JP2023517242A - 安定性が高められた脱落遮断剤 - Google Patents

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Abstract

リンカーにより分離された少なくとも２つの部分を含む薬剤であって、第１の部分は、細胞表面上のｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害し、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める、薬剤が提供される。この薬剤を投与することを含む、癌を治療する方法および免疫療法を改善する方法も提供される。【選択図】図１９

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９８８，５０３号の優先権の利益を主張し、その内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、免疫調節および免疫療法の分野に関する。
適応免疫系は、主に抗原特異的ヘルパーＣＤ４＋および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を調整することにより、病原体および癌細胞に対する調節および保護において重要な役割を果たす。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の耐久性のある持続的な活性化は、ｉ）ＡＰＣ上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチドとのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与、およびｉｉ）ＡＰＣによりまた発現されるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）リガンドに結合するＴ細胞上の共刺激性ＣＤ２８受容体、を必要とする。ＣＤ２８共刺激の生物学的影響は、多数であり、Ｔ細胞周期の調節、Ｔ細胞の増殖、分化、ならびに免疫エフェクター機能を達成するために必要な閾値を下げることによるＴＣＲ刺激の増幅を含む。
共刺激分子ＣＤ２８の活性化とは対照的に、構造的相同体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連４（ＣＴＬＡ－４）は、ＣＤ２８のトリガーによって駆動される膜発現を伴う抑制性共刺激受容体である。ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８はどちらも、Ｉ型の膜貫通タンパク質である。それらの細胞外部分は、膜貫通領域に近接するＩｇＶドメインの外側に位置するシステイン残基によってホモ共有的に連結される、１つのＶセット免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ－Ｖ）ドメインで構成される。類似性にも関わらず、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２８は、親和性および四次構造配置の点で異なる。ＣＴＬＡ－４は、Ｂ７分子へのより高い結合親和性、および共有リガンドとの異なる化学量論的結合をもたらすＣＤ２８とは異なる二量体化モードを有することが判明した。ＣＤ２８は、一価の結合化学量論を示し、一方でＣＴＬＡ－４は、二価の様式で相互作用する。したがって、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりもはるかに高い親和性および結合力でＢ７分子に結合し、その結果、Ｔ細胞応答を下方調節し、抗原特異的寛容の開始を有利にする。
いくつかの共刺激分子はいくつかの生理学的形態を有することが示されている。膜結合型に加えて、ナイーブ免疫細胞で発現される可溶型も報告されており、Ｔ細胞生物学の複雑さを増す。ＣＤ２８の可溶型（ｓＣＤ２８）は、選択的スプライシング遺伝子産物ならびに能動的脱落に起因するとされている。Ｔ細胞活性化中の能動的脱落は、接着分子のタンパク質分解による持続的な活性化に対抗する調節機序として過去に説明され、現在ＣＤ２８に対しても示されている。
膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）は、タンパク分解的に切断されて、ｓＣＤ２８を産生することが示された。この切断の阻害は、ｓＣＤ２８を阻害しそれによりｓＣＤ２８免疫抑制を阻害する方法として提案されている。従って、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を遮断できる、長い血清半減期を有する薬学的に存続可能な薬剤に対する大きな必要性が存在する。
本発明は、リンカーにより分離された少なくとも２つの部分を含む薬剤を提供し、第１の部分は、細胞表面上の膜のＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害し、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める。薬剤を投与することを含む、癌を治療および予防する方法、ならびにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベース免疫療法を改善する方法もまた、提供される。
第１の態様では、リンカーにより分離された少なくとも２つの部分を含む薬剤が提供され、第１の部分は、細胞表面上の膜のＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害し、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める。
いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分、または両方は、１００キロダルトン（ｋＤａ）より小さい。
いくつかの実施形態では、薬剤は、１００ｋＤａより小さい。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、単一ドメイン抗体を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ラクダ抗体またはサメ抗体である。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、３つのＣＤＲを含み、
ＣＤＲ１は、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）で示されるアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲ１は、配列番号４（ＩＮＡＭＡ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号５（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号６（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含み；または
ＣＤＲ１は、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号８（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、下記からなる群から選択される配列を含む。
ａ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ｂ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；および
ｃ．ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１２（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１３（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１４（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１５（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１６（ＡＴＳＤＬＡＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１７（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストではない。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ２８アンタゴニストではない。
いくつかの実施形態では、第１の部分の高められた安定性は、血液中での安定性を高めることを含む。
いくつかの実施形態では、血液中での安定性を高めることは、血液からの第１の部分の排出を低減することを含む。
いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、腎臓濾過を低減すること、リソソーム分解を低減することまたは両方を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、剛性ペプチドリンカーである。
いくつかの実施形態では、剛性ペプチドリンカーは、ヘリックスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、剛性ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、剛性ペプチドリンカーは、最大で３０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１個のシステイン残基を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基は、Ｃ末端システインである。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、チオール結合を介してシステインに付着される。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＰＥＧであり、ＰＥＧは、第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり、ＰＥＧは、ペプチドリンカーのアミノ酸にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２，０００～４０，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズの直鎖のまたは分岐鎖のＰＥＧである。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドを含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡ結合ポリペプチドを含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、下記配列を含む、またはそれからなる：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡ（配列番号１９）。
いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端は、リンカーに連結され、第２の部分のＮ末端は、リンカーに連結される。
いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端は、リンカーのＮ末端に連結され、第２の部分のＮ末端は、リンカーのＣ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号６３および６４から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内のアミノ酸残基へのＰＥＧ部分の不可逆的コンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内のアミノ酸残基へのＰＥＧ部分の可逆的コンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２，０００～４０，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズの直鎖または分岐鎖ＰＥＧである。
別の態様では、本発明の薬剤をコードする核酸分子が提供される。
別の態様では、本発明の薬剤を含む発現ベクターが提供される。
別の態様では、本発明の薬剤を生成する方法が提供され、方法は：
ａ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する第１の部分を得ること；
ｂ．リンカーにより第１の部分を第２の部分に連結して、連結された薬剤を産生すること、および細胞表面上のｍＣＤ２８への連結された薬剤の結合およびｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断の阻害を試験すること；
ｃ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する連結された薬剤を選択すること；および
ｄ．薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列が、
ｉ．細胞表面状のｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する第１の部分を得ること；
ｉｉ．リンカーにより第１の部分を第２の部分に連結して、連結された薬剤を産生すること、および細胞表面上のｍＣＤ２８への連結された薬剤の結合およびｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断の阻害を試験すること；および
ｉｉｉ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する連結された薬剤を選択すること；
により選択される薬剤の核酸配列である、培養すること、
の少なくとも１つを含み、
それにより本発明の薬剤を生成する。
いくつかの実施形態では、本方法は、連結された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすること、およびｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的にアゴナイズせずかつ実質的にアンタゴナイズしない少なくとも１つの連結された薬剤を選択することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、連結された薬剤の血液中での安定性をアッセイすること、および血液中での第１の部分に比較して、高められた安定性を有する少なくとも１種の連結された薬剤を選択することをさらに含む。
別の態様では、本発明の方法により産生される薬剤が提供される。
別の態様では、本発明の薬剤、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、それを必要とする対象において可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させる方法が提供され、方法は、本発明の薬剤または本発明の医薬組成物を投与すること、それにより対象のｓＣＤ２８レベルを減少させることを含む。
別の態様では、それを必要とする対象において癌を治療するおよび／または予防する方法が提供され、方法は、本発明の薬剤または本発明の医薬組成物を投与すること、それにより対象の癌を治療することおよび／または予防することを含む。
別の態様では、それを必要とする対象においてＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベース免疫療法を改善する方法が提供され、方法は、本発明の薬剤または本発明の医薬組成物を投与すること、それにより対象でのＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベース免疫療法を改善することを含む。
いくつかの実施形態では、対象は、癌に罹患している。
いくつかの実施形態では、方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を低減させない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を活性化しない。
本発明のさらなる実施形態および適用性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内で様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられると理解されるべきである。
ＢＳＡコンジュゲートＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（右）および組換えヒトＣＤ２８タンパク質（左）への段階希釈クローンＭ９による抗原結合を示す折れ線グラフである。抗原は、ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートに固定化された。クローンＭ９の段階希釈を行い、結合された抗体の検出を、ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰおよびＴＭＢによる発色で行った。 組換えヒトｓＣＤ２８（左）およびＳＥＢで活性化されたヒトＰＢＭＣから脱落したｓＣＤ２８（右）のＥＬＩＳＡ検出の棒グラフ。ＥＬＩＳＡは、陽性対照として抗体＃３（２μｇ／ｍＬ、灰色バー）、陰性対照として無関係な抗体Ｍ３９（１０μｇ／ｍＬ、濃い灰色バー）、および抗切断抗体Ｍ９（１０μｇ／ｍＬ、黒色バー）を使用した。組換えＣＤ２８または脱落ＣＤ２８の検出は、ＨＲＰにコンジュゲートされたＥＬＩＳＡキット検出抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を使用することにより実施した。 マウスＨＥＫ２９３細胞で発現されたヒトＣＤ２８への１０μｇ／ｍｌの固定濃度での抗体Ｍ９（上）および対照抗体ＣＤ２８．２（下）の結合を示すヒストグラム（黒色のヒストグラム）。ポリクローナルマウスＩｇＧを、陰性対照として使用し（１０μｇ／ｍＬ）、灰色のヒストグラムで示す。検出を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスとのインキュベーションにより行った。 ＥＬＩＳＡによるヒトＣＤ２８ストーク領域配列への結合。段階希釈の種々のＶＨＨクローンによる抗原結合の分析。抗原として機能するビオチンコンジュゲートＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンでコートされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレート上で固定化した。ＶＨＨクローンの段階希釈を行い、結合されたＶＨＨの検出を、抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰコンジュゲート抗体で行い、発色を、ＴＭＢで行った。 ヒト膜状ＣＤ２８へのＶＨＨ＃２Ａ１の結合。ＦＩＴＣコンジュゲートＶＨＨクローン２Ａ１（５０μｇ／ｍＬ、黒色のヒストグラム）およびＦＩＴＣコンジュゲートアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ、５０μｇ／ｍＬ、灰色のヒストグラム）を、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞とインキュベートした。結合を、ＦＡＣＳ分析により評価した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１、４Ａ１および４Ａ４は、ヒトＣＤ２８のＭＭＰ切断部位に特異的に結合する。直接ＥＬＩＳＡによる、ヒトＣＤ２８ストーク領域ＷＴ配列またはＬ１４５Ｋ変異配列のいずれかへのＶＨＨクローンの特異的結合の比較。ビオチンコンジュゲート野生型またはＬ１４５Ｋ ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンでコートされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレート上に固定化した。ＶＨＨクローン（０．２～５μｇ／ｍＬ）および無関係なＶＨＨクローン（左上のグラフ）の段階希釈を行い、結合されたＶＨＨの検出を、抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて実施し、発色を、ＴＭＢで行った。 ＶＨＨクローンによるヒトＣＤ２８ストーク領域のＭＭＰ－２媒介性切断のインビトロ遮断。ｃ－Ｍｙｃがコンジュゲートされおよびビオチン化されたヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（１μＭ）を、ＭＭＰ－２阻害剤（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ）、種々の濃度（０．４～１０μｇ／ｍＬ）でのＭ９ Ｆａｂ、または示されたＶＨＨクローンの存在下で、５０ｎｇのｒｈＭＭＰ－２と５時間インキュベートした。混合物を、ニュートラアビジンでコートされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートにロードし、続いて十分に洗浄し、抗ｃＭｙｃ ＨＲＰコンジュゲート抗体によってインタクトなペプチドを検出し、発色を、ＴＭＢを用いて行った。 ＭＭＰ－１３によるヒトＣＤ２８ストーク領域の切断に対するＶＨＨクローン２Ａ１のインビトロ遮断活性。ｃ－Ｍｙｃおよびビオチン化ヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（１μＭ）を、ＭＭＰｉ（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ、濃い灰色バー）、様々な濃度（０．６２～１０μｇ／ｍＬ）での無関係なＶＨＨクローン（左のグラフの黒色バー）、またはＶＨＨクローン２Ａ１（右のグラフの黒色バー）の存在下で、５０ｎｇのｒｈＭＭＰ－１３（薄い灰色バー）と５時間インキュベートした。混合物を、ニュートラアビジンでコートされたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートにロードし、続いて十分に洗浄し、抗ｃＭｙｃ－ＨＲＰコンジュゲート抗体によってインタクトなペプチドを検出し、発色を、ＴＭＢを用いて行った。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞において、ＣＤ２８の脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルを、４８時間のインキュベーション後、ヒトＣＤ２８を安定に発現するＨＥＫ細胞の培地中で測定しれた。ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色バー）、無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色バー）、または様々な濃度（３．３～１００μｇ／ｍＬ）での抗ＣＤ２８ストーク領域のＶＨＨクローン（黒色バー）の、可溶性ＣＤ２８のレベルに対する効果を示す。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルを、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、ＰＨＡおよびＩＬ－２によって活性化された単離ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ２８脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルを、５μｇ／ｍＬのＰＨＡおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（薄い灰色バー）で刺激された単離されたヒトＣＤ４Ｔ細胞の培地中で測定した。種々の濃度（０．４～５０μｇ／ｍＬ）での抗体Ｍ９クローン（黒色バー）のＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色バー）、無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色バー）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローンまたはＦａｂフォーマットの異なる処理の、可溶性ＣＤ２８の量に対する効果を示す。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルを、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン２Ａ１および４Ａ４は、スーパー抗原によって活性化されたＰＢＭＣにおけるＣＤ２８脱落を阻害する。可溶性ＣＤ２８のレベルを、１ｎｇ／ｍＬ ＳＥＢ（薄い灰色バー）で刺激された単離ＰＢＭＣの培地中で測定した。ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、１μＭ、濃い灰色バー）、様々な濃度（０．４～５０μｇ／ｍＬ）での無関係なＶＨＨの陰性対照（左上のグラフ、黒色バー）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローン、またはＦａｂフォーマットのＭ９クローン（黒色バー）の、可溶性ＣＤ２８の量に対する、異なる処理の効果を示さす。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルを、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨクローンは、膜のＣＤ２８へのリガンド結合を遮断しない。ヒトＣＤ２８を発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７にコンジュゲートされた標識二次抗ヒトＦｃ抗体を使用して、ＣＤ８６－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）結合に関しフローサイトメトリーにより監視した。ＣＤ８６－Ｆｃへの抗ＣＤ２８Ｖ ＨＨクローンの添加（３０μｇ／ｍＬ、黒色のヒストグラム）は、ＣＤ８６結合の大きさを変えなかったが、市販の抗体クローンＣＤ２８．２の添加（１０μｇ／ｍＬ、左上のグラフ、黒色のヒストグラム）は、結合を有意に減少した。 抗ＣＤ２８ストークＶＨＨクローンのアゴニスト効果の評価。ヒト単離ＣＤ３細胞を、陽性対照として機能する抗ＣＤ２８アゴニスト抗体クローン２８．２（２μｇ／ｍＬ、濃い灰色バー）、抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨ、または無関係なＶＨＨクローン（２０μｇ／ｍＬ、黒色バー）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄い灰色バー）で２日間刺激した。上清中に分泌されたヒトＩＮＦγの濃度を、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量した。 抗ＣＤ２８ストークＶＨＨクローンのアンタゴニスト効果の評価。ヒト単離ＣＤ３細胞を、ＣＤ２８共刺激のリガンドとして機能する組換えＣＤ８０－Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ、濃い灰色バー）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄い灰色バー）で２４時間刺激した。無関係なＶＨＨクローン（左上のグラフ）または抗ＣＤ２８ストーク領域ＶＨＨを、種々の濃度で添加した（３．７５～３０μｇ／ｍＬ、黒色バー）。上清中のヒトＩＬ－２の濃度を、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量した。 異なる２Ａ１半減期延長構築物によるヒトＣＤ２８ストーク領域配列への結合。段階希釈の親２Ａ１ ＶＨＨおよび１１個の半減期延長構築物による抗原結合の分析。ＣＤ２８－Ｆｃ組換えペプチドをベイトとして使用した。 膜ＣＤ２８に対する異なる２Ａ１半減期延長構築物によるリガンド遮断活性。親２Ａ１ ＶＨＨ（上段中央のグラフ）、陽性対照アンタゴニスト活性抗体（上段右のグラフ）ならびに種々の半減期延長構築物存在下での、ヒトＣＤ２８発現ＨＥＫ２９３細胞へのＣＤ８６結合を示すヒストグラム（上段左のグラフ）。１５アミノ酸長のフレキシブルリンカーを有する構築物を示すが、類似の結果は、５アミノ酸および３５アミノ酸フレキシブルリンカーでも観察された。２０アミノ酸長の剛性リンカーを示すが、類似の結果は、３０アミノ酸剛性リンカーでも観察された。 異なる２Ａ１半減期延長構築物のアゴニスト効果の評価。無関係のＶＨＨクローン＃３Ｃ０４（１．２μＭ、濃い灰色バー）、陽性対照抗ＣＤ２８アゴニスト抗体クローン２８．２（２μｇ／ｍＬ、濃い灰色バー）、または異なる２Ａ１構築物（１．２μＭ、黒色バー）の存在下で、（１５Ａ）プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄い灰色バー）または（１５Ｂ）ｓｃＯＫＴ３プラスミド（人工ＡＰＣ、灰色バー）を遺伝子導入したＡ３７５細胞で２４時間刺激されたヒト単離ＣＤ３ Ｔ細胞からのＩＬ－２分泌の棒グラフ。 異なる２Ａ１半減期延長構築物のアンタゴニスト効果の評価。無関係のＶＨＨクローン＃３Ｃ０４（２μＭ、アイソタイプ対照、濃い灰色バー）、陽性対照抗ＣＤ２８アンタゴニストクローンＶＨＨ＃１２Ｂ０７（１μＭ）、または種々の２Ａ１構築物の存在下で、ヒトＣＤ８０およびｓｃＯＫＴ３プラスミド（人工ＡＰＣ－ＣＤ８０、薄い灰色バー）の両方で２４時間刺激されたヒト単離ＣＤ３ Ｔ細胞からのＩＬ－２分泌の棒グラフ。フレキシブルなおよび剛性のリンカーを有する構築物を、２μＭで使用した。ペグ化構築物を、種々の濃度（０．１～３μＭ）で使用した。 ＭＬＲベースアッセイでの異なる２Ａ１半減期延長構築物の免疫調節効果。無関係のＶＨＨクローン＃３Ｃ０４（３μＭ、アイソタイプ対照、濃い灰色バー）、ＣＤ２８アンタゴニストクローンＶＨＨ＃１Ａ０７（３μＭ）、および種々の濃度（０．１～３μＭ；２．５μＭの唯一の濃度で使用した２Ａ１－１Ｃ－Ｐ２Ｋ－ＨＳＡを除く）の異なる２Ａ１構築物の存在下での、混合リンパ球反応（薄灰色バー）からのＩＬ－２分泌の棒グラフ。 マウスにおける２Ａ１血清曝露に対する半減期延長構築物の影響。種々の試験したマウス中のＶＨＨ構築物の時間（時間）の関数として観察された平均血清濃度（μｇ／ｍＬ）の折れ線グラフ（ｎ＝３＊；±標準偏差）。 刺激されたリンパ球中のＣＤ２８脱落の阻害。可溶性ＣＤ２８のレベルを、ＰＨＡおよびＩＬ－２で刺激された単離ヒトＣＤ４の培地中、またはＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣ中で測定し、無関係のＶＨＨ＃３Ｃ０４陰性対照（３μＭ、アイソタイプ対照灰色バー）を用いて、陰性対照に対し正規化した。親２Ａ１ ＶＨＨ（３μＭ、濃い灰色バー）、ＭＭＰ阻害剤（陽性対照、１μＭ ＴＭＩ－１、薄い灰色バー）および種々の２Ａ１半減期延長構築物（３μＭ、黒色バー）もまた、評価しおよび正規化した。
本発明は、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの部分を含む薬剤を提供し、第１の部分は、細胞表面上の膜のＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害し、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める。本発明の薬剤を投与することを含む、本発明の薬剤を生成する、対象の癌を治療する、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベース免疫療法を改善する、およびｓＣＤ２８レベルを減少させる方法もまた、提供される。本発明の薬剤を含む医薬組成物、ならびに医薬組成物の使用の方法もまた、提供される。本発明の薬剤、方法および組成物は、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断から生じたｓＣＤ２８が、免疫抑制剤として機能し、そのため脱落の低減は、ｓＣＤ２８による阻害を減少させ、かつｍＣＤ２８シグナル伝達を介して免疫活性化を増加させるという二重の利点を有するという、驚くべき発見に基づいている。ｍＣＤ２８の切断部位に対するフルサイズの抗体は、膜近位領域にアクセスするには大きすぎ、そのため脱落を阻害できず、一方、細胞表面上のｍＣＤ２８に対する特異性を有するより小さいポリペプチドは、膜近位領域にアクセスでき、タンパク質分解性切断を遮断できる。血清中のポリペプチドの治療的に有用な安定性は、第２の部分への連結により強化される。第２の部分は、第１の部分の血清半減期を増大させ、一方で細胞上のｍＣＤ２８へのポリペプチドの結合能力に影響しない。
薬剤
第１の態様では、リンカーにより分離された少なくとも２つの部分を含む薬剤が提供され、第１の部分は、細胞の表面上のｍＣＤ２８に結合し、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める。
本明細書で使用される場合、用語の「部分」は、部分構造として全官能基または官能基の一部を含み得る、分子の部分に関する。用語「部分」は、対応する分子に類似する、特定のセットの化学的および／または薬理的特性を示す分子の一部をさらに意味する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、哺乳動物ＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２０）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、成熟ＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠き、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２１）を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、完全長ヒトＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号２２）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、膜のＣＤ２８（ｍＣＤ２８）である。いくつかの実施形態では、膜のＣＤ２８は、膜ＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８は、細胞表面にある。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８は、膜中にある。いくつかの実施形態では、細胞表面は、細胞膜である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ｍＣＤ２８を発現する。いくつかの実施形態では、細胞株は、発現ベクターからのｍＣＤ２８を発現する。いくつかの実施形態では、細胞株は、ｍＣＤ２８を安定に発現する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）である。本明細書で使用される場合、ｓＣＤ２８は、膜貫通ドメインを含まず、したがって膜に組み込むことができないいずれかのＣＤ２８フラグメントまたはバリアントを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号２３）を含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、膜結合型ではない。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、溶液中にある。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、血液中のＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、ＴＭＥ中のＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、体液中のＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３を欠失している。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングで切り出す選択的スプライシングから生じるスプライスバリアントである。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、膜状ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）からの切断産物である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、短縮型ＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、完全長ＣＤ２８の細胞質ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、二量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、単量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８の選択的スプライシングから生じるスプライスバリアントではない。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングで切り出す。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号２４）を含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、配列番号２４のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠き、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号２５）を含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、配列番号２５のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰ（配列番号２６）を含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、配列番号２６のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠き、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰ（配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８は、配列番号２７のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、ヒトｓＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号２８）を含む。
免疫細胞に対するｓＣＤ２８の効果は、当技術分野で周知であり、非限定的な例としては、ＩＬ－１０またはＴＧＦβなどの抗炎症性サイトカインの免疫細胞誘導、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の免疫細胞発現、およびＩＬ－２またはＩＦＮγなどの炎症促進性サイトカインの免疫細胞下方制御が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜のＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する薬剤は、ｓＣＤ２８の生成を阻害することを含む。いくつかの実施形態では、ｓＣＤ２８の生成を阻害することは、免疫細胞に対するｓＣＤ２８の効果を阻害することを含む。
いつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、複数の部分を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも２、３、４、５、６、または７つの部分を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、薬剤は、２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、第１の部分および第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部分は、結合部分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部分は、半減期改良部分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部分は、半減期延長部分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部分は、安定性改良部分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部分は、安定性強化部分である。
いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、フルサイズ抗体ではない。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、ＩｇＧではない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、１００キロダルトン（ｋＤａ）より小さい。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５ｋＤａより小さい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、５０ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、２５ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、２０ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、１５ｋＤａより小さい。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、細胞の表面上のｍＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８は、第１の部分により結合されるｍＣＤ２８である。本明細書で使用される場合、「タンパク質分解性切断を阻害すること」は、ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断のなんらかの低減を指す。いくつかの実施形態では、阻害は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の切断の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、タンパク質分解性切断を阻害することは、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを維持する。いくつかの実施形態では、タンパク質分解性切断を阻害することは、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、タンパク質分解性切断を阻害することは、免疫刺激に適切なｍＣＤ２８のレベルを維持する。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解性切断の低減は、少なくとも１つのプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態では、タンパク質分解性切断の低減は、少なくとも１つのメタロプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２またはＭＭＰ－１３である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される。いくつかの実施形態では、第１の部分は、Ｆａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、第１の部分は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、第１の部分は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＣＤ２８に特異的に結合するペプチドである。いくつかの実施形態では、第１の部分は、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、および単一ドメイン抗体から選択される。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、フルサイズ抗体ではない。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、Ｆｃドメインを欠く。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、Ｆｃドメインを欠く抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、ラクダ科動物抗体、サメ抗体またはナノボディである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、別のタンパク質またはタンパク質のフラグメントに融合される。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質またはフラグメントは、ＣＤ２８に対する薬剤を標的にする。いくつかの実施形態では、別のタンパク質またはタンパク質のフラグメントは、ＣＤ２８の細胞外ドメインに結合する抗原結合部分である。
第１の部分、第２の部分または両方の例は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎから選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびＣＤ２８に特異的に結合するペプチドから選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ナノボディである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＶＨＨ抗体である。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」および「ＶＨＨ抗体」という用語は同義であり、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＣＤ２８への特異的結合を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ２８への特異的結合を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨ抗体および抗体ミメティックから選択される。本明細書で使用される場合、「抗体ミメティック」という用語は、標的抗原に特異的に結合できる有機化合物を指す。いくつかの実施形態では、抗体ミメティックは、構造的に抗体に関連しない。抗体ミメティックの例は、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびｎａｎｏＣＬＡＭＰＳを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体ミメティックは、ＤＡＲＰｉｎである。これらの薬剤のすべては、当技術分野で周知であり、受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するのに有用であることが知られている。ｍＣＤ２８に結合できる小分子およびタンパク質は、切断部位を塞ぐ、またはプロテアーゼへのアクセスを妨害または低下させ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体ミメティックである。本明細書で使用される場合、「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を指す。ＤＡＲＰｉｎは、通常それらのタンパク質標的に対し高度に特異的である、遺伝子操作された抗体ミメティックタンパク質である。したがって、ＣＤ２８に対するＤＡＲＰｉｎは、薬剤の一例である。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、約５０ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、１００ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、８０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、７０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、５０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、５０ｋＤａ以下のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、約２５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、５０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、４０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、３０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、２５ｋＤａ以下のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、約１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１０～２０ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１０～１７ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１０～１６ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１０～１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１２～１５ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１２～１６ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１２～１７ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１２～２０ｋＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、２０ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１５ｋＤａ未満のサイズを含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、１５ｋＤａ以下のサイズを含む。その小さいサイズ、および抗原結合が３つのみのＣＤＲに依存しているために、単一ドメイン抗体、特にＶＨＨの結合機構は、凸形状であり、片側からそのエピトープに結合し、従って、膜に固定されたＣＤ２８のストーク領域のようなタンパク質裂け目中に認められるものなどの、限定的な溶媒曝露を特徴とするエピトープへの結合に、より好適である。比較により、Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体は、６つのＣＤＲを含み、少なくとも２つの側からエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、３つのＣＤＲのみによる結合は、６つのＣＤＲによる結合と比較して、ｍＣＤ２８ストーク領域への優れたアクセスを可能にする。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体結合の幾何学的形状は、ｍＣＤ２８ストーク領域へのアクセス性に優れている。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。抗体は典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含む四量体形態を有し、各対は１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、単独のまたは他のアミノ酸配列と組み合わせた、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト化、多重特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプ、および可溶型または結合型で標識できる抗体、ならびに、そのエピトープ結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含むフラグメントであってよい。抗体は、いずれの種由来であってよもい。抗体という用語はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがこれらに限定されない結合フラグメントも含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子を含む。抗体フラグメントは、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含むがこれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてよく、または融合されなくてもよい。当業者はさらに、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合体およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体を含むがそれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることを理解する。
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。
天然起源の抗体構造の基本単位は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成され、非共有結合およびジスルフィド結合の両方により相互に連結されている。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置される鎖内ジスルフィド架橋も有する。５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）が存在し、これらのクラス内で、様々なサブクラスが、単一の抗体分子内の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の違い等の構造の違いに基づいて認識される。ある抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５または５０ｋＤａ未満のサイズを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、５０ｋＤａ未満のサイズを有する。
重鎖および軽鎖のアミノ末端領域は、カルボキシ末端領域よりも配列が多様であり、したがって可変ドメインと呼ばれる。抗体構造のこの部分は、抗体の抗原結合特異性を付与する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは一緒に、単一の抗原結合部位を形成し、したがって基本的な免疫グロブリン単位は２つの抗原結合部位を有する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１－６３（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ４５９２－４５９６）。
重鎖および軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬを形成する。これらのドメインの多様性ははるかに低いが、動物種ごとに違いがあり、さらに、同じ個体内でそれぞれ異なる機能を有するいくつかの異なる抗体のアイソタイプがある。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義される超可変領域アミノ酸残基以外の、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
免疫グロブリン可変ドメインは、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析されて、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊ６：Ｗ５０３－５０８（２００８）を参照されたい。
Ｃｈｏｔｈｉａらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、実験データに依存することなく、配列自体を超えて、この「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ”（１９８９）に記載のナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」および「単鎖可変フラグメント」という用語は同義的に使用され、短いペプチドリンカーによって接続された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、または２０ｋＤａ未満のサイズを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、２５ｋＤａ未満のサイズを有する。いくつかの実施形態では、単鎖抗体のリンカーは、１０～２５アミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～４０、５～４０、１０～４０、１～３５、５～３５、１０～３５、１～３０、５～３０、１０～３０、１～２５、５～２５、または１０～２５アミノ酸である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、抗体Ｍ９の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、抗体Ｍ９の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、抗体Ｍ９のＣＤＲを含む。
本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」、「ＤＡＲＰｉｎ」および「ＶＨＨ」という用語は、同義に使用され、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントを指す。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物抗体である。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、ラクダ、アルパカまたはラマである。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、ラクダである。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、アルパカである。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、ラマである。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、サメ抗体である。
また、本明細書で既に示されたように、ナノボディのアミノ酸残基は、Ｃａｍｅｌｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ Ｊｕｎ．２３；２４０（１－２）：１８５－１９５の論文におけるラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、または本明細書で言及されるように、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって与えられるＶＨのための一般的なナンバリングに従って番号を付けられる。このナンバリングによれば、ナノボディのＦＲ１は、１～３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は、３１～３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６～４９位のアミノ酸を含み、ナノボディのＣＤＲ２は、５０～６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は、６６～９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は、９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は、１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。この点では、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は、変化し得、Ｋａｂａｔナンバリングによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに留意されたい（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングによる１つ以上の位置は、実際の配列において占有されていない場合があるか、または実際の配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによって許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）。これは、一般に、Ｋａｂａｔによるナンバリングが、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応する、または対応しない場合があることを意味する。しかしながら、一般に、Ｋａｂａｔのナンバリングにより、およびＣＤＲ中のアミノ酸残基の数に関係なく、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１位はＦＲ１の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔのナンバリングによる３６位はＦＲ２の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔのナンバリングによる６６位はＦＲ３の開始に対応し、その逆も同様であり、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３位はＦＲ４の開始に対応し、その逆も同様であると言える。
ＶＨドメインのアミノ酸残基のナンバリングのための代替的な方法は、ラクダ科動物由来のＶＨＨドメインおよびナノボディにも同様の方法で適用され得る方法であり、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３（１９８９））、いわゆる「ＡｂＭ定義」およびいわゆる「接触定義」によって記載される方法である。しかしながら、本説明、態様、および図では、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによるＶＨＨドメインに適用されるようにＫａｂａｔによるナンバリングに、特に明記されない限り、従う。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列がヒト抗体との類似性を高めるように改変されている非ヒト種由来の抗体を指す。ヒト化抗体は、ヒト抗体に類似する配列により囲まれた非ヒト抗体のＣＤＲをコードする組換えＤＮＡの生成により産生され得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化は、ヒト抗体足場または骨格への本発明のＣＤＲの挿入を含む。ヒト化抗体は、当技術分野で周知であり、本発明のＣＤＲを保持するそれらを生成する任意の方法が、採用され得る。
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能なバリアントを除いて同一であり、および／または同じエピトープに結合し、このようなバリアントは一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンに混入されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれか特定の調製方法によって生成されると解釈されるべきではない。本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂを、インビボ産生から得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）刺激Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入して、高濃度の所望のｍＡｂを含む腹水を産生する。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、このような腹水から、または培養上清から精製され得る。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））、ワンアーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ジ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ、またはタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）－ｓｃＦｖ）、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、それぞれは単一の抗原結合部位、および残留「Ｆｃ」フラグメントを有し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。ＶＨ－ＶＬ二量体の３つの表面は、この構成である。ひとまとめにして、６つの超可変領域は、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端でのいくつかの残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を保持するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた、知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、２つの明確に区別できるタイプの１つに割り当てることができる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を、異なるクラスに割り当てることができる。インタクトな抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、があり、これらのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、μと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、周知である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖の２つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディの生成は当技術分野で知られており、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）に記載されている。
「多重特異性抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、ポリエピトープ特異性を有する抗体を包含する。このような多重特異性抗体は、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能性抗体、共有的にまたは非共有的に連結された抗体フラグメント等の抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して調製され得る。例としては、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ，ｐｇ．７７－９６ ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）などの種々の技術が挙げられる。
抗体をインビボで産生する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を使用してインビトロで生成できる。このような組換え抗体の生成は、従来の抗体生成と比較してはるかに速く、それらは膨大な数の抗原に対して生成され得る。さらに、従来の方法を使用する場合、多くの抗原は非免疫原性または非常に毒性があることが判明しており、そのため動物での抗体の生成には使用できない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性および特異性を増加させること）は、非常に単純であり比較的速い。最終的に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体が、１回の選択手順で生成できる。組換えモノクローナル抗体を生成するために、ディスプレイライブラリに全て基づく種々の方法を使用して、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールを生成できる。このようなライブラリは、いくつかの方法で作製され得る：合成ＣＤＲ３領域を重鎖生殖細胞系列遺伝子のプールにクローニングすることおよびそれにより合成レパートリーを生成することにより大きな抗体レパートリーを生成し、それから様々な特異性を有する組換え抗体フラグメントを選択できる。ヒトのリンパ球プールを、抗体ライブラリ構築の出発材料として使用できる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、それにより多様性の高いヒトライブラリを作成することが可能である。この方法は、種々の抗原に対する多数の抗体を選択するために広範にうまく使用されている。バクテリオファージライブラリの構築および組換え抗体の選択のためのプロトコルは、周知の参考テキストであるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２－２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ １７．１に記載されている。
非ヒト抗体は、当技術分野で知られている任意の方法によってヒト化され得る。１つの方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列中に挿入される。さらなる変更をその後、抗体フレームワークに導入して、親和性または免疫原性を調節できる。
いくつかの実施形態では、抗体およびその一部は、抗体、抗体のフラグメント、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗原結合組換えフラグメントおよび天然ナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、またはｓｃＦＶ２フラグメントからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の薬剤をコードする核酸配列を提供する。
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖などの、免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）も含み、それは典型的には、３つの定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびに「ヒンジ」領域を含む。いくつかの状況では、定常領域の存在が望ましい。
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＣＨＩなどの抗原結合抗体フラグメントを含み、ＣＫまたはＣＬドメインは切除されている。ミニボディは従来の抗体よりも小さいため、それらは、臨床／診断における使用でのよりよい組織浸透性を達成するはずであるが、二価であることから、それらはｄＡｂなどの一価抗体フラグメントよりも高い結合親和性を保持するはずである。したがって、特に断らない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子全体だけでなく、上で議論したタイプの抗原結合抗体フラグメントも包含する。コードされたポリペプチドに存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。開示されたタンパク質生成物を構成する個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
適宜、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単離および／または精製され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「非天然起源」物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせ、またはそれらの文法上の変形は、当業者によって「天然起源」と十分に理解されている、あるいは任意の時点で判定者または行政機関または司法機関によって「天然起源」と決定もしくは解釈される、または決定もしくは解釈され得る、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけの条件語である。
いくつかの実施形態では、第１の部分は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１は、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１は、配列番号４（ＩＮＡＭＡ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号５（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号６（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１は、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号８（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ａｂｍ法のナンバリングに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法のナンバリングに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法のナンバリングに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２９（ＩＮＡＭＸ１）で示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＧまたはＡである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、配列番号３０（ＡＩＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＸ４ＴＸ５ＹＡＸ６ＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、ＧまたはＳであり、Ｘ３は、ＧまたはＳであり、Ｘ４は、ＤまたはＳであり、Ｘ５は、ＹまたはＮであり、Ｘ６は、ＤまたはＮである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、配列番号３１（ＤＸ１ＹＧＸ２ＤＹＷＸ３）で示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＥまたはＬであり、Ｘ２は、ＥまたはＳであり、Ｘ３は、ＤまたはＩである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、配列番号３２（ＤＸ１ＹＧＳＤＹＷＸ２）で示されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＥまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＩである。
いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、ＶＨＨ抗体である。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、ラクダ科動物抗体である。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、ラマである。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、本明細書で上述のＣＤＲ以外の他のＣＤＲを含まない。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）を含む、および／またはそれからなる配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨＨ配列は、Ｈｉｓタグをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヒスチジン残基である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、６個のヒスチジン残基からなる。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、リンカーを介してＶＨＨに接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アラニンリピートリンカーである。いくつかの実施形態では、アラニンリピートは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、アラニンリピートリンカーは、３個のアラニン残基からなる。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、６Ｈｉｓ ｔａｇである。
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ２８のストーク領域を特異的に結合することが明らかにされた、Ｈｉｓタグを含むＶＨＨ配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３３、クローン２Ａ１）；ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３４、クローン４Ａ４）；およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３５、クローン４Ａ１）である。
いくつかの実施形態では、ＶＨＨ配列は、ＨｉｓタグのＣ末端でシステインをさらに含む。いくつかの実施形態では、システインは、スペーサーによりＨｉｓタグから分離される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、単一アミノ酸である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシン残基を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＨｉｓタグおよびグリシンによりＨｉｓタグから分離されるＣ末端システインを含むヒトＣＤ２８のストーク領域を特異的に結合することが明らかにされたＶＨＨ配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＣ（配列番号３６）；ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＣ（配列番号３７）；およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＣ（配列番号３８）から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号３９（ＧＹＴＬＴＮＹ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４０（ＮＴＹＴＧＫ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号４１（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４２（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４３（ＲＡＮＲＬＶＤ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号４４（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１２（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１３（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１４（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１５（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１６（ＡＴＳＤＬＡＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１７（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）で示されるアミノ酸配列を含む。この抗体は、本明細書では、Ｍ９と称される。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、アミノ酸配列ＤＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＬＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＦＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＨＷＰＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号４５）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖の可変領域は、配列番号４５を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＣＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号４６）によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号４６からなる。抗体Ｍ９は、配列決定され、配列番号４５からなる重鎖を有することが明らかにされた。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号１２～１４である。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、アミノ酸配列ＱＦＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＭＬＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＤＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＨＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号４７）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖の可変領域は、配列番号４７を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ヌクレオチド配列ＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡ（配列番号４８）によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号４８からなる。抗体Ｍ９は、配列決定され、配列番号４７からなる軽鎖を有することが明らかにされた。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号１５～１７である。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、単量体として結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、二量体として結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、単量体および／または二量体として結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、二量体として結合するが、ｍＣＤ２８を架橋および／または活性化しない。いくつかの実施形態では、第１の部分は、二量体として結合するが、ＣＤ２８の単一分子のみに結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、単量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、二量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、単量体および／または二量体ＣＤ２８に結合する。
いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ２８アゴニストではない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ２８アンタゴニストではない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ２８アゴニストでも、アンタゴニストでもない。
「アゴニスト」という用語は通常、受容体に結合し、受容体を完全にまたは部分的に活性化する分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態では、アゴニストは、天然リガンドと同じ部位で結合する。いくつかの実施形態では、アゴニストは、天然リガンドの結合部位とは異なるアロステリック部位で結合する。「アンタゴニスト」という用語は通常、アゴニストと同じ部位または別の部位で受容体に結合し、受容体を活性化せず、天然リガンドによる受容体の活性化の妨害または遮断、および受容体アゴニストによる受容体の活性化の妨害または遮断の１種または複数を行う分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ｍＣＤ２８に結合するが、受容体の活性化または活性化の遮断をしない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ８６による活性化を遮断しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ｍＣＤ２８に結合しない。
本明細書で使用される場合、「直接アゴニスト／アンタゴニスト」は、受容体（ｍＣＤ２８）に結合し、かつ結合することによりその分子によるシグナル伝達を増加／減少させる、分子を指す。ｍＣＤ２８の場合、アゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、結合することにより細胞内のｍＣＤ２８シグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｔ細胞活性化を増加させる。いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｔ細胞増殖を増加させる。いくつかの実施形態では、アゴニストは、炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる。炎症促進性サイトカインは、当技術分野で周知であり、活性化Ｔ細胞によって分泌されることが知られている。炎症促進性サイトカインの例としては、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－２、およびＩＬ－６が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＦＮγである。いくつかの実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－２である。ｍＣＤ２８の場合、アンタゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、かつ結合することにより細胞中のｍＣＤ２８シグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、Ｔ細胞活性化を減少させ、Ｔ細胞増殖を減少させ、および／または炎症促進性サイトカイン分泌を減少させる。受容体シグナル伝達を改変するために、そのリガンドに接触すること、阻害剤に接触すること、共受容体に接触すること、または当該受容体以外のいずれかの分子に接触することによって受容体のシグナル伝達に影響を与える分子は、直接のアゴニスト／アンタゴニストとはみなされない。いくつかの実施形態では、本発明の薬剤は、血清中のｓＣＤ２８と接触し、それにより細胞上のｍＣＤ２８を介するシグナル伝達の増加を可能にする。結果は増加されたｍＣＤ２８シグナル伝達であるが、抗体は、ｍＣＤ２８へのその結合は受容体シグナル伝達を増加させないため、ｍＣＤ２８のアゴニストまたは直接アゴニストではない。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽または遮断しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ｓＣＤ２８のＩｇＶドメインに結合しない、ＩｇＶドメインへのアクセスを遮蔽または遮断しない。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸２８～１３７を含む。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、アミノ酸配列ＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧ（配列番号４９）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、リガンドへのｓＣＤ２８の結合を阻害しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＯＳＬから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８リガンドは、ＩＣＯＳＬである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８６は、ＣＤ８６－Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０は、ＣＤ８０－Ｆｃである。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＣＤ２８のストーク領域に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８の膜近位領域に結合する。いくつかの実施形態では、ストーク領域は、配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５０）を含む。いくつかの実施形態では、ストーク領域は、配列ＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号５１）を含む。いくつかの実施形態では、ストーク領域は、配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５２）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞外ドメインのフラグメントは、ストーク領域である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８に結合する第１の部分は、ＣＤ２８の切断を防止する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８に結合する第１の部分は、細胞からのＣＤ２８の脱落を防止する。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ストーク領域中の切断部位で結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８内の切断部位で結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、少なくとも１つのプロテアーゼの切断部位で結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＭＭＰ－２内の切断部位で結合する。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽または遮断しない。いくつかの実施形態では、第１の部分は、切断部位に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、切断部位へのアクセスを遮蔽、閉塞、または遮断する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、プロテアーゼ切断部位を結合、遮断、閉塞、または隠蔽する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、プロテアーゼ切断部位に結合しないが、その部位を塞ぐ。いくつかの実施形態では、第１の部分は、プロテアーゼ切断部位へのアクセスを遮断する。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分、これらの組み合わせの薬剤は、プロテアーゼ切断部位を遮断する立体障害を生成する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、プロテアーゼ切断部位に結合しないが、薬剤の結合が、プロテアーゼ切断部位を遮断するｍＣＤ２８に対する立体構造変化を生成する。いくつかの実施形態では、第１の部分の結合は、プロテアーゼ切断部位を遮断するｍＣＤ２８に対する立体構造変化を生成する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ－１３である。いくつかの実施形態では、切断部位は、切断モチーフである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰ－２切断モチーフは、ＰＸＸ／Ｘであり、最後のＸは、疎水性残基である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８のＰＸＸ／Ｘモチーフは、ＰＳＰ／Ｌである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号２０のアミノ酸１４２～１４５（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号２１のアミノ酸１２４～１２７（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号５２のアミノ酸９～１２（ＰＳＰＬ）である。いくつかの実施形態では、第１の部分は、プロテアーゼの切断部位へのアクセスを遮断する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ｍＣＤ２８のストークドメイン中のＰＳＰＬに結合する。
いくつかの実施形態では、切断部位は、ロイシンの前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、バリンの前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、ロイシン、バリンおよび／または芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態では、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジンから選択される。いくつかの実施形態では、切断部位は、配列番号２０のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、およびフェニルアラニン１４６のいずれか１つの前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、配列番号２０のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、またはフェニルアラニン１４６の前にある。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、切断部位は、配列番号２０のロイシン１４５の前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、配列番号１のロイシン１４５の前にある。いくつかの実施形態では、切断部位は、配列番号２１のロイシン１２７の前にある。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域に結合しない。いくつかの実施形態では、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、プロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態では、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、メタロプロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態では、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼの基質ではない。いくつかの実施形態では、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ－２）の基質ではない。いくつかの実施形態では、変異切断部位を有するＣＤ２８のストーク領域は、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ＭＭＰ－１３）の基質ではない。いくつかの実施形態では、変異切断部位は、配列番号２０のロイシン１４５の変異である。いくつかの実施形態では、変異切断部位は、配列番号２０のロイシン１４５のアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、配列番号２０のロイシン１４５のアミノ酸置換は、リジンである。
いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ２８機能および／またはシグナル伝達を調節しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ｍＣＤ２８を分解しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ｍＣＤ２８分解をもたらさない、または促進しない。いくつかの実施形態では、シグナル伝達は、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化である。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、免疫細胞活性化を阻害しない。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、ＣＤ２８受容体内部移行または再利用を誘導しない。ｍＣＤ２８を介する共刺激が、Ｔ細胞の免疫活性化のために不可欠である。タンパク質分解性切断は、膜に残るタンパク質の膜貫通部分および細胞質部分からＣＤ２８の細胞外領域中のリガンド結合ドメインを除去する。したがって、切断されたＣＤ２８は、シグナル伝達できず、Ｔ細胞の活性化に寄与できない。したがって、切断を遮断し、かつアンタゴニストでもある薬剤は、ｍＣＤ２８の活性化を可能にしない。同様に、切断を遮断するがアゴニストでもある薬剤は、異常なＴ細胞活性化、および潜在的に自己免疫応答を誘導し得る。
いくつかの実施形態では、薬剤は、免疫細胞上のｍＣＤ２８の表面レベルを低減しない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｍＣＤ２８の表面レベルを５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、７、５、３、２または１％未満だけ低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、細胞への薬剤の結合は、細胞を死滅させない。いくつかの実施形態では、細胞への薬剤の結合は、細胞の死につながらない。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体であり、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体の結合によって媒介される細胞死を低減するように変異されたＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆｃ受容体結合ドメインを変異させる。いくつかの実施形態では、抗体のＦｃドメインは、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは両方を低減するように操作または変異される。Ｆｃ操作は当技術分野で周知であり、抗体媒介性細胞死滅を低減することが知られている任意の変異またはアミノ酸変化を、使用し得る。
いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、Ｆｃドメインを欠く。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、Ｆｃドメインを欠く抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、ラクダ科動物抗体、サメ抗体またはナノボディである。
いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、非抗体タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１の部分、第２の部分または両方は、小分子である。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、核酸分子である。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、合成ペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、合成結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、合成ペプチドは、非抗体足場をベースにする。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、抗体ミメティックである。いくつかの実施形態では、抗体ミメティックは、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ｋＤａ未満のモル質量を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、薬剤、第１の部分、第２の部分、またはこれらの組み合わせは、核酸アプタマーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。抗体ミメティックの例は、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびｎａｎｏＣＬＡＭＰＳを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体ミメティックは、ＤＡＲＰｉｎである。
いくつかの実施形態では、第１の部分は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を阻害する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、システインプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、スレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリン、システインまたはスレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グルタミン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システインおよびスレオニンプロテアーゼから選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、アスパラギンペプチドリアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、シェダーゼである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、エンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、亜鉛触媒である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、コバルト触媒である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ－１３（ＭＭＰ－１３）である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ－２、および／またはＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、および／またはＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－１３、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはこれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドではない遮蔽分子に融合される。本明細書で使用される場合、「遮蔽分子」という用語は、第１の部分を分解、排出または除去から保護する部分を指す。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、コポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、生分解性ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、多糖類ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、タンパク質ポリマーである。いくつかの実施形態では、タンパク質ポリマーは、非構造化タンパク質ポリマーである。ポリマーの例としては、限定されないが、天然ポリサッカライド、半合成ポリサッカライド、Ｏ結合型オリゴ糖、Ｎ結合型オリゴ糖、デキストラン、アガロース、アルギネート、キトサン、カラギーナン、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、ヒアルロン酸、ホモアミノ酸ポリマー、エラスチン様ポリマー、ＸＴＥＮ、ＰＡＳ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ－Ｄ，Ｌ－乳酸（ＰＤＬＬＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、生体適合性ポリマーである。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、ＰＬＡ、およびＰＤＬＬＡから選択される。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ＰＬＧＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ＰＧＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ＰＬＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ＰＤＬＬＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、デキストラン、アガロース、アルギネート、キトサン、カラギーナン、ＨＥＳ、ポリシアル酸およびヒアルロン酸から選択されるオリゴ糖ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、ＸＴＥＮおよびＰＡＳから選択されるタンパク質ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、遮蔽分子は、複数のＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＥＧ分子または複数のＰＥＧ分子に融合されたポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリペプチドを含むが、ＰＥＧ分子を含まない。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリマー分子にまたは複数のポリマー分子に融合されたポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、複数のＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、直鎖ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、鎖状ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧの鎖である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧメチルエーテルを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧジメチルエーテルである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、低分子量ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、高分子量ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、１５０００または２００００グラム／モルの分子量を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、最大で５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００グラム／モルの分子量を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、１５０００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００グラム／モルの分子量を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも２ＫＤａのモル質量を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも２ＫＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２～４０ＫＤａのモル質量を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２～４０ＫＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、２ｋＤａ未満のＰＥＧは、半減期延長をもたらさない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、カルボン酸残基でポリペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、システイン残基でポリペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、アスパラギン酸残基でポリペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、グルタミン酸残基でポリペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、リジン残基でポリペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基またはシステイン残基でポリペプチドに付着され、各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、チオール連結を介してシステインにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、第１の部分のＣ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、リンカーのＣ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、第１の部分のＣ末端の近位のアミノ酸残基にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、リンカーのＣ末端の近位のアミノ酸残基にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、近位は、１０アミノ酸以内である。当業者なら、Ｃ末端に近接したコンジュゲーションは、ＰＥＧ部分をＣＤＲから離して保持し、それにより結合に干渉する機会を低減することを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「ペグ化」は、分子およびマクロ構造へのＰＥＧの共有結合性および共有結合性の両方の付着または融合の過程である。ペグ化の方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，６１０，１５６号で開示され、この特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、第１の部分に直接コンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、リンカーに直接コンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、不可逆的コンジュゲーションである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは化学基にコンジュゲートされ、化学基は、第１の部分に結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは化学基にコンジュゲートされ、化学基は、リンカーに結合される。いくつかの実施形態では、化学基と第１の部分またはリンカーとの間の結合は、可逆的である。例えば、ＳＰＤＰ基（２－ピリジル－ジチオ、ＯＰＳＳ－オルト－ピリジンジスルフィドとしても知られる）で置換されたＰＥＧは、上記の基を介してシステイン残基と反応して、可逆的ジスルフィド結合を形成できる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、不可逆的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、可逆的にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを含む。いつかの実施形態では、少なくとも２つの部分は、少なくとも１つのリンカーにより分離される。いつかの実施形態では、少なくとも２つの部分は、リンカーにより分離される。いつかの実施形態では、２つの部分は、リンカーにより分離される。いつかの実施形態では、２つの部分は、リンカーにより接合される。いつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも２つの部分の間にリンカーを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は第１の部分と第２の部分の間にリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルリンカーである。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、少なくとも１つのＧＧＧＧＳ（配列番号１８）配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、少なくとも１つのＧＧＧＳ配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、少なくとも１つのＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、１、３、または７個のＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、１つのＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、３個のＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーは、７個のＧＧＧＧＳ反復を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ｍＣＤ２８への第１の部分の結合を可能にするのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、その標的エピトープへの第１の部分の結合を可能にするのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞上のｍＣＤ２８のストーク領域への第１の部分の結合を可能にするのに十分な長さである。当業者なら、細胞表面上のｍＣＤ２８のストーク領域に結合できる小さい部分への保護部分の接続は、保護部分が、第１の部分の結合する能力を乱す可能性のある立体障害を生成しないように、十分な長さである必要があることを理解するであろう。従って、リンカーは、第１の部分がストークドメインにアクセスすることを可能にする第１の部分の一連の動きを許容するために十分な長さのものである必要がある。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｍＣＤ２８架橋を誘導しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、免疫活性化を誘導するｍＣＤ２８架橋を誘導しない。
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチドである。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、ＧＣである。 いくつかの実施形態では、リンカーは、システインを含む。いくつかの実施形態では、システインは、Ｃ末端システインである。いくつかの実施形態では、システインは、Ｃ末端に対し近位である。いくつかの実施形態では、近位は、Ｃ末端の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、３、２または１個のアミノ酸以内である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、近位は、Ｃ末端の１０個のアミノ酸以内である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端は、第１の部分のＣ末端である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端は、リンカーのＣ末端である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも３５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で、１５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で２０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で３０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で３５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で４０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～１００、５～７５、５～５０、５～３５、５～１５、１０～１００、１０～７５、１０～５０、１０～３５、１０～３０、１０～２０、１５～１００、１５～７５、１５～５０、１５～３５、１５～３０、１５～２０、２０～１００、２０～７５、２０～５０、２０～３５、２０～３０、２５～１００、２５～７５、２５～５０、２５～３５、２０～３０、３５～１００、３５～７５または３５～５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～３５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５～３５個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５～５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５～５０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０～２０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０～３０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５～２０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５～３０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０～４０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０～４０個のアミノ酸を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＮ末端は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分のＣ末端は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分のＮ末端は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端はリンカーに連結され、第２の部分のＮ末端はリンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＮ末端はリンカーに連結され、第２の部分のＣ末端はリンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端は、ペプチドリンカーのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＮ末端は、ペプチドリンカーのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分のＣ末端は、ペプチドリンカーのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分のＮ末端は、ペプチドリンカーのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＣ末端はペプチドリンカーのＮ末端に連結され、ペプチドリンカーのＣ末端は、第２の部分のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分のＮ末端はペプチドリンカーのＣ末端に連結され、ペプチドリンカーのＮ末端は、第２の部分のＣ末端に連結される。
本明細書で使用される場合、「連結された」という用語は、それにより２つの部分が安定に接続される、当該技術分野において既知のいずれかの付着の方法を指す。いくつかの実施形態では、連結されたは、共有的連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、ペプチド連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、可逆的連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、不可逆的連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、アミノ連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、チオール連結である。いくつかの実施形態では、連結されたは、セリン連結である。いくつかの実施形態では、連結は、アミノ酸の側鎖への連結である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、システインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１個のシステインを含む。いくつかの実施形態では、第１の部分はリンカーのＮ末端に連結され、システインはリンカーのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の部分はリンカーのＣ末端に連結され、システインはリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、システインを含むリンカーは、ヒスチジンタグを含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンタグは、複数のヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンタグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヒスチジンを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ヒスチジンタグは、６個のヒスチジンを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、システインに付着される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、システインに付着される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、チオール連結を介してシステインに付着される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、１つまたは複数のチオール反応性基を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、少なくとも１つのチオール反応性基を含む。チオール反応性基の例としては、ＯＰＳＳ、マレイミド、ビニルスルホンおよびヨードアセトアミド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、チオール結合を介してシステインに付着される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、１つまたは複数のチオール反応性基を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、１つのチオール反応性基を含む。いくつかの実施形態では、チオール反応性基は、ＯＰＳＳ、マレイミド、ビニルスルホンおよびヨードアセトアミド官能基から選択される。
いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８に結合する第１の部分は、１００ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８に結合する第１の部分は、５０ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８に結合する第１の部分は、２５ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８に結合する第１の部分は、２０ｋＤａより小さい。いくつかの実施形態では、ｍＣＤ２８に結合する第１の部分は、１５ｋＤａより小さい。
いくつかの実施形態では、薬剤は、第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、リンカーにより第１の部分に接続される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、遮蔽分子を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、遮蔽部分である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、保護部分である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第１の部分を保護する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第１の部分を遮蔽する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める。いくつかの実施形態では、安定性を高めることは、生理液中で安定性を高めることである。いくつかの実施形態では、生理液は、生体液である。いくつかの実施形態では、体液は、血清、血清、胃液、腸液、唾液、胆汁、腫瘍液、母乳、尿、間質液、および便からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、生体液は、血液である。いくつかの実施形態では、血液は、全血または全血清である。いくつかの実施形態では、血液は、血清である。いくつかの実施形態では、血液中での安定性を高めることは、血液からの排出を低減することを含む。いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、血液からの第１の部分の排出を低減することである。いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、血液からの薬剤の排出を低減することである。いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、腎臓濾過を低減すること、リソソーム分解を低減することまたは両方を含む。いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、腎臓濾過を低減することを含む。いくつかの実施形態では、血液からの排出を低減することは、リソソーム分解を低減することを含む。いくつかの実施形態では、安定性を高めることは、第１の部分の半減期を延長することを含む。いくつかの実施形態では、安定性を高めることは、分解を低減することを含む。いくつかの実施形態では、分解は、プロテアーゼによる分解を含む。いくつかの実施形態では、分解は、リソソームによる分解を低減することを含む。いくつかの実施形態では、排出を低減することは、腎臓系または腎糸球体により濾過される第１の部分の比率を低減することを含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第１の部分の安定性を高める、第１の部分の排出を低減する、第１の部分の分解を低減する、またはこれらの任意の組み合わせである。対象中のタンパク質の安定性を測定することは、当該技術分野において明確に特徴づけられており、いずれかの方法を実施してよい。いくつかの実施形態では、流体中の分子濃度の測定は、安定性を計算するために、種々の時点で実施される。
当業者なら、第２の部分の機能が、増加する、減少する、強化する、低減するまたは任意の比較尺度で表現される場合、この比較は、第１の部分単独に対して比較されることを理解するであろう。リンカーに連結された第１の部分に対する比較もまた想定される。いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０ ３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００％の増加である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、減少は、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の減少である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清または血液分子を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、血清または血液分子は、ヒト分子である。いくつかの実施形態では、分子は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞上の受容体により結合され得る。いくつかの実施形態では、受容体による結合は、細胞中への取り込みを可能にする。いくつかの実施形態では、取り込みは、血液中へ戻すことを可能にする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、血清アルブミンである。好ましくは、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、アミノ酸配列ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号６５からなる。
いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清タンパク質に結合する分子を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清タンパク質に結合するポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清タンパク質に結合する脂質を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清アルブミンに結合するポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡに結合するポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、血清アルブミンに結合する脂質を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡに結合する脂質を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、脂質は、脂肪酸または脂肪酸誘導体である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡ結合ポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＨＳＡ結合脂質を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびＨＳＡに特異的に結合するペプチドから選択される。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、ＨＳＡに特異的に結合するペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、第２の部分は、配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡ（配列番号１９）を含む、またはそれからなる、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡに結合する単一ドメイン抗体は、Ａｌｂ８である。
別の態様により、本発明の薬剤をコードする核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒト細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターで提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本発明の薬剤をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
用語「核酸」は、当該技術分野においてよく知られている。本明細書で使用される場合、「核酸」は一般的に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡの分子、またはその誘導体もしくは類似体を指す。核酸塩基は、例えば、ＤＮＡ中で認められる天然起源プリンまたはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）またはＲＮＡ中で認められる天然起源プリンまたはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）を含む。用語「核酸分子」は、限定されないが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび他の短干渉核酸などの小型ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｎＲＮＡ、小型ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、循環核酸、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメント、分解核酸、リボザイム、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、感染起源の核酸、増幅産物、改変核酸、プラスミドまたはオルガネラ核酸およびオリゴヌクレオチドなどの人工核酸を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、薬剤の第１の部分をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、薬剤の第２の部分をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、薬剤の第１および第２の部分の両方をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、薬剤の第１の部分のみをコードする。いくつかの実施形態では、第１および第２の部分のためのコード配列は、同じ核酸分子上に配置される。いくつかの実施形態では、第１および第２の部分のためのコード配列は、別々の核酸分子上に配置される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、核酸によりコードされない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本発明の薬剤またはその一部をコードする１つまたは複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本発明の薬剤のための１つまたは複数のコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の部分のためのコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第２の部分のためのコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１および第２の部分のためのコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１および第２の部分のためのコード配列を含み、第１および第２の部分のためのコード配列は、インフレームであり、従って融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、リンカーのためのコード配列により分離された第１および第２の部分のためのコード配列を含み、第１の部分、リンカーおよび第２の部分のためのコード配列は、インフレームであり、従って融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、インフレームで第１および第２の部分のためのコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、リンカーのためのコード配列により分離された第１および第２の部分のためのコード配列を含み、第１の部分、リンカーおよび第２の部分のためのコード配列は、インフレームである。
いくつかの実施形態では、薬剤をコードする核酸配列またはその一部は、プロモーターに作動可能に連結される。「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）を可能にするように調節エレメントに連結されることを意味すると意図される。
使用の方法
別の態様により、それを必要とする対象において癌を治療するおよび／または予防する方法が提供され、方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様により、それを必要とする対象において免疫療法を改善する方法が提供され、方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
別の態様により、それを必要とする対象においてｓＣＤ２８を減少させる方法が提供され、方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、免疫療法は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、療法は、ＰＤ－１チェックポイントの遮断を含む。いくつかの実施形態では、免疫療法は、同種の、同系の、または自己の免疫細胞を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫療法を必要とする対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態では、癌は、ｓＣＤ２８陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、高ｓＣＤ２８の癌である。いくつかの実施形態では、対象は、癌を発症するリスクを有する。
本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「治療」または「治療すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の軽減、その重症度の低減、またはその進行の阻害を包含する。治療は、疾患、障害、または状態が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な治療であるためには、本明細書における有用な組成物は、疾患、障害、もしくは状態の重症度を軽減する、それに関連する症状の重症度を軽減する、または患者もしくは対象の生活の質の改善を提供するだけでよい。
いくつかの実施形態では、減少させることは、対象に少なくとも１つの本発明の薬剤を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与」などの用語は、健全な医療行為において、治療的効果を提供するような様式で対象に活性剤を含む組成物を送達する、任意の方法を意味する。本主題の一態様は、それを必要とする患者への治療的有効量の本発明の薬剤の経口投与を提供する。他の適切な投与経路は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内を含み得る。
別の態様により、本発明の薬剤および治療上許容される担体、補助剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、投与することは、本発明の医薬組成物を投与することである。
本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「補助剤」という用語は、活性薬剤ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水などの無菌水性媒体を指す。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；発熱物質を含まない水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用される他の非毒性適合性物質である。本明細書において担体として機能し得る物質のいくつかの非限定例は、糖、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、ポリオール、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、および他の医薬製剤で使用される他の非毒性の医薬適合性物質を含む。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および滑剤、ならびに賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。任意の非毒性の、不活性のおよび有効な担体が、本明細書で企図される組成物を製剤化するために使用され得る。
担体は、全体で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、または分解をもたらさない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを低下させない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを維持する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを増加させる。
いくつかの実施形態では、低減は、ｓＣＤ２８の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、低減は、血清ｓＣＤ２８の低減である。いくつかの実施形態では、低減は、ｓＣＤ２８の血中レベルの低減である。いくつかの実施形態では、低減は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のｓＣＤ２８レベルの低減である。
いくつかの実施形態では、対象の血液は、上昇したレベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、減少させる前の対象の血液は、上昇したレベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、レベルは、健康な対象のレベルよりも上昇する。いくつかの実施形態では、対象のｓＣＤ２８レベルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％、健康な対象のレベルよりも上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌの血液を超えて上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、レベルは、５ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態では、レベルは、１０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態では、レベルは、２０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態では、対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、減少する前の対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、減少する前の対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、減少する前の対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、減少する前の対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態では、癌は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法で治療できる癌である。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けたことがある。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に対する非奏効者である。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に対してナイーブである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法と一緒に行われる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の前に行われる。
いくつかの実施形態では、方法は、対象に別の免疫療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、別の免疫療法は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施形態では、別の免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ベースの免疫療法である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ－ＮＫである。いくつかの実施形態では、別の免疫療法は、癌ワクチンである。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」および「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」という用語は、少なくとも１つの目的のタンパク質（例えば、エピジェネティック修飾剤での処理後に発現が増加した免疫原性タンパク質）に対する特異性を有し、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞）にグラフト化される、操作された受容体を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞にグラフト化されたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞にグラフト化されたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔ細胞から選択される。
ＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ－ＮＫ細胞ならびにそれらのベクターは、当技術分野で周知である。そのような細胞は、受容体が結合するタンパク質を標的とし、それに対し細胞傷害性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、複数のウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、エピジェネティック修飾剤との接触により発現が増加したウイルスタンパク質を標的とする。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築は、当技術分野で周知である。１つの非限定的な例では、ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製でき、その後、抗体をコードするベクターが構築される。ベクターはまた、共刺激シグナル領域を含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル領域は、既知のＴ細胞またはＮＫ細胞刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、次の少なくとも１つから選択される：ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド。いくつかの実施形態では、ベクターはまた、ＣＤ３Ｚシグナル伝達ドメインも含む。このベクターはその後、例えばレンチウイルス感染により、Ｔ細胞中に遺伝子導入される。
いくつかの実施形態では、癌は、上昇したｓＣＤ２８レベルを有する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態では、上昇した、および／または高いｓＣＤ２８レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍｌのレベル、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、癌は、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態では、上昇したｓＣＤ２８レベルおよび／または高いｓＣＤ２８レベルは、健康な対象で、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５％のレベル、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌ではない。いくつかの実施形態では、癌は、メラノーマ、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌および結腸直腸癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、メラノーマ、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、メラノーマ、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌または結腸直腸癌である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
キット
別の態様により、本発明の少なくとも１つの薬剤、または本発明の医薬組成物を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の薬剤がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法薬とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの治療薬が本発明の抗体または医薬組成物とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む。
別の態様により、本発明の抗体または医薬組成物とともに使用するためのものであることを示すラベルを含む、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法薬を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、癌の治療における使用のためである。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、診断キットである。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、それを必要としている対象でｓＣＤ２８の血清レベルを測定することにおける使用のためである。いくつかの実施形態では、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明の薬剤または医薬組成物で治療される対象の適合性を決定することにおける使用のためである。いくつかの実施形態では、キットは、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法で治療される対象の適合性を決定することにおける使用のためである。
薬剤生成の方法
別の態様では、本発明の薬剤を生成する方法が提供され、方法は：
ａ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する第１の部分を得ること；
ｂ．リンカーによりタンパク質安定性を高める第２の部分に第１の部分を連結して連結された薬剤を生成すること、および細胞表面上のｍＣＤ２８への連結された薬剤の結合を試験すること；および
ｃ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する連結された薬剤を選択すること、
の少なくとも１つを含み、
それにより本発明の薬剤を生成する。
別の態様では、本発明の薬剤を生成する方法が提供され、方法は：
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列が、
ｉ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する第１の部分を得ること；
ｉｉ．リンカーによりタンパク質安定性を高める第２の部分に第１の部分を連結して、連結された薬剤を生成すること、および細胞表面上のｍＣＤ２８への連結された薬剤の結合を試験すること；および
ｉｉｉ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する連結された薬剤を選択すること、
により選択された薬剤のものである、培養すること
を含み、
それにより本発明の薬剤を生成する。
いくつかの実施形態では、連結することは、リンカーへ第１の部分を連結することを含む。いくつかの実施形態では、連結することは、リンカーへ第２の部分を連結することを含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第１の部分に付着されたリンカーに連結される。いくつかの実施形態では、第１の部分は、第２の部分に付着されたリンカーに連結される。いくつかの実施形態では、連結することは、連結の化学過程を含む。ペプチド連結ならびに化学的連結の方法は、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような方法を採用し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞表面上のｍＣＤ２８のプロテアーゼによる切断を遮断する薬剤の能力を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗切断剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、脱落防止剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象においてｓＣＤ２８の脱落を減少させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｍＣＤ２８の切断を減少させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象においてｍＣＤ２８の切断を減少させる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ－２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはそれらの組み合わせである。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８の細胞外ドメイン」という用語は、膜貫通ドメインの前に来るＣＤ２８のＮ末端部分を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ａである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ストークドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８のストークドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、配列ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５３）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントは、二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントは、単量体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントは、二量体または単量体である。
本明細書で使用される場合、「フラグメント」は、より大きなタンパク質またはタンパク質ドメインの一部を構成する部分的ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の細胞外ドメインのフラグメントに結合する薬剤を取得することは、ＣＤ２８ストークドメインに特異的に結合する薬剤を取得することである。
いくつかの実施形態では、方法は、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすること、およびｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的にアゴナイズせず実質的にアンタゴナイズもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択することは、ｍＣＤ２８シグナル伝達をアンタゴナイズしない少なくとも１つの薬剤を選択することである。当業者なら、癌の治療のためにＣＤ２８シグナル伝達をアゴナイズすることは有害ではないかもしれないが、シグナル伝達をアンタゴナイズすることは逆効果であることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、薬剤の存在下および非存在下において、活性化された免疫細胞の血清中のｓＣＤ２８を測定することを含む。いくつかの実施形態では、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、薬剤、プロテアーゼおよびＣＤ２８の細胞外ドメインまたは切断部位を含むそのフラグメントの混合を含む。いくつかの実施形態では、試験することは、ＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを配列決定して、短縮および／または切断をチェックすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、試験することは、切断によるサイズ変化を測定するのに十分な感度を有するゲル上で、ＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを泳動することをさらに含む。いくつかの実施形態では、試験することは、薬剤およびプロテアーゼの存在下で、ｍＣＤ２８を発現する細胞からのｓＣＤ２８の生成を測定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、血液中の連結された薬剤の安定性をアッセイすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、血液中で増加された安定性を有する連結された薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、増加された安定性をアッセイすることは、第１の部分単独の安定性と比較することである。いくつかの実施形態では、増加された安定性をアッセイすることは、リンカーに連結された第１の部分単独の安定性と比較することである。タンパク質安定性のアッセイ方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書記載の方法を含む。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、血液または血清中で薬剤をインキュベートすること、および種々の時点で薬剤濃度を測定することである。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、薬剤をモデル動物に投与すること、および種々の時点で動物の血液中の薬剤濃度を測定することである。いくつかの実施形態では、対象動物は、げっ歯類である。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、マウスである。当該技術分野において既知の安定性、半減期および／または血中滞留をアッセイする任意の方法を用い得る。
いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、上記ＣＤ２８細胞外ドメインまたはそのフラグメントでサメまたはラクダ科動物を免疫化すること、および上記免疫化された生物から抗体を収集することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはそのフラグメントへの結合に関し薬剤のライブラリをスクリーニングすること、および結合する薬剤を選択することを含む。
いくつかの実施形態では、抗体を収集することは、免疫化されたサメまたはラクダ科動物の脾臓から、Ｂ細胞を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、メラノーマ細胞と融合されて、ハイブリドーマを生成する。いくつかの実施形態では、抗体は、ハイブリドーマの培地から収集される。いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはそのフラグメントで生物を免疫化すること、および免疫化された生物から抗体を収集することを含む。いくつかの実施形態では、生物は、マウスである。いくつかの実施形態では、生物は、ウサギ、マウス、ラット、サメ、ラクダ科動物、ニワトリ、ヤギおよびファージから選択される。いくつかの実施形態では、ラクダ科動物は、ラクダおよびラマから選択される。いくつかの実施形態では、収集することは、採血を含む。いくつかの実施形態では、収集することは、
ａ．免疫化された生物の脾臓からＢ細胞を抽出すること；
ｂ．抽出されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成すること；および
ｃ．ハイブリドーマから抗体を収集すること、
を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはそのフラグメントへの結合に関し薬剤のライブラリをスクリーニングすること、およびそのように結合する薬剤を選択することを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ファージディスプレイライブラリである。いくつかの実施形態では、ライブラリは、脾臓Ｂ細胞に由来する免疫化ライブラリである。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ＩｇＧライブラリである。いくつかの実施形態では、ライブラリは、Ｆａｂライブラリである。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ＶＨＨ抗体のライブラリである。いくつかの実施形態では、ライブラリは、単鎖、単一ドメインまたはナノボディのライブラリである。いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤を取得することは、薬剤の組換え型を生成することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤を選択することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤を選択することは、薬剤の組換え型を生成することを含む。いくつかの実施形態では、組換え型は、薬剤の配列から生成される。いくつかの実施形態では、方法は、薬剤をヒト化することをさらに含む。
細胞内で薬剤をコードする核酸分子を発現させることは、当業者に周知である。それは、多くの方法の中でも特に、遺伝子導入、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接変更によって実行できる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、プラスミドまたはウイルスベクター等の発現ベクター中にある。ｐ１６－Ｉｎｋ４ａを含む発現ベクターの１つのそのような例は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能な哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ ｐ１６ ＩＮＫ４Ａである。
ベクター核酸配列は通常、少なくとも細胞内での増殖のための複製起点、および任意選択で、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニン配列などの追加のエレメントを含む。
ベクターは、非ウイルス法によりまたはウイルス法により送達されるＤＮＡプラスミドであってよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであってよい。プロモーターは、哺乳動物細胞において活性であり得る。プロモーターは、ウイルスプロモーターであってよい。
別の態様により、本発明の方法によって生成される薬剤が提供される。
別の態様により、本発明の方法によって生成された薬剤、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む医薬組成物が提供される。
本明細書で使用される場合、値と組み合わせたときの「約」という用語は、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に既知のその同等物などへの言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、いずれか任意の要素を除外するように記載されてもよいことに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」などの排他的な用語を使用するための先行基準として機能することが意図される。
「Ａ、Ｂ、およびＣ等の少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される事例では、概して、このような構造は、当業者が慣例を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、ならびにＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に等を有する系を含むがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替的な用語を提示する実質的にどのような離接的な単語および／または句が、用語の１つ、用語のいずれか、またはいずれの用語も含む可能性を企図すると理解されるべきであることは当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態として説明される本発明の種々の特徴は、別々にまたは任意の好適な副組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、全ての組み合わせが個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、すべてのそのような部分的組み合わせが本明細書で個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。
本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図しない、以下の実施例を検討すると、当業者には明らかになるであろう。さらに、上記で説明されおよび以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される、本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的裏付けが認められる。
上記で説明し、以下の特許請求の範囲で請求する本発明の様々な実施形態および態様に関して、以下の実施例において実験的裏付けが明らかになる。
実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載される方法論；”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、を参照されたい。これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書全体を通して提供される。
材料および方法
抗体－市販のマウスモノクローナル抗ＣＤ２８クローン＃ＣＤ２８．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０２）およびＦＩＴＣコンジュゲート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０６）。ヤギポリクローナル抗ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＡＦ－３４２－ＰＢ）。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＰＤ－Ｌ１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８０６５）。ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＰＤ－Ｌ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５５０８）。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩＤＯ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＩＣ６０３０Ｐ）。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５３２２）。ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９－６０５－１４９）。ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３５－０７１）。抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３０４）。抗ヒトＰＤ－１ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４５０６）。
ヒトＣＤ２８受容体のストーク領域を標的とするＶＨＨの単離－ナイーブな非免疫化ラマに由来する末梢血Ｂ細胞の遺伝コードを使用して、Ｃ末端Ｈｉｓ６－Ｍｙｃタグを有する融合タンパク質として個々のＶＨＨを発現する粒子からなるファージライブラリを構築した。ナイーブライブラリを使用して、ヒトＣＤ２８のストーク領域に結合する能力を有するナノボディを選択した。スクリーニングを、Ｃ末端にビオチンを付加した「ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５２）」の配列を有するビオチン化組換えＣＤ２８－Ｆｃキメラまたは酸化二量体ペプチドを用いて行った。各抗原を、脱脂乳でブロックされたストレプトアビジン磁気ビーズに結合させた。ファージの溶液中選択を、ファージの入力量および抗原濃度を変化させて、３つの連続した選択ラウンド全体にわたり同じ抗原を使用して実施した。抗原を含まないブロックされたビーズを、対照として使用した。結合したファージの溶出を、トリプシンを用いて２０分間行った。溶液中選択での濃縮比を、ＣＤ２８抗原選択条件から溶出されたファージの数の、抗原選択条件なしから溶出されたファージの数に対する比として計算した。選択された出力の２７９個の個々のファージモノクローンを、ファージまたはペリプラズムのいずれかのフォーマットで、ＥＬＩＳＡにより抗原結合について検証し、フローサイトメトリーにより膜状ＣＤ２８への結合について特徴付けた。７２個のクローンは、ペリプラズム形式でストーク領域ペプチドへの特異的結合を示し、２２個は、ユニークなＣＤＲ配列を有することが証明され、６個のみが、特徴的なＣＤＲ３ファミリーに属すると明らかにされた。６個のＶＨＨを、ＣＨＯ細胞中で、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する組換えタンパク質として生成し、抗脱落活性および細胞結合を評価した。遺伝子導入－ＣＤ２８ｗｔ（全長ＣＤ２８転写物をコードする）プラスミドを、ＤＮＡ配列をＰＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングすることによって生成した。遺伝子導入を、Ｊｅｔ Ｐｅｉ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を使用して行った。安定な遺伝子導入体を、Ｇ４１８含有培地中で選択した。
ＥＬＩＳＡ－市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトインターフェロン－γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０１０３）、ヒトインターロイキン２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３１８０２）、ヒトインターロイキン６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０５０２）、ヒトインターロイキン１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０６０３）、ヒト腫瘍増殖因子ベータ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３６７０８）、ヒトインターロイキンベータ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３７００４）およびヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＤＹ３４２）の量を定量した。細胞増殖および生存率アッセイ（ＭＴＴアッセイ）を、製造元（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１４６５００７００１）の指示に従い行った。キヌレニン（ＩＤＯ活性）ＥＬＩＳＡキットを、製造元（ＩｍｍｕＳｍｏｌ、カタログ番号ＢＡ Ｅ－２２００）の指示に従い実施した。
ＣＤ２８ストーク領域結合アッセイ－ビオチンコンジュゲート野生型またはＬ１４５Ｋ ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを、ニュートラアビジンをコートしたＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートに固定化した。ＶＨＨクローンの段階希釈（０．２～５μｇ／ｍＬ）を行い、結合したＶＨＨの検出を、抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて行い、発色を、ＴＭＢを用いて行った。
サイトカインマルチプレックス－いくつかのサイトカインの同時評価を、Ｍａｇｐｉｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＰｒｏｃａｒｔａＰＬｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＰＸ－０７－ＭＸＸＧＰＹ２）を使用して行った。
フローサイトメトリー－通常、細胞を、すべてのステップで氷上で保持した。染色する前に、５ｘ１０５個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）中の５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１４５０６）で１５分間ブロックした。抗ＣＤ２８ ＶＨＨ構築物を、示した濃度で使用した。Ａｌｂ－８構築物を用いた場合、混合物に、組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９７３１）を補充した。抗体を、製造元が推奨する濃度で使用し、暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーションを、９６ウェルＵ底プレートで１００μＬの体積で行った。細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中のＦＡＣＳチューブに移した。細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ＳｏｆｔｗａｒｅのＫａｌｕｚａを使用して、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
細胞株およびヒト免疫細胞の単離－Ｊｕｒｋａｔ白血病性Ｔ細胞リンパ芽球細胞株クローンＥ６．１およびＳＣＣ－２５舌扁平上皮癌を、ＡＴＣＣから取得した。ＰＢＭＣを、標準的なリンパ球分離培地（ＭＢＰ、カタログ番号８５０４９４）を使用して、健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ３細胞を、ＲｏｓｓｅｔｔｅＳＥＰ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１５０６１）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ４細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４ Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９０５９）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。単球を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５２）を使用して、ネガティブ選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。すべての細胞を、１０％のＨＩ－ＦＣＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で成長させた。
ＣＤ８６遮断ＦＡＣＳ－ヒトＣＤ２８で安定に遺伝子導入された０．５ｘ１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、室温で３０分間、示した濃度での抗ＣＤ２８脱落ナノボディ有りでまたはなしで２μｇ／ｍＬのＣＤ８６－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４１－Ｂ２）とインキュベートした。細胞を、洗浄し、氷上で２０分間、１：５０００希釈でフルオロフォアにコンジュゲートされた抗ヒト重鎖および軽鎖抗体を使用する二次結合のために採取した。Ａｌｂ－８構築物を用いた場合、混合物に、組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９７３１）を補充して、Ａｌｂ－８を飽和させた。
遺伝子導入－ＣＤ２８－ＦＬ（完全長ＣＤ２８転写物をコードする）、ＣＤ８０－ＦＬ（完全長ＣＤ８０転写物をコードする）およびｓｃＯＫＴ３－ＣＤ１４（ＣＤ１４細胞外ドメインに融合されたマウス抗ＣＤ３ ＯＫＴ３クローンの単鎖Ｆｖ部分をコードする）プラスミドを、ＤＮＡ配列をＰＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングすることによって生成した。遺伝子導入を、Ｊｅｔ Ｐｅｉ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を使用して行った。安定な遺伝子導入体を、Ｇ４１８および／またはヒグロマイシン含有培地中で選択した。
樹状細胞の分化－単球を、３日目および６日目にリフレッシュされた成長因子を有するＲＰＭＩ培地で１ｘ１０６／ｍＬの密度で培養した。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５－ＧＭ）および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０４－ＩＬ）により６日間誘導した。必要に応じてｉＤＣを、４８時間１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ４３９１）および２０ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２８５－ＩＦ）の添加により成熟樹状細胞へとさらに分化させた。生成された細胞集団を、関連マーカーのＦＡＣＳ分析により、および特徴的なサイトカインの分泌の分析により、示された表現型について試験した。
メタロプロテイナーゼ－市販の組換えヒトメタロプロテイナーゼＭＭＰ－２は、Ａｎａｓｐｅｃ（カタログ番号ＡＳ－７２００５）またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号９０２－ＭＰ）からのものの両方を使用した。市販の組換えヒトメタロプロテイナーゼＭＭＰ－１３を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号５１１－ＭＭ）から購入した。Ｐｒｏ－ＭＭＰ２およびＰｒｏ－ＭＭＰ－１３を、製造元のプロトコルに従い３７℃で１～２時間、１ｍＭのｐ－アミノフェニル水銀（ＩＩ）アセテート（ＡＰＭＡ）を用いて活性化した。
合成ペプチド－「ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧＧＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５４）－ビオチン」の最終形態を有する基質ペプチドを、Ｎ末端ｃＭｙｃタグ、それに続く５個のグリシン配列と、Ｃ末端ビオチン結合との間のヒトＣＤ２８ストーク領域（Ｈｉｓ１３４～Ｐｒｏ１５２）のアミノ酸配列を含むように設計した。このペプチドを、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ Ｅｕｒｏｐｅによりカスタム合成した。１４１位のシステイン残基を使用して、ジスルフィド連結による二量体ペプチドを生成した。切断部位で１４５位のロイシンがリシンに置換された変異を有するＣＤ２８ストーク領域ペプチドを、「ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧＧＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＫＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号５５）－ビオチン」の最終形態で同様に合成した。
インビトロ切断アッセイ－５０ｎｇのｐｆ精製組換えＭＭＰ－２またはＭＭＰ－１３を、ＭＭＰ阻害剤（ＴＭＩ－１、５０ｎＭ）、様々な濃度（０．４～１０μｇ／ｍＬ）のＭ９ Ｆａｂまたは示されたＶＨＨクローンの存在下もしくは非存在下で、０．１２５μＭの二量体ｃ－Ｍｙｃタグ付きおよびビオチン化基質ペプチドと５時間インキュベートした。アッセイを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＢｒｉｊ－３５、ｐＨ７．５で行った。５時間後、切断反応混合物を、最終１ｎＭ濃度のペプチドに希釈し、ニュートラアビジンプレートにロードして、ペプチドに結合させた。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、未切断ペプチドの検出を、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗ｃＭｙｃ抗体を使用して行う。
可溶性ＣＤ２８を生成するためのＰＢＭＣのＳＥＢまたはＣＭＶ活性化－０．３ｘ１０６個のＰＢＭＣを、４８ウェルプレート中で示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤の有り／無しの場合について、３７℃にて５～７日間０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で刺激した。あるいは、０．１ｘ１０６のＰＢＭＣを、９６ウェルプレートフォーマットアッセイにて０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。ＣＭＶ刺激では、０．５ｘ１０６個のＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中で示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤有り／無しの場合について、３７℃にて２～５日間０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－４３５）で刺激した。連続脱落実験では、ＰＢＭＣを、２４時間２４ウェルプレートにてＳＥＢまたはＣＭＶで刺激し、細胞を、採取し、刺激剤不含のＲＰＭＩで３回洗浄し、９６ウェルプレートに再度播種した。試料を、指示された時間に採取し、可溶性ＣＤ２８についての検査まで凍結条件下に置いた。
可溶性ＣＤ２８の生成のためのＴ細胞のＰＨＡ活性化－２ｘ１０５個のＣＤ３またはＣＤ４ Ｔ細胞を、７日間５μｇ／ｍＬの濃度のフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）、２００ＩＵのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎｅ）および示された治療薬とインキュベートした。Ａｌｂ－８構築物を用いた場合、混合物に組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９７３１）を補充して、Ａｌｂ－８を飽和させた。
プロテアーゼ阻害剤－プロテアーゼ阻害剤を、各実験の開始時に示された濃度で添加した。１週間の細胞アッセイでは、さらなる阻害剤を、最終濃度で３日後に追加した。使用されたプロテアーゼ阻害剤は、ＧＩ２５４０２３Ｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＭＬ０７８９）またはＴＭＩ－１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＺ０３３６）である。
ＶＨＨの抗脱落活性を評価する細胞アッセイ－ＰＢＭＣのＳＥＢ活性化では、０．１ｘ１０６個のＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中で示された濃度の様々な治療薬有り／無しの場合について、３７℃で５～７日間２ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で刺激した。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞では、０．１ｘ１０６個のＣＤ４ Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中で示された濃度の様々な治療薬有り／無しの場合について、３７℃で５～７日間示された濃度のフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）および２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎｅ）で刺激した。ＨＥＫ自発的ＣＤ２８脱落アッセイでは、０．１ｘ１０５個のＨＥＫ細胞を、９６ウェルプレート中で示された濃度の様々な治療薬有り／無しの場合について、３７℃で４８時間インキュベートした。
混合リンパ球反応－０．１ｘ１０６個のＴ細胞を、示された濃度の治療薬の有り／無しの場合について、３７℃で２４～７２時間異なるドナー由来の０．２ｘ１０４個の成熟樹状細胞と混合した。アッセイを、１０％のＨＩ－ヒト血清およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で実施した。
自己単球ＣＤ３ ＭＬＲ－０．５ｘ１０６個のＴ細胞を、同じＣＭＶ反応性ドナー由来の０．５ｘ１０５個の単球と混合し、示された濃度の治療薬有り／無しの場合について、３７℃で６日間０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーターで刺激した。
抗体塩基配列決定－抗体を、アミノ酸配列決定のためにＲａｐｉｄ Ｎｏｖｏｒ社に提供した。配列決定を、標準的な方法を使用して行い、手短に説明すると、これは、６種の酵素（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、Ｌｙｓ ＣおよびＡｓｐ Ｎ）による酵素消化後に実施されるＬＣ－ＭＳ分析を含む。消化を、ジスルフィド還元およびアルキル化を使用して行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用して行った。各抗体の重鎖と軽鎖の両方で、アミノ酸残基の１００％が少なくとも５回のペプチドスキャンでカバーされ、有意なサポートフラグメントイオンが含まれていた。ＣＤＲを、Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定した。
組換え２Ａ１構築物の生成－合成コドン最適化遺伝子を、関連ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中にサブクローニングした。２Ａ１構築物を、一過的に遺伝子導入したＥｘｐｉＣＨＯ細胞から生成し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４中のタンパク質調製物を、非還元条件下で正確な鎖の存在についてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、調製物内の単量体型の定量について分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により分析した。
親２Ａ１分子の化学修飾－Ｃ末端システインを有する２Ａ１構築物（２Ａ１－１Ｃ）を、直鎖ｍＰＥＧ ２０ｋＤａ－ＯＰＳＳ（Ｎａｎｏｃｓ、カタログ番号ＰＧ１－ＯＳ－２０Ｋ））、直鎖ｍＰＥＧ ４０ｋＤａ－Ｍａｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＪＫＡ３１２３）、ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ１１（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、カタログ番号ＢＰ－２２１５１）などの種々の化学部分とインキュベートした。場合によっては、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号７５２５９）を反応の前に加えて、二量体物を分解した。種々の修飾反応の完了後、反応混合物を、ＳＰカチオン交換カラムにロードして、過剰試薬、および場合によっては、未反応材料を除去した。調製物を、Ｖｉｖａスピン濃縮機を使用してＰＢＳ脱塩し、コンジュゲーション検証のために、質量分析により分析した。他の調製物では、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９７３１）を、ＭＡＬ－ＰＥＧ（２０００Ｄａ）－ＭＡＬ（Ｎａｎｏｃｓ、カタログ番号ＰＧ２－ＭＬ－２Ｋ）で修飾し、アニオン交換カラムにより未反応試薬の残存物から精製して、２Ａ１－１Ｃとのインキュベーション後に最終生成物ＨＳＡ－Ｐ２Ｋ－２Ａ１を得た。
直接ＣＤ２８ ＥＩＡ－特に記載がない限り、Ｃｏｒｎｉｎｇの高結合プレートまたは同等物をスクリーニングに使用した。各ウェルを、２００ｎｇのヒトＣＤ２８－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３４２－ＣＤ）でコートした。プレートを、室温（ＲＴ）で１時間ＰＢＳ中の１％カゼインを使用してブロックした。プレートを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、調査される抗体とインキュベートしその後１：５０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートマウス抗Ｈｉｓ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号６５２５０４）または１：５００に希釈したＨＲＰコンジュゲート抗ラクダ科動物ＶＨＨカクテル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ０２０１６）で検出した。Ａｌｂ－８構築物を用いた場合、混合物に組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９７３１）を補充して、Ａｌｂ－８を飽和させた。
ＯＫＴ３によるＴ細胞刺激－０．１ｘ１０６個の単離されたＣＤ３ Ｔ細胞（健康なドナー由来）を、３７℃で２４～４８時間示された量の抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で刺激した。明言される場合、組換えヒトＣＤ８０－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号１４１－Ｂ１）を、可溶型で添加した。抗体またはＣＤ２８標的化ＶＨＨまたは対照の治療薬を、可溶型で示された濃度にて添加した。
Ａ３７５／ｓｃＯＫＴ３人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＴ細胞刺激－０．１ｘ１０５個の単離されたＣＤ３ Ｔ細胞（健康なドナー由来）を、３７℃で２４時間０．４ｘ１０４個のマイトマイシン処理ａＡＰＣ（ｓｃＯＫＴ３－ＣＤ１４キメラプラスミドを安定に遺伝子導入したＡ３７５細胞）で刺激した。抗体またはＣＤ２８標的化ＶＨＨまたは対照の治療薬を、可溶型で示された濃度にて添加した。アッセイを、１０％のＨＩ－ヒト血清およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で実施した。
ＨＥＫ／ＣＤ８０／ｓｃＯＫＴ３人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ８０）によるＴ細胞刺激－０．１ｘ１０５個の単離されたＣＤ３ Ｔ細胞（健康なドナー由来）を、３７℃で２４～４８時間０．５ｘ１０４個のマイトマイシン処理ａＡＰＣ－ＣＤ８０（ＣＤ８０およびをｓｃＯＫＴ３－ＣＤ１４キメラプラスミドを安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞）で刺激した。抗体またはＣＤ２８標的化ＶＨＨまたは対照の治療薬を、可溶型で示された濃度にて添加した。アッセイを、１０％のＨＩ－ヒト血清およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で実施した。
薬物動態プロファイル試験－各試験品のＰＫ試験を、１２匹の成体雄マウス（雄ＢＡＬＢ／ｃ）群で実施した。各試験品を、静脈内注射により２．５～１０ｍｇ／ｋｇに等価な投与量投与した。血液試料を、３匹の動物から次の時点で採取した：０．０８３時間（動物１～３）、１時間（動物４～６）、２時間（動物７～９）、８時間（動物１０～１２）、２４時間（動物１～３）、４８時間（動物３～６）、７２時間（動物７～９）、９６時間（動物１０～１２）および１６８（全動物）。試験品の濃度を、Ｋ－ＥＤＴＡ収集された血液で測定した。各試験品の濃度の定量化を、表１に記載のように、次の抗体対から構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施した：ウサギ抗ラクダ科動物ＶＨＨ（ＱＶＱ、カタログ番号ＱＥ－１９）、ＨＲＰ標識ウサギ抗ラクダ科動物ＶＨＨ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ０１８６１）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト血清アルブミン（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１９１８３）。
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実施例１：抗脱落抗体ベース薬剤のキャラクタリゼーション
ヒトＣＤ２８がマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によるタンパク質分解プロセスを受けるという知見は、タンパク質分解性脱落の潜在的感受性を示す候補領域のそのポリペプチド配列の検査を促した。ヒトＣＤ２８中で最も興味を引く配列領域は、球状ＩｇＶドメインを膜貫通領域に接続する、ヒスチジン１３４からプロリン１５２の範囲（配列番号５２：ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ）のストーク区間である。この領域は、合計３つのロイシンおよびバリン残基、ならびにフェニルアラニン残基を保持し、プロテアーゼのアクセスを妨げる可能性のある何らかの二次構造要素を欠くと予測される。特に、ストーク領域はまた、ＣＤ２８のホモ二量体化を促進するジスルフィド間結合を形成するシステイン１４１も含む。ＣＤ２８オリゴマーの構造および機能の低下を何ら損なうことなく、ＣＤ２８ストーク領域を特異的に結合しかつ脱落したＣＤ２８への異なるプロテアーゼのアクセスを潜在的に遮断する抗体または抗体フラグメントを生成する目的で、ＣＤ１マウスを、ＣＤ２８ストーク領域を模倣する二量体ペプチドで免疫化した。免疫化に使用されたペプチド配列は、配列番号５６、ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＫであり、このＣ末端リジンは、ヒドラジド化学を使用するＫＬＨまたはＢＳＡのコンジュゲーションを可能にする遊離アミノ基を有するように追加された。コンジュゲーションを、ヒドラジド末端ＣＤ２８ペプチドとＳ－４ＦＢ修飾ＢＳＡとの間で行い、これは、部位特異的コンジュゲーションのための遊離アルデヒドを生成する。二量体化を、ペプチドを非変性ゲルで泳動することにより確認した。
直接ＣＤ２８ ＥＩＡによって測定された、組換えヒトＣＤ２８に対する高い結合親和性を有する抗体が見出された。本抗体は、Ｍ９と称され、本抗体の配列は、本明細書の上で提供される。抗体Ｍ９の段階希釈を使用して、組換えヒトｓＣＤ２８へのおよびストーク領域ペプチドへのその特異的結合を確認した（図１Ａ）。興味深いことに、この抗体は、組換えヒトｓＣＤ２８を検出できたが、実際に免疫細胞から脱落したｓＣＤ２８を検出できなかった（図１Ｂ）。これは、抗体が切断部位で結合し、それが結合するデアイソトープ処理物（ｄｅｉｓｏｔｏｐｅ）が切断形態では不完全であることを強く示唆している。
次に、細胞表面上のｍＣＤ２８に結合する抗体の能力を調査した。細胞からのｓＣＤ２８の脱落を低減するために、抗体は、溶液中の単なる組換えタンパク質ではなく、タンパク質の膜状形態に実際に結合する必要があると思われる。ヒト全長ＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、分析した。マウスＣＤ２８は、可溶型へと切断されないように見えるため（活性化されたマウス脾細胞は、ｓＣＤ２８を産生しないようである）、ヒトタンパク質を調査しなければならない。細胞を、Ｍ９抗体およびＣＤ２８．２抗体を陽性対照として使用してフローサイトメトリーにより分析した。驚くべきことに、Ｍ９は、表面ｍＣＤ２８に結合するようには見えなかった（図１Ｃ）。これは、それが膜に隣接している場合の立体障害およびストーク領域へのアクセスの制限に起因する可能性がある。
実施例２：単一ドメイン抗体は、細胞表面からのｓＣＤ２８脱落を阻害する
細胞の表面上のｍＣＤ２８に結合できｓＣＤ２８の脱落を遮断できる小さな薬剤を、設計した。フルサイズ抗体は、サイズが約１５０ｋＤａであるが、抗体に由来するＦａｂフラグメントは、約５０ｋＤａのサイズを有し、一方、単鎖抗体（単鎖可変フラグメント、ｓｃＦｖとも呼ばれる）は、約２５ｋＤａのサイズを有し、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ抗体およびＤＡＲＰｉｎとも呼ばれる）は、ほんの１２～２０ｋＤａのサイズを有する。
単一ドメイン抗体を、ナイーブラマ由来ＶＨＨのファージライブラリを使用して単離した。ライブラリは、ナイーブな非免疫化ラマから採取されたＶＨＨ配列から構成され、すなわち、Ｂ細胞を抽出し、利用可能なＶＨＨのＣＤＲのレパートリー全体を配列決定した。これらのＣＤＲをファージに組み込んで、ライブラリを生成した。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを使用して、ライブラリを、組換えＣＤ２８細胞外ドメインおよび二量体ストーク領域ペプチドに対しスクリーニングして、ヒトＣＤ２８のストーク領域を特異的に結合する抗体を見つけた。ヒトＣＤ２８のストーク領域を特異的に結合すると明らかにされたＶＨＨ配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３３、クローン２Ａ１）；ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３４、クローン４Ａ４）；およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３５、クローン４Ａ１）である。ＶＨＨを、ＣＨＯ細胞で組換えタンパク質として産生し、次いで、以下に記載されるように、細胞結合および抗脱落活性に関し評価した。Ｃ末端のＨｉｓタグを、精製のために使用し、トリプルアラニンリピートを介して連結した。調査した３つのクローンのＣＤＲを、表２に提供する。
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ＶＨＨクローンのヒトＣＤ２８ストーク領域配列への結合を最初に、ＶＨＨクローンの段階希釈を使用してＥＬＩＳＡで確認した（図２）。細胞レベルでの膜のヒトＣＤ２８への結合を、標識ＶＨＨクローンおよびＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞を使用して、ＦＡＣＳ分析で確認した（図３）。膜のＣＤ２８結合は、ＣＤ２８近位膜領域へのアクセスを示す。以前の実験は、ＣＤ２８ストーク領域ペプチドに結合し得るフルサイズ抗体が細胞上でＣＤ２８ストーク領域に結合できなかったので、薬剤のサイズがこの領域にアクセスするために重要であることを示した（図１Ｃ）。特に、ＶＨＨクローンは、潜在的ＭＭＰ切断部位内に位置するアミノ酸残基１４５でＬ－Ｋ置換を有するヒトＣＤ２８ストーク領域配列に結合できなかった（図４）。
抗脱落活性を、ペプチドレベルおよび細胞レベルの両方で確認した。ＥＬＩＳＡ技術を使用して、インタクトなヒトＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチドを検出して、ＶＨＨクローンが、ＭＭＰ－２（図５）およびＭＭＰ－１３（図６）によるヒトＣＤ２８ストーク領域の切断を遮断することを確認した。一方、Ｍ９ Ｆａｂは、ＣＤ２８ストーク領域ペプチドの切断を遮断する能力を示したが、上記のようにそれは細胞上のＣＤ２８ストーク領域に結合できず、細胞膜からのＣＤ２８の脱落を阻害できなかった。細胞レベルで、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＣＤ２８を過剰発現するＨＥＫ細胞（図７）、ＰＨＡおよびＩＬ－２により活性化された単離ＣＤ４ Ｔ細胞（図８）、ならびにスーパー抗原により活性化されたＰＢＭＣ（図９）の上清中のヒトｓＣＤ２８レベルを測定することにより、ｓＣＤ２８の脱落を阻害することにおけるＶＨＨクローンの有効性を確認した。予想通り、Ｍ９ Ｆａｂは、上清中のｓＣＤ２８レベルを減少させず、実際に脱落を遮断するその能力に対する遮断剤のサイズおよびアーキテクチャの重要性をさらに強調した。
重要なことに、ＶＨＨクローンは、ヒトＣＤ２８機能を損なわないことが見出された。フローサイトメトリーを使用して、ＶＨＨクローンは、膜ＣＤ２８へのＣＤ８６結合の大きさを変化させないことが見出された（図１０）。標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＶＨＨクローンが、炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマの分泌レベルにより測定した場合、ＣＤ２８をアゴナイズしないことを示した（図１１）。活性化抗体ＣＤ２８．２を、陽性対照として使用した。同様に、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＶＨＨクローンが、サイトカインＩＬ－２の分泌レベルにより測定した場合、ＣＤ２８を介してＣＤ８０－Ｆｃ刺激をアンタゴナイズしないことを示した（図１２）。
実施例３：細胞表面からのｓＣＤ２８の脱落を阻害するための他の小さな薬剤の設計
Ｆａｂフラグメントの生成を、市販のキット、または市販のサービスを使用して行う。抗体Ｍ９のＣＤＲ領域を、それらが適切なデアイソトープ処理物に結合することが示されているため、Ｆａｂ生成に使用する。得られたＦａｂフラグメントの有効性をまず、組換えヒトＣＤ２８および二量体ストーク領域ペプチドへの結合アッセイにより試験して、この結合が保持されることを確認する。表面ｍＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するマウス細胞に対しおよびヒト免疫細胞に対しＦＡＣＳによりアッセイする。抗体ＣＤ２８．２を、陽性対照として使用する。ｓＣＤ２８脱落の直接阻害を、刺激後の免疫細胞培養物で試験する。培養培地中のｓＣＤ２８を、細胞がＦａｂフラグメントの存在下および非存在下にあるときに、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定する。脱落阻害作用を有するＦａｂフラグメントを、ＣＤ２８シグナル伝達に対するそれらの効果についてアッセイする。まず、アゴニズムを、Ｔ細胞から炎症促進性のサイトカイン（例えば、インターフェロンγ）の分泌を誘導するＦａｂフラグメントの能力をアッセイすることにより試験する。次に、ＣＤ８０－Ｆｃ（アゴニスト）の結合を遮断する能力を使用して、Ｆａｂフラグメントのアンタゴニスト特性を試験する。
Ｍ９のＣＤＲを使用する単鎖抗体生成を、市販のサービスを使用する標準的な方法により、またはＣＤＲをｓｃＦｖ骨格に挿入することにより行う。精製を行い、得られた抗体を、Ｆａｂフラグメントについて記載された同じアッセイにより評価する。
実施例４：細胞表面からのＣＤ２８脱落を阻害する血清安定性薬剤の生成
ＶＨＨ分子は効果的な切断遮断剤であるが、それらの小さいサイズは、対象へ投与された場合、それらを血清中の分解および血清からの排出のリスクにさらす。ＶＨＨ分子の血清中半減期を延長するために、それらを、それらのサイズを増やし安定性を高める第２の部分に連結した。ＶＨＨ ２Ａ１を、それが最も効力の高い切断遮断剤であると見出されたので、全てのコンジュゲーション試験のために選択した。１１個の別個の分子を、生成しおよび試験した；これらの分子は、表３にまとめられる。これらの分子の配列は、表４で提供される。細胞上のＣＤ２８のストーク領域に薬剤が結合することが必要なため、ＶＨＨを半減期延長部分に接続するリンカーの長さと性質は、非常に重要である。短すぎるリンカーは、第２の部分をＣＤ２８結合部分に近接させ、膜のＣＤ２８のその結合を妨害するであろう。長すぎるリンカーは、第２の部分が第１の部分に対し自由に動きすぎる薬剤をもたらし、この場合も、そのＣＤ２８結合活性を妨害するであろう。
第１に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、半減期延長分子として採用した。ヒト血清中で最も豊富なタンパク質である、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、そのサイズ（６６ＫＤａ）による長い半減期、ならびにその細胞による取り込みおよび放出物を循環中に戻すことを可能にする新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力で知られている。ＶＨＨ ２Ａ１を、ＧＧＧＧＳ反復を含むフレキシブルペプチドリンカーを介して、そのＣ末端でＨＳＡにコンジュゲートした。１、３、および７個の反復を調査して（それぞれ、２Ａ１－５ＧＳ－ＨＳＡ、２Ａ１－１５ＧＳ－ＨＳＡ、および２Ａ１－３５ＧＳ－ＨＳＡ）、切断部位へのＶＨＨのアクセスを依然として可能にするリンカーの最適サイズを決定した。２０または３０アミノ酸長の剛性ヘリカルリンカーもまた、試験した（それぞれ、２Ａ１－２０Ｈｅｌ－ＨＳＡおよび２Ａ１－３０Ｈｅｌ－ＨＳＡ）。
第２の試験された半減期延長分子は、ＨＳＡに特異的なＶＨＨクローンのＡｌｂ８であった。Ａｌｂ８ ＶＨＨなどのＨＳＡ結合ペプチド（Ｍａｒｉａ，Ｊ．Ｗ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２，１１，１０１７－１０２５）は、タンパク質複合体中で使用されると、半減期を延長することが知られている。Ａｌｂ８はまた、１、３、または７個のＧＧＧＧＳ反復を含むフレキシブルペプチドリンカー（それぞれ、２Ａ１－５ＧＳ－Ａｌｂ８、２Ａ１－１５ＧＳ－Ａｌｂ８、および２Ａ１－３５ＧＳ－Ａｌｂ８）を介してコンジュゲートされた。
次に、ペグ化を、半減期延長部分として試験した。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加は、タンパク質サイズを増大させ、および従って半減期を延長させるために広く利用されている。切断遮断ＶＨＨへＰＥＧ分子を付着するために、ラクダ科動物由来、特にラマ由来の単一ドメイン抗体が遊離システイン残基を欠き、さらに大部分は、ジスルフィド結合も欠くという事実を利用して、ＶＨＨのＣ末端で遊離システイン基が、付加された。その遊離チオール基と共に、結合物質のＣＤＲから遠くに位置するこのシステインは、マレイミドおよびヨード酢酸官能基を含むチオール反応性基を有する種々のＰＥＧ分子を付着するために利用できる。生成される薬剤は、５００Ｄａ～４０ＫＤａのサイズ範囲の、直鎖または分岐鎖のＰＥＧ分子を含み得る。小さすぎるＰＥＧは、半減期延長を可能にせず、大きすぎるＰＥＧは、ＣＤ２８への結合を立体的に妨害する可能性がある。ＰＥＧ分子はまた、Ｃ末端システインに加えて、リジンまたはカルボン酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸残基）などの、追加の位置で付着され得る。
ペグ化を促進するために、ジペプチドＧＣを、２Ａ１ ＶＨＨのＣ末端に付加した。このＣ末端システインは、マレイミドチオール反応性官能基で置換された直鎖４０ＫＤａのＰＥＧ部分と直接にコンジュゲートされた（２Ａ１－１Ｃ－Ｌ４０Ｋ）か、またはＳＰＤＰ官能基で置換された直鎖２０ＫＤａのＰＥＧ部分（２Ａ１－１Ｃ－Ｒ２０Ｋ）に化学的にコンジュゲートされた。ＳＰＤＰ基は、ＶＨＨのＣ末端システインとジスルフィド結合を形成するピリジルジチオ部分を含む。最後に、組み合わせた手法を試み、２Ａ１ ＶＨＨを、ＧＣジペプチドによりＨＳＡに連結し、ＨＳＡを、２ＫＤａのＰＥＧ部分でのペグ化により修飾した。これを促進するために、ＨＳＡを、ビス－マレイミド－ＰＥＧ（直鎖２ＫＤａ ＰＥＧ）を用いてその単一遊離チオール（システイン３４の）上で予め修飾し、その後、露出したマレイミド基は、ＶＨＨのＣ末端システインと反応する。両ジスルフィドは、可逆的で容易に切断される連結であるが、マレイミド基の結合は、不可逆的で極めて安定である。
薬剤は、融合タンパク質である。融合タンパク質は、タンパク質精製および好適な結合抗体による認識のために６Ｘヒスチジンタグを含む。ヒスチジンタグベース精製の技術は、当該技術分野において周知である。
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Figure 2023517242000005
Figure 2023517242000006
Figure 2023517242000007
実施例５：ＣＤ２８ペプチドの機能的結合
上述の薬剤を、組換えＣＤ２８ペプチドに結合するそれらの能力について評価した。ストーク領域配列を含み、かつ二量体として存在する、組換えヒトＣＤ２８－Ｆｃキメラタンパク質を、ＥＬＩＳＡ ｍａｘｉ－ｓｏｒｂプレートに固定化した。親２Ａ１および１１個の半減期延長２Ａ１構築物の３倍段階希釈を実施し、結合ＶＨＨの検出を、抗ＶＨＨ－ＨＲＰコンジュゲート抗体、続いてＴＭＢによる発色を用いて実施した。各構築物のＥＣ５０値を、４パラメーター非線形回帰曲線を利用するＧｒａｐｈ－Ｐａｄソフトウェアを用いて計算し、表５にまとめる。この分析に基づき、全ての生成２Ａ１構築物は、ＣＤ２８組換えペプチドに結合するそれらの能力を保持した。ＶＨＨは非常に小さいので、ＶＨＨへの抗ＶＨＨ抗体の結合との干渉がよくあることに留意されたい。これは、ＥＣ５０値のいくらかの変動を説明し得るが、データは、全てのＶＨＨが機能的結合物質であることを示す。この干渉は、ＶＨＨが細胞表面上の膜のＣＤ２８に結合する場合に、最も強く観察される。ストークは細胞膜に直接に隣接するので、ＶＨＨ抗体により結合されるＶＨＨエピトープは、埋没する。従って、細胞表面ＣＤ２８へのＶＨＨ結合は、直接結合アッセイにおいてではなく、切断の遮断（または他の機能的結果）に対するその効果により直接的に測定されなければならない。
Figure 2023517242000008
実施例６：半減期延長構築物によるＣＤ８６結合の遮断試験
上述の薬剤を、本発明の薬剤の存在下で膜のＣＤ２８への天然のリガンド結合の望まれない遮断の可能性について評価した。ＣＤ２８の天然リガンドは、ＣＤ８６であり、この結合は、免疫活性化を誘導する。ＶＨＨそれ自体は、ＣＤ２８へのＣＤ８６結合を損なわないことが示されているが、しかし、半減期延長部分は、ＣＤ２８結合領域を遮断するまたはそれと干渉する、あるいは、リガンド結合に影響する可能性がある。ＣＤ８６結合を損なう構築物は、この分子は免疫応答を上方制御する／強化すると意図されるため、ほとんど価値がない。
ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＣＤ２８を過剰発現するようにし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７にコンジュゲートされた二次抗ヒトＦｃ抗体を使用して、ＣＤ８６－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）結合に関しフローサイトメトリーにより監視した。結合を、いずれの抗ＣＤ２８分子も含まずに、親ＶＨＨおよび１１個の半減期延長構築物で試験した。ＣＤ２８アンタゴニストであるＶＨＨ＃１０Ｅ９は、陽性対照として機能した（右上のグラフ）。アイソタイプ対照としては、無関係のＶＨＨ、クローン＃３Ｃ０４を使用した。試験した半減期延長構築物のいずれも、ＣＤ８６結合を有意に損わないと明らかにされた（図１４）。ＣＤ８６遮断のパーセントを、治療薬のなしの場合の各構築物の基底ＣＤ８６－Ｆｃ結合からの各構築物のシグナル（中央値）低減のパーセントとして計算し、表６にまとめる。半減期延長構築物は一般に、親ＶＨＨと同等であると明らかにされ、どの分子もアイソタイプ対照よりも高いレベルでＣＤ８６結合を遮断しなかった。
Figure 2023517242000009
実施例７：半減期延長構築物のアゴニスト効果の試験
上述の薬剤を、膜状ＣＤ２８に対する望まれないアゴニスト効果の可能性について評価した。構築物が通常アゴニスト性である場合、それは、有害であり得る全身性免疫活性化の非特異的効果を生成し得る。アゴニスト効果を、次のように試験した。単離ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３で（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ、薄灰色バー）（図１５Ａ）またはｓｃＯＫＴ３プラスミドを遺伝子導入したＡ３７５細胞で（図１５Ｂ）２４時間刺激した。これを、無関係のＶＨＨクローン＃３Ｃ０４、陽性対照抗ＣＤ２８アゴニスト抗体クローン２８．２または種々の異なる２Ａ１構築物の存在下で実施した。上清中の分泌されたＩＬ－２の濃度を、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により測定し、それはＣＤ２８刺激の読み出し値（アゴニスト効果）として機能した。試験した２Ａ１構築物ものいずれもアゴニスト効果をもたらさなかった。
実施例８：半減期延長構築物のアンタゴニスト効果の試験
上述の薬剤を、膜状ＣＤ２８に対する望まれないアンタゴニスト効果の可能性について評価した。この分子は、天然免疫活性化の可能性を強化することが意図されるので、アンタゴニスト効果は、望ましくないであろう。単離ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８０およびｓｃＯＫＴ３プラスミドを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で２４時間刺激した（人工ＡＰＣ－ＣＤ８０、薄灰色バー）。これを、陰性対照としての無関係のＶＨＨクローン＃３Ｃ０４、アイソタイプ対照、陽性対象としての抗ＣＤ２８アンタゴニストクローンＶＨＨ＃１２Ｂ０７および種々の２Ａ１半減期延長構築物の存在下で実施した（図１６）。前述のように、ＩＬ－２分泌を、免疫活性化およびＣＤ２８アンタゴニズムの尺度として、標準化サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で定量化した。アゴニズムおよびリガンド遮断の結果と同様に、半減期延長構築物のいずれも、ＣＤ２８をアンタゴナイズしないと明らかにされた。
実施例９：半減期延長構築物の免疫調節性効果の試験
上述の薬剤を、生理学的設定における全身性免疫調節効果について評価した。混合リンパ球反応を、本明細書で前述のように実施した。具体的には、単離した成熟樹状細胞を、２４時間同種ＣＤ３陽性Ｔ細胞とインキュベートした。これを、対照ＶＨＨ（クローン＃３Ｃ０４、アイソタイプ）およびアンタゴニストＶＨＨクローン（＃１Ａ０７）、ならびに親２Ａ１ ＶＨＨおよび種々の濃度の種々の半減期延長構築物の存在下で実施した。ここでも、ＩＬ－２分泌を読み出し値として使用した。驚くべきことに、親ＶＨＨは、試験した最大濃度でごくわずかの望まれない抑制効果を生じた（図１７）。この抑制効果は、種々の半減期延長分子で抑止され、実際に、これらの分子のいずれもこのアッセイで免疫調節性効果を示さなかった（図１７）。
実施例１０：半減期延長部分による半減期延長の試験
上述薬剤の全ては望まれない活性化または抑制効果を生じないことがわかったので、２Ａ１ ＶＨＨの半減期を実際に延長するそれらの能力を、試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス当り１００μｇの各ＶＨＨ分子の固定用量を静脈内注射により投与した（２Ａ１－１Ｃ－Ｐ２Ｋ－ＨＳＡを５０μｇ／マウスで投与した）。これを、３重で実施し、血清濃度を、１６８時間まで種々の時点で測定した（図１８）。各分子の半減期（Ｔ１／２）を、測定した終点から推定し、表７に示す。このように、全ての半減期延長分子は、機能的であり、ＶＨＨの半減期を実際に延長した。ＶＨＨとペグ化ペプチドの間にジスルフィド結合を含む２Ａ１－１Ｃ－Ｒ２０Ｋは、血清中での結合の切断に起因する可能性がある半減期のわずかの改善のみを生じた。それでも、この構築物は、半減期を８倍延長した。全ての他の構築物は、極めて効果的であったが、表７からわかるように、いくつかは、他のものより効果的である。相対的半減期を、次の通り要約できる：２Ａ１－１５ＧＳ－Ａｌｂ８＞２Ａ１－１Ｃ－Ｌ４０Ｋ＞２Ａ１－１５ＧＳ－ＨＳＡ＞２Ａ１－２０ＨＥＬ－ＨＳＡ＞２Ａ１－１Ｃ－Ｐ２Ｋ－ＨＳＡ＞＞２Ａ１－１Ｃ－Ｒ２０Ｋ＞＞２Ａ１。
Figure 2023517242000010
実施例１１：半減期延長構築物によるｓＣＤ２８脱落の阻害試験
上述半減期延長分子は、程度の差はあれ、半減期を延長することがわかったので、細胞からｓＣＤ２８の脱落を遮断するそれらの能力を、ここで試験した。半減期延長ドメインまたは基の付加が、この基本的能力を妨害しない、または少なくともＶＨＨがそれ以上機能できないような大きすぎるレベルでそれを妨害しないことが不可欠である。この目的のために、可溶性ＣＤ２８のレベルを、ＰＨＡおよびＩＬ－２で刺激された単離ヒトＣＤ４の培地中で、またはＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣ中で測定した。ＣＤ２８脱落の阻害を、基底刺激からの可溶性ＣＤ２８低減のパーセントとして計算した。試験を、３重で、およびいくつかの構築物について種々の濃度で実施した。ＭＭＰ阻害剤を、陽性対照として使用し、無関係のＶＨＨ＃３Ｃ０４を、陰性対照（アイソタイプ対照）として使用した。上清中の可溶性ヒトＣＤ２８のレベルを、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。図１９からわかるように、５アミノ酸のみのリンカーを有するフレキシブルリンカー構築物は、それらがＨＳＡまたはＡＬＢ－８に融合されたかどうかにかかわらず、ＣＤ２８脱落の遮断において完全に無効力であった。同様に、単一アミノ酸のみがＶＨＨをペグ化ＨＳＡから分離された場合、分子は、脱落遮断において効果的でなかった。３５アミノ酸の非常に長フレキシブルリンカーによる結果は、わずかにより良好であったに過ぎず、１５アミノ酸の中間的中間リンクカーは最良の結果を示したが、これらは、アイソタイプ対照よりわずかに良好であるに過ぎなかった。４つの構築物は、有意な脱落遮断を示した。剛性リンカーを有する両方の構築物は、親ＶＨＨより低いレベルではあるが、有意な脱落遮断を生じた。両方のペグ化ＶＨＨ（ＨＳＡなしの）はまた、有意な脱落遮断を示し、実際に２Ａ１－１Ｃ－Ｒ２０Ｋは、親ＶＨＨよりさらにわずかに優れた脱落を生じた。遮断パーセントを、表８にまとめる。
Figure 2023517242000011
本発明はその特定の実施形態と共に説明されているが、多くの代替物、修正物および変形物があることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲の趣旨と広い範囲に入るこのような代替物、修正物および変形物のすべてを包含することが意図される。

Claims (46)

  1. リンカーにより分離された少なくとも２つの部分を含む薬剤であって、第１の部分が、細胞表面上の膜のＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合しかつ前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害し、かつ第２の部分が、前記第１の部分の安定性を高める、薬剤。
  2. 前記第１の部分、前記第２の部分、または両方が、１００キロダルトン（ｋＤａ）より小さい、請求項１に記載の薬剤。
  3. 前記薬剤が、１００ｋＤａより小さい、請求項２に記載の薬剤。
  4. 前記第１の部分が、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびペプチドから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬剤。
  5. 前記第１の部分が、単一ドメイン抗体を含むまたはそれからなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の薬剤。
  6. 前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科動物またはサメ抗体である、請求項５に記載の薬剤。
  7. 前記第１の部分が、３つのＣＤＲを含み、
    ＣＤＲ１が、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号２（ＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号３（ＤＬＹＧＳＤＹＷＤ）で示されるアミノ酸配列を含み；
    ＣＤＲ１が、配列番号４（ＩＮＡＭＡ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号５（ＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号６（ＤＥＹＧＳＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含み；または
    ＣＤＲ１が、配列番号１（ＩＮＡＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号７（ＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号８（ＤＬＹＧＥＤＹＷＩ）で示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項４～６のいずれか１項に記載の薬剤。
  8. 前記第１の部分が、
    ａ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＳＱＲＥＬＶＡＡＩＳＧＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＳＤＹＷＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
    ｂ．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＬＦＳＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＶＤＥＹＧＳＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；および
    ｃ．ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＲＶＡＡＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＥＰＲＤＡＧＶＹＹＣＶＶＤＬＹＧＥＤＹＷＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）、
    からなる群から選択される配列を含む、請求項７に記載の薬剤。
  9. 前記第１の部分が、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、
    ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１２（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１３（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１４（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１５（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）で示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号１６（ＡＴＳＤＬＡＳ）で示されるアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号１７（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）で示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の薬剤。
  10. 前記薬剤が、ＣＤ２８アゴニストでない、請求項１～９のいずれか１項に記載の薬剤。
  11. 前記薬剤が、ＣＤ２８アンタゴニストでない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の薬剤。
  12. 前記第１の部分の前記高められた安定性が、血液中の安定性を高めることを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬剤。
  13. 血液中での高められた安定性が、血液からの前記第１の部分の排出を低減することを含む、請求項１２に記載の薬剤。
  14. 血液からの排出を低減することが、腎臓濾過を低減すること、リソソーム分解を低減することまたは両方を含む、請求項１３に記載の薬剤。
  15. 前記リンカーが、剛性ペプチドリンカーである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の薬剤。
  16. 前記剛性ペプチドリンカーが、ヘリックスモチーフを含む、請求項１５に記載の薬剤。
  17. 前記剛性ペプチドリンカーが、少なくとも１５個のアミノ酸を含む、請求項１５または１６に記載の薬剤。
  18. 前記剛性ペプチドリンカーが、最大で３０個のアミノ酸を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の薬剤。
  19. 前記リンカーが、少なくとも１個のシステイン残基を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の薬剤。
  20. 前記少なくとも１個のシステインが、Ｃ末端システインである、請求項１９に記載の薬剤。
  21. 前記第２の部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でありかつチオール連結を介して前記システインに付着される、請求項１９または２０に記載の薬剤。
  22. 前記第２の部分がＰＥＧであり、かつ前記ＰＥＧが、前記第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内にコンジュゲートされる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の薬剤。
  23. 前記リンカーが、ペプチドリンカーでありかつＰＥＧが、前記ペプチドリンカーのアミノ酸にコンジュゲートされる、請求項２２に記載の薬剤。
  24. 前記ＰＥＧが、２，０００～４０，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズから構成される直鎖のまたは分岐鎖のＰＥＧである、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の薬剤。
  25. 前記第２の部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の薬剤。
  26. 前記第２の部分が、ＨＳＡ結合ポリペプチドを含むまたはそれからなる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の薬剤。
  27. 前記ＨＳＡ結合ポリペプチドが、単一ドメイン抗体である、請求項２６に記載の薬剤。
  28. 前記単一ドメイン抗体が、配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡ（配列番号１９）を含むまたはそれからなる、請求項２７に記載の薬剤。
  29. 前記第１の部分のＣ末端が、前記リンカーに連結されかつ前記第２の部分のＮ末端が、前記リンカーに連結される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の薬剤。
  30. 前記第１の部分のＣ末端が、前記リンカーのＮ末端に連結されかつ前記リンカーおよび前記第２の部分のＮ末端が、前記リンカーのＣ末端に連結される、請求項２９に記載の薬剤。
  31. 配列番号６３および６４から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の薬剤。
  32. 配列番号３６のアミノ酸配列を含みかつ第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内のアミノ酸残基へのＰＥＧ部分の不可逆的コンジュゲーションを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の薬剤。
  33. 配列番号３６のアミノ酸配列を含みかつ前記第１の部分のＣ末端の１０個のアミノ酸内のアミノ酸残基へのＰＥＧ部分の可逆的コンジュゲーションを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の薬剤。
  34. 前記ＰＥＧが、２，０００～４０，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズから構成される直鎖のまたは分岐鎖のＰＥＧである、請求項３２または３３に記載の薬剤。
  35. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の薬剤をコードする核酸分子。
  36. 請求項３５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  37. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の薬剤を生成する方法であって、
    ａ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合しかつ前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する第１の部分を得ること；
    ｂ．連結された薬剤を産生するためにリンカーにより第２の部分に前記第１の部分を連結することおよび細胞の表面上のｍＣＤ２８への前記連結された薬剤の結合および前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断の阻害を試験すること；
    ｃ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合しかつ前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する連結された薬剤を選択すること；
    および
    ｄ．薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、前記核酸配列が、
    ｉ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合しかつ前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する第１の部分を得ること；
    ｉｉ．連結された薬剤を産生するためにリンカーにより第２の部分に前記第１の部分を連結することおよび細胞の表面上のｍＣＤ２８への前記連結された薬剤の結合および前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断の阻害を試験すること；および
    ｉｉｉ．細胞表面上のｍＣＤ２８に結合しかつ前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解性切断を阻害する連結された薬剤を選択すること；
    により選択された薬剤のものである、培養すること
    の少なくとも１つを含み、それにより請求項１～３４のいずれか１項に記載の薬剤を生成する、方法。
  38. 前記連結された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすることおよびｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的にアゴナイズせず実質的にアンタゴナイズしない少なくとも１つの連結された薬剤を選択することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 血液中での前記連結された薬剤の安定性をアッセイすることおよび血液中での前記第１の部分に比較して高められた安定性を含む少なくとも１種の連結された薬剤を選択することをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法により生成される薬剤。
  41. 請求項１～２３および４０のいずれか１項に記載の薬剤、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む医薬組成物。
  42. それを必要とする対象において可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを低減する方法であって、請求項１～３４および４０のいずれか１項に記載の薬剤または請求項４１に記載の医薬組成物を投与すること、それにより対象においてｓＣＤ２８を低減することを含む、方法。
  43. それを必要とする対象において癌を治療するおよび／または予防する方法であって、請求項１～３４および４０のいずれか１項に記載の薬剤または請求項４１に記載の医薬組成物を投与すること、それにより対象の癌を治療するおよび／または予防することを含む、方法。
  44. それを必要とする対象においてＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法を改善する方法であって、請求項１～３４および４０のいずれか１項に記載の薬剤または請求項３９に記載の医薬組成物を投与すること、それにより対象のＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法を改善することを含む、方法。
  45. 前記対象が、癌に罹患している、請求項４２または４４に記載の方法。
  46. ｍＣＤ２８を分解しない、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を有効化しない、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。


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