28。
在一些实施方式中，抗体包含在CDR中的突变，该突变在低pH下降低与抗原的结合。在一些实施方式中，抗原是sCD28。在一些实施方式中，突变是突变成组氨酸。在一些实施方式中，至少1、2、3、4或5个氨基酸突变成组氨酸。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被突变成组氨酸。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，CDR外部的氨基酸被突变成组氨酸。
已经显示在抗体的结合界面中并入组氨酸残基可用于改造pH依赖性结合。pH敏感性结合的基础来自组氨酸对质子化的敏感性，这是各种微环境(包括细胞内微环境，更具体而言是内体囊泡，更优选是早期内体)的pH值降低的结果。结合界面中组氨酸侧链的质子化可以改变静电相互作用或诱导构象变化，导致结合亲和力的pH依赖性差异。
将pH敏感性并入抗原结合位点可以增加抗原结合周期的数量，pH依赖性抗体在血浆pH(pH 7.4)下以与其抗原相似的高亲和力或降低的足够亲和力结合，并在低pH下显示降低的结合，导致酸性内体中抗体与其抗原结合位点更快且增加的解离，从而能够再循环回血浆并增加抗原从血浆中的清除。
His扫描是本领域已知的成熟技术，通过His扫描，CDR中的每个氨基酸都被组氨酸取代并pH依赖性结合被评估。可以将多于一个的组氨酸突变组合，以协同地或线性地增加突变的作用。使用噬菌体或酵母菌展示的组合型his扫描文库方法在本领域中也是公知的。
在一些实施方式中，抗体是清除抗体。在一些实施方式中，抗体是诊断抗体。在一些实施方式中，抗体是治疗抗体。在一些实施方式中，抗体是抗癌抗体。
在一些实施方式中，试剂是非抗体蛋白。在一些实施方式中，肽是非抗体肽。在一些实施方式中，非抗体蛋白是抗体模拟物。在一些实施方式中，肽是多肽。在一些实施方式中，试剂是小分子。在一些实施方式中，试剂是核酸分子。在一些实施方式中，试剂是合成肽。在一些实施方式中，试剂是合成结合蛋白。在一些实施方式中，合成肽基于非抗体支架。在一些实施方式中，试剂是抗体模拟物。在一些实施方式中，抗体模拟物的摩尔质量小于100、90、80、70、60、50、40、30或20kDa。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂是核酸适配体。在一些实施方式中，适配体是DNA。在一些实施方式中，适配体是RNA。在一些实施方式中，适配体是DNA或RNA。
在一些实施方式中，抗体用于治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症。在一些实施方式中，抗体用于改善对其需要的对象中的免疫疗法。在一些实施方式中，免疫疗法是基于PD1和/或PD-L1的免疫疗法。PD-1和PD-L1免疫疗法是本领域公知的，并且包括PD-1和PD-L1封锁(blockade)以及PD-1和PD-L1抑制剂。一些示例包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、纳武单抗(nivolumab)(Opdivo)、匹迪单抗(pidilizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿特珠单抗(atezolizumab)(Tecentriq)、阿维单抗(avelumab)(Bevancio)和度伐鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi)。
阻断mCD28的脱落
另一方面，提供了结合膜CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白酶剪切的试剂。
如本文所用，抑制蛋白酶剪切是指mCD28的蛋白酶剪切的任何降低。在一些实施方式中，抑制是剪切降低至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97、99或100％。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切维持免疫细胞上mCD28的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切增加了免疫细胞上mCD28的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白酶剪切维持足以用于免疫刺激的mCD28的水平。
在一些实施方式中，蛋白酶剪切的降低是至少一种蛋白酶的剪切的降低。在一些实施方式中，蛋白酶剪切的降低是至少一种金属蛋白酶的剪切的降低。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM 10、ADAM 17或两者。
在一些实施方式中，试剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或片段与另一蛋白质或蛋白质的片段融合。在一些实施方式中，第二蛋白质或片段增加半衰期，特别是血清中的半衰期。在一些实施方式中，延长半衰期的蛋白质是人血清白蛋白。在一些实施方式中，试剂由产生提高半衰期的修饰的化学品修饰。在一些实施方式中，修饰是PEG化，并且化学品是聚乙二醇。技术人员将理解，可以使用任何延长半衰期的蛋白质或化学试剂或本领域已知的修饰。
在一些实施方式中，试剂作为单体结合。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合。在一些实施方式中，试剂作为单体和/或二聚体结合。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合，但不交联和/或激活mCD28。在一些实施方式中，试剂作为二聚体结合，但是仅结合CD28的单个分子。在一些实施方式中，试剂结合单体CD28。在一些实施方式中，试剂结合二聚体CD28。在一些实施方式中，试剂结合单体和/或二聚体CD28。
在一些实施方式中，试剂不是CD28激动剂。在一些实施方式中，试剂不是CD28拮抗剂。在一些实施方式中，试剂既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂。
在一些实施方式中，试剂不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂不妨碍或阻止对配体结合结构域的进入。在一些实施方式中，试剂结合剪切位点。在一些实施方式中，该试剂妨碍或阻止对剪切位点的进入。在一些实施方式中，试剂阻止蛋白酶进入剪切位点。在一些实施方式中，试剂结合CD28的茎部区域。在一些实施方式中，试剂结合mCD28的膜近侧区域。在一些实施方式中，剪切位点在茎部区域内。在一些实施方式中，茎部区域包含序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，茎部区域包含序列KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:36)。在一些实施方式中，茎部区域包含以下序列或由以下序列组成：HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方式中，剪切位点在亮氨酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在缬氨酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在芳族氨基酸之前。在一些实施方式中，剪切位点在亮氨酸、缬氨酸和/或芳族氨基酸之前。在一些实施方式中，芳族氨基酸选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145和苯丙氨酸146中的任一个之前。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145或苯丙氨酸146之前。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，剪切位点在SEQ ID NO:1的亮氨酸145之前。
在一些实施方式中，试剂不调节CD28功能和/或信号传导。在一些实施方式中，试剂不降解mCD28。在一些实施方式中，试剂不导致或不促进mCD28降解。在一些实施方式中，信号传导是mCD28介导的免疫细胞激活。在一些实施方式中，试剂不抑制免疫细胞激活。在一些实施方式中，试剂不诱导CD28受体内在化或再循环。经由mCD28的共同刺激对于T细胞的免疫激活是必需的。蛋白酶剪切从保留在膜中的蛋白质的跨膜部分和胞质部分去除了CD28细胞外区域中的配体结合结构域。因此，剪切的CD28不能发出信号并且不能促使T细胞激活。因此，阻断剪切且也是拮抗剂的试剂不允许mCD28激活。类似地，阻断剪切但也是激动剂的试剂可能会诱导异常的T细胞激活，并可能诱导自身免疫响应。在一些实施方式中，试剂不是抗CD28抗体MAB342。在一些实施方式中，该试剂不是抗CD28抗体克隆#37407。
在一些实施方式中，试剂不降低免疫细胞上mCD28的表面水平。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，试剂将mCD28的表面水平降低小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、7％、5％、3％、2％或1％。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不杀死细胞。在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不导致细胞死亡。在一些实施方式中，试剂不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方式中，试剂不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，试剂不诱导ADCC和/或CDC。在一些实施方式中，试剂是抗体并且包含IgG2或IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包含IgG2结构域。在一些实施方式中，抗体包含IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包含经突变以减少由抗体结合介导的细胞死亡的IgG1或IgG3。在一些实施方式中，突变使Fc受体结合结构域突变。在一些实施方式中，抗体的Fc结构域被改造或突变以降低CDC、ADCC或两者。Fc改造是本领域公知的，并且可以使用已知降低抗体介导的细胞杀伤的任何突变或氨基酸改变。
在一些实施方式中，试剂是非抗体蛋白质。在一些实施方式中，试剂是小分子。在一些实施方式中，试剂是核酸分子。在一些实施方式中，试剂是合成肽。在一些实施方式中，试剂是合成结合蛋白。在一些实施方式中，合成肽基于非抗体支架。在一些实施方式中，试剂是抗体模拟物。在一些实施方式中，抗体模拟物的摩尔质量小于100、90、80、70、60、50、40、30或20kDa。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂是核酸适配体。在一些实施方式中，适配体是DNA。在一些实施方式中，适配体是RNA。在一些实施方式中，适配体是DNA或RNA。抗体模拟物的示例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体和纳米CLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。
在一些实施方式中，该试剂抑制至少一种蛋白酶的蛋白酶剪切。在一些实施方式中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是基质金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶或苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是谷氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶选自天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬酰胺肽裂解酶。在一些实施方式中，蛋白酶是脱落酶(sheddase)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶或内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是锌催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是钴催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM 10和/或ADAM 17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM 10、ADAM 17或两者。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:30(GFTFSSYYMS)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:31(TISDGGDNTYYAGTVTG)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含如SEQ ID NO:32(IHWPYYFDS)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:33(RASSSVSYMN)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:34(ATSDLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ IDNO:35(QQWSSHPPT)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCVASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGDNTYYAGTVTGRFTISRDFAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCARIHWPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:53)。在一些实施方式中，重链的可变区包含SEQ ID NO:53和/或由SEQ ID NO:53组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的重链：GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATAAGTGATGGTGGTGATAACACCTACTACGCAGGCACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGACCTCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATTCATTGGCCTTACTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:54)。在一些实施方式中，重链由SEQ ID NO:54组成。对本申请的抗剪切抗体进行测序，并发现其具有由SEQ ID NO:54组成的重链。使用Chothia方案确定的此重链的CDR是SEQ ID NO:30-32。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：QFVLSQSPAILSASPGEMLTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:55)。在一些实施方式中，轻链的可变区包含SEQ ID NO:55和/或由SEQ ID NO:55组成。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括含有以下氨基酸序列的轻链：CAATTTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCCGGGGAGATGCTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCGACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGA(SEQ ID NO:56)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:56组成。对如本申请中所指的抗剪切抗体进行测序，并发现其具有由SEQ IDNO:56组成的轻链。使用Chothia方案确定的此轻链的CDR是SEQ ID NO:33-35。
治疗/预防癌症的方法
另一方面，提供了治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括降低所述对象中的可溶性CD28(sCD28)水平。
另一方面，提供了改善对其需要的对象中的免疫疗法的方法，所述方法包括降低所述对象中的sCD28水平。
在一些实施方式中，免疫疗法是基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，基于PD-1/PD-L1的免疫疗法包括给予抗PD1或抗PD-L1抗体。在一些实施方式中，疗法包括PD-1检查点的封锁。在一些实施方式中，免疫疗法包括给予对象同种异体、同基因或自体免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，需要免疫疗法的对象患有癌症。
如本文所用，疾病、障碍或状况的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”涵盖减轻其至少一种症状、减少其严重性、或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病、障碍或状况完全治愈。为了成为有效的治疗，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、障碍或状况的严重性，降低与其相关的症状的严重性、或改善患者或对象的生活质量。
在一些实施方式中，降低包括给予对象至少一种本发明的试剂。如本文所用，术语“给予(administering)”、“给予(administration)”等是指在合理的医学实践中，以提供治疗作用的方式将包含活性剂的组合物递送至对象的任何方法。本主题的一方面提供了向对其需要的患者口服给予治疗有效量的本发明的试剂。其它适合的给予途径可包括肠胃外、皮下、静脉内、肌内或腹膜内。
另一方面，提供了药物组合物，其包含本发明的试剂和治疗上可接受的载体、佐剂或赋形剂。在一些实施方式中，给予是给予本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“载剂”、“赋形剂”或“佐剂”是指药物组合物中不是活性剂的任何组分。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指无毒的惰性的固体、半固体、液体填料、稀释剂、包封材料、任意类型的配制助剂，或仅仅是无菌水性介质，如盐水。可用作药学上可接受的载剂的材料的一些示例是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素，粉末状黄芪胶；麦芽、明胶、滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水、林格氏溶液；乙醇溶液和磷酸盐缓冲溶液，以及药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。在本文中可以用作载剂的物质的一些非限制性示例包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、粉末状黄芪胶、麦芽、明胶、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、多元醇类、海藻酸、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲溶液、可可脂(栓剂基质(base))、乳化剂，以及用于其它药物制剂中的其它无毒药学上相容性物质。也可以存在润湿剂和润滑剂，如月桂硫酸酯钠，以及着色剂、调味剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。任何无毒、惰性和有效的载剂均可用于配制本文考虑的组合物。在这方面，适合的药学上可接受的载剂、赋形剂和稀释剂是本领域技术人员公知的，诸如在The Merck Index,第十三版,Budavari等人,Eds.,Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.(2001)；the CTFA (Cosmetic,Toiletry,andFragrance Association)International Cosmetic Ingredient Dictionary andHandbook,第十版(2004)；和the“Inactive Ingredient Guide,”U.S.Food and DrugAdministration(FDA)Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Office ofManagement(其通过引用以其全部内容整体并入本文)中描述的那些。用于本组合物中的药学上可接受的赋形剂、载剂和稀释剂的示例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液和DMSO。这些另外的非活性组分以及有效的制剂和给予程序是本领域公知的，并在标准教科书中进行了描述，如Goodman and Gillman’s:The PharmacologicalBases of Therapeutics,第8版,Gilman等人Eds.Pergamon Press(1990)；Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)(其每一个均通过引用以其整体并入本文)。本文描述的组合物也可以包含在人工产生的结构中，如脂质体、ISCOMS、缓慢释放颗粒和其它增加血清中肽或多肽的半衰期的媒介物(vehicles)。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。与本文描述的肽一起使用的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，该脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常取决于诸如血液中脂质体大小和稳定性的考虑。例如，Coligan,J.E.等人,Current Protocols inProtein Science,1999,John Wiley&Sons,Inc.,New York综述了可用于制备脂质体的各种方法，以及还参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
载剂可总共占本文提出的药物组合物重量的约0.1％至约99.99999％。
在一些实施方式中，降低包括给予与编码sCD28的mRNA结合而不与编码mCD28的mRNA结合的抑制性核酸分子。sCD28的一种可能的来源来自缺少跨膜结构域的CD28转录变体的翻译。这样的变体可以具有可以被靶向以便降解或抑制mRNA翻译的独特的mRNA序列。对于非限制性示例，sCD28由缺少外显子3的mRNA剪接变体(SEQ ID NO:7)产生。在此变体中，外显子2和外显子4连接是存在于该变体中但缺少于全长CD28中的唯一序列。在一些实施方式中，核酸分子结合至SEQ ID NO:7的外显子2和外显子4的至少连接。在一些实施方式中，外显子2和4的剪接连接包含序列AAAGGTGA(SEQ ID NO:11)。在一些实施方式中，核酸分子结合SEQ ID NO:7的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个碱基，包括外显子2和4的剪接连接。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，核酸分子是siRNA。在一些实施方式中，所述分子是shRNA。在一些实施方式中，所述分子是siRNA或shRNA。
在一些实施方式中，降低包括给予抑制能够剪切mCD28的蛋白酶的试剂。在一些实施方式中，试剂抑制ADAM 10、ADAM 17或两者。蛋白酶抑制剂是本领域公知的。抑制ADAM17和ADAM10的蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于TAPI-1、GM6001和GI254023X。在国际专利申请WO2004096139中公开了其它治疗性蛋白酶抑制剂。
在一些实施方式中，降低包括给予包含CD28的茎部区域或其片段的肽。在一些实施方式中，肽是单体的。在一些实施方式中，肽是二聚体的。在一些实施方式中，CD28是人CD28。在一些实施方式中，肽抑制蛋白酶进入剪切位点。在一些实施方式中，肽诱导产生阻断剪切位点的自身抗体。
在一些实施方式中，本发明的方法不降解mCD28或不导致mCD28降解。在一些实施方式中，本发明的方法不降低免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法不降低mCD28介导的免疫细胞激活。在一些实施方式中，本发明的方法维持对象中免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法提高对象中免疫细胞上的mCD28水平。
在一些实施方式中，减少是sCD28减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99％。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是在血清sCD28中。在一些实施方式中，减少是在sCD28的血液水平上。在一些实施方式中，减少是在肿瘤微环境(TME)中sCD28的水平上。
在一些实施方式中，对象的血液包含升高水平的sCD28。在一些实施方式中，在降低之前，对象的血液包含升高水平的sCD28。在一些实施方式中，水平升高至健康对象的水平以上。在一些实施方式中，对象的sCD28水平升高至健康对象水平以上至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng/ml血液以上。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至5ng/ml以上。在一些实施方式中，水平升高至10ng/ml以上。在一些实施方式中，水平升高至20ng/ml以上。在一些实施方式中，对象的血液包含每毫升血液至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，在降低之前，对象的血液包含每毫升血液至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，对象的血液包含至少5ng/ml sCD28。在一些实施方式中，对象的血液包含至少10ng/ml sCD28。在一些实施方式中，对象的血液包含至少20ng/ml sCD28。在一些实施方式中，在降低之前，对象的血液包含至少5ng/ml sCD28。在一些实施方式中，在降低之前，对象的血液包含至少10ng/ml sCD28。在一些实施方式中，在降低之前，对象的血液包含至少20ng/ml sCD28。
在一些实施方式中，对象患有癌症。在一些实施方式中，癌症是可以用PD-1/PD-L1疗法治疗的癌症。在一些实施方式中，对象已经历PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，对象对PD-1/PD-L1疗法无反应。在一些实施方式中，对象未受过(
Figure BDA0002755381420000321
to)PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，本发明的方法与PD-1/PD-L1疗法一起进行。在一些实施方式中，本发明的方法在PD-1/PD-L1疗法之前进行。
在一些实施方式中，方法进一步包括给予对象另一种免疫疗法。在一些实施方式中，方法进一步包括给予基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，另一种免疫疗法是检查点抑制剂。在一些实施方式中，检查点抑制剂是PD-1和/或PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，另一种免疫疗法是基于嵌合抗原受体(CAR)的免疫疗法。在一些实施方式中，CAR是CAR-T。在一些实施方式中，CAR是CAR-NK。在一些实施方式中，另一种免疫疗法是癌症疫苗。
如本文所用，术语“CAR-T细胞”和“CAR-NK细胞”是指对至少一种目的蛋白质(例如，在用表观遗传修饰剂处理后表达增强的免疫原性蛋白质)具有特异性并且被移植到免疫效应细胞(T细胞或NK细胞)上的改造的受体。在一些实施方式中，CAR-T细胞具有移植到T细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，CAR-NK细胞具有移植到NK细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞和调节性T细胞。
CAR-T和CAR-NK细胞及其载体是本领域公知的。此类细胞靶向受体结合的蛋白质并对受体结合的蛋白质具有细胞毒性。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向至少一种病毒蛋白质。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向多种病毒蛋白质。在一些实施方式中，由于与表观遗传修饰剂接触，CAR-T或CAR-NK细胞靶向表达增强的病毒蛋白质。
CAR-T细胞的构建是本领域公知的。在一个非限制性示例中，可以制备针对病毒蛋白质的单克隆抗体，然后将构建编码抗体的载体。载体还将包含共刺激信号区域。在一些实施方式中，共刺激信号区域包含已知的T细胞或NK细胞刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域选自以下中的至少一个：CD3Z、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICQS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方式中，载体还包含CD3Z信号传导结构域。然后将此载体例如通过慢病毒感染而转染到T细胞中。
在一些实施方式中，癌症是具有升高的sCD28水平的癌症。在一些实施方式中，癌症包括高的sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高的sCD28水平是5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100ng/ml的水平和/或其以上的水平。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症包括高sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高的sCD28水平是健康对象中的水平的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000％或其以上的水平。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症不是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结直肠癌。在一些实施方式中，癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌。在一些实施方式中，癌症是黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，方法在体内进行。在一些实施方式中，方法在体外进行。在一些实施方式中，降低在体内进行。在一些实施方式中，降低在体外进行。在一些实施方式中，降低包括从对象中去除血液，从而降低去除的血液中的sCD28水平并将血液返回对象，从而降低对象中的sCD28。透析和血液清洁的方法是公知的。本发明可以通过体外清除sCD28然后将血液返回对象来实施。
使用方法
另一方面，提供了体外检测样品中sCD28的方法，所述方法包括：
a.提供包含sCD28的样品；
b.使样品与本发明的试剂接触；和
c.检测与sCD28结合的试剂；
从而检测样品中的sCD28。
在一些实施方式中，样品来自对象。在一些实施方式中，样品包含体液。在一些实施方式中，样品包含组织。在一些实施方式中，样品包含细胞。在一些实施方式中，通过第二抗体进行检测。在一些实施方式中，检测是结合试剂的是哪个标记分子。在一些实施方式中，通过ELISA进行检测。在一些实施方式中，通过免疫组织化学进行检测。在一些实施方式中，通过免疫印迹进行检测。在一些实施方式中，本发明的试剂用于检测sCD28。在一些实施方式中，本发明的试剂用于检测sCD28而不检测mCD28。
另一方面，提供了确定待通过本发明的治疗方法治疗的对象的适合性的方法，所述方法包括提供来自该对象的样品，并确定样品中的sCD28水平，其中升高的sCD28水平指示对象适于通过本发明的治疗方法治疗。
另一方面，提供了确定待通过抗PD-1和/或PD-L1免疫疗法和/或通过基于CD80和/或CD86的免疫疗法治疗的对象的适合性的方法，所述方法包括提供来自对象的样品，并确定样品中的sCD28水平，其中5ng/ml以上的sCD28水平表示对象不适合通过抗PD-1和/或PD-L1免疫疗法或基于CD80和/或CD86的免疫疗法进行治疗。
另一方面，提供了使不适合的对象适于接受抗PD-1和/或PD-L1免疫疗法和/或基于CD80和/或CD86的免疫疗法的方法，所述方法包括降低不适合的对象中的sCD28水平，从而使其适合。
另一方面，提供了改善对象中的基于CD80和/或CD86的免疫疗法的方法，所述方法包括：
a.测量对象中的sCD28水平；和
b.对5ng/ml以上的sCD28水平的对象增加基于CD80和/或CD86的免疫疗法的剂量；
从而改善基于CD80和/或CD86的免疫疗法。
在一些实施方式中，方法进一步包括通过执行本发明的方法使不适合的对象适合。
在一些实施方式中，升高的水平升高至健康对象中的水平附近。在一些实施方式中，升高的水平升高至预定阈值中的水平附近。在一些实施方式中，升高的水平是5、10、15、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml以上的sCD28水平。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml以上的sCD28水平指示对象不适合被治疗。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，10以上的sCD28水平指示对象不适合被治疗。在一些实施方式中，20以上的sCD28水平指示对象不适合被治疗。
CD80和CD86免疫疗法是本领域公知的，并且包括给予CD80/CD86和或其模仿物、衍生物或模拟物以刺激免疫响应。以非限制性示例为例，CD80-Fc作为抗癌免疫疗法目前处于临床试验中。
在一些实施方式中，检测结合至sCD28的试剂包括测定结合的sCD28的量。在一些实施方式中，检测结合的sCD28的量是测定体液中sCD28的量。在一些实施方式中，方法用于确定用本发明的药物组合物治疗的对象的适合性。在一些实施方式中，预定阈值以上的sCD28水平指示对象适合用本发明的组合物治疗。在一些实施方式中，方法用于确定对象对免疫疗法的适合性。在一些实施方式中，低于预定阈值的sCD28水平或sCD28的不存在指示对象适合免疫疗法。在一些实施方式中，预定阈值以上的sCD28水平指示对象适合免疫疗法与本发明的组合物结合。
在一些实施方式中，对象患有癌症。在一些实施方式中，对象处于发展癌症的风险中。
在一些实施方式中，方法进一步包括给予对象本发明的药物组合物。在一些实施方式中，方法进一步包括当检测到的sCD28在预定阈值以上时，给予对象本发明的药物组合物。在一些实施方式中，方法进一步包括给予对象免疫疗法。
试剂盒
另一方面，提供了试剂盒，其包含至少一种本发明的试剂或本发明的药物组合物。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂。在一些实施方式中，试剂盒包含声明本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法联用的标签。在一些实施方式中，试剂盒包含声明本发明的抗体或药物组合物与基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法联用的标签。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含用于检测本发明的试剂的检测分子。在一些实施方式中，检测分子是第二检测分子。在一些实施方式中，检测分子与试剂结合。检测分子在本领域中是公知的，并且包括但不限于荧光部分和分子、染料、和第二抗体。
另一方面，提供了包含基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的试剂盒，所述试剂盒包含声明基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法与本发明的抗体或药物组合物联用的标签。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于治疗癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于测定需对其需要的对象中sCD28的血清水平。在一些实施方式中，对象患有癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于确定待用本发明的试剂或药物组合物治疗的对象的适合性。在一些实施方式中，试剂盒用于确定将待用基于抗PD-1/PD-L1的免疫疗法治疗的对象的适合性。
试剂生成方法
另一方面，提供了用于产生本发明的试剂的方法，所述方法包括：
a.获得与CD28胞外结构域或其片段特异性结合的试剂；和
b.测试试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力，并选择至少一种阻断蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；
从而产生本发明的试剂。
另一方面，提供了用于产生本发明试剂的方法，所述方法包括：
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中核酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.测试试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力；和
iii.选择至少一种阻断蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；
从而产生本发明的试剂。
在一些实施方式中，试剂是抗剪切剂。在一些实施方式中，试剂是防脱落剂。在一些实施方式中，试剂降低对象中sCD28的脱落。在一些实施方式中，试剂降低mCD28的剪切。在一些实施方式中，试剂降低对象中mCD28的剪切。
在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM 10。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM10、ADAM17或两者。
如本文所用，术语“CD28的胞外结构域”是指在跨膜结构域之前的CD28的N-末端部分。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是sCD28。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28a。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28茎部结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包含CD28的茎部结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包含序列NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:37)。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是单体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体或单体的。
如本文所用，“片段”是指构成较大蛋白质或蛋白质结构域的部分的部分多肽。在一些实施方式中，片段包含至少10、20、30、40或50个氨基酸。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，片段包含至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。每种可能都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，获得结合CD28胞外结构域的片段的试剂是获得特异性结合CD28茎部结构域的试剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括在获得的试剂的存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂。在一些实施方式中，选择是选择不拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。本领域技术人员将理解，对于癌症治疗，使CD28信号传导激动可能不是有害的，但是使信号传导拮抗将适得其反。
在一些实施方式中，通过下文描述的方法测试试剂阻断剪切的能力。在一些实施方式中，测试试剂阻断剪切的能力包括将试剂、蛋白酶和CD28的胞外结构域或其包含剪切位点的片段混合。在一些实施方式中，测试进一步包括对CD28的胞外结构域或其片段进行测序以检查截短和/或剪切。在一些实施方式中，测试进一步包括在足够灵敏以测量由于剪切引起的大小变化的凝胶上使CD28的胞外结构域或其片段跑动(run)。在一些实施方式中，测试进一步包括在试剂和蛋白酶的存在下测量来自表达mCD28的细胞的sCD28的产生。
另一方面，提供了用于产生本发明试剂的方法，所述方法包括：
a.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；和
b.在获得的试剂的存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；
从而产生本发明的试剂。
另一方面，提供了用于产生本发明试剂的方法，所述方法包括：
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中核酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.在所述获得的试剂的存在下测定mCD28下游信号传导；和
iii.选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；
从而产生本发明的试剂。
在一些实施方式中，试剂是清除剂。在一些实施方式中，试剂用于从对象中去除sCD28。在一些实施方式中，试剂特异性结合CD28。在一些实施方式中，试剂特异性结合sCD28。
在一些实施方式中，方法进一步包括从宿主细胞中分离和/或提取试剂。在一些实施方式中，方法进一步包括从宿主细胞的培养基中分离和/或提取试剂。在一些实施方式中，方法进一步包括从宿主细胞或宿主细胞的培养基中纯化试剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括测试所获得的试剂与mCD28的结合并选择至少一种不结合mCD28的试剂。在一些实施方式中，方法进一步包括测试所获得的试剂与对象的sCD28的结合并选择至少一种结合对象的sCD28的试剂。在一些实施方式中，对象是癌症患者。在一些实施方式中，对象是自身免疫患者。
在一些实施方式中，获得试剂包括用CD28胞外结构域或其片段免疫有机体，并从免疫的有机体收集抗体。在一些实施方式中，有机体是小鼠。在一些实施方式中，有机体选自兔子、小鼠、大鼠、鲨鱼、骆驼科动物、鸡、山羊和噬菌体。在一些实施方式中，骆驼科动物选自骆驼和美洲驼。在一些实施方式中，收集包括抽血。在一些实施方式中，收集包括：
a.从免疫的有机体的脾脏中提取B细胞；
b.将提取的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤；和
c.从杂交瘤中收集抗体。
在一些实施方式中，获得试剂包括筛选与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂文库并选择如此结合的试剂。在一些实施方式中，文库是噬菌体展示文库。在一些实施方式中，文库是源自脾B细胞的免疫文库。在一些实施方式中，文库是IgG文库。在一些实施方式中，文库是Fab文库。在一些实施方式中，文库是VHH抗体的文库。在一些实施方式中，文库是单链、单结构域或纳米抗体的文库。在一些实施方式中，获得试剂包括对试剂进行测序。在一些实施方式中，获得试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，选择试剂包括对试剂进行测序。在一些实施方式中，选择试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，重组形式由试剂的序列产生。在一些实施方式中，方法进一步包括使试剂人源化。
在细胞内表达编码试剂的核酸分子是本领域技术人员公知的。它可以通过转染、病毒感染、或直接改变细胞基因组等多种方法进行。在一些实施方式中，基因在表达载体(如质粒载体或病毒载体)中。含有p16-Ink4a的表达载体的一个这样的示例是可从Addgene获得的哺乳动物表达载体pCMV p16 INK4A。
载体核酸序列通常至少包含用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的其它元件，如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、可选择的标记物(例如，抗生素抗性)、聚腺嘌呤序列。
载体可以是经由非病毒方法或通过病毒方法递送的DNA质粒。病毒载体可以是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。启动子在哺乳动物细胞中可具有活性。启动子可以是病毒启动子。
在一些实施方式中，编码试剂的核酸序列与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”是指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式与一个或多个调节元件连接。
在一些实施方式中，载体通过标准方法被引入细胞中，包括电穿孔(例如，如From等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985)中描述的)、热激、病毒载体的感染、通过在小珠或小颗粒阵列(matrix)内或表面上具有核酸的小颗粒的高速弹道穿透(Klein等人,Nature 327.70-73(1987))和/或类似方法。
本文所用的术语“启动子”是指一组转录控制模块，它们聚集在RNA聚合酶(即，RNA聚合酶II)的起始位点周围。启动子由离散的功能模块组成，每个功能模块由大约7-20bp的DNA组成，并包含一个或多个转录激活因子或阻遏蛋白的识别位点。
在一些实施方式中，核酸序列由RNA聚合酶II(RNAP II和Pol II)转录。RNAP II是在真核细胞中发现的一种酶。它催化DNA的转录以合成mRNA的前体以及大多数snRNA和微小RNA。
在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于：可购自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81；可购自Promega的pCI；可购自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可购自Clontech的pTRES，及它们的衍生物。
在一些实施方式中，本发明使用了含有来自真核病毒(如逆转录病毒)的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，和衍生自埃巴病毒的载体包括pHEBO，以及p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或其它的在真核细胞中显示有效表达的启动子的指导下允许蛋白质表达的载体。
在一些实施方式中，提供诸如横向感染(lateral infection)和靶向特异性的优点的重组病毒载体用于体内表达。在一个实施方式中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是单个感染细胞产生许多子代病毒体的过程，该子代病毒体萌发(budoff)并感染相邻的细胞。在一个实施方式中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初并未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方式中，产生了不能横向扩散的病毒载体。在一个实施方式中，如果期望的目的是仅将特定基因引入局部数量的靶细胞中，则此特性会是有用的。
可以使用各种方法将本发明的表达载体引入细胞中。这样的方法在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,NewYork(1989,1992)中，在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley和Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,Somatic Gene Therapy,CRC Press,AnnArbor,Mich.(1995),Vega等人,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4(6):504-512,1986]中进行了大致的描述，并且包括例如稳定转染或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，参见美国专利号5,464,764和5,487,992的阳性和阴性选择法。
应当理解，除了包含用于插入的编码序列的转录和翻译(编码多肽)的必需元件外部，本发明的表达构建物还可以包括经改造以优化所表达多肽的稳定性、产生、纯化、产量或活性的序列。
另一方面，提供了通过本发明的方法产生的试剂。
另一方面，提供了药物组合物，其包含通过本发明的方法产生的试剂和药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。
如本文所用，术语“约”当与值组合时是指参考值的正负10％。例如，约1000纳米(nm)的长度是指1000nm+-100nm的长度。
注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“多核苷酸”的提及包括多个这样的多核苷酸，而对“多肽”的提及包括本领域技术人员已知的一个或多个多肽及其等同物，等等。还应注意，权利要求可撰写为排除任意任选的要素。由此，此声明旨在充当诸如“仅仅”、“只有”等排他性术语与权利要求要素的限定结合使用，或“负”限制的使用的先行基础。
在那些使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的协定(convention)的情况下，这样的结构(construction)通常意图是在本领域技术人员会理解该协定的意义上(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B一起、具有A和C一起、具有B和C一起、和/或具有A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个可选术语的任何反意连接词和/或短语都应理解为考虑了包括术语中的一个、术语中的任一个、或这两个术语的可能。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能。
应当理解，为清楚起见，在单独的实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任意适合的子组合来提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都被本发明具体地涵盖并在本文中公开，就像每一个组合都被单独地并且明确地公开一样。另外，各种实施方式及其要素的所有子组合也被本发明具体地涵盖并在本文中被公开，就像每一个这样的子组合在本文中被单独地并且明确地公开一样。
在考查以下实施例后，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，而这些实施例并非旨在进行限制。另外，如上文所述和如以下权利要求部分中所要求保护的，本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中均得到实验支持。
如上文所述和如以下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中均得到实验支持。
实施例
总体上，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。文献中对这样的技术进行了详尽的解释。参见，例如，“MolecularCloning:A laboratory Manual”Sambrook等人,(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”第I-III卷Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人(eds)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,第1-4卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法学；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷Cellis,J.E.,ed.(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique”by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；“Current Protocols inImmunology”第I-III卷Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等人(eds),“Basic andClinical Immunology”(第八版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds),“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入。贯穿本文件提供了其它一般性参考。
材料和方法
抗体—商业小鼠单克隆抗CD28克隆#CD28.2(Biolegend,分类号302902)和FITC缀合(Biolegend,分类号302906)。山羊多克隆抗CD28(R&D系统,分类号AF-342-PB)。FITC缀合的抗人PD-L1(BD bioscience,分类号558065)。APC缀合的抗人PD-L2(Biolegend,分类号345508)。PE缀合的抗人IDO(R&D system,分类号IC6030P)。山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor647(Biolegend,分类号405322)。驴抗人IgG(H+L)Alexa Fluor 647(Jackson immuneresearch,分类号709-605-149)。山羊抗小鼠IgG HRP(Jackson immune research,分类号115-035-071)。抗人CD3克隆OKT3(Biolegend,分类号317304)。抗人PD-1派姆单抗(MK-3475)。人IgG(Sigma,cat#I4506)。
重组可溶性人CD28a的产生—CD28a cDNA被亚克隆到pCDNA3·1载体中，其中c-末端TEV蛋白酶剪切位点在6个组氨酸残基之前，以促进亲和纯化。该质粒用于转染HEK293细胞，并且可溶性重组CD28a经由固定化金属亲和层析(IMAC)纯化。在第二次IMAC之后，使用TEV蛋白酶对合并的(Pooled)材料进行His-tag剪切，以去除His-tag和TEV蛋白酶。
ELISA—商业ELISA试剂盒用于定量人干扰素-γ(Biolegend,分类号430103)、人白细胞介素2(Biolegend,分类号431802)、人白细胞介素6(Biolegend,分类号430502)、人白细胞介素10(Biolegend,分类号430603)、人肿瘤生长因子β1(Biolegend,分类号436708)、人白细胞介素β1(Biolegend,分类号437004)和人CD28(R&D system,分类号DY342)的量。根据生产商的说明(Roche,分类#11465007001)进行细胞增殖和存活(MTT试验)。根据生产商的说明(ImmuSmo分类#BA E-2200)进行犬尿氨酸(IDO活性)ELISA试剂盒。
细胞因子多重分析(multiplex)—使用ProcartaPLex(Invitrogen,分类号PPX-07-MXXGPY2)，在Magpix system(Millipore)上进行若干细胞因子的同时评估。
流式细胞术—通常，在所有步骤中都将细胞保持在冰上。染色前，在FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中用50μg/mL人IgG(Sigma,分类号I4506)封闭5×l05个细胞15分钟。以生产商推荐的浓度使用抗体并将其在黑暗中温育30分钟。在96孔U底板中以100μL的体积进行温育。用200μL FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后以150μL FACS缓冲液将其转移到FACS管中进行分析。使用用于Gallios流式细胞术采集软件的Kaluza，在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析细胞。
细胞系和人免疫细胞的分离—从ATCC获得Jurkat白血病T细胞淋巴母细胞细胞系克隆E6.1和SCC-25舌鳞状细胞癌。使用标准淋巴细胞分离培养基(MBP,分类号850494)从健康供体的新鲜血液样品中分离PBMC。通过阴性选择法，使用RossetteSEPTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL,分类号15061)从健康供体的新鲜血液样品中分离CD3细胞。通过阴性选择法，使用EasySepTM人CD4 T细胞富集试剂盒(STEMCELL,分类号19059)从健康供体的新鲜血液样品中分离CD4细胞。通过阴性选择法，使用EasySepTM人单核细胞富集试剂盒(STEMCELL,分类号17952)从健康供体的新鲜血液样品中分离单核细胞。所有细胞均在补充有10％HI-FCS和青霉素/链霉素混合物的完全RPMI-1640培养基中生长。
树突细胞分化—在具有生长因子的RPMI培养基中以1×106/mL的密度培养单核细胞，在第3天和第6天对培养基补给(refreshed)。用50ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4诱导未成熟的树突细胞(iDC)6天。当需要时，通过添加100ng/mL LPS，将iDC进一步分化为成熟的树突细胞48小时。通过相关标记物的FACS分析和特征细胞因子的分泌分析，测试所产生的细胞群的指示表型。
蛋白酶抑制剂—在每项实验开始时，以指示的浓度添加蛋白酶抑制剂。在为期一周的试验中，在3天后以终浓度添加另一部分抑制剂。使用的蛋白酶抑制剂是TAPI-1(Cayman,分类号18505)、GM6001(Santa Cruz,分类号SC-203979)、TMI-1(Sigma,分类号PZ0336)和GI254023X(Sigma,分类号SML0789)。在提及时，蛋白酶混合物由等摩尔比的TAPI-1和GM6001的混合物组成。
PHA激活CD4 T细胞或Jurkat T细胞系以生成可溶性CD28—将1×105个Jurkat细胞或CD4 T细胞与指示浓度的植物血凝素(Sigma,分类号L8902)和各种蛋白酶抑制剂温育另外5天(Jurkat)或7天(CD4 T细胞)。
SEB或CMV激活PBMC以生成可溶性CD28—在48孔板中，于37℃下，在含有/不含有指示浓度的各种蛋白酶抑制剂的情况下用0.5ng/mL SEB(Sigma,分类号S4881)刺激0.3×106个PBMC 5-7天。可选地，在96孔板形式的试验中，用0.5ng/mL SEB刺激0.1×106个PBMC。对于CMV刺激，在96孔板中，于37℃下，在含有/不含指示浓度的各种蛋白酶抑制剂的情况下用0.5μg/mL CMV peptivator(Milteny Biotec,分类号130-093-435)刺激0.5×106个PBMC2-5天。为了进行连续的脱落实验，在24孔板中，用SEB或CMV刺激PBMC 24小时，取出细胞并用不含刺激物的RPMI洗涤3次，再次在96孔板中铺板(plated)。在指示的时间取样并置于冷冻条件下，直到检查可溶性CD28。
混合淋巴细胞反应—将1×105个未成熟的DC与5×105个分离的自发的CD3 T细胞混合6天。
用异位重组人CD28、人CTLA-4和人CD80进行SEB或CMV刺激试验—对于CMV刺激，在96孔板中，于在37℃下，在含有/不含指示浓度的重组人CD28(R&D systems,分类号342-CD)、人CTLA-4(R&D systems,分类号434-CT)、人CD80(R&D systems,分类号140-B1)的情况下用0.5μg/mL CMV peptivator(Milteny Biotec,分类号130-093-435)刺激0.5×106个PBMC(来自健康供体或癌症患者供体)2-5天。对于SEB的情况，在指示浓度的重组人CD28的存在下，用0.5ng/mL葡萄球菌肠毒素B(SEB)(Sigma,分类号S4881)培养1×105个PBMC 72小时。在有规定时，以5μg/mL的终浓度添加抗PD 1或人IgG。
自体单核细胞CD3 MLR—将0.5×106个T细胞与来自相同CMV反应性供体的0.5×105个单核细胞混合，并在含有/不含指示浓度的处理的情况下，于37℃下，用0.5μg/mL CMVpeptivator刺激6天。
用重组人CD28刺激单核细胞—在指示浓度的重组人CD28的存在下，将1.5×106个单核细胞铺板在24孔板中的含有100-100U/ml IFNγ(R&D system,分类号285-IF)的RPMI培养基中48小时。通过相关标记物(IDO、PD-L1和PD-L2)的FACS分析和特征细胞因子(IL-6)的分泌分析，测试所产生的细胞群的指示表型。
用OKT3刺激T细胞—在37℃下，用指示量的抗CD3克隆OKT3刺激0.1×106个分离的CD3 T细胞(来自健康供体)48-72小时。当声明时，以可溶形式添加重组人CD80-Fc(2μg/mL,R&D system)。在指示的浓度下，以可溶形式添加针对CD28的抗体或对照。
CD86阻断FACS—在室温下，在不含或含有抗CD28抗体(20μg/mL)的情况下，将稳定转染有人CD28的0.5×106个HEK293细胞与5μg/mL CD86-Fc(R&D systems,分类号141-B2)一起温育30分钟。将细胞洗涤，并取出细胞，使用以1:5000稀释度与荧光团缀合的抗人重链和轻链抗体在冰上进行20分钟的第二结合。
SCC-25癌细胞系在基于孔迁移(trans-well)的测试中与单核细胞的共培养—在不含血清的饥饿培养基中，在含有或不含指示处理的情况下，将4×104个SCC-25细胞在24孔板的底部铺板，其中1×105个单核细胞置于细胞培养插件(culture insert)(Millipore,分类号MCHT241148)，持续4天。
CD28mRNA变体的鉴定、克隆和测序—在37℃下，用0.5ng/mL SEB(Sigma,分类号S4881)刺激人PBMC 7天。在37℃下，将人CD4 T细胞与植物血凝素(2μg/mL,Sigma,分类号L8902)一起温育7天。使用Qiacube自动化系统(Qiagen)，用RNeasy mini试剂盒(Qiagen,分类号74106)从激活的和幼稚的免疫细胞的细胞团块(pellets)中提取总RNA。取500ng RNA，利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,分类号4374966)进行RT反应。RT反应的阴性对照是不含RNA的管和不含逆转录酶的另一个管。取1μL cDNA，使用以下正向引物(CD28F)5’-ATGCTGAGGCTGCTCTTGGCTCTCAAC-3’(SEQ ID NO:38)和反向引物(CD28R)5’-TCAGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCG-3’(SEQ ID NO:39)进行PCR。将PCR产物装载在1％琼脂糖凝胶上。从凝胶上切下PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取。在使用CD28F引物指示的情况下进行Sanger测序。
在癌症患者的血浆中检测可溶性人CD28—从DxBiosamples(San Diego,CA,USA)购买了10种不同癌症适应症供体和健康供体中的每一个中的20个冷冻血浆样品。血浆样品按1:20稀释，并通过ELISA分析可溶性人CD28。以适当的稀释度再次分析高sCD28的样品。
直接CD28 EIA—除非另有讨论，否则使用康宁高结合平板(Corning highbinding plate)或等同物进行筛选。每个孔都涂覆有200-300ng人CD28-Ig嵌合体(R&D,分类号342-CD)、小鼠CD28-Ig嵌合体(R&D,分类号483-CD)或BSA缀合的由CD28茎部区域氨基酸序列(Gly137-Pro152)组成的二聚体肽。在室温(RT)下，用PBS中的5％牛奶或1％酪蛋白封闭平板1小时。用PBST洗涤板3次，并在用1:5000稀释的特异性山羊抗小鼠HRP Fc检测后与所研究的抗体一起温育。阳性对照是小鼠抗人CD28克隆28.2或来自所免疫的小鼠的小鼠血清。杂交瘤上清培养物被筛选而未稀释。
模拟清除癌症患者血浆中的可溶性CD28。如生产商方案描述的，将抗体或重组蛋白涂覆在甲苯磺酰基活化的磁珠上(Invitrogen,分类号DY-14203)。珠子被取出以展示指示量的抗体并与癌症患者的血浆样品混合。在热混合器中，于37℃下，在1000RPM下将混合物温育2小时，然后使用DynaMag磁体(Invitrogen,分类号12321D)去除珠子，并使用CD28特异性ELISA检查样品。
抗体测序。将抗体提供给Rapid Novor公司用于氨基酸测序。使用标准方法进行测序，该方法简要地包括：在用六种酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、LysC和Asp N)酶消化后进行LC-MS分析。用二硫化物还原和烷基化进行消化。使用Thermo-Fisher Q-exactive质谱仪进行LC-MS/MS分析。在每种抗体的重链和轻链两者中，通过至少5次肽扫描覆盖100％的氨基酸残基，带有明显的支持碎片离子。使用Chothia方案确定CDR。
实施例1：人CD28在慢性刺激期间经历蛋白水解脱落
在慢性刺激的人PBMC的培养物中通过ELISA检测可溶性CD28(sCD28)(图1)。不管刺激物、人工的(SEB)还是生理的(CMV)性质如何，该现象都是明显的，表明该现象的稳定性。可溶性CD28的起源是来自膜形式的脱落，因为TAPI-1和GM6001(宽泛的MMP和ADAM17抑制剂)的处理以剂量依赖性方式降低sCD28的量(图1)。脱落的CD28的细胞来源是T细胞，如图2所示。用PHA慢性刺激来自健康供体的外周血的Jurkat T细胞系或人CD4 T细胞，导致以剂量依赖性方式产生sCD28(图2，上图)。用TAPI-1和GM6001进行处理，降低每种PHA浓度下的sCD28的量(图2，上图)，而在固定PHA浓度下呈剂量依赖性方式(图2，下图)。
用高度特异性的ADAM-10抑制剂GI254023X进行治疗，导致几乎完全抑制sCD28从激活的免疫细胞中的释放，并呈剂量依赖性方式(图3A，下图)。用ADAM-17特异性抑制剂TMI-1观察到了相似的结果(图3B，下图)。通过MTT试验监测免疫细胞的存活，检查培养物中细胞的代谢活性。结果显示，在使用和不使用任一种ADAM抑制剂的治疗之间均无显著差异，这表明低sCD28水平是由蛋白酶活性的阻断引起的，而不是由蛋白酶抑制剂引起的细胞死亡的假象(图3A-B，上图)。
sCD28的生成也在更多的生理学系统中得到了验证。首先，使用模仿抗原呈递细胞对T细胞的生理刺激的分离的自体树突细胞和CD4 T细胞。当混合两个细胞群时，sCD28的升高明显，而当将CMV加入培养物中时，sCD28的升高甚至变得更加显著(图4A)。这显示，当慢性刺激发生时，人CD28蛋白经历蛋白水解脱落过程。
接下来，用CMV肽(图4B)或SEB(图4C)刺激人PBMC 24小时。之后，洗涤细胞以去除刺激物，并在各个时间段再次铺板而不含任何刺激信号。在这之后检查培养基中sCD28的存在。随着时间的推移，sCD28的积累清晰可见。此外，如图4D所示，积累取决于ADAM-10和ADAM-17的活性。在SEB刺激后，添加不同浓度的特异性抑制剂导致120小时后所定量的sCD28的量降低。这项研究可以解释患者血液中大量可溶性CD28的存在，因为CD28脱落是在T细胞的初级激活后发生的，并且不一定需要恒定或反复的刺激。
sCD28的来源是来自蛋白水解脱落的最终证据是通过观察到CD28的已知的可选剪接变体在激活的淋巴细胞中显著下调获得的(图5)。在未刺激的样品中可检测到四种CD28mRNA产物，而在激活的细胞中仅可发现两种。通过Sanger测序确认最上面的条带对应于在翻译时与膜结合的全长成熟的CD28，而第二条带(黑色箭头，～500bp)先前已显示为可选择地剪接的产物，该产物导致分泌截短的蛋白质。使用Sanger测序确认来自幼稚序列的此条带是缺少外显子3，并因此缺少跨膜结构域的剪接变体。SEB或PHA刺激PBMC和T细胞导致全长CD28 mRNA优先表达，伴有剪接转录本的抑制(图5，泳道5和7)。这些结果加在一起，证明了激活的T细胞中sCD28的来源是蛋白水解脱落，而不是基因水平的可选择性剪接。
实施例2：可溶性人CD28具有免疫抑制活性
从图1中可以看出，使用蛋白酶抑制剂混合物降低sCD28的水平与T细胞激活的升高直接相关，这由分泌的IFNγ的水平所表明，表明sCD28具有免疫抑制功能。蛋白酶抑制剂混合物浓度的增加导致细胞培养基中sCD28的水平降低，而这些较低水平的sCD28与更高水平的分泌IFNγ呈负相关。为了进一步探索sCD28的免疫抑制作用，将缺少跨膜结构域和胞质结构域的重组人CD28加入用CMV刺激的人PBMC培养物中。这导致剂量依赖性抑制IFNγ分泌(图6)。在不同的人PBMC供体中观察到了这种免疫抑制作用，证实了被sCD28阻断的该信号转导轴的稳定性。
平行地，白细胞介素-6分泌(图7和8A)和白细胞介素-10(图8A)的升高是明显的。这些细胞因子据报道展示出对免疫效应子活性的抑制(IL-10)和免疫系统向2型免疫响应的倾斜，2型免疫响应可以通过STAT-3信号传导支持癌症增殖和血管生成(IL-6)。此外，与可溶性CTLA-4(模仿Abatacept—一种针对自身免疫性障碍的注册疗法)进行比较，并且揭示了，就细胞因子分泌曲线(profiles)而言，对免疫系统的总体影响是相似的(图8A)。
接下来，在重组人CD28不存在或存在的情况下，用SEB(1ng/mL)刺激人PBMC。人IgG用作对照。使用
Figure BDA0002755381420000451
S3 Live-Cell监测免疫激活的标志——淋巴细胞聚集，每12小时拍摄一次照片。如图8C中可见，当存在重组人sCD28时，SEB对淋巴细胞基本没有作用。公认的是，在体外免疫响应过程中，抗原呈递细胞(APC)相互聚集并与其它细胞类型聚集，并且聚集对于休眠的淋巴细胞的抗原特异性激活是必不可少的。可溶性CD28似乎降低了SEB免疫响应过程中簇形成的数量和大小，这意味着它抑制了APC对T细胞特异性激活的第一步。
当在混合淋巴细胞反应(MLR)中共培养分离的自体单核细胞和CD3 T细胞时，观察到相似的结果。在存在增加浓度的重组人sCD28和不存在增加浓度的重组人sCD28的情况下，用CMV肽(0.5μg/mL)刺激混合细胞5天。再次发现sCD28抑制IFNγ分泌，而同时增加IL-1B，、TGFβ和IL-10的分泌(图8B)。
sCD28对单核细胞具有类似的免疫抑制作用。吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通过其分解代谢必需氨基酸——色氨酸的能力参与免疫调节。它由不同的免疫细胞以及还有多种癌细胞表达。色氨酸短缺抑制T淋巴细胞的成熟和增殖，而色氨酸分解代谢的最终产物犬尿氨酸也被称为免疫抑制代谢物，免疫抑制代谢物在各种生理和病理生理条件下促进免疫耐受。为了测试sCD28对IDO的作用，在存在对照人IgG或重组人CD28(10μg/mL)的情况下，用IFNγ(1000U/mL)刺激分离的人单核细胞48小时。温育后，在细胞内对单核细胞进行人IDO染色(图8E)。为了促进细胞内染色，将细胞固定并用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液试剂盒渗透。使用ImmuSmol特异性犬尿氨酸ELISA试剂盒评估不同处理的培养基的IDO活性(图8D)。sCD28强烈增强了IDO在单核细胞中的表达。
此外，令人惊讶地发现sCD28是抗PD1免疫疗法的强力抑制剂。MK-3475(派姆单抗或Keytruda，Merck)是一种获批的药物，在多种癌症适应症中均具有前所未有的功效。将其添加到PMBC培养物中会增加促炎性细胞因子的分泌(IFNγ和IL-2)，但是sCD28的存在完全消除了这种免疫激活作用(图9A)。
在MLR背景下再次观察到类似的结果。仅在存在和不存在sCD28以及存在和不存在抗PD1抗体(MK3475，5μg/mL)的情况下，MLR才像以前一样运行(图9B)。如所预期的，MK-3475增加了IFNγ的分泌并降低了TGFβ的分泌。值得注意的是，在sCD28的存在下，MK-3475的作用显著降低。
为了阐明sCD28抑制抗PD-1疗法的促激活作用的机理，检查了在sCD28的存在下PD-1配体在免疫细胞上的表达。在存在对照人IgG(10μg/mL)或重组人CD28(10μg/mL)的情况下，用IFNγ(1000U/mL)刺激分离的人单核细胞48小时。温育后，对单核细胞进行PD-L1染色(图9C，左)和PD-L2(图9C，右)。两种配体在与sCD28一起培养的单核细胞上均上调，表明sCD28可能规避抗PD-1免疫疗法的作用的一种可能的方式。
实施例3：在癌症患者血浆中发现可溶性人CD28
仅在少数乳腺癌患者中显示了癌症中的sCD28水平，并且发现该水平仅略微在健康个体中所观察到的水平以上(Isitmangil,G.,In vivo,2016)。尽管作者认为sCD28可能被用作乳腺癌的标记物，但未提出功能上的联系。现在知道了可溶性CD28实际上可以增强免疫系统的癌症逃避，因此对220个样品进行了调查，这些样品涵盖10种不同的癌症适应症和来自健康供体的20个样品。调查发现几种癌症中的sCD28水平较高，有时比健康对照甚至乳腺癌患者中见到的水平高几个数量级(图10A)。实际上，与某些黑素瘤、结直肠癌、卵巢癌、NSCLC和头颈癌患者中发现的sCD28水平相比来看，乳腺癌患者中的水平似乎与健康个体相当。使用本发明的抗体#1和#3进行了此项调查。令人惊讶的是，以前在发明人已知的任何研究中均未报道过这样高的水平。因此，使用本发明的抗体(用于捕获的抗体#3和用于检测的抗体#1)以及还有购自R&D Systems的可商购的CD28试剂盒(分类#DY342)，通过夹心ELISA测试了20个黑素瘤患者样品。尽管本发明的抗体在三个样品中检测到非常高水平的sCD28，而在另外14个样品中检测到较低的水平，但可商购的试剂盒在任何一个样品中均未检测到sCD28(图10B)。用可商购的CD28 ELISA试剂盒BMS290(可购自Thermo FischerScientific)发现了相似的结果，该试剂盒已用于Isitmangil等人关于乳腺癌的研究中。可商购的试剂盒无法检测从人细胞中脱落的sCD28，这就可以解释为何迄今为止癌症患者中高sCD28是不为人知的现象。
为了进一步阐明sCD28在癌症中的作用，从患有不同适应症的癌症患者中分离了PBMC。用SEB(5ng/mL)单独地、与MK-3475一起、与重组人sCD28一起、或与两种分子进行组合来刺激细胞3天。在sCD28的存在下，即使存在MK-3475，来自所有供体的细胞上清液中的人IFNγ的浓度也大大降低(图10C)。实际上，sCD28使得MK-3475的作用不存在。
接下来，在孔迁移试验中将头颈癌细胞系SCC-25的细胞单独地或与单核细胞一起温育。单独生长的SCC-25细胞被给予IL-6作为阳性对照，并且由MTT测量的(图10D，上)和以％汇合(confluency)测量的(图10D，下)细胞增殖确实增加了。在单核细胞的存在下使癌细胞生长也会增加增殖，但到目前为止，当共培养物包含sCD28时，观察到最大的增加。此数据进一步支持sCD28具有促癌作用。
实施例4：sCD28抑制CD80-Fc功效
CD80是mCD28的两个主要配体之一，还有CD86。与Fc部分融合的CD80的胞外结构域被用作免疫刺激分子，并且作为癌症疗法正处于研究当中。为了检查sCD28对CD80-Fc功效的作用，在2μg/mL可溶性重组人CD80-Fc的存在下，用平板结合的抗CD3抗体(OKT3，2μg/mL)刺激分离的CD3人T细胞。如所预期的，CD80-Fc增加了IFNγ的分泌。然而，sCD28的添加抵消了CD80-Fc的二次激活作用(图11A)。类似地，当用CMV肽刺激分离的PBMC 3天，然后与sCD28一起温育时，需要提高CD80-Fc的量以产生预期的免疫响应(图11B)。
实施例5：sCD28对体内癌症的作用
由于小鼠不剪切mCD28，因此在小鼠模型中无法轻易地检查sCD28的作用。最接近的选择是向小鼠给予重组sCD28，以模拟sCD28水平升高的情况。在H22同系小鼠模型中对此进行了研究。Balb/c完全免疫活性的小鼠接受了H22肝细胞癌的同种异体移植。这些细胞甚至在完全免疫活性的小鼠中也生长，并且抗PD-1疗法的加入几乎完全消除了肿瘤的生长(图12A)。当添加重组人sCD28时，小鼠中的两只中的抗PD-1疗法的作用几乎完全消除了(图12B)。这表明在某些对象中，提高的sCD28水平对癌症的进展可产生高度有害的作用。
实施例6：消除sCD28的免疫抑制作用的基于抗体的试剂的表征(抗剪切)
人CD28经历ADAM10和ADAM 17的蛋白水解过程的发现促使对其多肽序列的候选区域进行检查，该候选区域显示出潜在的蛋白水解脱落的敏感性。研究表明ADAM 10和ADAM17在P1'位点更偏好亮氨酸、缬氨酸和芳族的残基。人CD28中最有吸引力的序列区域是茎部区段，范围从组氨酸134到脯氨酸152(SEQ ID 10:HVKGKHLCPSPLFPGPSKP)，将球状IgV结构域与跨膜区域连接。此区域保持3个总的亮氨酸和缬氨酸残基，以及苯丙氨酸残基，并且据预测该区域不含可能阻碍蛋白酶进入的任何二级结构元件。值得注意的是，茎部区域还包含半胱氨酸141，半胱氨酸141形成促进CD28的均二聚的二硫键。为了产生特异性结合CD28茎部区域并且潜在地阻断不同的蛋白酶进入脱落的CD28的抗体或抗体片段，同时避免对CD28寡聚体结构和功能造成任何损伤，用模拟CD28茎部区域的二聚体肽免疫CD1小鼠。用于免疫的肽序列是SEQ ID:40，GKHLCPSPLFPGPSKPK，添加C-末端赖氨酸是为了具有游离氨基以允许利用酰肼化学作用进行KLH或BSA缀合。在酰肼封端的CD28肽和S-4FB修饰的BSA之间进行缀合，后者产生游离醛以进行位点特异性缀合。通过使肽在非变性凝胶上跑动来确认二聚化。
用BSA缀合的肽免疫六只小鼠。常规地通过ELISA检查小鼠尾巴出血血清与靶抗原、重组人CD28(rhCD28)和与KLH缀合的混合肽的结合。
高通量筛选平台用于初始克隆筛选ELISA中与抗原靶标的结合。使用培养上清液作为一抗，并用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(γ)和TMB进行展开，在针对rhCD28的初始EIA中生成并筛选约2000个杂交瘤。获得20个克隆，所有克隆均为IgG2a抗体，并进一步扩大用于纯化和分型。ELISA试验证实了所有20个IgG对重组可溶性CD28具有各种水平的显著结合(表1)。
表1：抗剪切抗体
Figure BDA0002755381420000471
Figure BDA0002755381420000481
对三个结合最高的克隆进行了测序，并发现它们是同一抗体(以下称为克隆M9)，因此继续对此抗体进行实验。M9抗体的序列可以在上文中找到。使用抗体M9的系列稀释来确认其与重组人sCD28和与茎部区域肽的特异性结合(图13A)。有趣的是，尽管该抗体能够检测重组人sCD28，但它却无法检测实际上从免疫细胞中脱落的sCD28(图13B)。这有力地表明了抗体在剪切位点结合，并且其所结合的去同位素(deisotope)在剪切形式下是不完全的。在抗体M9存在和不存在的情况下，通过将rhCD28与ADAM 10或ADAM17混合来检查对剪切的直接抑制。通过质谱对所得的rhCD28肽进行测序，以确定剪切是否发生。
这些结果表明，结合茎部区域可能对mCD28信号传导没有直接影响。然而，据报道，单克隆抗体MAB342——R&D Systems的克隆37407在CD28的茎部区域中结合(参见国际专利申请WO2004096139)。此外，R&D Systems报道了此抗体是CD28激动剂(rndsystems.com/products/human-cd28-mab-clone-37407-37407_mab342)。因此研究了此抗体的结合。发现MAB342结合重组人CD28-Fc以及重组人CD28a(缺少茎部区域序列的可溶性剪接变体)，但不结合重组小鼠CD28(图13C)。然而，在对与人CD28茎部肽的结合进行试验时，未观察到结合，这有力地表明此抗体实际上不结合CD28茎部区域(图13C)。
实施例7：消除sCD28的免疫抑制作用的基于抗体的试剂的表征(清除)
获得了三种牢固结合sCD28的抗体，并研究了它们作为清除剂降低sCD28水平的潜在功效。上文提供了三种抗体的序列。
为了证实这三种抗体结合人sCD28的能力，用PHA刺激人CD3 T细胞，并使用本发明的两种抗体通过夹心ELISA测量sCD28。使用抗体1作为检测抗体，并使用抗体2作为捕获抗体的代表性结果在图14A中显示。类似地，用SEB刺激人PBMC，并且本发明的抗体再次能够强力地检测sCD28(图14B)。当使用蛋白酶抑制剂TAPI、GI254023X和TMI-1时，检测到较低水平的sCD28，证实确实检测到了sCD28。
将抗体#1和#2与已知结合mCD28的对照商业CD28抗体——CD28.2进行比较。在变化浓度的sCD28的情况下，用每种抗体(并以mIgG作为阴性对照)进行直接ELISA(图14C)。将重组人sCD28蛋白固定在maxisorp ELISA平板上，并通过用驴抗小鼠IgG(H&L)-HRP检测结合的抗体并用TMB展开来评估结合。尽管商业抗体CD28.2确实结合sCD28，但结合较差，并且即使输入提高了十倍，O.D也仅有少量增加。相比之下，抗体#1和#2均显示出与sCD28的更强结合，其中抗体#1显示高出近十倍的检测，而抗体#2显示在所检查的整个范围内与增加的抗体浓度呈线性关系。图14D中单独提供了每种抗体的直接ELISA。有趣的是，抗体#2也能够结合小鼠CD28，而抗体#1和#3则不能(图14E)。
已知CD28.2刺激T细胞增殖和细胞因子分泌，因此它起mCD28激动剂的作用。实际上，当通过FACS测量CD86与mCD28的结合时，CD28.2的添加大大降低了CD86结合(图15A)，表明CD28.2与mCD28的配体结合结构域结合或将使堵塞。相比之下，抗体#1(图15B)、抗体#2(图15C)或抗体#3(图15D)都不阻断CD86与mCD28的结合，而实际上两种抗体看起来都与mIgG对照相当(图15E)。
干扰素γ(IFNγ)分泌被测量为T细胞的促炎性细胞因子分泌的代表。在抗CD3刺激的存在下，抗体CD28.2诱导了强健的(robust)IFNγ分泌，表明T细胞已被激活。相比之下，抗体#1、#2和#3在各种浓度下均对IFNγ分泌没有影响(图15F)。因此，尽管CD28.2充当mCD28激动剂，但抗体#1-3并非激动剂。当用SEB刺激人PBMC时发现了相似的结果(图15G)。
类似地，当用抗CD3抗体刺激人分离的T细胞时，CD80-Fc表现为激动剂，提高IFNγ的分泌。加入拮抗剂应当降低CD80的作用，然而，当添加抗体#1-3时，未观察到分泌的降低(图15H)。这表明抗体#1-3也非拮抗的。
最后，检查了抗体#1-3完全与mCD28结合的能力。尽管sCD28抗体不结合mCD28不是必需的，但它是有利的。这样的抗体可用于特异性检测可溶性蛋白质，并且如果用于治疗，将对膜形式没有影响。通过FAC评估幼稚的分离的CD3 T细胞以测定mCD28结合。将细胞与抗体#1-3(20μg/mL深灰色直方图)或同种型对照(mIgG，20μg/mL浅灰色直方图)一起温育。用Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠二抗进行结合检测。如图15I中可见，仅抗体#1完全结合mCD28。抗体#2和#3在细胞表面不结合CD28，因此对sCD28具有完全的特异性。
实施例8：抗体可用于从血浆中去除sCD28
根据生产商的方案(Thermo Fisher Scientific)，将不同量(0.125-2μg)的抗体#1和#2装载到甲苯磺酰基活化的磁珠上。然后将装载的珠子添加到来自癌症患者的血浆样品中，并在热混合器中，于37℃下，在1000RPM下将混合物温育2小时。将珠子分离，并用磁铁从血浆中去除，并通过ELISA测量血清中留存的sCD28的量。提供了抗体#1(图16A)和抗体#2(图16B)的代表性结果，显示本发明的抗体能够结合sCD28并从血浆中去除sCD28。
在各种癌症样品(黑素瘤、结直肠癌和卵巢癌)上抗体#1进行了进一步测试，并与三种已知的CD28配体B7分子进行了比较。将约1.5μg的抗体#1、CD80、CD86和ICOSL各自装载到甲苯磺酰基活化的磁珠上，并且如前所述将珠子与血浆混合。结直肠样品(图16C)，以及两个黑素瘤样品(图16D-E)，卵巢样品(图16F)和来自健康供体的样品(图16G)全部进行测试。抗体#1优于其它三种测试分子，并且在所有情况下都能够将血浆中的sCD28水平降低至在健康样品中观察到的水平或低于该水平。实际上，除了其中一个黑素瘤样品(图16D)外，在所有的样品中，抗体#1都将sCD28降低至几乎不可检测的水平，但是即使在此样品中也观察到大于50％的降低。
尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是显然，许多可选方案、修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的可选方案、修改和变型。
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg tgaggagtaa 420
gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac 480
ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctcctga 538
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<213> 智人
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Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu
20 25 30
Asp Ser Ala Val Glu Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln
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Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly
50 55 60
Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr
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Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
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Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
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Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
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<213> 智人
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His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
1 5 10 15
Ser Lys Pro
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Gly Asp Ala Asn Gln Gln Phe Ala Tyr
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Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
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Thr
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Gly
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
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Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser
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Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
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Lys
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<220>
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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe
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100 105 110
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<220>
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<400> 43
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Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
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Asp Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro
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<211> 214
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 44
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1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
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Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
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210
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<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Gln Trp Ile Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
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100 105 110
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Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln
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Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Lys
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<220>
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<400> 48
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<220>
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<400> 49
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<212> PRT
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<220>
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245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
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195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
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Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<400> 54
Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr
20 25 30
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Thr Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr
85 90 95
Thr Ala Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys
100 105 110
Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys
130 135 140
Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly
145 150 155 160
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly
180 185 190
Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala
195 200 205
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys
225 230 235 240
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
260 265 270
Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly Cys
290 295 300
Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Cys
305 310 315 320
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys
325 330 335
Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
340 345 350
Cys Ala
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Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
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<223> 合成的
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Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala
50 55 60
Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys
65 70 75 80
Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly
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Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala
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Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys
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Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr
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Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly
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Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys
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Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly
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Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala
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Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr
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Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala
305 310 315

Claims (54)

1.治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括降低所述对象中的可溶性CD28(sCD28)水平。
2.改善对其需要的对象中的基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括降低所述对象中的sCD28水平。
3.权利要求2所述的方法，其中需要免疫疗法的所述对象患有癌症。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述对象对基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法不响应或响应低。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述降低发生在所述对象的血液、外周血或肿瘤微环境中。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述降低包括以下中的至少一项：
a.给予所述对象与sCD28结合的试剂，并且其中所述试剂在结合后降解所述sCD28或靶向所述sCD28以降解；
b.给予所述对象抑制性核酸分子，其中所述分子与编码sCD28的mRNA结合而不与编码膜CD28(mCD28)的mRNA结合；
c.给予所述对象结合mCD28并抑制所述mCD28的蛋白酶剪切的试剂；
d.给予所述对象包含人CD28的茎部区域的二聚体肽；
e.给予所述对象抑制能够剪切mCD28的蛋白酶的试剂，和
f.从所述对象中抽血，降低所述血液中sCD28的量并将所述血液返回所述对象。
7.权利要求6所述的方法，其中所述茎部区域，
a.包含氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:36)；
b.由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成；或
c.(a)和(b)两者。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法不降解mCD28或不降低mCD28介导的免疫细胞激活。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在所述降低之前，所述对象的血液包含至少5ng/ml的sCD28。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结直肠癌。
11.权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括给予所述对象另一种免疫疗法。
13.权利要求12所述的方法，其中所述免疫疗法选自：
a.检查点抑制剂；
b.基于嵌合抗原受体(CAR)的疗法；和
c.癌症疫苗。
14.权利要求13所述的方法，其中所述检查点抑制剂是基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。
15.试剂，其结合膜CD28(mCD28)并抑制所述mCD28的蛋白酶剪切。
16.权利要求15所述的试剂，其中所述试剂既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂。
17.权利要求15或16所述的试剂，其中所述试剂既不降解所述mCD28也不抑制mCD28介导的免疫细胞激活。
18.权利要求15至17中任一项所述的试剂，其中所述试剂
a.不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)；
b.包含IgG2或IgG4；
c.包含经改造以降低CDC、ADCC或两者的Fc结构域；
d.缺少Fc结构域；
e.是Fab片段；
f.是单链抗体；
g.是单结构域抗体；
h.是小分子；
i.是与mCD28特异性结合的肽；或
j.其组合。
19.权利要求15至18中任一项所述的试剂，其中所述试剂结合在CD28的茎部区域内。
20.权利要求19所述的试剂，其中所述茎部区域
a.包含氨基酸序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)或KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:36)；
b.由氨基酸序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:10)组成；或
c.(a)和(b)两者。
21.权利要求15至20中任一项所述的试剂，其中所述试剂抑制至少一种蛋白酶的蛋白酶剪切。
22.权利要求21所述的试剂，其中所述至少一种蛋白酶是至少一种金属蛋白酶。
23.权利要求22所述的试剂，其中所述至少一种金属蛋白酶选自ADAM 10和ADAM 17。
24.权利要求15至23中任一项所述的试剂，其中所述试剂是抗体或其抗原结合片段，并且包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:30(GFTFSSYYMS)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:31(TISDGGDNTYYAGTVTG)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:32(IHWPYYFDS)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:33(RASSSVSYMN)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:34(ATSDLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:35(QQWSSHPPT)中所示的氨基酸序列。
25.权利要求24所述的试剂，包含以下中的至少一个
a.重链，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
b.轻链，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
26.试剂，其结合可溶性CD28(sCD28)并且既非CD28激动剂也非CD28拮抗剂。
27.权利要求26所述的试剂，其中所述试剂不结合膜CD28(mCD28)。
28.权利要求26或27所述的试剂，其中所述试剂选自与sCD28特异性结合的抗体或其抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和肽。
29.权利要求26至28中任一项所述的试剂，其中所述试剂与有机体中的sCD28结合导致以下中的至少一项：
a.所述结合的sCD28的降解；
b.从血液中去除sCD28；和
c.将所述结合的sCD28转运至溶酶体、内体、蛋白酶体或其组合。
30.权利要求26至29中任一项所述的试剂，其中所述试剂不抑制所述sCD28与配体的结合。
31.权利要求26至30中任一项所述的试剂，其中所述试剂结合二聚体sCD28、单体sCD28或两者。
32.权利要求26至31中任一项所述的试剂，其中所述试剂结合在sCD28的IgV结构域外部。
33.权利要求26至32中任一项所述的试剂，其中所述试剂是抗体或其抗原结合片段，并且包含三条重链CDR(CDR-H)和三条轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GYTLTNY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:13(NTYTGK)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:14(GDANQQFAY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:15(KASQDINSYLS)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:16(RANRLVD)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:17(LQYDEFPPT)中所示的氨基酸序列；
CDR-H1包含SEQ ID NO:18(GYTFTSY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:19(YPGDGD)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:20(NYRYSSFGY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:21(KSSQSLLNSGNQKNYLT)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQID NO:22(WASTRES)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:23(QSDYSYPLT)中所示的氨基酸序列；或
CDR-H1包含SEQ ID NO:24(GYTFTDY)中所示的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:25(NPNYDS)中所示的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:26(SSPYYDSNHFDY)中所示的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:27(SARSSINYMH)中所示的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ IDNO:28(DTSKLAS)中所示的氨基酸序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:29(HQRNSYPFT)中所示的氨基酸序列。
34.权利要求33所述的试剂，包括以下中的至少一种
a.重链，包含选自SEQ ID NO:41、45或49的氨基酸序列；和
b.轻链，包含选自SEQ ID NO:43、47或51的氨基酸序列。
35.权利要求33或34所述的试剂，其中所述抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab')2、scFV或scFV2片段。
36.权利要求33至35中任一项所述的试剂，其中所述试剂是人源化的。
37.权利要求33至36中任一项所述的试剂，其中所述试剂不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
38.用于产生权利要求15至25中任一项所述的试剂的方法，所述方法包括：
获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂，测试所述试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力，并选择至少一种阻断所述蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；或
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中所述核酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.测试所述试剂阻断蛋白酶对mCD28的剪切的能力；和
iii.选择至少一种阻断所述蛋白酶对mCD28的剪切的试剂；
从而产生权利要求15至25中任一项所述的试剂。
39.权利要求38所述的方法，其中所述蛋白酶选自ADAM 10和ADAM 17。
40.权利要求38或39所述的方法，其中获得与CD28胞外结构域或其片段特异性结合的试剂是获得与CD28茎部结构域特异性结合的试剂。
41.权利要求38至40中任一项所述的方法，进一步包括在所述获得的试剂存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂。
42.用于产生权利要求26至37中任一项所述的试剂的方法，所述方法包括：
获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂，在所述获得的试剂的存在下测定mCD28下游信号传导，并选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；或
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中核所述酸序列是通过以下方式选择的试剂的核酸序列：
i.获得与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂；
ii.在所述获得的试剂存在下测定mCD28下游信号传导；和
iii.选择至少一种既不大幅激动也不大幅拮抗mCD28信号传导的试剂；
从而产生权利要求26至37中任一项所述的试剂。
43.权利要求42所述的方法，进一步包括以下中的至少一项：
a.测试所述获得的试剂与mCD28的结合，并选择至少一种不结合mCD28的试剂；和
b.测试所述获得的试剂与来自癌症患者的sCD28的结合，并选择至少一种与来自癌症患者的所述sCD28结合的试剂。
44.权利要求38或40所述的方法，所述获得试剂包括以下至少中的至少一项：
a.用所述CD28胞外结构域或其片段免疫有机体，并从所述免疫的有机体中收集抗体；
b.筛选与CD28胞外结构域或其片段结合的试剂库，并选择结合的试剂。
45.权利要求44所述的方法，其中所述CD28胞外结构域或其片段是二聚体或单体的。
46.权利要求44或45所述的方法，其中所述有机体选自兔子、小鼠、大鼠、鲨鱼、骆驼科动物、鸡、山羊和噬菌体。
47.权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述收集抗体包括：
a.从所述免疫的有机体的脾脏中提取B细胞；
b.将所述提取的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤；和
c.从所述杂交瘤中收集抗体。
48.权利要求44或45所述的方法，其中所述选择结合的试剂包括对所述选择的试剂进行测序并从所述序列产生所述试剂的重组形式。
49.试剂，其通过权利要求38至48中任一项所述的方法产生。
50.药物组合物，其包含权利要求15至37和49中任一项所述的试剂以及药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。
51.治疗和/或预防对其需要的对象中的癌症或改善对其需要的对象中的基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包括给予所述对象权利要求50所述的药物组合物。
52.确定待通过权利要求1至12中任一项所述的方法治疗的对象的适合性的方法，包括从所述对象获得样品并测定所述样品中的sCD28水平，其中5ng/ml以上的sCD28水平表示所述对象适合权利要求1至12中任一项所述的治疗的方法。
53.试剂盒，其包含权利要求15至37和49中任一项所述的至少一种试剂。
54.权利要求53所述的试剂盒，进一步包含以下中的至少一种：
a.抗PD-1和/或PD-L1免疫疗法；
b.声明本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法联用的标签；和
c.第二检测分子，用于检测权利要求15至37和49中任一项所述的至少一种试剂。
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