KR20220152555A - 증가된 안정성을 가진 쉐딩 차단제 - Google Patents

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안나 프리드만-드로르
이라나 만델
테히라 벤-모세
야이르 사피르
아비도르 슐만
라일락 첸 젤츠부르그
아야라 레프코비치
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Abstract

링커에 의해 분리된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서, 여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 막 mCD28에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하고 여기서 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제가 제공된다. 상기 제제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하고 면역요법을 개선하는 방법이 또한 제공된다.

Description

증가된 안정성을 가진 쉐딩 차단제
관련 출원에 대한 상호 참조　
본원은 2020년 3월 12일자로 출원된 미국 가 특허 출원 62/988,503의 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가 출원 내용 전체는 본원에 참고로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 면역 조절 및 면역요법 분야에 속한다.
적응 면역 시스템은 주로 항원 특이적 헬퍼 CD4+ 및 세포독성 CD8+ T 세포의 자극을 조정함으로써 병원체와 암 세포에 대한 조절 및 보호에서 중요한 역할을 한다. 항원 제시 세포(APC)에 의한 T 세포의 영속성있고 지속적인 활성화는 i) APC 위 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 제공된 펩타이드와 T 세포 수용체(TCR)의 결합; 및 ii) APC에 의해 또한 발현된 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86) 리간드에 결합하는 T 세포 위 공동-자극 CD28 수용체를 포함한다. CD28 공동-자극의 생물학적 결과는 다양하며, 면역 효과기 기능을 달성하는 데 필요한 임계값을 낮추어 T 세포 주기, 확장, 분화 및 TCR 자극 증폭의 제어를 포함한다.
활성화되는 공동-자극 분자 CD28과는 대조적으로, 구조적으로 동족인 세포독성 T 림프구 관련 4(CTLA-4)는 억제성 공동-자극 수용체이며, 이 때 막 발현은 CD28의 트리거링(triggering)에 의해 유도된다. CTLA-4 및 CD28 둘 모두는 I형 막-횡단 단백질이다. 이들의 세포외 부분은 하나의 V-세트(set) 면역글로불린 슈퍼 패밀리(Ig-V) 도메인으로 구성되며, 이것은 막횡단 영역에 근접한 IgV 도메인 외부에 위치한 시스테인 잔기에 의해 동종-공유적으로 연결된다. 유사성에도 불구하고, CTLA-4 및 CD28은 친화도 및 4차 구조 배열의 측면에서 상이하다. CTLA-4는 B7 분자에 대해 더 높은 결합 친화도 및 CD28과 상이한 이량체화 모드를 가져서, 공유된 리간드와 상이한 화학량론적 결합을 초래하는 것으로 밝혀졌다. CD28은 1가 결합 화학량론을 나타내는 반면, CTLA-4는 2가 방식으로 상호작용한다. 따라서, CTLA-4는 CD28보다 훨씬 더 높은 친화도 및 결합력(avidity)으로 B7 분자에 결합하고, 결과적으로 T 세포 반응을 하향조절하며 항원 특이적 내성의 시작을 지지한다.
일부 공동-자극 분자는 여러 생리학적 형태를 갖는 것으로 나타났다. 막-결합 형태와 함께, 나이브(naive) 면역 세포에서 발현되는 가용성 형태가 설명되어, T 세포 생물학의 복잡성을 증가시킨다. 가용성 형태의 CD28(sCD28)은 교대로 스플라이싱된 유전자 산물 및 활성 쉐딩(shedding)에 기인하였다. T 세포 활성화 중 활성 쉐딩은 접착 분자의 단백질분해에 의한 지속적인 활성화를 방해하는 조절 메커니즘으로 과거에 설명되었고, 현재 CD28에 대해서도 밝혀졌다.
막 CD28(mCD28)은 단백질분해로 절단되어 sCD28을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이 절단의 억제는 sCD28을 억제하여 sCD28-매개 면역 억제를 억제하는 방법으로 제안되었다. 따라서, mCD28의 단백질분해 절단을 차단할 수 있는, 긴 혈청 반감기를 갖는 약제학적으로 실행가능한 제제가 매우 필요하다.
발명의 요약
본 발명은, 링커에 의해 분리된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서, 여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 막 CD28(mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하며 여기서 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제를 제공한다. 상기 제제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 및 예방하고 PD-1/PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법이 또한 제공된다.
제1 측면에 따르면, 링커에 의해 분리된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서, 여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 막 CD28(mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하며 여기서 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제가 제공된다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이 둘 모두는 100 킬로달톤(kDa) 미만이다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 제제는 100 kDa 미만이다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티는 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩타이드로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티는 단일 도메인 항체를 포함하거나 이것으로 구성된다.
일부 실시양태에 따르면, 단일 도메인 항체는 낙타과 동물(camelid) 또는 상어 항체이다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티는 3개의 CDR을 포함하며, 여기서:
CDR1은 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2는 서열번호 2에 명시된 아미노산 서열(AISGGGDTYYADSVKG)을 포함하고, CDR3은 서열번호 3에 명시된 아미노산 서열 (DLYGSDYWD)을 포함하거나;
CDR1은 서열번호 4에 명시된 아미노산 서열(INAMA)을 포함하고, CDR2는 서열번호 5에 명시된 아미노산 서열(AITSSGSTNYAN)을 포함하고, CDR3은 서열번호 6에 명시된 아미노산 서열(DEYGSDYWI)을 포함하거나;
CDR1은 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2는 서열번호 7에 명시된 아미노산 서열(AITSGGSTNYADSVKG)을 포함하고, CDR3은 서열번호 8에 명시된 아미노산 서열(DLYGEDYWI)을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티는
a. EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKG RFTIS RDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열번호 9);
b. EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGR FTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 10); 및
C. QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 11)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티는 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하고, 여기서: CDR-H1은 서열번호 12에 명시된 아미노산 서열(GFTFSSYYMS)을 포함하고, CDR-H2은 서열번호 13에 명시된 아미노산 서열(TISDGGDNTYYAGTVTG)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 14에 명시된 아미노산 서열(IHWPYYFDS)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 15에 명시된 아미노산 서열(RASSSVSYMN)을 포함하고, CDR-L2은 서열번호 16에 명시된 아미노산 서열(ATSDLAS)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 17에 명시된 아미노산 서열(QQWSSHPPT)을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 제제는 CD28 작용제가 아니다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 제제는 CD28 길항제가 아니다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티의 증가된 안정성은 혈액 내 안정성을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 혈액 내 안정성을 증가시키는 것이 혈액으로부터 제1 모이어티의 제거(clearance)를 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것이 신장 여과를 감소시키는 것, 리소좀 분해를 감소시키는 것 또는 이 둘 모두를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 링커는 강성 펩타이드 링커이다.
일부 실시양태에 따르면, 강성 펩타이드 링커는 나선 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 강성 펩타이드 링커는 적어도 15개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 강성 펩타이드 링커는 최대 30개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 링커는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 시스테인은 C-말단 시스테인이다.
일부 실시양태에 따르면, 제2 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이고, 티올 연결을 통해 상기 시스테인에 부착된다.
일부 실시양태에 따르면, 제2 모이어티는 PEG이고, PEG는 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내에서 접합된다.
일부 실시양태에 따르면, 링커는 펩타이드 링커이고, PEG는 펩타이드 링커의 아미노산에 접합된다.
일부 실시양태에 따르면, PEG는 2000-40,000 달톤(Da)의 크기를 포함하는 선형 또는 분지형 PEG이다.
일부 실시양태에 따르면, 제2 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다.
일부 실시양태에 따르면, 제2 모이어티는 HSA 결합 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다.
일부 실시양태에 따르면, HSA 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체이다.
일부 실시양태에 따르면, 단일 도메인 항체는 서열 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA (서열번호 19)을 포함하거나 이것으로 구성된다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티의 C-말단은 링커에 연결되고, 제2 모이어티의 N-말단은 링커의 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에 따르면, 제1 모이어티의 C-말단은 링커의 N-말단에 연결되고, 제2 모이어티의 N-말단은 링커의 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에 따르면, 제제는 서열번호 63 및 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된다.
일부 실시양태에 따르면, 제제는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내 아미노산 잔기에 PEG 모이어티를 비가역적으로 접합하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 제제는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내 아미노산 잔기에 PEG 모이어티를 가역적으로 접합하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, PEG는 2000-40,000 달톤(Da)의 크기를 포함하는 선형 또는 분지형 PEG이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 제제를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 제제를 생성하는 방법으로서, 상기 방법이
a. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제1 모이어티를 얻는 단계;
b. 제1 모이어티를 링커에 의해 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생성하고, 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 결합 및 mCD28의 단백질분해 절단의 억제를 시험하는 단계;
c. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 연결된 제제를 선택하는 단계; 및
d. 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 제제를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 핵산 서열이
i. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제1 모이어티를 얻고;
ii. 제1 모이어티를 링커에 의해 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생성하고, 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 결합 및 mCD28의 단백질분해 절단의 억제를 시험하고;
iii. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 연결된 제제를 선택함에 의해 선택된 제제의 핵산 서열인 단계 중 적어도 하나를 포함하는 생성 방법이 제공된다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 방법은 연결된 제제의 존재 하에 mCD28 하류 신호전달을 검정하고, mCD28 신호전달을 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 연결된 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 방법은 혈액 내 연결된 제제의 안정성을 검정하고 혈액 내 제1 모이어티와 비교하여 증가된 안정성을 포함하는 적어도 하나의 연결된 제제를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생산된 제제가 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이 본 발명의 제제 또는 본 발명의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 sCD28을 감소시키는 것을 포함하는 감소 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 본 발명의 제제 또는 본 발명의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법으로서, 상기 방법이 본 발명의 제제 또는 본 발명의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 것을 포함하는 개선 방법이 제공된다.
일부 실시양태에 따르면, 대상체는 암을 앓는다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 방법은 mCD28을 분해하지 않거나, mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않거나, mCD28-매개 면역 세포 활성화를 활성화하지 않는다.
본 발명의 추가 실시양태 및 적용가능성의 전체 범위는 이하에 주어진 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 이 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시를 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a 내지 1c. (1a) 클론 M9의 연속 희석에 의한, BSA 접합된 CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드(우측) 및 재조합 인간 CD28 단백질(좌측)로의 항원 결합을 보여주는 선 그래프. 항원을 maxisorp ELISA 플레이트 위에 고정시켰다. 클론 M9의 연속 희석을 수행하였고, 결합된 항체의 검출을 당나귀 항 마우스 IgG(H&L)-HRP를 사용하여 수행하였고, TMB를 사용하여 전개하였다. (1b) SEB로 활성화된 인간 PBMC로부터 쉐딩된 sCD28(우측) 및 재조합 인간 sCD28(좌측)의 ELISA 검출의 막대 그래프. ELISA는 항체 #3을 양성 대조군(2 μg/mL, 회색 막대)으로, 무관한 항체 M39를 음성 대조군(10 μg/mL, 어두운 회색 막대)으로, 그리고 항-절단 항체 M9(10 μg/mL, 검은색 막대)를 사용하였다. HRP(0.5 μg/mL)에 접합된 ELISA 키트 검출 항체를 사용하여 재조합 CD28 또는 쉐딩된 CD28의 검출을 수행하였다. (1c) 마우스 HEK293 세포에서 발현된 인간 CD28로의, 10 μg/mL의 고정 농도에서의 항체 M9(위쪽) 및 대조군 항체 CD28.2(아래쪽)의 결합을 보여주는 히스토그램(검정색 히스토그램). 다클론 마우스 IgG가 음성 대조군(10 μg/mL)으로 사용되었고, 회색 히스토그램으로 표시된다. 2차 Alexa Fluor 647-접합된 염소 항-마우스와 함께 인큐베이션하여 검출을 수행하였다.
도 2. ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 서열로의 결합. 상이한 VHH 클론의 연속 희석에 의한 항원 결합 분석. 항원으로 작용하는 비오틴 접합된 CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 위에 고정시켰다. VHH 클론의 연속 희석을 수행하였고, 결합된 VHH의 검출을 항 His 태그-HRP 접합된 항체를 사용하여 실시하였고, TMB를 사용하여 전개를 실시하였다.
도 3. 막 인간 CD28로의 VHH#2A1의 결합. FITC 접합된 VHH 클론 2A1(50 μg/mL, 검은색 히스토그램) 및 FITC 접합된 아이소타입 대조군(mIgG, 50 μg/mL, 회색 히스토그램)을 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포와 함께 인큐베이션하였다. 결합을 FACS 분석에 의해 평가하였다.
도 4. 항 CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1, 4A1 및 4A4는 인간 CD28의 MMP 절단 부위에 특이적으로 결합한다. 직접 ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 WT 서열로의 또는 L145K 돌연변이된 서열로의 VHH 클론의 특이적 결합 비교. 비오틴 접합된 야생형 또는 L145K CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 위에 고정시켰다. VHH 클론(0.2-5 μg/mL) 및 무관한(irrelevant) VHH 클론(좌측 상단 차트)의 연속 희석을 수행하였고, 결합된 VHH의 검출을 항 His 태그-HRP 접합된 항체를 사용하여 실시하였고, TMB를 사용하여 전개를 실시하였다.
도 5. VHH 클론에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 MMP-2 매개 절단의 시험관 내 차단. c-Myc 접합되고 비오티닐화된 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드(1 μM)를 5시간 동안 MMP-2 억제제(TMI-1, 50 nM), M9 Fab 또는 다양한 농도(0.4-10 μg/mL)에서의 표시된 VHH 클론의 존재 하에 50 ng rhMMP-2와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 위에 로딩한 후, 광범위한 세척 및 항-cMyc HRP-접합된 항체에 의한 온전한 펩타이드 검출을 실시하였고, TMB를 사용하여 전개를 실시하였다.
도 6. MMP-13에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 절단에 대한 VHH 클론 2A1의 시험관 내 차단 활성. c-Myc 및 비오티닐화 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드(1 μM)를 5시간 동안 MMPi(TMI-1, 50 nM, 짙은 회색 막대), 무관한 VHH 클론(좌측 차트의 검은색 막대) 또는 다양한 농도(0.62-10 μg/mL)에서의 VHH 클론 2A1(우측 차트의 검은색 막대)의 존재 하에 50 ng rhMMP-13(밝은 회색 막대)과 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 위에 로딩한 후, 광범위한 세척 및 항-cMyc HRP-접합된 항체에 의한 온전한 펩타이드 검출을 실시하고, TMB를 사용하여 전개를 실시하였다.
도 7. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 48시간의 인큐베이션 후에 인간 CD28을 안정적으로 발현하는 HEK 세포의 배양 배지에서 측정하였다. 가용성 CD28의 수준에 대한, MMP 억제제(TMI-1, 1 μM, 어두운 회색 막대), 무관한 VHH의 음성 대조군(좌측 상단 차트, 검은색 막대) 또는 다양한 농도(3.3-100 μg/mL)에서의 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론(검은색 막대)의 다양한 처리 효과가 표시된다. 상청액 내 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화 샌드위치 ELISA(R&D system)를 사용하여 정량화하였다.
도 8. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 PHA 및 Il2에 의해 활성화된 단리된 CD4 세포에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 5 ㎍/mL PHA 및 200 IU/mL IL-2(밝은 회색 막대)로 자극된 단리된 인간 CD4 T 세포의 배양 배지에서 측정하였다. 가용성 CD28의 양에 대한, MMP 억제제(TMI-1, 1 μM, 어두운 회색 막대), 무관한 VHH의 음성 대조군(좌측 상단 차트, 검은색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론, 또는 다양한 농도(0.4-50 μg/mL)에서의 Fab 형태의 항체 M9 클론(검은색 막대)의 다양한 처리 효과가 표시된다. 상청액 내 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화 샌드위치 ELISA(R&D system)를 사용하여 정량화하였다.
도 9. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 초항원에 의해 활성화된 PBMC에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 1 ng/mL SEB(밝은 회색 막대)로 자극된 단리된 PBMC의 배양 배지에서 측정하였다. 가용성 CD28의 양에 대한, MMP 억제제(TMI-1, 1 μM, 어두운 회색 막대), 무관한 VHH(좌측 상단 차트, 검은색 막대)의 음성 대조군, 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 또는 다양한 농도(0.4-50 μg/mL)에서의 Fab 형태의 M9 클론(검은색 막대)의 다양한 처리 효과가 표시된다. 상청액 내 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화 샌드위치 ELISA(R&D system)를 사용하여 정량화하였다.
도 10. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론은 막 CD28에 결합하는 리간드를 차단하지 않는다. 인간 CD28을 과발현하는 HEK293 세포를 Alexa Fluor 647에 접합된 2차 항 인간 Fc 항체를 사용하여 CD86-Fc(2 μg/mL) 결합에 대한 유세포 분석으로 모니터링하였다. CD86-Fc(30 μg/mL, 검은색 히스토그램)에 항 CD28 VHH 클론을 첨가해도 CD86 결합의 크기는 변경되지 않았던 반면, 상업용 항체 클론 CD28.2(10 μg/mL, 좌측 위 차트, 검은색 히스토그램)의 첨가는 결합을 상당히 감소시켰다.
도 11. 항-CD28 줄기 VHH 클론의 작용제 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포를 양성 대조군으로 작용하는 항-CD28 작용제 항체 클론 28.2(2 μg/mL, 어두운 회색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 또는 무관한 VHH 클론(20 μg/mL, 검은색 막대)의 존재 하에 플레이트 결합된 항-CD3(OKT3, 2 μg/mL, 밝은 회색 막대)을 사용하여 2일 동안 자극하였다. 상청액 내로 분비된 인간 IFN 감마의 농도를 표준화 샌드위치 ELISA(Biolegend)를 사용하여 정량화하였다.
도 12. 항-CD28 줄기 VHH 클론의 길항제 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포를 CD28 공동-자극을 위한 리간드로 작용하는 재조합 CD80-Fc 단백질(5 μg/mL, 짙은 회색 막대)의 존재 하에 플레이트 결합된 항-CD3(OKT3, 2 μg/mL, 밝은 회색 막대)을 사용하여 24시간 동안 자극하였다. 무관한 VHH 클론(좌측 상단 차트) 또는 항-CD28 줄기 영역 VHH가 다양한 농도(3.75-30 μg/mL, 검은색 막대)에서 첨가되었다. 상청액 내 인간 Il-2의 농도를 표준화 샌드위치 ELISA(Biolegend)를 사용하여 정량화하였다.
도 13: 상이한 2A1 반감기 연장 작제물에 의한 인간 CD28 줄기 영역 서열로의 결합. 모 2A1 VHH 및 11개의 반감기 연장 작제물의 연속 희석에 의한 항원 결합의 분석. CD28-Fc 재조합 펩타이드를 미끼(bait)로 사용하였다.
도 14: 막 CD28에 대한 상이한 2A1 반감기 연장 작제물에 의한 리간드 차단 활성. 모 2A1 VHH(상단 행/가운데), 양성 대조군 길항 항체(상단 행/우측) 및 다양한 반감기 연장 작제물의 존재 하에 인간 CD28을 발현하는 HEK293 세포로의 CD86 결합(상단 행/좌측)을 보여주는 히스토그램. 5개 아미노산 및 35개 아미노산 가요성 링커를 사용하여 유사한 결과가 관찰되었지만, 15개 아미노산 길이의 가요성 링커를 갖는 작제물이 표시된다. 30개 아미노산 강성 링커를 사용하여 유사한 결과가 관찰되었지만, 20개 아미노산 길이의 강성 링커가 표시된다.
도 15a 내지 15b: 상이한 2A1 반감기 연장 작제물의 작용제 효과 평가. 무관한 VHH 클론#3C04(1.2 μM, 어두운 회색 막대), 양성 대조군 항-CD28 작용제 항체 클론 28.2(2 μg/mL, 어두운 회색 막대) 또는 상이한 2A1 작제물(1.2 μM, 검은색 막대)의 존재 하에 (15a) 플레이트 결합된 항-CD3(OKT3, 2 μg/mL, 밝은 회색 막대) 또는 (15b) scOKT3 플라스미드로 형질감염된 A375 세포(인공 APC, 회색 막대)를 사용하여 24시간 동안 자극한 단리된 인간 CD3 T 세포로부터 IL2 분비의 막대 차트.
도 16: 상이한 2A1 반감기 연장 작제물의 길항제 효과 평가. 무관한 VHH 클론#3C04(2 μM, 아이소타입 대조군, 짙은 회색 막대), 양성 대조군 항-CD28 길항제 클론 VHH#12B07 (1 μM) 또는 다양한 2A1 작제물의 존재 하에 인간 CD80 및 scOKT3 플라스미드(인공 APC-CD80, 밝은 회색 막대) 둘 모두를 사용하여 24시간 동안 자극한 단리된 인간 CD3 T 세포로부터 IL2 분비의 막대 차트. 가요성 및 강성 링커가 있는 작제물은 2 μM로 사용하였다. PEG화 작제물을 다양한 농도(0.1 내지 3 μM)에서 사용하였다.
도 17: MLR 기반 검정에서 다양한 2A1 반감기 연장 작제물의 면역 조절 효과. 무관한 VHH 클론#3C04(3 μM, 아이소타입 대조군, 어두운 회색 막대), CD28 길항제 클론 VHH#1A07(3 μM), 및 다양한 농도(0.1-3μM, 2.5 μM의 단독 농도에서 사용된 2A1-1C-P2K-HSA는 제외함)에서의 상이한 2A1 작제물의 존재 하에 혼합된-림프구 반응으로부터 IL2 분비의 막대 차트(밝은 회색 막대).
도 18: 마우스에서 2A1 혈청 노출에 대한 반감기 연장된 작제물의 영향. 마우스에서 시험된 다양한 VHH 작제물의 시간(시)의 함수인 관찰된 평균(n = 3*, ±표준 편차) 혈청 농도(μg/mL)의 선 그래프.
도 19: 자극된 림프구에서 CD28 쉐딩의 억제. 가용성 CD28의 수준을 PHA 및 IL-2로 자극된 단리된 인간 CD4, 또는 SEB로 자극된 PBMC의 배양 배지에서 측정하였고, 무관한 VHH#3C04 음성 대조군(3 μM, 아이소타입 대조군, 회색 막대)을 갖는 음성 대조군으로 정규화하였다. 모 2A1 VHH(3 μM, 어두운 회색 막대), MMP 억제제(양성 대조군, 1 μM TMI-1, 밝은 회색 막대) 및 다양한 2A1 반감기 연장 작제물(3 μM, 검은색 막대)을 또한 평가하고 정규화하였다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서, 여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 막 CD28(mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하며 여기서 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제를 제공한다. 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 본 발명의 제제 생성, 암 치료, PD-1/PD-L1 기반 면역요법 개선, 및 sCD28 수준 감소 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 제제를 포함하는 약제 조성물 뿐만 아니라, 상기 약제 조성물의 사용 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 제제, 방법 및 조성물은, mCD28의 단백질분해 절단의 결과로서 sCD28이 면역억제제로서 작용하고, 따라서 쉐딩의 감소가 sCD28에 의한 억제를 감소시키고 mCD28 신호전달을 통한 면역 활성화를 증가시키는 이중 이점을 갖는다는 놀라운 발견에 기반한다. mCD28의 절단 부위에 대한 전체 크기 항체는 막 근접 영역에 접근하기에는 너무 크므로 쉐딩을 억제할 수 없는 반면, 세포 표면 위 mCD28에 대하여 특이성을 갖는 더 작은 폴리펩타이드는 막 근접 영역에 접근하여 단백질분해 절단을 차단할 수 있다. 혈청 내 폴리펩타이드의 치료학적으로 유용한 안정성은 제2 모이어티로의 연결에 의해 향상된다. 제2 모이어티는 제1 모이어티의 혈청 반감기를 증가시키면서, 폴리펩타이드의 세포 위 mCD28로의 결합 능력에는 영향을 미치지 않는다.
제제
제1 측면에 따르면, 링커에 의해 분리된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서, 여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 여기서 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "모이어티"는, 하위구조로 전체 작용 기 또는 작용 기의 일부를 포함할 수 있는 분자의 일부를 지칭한다. 용어 "모이어티"는 상응하는 분자와 유사한 화학적 및/또는 약리학적 특성의 특정 세트를 나타내는 분자의 일부를 추가로 의미한다.
일부 실시양태에서, CD28은 포유동물 CD28이다. 일부 실시양태에서, CD28은 인간 CD28이다. 일부 실시양태에서, 인간 CD28은 아미노산 서열: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열번호 20)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 성숙한 CD28에는 신호 펩타이드가 결여되어 있고, 서열: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열번호 21)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전장 인간 CD28을 코딩하는 DNA 코딩 서열은 서열: ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA (서열번호 22)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD28은 막 CD28 (mCD28)이다. 일부 실시양태에서, 막(membranal) CD28은 막(membrane) CD28이다. 일부 실시양태에서, mCD28은 세포 표면 위에 있다. 일부 실시양태에서, mCD28은 막 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포 표면은 세포 막이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 NKT 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포주의 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포주는 mCD28을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포주는 발현 벡터로부터 mCD28을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포주는 mCD28을 안정적으로 발현한다.
일부 실시양태에서, CD28은 가용성 CD28(sCD28)이다. 본원에 사용된 sCD28은 막횡단 도메인을 포함하지 않아 막에 통합될 수 없는 임의의 CD28 단편 또는 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 아미노산 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열번호 23)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 막 결합되지 않는다. 일부 실시양태에서, sCD28은 용액 내 있다. 일부 실시양태에서, sCD28은 혈액 내 CD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 TME 내 CD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 체액 내 CD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28에는 CD28의 엑손 3이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, sCD28은 CD28의 엑손 3을 스플라이싱하는 선택적 스플라이싱으로부터 생성되는 스플라이스 변이체이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 막 CD28(mCD28)로부터의 절단 생성물이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 절두형(truncated) CD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28에는 전장 CD28의 세포질 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, sCD28은 이량체 sCD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 단량체 sCD28이다. 일부 실시양태에서, sCD28은 CD28의 선택적 스플라이싱으로부터 생성되는 스플라이스 변이체이다. 일부 실시양태에서, 선택적 스플라이싱은 CD28의 엑손 3을 스플라이싱한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 아미노산 서열: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE (서열번호 24)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, sCD28에는 신호 펩타이드가 결여되어 있고, 서열: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE (서열번호 25)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, sCD28은 아미노산 서열: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열번호 26)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, sCD28에는 신호 펩타이드가 결여되어 있고, 서열: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLG NESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열번호 27)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28은 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된다.
일부 실시양태에서, 인간 sCD28을 코딩하는 DNA 코딩 서열은 서열: ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA (서열번호 28)을 포함한다.
면역 세포에 대한 sCD28의 효과는 당업계에 잘 알려져 있고, 비제한적인 예로 항염증 사이토카인, 예컨대 IL-10 또는 TGF의 면역 세포 유도, 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 면역 세포 발현, 및 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL-2 또는 IFN-γ의 면역 세포 하향조절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막 CD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제제는 sCD28의 생성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, sCD28의 생성을 억제하는 것은 면역 세포에 대한 sCD28의 효과를 억제하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 적어도 2개의 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 복수의 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 모이어티를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 2개의 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 제1 모이어티 및 제2 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 모이어티 중 적어도 하나는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 상기 모이어티 중 적어도 하나는 반감기 향상 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 상기 모이어티 중 적어도 하나는 반감기 연장 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 상기 모이어티 중 적어도 하나는 안정성 향상 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 상기 모이어티 중 적어도 하나는 안정성 증가 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 전체 크기 항체가 아니다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 IgG가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 100 킬로달톤(kDa) 미만이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이의 조합은 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 또는 15 kDa 미만이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 50 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 25 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 20 kDa 미만이다. 일부 실시양태에 따르면, 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 15 kDa 미만이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 세포 표면 위 mCD28에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28의 단백질분해 절단을 억제한다. 일부 실시양태에서, mCD28은 제1 모이어티에 의해 결합된 mCD28이다. 본원에 사용된 "단백질분해 절단을 억제하는"은 mCD28의 단백질분해 절단에서의 임의의 감소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 억제는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100%의 절단에서의 감소이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 세포 위 mCD28의 수준을 유지한다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 세포 위 mCD28 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 자극에 적합한 mCD28의 수준을 유지한다.
일부 실시양태에서, 단백질분해 절단에서의 감소는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 절단에서의 감소이다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 절단에서의 감소는 적어도 하나의 메탈로프로테아제에 의한 절단에서의 감소이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17, MMP-13 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2 또는 MMP-13이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10, MMP-13 또는 이의 조합이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩타이드로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단일 사슬 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 CD28에 특이적으로 결합하는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 및 단일 도메인 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 전체 크기 항체가 아니다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두에는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 Fc 도메인이 결여되어 있는 항원 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 낙타과 동물, 상어 또는 나노바디(nanobody)이다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 또 다른 단백질 또는 단백질의 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질 또는 단편은 제제를 CD28로 표적화한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 단백질 또는 단백질의 단편은 CD28의 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두의 예는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩타이드 및 DARPin을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩타이드 및 DARPin으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩타이드로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 나노바디이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 VHH 항체이다. 본원에 사용된 용어 "단일 도메인 항체", "나노바디" 및 "VHH 항체"는 동의어이며 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 CD28에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 CD28로의 특이적 결합을 갖는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 나노바디, VHH 항체 및 항체 모방체(mimetic)로부터 선택된다. 본원에 사용된 용어 "항체 모방체"는, 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 유기 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 항체와 구조적으로 관련되지 않는다. 항체 모방체의 예는 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 파이노머, Kunitz 도메인 펩타이드, 모노바디 및 nanoCLAMPS를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 DARPin이다. 이들 제제 모두는 당업계에 잘 알려져 있고, 수용체와 이것들의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는데 유용한 것으로 알려져 있다. mCD28에 결합할 수 있는 소분자 및 단백질은 절단 부위를 폐색시킬 수 있거나, 프로테아제에 대한 접근을 방해하거나 손상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 모방체이다. 본원에서 용어 "DARPin"은 설계된 안키린 반복 단백질을 지칭한다. DARPin은 이것의 단백질 표적에 대해 일반적으로 매우 특이적인 유전자 조작된 항체 모방 단백질이다. 따라서, CD28에 대한 DARPin이 제제의 한 예일 수 있다.
일부 실시양태에서, Fab 단편은 약 50 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 100 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 80 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 70 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 50 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 약 50 kDa 이하의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 약 25 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 50 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 40 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 30 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 25 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 약 25 kDa 이하의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 약 15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 10 내지 20 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 10 내지 17 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 10 내지 16 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 10 내지 15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 12 내지 15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 12 내지 16 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 12 내지 17 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 12 내지 20 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 25 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 20 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 15 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 약 15 kDa 이하의 크기를 포함한다. 크기가 작고 항원 결합이 3개의 CDR에만 의존하기 때문에, 단일 도메인 항체, 특히 VHH의 결합 기구(machinery)는 볼록한 형상이고 한쪽에서만 에피토프에 결합하므로 막 고정(anchored) CD28의 줄기 영역과 같은 단백질 틈에서 발견된 것과 같은, 제한된 용매 노출을 특징으로 하는 에피토프에 결합하는 데 더욱 적합하다. 비교로, Fab 단편 및 단일 사슬 항체는 6개의 CDR을 포함하고 적어도 2개의 면으로부터의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단 3개의 CDR과의 결합이 6개의 CDR과의 결합과 비교하여 mCD28 줄기 영역에 대한 우수한 접근을 허용한다. 일부 실시양태에서, 단일-도메인 항체 결합의 기하구조가 mCD28 줄기 영역에 접근하는 데 우수하다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 항원의 항원 결정적 특징에 상보적인 내부 표면 형상 및 전하 분포를 지닌 3차원 결합 공간을 갖는 폴리펩타이드 사슬의 접힘(folding)으로부터 형성되는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 그룹을 지칭한다. 항체는 전형적으로 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍을 포함하는 사량체 형태를 가지며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"를 갖는다.　각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 올리고클론, 다클론, 단클론, 키메라, 낙타화(camelised), CDR-이식된, 다중-특이적, 이중-특이적, 촉매적, 인간화, 완전 인간, 항-이디오타입(idiotype), 및 가용성 또는 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체 뿐만 아니라, 단독으로 또는 다른 아미노산 서열과 함께 에피토프-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 단편일 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다.　용어 항체는 또한 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 단일 가닥 항체(scFv), 이량체 가변 영역(Diabody) 및 이황화-연결된 가변 영역(dsFv)을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 항체 단편은 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 또 다른 면역글로불린 도메인에 융합될 수 있거나 융합되지 않을 수 있다.　당업자는 scFv-Fc 융합체, 가변 영역(예를 들어, VL 및 VH)~Fc 융합체 및 scFv-scFv-Fc 융합체를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 다른 융합체 생성물이 생성될 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
자연적으로 발생하는 항체 구조의 기본 단위는, 비공유 결합에 의해 그리고 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질 복합체이다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬-내 이황화 브릿지(bridge)를 갖는다. 5개의 인간 항체 부류(IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)가 존재하며, 이들 부류 내에서 구조적 차이, 예컨대 단일 항체 분자 내 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위의 이황화 브릿지 구조, 및 사슬 길이 및 순서에서의 차이에 기반하여 다양한 하위부류가 인지된다. 항체의 부류 및 하위부류는 이것의 아이소타입이다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 또는 50 kDa 미만의 크기를 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fab 단편은 50 kDa 미만의 크기를 갖는다.
중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 영역은 카복시 말단 영역보다 서열이 더 다양하므로 가변 도메인이라고 칭해진다. 항체 구조의 이 부분은 항체의 항원 결합 특이성을 부여한다. 중 가변(VH) 도메인 및 경 가변(VL) 도메인이 함께 단일 항원-결합 부위를 형성하므로, 기본 면역글로불린 단위는 2개의 항원-결합 부위를 갖는다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 믿어진다(Chothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-63 (1985); Novotny and Haber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4592-4596).
중쇄 및 경쇄의 카복시 말단 부분은 불변 도메인, 즉 CH1, CH2, CH3, CL을 형성한다. 이들 도메인에서는 다양성이 훨씬 더 적지만 동물 종마다 차이가 있고, 또한 동일한 개체 내에서 각각 상이한 기능을 갖는 여러 상이한 아이소타입의 항체가 있다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은, 본원에 정의된 초가변 영역 아미노산 잔기를 제외한, 항체의 가변 도메인 내 아미노산 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은, 항원 결합을 담당하는 항체의 가변 도메인 내 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 항원의 에피토프로의 결합을 주로 담당한다. FR 및 CDR의 범위는 정확히 정의되었다(Kabat et al. 참고).
면역글로불린 가변 도메인은 또한 IMGT 정보 시스템(www://imgt.cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)를 사용하여 분석되어, CDR을 포함한 가변 영역 분절을 확인하였다. 예를 들어, Brochet, X. et al, Nucl. Acids Res. J6:W503-508(2008)를 참고한다.
Chothia 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 이 "Chothia 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 분명히 할당할 수 있다. 본원에 사용된 "Chothia 넘버링"은 Chothia et al., Journal of Molecular Biology, "Canonical Structures for Hypervariable region of immunoglobulins"(1987) 및 Chothia et al., Nature, "Conformations of Immunogm lobulin Hypervariable Regions"(1989)에 명시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단일 사슬 항체" 및 "단일 사슬 가변 단편"은 동의어로 사용되며, 짧은 펩타이드 링커로 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20 kDa 미만의 크기를 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 25 kDa 미만의 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체의 링커는 10 내지 25개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체의 링커는 1-40, 5-40, 10-40, 1-35, 5-35, 10-35, 1-30, 5-30, 10-30, 1-25, 5-25 또는 10-25개의 아미노산이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 CDR을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단일 도메인 항체", "나노바디", "DARPin" 및 "VHH"는 동의어로 사용되며, 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성되는 항체 단편을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 낙타과 동물 항체이다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 낙타, 알파카 또는 라마이다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 낙타이다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 알파카이다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 라마이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 상어 항체이다.
또한, 본원에 이미 표시된 바와 같이, 나노바디의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240(1-2): 185-195의 논문에서; 또는 본원에 언급된 낙타과 동물로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같은, Kabat 등("Sequence of protein of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91)에 의해 제공된 VH에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다. 이 넘버링에 따르면, 나노바디의 FR1은 위치 1-30에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31-35에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36-49에서 아미노산을 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50-65에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3은 위치 66-94에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95-102에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103-113에서 아미노산 잔기를 포함한다. 이와 관련하여, VH 도메인에 대해 그리고 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이 - 각 CDR 내 아미노산 잔기의 총 수는 가변될 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수와 일치하지 않을 수 있다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은 일반적으로, Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링과 일치할 수 있거나 일치하지 않을 수 있음을 의미한다. 그러나 일반적으로 Kabat의 넘버링에 따르면 그리고 CDR 내 아미노산 잔기의 수와 상관없이, Kabat 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 시작과 일치하고 그 반대도 마찬가지이며, Kabat 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 시작과 일치하고 그 반대도 마찬가지이며, Kabat 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 시작과 일치하고 그 반대도 마찬가지이며, Kabat 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 시작과 일치하고 그 반대도 마찬가지이다.
낙타과 동물로부터의 VHH 도메인에 그리고 나노바디에 유사한 방식으로 또한 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안적인 방법은, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"인 Chothia 등(Nature 342, 877-883 (1989))에 의해 설명된 방법이다. 그러나, 본 설명, 측면 및 도면에서는, 달리 표시되지 않는 한, Riechmann 및 Muyldermans에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 Kabat에 따른 넘버링이 지켜질 것이다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는, 인간 항체에 대한 유사성을 증가시키도록 단백질 서열이 변형된, 비-인간 종으로부터의 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 인간 항체와 유사한 서열로 둘러싸인 비-인간 항체의 CDR을 코딩하는 재조합 DNA의 생산에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 인간화는 본 발명의 CDR을 인간 항체 스캐폴드 또는 백본 내로 삽입하는 것을 포함한다. 인간화 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 CDR을 보유하는 이것들의 임의의 생산 방법이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는, 단클론 항체의 생산 동안 생성될 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정인자(에피토프)를 향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제조물과는 대조적으로, 각 단클론 항체는 항원 위 단일 결정인자를 향한다. 단클론항체는 특이성 외에도 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "단클론"은, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 바와 같은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 제조 방법에 의해 생산되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 단클론 항체는 Kohler et al, Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참고)에 의해 제조될 수 있다. "단클론 항체"는 또한 예를 들어, Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류의 것일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 개별 하이브리도마로부터의 세포를 처음 그대로의-프라이밍된(pristine-primed) Balb/c 마우스에 복강 내 주사하여 고농도의 원하는 mAb를 함유하는 복수액을 생산하는 생체 내 생산으로부터 높은 역가의 mAb를 얻을 수 있다. 아이소타입 IgM 또는 IgG의 mAb는 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 이러한 복수액으로부터 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
"항체 단편"은, 이의 항원 결합 영역을 바람직하게 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디(taDb), 선형 항체(예를 들어, 미국 특허 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 외팔(one-armed) 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일 사슬 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, 또는 탠덤(디,트리)- scFv를 포함하지만 이것들로 제한되지 않음); 및 이중특이적 T-세포 인게이저(BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 소화(papain digestion)는 "Fab" 단편이라고 하는, 각 단일-항원 결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편을 생산하며, 상기 "Fc" 단편의 명칭은 쉽게 결정화하는 이것의 능력을 나타낸다. 펩신 처리는 두 개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편이 생기게 한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 결합으로 된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이 구성에서는 VH-VL 이량체의 3개 표면이 있다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올 기를 보유하는, Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 다른 부류로 배정될 수 있다. 온전한 항체에는 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 에이(a), 델타, 이(e), 감마 및 마이크로라고 한다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩타이드는, scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 고찰은 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)를 참고한다.
용어 "디아바디"는, 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH - VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 위 두 도메인 사이에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루며 두 개의 항원-결합 부위를 만들도록 강제된다. 디아바디 생산은 당업계에 알려져 있고, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)에 설명되어 있다.
용어 "다중특이성 항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이성 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체로서, 여기서 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체로서, 각 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 둘 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체로서, 각각이 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼작용성 항체, 공유 또는 비공유 연결된 항체 단편을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 위 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
본 발명의 단클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예는 Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497(1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)에서의 기술과 같은 다양한 기술을 포함한다.
생체 내에서 항체를 생성하는 통상의 방법 외에도, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 시험관 내에서 항체가 생성될 수 있다. 이러한 재조합 항체의 생산은 통상의 항체 생산에 비해 훨씬 더 빠르며, 엄청난 수의 항원에 대해 생성될 수 있다. 또한, 통상의 방법을 사용할 때, 많은 항원이 비면역원성이거나 극도로 독성이 있는 것으로 판명되어, 동물에서 항체를 생성하는 데 사용될 수 없다. 더욱이, 재조합 항체의 친화도 성숙(즉, 친화도 및 특이성 증가)은 매우 간단하고 비교적 빠르다. 마지막으로, 하나의 선택 절차에서 특정 항원에 대한 많은 수의 상이한 항체가 생성될 수 있다. 재조합 단클론 항체를 생성하기 위해서는, 모두 디스플레이 라이브러리에 기반한 다양한 방법을 사용하여 상이한 항원 인식 부위를 가진 큰 항체 풀(pool)을 생성할 수 있다. 이러한 라이브러리는 여러가지 방식으로 만들어질 수 있다: 중쇄 생식계열 유전자의 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하여, 다양한 특이성을 갖는 재조합 항체 단편이 선택될 수 있는 큰 항체 레퍼토리를 생성함으로써 합성 레퍼토리를 생성할 수 있다. 항체 라이브러리 구성을 위한 출발 물질로 인간의 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 나이브 레퍼토리를 작제하여 매우 다양한 인간 라이브러리를 만드는 것이 가능하다. 이 방법은 상이한 항원에 대한 많은 항체를 선택하는 데 성공적으로 널리 사용되었다. 박테리오파지 라이브러리 구성 및 재조합 항체의 선택을 위한 프로토콜은 잘 알려진 참고 텍스트 Current Protocols in Immunology, Colligan et al(Eds.), John Wiley & Sons, Inc.(1992-2000), Chapter 17, Section 17.1에 제공되어 있다.
비-인간 항체는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 한 방법에서, 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 항체 또는 공통 항체 프레임워크 서열에 삽입된다. 그 다음, 항체 프레임워크에 추가 변화를 도입하여 친화도 또는 면역원성을 조절할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 및 이의 일부는 항체, 항체의 단편, Fab 및 F(ab')2, 단일-도메인 항원-결합 재조합 단편 및 천연 나노바디를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFv 또는 scFv2 단편으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 제제를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 전체 면역글로불린 분자 사슬, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 뿐만 아니라, 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3을 포함할 중쇄 불변 영역(CH); 및 "힌지" 영역을 포함한다. 어떤 상황에서는, 불변 영역의 존재가 바람직하다.
폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있는 다른 폴리펩타이드는, 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 Ch1을 포함하며, CK 또는 CL 도메인은 절단되었다. 미니바디는 기존 항체보다 작기 때문에 이것들은 임상/진단 용도에서 더 나은 조직 침투를 달성해야 하지만 2가이므로, 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 더 높은 결합 친화도를 유지해야 한다. 따라서, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 뿐만 아니라, 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편도 포함한다. 암호화 폴리펩타이드에 존재하는 각 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용체 프레임워크에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용체 프레임워크 영역에 대해 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개시된 단백질 산물을 포함하는 개별 아미노산의 특성을 감안할 때, 일부 합리적인 치환이 당업자에 의해 인식될 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은 예를 들어, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다.
적합하게는, 본원에 설명된 폴리뉴클레오타이드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된 폴리뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 용어 "비-자연 발생" 물질, 조성물, 실재물, 및/또는 물질, 조성물 또는 실재물의 임의의 조합, 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 당업자가 "자연-발생하는" 것으로 잘 이해하거나, 언제든지 판사 또는 행정 또는 사법 기관이 "자연적으로 발생하는" 것으로 결정 또는 해석하거나 결정 또는 해석할 수 있는 그러한 형태의 물질, 조성물, 실재물, 및/또는 물질, 조성물 또는 실재물의 임의의 조합을 명시적으로 제외하지만 단지 제외하는 조건부 용어이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2는 서열번호 2에 명시된 아미노산 서열(AISGGGDTYYADSVKG)을 포함하고, CDR3은 서열번호 3에 명시된 아미노산 서열 (DLYGSDYWD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호 4에 명시된 아미노산 서열(INAMA)을 포함하고, CDR2는 서열번호 5에 명시된 아미노산 서열(AITSGSTNYANSVKG)을 포함하고, CDR3은 서열번호 6에 명시된 아미노산 서열(DEYGSDYWI)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2는 서열번호 7에 명시된 아미노산 서열(AITSGGSTNYADSVKG)을 포함하고, CDR3은 서열번호 8에 명시된 아미노산 서열(DLYGEDYWI)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CDR은 Abm 넘버링 방법에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR은 Chothia 넘버링 방법에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR은 Kabat 넘버링 방법에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, CDR1은 서열번호 29에 명시된 아미노산 서열(INAMX1)을 포함하고, 여기서 X1은 G 또는 A이다. 일부 실시양태에서, CDR2는 서열번호 30에 명시된 아미노산 서열(AIX1X2X3GX4TX5YAX6SVKG)을 포함하고, 여기서 X1은 S 또는 T이고, X2는 G 또는 S이고, X3은 G 또는 S이고, X4는 D 또는 S이고, X5는 Y 또는 N이고, X6은 D 또는 N이다. 일부 실시양태에서, CDR3은 서열번호 31에 명시된 아미노산 서열(DX1YGX2DYWX3)을 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고, X2는 E 또는 S이고, X3은 D 또는 I이다. 일부 실시양태에서, CDR3은 서열번호 32에 명시된 아미노산 서열(DX1YGSDYWX2)을 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고, X2는 D 또는 I이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 단일-도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 VHH 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 낙타과 동물 항체이다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 라마이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 위에 언급된 CDR 이외의 다른 CDR을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열번호 9)을 포함하고/하거나 이것으로 구성되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 10)을 포함하고/하거나 이것으로 구성되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 11)을 포함하고/하거나 이것으로 구성되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VHH 서열은 His 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, His 태그는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 히스티딘 잔기이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, His 태그는 6개의 히스티딘 잔기로 구성된다. 일부 실시양태에서, His 태그는 링커를 통해 VHH에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌 반복 링커이다. 일부 실시양태에서, 알라닌 반복은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 알라닌 잔기를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 알라닌 반복 링커는 3개의 알라닌 잔기로 구성된다. 일부 실시양태에서, His-태그는 6개의 His 태그이다.
일부 실시양태에서, 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하고 His 태그를 포함하는 VHH 서열은 EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 33, 클론 2A1); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 34, 클론 4A4); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 35, 클론 4A1)이다.
일부 실시양태에서, VHH 서열은 His 태그의 C-말단에 시스테인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 스페이서에 의해 His-태그로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 단일 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 글라이신 잔기를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, His-태그, 및 글라이신에 의해 His-태그로부터 분리된 C-말단 시스테인을 포함하는 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 VHH 서열은 EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC (서열번호 36); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC (서열번호 37); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC (서열번호 38)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하고, 여기서: CDR-H1은 서열번호 39에 명시된 아미노산 서열(GYTLTNY)을 포함하고, CDR-H2은 서열번호 40에 명시된 아미노산 서열(NTYTGK)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 41에 명시된 아미노산 서열(GDANQQFAY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 42에 명시된 아미노산 서열(KASQDINSYLS)을 포함하고, CDR-L2은 서열번호 43에 명시된 아미노산 서열(RANRLVD)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 44에 명시된 아미노산 서열(LQYDEFPPT)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하고, 여기서: CDR-H1은 서열번호 12에 명시된 아미노산 서열(GFTFSSYYMS)을 포함하고, CDR-H2은 서열번호 13에 명시된 아미노산 서열(TISDGGDNTYYAGTVTG)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 14에 명시된 아미노산 서열(IHWPYYFDS)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 15에 명시된 아미노산 서열(RASSSVSYMN)을 포함하고, CDR-L2은 서열번호 16에 명시된 아미노산 서열(ATSDLAS)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 17에 명시된 아미노산 서열(QQWSSHPPT)을 포함한다. 이 항체는 본원에서 M9로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 아미노산 서열 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCVASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGDNTYYAGTVTGRFTISRDFAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCARIHWPYYFDSWGQGTTLTVSS (서열번호 45)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 가변 영역은 서열번호 45를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 뉴클레오타이드 서열 GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATAAGTGATGGTGGTGATAACACCTACTACGCAGGCACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGACCTCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATTCATTGGCCTTACTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (서열번호 46)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 서열번호 46으로 구성된다. 항체 M9를 시퀀싱하였고, 서열번호 45로 구성되는 중쇄를 갖는 것으로 밝혀졌다. Chothia 계획을 사용하여 결정된 이 중쇄의 CDR은 서열번호 12-14이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 아미노산 서열 QFVLSQSPAILSASPGEMLTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGGGTKLEIR (서열번호 47)을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄의 가변 영역은 서열번호 47을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 뉴클레오타이드 서열 CAATTTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCCGGGGAGATGCTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCGACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGA (서열번호 48)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 서열번호 48로 구성된다. 항체 M9를 시퀀싱하였고, 서열번호 47로 구성되는 경쇄를 갖는 것으로 밝혀졌다. Chothia 계획을 사용하여 결정된 이 경쇄의 CDR은 서열번호 15-17이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단량체로서 결합한다. 일부 실시양태에서 제1 모이어티는 이량체로서 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단량체 및/또는 이량체로서 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 이량체로 결합하지만, mCD28을 가교 및/또는 활성화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 이량체로 결합하지만, CD28의 단일 분자에만 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단량체 CD28에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 이량체 CD28에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 단량체 및/또는 이량체 CD28에 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD28 작용제가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD28 길항제가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD28 작용제도 길항제도 아니다.
용어 "작용제"는 수용체에 결합하고 수용체를 완전히 또는 부분적으로 활성화하는 분자, 화합물 또는 제제를 일반적으로 지칭한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 천연 리간드와 동일한 부위에서 결합한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 천연 리간드의 결합 부위와 상이한 알로스테릭(allosteric) 부위에서 결합한다. 용어 "길항제"는 작용제와 동일한 부위 또는 또 다른 부위에서 수용체에 결합하고, 수용체를 활성화하지 않고, 다음 중 하나 이상을 수행하는 분자, 화합물 또는 제제를 일반적으로 지칭한다: 천연 리간드에 의한 수용체의 활성화를 방해하거나 차단하고, 수용체 작용제에 의한 수용체의 활성화를 방해하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 mCD28에 결합하지만, 수용체를 활성화하지 않거나 활성화를 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD86에 의한 활성화를 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 mCD28에 결합하지 않는다.
본원에 사용된 "직접 작용제/길항제"는 수용체(mCD28)에 결합하고 결합함으로써 그 분자에 의한 신호전달을 증가/감소시키는 분자를 지칭한다. mCD28의 경우, 작용제는 mCD28에 결합하고 결합함에 의해 세포에서 mCD28 신호전달을 증가시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 T 세포 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 작용제는 T 세포 증식을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 작용제는 전염증성 사이토카인 분비를 증가시킨다. 전염증성 사이토카인은 당업계에 잘 알려져 있고, 활성화 T 세포에 의해 분비되는 것으로 알려져 있다. 전염증성 사이토카인의 예는 TNFα, IFNγ, IL-1B, IL-2 및 IL-6을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전염증성 사이토카인은 IFNγ이다. 일부 실시양태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-2이다. mCD28의 경우, 길항제는 mCD28에 결합하고 결합함으로써 세포에서 mCD28 신호전달을 감소시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 T 세포 활성화를 감소시키고, T 세포 증식을 감소시키고/시키거나, 전염증성 사이토카인 분비를 감소시킨다. 수용체 신호전달을 수정하기 위해 리간드 접촉, 억제제 접촉, 공동-수용체 접촉 또는 당해 수용체 이외의 임의의 분자와 접촉함으로써 수용체 신호전달을 수행하는 분자는 직접 작용제/길항제로 간주되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제제는 혈청 내 sCD28과 접촉하여, 세포 위 mCD28을 통한 증가된 신호전달을 허용한다. 그 결과 mCD28 신호전달이 증가하지만, mCD28로의 결합이 수용체 신호전달을 증가시키지 않기 때문에 항체는 mCD28 작용제 또는 직접 작용제가 아니다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 리간드 결합 도메인으로의 접근을 가리거나 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 sCD28의 IgV 도메인에 결합하지 않거나 이 도메인으로의 접근을 가리거나 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, IgV 도메인은 리간드 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 서열번호 20의 아미노산 28-137을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 아미노산 서열 MLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG (서열번호 49)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 sCD28의 리간드로의 결합을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD28 리간드는 CD80, CD86 및 ICOSL로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD28 리간드는 CD86이다. 일부 실시양태에서, CD28 리간드는 CD80이다. 일부 실시양태에서, CD28은 ICOSL이다. 일부 실시양태에서, CD86은 CD86-Fc이다. 일부 실시양태에서, CD80은 CD80-Fc이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 CD28의 줄기 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28의 막 근접 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 줄기 영역은 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호 50)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 영역은 서열 KGKHLCPSPLFPGPS (서열번호 51)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 영역은 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호 52)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, CD28 세포외 도메인의 단편은 줄기 영역이다. 일부 실시양태에서, CD28에 결합하는 제1 모이어티는 CD28의 절단을 방해한다. 일부 실시양태에서, CD28에 결합하는 제1 모이어티는 세포로부터 CD28의 쉐딩을 방해한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 줄기 영역 내 절단 부위에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28 내 절단 부위에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 적어도 하나의 프로테아제의 절단 부위에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 MMP-2의 절단 부위에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 리간드 결합 도메인으로의 접근을 가리거나 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 절단 부위에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 절단 부위로의 접근을 가리거나 폐색하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 프로테아제 절단 부위에 결합, 차단, 폐색 또는 가린다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 프로테아제 절단 부위에 결합하지 않지만 상기 부위를 폐색시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 절단 부위로의 접근을 차단한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 이의 조합의 제제는 프로테아제 절단 부위를 차단하는 입체 장애를 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 프로테아제 절단 부위에 결합하지 않지만, 제제의 결합은 프로테아제 절단 부위를 차단하는, mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 결합은 프로테아제 절단 부위를 차단하는, mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MMP-2이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MMP-13이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 절단 모티프이다. 일부 실시양태에서, MMP-2 절단 모티프는 PXX/X이고, 여기서 마지막 X는 소수성 잔기이다. 일부 실시양태에서, CD28 내 PXX/X 모티프는 PSP/L이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호 20의 아미노산 142-145(PSPL)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호 21의 아미노산 142-145(PSPL)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호 52의 아미노산 9-12(PSPL)이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 프로테아제의 절단 부위로의 접근을 차단한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 mCD28의 줄기 영역 내 PSPL에 결합한다.
일부 실시양태에서, 절단 부위는 류신 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 발린 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 방향족 아미노산 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 류신, 발린 및/또는 방향족 아미노산 앞이다. 일부 실시양태에서, 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 티로신 및 히스티딘으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 서열번호 20의 히스티딘 134, 발린 135, 히스티딘 139, 류신 140, 류신 145, 및 페닐알라닌 146 중 어느 하나의 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 서열번호 20의 히스티딘 134, 발린 135, 히스티딘 139, 류신 140, 류신 145, 및 페닐알라닌 146 앞이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 서열번호 20의 류신 145 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 서열번호 1의 류신 145 앞이다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 서열번호 21의 류신 127 앞이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역은 프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역은 메탈로프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제 2(MMP-2)에 대한 기질이 아니다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제 13(MMP-13)에 대한 기질이 아니다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위는 서열번호 20의 류신 127의 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위는 서열번호 20의 류신 145에 대한 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 20의 류신 145에 대한 아미노산 치환은 라이신이다.
일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD28 기능 및/또는 신호전달을 조절하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 mCD28을 분해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 mCD28 분해로 이어지거나 이를 촉진하지 않는다. 일부 실시양태에서, 신호전달은 mCD28-매개 면역 세포 활성화이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 면역 세포 활성화를 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 CD28 수용체 내재화(internalization) 또는 재이용을 유도하지 않는다. mCD28을 통한 공동-자극은 T-세포의 면역 활성화에 필수적이다. 단백질분해 절단은, 막에 남아 있는 단백질의 막횡단 및 세포질 부분으로부터 CD28의 세포외 영역 내 리간드-결합 도메인을 제거한다. 따라서, 절단된 CD28은 신호전달할 수 없고 T 세포 활성화에 기여할 수 없다. 따라서, 절단을 차단하며 길항제이기도 한 제제는 mCD28 활성화를 허용하지 않는다. 유사하게, 절단을 차단하지만 작용제이기도 한 제제는 비정상적인 T-세포 활성화 및 잠재적으로 자가면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 면역 세포 위 mCD28의 표면 수준을 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 mCD28의 수준을 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7, 5, 3 또는 1% 미만까지 감소시킨다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기 제제의 세포로의 결합은 세포를 사멸시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제의 세포로의 결합은 세포의 사멸로 이어지지 않는다. 일부 실시양태에서 상기 제제는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 ADCC 및/또는 CDC를 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 항체이고, IgG2 또는 IgG4 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG2 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG4 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체의 결합에 의해 매개된 세포 사멸을 감소시키도록 돌연변이된 IgG1 또는 IgG3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 Fc 수용체 결합 도메인을 돌연변이한다. 일부 실시양태에서, 항체의 Fc 도메인은 CDC, ADCC 또는 이 둘 모두를 감소시키도록 조작되거나 돌연변이된다. Fc 조작은 당업계에 잘 알려져 있으며, 항체 매개 세포 사멸을 감소시키는 것으로 알려진 임의의 돌연변이 또는 아미노산 변화가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합에는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 Fc 도메인이 결여되어 있는 항원 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 단일-도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 낙타과 동물, 상어 또는 나노바디이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 비-항체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티, 제2 모이어티 또는 이 둘 모두는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 합성 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 합성 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 합성 펩타이드는 비-항체 스캐폴드에 기반한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 항체 모방체이다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 또는 20 kDa 미만의 몰 질량(molar mass)을 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 제제, 제1 모이어티, 제2 모이어티, 또는 이의 조합은 핵산 압타머(aptamer)이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 DNA 또는 RNA이다. 항체 모방체의 예는 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 파이노머, Kunitz 도메인 펩타이드, 모노바디 및 nanoCLAMPS를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 DARPin이다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 단백질분해 절단을 억제한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 메탈로프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트레오닌 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 세린, 시스테인 또는 트레오닌 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 글루탐산 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 시스테인 및 트레오닌 프로테아제로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 아스파라긴 펩타이드 리아제(lyase)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 셰다제(sheddase)이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 엑소펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 엔도펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 엑소펩티다제 또는 엔도펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 아연 촉매화된다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 코발트 촉매화된다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-13(MMP-13)이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 ADAM17이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10, MMP-2 및/또는 ADAM17이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10, MMP-2, MMP-13 및/또는 ADAM17이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, MMP-13, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 아닌 차폐 분자에 융합된다. 본원에 사용된 용어 "차폐 분자"는 분해, 청소 또는 제거로부터 제1 모이어티를 보호하는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 생분해성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 다당류 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 단백질 중합체이다. 일부 실시양태에서, 단백질 중합체는 구조화되지 않은 단백질 중합체이다. 중합체의 예는 천연 다당류, 반-합성 다당류, O-연결된 올리고당류, N-연결된 올리고당류, 덱스트란, 아가로스, 알기네이트, 키토산, 카라기난, 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 히알루론산, 호모-아미노산 중합체, 엘라스틴 유사 중합체, XTEN, PAS, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리-(글리콜산)(PGA) 및 폴리-(락트산)(PLA), 폴리-(락트산-코-글리콜) 산)(PLGA) 및 폴리-D,L-락트산(PDLLA)을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 생체적합성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 PEG이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 PEG, PLGA, PGA, PLA 및 PDLLA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 PLGA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 PGA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 PLA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 PDLLA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 덱스트란, 아가로스, 알기네이트, 키토산, 카라기난, HES, 폴리시알산 및 히알루론산으로부터 선택된 올리고당류 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 XTEN 및 PAS로부터 선택된 단백질 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 분자는 복수의 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 PEG 분자에 또는 복수의 PEG 분자에 융합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 폴리펩타이드를 포함하지만 PEG 분자를 포함하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 중합체 분자에 또는 복수의 중합체 분자에 융합된 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 복수의 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 PEG 또는 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG는 사슬화 PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG는 PEG의 사슬이다. 일부 실시양태에서, PEG는 분지형 PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG는 PEG 메틸 에테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 PEG 디메틸 에테르이다.
일부 실시양태에서, PEG는 저분자량 PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG는 고분자량 PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 10000, 15000 또는 20000 g/mol의 분자량을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, PEG는 최대 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000 또는 50000 g/mol의 분자량을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 10000, 15000, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 또는 50000 g/mol의 분자량을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, PEG는 적어도 2KDa의 몰 질량을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 적어도 2 kDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 2 내지 40 KDa의 몰 질량을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 2 내지 40 KDa의 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2 KDa 미만의 PEG는 반감기 연장을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 카복실산 잔기에서 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 시스테인 잔기에서 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 아스파르트산 잔기에서 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 글루탐산 잔기에서 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 라이신 잔기에서 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기에서 폴리펩타이드에 부착되고, 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, PEG는 티올 연결을 통해 시스테인에 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 제1 모이어티의 C-말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 링커의 C-말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 제1 모이어티의 C-말단에 근접한 아미노산 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 링커의 C-말단에 근접한 아미노산 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 근접은 10개 아미노산 이내이다. C-말단에 가까운 접합은 PEG 모이어티를 CDR로부터 멀리 유지하여, 결합을 방해할 가능성을 감소시킬 것임을 당업자는 이해할 것이다.
본원에 사용된 "PEG화"는, 분자 및 거대구조로의 PEG의 공유 및 비공유 부착 또는 융합 둘 모두의 과정이다. PEG화 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참고로 편입되는 미국 특허 7,610,156에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, PEG는 제1 모이어티에 직접 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 링커에 직접 접합된다. 일부 실시양태에서, 접합은 비가역적 접합이다. 일부 실시양태에서, PEG는 화학 기에 접합되고 화학 기는 제1 모이어티에 결합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 화학 기에 접합되고 화학 기는 링커에 결합된다. 일부 실시양태에서, 화학 기와 제1 모이어티 또는 링커 사이의 결합은 가역적이다. 예를 들어, SPDP 기(2-피리딜-디티오, OPSS-오르토-피리딘 이황화물로도 알려짐)로 치환된 PEG는 상기 기를 통해 시스테인 잔기와 반응하여 가역적 이황화 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 비가역적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG는 가역적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 모이어티는 적어도 하나의 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 모이어티는 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 2개의 모이어티는 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 2개의 모이어티는 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 적어도 2개의 모이어티 사이에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 제1 모이어티와 제2 모이어티 사이에 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 적어도 하나의 GGGGS (서열번호 18) 서열을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 적어도 하나의 GGGS 서열을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 적어도 하나의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 1, 3, 또는 7개의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 GGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 1개의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 3개의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 7개의 GGGGS 반복부를 포함하거나 이것들로 구성된다.
일부 실시양태에서, 링커는 제1 모이어티의 mCD28로의 결합을 허용하기에 충분한 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 제1 모이어티의 이것의 표적 에피토프로의 결합을 허용하기에 충분한 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 제1 모이어티의 세포 위 mCD28의 줄기 영역으로의 결합을 허용하기에 충분한 길이이다. 당업자는 보호 모이어티의, 세포 표면 위 mCD28의 줄기 영역에 결합할 수 있는 작은 모이어티로의 연결이, 보호 모이어티가 제1 모이어티의 결합 능력을 교란시킬 입체 장애를 생성하지 않기에 충분한 길이여야 할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 링커는 줄기 도메인으로 접근되게 하는 제1 모이어티의 이동 범위를 허용하기에 충분한 길이여야 한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 mCD28 가교를 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 면역 활성화를 유도하는 mCD28 가교를 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 하나의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 두 개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 디펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 GC이다. 일부 실시양태에서, 링커는 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 C-말단 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 C-말단에 근접한다. 일부 실시양태에서, 근접부는 C-말단의 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 3, 2 또는 1개의 아미노산 이내이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 근접부는 C-말단의 10개 아미노산 이내이다. 일부 실시양태에서, C-말단은 제1 모이어티의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, C-말단은 링커의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 5개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 10개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 15개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 35개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 5개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 15개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 20개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 30개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 35개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 40개의 아미노산을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 최대 50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100, 5-75, 5-50, 5-35, 5-15, 10-100, 10-75, 10-50, 10-35, 10-30, 10-20, 15-100, 15-75, 15-50, 15-35, 15-30, 15-20, 20-100, 20-75, 20-50, 20-35, 20-30, 25-100, 25-75, 25-50, 25-35, 20-30, 35-100, 35-75 또는 35-50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-35개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 15-35개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 15-50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 35 내지 50개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 10 내지 30개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 15 내지 20개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 15 내지 30개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 10 내지 40개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 20 내지 40개의 아미노산을 포함하거나 이것들로 구성된다.
일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 C-말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 N-말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티의 C-말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티의 N-말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 C-말단은 링커에 연결되고, 제2 모이어티의 N-말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 N-말단은 링커에 연결되고, 제2 모이어티의 C 말단은 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 C-말단은 펩타이드 링커의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 N-말단은 펩타이드 링커의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티의 C-말단은 펩타이드 링커의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티의 N-말단은 펩타이드 링커의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 C-말단은 펩타이드 링커의 N-말단에 연결되고, 펩타이드 링커의 C-말단은 제2 모이어티의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티의 N-말단은 펩타이드 링커의 C-말단에 연결되고, 펩타이드 링커의 N-말단은 제2 링커의 C-말단에 연결된다.
본원에 사용된 용어 "연결된(linked)"은, 2개의 모이어티가 안정적으로 연결되는 당업계에 알려진 임의의 부착 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 연결된은 공유 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 펩타이드 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 가역적 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 비가역적 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 아미노 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 티올 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결된은 세린 연결이다. 일부 실시양태에서, 연결은 아미노산의 측쇄로의 연결이다.
일부 실시양태에서, 링커는 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 하나의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 링커의 N-말단에 연결되고, 시스테인은 링커의 C-말단에 있다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 링커의 C-말단에 연결되고, 시스테인은 링커의 N-말단에 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인을 포함하는 링커는 히스티딘 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘 태그는 복수의 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘 태그는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 히스티딘을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 히스티딘 태그는 6개의 히스티딘을 포함한다.
일부 실시양태에서, PEG 분자는 시스테인에 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 시스테인에 부착된다. 일부 실시양태에 따르면, 제2 모이어티는 티올 연결을 통해 시스테인에 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 티올 반응성 기 또는 복수의 티올 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 적어도 하나의 티올 반응성 기를 포함한다. 티올 반응성 기의 예는 OPSS, 말레이미드, 비닐설폰 및 요오도아세트아미드 작용 기를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 티올 연결을 통해 시스테인에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 티올 반응성 기 또는 복수의 티올 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG 분자 또는 분자들은 하나의 티올 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 기는 OPSS, 말레이미드, 비닐설폰 및 요오도아세트아미드 작용 기로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, mCD28에 결합하는 제1 모이어티는 100 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, mCD28에 결합하는 제1 모이어티는 50 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, mCD28에 결합하는 제1 모이어티는 25 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, mCD28에 결합하는 제1 모이어티는 20 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, mCD28에 결합하는 제1 모이어티는 15 kDa 미만이다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 제2 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 링커에 의해 제1 모이어티에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 차폐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 차폐 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 보호 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 제1 모이어티를 보호한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 제1 모이어티를 차폐한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안정성을 증가시키는 것은 생리학적 유체 내 안정성을 증가시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 생리학적 유체는 생물학적 유체이다. 일부 실시양태에서, 체액은 혈액, 혈청, 위액, 장액, 타액, 담즙, 종양액, 모유, 소변, 간질액 및 대변으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 유체는 혈액이다. 일부 실시양태에서, 혈액은 전혈 또는 혈청이다. 일부 실시양태에서, 혈액은 혈청이다. 일부 실시양태에서, 혈액 내 안정성을 증가시키는 것은 혈액으로부터의 제거를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터의 제거를 감소시키는 것은 혈액으로부터 제1 모이어티의 제거를 감소시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것은 혈액으로부터 상기 제제의 제거를 감소시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것은 신장 여과를 감소시키는 것, 리소좀 분해를 감소시키는 것 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것은 신장 여과를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것은 리소좀 분해를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안정성을 증가시키는 것은 제1 모이어티의 반감기를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안정성을 증가시키는 것은 분해를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분해는 프로테아제에 의한 분해를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분해는 리소좀에 의한 분해를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제거를 감소시키는 것은 신장계 또는 신장 사구체에 의해 여과되는 제1 모이어티의 비율을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 제1 모이어티의 안정성을 증가시키고 제1 모이어티의 제거를 감소시키고 제1 모이어티의 분해를 감소시키거나 이의 임의 조합이다. 대상체에서 단백질의 안정성을 측정하는 것은 당업계에 잘 특성화되어 있고, 임의의 방법이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 내 분자 농도의 측정은 안정성을 계산하기 위해 다양한 시점에서 실시된다.
당업자는 제2 모이어티의 기능이 증가, 감소, 향상, 줄어듬, 또는 임의의 비교 측정으로 지칭될 때, 상기 비교가 제1 모이어티 단독과 비교되는 것임을 이해할 것이다. 링커에 연결된 제1 모이어티와의 비교도 구상된다. 일부 실시양태에서, 증가는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000% 증가이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 감소는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100% 감소이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 또는 혈액 분자를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 혈청 또는 혈액 분자는 인간 분자이다. 일부 실시양태에서, 상기 분자는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 세포 위 수용체에 의해 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용체에 의한 결합은 세포로의 흡수를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 흡수는 혈액으로 다시 방출되게 한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 혈청 알부민이다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 HSA 결합 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, HSA는 아미노산 서열 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 65)을 포함한다. 일부 실시양태에서, HSA는 서열번호 65로 구성된다.
일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 단백질에 결합하는 분자를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 단백질에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 단백질에 결합하는 지질을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 알부민에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 HSA에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 혈청 알부민에 결합하는 지질을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 HSA에 결합하는 지질을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 지질은 지방산 또는 지방산 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 HSA 결합 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 HSA 결합 지질을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 HSA에 특이적으로 결합하는 펩타이드로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 단일 사슬 항체이다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 HSA에 특이적으로 결합하는 펩타이드이다.
일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, HSA 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 서열: EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA (서열번호 19)를 포함하거나 이것으로 구성되는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, HSA에 결합하는 단일 도메인 항체는 Alb8이다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 인간 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 발현 벡터 위에 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터이다.
용어 "핵산"은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 "핵산"은, 핵염기를 포함하는 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체의 분자(즉, 가닥)를 일반적으로 지칭할 것이다. 핵염기는 예를 들어, DNA에서 발견된 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기(예를 들어, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 사이토신 "C") 또는 RNA(예를 들어, A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다. 용어 "핵산 분자"는, 단일-가닥 RNA(ssRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 단일-가닥 DNA(ssDNA), 이중-가닥 DNA(dsDNA), 작은 RNA, 예컨대 miRNA, siRNA 및 기타 짧은 간섭 핵산, snoRNA, snRNA, tRNA, piRNA, tnRNA, 작은 rRNA, hnRNA, 순환 핵산, 게놈 DNA 또는 RNA의 단편, 분해된 핵산, 리보자임, 바이러스 RNA 또는 DNA, 감염 기원의 핵산, 증폭 산물, 변형된 핵산, 플라스미드 또는 소기관 핵산 및 인공 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제제의 제1 모이어티를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제제의 제2 모이어티를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제제의 제1 및 제2 모이어티 둘 모두를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제제의 제1 모이어티만을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열은 동일한 핵산 분자 위에 위치한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열은 별도의 핵산 분자 위에 위치한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 헥산에 의해서는 암호화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본 발명의 제제 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 제제에 대한 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 제1 모이어티에 대한 코팅 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하고, 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열은 프레임 내에 있어 융합 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 링커에 대한 코딩 서열에 의해 분리된 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하고, 제1 모이어티, 링커, 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열은 프레임 내에 있어 융합 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 프레임 내 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 링커에 대한 코딩 서열에 의해 분리된 제1 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 제1 모이어티, 링커, 및 제2 모이어티에 대한 코딩 서열은 프레임 내에 있다.
일부 실시양태에서, 제제 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은, 관심 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템에서, 또는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때는 숙주 세포에서) 조절 요소 또는 요소들에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다.
사용 방법
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및 예방하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 면역요법을 개선하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 sCD28을 감소시키는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 면역요법은 PD-1 또는 PD-L1 기반 면역요법이다. 일부 실시양태에서, PD-1/PD-L1 기반 면역요법은 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 요법은 PD-1 체크포인트의 차단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 대상체에게 동종, 동계 또는 자가 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역요법이 필요한 대상체는 암을 앓는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 앓는다. 일부 실시양태에서, 암은 sCD28 양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 sCD28 높은 암이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발병할 위험이 있다.
본원에 사용된 용어, 질병, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "치료하는"은, 이의 적어도 하나의 증상의 완화, 이의 중증도에서의 감소, 또는 이의 진행의 억제를 포함한다. 치료는 질병, 장애 또는 병태가 완전히 치유됨을 의미할 필요는 없다. 효과적인 치료가 되기 위해서는, 본원에서의 유용한 조성물이 단지 질병, 장애 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 이와 관련된 증상의 중증도를 감소시키거나, 환자 또는 대상체의 삶의 질에 대한 개선을 제공해야 한다.
일부 실시양태에서, 감소는 본 발명의 적어도 하나의 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "투여하는", "투여" 및 유사한 용어는, 건전한 의료 관행에서 치료 효과를 제공하는 그러한 방식으로 활성제를 함유하는 조성물을 대상체에게 전달하는 임의의 방법을 지칭한다. 본 발명의 내용의 한 측면은, 치료적 유효량의 본 발명의 제제를 필요로 하는 환자에게 경구 투여하는 것을 제공한다. 다른 적절한 투여 경로는 비경구, 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투여는 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "담체", "부형제" 또는 "보조제"는, 활성제가 아닌 약제 조성물의 임의의 성분을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 무독성, 불활성 고체, 반-고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의 유형의 제형 보조제, 또는 단순히 멸균 수성 매체, 예컨대 염수를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트, 발열원-비함유 물; 등장 식염수, 링거 용액; 에틸 알콜 및 인산염 완충 용액 뿐만 아니라, 제약 제형에 사용된 기타 무독성 친화성 물질이다. 본원에서 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 당, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 황산칼슘, 폴리올, 발열원-비함유 물, 등장 식염수, 인산염 완충 용액 뿐만 아니라, 기타 제약 제형에 사용된 기타 무독성의 약제학적 친화성 물질을 포함한다. 습윤제 및 윤활제, 예컨대 라우릴황산나트륨 뿐만 아니라, 부형제, 안정제, 항산화제 및 보존제가 또한 존재할 수 있다. 임의의 무독성의, 불활성이고 효과적인 담체를 사용하여 본원에서 고려된 조성물을 제형화할 수 있다.
담체는 본원에 제시된 약제 조성물의, 총 약 0.1 내지 약 99.99999중량%를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 mCD28을 분해하지 않거나 분해로 이어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 면역 세포 위 mCD28 수준을 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 면역 세포 위 mCD28 수준을 유지한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 면역 세포 위 mCD28 수준을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 감소는 sCD28에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99% 감소이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 감소는 혈청 sCD28에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 감소는 sCD28의 혈액 수준에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 감소는 종양 미세환경(TME) 내 sCD28의 수준에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 감소 전 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수준은 건강한 대상체의 수준 이상으로 상승된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 sCD28 수준은 건강한 대상체 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000%까지 높게 상승된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 수준은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng/혈액 mL 초과로 상승된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 수준은 5 ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시양태에서, 상기 수준은 10 ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시양태에서, 상기 수준은 20 ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈액은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng sCD28/혈액 mL를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng sCD28/혈액 mL를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈액은 적어도 5 ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈액은 적어도 10 ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈액은 적어도 20 ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 5 ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 10 ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 20 ng/mL sCD28을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 앓는다. 일부 실시양태에서, 암은 PD-1/PD-L1 요법으로 치료될 수 있는 암이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법을 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대한 무반응자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대해 무경험이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법과 함께 수행된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법에 앞서 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 또 다른 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 PD-1 또는 PD-L1 기반 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 면역요법은 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 및/또는 PD-L1 억제제이다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 일부 실시양태에서, 또 다른 면역요법은 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 면역요법이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CAR-T이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CAR-NK이다. 일부 실시양태에서, 또 다른 면역요법은 암 백신이다.
본원에 사용된 용어 "CAR-T 세포" 및 "CAR-NK 세포"는, 적어도 하나의 관심 단백질에 대해 특이성을 가지며(예를 들어, 후성유전학적 변형제로의 치료 후 증가된 발현을 갖는 면역원성 단백질) 면역 효과기 세포(T 세포 또는 NK 세포) 위에 이식되는 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CAR-T 세포는 T-세포 위에 이식된 단클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR-NK 세포는 NK-세포 위에 이식된 단클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, T 세포는 세포독성 T 림프구 및 조절 T 세포로부터 선택된다.
CAR-T 및 CAR-NK 세포, 및 이들의 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 세포는 수용체가 결합하는 단백질을 표적화하며 이에 대해 세포독성이다. 일부 실시양태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 적어도 하나의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 복수의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 후성유전학적 변형제와의 접촉으로 인해 증가된 발현을 갖는 바이러스 단백질을 표적화한다.
CAR-T 세포의 작제는 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 바이러스 단백질에 대한 단클론 항체가 제조될 수 있고, 그 다음 상기 항체를 코딩하는 벡터가 작제될 것이다. 상기 벡터는 또한 공동자극 신호 영역을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 공동자극 신호 영역은 알려진 T 세포 또는 NK 세포 자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3Z, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD 7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 또한 CD3Z 신호전달 도메인을 포함한다. 그 다음 이 벡터는 예를 들어, 렌티바이러스 감염에 의해 T 세포로 형질감염된다.
일부 실시양태에서, 암은 sCD28 수준이 상승된 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상승되고/되거나 높은 sCD28 수준은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 ng/mL이고/이거나, 이 초과의 수준이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상승된 및/또는 높은 sCD28 수준은 건강한 대상체 내 수준의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75%이고/이거나, 이 초과의 수준이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 암은 유방 암이 아니다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 및 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 및 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 또는 결장직장암이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다.
키트
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 적어도 하나의 제제, 또는 본 발명의 약제 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 상기 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 본 발명의 제제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제와 함께 사용하기 위한 것임을 진술하는 라벨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료제가 본 발명의 항체 또는 약제 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 진술하는 라벨을 포함한다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 항체 또는 약제 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 진술하는 라벨을 포함하는, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 암 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 진단 키트이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 필요로 하는 대상체에서 sCD28의 혈청 수준을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 앓는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 제제 또는 약제 조성물로 치료될 대상의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 항-PD-1/PD-L1 기반 면역요법으로 치료될 대상체의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다.
제제 생성 방법
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 제제를 생성하는 방법으로서,
a. 세포 표면 위 mCD28에 결합하는 제1 모이어티를 얻는 단계;
b. 제1 모이어티를 링커에 의해 단백질 안정성을 향상시키는 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생성하고, 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 결합을 시험하는 단계; 및
c. 세포 표면 위 mCD28에 결합하는 연결된 제제를 선택하여 본 발명의 제제를 생성하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 생성 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명에 대한 제제를 생성하는 방법으로서,
제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 제제를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 핵산 서열이
i. 세포 표면 위 mCD28에 결합하는 제1 모이어티를 얻고;
ii. 제1 모이어티를 링커에 의해 단백질 안정성을 향상시키는 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생성하고, 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 결합을 시험하고;
iii. 세포 표면 위 mCD28에 결합하는 연결된 제제를 선택함으로써 선택된 제제의 핵산 서열인 단계를 포함하는 생성 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 연결은 제1 모이어티를 링커에 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제2 모이어티를 링커에 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 제1 모이어티에 부착된 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 제2 모이어티에 부착된 링커에 연결된다. 일부 실시양태에서, 연결은 연결의 화학적 과정을 포함한다. 펩타이드 연결 방법 및 화학적 연결 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 임의의 이러한 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 표면 위 mCD28의 프로테아제에 의한 절단을 차단하는 상기 제제의 능력을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 절단 방지제이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 쉐딩 방지제이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 대상체에서 sCD28의 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 mCD28의 절단을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 대상체에서 mCD28의 절단을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 MMP-2이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 ADAM10이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 ADAM17이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다.
본원에 사용된 용어 "CD28의 세포외 도메인"은, 막횡단 도메인 앞에 오는 CD28의 N-말단 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인은 sCD28이다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인은 CD28a이다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인은 CD28 줄기 도메인이다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인은 CD28의 줄기 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인은 서열 NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호 53)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 이량체이다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 단량체이다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 이량체 또는 단량체이다.
본원에 사용된 "단편"은, 더 큰 단백질 또는 단백질 도메인의 일부를 구성하는 부분 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단편은 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CD28의 세포외 도메인의 단편에 결합하는 제제를 얻는 것은 CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 제제를 얻는 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 얻어진 제제의 존재 하에 mCD28 하류 신호전달을 검정하고, mCD28 신호전달에 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 연결된 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 선택은 mCD28 신호전달을 길항하지 않는 적어도 하나의 제제를 선택하는 것이다. 당업자는, 암 치료의 경우 CD28 신호전달에 작용하는 것은 해롭지 않을 수 있지만, 상기 신호전달에 길항하는 것은 역효과를 낳을 것임을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 것은 제제의 존재 및 부재 하에 활성화된 면역 세포의 혈청 내 sCD28을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 것은 제제, 프로테아제, 및 절단 부위를 포함하는 CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 혼합하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험하는 것은 절두 및/또는 절단을 체크하기 위해 CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 시퀀싱하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험하는 것은 절단으로 인한 크기 변화를 측정하기에 충분히 민감한 겔 위에 CD28의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 흘려보내는(running) 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험하는 것은 제제 및 프로테아제의 존재 하에 mCD28을 발현하는 세포로부터 sCD28의 생산을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈액 내, 연결된 제제의 안정성을 검정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈액 내 증가된 안정성을 갖는 연결된 제제를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 안정성을 검정하는 것은 제1 모이어티 단독의 안정성과 비교된다. 일부 실시양태에서, 증가된 안정성을 검정하는 것은 링커에 연결된 제1 모이어티의 안정성과 비교된다. 단백질 안정성을 검정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 설명된 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정하는 것은 혈액 또는 혈청 내 제제를 인큐베이션하고, 다양한 시점에서 제제 농도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정하는 것은 제제를 모델 동물에 투여하고, 다양한 시점에서 동물의 혈액 내 제제 농도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델 동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 마우스이다. 당업계에 알려진 안정성, 반감기 및/또는 혈액 보유를 검정하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 상어 또는 낙타과 동물을 상기 CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화하고 상기 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합시키기 위한 제제의 라이브러리를 스크리닝하고 결합하는 제제를 선택하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 수집하는 것은 면역화된 상어 또는 낙타과 동물의 비장으로부터 B 세포를 추출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포는 흑색종 세포와 융합되어 하이브리도마를 생성한다. 일부 실시양태에서, 항체는 하이브리도마의 배양 배지로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 유기체를 CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화하고, 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기체는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 토끼, 마우스, 래트, 상어, 낙타과 동물, 닭, 염소 및 파지로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 낙타과 동물은 낙타 및 라마로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 수집하는 것은 혈액을 뽑는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집하는 것은
a. 면역화된 유기체의 비장으로부터 B 세포를 추출하고;
b. 추출된 B 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하고;
c. 하이브리도마로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합시키기 위한 제제의 라이브러리를 스크리닝하고 이렇게 결합하는 제제를 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 비장 B 세포로부터 유래된 면역화된 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 IgG 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 Fab 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 VHH 항체의 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 단일 사슬, 단일 도메인 또는 나노바디의 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 제제를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제를 얻는 것은 재조합 형태의 제제를 생산하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제를 선택하는 것은 제제를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제를 선택하는 것은 재조합 형태의 제제를 생산하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 형태는 제제의 서열로부터 생산된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제제를 인간화하는 것을 추가로 포함한다.
세포 내에서 제제를 암호화하는 핵산 분자의 발현은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이것은 많은 방법 중에서 형질감염, 바이러스 감염 또는 세포 게놈의 직접 변경에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내에 있다. p16-Ink4a를 함유하는 발현 벡터의 하나의 이러한 예는 Addgene으로부터 입수가능한 포유동물 발현 벡터 pCMV p16 INK 4A이다.
벡터 핵산 서열은 일반적으로 세포에서 증식을 위한 적어도 하나의 복제 기원 및 선택적으로 추가 요소, 예컨대 이종 폴리뉴클레오타이드 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리-아데닌 서열을 일반적으로 함유한다.
벡터는 비-바이러스 방법을 통해 또는 바이러스 방법을 통해 전달된 DNA 플라스미드일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포에서 활성일 수 있다. 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 방법에 의해 생산된 제제가 제공된다.
또 다른 측면에 의해, 본 발명의 방법에 의해 생산된 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 값과 결합될 때 기준 값의 +- 10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000 나노미터(nm)의 길이는 1000 nm+-100 nm의 길이를 지칭한다.
본원에 그리고 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함함을 유의한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오타이드"에 대한 언급은 복수의 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, "폴리뉴클레오타이드"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 폴리펩타이드 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등과 같은 이러한 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.
"A, B, C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관례가 사용되는 그러한 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업자가 상기 관례를 이해할 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B, C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이것들로 제한되지 않을 것이다). 설명, 청구범위, 또는 도면에 있든지 간에 둘 이상의 대안적 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접적(disjunctive) 단어 및/또는 구절은, 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나 또는 둘 모두의 용어를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 함을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 구절 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B," 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
명료함을 위해 별도의 실시양태의 맥락에서 설명되는 본 발명의 특정 특징이 또한 단일 실시양태에서 함께 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시양태의 맥락에서 설명되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 실시양태의 모든 조합이 본 발명에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 그리고 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시양태 및 이의 요소의 모든 하위-조합도 본 발명에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 그리고 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 추가 목적, 이점 및 신규한 특징은, 제한하려는 의도가 아닌 다음의 실시예를 검토한 당업자에게 명백해질 것이다. 또한, 위에서 설명된 바와 같은 그리고 아래의 청구범위 부분에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시양태 및 측면의 각각은 다음의 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
위에서 설명된 바와 같은 그리고 아래의 청구범위 부분에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시양태 및 측면은 다음의 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 모두 참고로 편입되는 "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 설명된 방법; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참고한다. 기타 일반 참고문헌은 이 문서 전체에 제공된다.
재료 및 방법
항체 - 상업용 마우스 단클론 항-CD28 클론 #CD28.2(Biolegend, 카탈로그 번호 302902) 및 접합된 FITC(Biolegend, 카탈로그 번호 302906). 염소 다클론 항-CD28(R&D system, 카탈로그 번호 AF-342-PB). FITC 접합된 항-인간 PD-L1(BD bioscience, 카탈로그 번호 558065). APC 접합된 항-인간 PD-L2(Biolegend, 카탈로그 번호 345508). PE 접합된 항-인간 IDO(R&D system, 카탈로그 번호 IC6030P). 염소 항 마우스 IgG Alexa Fluor 647(Biolegend, 카탈로그 번호 405322). 당나귀 항 인간 IgG(H+L) Alexa Fluor 647(Jackson immune research, 카탈로그 번호 709-605-149). 염소 항 마우스 IgG HRP(Jackson immune research, 카탈로그 번호 115-035-071). 항-인간 CD3 클론 OKT3(Biolegend, 카탈로그 번호 317304). 항-인간 PD-1 펨브롤리주맙(MK-3475). 인간 IgG(Sigma, 카탈로그 번호 I4506).
인간 CD28 수용체의 줄기 영역을 표적화하는 VHH의 단리 - 면역화되지 않은 나이브 Llama에서 유래된 말초혈액 B 세포의 유전자 코드를 사용하여, 개별 VHH를 C-말단 His6-Myc 태그가 있는 융합 단백질로 발현하는 입자로 구성된 파지 라이브러리를 작제하였다. 나이브 라이브러리를 사용하여 인간 CD28의 줄기 영역에 결합하는 능력을 갖는 나노바디를 선택하였다. C-말단에 비오틴이 첨가된 "HVKGKHLCPSPLFPGPSKP의 서열(서열번호 52)"을 갖는 산화된 이량체 펩타이드 또는 비오티닐화 재조합 CD28-Fc 키메라를 사용하여 스크리닝을 수행하였다. 각 항원을, 탈지유로 차단시킨 스트렙타비딘 자기 비드에 결합시켰다. 파지 투입량 및 항원 농도를 변화시키면서 3회의 연속적인 선택 라운드 내내 동일한 항원을 사용하여 파지의 용액 내 선택을 수행하였다. 항원이 없는 차단된 비드를 대조군으로 사용하였다. 결합된 파지의 용출을 트립신을 사용하여 20분 동안 실시하였다. 용액 내 선택 동안 농축 비율(enrichment ratio)을, 항원 선택 조건이 없는 경우로부터 용출된 파지 수에 대한 CD28 항원 선택 조건으로부터 용출된 파지 수 간의 비율로 계산하였다. 파지 또는 주변세포질 형식으로 된, 선택된 출력의 279개의 개별 파지 단클론을 ELISA에 의해 항원 결합에 대해 확인하였고, 유세포 분석에 의해 막 CD28으로의 결합에 대해 특성화하였다. 72개의 클론은 주변세포질 형식으로 된 줄기 영역 펩타이드에 특이적인 결합을 보였고, 22개는 독특한 CDR 서열을 갖는 것으로 입증되었으며, 6개만이 특이한 CDR3 패밀리에 속하는 것으로 밝혀졌다. 6개의 VHH를 c-말단 His 태그가 있는 CHO 세포에서 재조합 단백질로 생산하였고, 쉐딩 방지 활성 및 세포 결합에 대해 평가하였다. 형질감염 - DNA 서열을 PCDNA3.1 벡터에 클로닝하여 (전장 CD28 전사체를 암호화하는) CD28wt 플라스미드를 생성하였다. Jet Pei Transfection regent(PolyPlus Transfections)를 사용하여 형질감염을 실시하였다. G418 함유 배지에서 안정한 형질감염체를 선택하였다.
ELISA - 인간 인터페론-감마(Biolegend, 카탈로그 번호 430103), 인간 인터루킨 2(Biolegend, 카탈로그 번호 431802), 인간 인터루킨 6(Biolegend, 카탈로그 번호 430502), 인간 인터루킨 10(Biolegend, 카탈로그 번호 430603), 인간 종양 성장 인자 베타 1(Biolegend, 카탈로그 번호 436708), 인간 인터루킨 베타 1(Biolegend, 카탈로그 번호 437004) 및 인간 CD28(R&D system, 카탈로그 번호 DY342)의 양을 정량화하기 위해 상업용 ELISA 키트를 사용하였다. 세포 증식 및 생존율 검정(MTT 검정)을 제조업체 지침(Roche, 카탈로그 번호 11465007001)에 따라 수행하였다. 키누레닌(IDO 활성) ELISA 키트는 제조업체 지침(ImmuSmol, 카탈록 번호BA E-2200)에 따라 수행하였다.
CD28 줄기 영역 결합 검정 - 비오틴 접합된 야생형 또는 L145K CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 위에 고정시켰다. VHH 클론(0.2-5 μg/mL)의 연속 희석을 수행하고, 결합된 VHH의 검출을 항 His 태그-HRP 접합된 항체를 사용하여 실시하고, TMB를 사용하여 전개를 실시하였다.
사이토카인 멀티플렉스 - Magpix 시스템(Millipore)에서 ProcartaPlex(Invitrogen, 카탈로그 번호 PPX-07-MXXGPY2)를 사용하여 여러 사이토카인의 동시 평가를 실시하였다.
유세포 분석 - 일반적으로, 세포를 모든 단계 동안 얼음 위에 두었다. 염색 전, 5×105개의 세포를 FACS 완충제(0.1% BSA를 함유하는 PBS) 중의 50 ㎍/mL 인간 IgG(Sigma, 카탈로그 번호 I4506)을 사용하여 15분 동안 차단하였다. 항-CD28 VHH 작제물을 표시된 농도에서 사용하였다. Alb-8 작제물이 사용되었을 때, 혼합물에 재조합 인간 혈청 알부민(Sigma, 카탈로그 번호 A9731)을 보충하여 Alb-8을 포화시켰다. 항체는 제조업체가 권장한 농도에서 사용하였고, 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 96-웰 U 바닥 플레이트에서 100 μL의 부피에서 실시하였다. 세포를 200 μL의 FACS 완충제로 2회 세척하였고, 분석을 위해 150 μL의 FACS 완충제 내 FACS 튜브로 옮겼다. Gallios Flow Cytometry Acquisition Software에 대하여 Kaluza를 사용하여 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)에서 세포를 분석하였다.
세포주 및 인간 면역 세포의 단리 - Jurkat 백혈병 T-세포 림프모구 세포주 클론 E6.1 및 SCC-25 혀 편평 세포 암종을 ATCC로부터 얻었다. 표준 림프구 분리 배지(MBP, 카탈로그 번호 850494)를 사용하여 건강한 기증자의 신선한 혈액 샘플로부터 PBMC를 단리하였다. 음성 선택 방법에 의해 RossetteSEP™ 인간 T 세포 농축 키트(STEMCELL, 카탈로그 번호 15061)를 사용하여 건강한 기증자의 신선한 혈액 샘플로부터 CD3 세포를 단리하였다. 음성 선택 방법에 의해 EasySep™ 인간 CD4 T 세포 농축 키트(STEMCELL, 카탈로그 번호 19059)를 사용하여 건강한 기증자의 신선한 혈액 샘플로부터 CD4 세포를 단리하였다. 음성 선택 방법에 의해 EasySep™ 인간 단핵구 농축 키트(STEMCELL, 카탈로그 번호 17952)를 사용하여 건강한 기증자의 신선한 혈액 샘플로부터 단핵구를 단리하였다. 모든 세포를 10% HI-FCS 및 펜/스트렙(pen/strep) 혼합물이 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다.
CD86 차단 FACS - 인간 CD28로 안정적으로 형질감염시킨 0.5×106개의 HEK293 세포를, 실온에서 30분 동안 표시된 농도에서 CD28-쉐딩 방지 나노바디를 함유하거나 함유하지 않는 2 ㎍/ml CD86-Fc(R&D systems, 카탈로그 번호 141-B2)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하였고, 얼음 위에서 20분 동안 1:5000 희석된 형광단에 접합된 항-인간 중쇄 및 경쇄 항체를 사용하여 2차 결합을 위해 채취하였다. Alb-8 작제물이 사용되었을 때, 혼합물에 재조합 인간 혈청 알부민(Sigma, 카탈로그 번호 A9731)을 보충하여 Alb-8을 포화시켰다.
형질감염 - DNA 서열을 PCDNA3.1 벡터에 클로닝하여 (전장 CD28 전사체를 암호화하는) CD28-FL, (전장 CD80 전사체를 암호화하는) CD80-FL 및 (CD14 세포외 도메인에 융합된 마우스 항-CD3 OKT3 클론의 단일-사슬 FV 부분을 암호화하는) scOKT3-CD14 플라스미드를 생성하였다. Jet Pei Transfection regent(PolyPlus Transfections)를 사용하여 형질감염을 실시하였다. G418 및/또는 하이그로마이신-함유 배지에서 안정한 형질감염체를 선택하였다.
수지상 세포 분화 - 3일 째 및 6일 째에 새로 교체한, 성장 인자를 함유하는 RPMI 배지에서 1×106/mL의 밀도로 단핵구를 배양하였다. 6일 동안 50 ng/mL GM-CSF(R&D systems, 카탈로그 번호 215-GM) 및 20 ng/mL IL-4(R&D system, 카탈로그 번호 204-IL)에 의해 미성숙 수지상 세포(iDC)를 유도하였다. 필요 시 48분 동안 100 ng/mL LPS(Sigma, 카탈로그 번호 L4391) 및 20 ng/mL 인터페론-감마(R&D systems, 카탈로그 번호 285-IF)를 첨가하여 iDC를 성숙한 수지상 세포로 추가 분화시켰다. 생성된 세포 집단을 관련 마커의 FACS 분석에 의해 그리고 특징적인 사이토카인 분비의 분석에 의해 표시된 표현형에 대해서 시험하였다.
메탈로프로테이나제 - Anaspec(카탈로그 번호 AS-72005) 또는 R&D system(카탈로그 번호 902-MP) 둘 모두로부터의 상업용 재조합 인간 메탈로프로테이나제 MMP-2를 사용하였다. 상업용 재조합 인간 메탈로프로테이나제 MMP-13을 R&D system(카탈로그 번호 511-MM)으로부터 구입하였다. Pro-MMP2 및 Pro-MMP-13을 제조업체의 프로토콜에 따라 37℃에서 1-2시간 동안 1mM p-아미노페닐수은 아세테이트(APMA)로 활성화하였다.
합성 펩타이드 - "DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호 54)-비오틴"의 최종 형태를 갖는 기질 펩타이드를, N-말단 cMyc 태그에 이어 5개의 글라이신 서열과 C-말단 비오틴 접합 사이에 인간 CD28 줄기 영역(His134-Pro152)의 아미노산 서열을 포함하도록 설계하였다. 펩타이드를 Genecust Europe에 의해 맞춤 합성하였다. 위치 141의 시스테인 잔기를 사용하여, 이황화 결합에 의해 이량체성 펩타이드를 생성하였다. 절단 부위에 돌연변이가 있고 위치 145에서 류신이 라이신으로 치환된 CD28 줄기 영역 펩타이드를 "DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPKFPGPSKP (서열번호 55)-비오틴"의 최종 형태를 갖도록 유사하게 합성하였다.
시험관 내 절단 검정 - 50 ng의 정제된 재조합 MMP-2 또는 MMP-13을, MMP 억제제(TMI-1, 50 nM), M9 Fab 또는 다양한 농도(0.4-10 μg/mL)의 표시된 VHH 클론의 존재 또는 부재 하에 5시간 동안 0.125 μM 이량체 c-Myc 태그 및 비오티닐화 기질 펩타이드와 함께 인큐베이션하였다. 50 mM Tris, 10 mM CaC2l, 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35, pH 7.5에서 검정을 수행하였다. 5시간 후, 절단 반응 혼합물을 최종 1 nM 농도의 펩타이드로 희석하였고, 펩타이드에 결합하도록 뉴트라비딘 플레이트 위에 로딩하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하였고, HRP에 접합된 항-cMyc 항체를 사용하여 절단되지 않은 펩타이드의 검출을 실시하였다.
가용성 CD28의 생성을 위한 PBMC의 SEB 또는 CMV 활성화 - 0.3×106개의 PBMC를 48 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 프로테아제 억제제와 함께/이것없이 37℃에서 5-7일 동안 0.5 ng/mL SEB(Sigma, 카탈로그 번호 S4881)로 자극하였다. 대안적으로, 0.1×106개의 PBMC를 96웰 플레이트 형식 검정에서 0.5 ng/mL SEB로 자극하였다. CMV 자극을 위해 0.5×106개의 PBMC를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 프로테아제 억제제와 함께/이것없이 37℃에서 2-5일 동안 0.5 ㎍/mL CMV 펩티베이터(Milteny Biotec, 카탈로그 번호 130-093-435)로 자극하였다. 연속 쉐딩 실험을 위해 PBMC를 24시간 동안 24웰 플레이트에서 SEB 또는 CMV로 자극하였고, 세포를 채취하였고, 자극제 없이 RPMI로 3회 세척하였고, 96웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 표시된 시간에 샘플을 채취하였고, 가용성 CD28에 대한 검사까지 동결 조건 하에 두었다.
가용성 CD28의 생성을 위한 T 세포의 PHA 활성화 - 2×105개의 CD3 또는 CD4 T 세포를 7일 동안 5 ㎍/mL 농도의 피토헤마글루티닌(Sigma, 카탈로그 번호 L8902), 200 IU의 IL-2(Proleukine) 및 표시된 치료제와 함께 인큐베이션하였다. Alb-8 작제물이 사용되었을 때, 혼합물에 재조합 인간 혈청 알부민(Sigma, 카탈로그 번호 A9731)을 보충하여 Alb-8을 포화시켰다.
프로테아제 억제제 - 각 실험의 시작 시에 프로테아제 억제제를 표시된 농도로 첨가하였다. 1주일 동안의 세포 검정에서, 상기 억제제의 또 다른 부분을 최종 농도에서 3일 후에 첨가하였다. 사용된 프로테아제 억제제는 GI254023X(Sigma, 카탈로그 번호 SML0789) 또는 TMI-1(Sigma, 카탈로그 번호 PZ0336)이다.
VHH의 쉐딩 방지 활성을 평가하는 세포 검정 - PBMC의 SEB 활성화를 위해, 0.1×106개의 PBMC를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리제와 함께/이것없이 37℃에서 5-7일 동안 2 ng/mL SEB(Sigma, 카탈로그 번호 S4881)로 자극하였다. PHA 활성화된 T 세포에 대해서는, 0.1×106개의 CD4 T 세포를 96웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리제와 함께/이것없이 37℃에서 5-7일 동안 표시된 농도의 피토헤마글루티닌(Sigma, 카탈로그 번호 L8902) 및 200 IU/mL의 IL-2(Proleukine)와 함께 인큐베이션하였다. HEK 자발적 CD28 쉐딩 검정을 위해서는, 0.1 x 105개의 HEK 세포를 96웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리제와 함께/이것없이 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
혼합 림프구 반응 - 0.1×106개의 T 세포를 표시된 농도의 처리제와 함께/이것없이 37℃에서 24-72시간 동안 상이한 기증자로부터의 0.2×104개의 성숙한 수지상 세포와 혼합하였다. 10% HI-인간 혈청 및 펜/스트렙 혼합물이 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 검정을 수행하였다.
자가 단핵구 CD3 MLR - 0.5×106개의 T 세포를 동일한 CMV 반응성 기증자로부터의 0.5 x 105개의 단핵구와 혼합하였고, 표시된 농도의 처리제와 함께/이것없이 37℃에서 6일 동안 0.5 μg/mL CMV 펩티베이터로 자극하였다.
항체 시퀀싱 - 아미노산 시퀀싱을 위해 항체를 Rapid Novor사에 공급하였다. 6가지 효소(펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, Lys C 및 Asp N)를 사용한 효소 소화 후에 수행된 LC-MS 분석을 간단히 포함하는 표준 방법을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 이황화물 환원 및 알킬화를 사용하여 소화를 수행하였다. Thermo-Fisher Q-exactive 질량 분석기를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서, 아미노산 잔기의 100%가 상당한 지지 단편 이온과 함께 적어도 5개의 펩타이드 스캔에 포함되었다. Chothia 계획을 사용하여 CDR을 결정하였다.
재조합 2A1 작제물의 생산 - 합성 코돈-최적화 유전자를 관련된 pcDNA3.1 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 일시적으로 형질감염된 ExpiCHO 세포로부터 2A1 작제물을 생산하였고, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제하였다. 1x PBS pH 7.4 내 단백질 제조물을 비환원 조건 하에서 정확한 사슬의 존재에 대해서는 SDS-PAGE에 의해, 그리고 상기 제조물 내 단량체 형태의 정량화에 대해서는 분석적 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)에 의해 분석하였다.
모 2A1 분자의 화학적 변형 - C-말단 시스테인(2A1-1C)을 보유하는 2A1 작제물을 상이한 화학적 모이어티, 예컨대 선형 mPEG 20kDa-OPSS(Nanocs, 카탈로그 번호 PG1-OS-20K), 선형 mPEG 40kDa-Mal(Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 JKA3123), bis-Mal-PEG11 (BroadPharm, 카탈로그 번호 Bp-22151)과 함께 인큐베이션하였다. 일부 경우에, 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 염산염(TCEP)(Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 75259)을 반응 전에 첨가하여 이량체 내용물을 용해하였다. 다양한 변형 반응이 완료된 후에, 반응 혼합물을 SP 양이온 교환 컬럼 위에 로딩하여, 과량의 시약, 및 일부 경우에는 미반응 물질을 제거하였다. 제조물을 Viva-spin 농축기를 사용하여 PBS 탈염시켰고, 접합 확인을 위해 질량 분석으로 분석하였다. 다른 제조물에서는, HSA(Sigma, 카탈로그 번호 A9731)를 MAL-PEG(2000Da)-MAL(Nanocs, 카탈로그 번호 PG2-ML-2K)를 사용하여 변형하였고, 음이온 교환에 의해 미반응 시약의 잔류물로부터 정제한 다음, 2A1-1C와 함께 인큐베이션하여 최종 생성물 HSA-P2K-2A1을 수득하였다.
직접 CD28 EIA - 달리 논의되지 않는 한, 스크리닝을 위해 Corning 높은 결합 플레이트 또는 등가물을 사용하였다. 각 웰을 200 ng의 인간 CD28-Fc 키메라(R&D, 카탈로그 번호 342-CD)로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS 내 1% 카제인을 사용하여 차단하였다. 플레이트를 PBST를 사용하여 3회 세척하였고, 1:5000으로 희석된 HRP(Biolegend, 카탈로그 번호 652504)와 접합된 마우스 항 His 또는 1:500으로 희석된 HRP(GenScript, 카탈로그 번호 A02016)와 접합된 토끼 항 낙타과 동물 VHH Cocktail을 사용하여 검출한 후에, 조사된 항체와 함께 인큐베이션하였다. Alb-8 작제물이 사용되었을 때, 혼합물에 재조합 인간 혈청 알부민(Sigma, 카탈로그 번호 A9731)을 보충하여 Alb-8을 포화시켰다.
OKT3으로 T 세포 자극 - (건강한 기증자로부터의) 0.1×106개의 단리된 CD3 T 세포를 37℃에서 24-48시간 동안 표시된 양의 항-CD3 클론 OKT3으로 자극하였다. 진술된 경우 재조합 인간 CD80-Fc(2 ㎍/ml, R&D system, 카탈로그 번호 141-B1)를 가용성 형태로 첨가하였다. 항체 처리제, 또는 CD28 또는 대조군을 표적화하는 VHH를 가용성 형태로 표시된 농도로 첨가하였다.
A375/scOKT3 인공 항원 제시 세포(aAPC)로의 T 세포 자극 - (건강한 기증자로부터의) 1×105개의 단리된 CD3 T 세포를 37℃에서 24시간 동안 0.4 X 104개의 미토마이신 처리된 aAPC(scOKT3-CD14 키메라 플라스미드)로 안정적으로 형질감염된 A375 세포)로 자극하였다. 항체 처리제, 또는 CD28 또는 대조군을 표적화하는 VHH를 가용성 형태로 표시된 농도로 첨가하였다. 10% HI-인간 혈청 및 펜/스트렙 혼합물이 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 검정을 수행하였다.
HEK/CD80/scOKT3 인공 항원 제시 세포(aAPC-CD80)로의 T 세포 자극 - (건강한 기증자로부터의) 1×105개의 단리된 CD3 T 세포를 37℃에서 24-48시간 동안 0.5 X 104개의 미토마이신 처리된 aAPC-CD80(CD80 및 scOKT3-CD14 키메라 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포)으로 자극하였다. 항체 처리제, 또는 CD28 또는 대조군을 표적화하는 VHH를 가용성 형태로 표시된 농도로 첨가하였다. 10% HI-인간 혈청 및 펜/스트렙 혼합물이 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 검정을 수행하였다.
약동학 프로파일 연구 - 각 시험 항목에 대한 PK 연구를 12마리의 성체 수컷 마우스(수컷 balb/c) 그룹에서 수행하였다. 각 시험 항목에 정맥 내 주사에 의해 2.5-10 mg/Kg에 해당하는 용량을 제공하였다. 다음 시점에서 3마리의 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다: 0.083(동물 1-3), 1(동물 4-6), 2(동물 7-9), 8(동물 10-5 12), 24(동물 1-3), 48(동물 3-6), 72 (동물 7-9), 96(동물 10-12) 및 168(모든 동물) 시간. K-EDTA 수집된 혈액에서 시험 항목의 농축을 실시하였다. 다음의 항체로부터의 한 쌍으로 구성된 샌드위치 ELISA를 사용하여 각 시험 항목 농도의 정량화를 실시하였다: 표 1에 기재된 바와 같은 토끼 항 낙타과 동물 VHH (QVQ, 카탈로그 번호 QE-19), HRP로 접합된 토끼 항 낙타과 동물 VHH(GenScript, 카탈로그 번호 A01861), HRP로 접합된 염소 항 인간 혈청 알부민(Abcam, 카탈로그 번호 ab19183).
표 1: 샌드위치 ELISA 성분
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실시예 1: 쉐딩 방지 항체 기반 제제의 특성화
인간 CD28이 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)에 의한 단백질분해 과정을 겪는다는 발견은, 단백질분해 쉐딩에 대한 잠재적 감수성을 보이는 후보 영역에 대한 폴리펩타이드 서열의 검사를 촉발하였다. 인간 CD28에서 가장 매력적인 서열 영역은 구형 IgV 도메인을 막횡단 영역에 연결시키는, 히스티딘 134에서 프롤린 152(서열번호 52, HVKGKHLCPSPLFPGPSKP)에 이르는 줄기 부분이다. 이 영역은 총 3개의 류신 및 발린 잔기와 페닐알라닌 잔기를 보유하고, 프로테아제의 접근을 방해할 수 있는 임의의 2차 구조 요소가 없을 것으로 예상된다. 특히, 줄기 영역은 또한 CD28의 동종-이량체화를 촉진하는 이황화간 결합을 형성하는 시스테인 141을 함유한다. CD28 줄기 영역에 특이적으로 결합하고, CD28 올리고머 구조 및 기능의 임의의 손상을 피하면서 CD28을 쉐딩하기 위해 상이한 프로테아제의 접근을 잠재적으로 차단하는 항체 또는 항체 단편을 생성하기 위한 목적으로, CD1 마우스를 CD28 줄기 영역을 모방하는 이량체 펩타이드로 면역화하였다. 면역화에 사용된 펩타이드 서열은 서열번호 56, GKHLCPSPLFPGPSKPK였고, 히드라지드 화학성을 사용하여 KLH 또는 BSA 접합을 허용하는 유리 아미노 기를 갖도록 C-말단 라이신을 첨가하였다. 히드라지드 말단 CD28 펩타이드와 S-4FB 변형 BSA 사이에서 접합을 수행하였고, 이는 부위 특이적 접합을 위한 유리 알데하이드를 생성한다. 비-변성 겔 위에 펩타이드를 흘려보내 이량체화를 확인하였다.
직접 CD28 EIA로 측정하였을 때 재조합 인간 CD28에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 발견되었다. 이 항체는 M9로 명명되며, 이 항체의 서열은 위에 제공된다. 항체 M9의 연속 희석을 사용하여, 재조합 인간 sCD28으로의 그리고 줄기 영역 펩타이드로의 이것의 특이적 결합을 확인하였다(도 1a). 흥미롭게도, 항체는 재조합 인간 sCD28은 검출할 수 있었지만, 이것은 면역 세포에서 실제로 쉐딩된 sCD28은 검출할 수 없었다(도 1b). 이것은, 항체가 절단 부위에 결합하며, 항체가 결합하는 디이소토프(deisotope)가 절단된 형태로는 불완전함을, 강하게 시사한다.
다음으로 세포 표면 위 mCD28에 결합하는 항체의 능력을 조사하였다. 세포로부터 sCD28의 쉐딩을 줄이기 위해, 항체는 용액 내 단지 재조합 단백질이 아니라 막 형태의 단백질 위에 실제로 결합해야 할 것이다. 인간 전장 CD28을 과발현하는 HEK293 세포를 분석하였다. 마우스 CD28은 가용성 형태로 절단되는 것으로 보이지 않으며(활성화된 쥐의 비장세포가 sCD28을 생산하는 것으로 보이지 않으며), 그래서 인간 단백질을 조사해야 한다. M9 항체 및 CD28.2 항체를 양성 대조군으로 사용하여 유세포 분석에 의해 세포를 분석하였다. 놀랍게도, M9는 표면 mCD28에 결합하는 것으로 보이지 않았다(도 1c). 이것은 아마도 막이 인접할 때 입체 장애 및 줄기 영역으로의 제한된 접근 때문일 것이다.
실시예 2: 단일-도메인 항체는 세포 표면으로부터 sCD28 쉐딩을 억제한다
세포 표면 위 mCD28에 결합하고 sCD28의 쉐딩을 차단할 수 있는 작은 제제를 설계하였다. 전체 크기 항체는 크기가 약 150 kDa인 반면, 항체로부터 유래된 Fab 단편은 크기가 약 50 kDa인 반면, 단일 사슬 항체(단일 사슬 가변 단편, scFv라고도 함)는 크기가 약 25 kDa이고 단일 도메인 항체(VHH 항체 및 DARPin이라고도 함)의 크기는 단지 12-20 kDa이다.
나이브(naive) 라마 유래 VHH의 파지 라이브러리를 사용하여 단일 도메인 항체를 단리하였다. 상기 라이브러리는 면역화되지 않은 나이브 라마로부터 채취한, 즉 B 세포를 추출하고 VHH CDR의 전체 사용가능한 레퍼토리를 시퀀싱하는, VHH 서열로 구성되었다. 이러한 CDR을 파지 내로 이행하여 라이브러리를 생성하였다. ELISA 및 유세포 분석을 사용하여, 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 재조합 CD28 세포외 도메인 및 이량체 줄기 영역 펩타이드에 대해 라이브러리를 스크리닝하였다. 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 VHH 서열은 EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 33, 클론 2A1); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 34, 클론 4A4); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호 35, 클론 4A1)이다. CHO 세포에서 재조합 단백질로서 VHH를 생산한 다음, 아래에 설명된 바와 같이 세포 결합 및 쉐딩 방지 활성에 대해 평가하였다. C-말단의 His-태그를 정제를 위해 사용하였고, 삼중 알라닌 반복부를 통해 연결했다. 3개의 조사된 클론의 CDR이 표 2에 제공되어 있다.
표 2: 시험된 클론의 CDR 서열
Figure pct00002
VHH 클론의 인간 CD28 줄기 영역 서열로의 결합을 VHH 클론의 연속 희석을 사용하여 ELISA로 먼저 확인하였다(도 2). 표지된 VHH 클론 및 CD28을 과발현하는 HEK 세포를 사용한 FACS 분석으로 세포 수준 위 막 인간 CD28로의 결합을 확인하였다(도 3). 막 CD28 결합은 CD28 막 근접 영역으로의 접근을 입증한다. 이전 실험은, CD28 줄기 영역 펩타이드에 결합할 수 있는 전체 크기 항체가 세포 위 CD28 줄기 영역에 결합할 수 없었기 때문에, 제제의 크기가 이 영역에 접근하는 데 중요하다는 것을 보여주었다(도 1c). 특히, VHH 클론은 잠재적인 MMP 절단 부위 내 위치한 아미노산 잔기 145에서 L-K 치환을 갖는 인간 CD28 줄기 영역 서열에 결합할 수 없었다(도 4).
펩타이드 및 세포 수준 둘 모두에 대한 쉐딩 방지 활성을 확인하였다. VHH 클론이 MMP-2(도 5) 및 MMP-13(도 6)에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 절단을 차단하는지 확인하기 위해 ELISA 기술을 사용하여 온전한 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩타이드를 검출하였다. M9 Fab는 CD28 줄기 영역 펩타이드 절단을 차단하는 능력을 나타냈지만, 상술한 바와 같이 세포 위 CD28 줄기 영역에는 결합할 수 없었고 세포막으로부터 CD28 쉐딩을 억제할 수 없었다. 세포 수준에서, 표준 샌드위치 ELISA를 사용하여 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포(도 7), PHA 및 IL-2에 의해 활성되고 단리된 CD4 T 세포(도 8) 및 초항원에 의해 활성화된 PBMC(도 9)의 상청액에서 인간 sCD28의 수준을 측정하여 sCD28 쉐딩을 억제하는 VHH 클론의 효능을 확인하였다. 예상대로, M9 Fab는 상청액에서 sCD28 수준을 감소시키지 않았고, 이는 쉐딩을 실제로 차단하는 이것의 능력에 대한 차단제의 크기 및 구조의 중요성을 더욱 강조한다.
결정적으로, VHH 클론은 인간 CD28 기능을 손상시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 유세포 분석을 사용하여, VHH 클론이 막 CD28에 결합하는 CD86의 크기를 변경시키지 않음이 밝혀졌다(도 10). 표준 샌드위치 ELISA를 사용하여, 염증성 사이토카인 인터페론 감마의 분비 수준에 의해 측정하여 VHH 클론이 CD28을 작용하지 않음을 보였다(도 11). 활성화되는 항체 CD28.2를 양성 대조군으로 사용하였다. 유사하게, 표준 샌드위치 ELISA를 사용하여, 사이토카인 IL-2의 분비 수준에 의해 측정하여 VHH 클론이 CD28을 통한 CD80-Fc 자극을 길항하지 않음을 보였다(도 12).
실시예 3: 세포 표면으로부터 sCD28 쉐딩을 억제하기 위한 다른 소형 제제 설계
상업용 키트 또는 상업적으로 입수가능한 서비스를 사용하여 Fab 단편 생성을 수행한다. 항체 M9의 CDR 영역은 적절한 디이소토프에 결합하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이것을 Fab 생성에 사용하였다. 이 결합이 유지되는 지를 확인하기 위해 재조합 인간 CD28 및 이량체 줄기 영역 펩타이드로의 결합 검정에 의해 생성된 Fab 단편의 효능을 먼저 시험한다. 인간 CD28을 발현하는 마우스 세포에 대한 그리고 인간 면역 세포에 대한 FACS에 의해 표면 mCD28로의 결합을 검정한다. 항체 CD28.2를 양성 대조군으로 사용한다. sCD28 쉐딩의 직접적인 억제는 자극 후 면역 세포 배양에서 시험한다. 세포가 Fab 단편의 존재 및 부재 하에 있을 때 샌드위치 ELISA에 의해 배양 배지 내 sCD28을 측정한다. 쉐딩 억제 작용을 갖는 Fab 단편을 CD28 신호전달에 대한 효과에 대해 검정한다. 먼저, T 세포로부터 전염증성 사이토카인, 예를 들어, 인터페론 감마의 분비를 유도하는 Fab 단편의 능력을 검정함으로써 효능작용(agonism)을 시험한다. 둘째, CD80-Fc의 결합을 차단하는 능력(작용제)을 사용하여 Fab 단편의 길항 특성을 시험한다.
상업용 서비스를 사용하는 표준 방법에 의해 또는 CDR을 scFv 백본에 삽입함에 의해 M9 CDR을 사용한 단일 사슬 항체 생성을 수행한다. 정제를 수행하고, 생성된 항체를 Fab 단편에 대해 설명된 것과 동일한 검정에 의해 평가한다.
실시예 4: 세포 표면으로부터 CD28 쉐딩을 억제하는 혈청 안정한 제제의 생성
VHH 분자는 효과적인 절단 차단제였으나, 대상체에게 투여되면 이것들의 크기가 작기 때문에 분해 및 혈청으로부터 제거될 위험이 있다. VHH 분자의 혈청 반감기를 향상시키기 위해, VHH 분자를 크기를 증가시키고 안정성을 향상시키는 제2 모이어티에 연결하였다. VHH 2A1이 가장 유력한 절단 차단제인 것으로 밝혀졌기 때문에, 이것을 모든 접합 시험을 위해 선택하였다. 11개의 별개의 분자를 생성하고 시험하였다; 이들 분자는 표 3에 요약되어 있다. 이들 분자의 서열이 표 4에 제공되어 있다. 제제가 세포 위 CD28 줄기 영역에 결합해야 하기 때문에, VHH를 반감기 연장 모이어티에 연결하는 링커의 길이 및 특성이 매우 중요하다. 너무 짧은 링커는 제2 모이어티가 CD28-결합 모이어티에 가까워지게 하여, 이것의 막 CD28의 결합을 방해할 수 있을 것이다. 너무 긴 링커는, 제2 모이어티가 제1 모이어티와 관련하여 너무 자유롭게 이동하여, 이것의 CD28 결합 활성을 다시 방해할 수 있는 제제가 얻어지게 할 수 있다.
먼저, 인간 혈청 알부민(HSA)을 반감기 연장 분자로 사용하였다. 인간 혈청 내 가장 풍부한 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA)은 크기(66 KDa)로 인한 긴 반감기, 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하여 세포에 의한 흡수 및 순환으로 다시 방출될 수 있게 하는 능력이 알려져 있다. VHH 2A1를, GGGGS 반복부를 함유하는 가요성 펩타이드 링커를 통해 C-말단에서 HSA에 접합하였다. 1, 3 및 7 반복부를 조사하여(각각 2A1-5GS-HSA, 2A1-15GS-HSA, 및 2A1-35GS-HSA), VHH가 절단 부위에 계속해서 접근할 수 있게 하는 링커의 최적 크기를 결정하였다. 길이가 20개 또는 30개의 아미노산으로 된 강성의 나선형 링커를 또한 시험하였다(각각 2A1-20Hel-HSA 및 2A1-30Hel-HSA).
두 번째로 시험된 반감기 연장 분자는, HSA에 특이적인 VHH 클론인 Alb8였다. HSA-결합 펩타이드, 예컨대 Alb8 VHH(Maria, J.W.D. et al., Mol Cancer Ther. 2012, 11, 1017-1025)는 단백질 접합체에 사용될 때 반감기를 향상시키는 것으로 알려져 있다. 1, 3 또는 7 GGGGS 반복부(각각 2A1-5GS-Alb8, 2A1-15GS-Alb8, 및 2A1-35GS-Alb8)를 함유하는 가요성 펩타이드 링커를 통해 Alb8을 또한 접합하였다.
다음으로, PEG화를 반감기 연장 모이어티로서 시험하였다. 단백질 크기를 증가시켜 반감기를 연장하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 단백질로의 첨가를 광범위하게 사용하였다. PEG 분자를 VHH를 차단하는 절단부에 부착하기 위해, 낙타과 동물 유래, 및 특히 라마 유래, 단일 도메인 항체에 유리 시스테인 잔기가 결여되어 있고 심지어는 대부분에 대해 이황화 결합이 결여되어 있다는 사실을 이용하여 VHH의 C-말단에 유리 시스테인 기를 첨가하였다. 결합제의 CDR로부터 멀리 위치한, 유리 티올기를 가진 이 시스테인을, 말레이미드 및 요오도아세테이트 작용 기를 포함하는 티올 반응성 기를 보유하는 다양한 PEG 분자를 부착하는 데 사용할 수 있다. 생성된 제제는 500 Da 내지 40 KDa 크기 범위의 선형 또는 분지형 PEG 분자를 포함할 수 있다. 너무 작은 PEG는 반감기 연장을 가능하게 하지 않을 수 있는 반면, 너무 큰 PEG는 CD28로의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다. PEG 분자는 또한 C-말단 시스테인, 예컨대 라이신 또는 카복실산(글루탐산 및 아스파르트산 잔기) 외 추가 위치에 부착될 수 있다.
PEG화를 촉진하기 위해, 디펩타이드 GC를 2A1 VHH의 C-말단에 첨가하였다. 이 C-말단 시스테인을, 말레이미드 티올 반응성 작용 기로 치환된 선형의 40 KDa PEG 모이어티(2A1-1C-L40K) 또는 SPDP 작용기로 치환된 선형의 20 KDa PEG 모이어티(2A1-1C-R20K)와 직접적으로 접합하였다. SPDP 기는 VHH의 C-말단 시스테인과 이황화 결합을 형성하는 피리딜디티올 모이어티를 함유한다. 마지막으로, 2A1 VHH를 GC 디펩타이드에 의해 HSA에 연결하고 2 KDa PEG 모이어티를 갖는 PEG화에 의해 HSA를 변형한 조합된 접근방법을 시도하였다. 이를 촉진하기 위해, HSA를 (시스테인 34에서의) 이것의 단일 유리 티올 위에서 비스-말레이미드-PEG(선형 2 KDa PEG)를 사용하여 미리 변형시켰고, 그 다음 노출된 말레이미드 기는 VHH의 C-말단 시스테인과 반응한다. 이황화물은 가역적이며 쉽게 절단된 연결인 반면, 말레이미드 기의 결합은 비가역적이며 매우 안정하다.
상기 제제는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 단백질 정제, 및 적절한 결합 항체에 의한 인식을 위해 6X 히스티딘 태그를 포함한다. 히스티딘 태그 기반 정제 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
표 3: 생산된 2A1 반감기 연장 작제물의 요약
Figure pct00003
표 4: 작제물의 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 5: CD28 펩타이드의 기능적 결합
재조합 CD28 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 상술된 제제를 평가하였다. 줄기 영역 서열을 함유하고 이량체로 존재하는 재조합 인간 CD28-Fc 키메라 단백질을 ELISA maxi-sorb 플레이트에 고정화시켰다. 모 2A1 및 11개의 반감기 연장 2A1 작제물의 3배 연속 희석을 수행하였고, 결합된 VHH의 검출을 항 VHH-HRP 접합된 항체를 사용하여 수행한 후, TMB를 사용하여 전개하였다(도 13). 각 작제물에 대한 EC50 값을 4개 매개변수 비선형 회귀 곡선을 사용하는 Graph-Pad 소프트웨어를 사용하여 계산하였고, 이것은 표 5에 요약되어 있다. 이 분석에 기초하여, 생성된 2A1 작제물 모두는 CD28 재조합 펩타이드에 결합하는 능력을 보유하였다. VHH가 매우 작기 때문에, 항-VHH 항체의 VHH로의 결합이 종종 방해될 수 있음을 유의해야 한다. 모든 VHH가 기능적 결합제임을 데이터가 보여주지만, 이것은 EC50 값에서의 변동성의 일부를 설명할 수 있다. 이 방해는 VHH가 세포 표면 위 막 CD28에 결합할 때 가장 강하게 관찰된다. 줄기가 원형질 막에 바로 인접하기 때문에, 항-VHH 항체에 의해 결합된 VHH 에피토프는 묻히게 된다. 따라서, 세포 표면 CD28로의 VHH의 결합은 직접 결합 검정에서가 아니라, 절단 차단(또는 기타 기능적 결과)에 대한 이것의 효과에 의해 간접적으로 측정되어야 한다.
표 5: 모 2A1에 대한 EC50 값 및 반감기 연장 작제물
Figure pct00009
실시예 6: 반감기 연장 작제물에 의한 CD86 결합의 차단 시험
상술된 제제를 본 발명의 제제의 존재 하에 막 CD28에 결합하는 천연 리간드의 잠재적인 원치않는 차단에 대해 평가하였다. CD28의 천연 리간드는 CD86이며, 이 결합은 면역 활성화를 유도한다. VHH 자체가 CD28로의 CD86 결합을 손상시키지 않음이 입증되었지만, 반감기 연장 모이어티는 CD28 결합 영역을 차단 또는 방해하거나 그렇지 않으면 리간드 결합을 수행할 수 있다. CD86 결합을 손상시키는 작제물은, 상기 분자가 면역 반응을 상향조절/향상시키도록 의도되기 때문에 거의 가치가 없다.
HEK293 세포에 인간 CD28 과발현을 실시한 다음, Alexa Fluor 647에 접합된 2차 항 인간 Fc 항체를 사용하여 CD86-Fc(2 μg/mL) 결합에 대하여 유세포 분석으로 모니터링하였다. 임의의 항-CD28 분자를 사용하지 않고, 모 VHH를 사용하여 그리고 11개의 반감기 연장 작제물을 사용하여 결합을 시험하였다. CD28 길항제인 VHH#10E9는 양성 대조군으로 작용하였다(우측 상단 차트). 아이소타입 대조군에 대해서는, 무관한 VHH, 클론#3C04를 사용하였다. 시험된 반감기 연장 작제물 중 어느 것도 CD86 결합을 상당히 손상시키는 것으로 밝혀지지 않았다(도 14). 처리제의 존재 없이 기본 CD86-Fc 결합으로부터 각 작제물에 대한 신호(중앙값) 감소 백분율로서 CD86 차단 백분율을 계산하였고, 이것은 표 6에 요약되어 있다. 반감기 연장 작제물은 모 VHH에 필적하는 것으로 일반적으로 밝혀졌고, 분자 중 어느 것도 아이소타입 대조군보다 높은 수준에서 CD86 결합을 차단하지 않았다.
표 6: CD86의 차단 백분율
Figure pct00010
실시예 7: 반감기 연장 작제물의 작용(agonistic) 효과 시험
막 CD28에 대한 잠재적인 원치않는 작용 효과에 대해 상술된 제제를 평가하였다. 작제물이 일반적으로 작용적이라면, 해로울 수 있는 일반화된 면역 활성화의 비특이적 효과를 생성할 수 있다. 작용 효과를 다음과 같이 시험하였다. 단리된 인간 CD3 양성 T 세포를 플레이트 결합 항-CD3(OKT3, 2 μg/mL, 밝은 회색 막대)(도 15a)으로 또는 scOKT3 플라스미드로 형질감염된 A375 세포(도 15b)로 24시간 동안 자극하였다. 이것을 무관한 VHH 클론#3C04, 양성 대조군 항-CD28 작용제 항체 클론 28.2 또는 다양한 상이한 2A1 작제물의 존재 하에 실시하였다. 상청액 내 분비된 IL-2의 농도를 표준화 샌드위치 ELISA(Biolegend)에 의해 측정하였고, 이것은 CD28 자극에 대한 판독값(readout)으로 작용하였다(작용 효과). 시험된 2A1 작제물 중 어느 것도 작용 효과를 나타내지 않았다.
실시예 8: 반감기 연장 작제물의 길항 효과 시험
상술된 제제를 막 CD28에 대한 잠재적인 원치않는 길항 효과에 대해 평가하였다. 상기 분자는 자연 면역 활성화의 가능성을 향상시키기 위한 것이기 때문에, 길항 효과는 바람직하지 않을 것이다. 단리된 인간 CD3 양성 T 세포를 인간 CD80 및 scOKT3 플라스미드(인공 APC-CD80, 밝은 회색 막대) 둘 다로 형질감염된 HEK293 세포로 24시간 동안 자극하였다. 이것을 음성, 아이소타입 대조군으로 무관한 VHH 클론 #3C04, 양성 대조군으로 항-CD28 길항제 클론 VHH#12B07 및 다양한 2A1 반감기 연장 작제물의 존재 하에 실시하였다(도 16). 이전과 같이, 면역 활성화 및 CD28 길항작용의 척도로서 표준화 샌드위치 ELISA(Biolegend)를 사용하여 IL-2 분비를 정량화하였다. 효능작용 및 리간드 차단에 대한 결과와 유사하게, 반감기 연장 작제물 중 어느 것도 CD28을 길항하는 것으로 밝혀지지 않았다.
실시예 9: 반감기 연장 작제물의 면역조절 효과 시험
상술된 제제를 생리학적 환경에서의 임의의 일반적인 면역조절 효과에 대해 평가하였다. 혼합-림프구 반응을 상술된 같이 수행하였다. 구체적으로, 단리된 성숙한 수지상 세포를 24시간 동안 동종 CD3 양성 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이것을 대조군 VHH(클론#3C04, 아이소타입) 및 길항 VHH 클론(#1A07) 뿐만 아니라 모 2A1 VHH 및 다양한 농도의 다양한 반감기 연장 작제물의 존재 하에 실시하였다. 다시 한번 IL-2 분비를 판독값으로 사용했다. 놀랍게도, 모 VHH는 시험된 최고 농도에서 매우 적은 원치않는 억제 효과를 나타냈다(도 17). 이 억제 효과는 다양한 반감기 연장 분자에서 폐지되었고, 실제로 이러한 분자 중 어느 것도 이 검정에서 면역조절 효과를 보이지 않았다(도 17).
실시예 10: 반감기 연장 모이어티에 의한 반감기 연장 시험
상술된 제제 모두가 바람직하지 않은 활성화 또는 억제 효과를 나타내지 않음을 결정한 후, 2A1 VHH의 반감기를 실제로 연장시키는 이것들의 능력을 시험하였다. Balb/C 마우스에게 정맥 내 주사를 통해 마우스 당 고정된 용량의 각 VHH 분자 100 ㎍를 투여하였다(50 ㎍/마우스에서 2A1-1C-P2K-HSA를 투여하였음). 이것을 3중으로 수행하였고, 최대 168시간까지의 다양한 시점에서 혈청 농도를 측정하였다(도 18). 각 분자의 반감기(T1/2)를 측정된 종점에 따라 추정하였고, 이것이 표 7에 제시되어 있다. 관찰될 수 있듯이, 모든 반감기 연장 분자는 기능적이었고 VHH의 반감기를 실제로 향상시켰다. VHH와 PEG화 펩타이드 사이에 이황화 결합을 포함하는 2A1-1C-R20K는 아마도 혈청 내 상기 결합의 절단으로 인해 반감기에서 단지 약간의 개선을 나타냈다. 여전히 이 작제물은 반감기를 8배까지 증가시켰다. 표 7에서 관찰될 수 있는 바와 같이 일부는 다른 것들보다 더 효과적이었지만, 다른 모든 작제물은 매우 효과적이었다. 상대 반감기는 2A1-15GS-Alb8>2A1-1C-L40K>2A1-15GS-HSA>2A1-20HEL-HSA>2A1-1C-P2K-HSA>>2A1-1C-R20K>>2A1로 요약될 수 있다.
표 7: 다양한 2A1 VHH 작제물의 반감기
Figure pct00011
실시예 11: 반감기 연장 작제물에 의한 sCD28 쉐딩의 억제 시험
상술된 반감기 연장 분자 모두가 반감기를 어느 정도로 연장함을 결정한 후, 세포로부터 sCD28의 쉐딩을 차단하는 능력을 이제 시험하였다. 반감기 연장 도메인 또는 기의 추가가 이러한 기본 능력을 방해하지 않거나, 적어도 VHH가 더 이상 기능할 수 없는 너무 큰 수준에서 이것을 방해하지 않음이 중요하다. 이를 위해, PHA 및 IL-2로 자극된 단리된 인간 CD4의 배양 배지 내 또는 SEB로 자극된 PBMC 내 가용성 CD28의 수준을 측정하였다. CD28 쉐딩의 억제를 기저 자극으로부터 가용성 CD28 감소의 백분율로 계산하였다. 시험을 일부 작제물에 대해 다양한 농도에서 그리고 3중으로 실시하였다. MMP 억제제를 양성 대조군으로 사용하였고, 무관한 VHH#3C04를 음성 대조군(아이소타입 대조군)으로 사용하였다. 상청액 내 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화 샌드위치 ELISA(R&D systems)를 사용하여 정량화하였다. 도 19에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 5개의 아미노산 링커만을 갖는 가요성 링커 작제물은 이것들이 HSA 또는 ALB-8에 융합되었는 지에 관계없이 CD28 쉐딩을 차단하는 데 완전히 효과가 없었다. 유사하게, 단일 아미노산만이 PEG화 HSA로부터 VHH를 분리한 경우, 분자는 쉐딩 차단에는 효과적이지 않았다. 35개 아미노산의 매우 긴 가요성 링커를 사용한 결과는 단지 약간 더 나았고, 15개 아미노산의 중간 링커가 최상의 결과를 보여주었지만 이것들은 아이소타입 대조군보다 단지 약간 더 나았다. 4개의 작제물은 상당한 쉐딩 차단을 보였다. 가요성 링커가 있는 둘 모두의 작제물은 모 VHH보다 낮은 수준이지만 상당한 쉐딩 차단을 나타냈다. 둘 모두의 (HSA 없는) PEG화 VHH 또한 상당한 쉐딩 차단을 나타냈고, 실제로 2A1-1C-R20K는 모 VHH보다 심지어 약간 더 우수한 쉐딩을 나타냈다. 차단 백분율이 표 8에 요약되어 있다.
표 8: 반감기 연장 작제물에 의한 쉐딩 차단 백분율
Figure pct00012
본 발명이 이의 특정 실시예와 함께 설명되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위에 속하는 이러한 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biond Biologics Ltd. <120> SHEDDING BLOCKING AGENTS WITH INCREASED STABILITY <130> BDB-P-011-PCT <150> US 62/988,503 <151> 2020-03-12 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 Ile Asn Ala Met Ala 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 Ala Ile Thr Ser 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240 Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser 245 250 255 Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala 260 265 270 Ala His His His His His His 275 <210> 63 <211> 727 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu 115 120 125 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Gly Ser Asp Ala 130 135 140 His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn 145 150 155 160 Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys 165 170 175 Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala 180 185 190 Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu 195 200 205 His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu 210 215 220 Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg 225 230 235 240 Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg 245 250 255 Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn 260 265 270 Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His 275 280 285 Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys 290 295 300 Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu 305 310 315 320 Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala 325 330 335 Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala 340 345 350 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala 355 360 365 Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His 370 375 380 Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala 385 390 395 400 Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys 405 410 415 Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile 420 425 430 Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala 435 440 445 Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala 450 455 460 Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His 465 470 475 480 Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu 485 490 495 Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr 500 505 510 Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn 515 520 525 Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 530 535 540 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val 545 550 555 560 Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 565 570 575 Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu 580 585 590 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys 595 600 605 Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val 610 615 620 Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 625 630 635 640 Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys 645 650 655 Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 660 665 670 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala 675 680 685 Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp 690 695 700 Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala 705 710 715 720 Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 725 <210> 64 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu 115 120 125 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 130 135 140 Ala Ala Lys Ala Ala Ala Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 145 150 155 160 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 165 170 175 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 180 185 190 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 195 200 205 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 210 215 220 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 225 230 235 240 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 245 250 255 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 260 265 270 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 275 280 285 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 290 295 300 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 305 310 315 320 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 325 330 335 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 340 345 350 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 355 360 365 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 370 375 380 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 385 390 395 400 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 405 410 415 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 420 425 430 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 435 440 445 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 450 455 460 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 465 470 475 480 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 485 490 495 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 500 505 510 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 515 520 525 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 530 535 540 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 545 550 555 560 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 565 570 575 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 580 585 590 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 595 600 605 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 610 615 620 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 625 630 635 640 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 645 650 655 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 660 665 670 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 675 680 685 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 690 695 700 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 705 710 715 720 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 725 730 735 Leu <210> 65 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585

Claims (46)

  1. 링커에 의해 분리된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 제제로서,
    여기서 제1 모이어티는 세포 표면 위 막 CD28(mCD28)에 결합하고 상기 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하며, 여기서 제2 모이어티는 상기 제1 모이어티의 안정성을 증가시키는 제제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 모이어티, 상기 제2 모이어티, 또는 이 둘 모두가 100 킬로달톤(kDa) 미만인 제제.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 제제가 100 kDa 보다 작은 제제.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티가 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩타이드로부터 선택되는 제제.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티가 단일 도메인 항체를 포함하거나 이것으로 구성되는 제제.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 단일 도메인 항체가 낙타과 동물 또는 상어 항체인 제제.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티가 3개의 CDR을 포함하고,
    CDR1이 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2가 서열번호 2에 명시된 아미노산 서열(AISGGGDTYYADSVKG)을 포함하고, CDR3이 서열번호 3에 명시된 아미노산 서열 (DLYGSDYWD)을 포함하거나;
    CDR1이 서열번호 4에 명시된 아미노산 서열(INAMA)을 포함하고, CDR2가 서열번호 5에 명시된 아미노산 서열(AITSSGSTNYANSVKG)을 포함하고, CDR3이 서열번호 6에 명시된 아미노산 서열(DEYGSDYWI)을 포함하거나;
    CDR1이 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열(INAMG)을 포함하고, CDR2가 서열번호 7에 명시된 아미노산 서열(AITSGGSTNYADSVKG)을 포함하고, CDR3이 서열번호 8에 명시된 아미노산 서열(DLYGEDYWI)을 포함하는 제제.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 제1 모이어티가
    a. EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKG RFTIS RDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열번호 9);
    b. EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGR FTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 10); 및
    C. QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGR FTISRDN AKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열번호 11)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 제제.
  9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티가 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하고, 여기서:
    CDR-H1이 서열번호 12에 명시된 아미노산 서열(GFTFSSYYMS)을 포함하고, CDR-H2가 서열번호 13에 명시된 아미노산 서열(TISDGGDNTYYAGTVTG)을 포함하고, CDR-H3이 서열번호 14에 명시된 아미노산 서열(IHWPYYFDS)을 포함하고, CDR-L1이 서열번호 15에 명시된 아미노산 서열(RASSSVSYMN)을 포함하고, CDR-L2가 서열번호 16에 명시된 아미노산 서열(ATSDLAS)을 포함하고, CDR-L3이 서열번호 17에 명시된 아미노산 서열(QQWSSHPPT)을 포함하는 제제.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 CD28 작용제가 아닌 제제.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 CD28 길항제가 아닌 제제.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티의 상기 증가된 안정성이 혈액 내 안정성을 증가시키는 것을 포함하는 제제.
  13. 청구항 12에 있어서, 혈액 내 안정성을 증가시키는 것이 혈액으로부터 상기 제1 모이어티의 제거(clearance)를 감소시키는 것을 포함하는 제제.
  14. 청구항 13에 있어서, 혈액으로부터 제거를 감소시키는 것이 신장 여과를 감소시키는 것, 리소좀 분해를 감소시키는 것 또는 이 둘 모두를 포함하는 제제.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 강성(rigid) 펩타이드 링커인 제제.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 강성 펩타이드 링커가 나선 모티프를 포함하는 제제.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 강성 펩타이드 링커가 적어도 15개의 아미노산을 포함하는 제제.
  18. 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강성 펩타이드 링커가 최대 30개의 아미노산을 포함하는 제제.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 제제.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 적어도 하나의 시스테인이 C-말단 시스테인인 제제.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 상기 제2 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이고, 티올 연결을 통해 상기 시스테인에 부착되는 제제.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 PEG이고, 상기 PEG가 상기 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내에서 접합되는 제제.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 링커가 펩타이드 링커이고, PEG가 상기 펩타이드 링커의 아미노산에 접합되는 제제.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG가 2000-40,000 달톤(Da)의 크기를 포함하는 선형 또는 분지형 PEG인 제제.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 인간 혈청 알부민(HSA) 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성되는 제제.
  26. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 HSA 결합 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 구성되는 제제.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 HSA 결합 폴리펩타이드가 단일 도메인 항체인 제제.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 단일 도메인 항체가 서열: EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA (서열번호 19)를 포함하거나 이것으로 구성되는 제제.
  29. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모이어티의 C-말단이 상기 링커에 연결되고, 상기 제2 모이어티의 N-말단이 상기 링커에 연결되는 제제.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 제1 모이어티의 C-말단이 상기 링커의 N-말단에 연결되고, 상기 제2 모이어티의 N-말단이 상기 링커의 C-말단에 연결되는 제제.
  31. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 서열번호 63 및 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 제제.
  32. 청구항 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, PEG 모이어티를 상기 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내 아미노산 잔기에 비가역적으로 접합하는 것을 포함하는 제제.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, PEG 모이어티를 상기 제1 모이어티의 C-말단의 10개 아미노산 내 아미노산 잔기에 가역적으로 접합하는 것을 포함하는 제제.
  34. 청구항 32 또는 33에 있어서, 상기 PEG가 2000-40,000 달톤(Da)의 크기를 포함하는 선형 또는 분지형 PEG인 제제.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 제제를 암호화하는 핵산 분자.
  36. 청구항 35의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  37. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 제제를 생성하는 방법으로서, 다음 중 적어도 하나를 포함하여 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 제제를 생성하는 방법:
    a. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 상기 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제1 모이어티를 얻는 단계;
    b. 상기 제1 모이어티를 링커에 의해 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생산하고, 상기 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 연결 및 상기 mCD28의 단백질분해 절단의 억제를 시험하는 단계;
    c. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 상기 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 연결된 제제를 선택하는 단계; 및
    d. 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 제제를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 핵산 서열이
    i. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 상기 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제1 모이어티를 얻고;
    ii. 상기 제1 모이어티를 링커에 의해 제2 모이어티에 연결하여 연결된 제제를 생산하고, 상기 연결된 제제의 세포 표면 위 mCD28로의 연결 및 상기 mCD28의 단백질분해 절단의 억제를 시험하고;
    iii. 세포 표면 위 mCD28에 결합하고 상기 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 연결된 제제를 선택함에 의해 선택된 제제의 핵산 서열인 단계.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 연결된 제제의 존재 하에 mCD28 하류 신호전달을 검정하고, mCD28 신호전달을 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 연결된 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 청구항 37 또는 38에 있어서, 혈액 내 상기 연결된 제제의 안정성을 검정하고, 혈액 내 상기 제1 모이어티와 비교하여 증가된 안정성을 포함하는 적어도 하나의 연결된 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 청구항 37 내지 39 중 어느 한 항의 생성 방법에 의해 생산된 제제.
  41. 청구항 1 내지 23 및 40 중 어느 한 항의 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약제 조성물.
  42. 가용성 CD28(sCD28) 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키는 방법으로서,
    상기 방법이 청구항 1 내지 34 및 40 중 어느 한 항의 제제 또는 청구항 41의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 sCD28을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  43. 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법이 청구항 1 내지 34 및 40 중 어느 한 항의 제제 또는 청구항 41의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하는 방법.
  44. PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법으로서,
    상기 방법이 청구항 1 내지 34 및 40 중 어느 한 항의 제제 또는 청구항 39의 약제 조성물을 투여하여 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 것을 포함하는 방법.
  45. 청구항 42 또는 44에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓는 방법.
  46. 청구항 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 mCD28을 분해하지 않거나, mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않거나, mCD28-매개 면역 세포 활성화를 활성화하지 않는 방법.
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