CN115515982A - 具有增加的稳定性的脱落阻断剂 - Google Patents

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Abstract

提供了包含由接头分开的至少两个部分的试剂，其中第一部分结合细胞表面上的mCD28并抑制mCD28的蛋白水解切割，并且其中第二部分增加第一部分的稳定性。还提供了包括施用试剂治疗癌症和改善免疫疗法的方法。

Description

具有增加的稳定性的脱落阻断剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月12日提交的美国临时专利申请号62/988,503的优先权权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明属于免疫调节和免疫疗法领域。
背景技术
适应性免疫系统在针对病原体和癌细胞的调节和保护中起关键作用，这主要通过协调结合(orchestrate)抗原特异性辅助CD4+和细胞毒性CD8+T细胞的刺激。抗原呈递细胞(APC)持久且连续的活化T细胞包括i)T细胞受体(TCR)与APC上主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽的接合；以及ii)结合也由APC表达的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)配体的T细胞上的共刺激性CD28受体。CD28共刺激的生物学后果很多，并包括通过降低实现免疫效应功能所需的阈值来控制T细胞周期、扩增、分化以及TCR刺激的放大。
与活化性共刺激分子CD28不同，结构同系物，细胞毒性T淋巴细胞相关4(CTLA-4)，是一种抑制性共刺激受体，其膜表达由CD28的触发驱动。CTLA-4和CD28都是I型跨膜蛋白。它们的胞外部分由一个V组免疫球蛋白超家族(Ig-V)结构域组成，该结构域由位于IgV结构域外靠近跨膜区的半胱氨酸残基同源共价连接。尽管相似，CTLA-4和CD28在亲和力和四级结构排列方面有所不同。CTLA-4被发现对B7分子具有更高的结合亲和力，并且与CD28不同的二聚化模式导致与共享配体不同的化学计量结合。CD28表现出单价结合化学计量，而CTLA-4以二价方式相互作用。因此，CTLA-4以比CD28高得多的亲和力和抗体亲抗源性结合B7分子，并从而下调T细胞反应并助于抗原特异性耐受的起始。
已经表明一些共刺激分子具有几种生理形式。除了膜结合形式，已经描述了在稚免疫细胞中表达的可溶性形式，这增加了T细胞生物学的复杂性。CD28的可溶性形式(sCD28)已被归因于交替剪接的基因产物以及有效脱落(active shedding)。过去，T细胞活化期间的有效脱落被描述为通过粘附分子的蛋白水解来抵消连续活化的调节机制并且现在已经显示为也用于CD28。
膜CD28(mCD28)已被证明通过蛋白水解切割以产生sCD28。抑制这种切割被认为是抑制sCD28并从而抑制sCD28-介导的免疫抑制的方法。因此，迫切需要药物上可行且血清半衰期长的可阻断mCD28的蛋白水解切割的试剂。
发明内容
本发明提供包含由接头分开的至少两个部分的试剂，其中第一部分结合细胞表面上的膜的CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白水解切割。还提供了治疗和预防癌症并改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法的方法，其包括施用所述试剂。
根据第一方面，提供了包含由接头分开的至少两个部分的试剂，其中第一部分结合细胞表面上的膜的CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白水解切割，并且其中第二部分增加第一部分的稳定性。
根据一些实施方式，第一部分、第二部分或两者小于100千道尔顿(kDa)。
根据一些实施方式，试剂小于100kDa。
根据一些实施方式，第一部分选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合CD28的肽。
根据一些实施方式，第一部分包含单结构域抗体或由其组成。
根据一些实施方式，单结构域抗体是骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。
根据一些实施方式，第一部分包含三个CDR，其中：
CDR1包含SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:2(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:3(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列；
CDR1包含SEQ ID NO:4(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:5(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:6(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:7(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:8(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
根据一些实施方式，第一部分包含选自以下的序列：
a.
EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)；
b.
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)；和
c.
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)。
根据一些实施方式，第一部分包含三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包含如SEQ IDNO:13(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包含如SEQ ID NO:14(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包含如SEQ ID NO:15(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包含如SEQ ID NO:16(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包含如SEQ ID NO:17(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。
根据一些实施方式，试剂不是CD28激动剂。
根据一些实施方式，试剂不是CD28拮抗剂。
根据一些实施方式，第一部分的增加的稳定性包含增加血液中的稳定性。
根据一些实施方式，增加血液中的稳定性包含减少第一部分从血液中的清除。
根据一些实施方式，减少从血液中的清除包含减少肾过滤、减少溶酶体降解或两者。
根据一些实施方式，接头是刚性肽接头。
根据一些实施方式，刚性肽接头包含螺旋基序。
根据一些实施方式，刚性肽接头包含至少15个氨基酸。
根据一些实施方式，刚性肽接头包含至多30个氨基酸。
根据一些实施方式，接头包含至少一个半胱氨酸残基。
根据一些实施方式，至少一个半胱氨酸是C末端半胱氨酸。
根据一些实施方式，第二部分是聚乙二醇(PEG)并且经由硫醇键附接到半胱氨酸。
根据一些实施方式，第二部分是PEG并且PEG在第一部分的C末端的10个氨基酸内缀合。
根据一些实施方式，接头是肽接头并且PEG与肽接头的氨基酸缀合。
根据一些实施方式，PEG是线性或分支PEG，其大小为2000-40,000道尔顿(Da)。
根据一些实施方式，第二部分包含人血清白蛋白(HSA)多肽或由其组成。
根据一些实施方式，第二部分包含HAS结合多肽或由其组成。
根据一些实施方式，HAS结合多肽是单结构域抗体。
根据一些实施方式，单结构域抗体包含以下序列或由其组成：EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA(SEQ ID NO:19)。
根据一些实施方式，第一部分的C末端连接至接头并且第二部分的N末端连接至接头。
根据一些实施方式，第一部分的C末端连接至接头的N末端并且第二部分的N末端连接至接头的C末端。
根据一些实施方式，试剂包含选自SEQ ID NO:63和64的氨基酸序列或由其组成。
根据一些实施方式，试剂包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且包含将PEG部分不可逆缀合至第一部分的C末端的10个氨基酸内的氨基酸残基。
根据一些实施方式，试剂包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且包含将PEG部分可逆缀合至第一部分的C末端的10个氨基酸内的氨基酸残基。
根据一些实施方式，PEG是线性或分支PEG，其大小为2000-40,000道尔顿(Da)。
根据另一方面，提供了编码本发明的试剂的核酸分子。
根据另一方面，提供了包含本发明的核酸分子的表达载体。
根据另一方面，提供了生成本发明的试剂的方法，该方法包含以下的至少一项：
a.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28并且抑制mCD28的蛋白水解切割；
b.通过接头将第一部分连接至第二部分以产生连接的试剂，并测试连接的试剂与细胞的表面上的mCD28的结合以及对mCD28的蛋白水解切割的抑制；和
c.选择结合细胞表面上的mCD28并且抑制mCD28的蛋白水解切割的连接的试剂；和
d.培养包含一种或多种载体的宿主细胞，该载体包含编码试剂的核酸序列，其中该核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
i.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28并抑制mCD28的蛋白水解切割；
ii.通过接头将第一部分连接至第二部分以产生连接的试剂，并测试连接的试剂与细胞表面上的mCD28的结合以及对mCD28的蛋白水解切割的抑制；和
iii.选择结合细胞表面的上mCD28并且抑制mCD28的蛋白水解切割的连接的试剂；
从而生成本发明的试剂。
根据一些实施方式，方法进一步包含在连接的试剂存在下测定mCD28下游信号传导并选择至少一种既不实质上激动也不实质上拮抗mCD28信号传导的连接的试剂。
根据一些实施方式，方法进一步包含测定连接的试剂在血液中的稳定性和选择至少一种与在血液中的第一部分相比包含增加的稳定性的连接的试剂。
根据另一方面，提供了由本发明的方法产生的试剂。
根据另一方面，提供了包含本发明的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂的药物组合物。
根据另一方面，提供了降低有需要的受试者中可溶性CD28(sCD28)水平的方法，该方法包含施用本发明的试剂或本发明的药物组合物，从而降低受试者中的sCD28。
根据另一方面，提供了治疗和/或预防有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包含施用本发明的试剂或本发明的药物组合物，从而治疗和/或预防受试者中的癌症。
根据另一方面，提供了改善有需要的受试者中基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，该方法包含施用本发明的试剂或本发明的药物组合物，从而改善受试者中基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。
根据一些实施方式，受试者患有癌症。
根据一些实施方式，方法不降解mCD28、降低mCD28介导的免疫细胞活化或活化mCD28介导的免疫细胞活化。
从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，该详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅作为说明给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1A-1C.(1A)显示通过系列稀释克隆M9与BSA缀合的CD28茎区二聚肽(右)和重组人CD28蛋白(左)结合的抗原的线图。抗原被固定在maxisorp ELISA平板上。进行克隆M9的系列稀释，并使用驴抗小鼠IgG(H&L)-HRP检测结合的抗体，并使用TMB进行显影。(1B)重组人sCD28(左)和从用SEB活化的人PBMC脱落的sCD28(右)的ELISA检测的条形图。ELISA使用抗体#3作为阳性对照(2μg/mL，灰色条)，不相关的抗体M39作为阴性对照(10μg/mL，深灰色条)，和抗-切割抗体M9(10μg/mL，黑色条)。通过使用缀合至HRP(0.5μg/mL)的ELISA试剂盒检测抗体进行重组CD28或脱落的CD28的检测。(1C)显示抗体M9(上)和对照抗体CD28.2(下)以10μg/mL(黑色直方图)的固定浓度与在小鼠HEK293细胞中表达的人CD28的结合的直方图。多克隆小鼠IgG用作阴性对照(10μg/mL)并在灰色直方图中描绘。通过与二抗AlexaFluor 647–缀合的山羊抗-小鼠的温育完成检测。
图2:通过ELISA与人CD28茎区序列结合。通过不同VHH克隆的系列稀释分析抗原结合。将作为抗原的生物素缀合的CD28茎区二聚肽固定在中性抗生物素蛋白包被的ELISAmaxi-sorb平板上。对VHH克隆进行系列稀释，并用抗His标签-HRP缀合的抗体检测结合的VHH，和用TMB进行显影。
图3:VHH#2A1与膜的人CD28的结合。将FITC缀合的VHH克隆2A1(50μg/mL，黑色直方图)和FITC缀合的同种型对照(mIgG，50μg/mL，灰色直方图)与过表达人CD28的HEK细胞一起温育。通过FACS分析评估结合。
图4:抗CD28茎区VHH克隆2A1、4A1和4A4特异性结合人CD28的MMP切割位点。通过直接ELISA比较VHH克隆与人CD28茎区WT序列或L145K突变序列的特异性结合。将生物素缀合的野生型或L145K CD28茎区二聚肽固定在中性抗生物素蛋白包被的ELISA maxi-sorb平板上。进行VHH克隆(0.2-5μg/mL)和不相关的VHH克隆(左上图)的系列稀释，并用抗His标签-HRP缀合的抗体检测结合的VHH，和用TMB进行显影。
图5:通过VHH克隆体外阻断MMP-2介导的人CD28茎区的切割。在MMP-2抑制剂(TMI-1,50nM)、M9 Fab或指示的VHH克隆——以多种浓度(0.4-10μg/mL)——存在下，将c-Myc缀合的和生物素化的人CD28茎区二聚肽(1μM)与50ng rhMMP-2一起温育5小时。将混合物加载到中性抗生物素蛋白包被的ELISA maxi-sorb平板上，然后进行充分洗涤，并通过抗cMycHRP缀合抗体检测完整肽，和用TMB进行显影。
图6:VHH克隆2A1对MMP-13切割人CD28茎区的体外阻断活性。在MMPi(TMI-1,50nM，深灰色条)、不相关VHH克隆(左图中的黑色条)或VHH克隆2A1(右图中的黑色条)——以多种浓度(0.62-10μg/mL)——存在下，将c-Myc和生物素化的人CD28茎区二聚肽(1μM)与50ngrhMMP-13(浅灰色条)一起温育5小时。将混合物加载到中性抗生物素蛋白包被的ELISAmaxi-sorb平板上，然后进行充分洗涤，并通过抗cMyc-HRP缀合抗体检测完整肽，和用TMB进行显影。
图7:抗CD28茎区VHH克隆2A1和4A4抑制过表达人CD28的HEK细胞中的CD28脱落。在48小时培养后，在稳定表达人CD28的HEK细胞的培养基中测量可溶性CD28的水平。描绘了MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、不相关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)或抗CD28茎区VHH克隆(黑色条)——以多种浓度(3.3-100μg/mL)——的不同处理对可溶性CD28水平的影响。上清液中可溶性人CD28的水平用标准化夹心ELISA(R&D系统)进行定量。
图8:抗CD28茎区VHH克隆2A1和4A4抑制由PHA和IL2活化的分离的CD4 T细胞中的CD28脱落。在用5μg/mL PHA和200IU/mL IL-2(浅灰色条)刺激的分离的人CD4T细胞的培养基中测量可溶性CD28的水平。描绘了MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、不相关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)、抗CD28茎区VHH克隆或抗体M9克隆的Fab形式(黑色条)——以多种浓度(0.4-50μg/mL)——的不同处理对可溶性CD28量的影响。上清液中可溶性人CD28的水平用标准化夹心ELISA(R&D系统)进行定量。
图9:抗CD28茎区VHH克隆2A1和4A4抑制由超抗原活化的PBMC中的CD28脱落。在用1ng/mL SEB(浅灰色条)刺激的分离的PBMC的培养基中测量可溶性CD28的水平。描绘了MMP抑制剂(TMI-1，1μM，深灰色条)、不相关VHH的阴性对照(左上图，黑色条)、抗CD28茎区VHH克隆或M9克隆的Fab形式(黑色条)——以多种浓度(0.4-50μg/mL)——的不同处理对可溶性CD28量的影响。上清液中可溶性人CD28的水平用标准化夹心ELISA(R&D系统)进行定量。
图10抗CD28茎区VHH克隆不阻断配体与膜CD28的结合。使用与AlexaFlour 647缀合的抗人Fc二抗通过流式细胞术监测过表达人CD28的HEK293细胞的CD86-Fc(2μg/mL)结合。将抗CD28 VHH克隆添加到CD86-Fc(30μg/mL，黑色柱状图)没有改变CD86结合的幅度，而添加商业抗体克隆CD28.2(10μg/mL，左上图，黑色柱状图)显著降低了结合。
图11:抗CD28茎区VHH克隆的激动剂效果评估。在作为阳性对照的抗CD28激动剂抗体克隆28.2(2μg/mL，深灰色条)、抗CD28茎区VHH或不相关VHH克隆(20μg/mL，黑色条)存在下，用平板结合的抗CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)刺激人分离的CD3细胞2天。用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量分泌到上清液中的人IFNγ的浓度。
图12:抗CD28茎区VHH克隆的拮抗剂效果评估。在作为CD28共刺激配体的重组CD80-Fc蛋白(5μg/mL，深灰色条)存在下，用平板结合的抗CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)刺激人分离的CD3细胞24小时。以不同浓度(3.75-30μg/mL，黑色条)添加不相关VHH克隆(左上图)或抗CD28茎区VHH。用标准化夹心ELISA(Biolegend)对上清液中人IL-2的浓度进行定量。
图13：不同2A1半衰期延长构建体与人CD28茎区序列的结合。通过连续稀释亲本2A1 VHH和11种半衰期延长构建体分析抗原结合。CD28-Fc重组肽用作诱饵。
图14：不同2A1半衰期延长构建体对膜CD28的配体阻断活性。直方图显示，在亲本2A1 VHH(顶排/中间)、阳性对照拮抗抗体(顶排/右侧)以及多种半衰期延长构建体的存在下，CD86与表达人CD28的HEK293细胞结合(顶排/左侧)。显示了具有15个氨基酸的长挠性接头的构建体，但是用5个氨基酸和35个氨基酸挠性接头观察到了类似的结果。显示了20个氨基酸的长刚性接头，但是用30个氨基酸的刚性接头观察到了类似的结果。
图15A-15B：不同2A1半衰期延长构建体的激动剂作用评估。在不相关的VHH克隆#3C04(1.2μM，深灰色条)、阳性对照抗CD28激动剂抗体克隆28.2(2μg/mL，深灰色条)、或不同的2A1构建体(1.2μM，黑色条)存在下，用(15A)平板结合的CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)或(15B)用scOKT3质粒转染的A375细胞(人工APC，灰色条)刺激24小时的分离的人CD3阳性T细胞的IL2分泌柱状图。
图16：不同2A1半衰期延长构建体的拮抗剂作用评估。在不相关的VHH克隆#3C04(2μM，同种型对照，深灰色条)、阳性对照抗CD28拮抗剂克隆VHH#12B07(1μM)或多种2A1构建体存在下，用人CD80和scOKT3质粒(人工APC-CD80，浅灰色条)刺激24小时的分离的人CD3 T细胞的IL2分泌柱状图。以2μM使用具有挠性和刚性接头的构建体。以多种浓度(0.1-3μM)使用聚乙二醇化构建体。
图17：基于MLR的测定中不同2A1半衰期延长构建体的免疫调节作用。在不相关的VHH克隆#3C04(3μM，同种型对照，深灰色条)、CD28拮抗剂克隆VHH#1A07(3μM)和多种浓度(0.1-3μM，2A1-1C-P2K-HSA除外，其仅以2.5μM的浓度使用)的不同2A1构建体存在下，来自混合淋巴细胞反应的IL2分泌柱状图(浅灰色条)。
图18：半衰期延长构建体对小鼠中2A1血清暴露的影响。小鼠中多种被测试的VHH构建体的平均观察的(n＝3*；±标准偏差)血清浓度(μg/mL)作为时间(小时)函数的曲线图。
图19：刺激的淋巴细胞中CD28脱落的抑制。在用PHA和IL-2刺激的分离的人CD4或用SEB刺激的PBMC的培养基中测量可溶性CD28的水平，并用不相关的VHH#3C04阴性对照(3μM，同种型对照，灰色条)对阴性对照归一化。还对亲本2A1 VHH(3μM，深灰色条)、MMP抑制剂(阳性对照，1μM TMI-1，浅灰色条)和多种2A1半衰期延长构建体(3μM，黑色条)进行了评估和归一化。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明提供了包含至少两个部分的试剂，其中第一部分结合细胞表面上的膜的CD28(mCD28)并抑制mCD28的蛋白水解切割，且第二部分增加第一部分的稳定性。还提供了生成本发明的试剂、治疗癌症、改善基于PD-1/PD-L1的免疫疗法和降低受试者中sCD28水平的方法，其包含施用本发明的试剂。还提供了包含本发明试剂的药物组合物，以及使用该药物组合物的方法。本发明的试剂、方法和组合物基于令人惊讶的发现，即由mCD28的蛋白水解切割产生的sCD28充当免疫抑制剂，因此减少脱落具有降低sCD28的抑制和经由mCD28信号传导增加免疫活化的双重益处。针对mCD28切割位点的全尺寸抗体太大而不能到达膜近侧区域，因此不能抑制脱落，而对细胞表面上mCD28具有特异性的较小多肽能够到达膜近侧区域并阻断蛋白水解切割。多肽在血清中的治疗上有用的稳定性通过与第二部分的连接而增强。第二部分增加了第一部分的血清半衰期，同时不影响多肽与细胞上mCD28的结合能力。
试剂
根据第一方面，提供了包含由接头分开的至少两个部分的试剂，其中第一部分结合细胞的表面上的mCD28并且其中第二部分增加第一部分的稳定性。
如本文所用，术语“部分”涉及分子的一部分，其可以包括整个官能团或部分官能团作为子结构。术语“部分”进一步指分子的一部分，其表现出与相应分子相似的一组具体化学和/或药理特征。
在一些实施方式中，CD28是哺乳动物CD28。在一些实施方式中，CD28是人CD28。在一些实施方式中，人CD28包括或由以下氨基酸序列组成：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:20)。在一些实施方式中，成熟CD28缺少信号肽并且包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)。
在一些实施方式中，编码全长人CD28的DNA编码序列包括序列：ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方式中，CD28是膜的CD28(mCD28)。在一些实施方式中，膜的CD28是膜CD28。在一些实施方式中，mCD28在细胞表面上。在一些实施方式中，mCD28在膜中。在一些实施方式中，细胞表面是细胞膜。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是NK细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是NKT细胞。在一些实施方式中，细胞是细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞系表达mCD28。在一些实施方式中，细胞系从表达载体表达mCD28。在一些实施方式中，细胞系稳定表达mCD28。
在一些实施方式中，CD28是可溶性CD28(SCD28)。如本文所使用，sCD28是指不包括跨膜结构域并因此不能在膜中整合的任何CD28片段或变体。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包括氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:23)。在一些实施方式中，sCD28不是膜结合的。在一些实施方式中，sCD28在溶液中。在一些实施方式中，sCD28是血液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是TME中的CD28。在一些实施方式中，sCD28是体液中的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28是由剪接掉CD28的外显子3的交替剪接产生的剪接变体。在一些实施方式中，sCD28是来自膜的CD28(mCD28)的切割产物。在一些实施方式中，sCD28是截短的CD28。在一些实施方式中，sCD28缺少全长CD28的胞质结构域。在一些实施方式中，sCD28是二聚体sCD28。在一些实施方式中，sCD28是单体sCD28。在一些实施方式中，sCD28不是由交替剪接CD28产生的剪接变体。在一些实施方式中，交替剪接剪接掉CD28的外显子3。在一些实施方式中，sCD28包括氨基酸序列：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQID NO:24)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28缺少信号肽并包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE(SEQ ID NO:25)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28包括氨基酸序列：MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sCD28缺少信号肽并包括序列：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，sCD28由SEQ IDNO:27的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，编码人sCD28的DNA编码序列包括序列：ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA(SEQ ID NO:28)。
sCD28对免疫细胞的作用是本领域众所周知的，并且作为非限制性实例包括抗炎症细胞因子诸如IL-10或TGFβ的免疫细胞诱导，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的免疫细胞表达，以及促炎细胞因子诸如IL-2或IFN-γ的免疫细胞下调。在一些实施方式中，试剂抑制膜的CD28的蛋白水解切割包括抑制sCD28的产生。在一些实施方式中，抑制sCD28的产生包括抑制sCD28对免疫细胞的作用。
在一些实施方式中，试剂包括至少两个部分。在一些实施方式中，试剂包括多个部分。在一些实施方式中，试剂包含至少2、3、4、5、6或7个部分。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂包含两个部分。在一些实施方式中，试剂包括第一部分和第二部分。在一些实施方式中，至少一个部分是结合部分。在一些实施方式中，至少一个部分是半衰期增强部分。在一些实施方式中，至少一个部分是半衰期延长部分。在一些实施方式中，至少一个部分是稳定性增强部分。在一些实施方式中，至少一个部分是稳定性增加部分。
在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者都不是全尺寸抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者都不是IgG。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于100千道尔顿(kDa)。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20或15kDa。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于50kDa。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于25kDa。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于20kDa。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合小于15kDa。
在一些实施方式中，第一部分结合mCD28。在一些实施方式中，第一部分结合细胞表面上的mCD28。在一些实施方式中，第一部分抑制mCD28的蛋白水解切割。在一些实施方式中，mCD28是由第一部分结合的mCD28。如本文所使用，“抑制蛋白水解切割”是指mCD28的蛋白水解切割的任意减少。在一些实施方式中，抑制是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的切割减少。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，抑制蛋白水解切割保持免疫细胞上mCD28的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白水解切割增加免疫细胞上mCD28的水平。在一些实施方式中，抑制蛋白水解切割保持足以免疫刺激的mCD28水平。
在一些实施方式中，蛋白水解切割的减少是至少一种蛋白酶的切割减少。在一些实施方式中，蛋白水解切割的减少是至少一种金属蛋白酶的切割减少。在一些实施方式中，金属蛋白酶MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17、MMP-13或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2或MMP-13。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13或其组合。
在一些实施方式中，第一部分选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合CD28的肽。在一些实施方式中，第一部分是Fab片段。在一些实施方式中，第一部分是单链抗体。在一些实施方式中，第一部分是单结构域抗体。在一些实施方式中，第一部分是特异性结合CD28的肽。在一些实施方式中，第一部分选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体和单结构域抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者都不是全尺寸抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者缺乏Fc结构域。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是缺乏Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是骆驼科动物抗体、鲨鱼抗体或纳米抗体。
在一些实施方式中，试剂与其他蛋白质或蛋白质片段融合。在一些实施方式中，第二蛋白或片段将试剂靶向CD28。在一些实施方式中，另一种蛋白质或蛋白质片段是结合CD28的胞外结构域的抗原结合部分。
第一部分、第二部分或两者的实例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、纳米抗体、单链抗体、单结构域抗体、小分子、肽和DARPin。在一些实施方式中，试剂选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和与CD28特异性结合的肽。在一些实施方式中，试剂是单结构域抗体。在一些实施方式中，试剂是纳米抗体。在一些实施方式中，试剂是VHH抗体。如本文所使用，术语“单结构域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”是同义词并可互换使用。在一些实施方式中，肽具有对CD28的特异性结合。在一些实施方式中，试剂是与CD28特异性结合的肽。在一些实施方式中，肽选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、纳米抗体、VHH抗体和抗体模拟物。如本文所使用，术语“抗体模拟物”是指可以特异性结合靶抗原的有机化合物。在一些实施方式中，抗体模拟物与抗体在结构上不相关。抗体模拟物的实例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体(alphabodies)、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体(monobodies)和nanoCLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。所有这些试剂在本领域是已知的并且已知可用于阻断受体与其配体之间的相互作用。可以结合mCD28的小分子和蛋白可以堵塞切割位点或可能引起隐蔽或损害蛋白酶的接近。在一些实施方式中，蛋白是抗体模拟物。如本文所使用，术语“DARPin”是指设计的锚蛋白重复蛋白。DARPins是遗传工程化的抗体模拟物蛋白，其通常对于其蛋白靶标具有高度特异性。因此，CD28的DARPin可以是试剂的实例。
在一些实施方式中，Fab片段包括约50kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于100kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于80kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于70kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括小于50kDa的尺寸。在一些实施方式中，Fab片段包括50kDa或更小的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括约25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于50kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于40kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于30kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体包括25kDa或更小的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括约15kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-20kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-17kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-16kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括10-15kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-15kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-16kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-17kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括12-20kDa之间的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于20kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括小于15kDa的尺寸。在一些实施方式中，单结构域抗体包括15kDa或更小的尺寸。由于其小尺寸，且抗原结合仅依赖3个CDR，单结构域抗体的结合机构，具体为VHH，是凸形的，且仅从一侧结合其表位并且因此，更适合结合以有限的溶剂暴露为特征的表位，例如在蛋白质裂缝(protein cleft)如膜锚定CD28的茎区中发现的。相比之下，Fab片段和单链抗体包含6个CDR并从至少2个侧面结合表位。在一些实施方式中，和与6个CDR结合相比，仅与3个CDR结合允许更好地接近mCD28茎区。在一些实施方式中，单结构域抗体结合的几何形状更优于接近mCD28茎区。
如本文所使用，术语“抗体”是指包含至少一个结合结构域的多肽或一组多肽，所述结合结构域由具有三维结合空间的多肽链折叠形成，所述三维结合空间具有与抗原决定簇的特征互补的内表面形状和电荷分布。抗体通常具有四聚体形式，包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。抗体可以是寡克隆、多克隆、单克隆、嵌合、骆驼科化、CDR移植、多特异性、双特异性、催化、人源化、全人、抗独特型和可以以可溶或结合形式标记的抗体以及片段(包括表位结合片段)、其变体或衍生物，单独或与其他氨基酸序列组合。抗体可以来自任何物种。术语抗体还包括结合片段，包括，但不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab')2单链抗体(scFv)、二聚可变区(Diabody)和二硫键可变区(dsFv)。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。抗体片段可以融合或不融合到另一免疫球蛋白结构域，其包括但不限于，Fc区或其片段。本领域技术人员将进一步认识到，可以产生其他融合产物，其包括但不限于scFv-Fc融合、可变区(例如VL和VH)～Fc融合和scFv-scFv-Fc融合。
免疫球蛋白分子可以拥有任何类型(如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。
天然存在的抗体结构的基本单元是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成，其通过非共价缔合和通过二硫键连接在一起。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在五种人抗体类别(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并且在这些类别内，基于结构差异识别各种亚类，诸如单个抗体分子中免疫球蛋白单元的数量，个体单元的二硫键结构，以及链长和序列的差异。抗体的类别和亚类是其同种型。在一些实施方式中，Fab片段具有小于100、90、80、75、70、65、60、55、或50kDa的尺寸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，Fab片段具有小于50kDa的尺寸。
重链和轻链的氨基末端区在序列上比羧基末端区更加多样性，因此被称为可变结构域。抗体结构的这部分赋予抗体的抗原结合特异性。重可变(VH)结构域和轻可变(VL)结构域一起形成单个抗原结合位点，因此，基本免疫球蛋白单元具有两个抗原结合位点。特定氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Chothia et al.,J.Mol.Biol.186,651-63(1985)；Novotny和Haber,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824592-4596)。
重链和轻链的羧基末端部分形成恒定结构域，即CH1、CH2、CH3、CL。虽然在这些结构域中存在更少多样性，但是动物物种之间存在差异，并且进一步，在相同的个体内，存在若干抗体的不同同种型，每个具有不同的功能。
术语“框架区”或“FR”是指抗体的可变结构域中的氨基酸残基，其不同于本文定义的高变区氨基酸残基。本文使用的术语“高变区”指抗体的可变结构域中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。CDR主要负责结合抗原的表位。FR和CDR的范围已经被精确定义(参见，Kabat等人)。
免疫球蛋白可变结构域还可以使用IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(
Figure BDA0003926623600000131
/V-Quest)进行分析以鉴定可变区段，包括CDR。参见，如，Brochet,X.et al,Nucl.Acids Res.J6:W503-508(2008)。
Chothia等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域技术人员可以明确地将这种“Chothia编号”系统分配给任何可变结构域序列，而无需依赖序列本身以外的任何实验数据。如本文所使用，“Chothia编号”是指由Chothia等人Journalof Molecular Biology,"Canonical Structures for the Hypervariable regions ofimmunoglobulins"(1987)和Chothia的人Nature,“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”(1989)提出的编号系统。
如本文所使用，术语“单链抗体”和“单链可变片段”同义使用，并且是指由短肽接头连接的免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合蛋白。在一些实施方式中，单链抗体具有小于50、45、40、35、30、25、或20kDa的尺寸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，单链抗体具有小于25kDa的尺寸。在一些实施方式中，单链抗体的接头在10和25个氨基酸之间。在一些实施方式中，单链抗体的接头在1-40、5-40、10-40、1-35、5-35、10-35、1-30、5-30、10-30、1-25、5-25或10-25个氨基酸之间。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的重链。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的轻链。在一些实施方式中，单链抗体包括抗体M9的CDR。
如本文所使用，术语“单结构域抗体”、“纳米抗体”、“DARPin”和“VHH”同义使用，并且是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体是骆驼科动物抗体。在一些实施方式中，骆驼科动物是骆驼、羊驼或美洲驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是骆驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是羊驼。在一些实施方式中，骆驼科动物是美洲驼。在一些实施方式中，单结构域抗体是鲨鱼抗体。
还有，本文已经指示，纳米抗体的氨基酸残基根据Kabat等人给出的VH一般编号进行编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public HealthServices,NIH Bethesda,Md.,Publication No.91)，在Riechmann和Muyldermans的文章中应用于骆驼科动物的VHH结构域，J.Immunol.Methods 2000Jun.23；240(1-2):185-195；或本文提及。根据该编号，纳米抗体的FR1包括在位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括在位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括在位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括在位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括在位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括在位置95-102的氨基酸残基，和纳米抗体的FR4包括在位置103-113的氨基酸残基。在这方面，应当注意到——如本领域熟知的VH结构域和VHH结构域——每个CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，并且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能不被占据，或实际序列可能包含比Kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，一般地，根据Kabat的编号可以或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。一般地，然而，可以说，根据Kabat的编号，且不考虑CDR的氨基酸残基数，根据Kabat编号的1位对应FR1的起始位置，反之亦然，根据Kabat编号的36位对应FR2的开始，反之亦然，根据Kabat编号的66位对应FR3的开始，反之亦然，以及根据Kabat编号的103位对应FR4的开始，反之亦然。
对VH结构域的氨基酸残基进行编号的可选方法(该方法也可以以类似的方式适用于来自骆驼科动物抗体和纳米抗体的VHH结构域)是Chothia等人描述的方法(Nature 342,877-883(1989))，所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。然而，在本说明书、方面和图中，除非另有说明，否则将遵循Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
如本文所使用，术语“人源化抗体”是指来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人抗体的相似性。人源化抗体可以通过产生编码被类似人抗体的序列包围的非人抗体的CDR的重组DNA来产生。在一些实施方式中，人源化抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，人源化包括将本发明的CDR插入到人抗体支架或骨架中。人源化抗体在本领域中是众所周知的，并且可以使用任何产生保留本发明的CDR的人源化抗体的方法。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同型的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，但在单克隆抗体的生产过程中可能出现的变体除外，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势还在于它们不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同型的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应被解释为通过任何具体制备方法生产。根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人(Nature256:495(1975))首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人(Nature 352：624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.222:581-597(1991))描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本发明的mAb可以是任何免疫球蛋白类别，其包括IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。可以在体外或体内培养产生mAb的杂交瘤。从体内生产中可以获得高滴度的mAb，其中来自单个杂交瘤的细胞被腹膜内注射到pristine-primed Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度所需mAb的腹水。同种型IgM或IgG的mAb可以使用本领域技术人员公知的柱色谱法从这些腹水液或培养物上清液中纯化。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于，Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFv)4-Fc、di-scFv、bi-scFv、或串联(di,tri)-scFv)；和双特异性T细胞接合器(BiTE)。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。VH-VL二聚体的三个表面正是在这种配置中。总的来说，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括三个对抗原特异的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有至少一个游离硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被归为称为κ和λ的两种明显不同的类型中的一种。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以被分配到不同的类别。完整抗体存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为a、δ、e、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的子单元结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，请参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体生产是本领域已知的，并且在Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中描述。
术语“多特异性抗体”以最广泛的意义使用，并且特别涵盖具有多表位特异性的抗体。这种多特异性抗体包括，但不限于，包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体——其中VHVL单元具有多表位特异性、具有两个或多个VL和VH结构域的抗体——其中每个VHVL单元结合至不同表位、具有两个或多个单个可变结构域的抗体——其中每个单个可变结构域结合至不同表位、全长抗体、抗体片段(比如Fab、Fv、dsFv、scFv)、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指与相同或不同靶标(一个或多个)上的两个或多个不同表位特异性结合的能力。
可以使用本领域公知的方法制备单克隆抗体。实例包括各种技术，比如Kohler,G.和Milstein,C,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor et al,Immunology Today 4:72(1983)；Cole et al,pg.77-96in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.(1985)中的那些。
除了在体内产生抗体的常规方法之外，还可以使用噬菌体展示技术在体外产生抗体。与常规抗体生产相比，这种重组抗体的生产要快得多，并且可以针对大量抗原产生重组抗体。此外，当使用常规方法时，许多抗原被证明是非免疫原性或剧毒的，因此不能用于在动物中产生抗体。此外，重组抗体的亲和力成熟(即，增加亲和力和特异性)非常简单且相对快速。最后，在一个选择程序中可以产生大量针对特定抗原的不同抗体。为了产生重组单克隆抗体，人们可以使用各种基于展示文库的方法来产生大量具有不同抗原识别位点的抗体。这种文库可以通过多种方式制造：可以通过在重链种系基因文库中克隆合成CDR3区域来生成合成文库，从而生成大抗体文库，从中可以选择具有各种特异性的重组抗体片段。人们可以使用人类的淋巴细胞文库作为构建抗体文库的起始材料。可以构建人类IgM抗体的原始文库，因而创建一个具有广泛多样性的人类文库。该方法已被广泛成功地用于选择大量针对不同抗原的抗体。噬菌体文库构建和重组抗体选择的方案在众所周知的参考文本Current Protocols in Immunology,Colligan et al(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.(1992-2000)，第17章，第17.1节中提供。
非人抗体可以通过本领域已知的任何方法人源化。在一种方法中，将非人互补决定区(CDR)插入到人抗体或共有抗体框架序列中。然后可以将进一步的变化引入抗体框架以调节亲和力或免疫原性。
在一些实施方式中，抗体及其部分包括：抗体、抗体片段、Fab和F(ab')2、单结构域抗原结合重组片段和天然纳米抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab')2、scFv或scFv2片段。
在一些实施方式中，本发明提供了编码本发明的试剂的核酸序列。
例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完全的重链不仅包括重链可变区(VH)还包括重链恒定区(CH)，其通常包括三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3；以及“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是期望的。
可由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，诸如单结构域抗体(“dAbs”)、Fv、scFv、Fab'和CHI并且CK或CL结构域已被切除。由于微型抗体比常规抗体小，所有它们在临床/诊断使用中应该实现更好的组织渗透，但是二价的它们应该比单价抗体片段诸如dAbs保留更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，本文使用的术语“抗体”不仅包括整个抗体分子，还包括以上讨论的类型的抗原结合抗体片段。编码的多肽中存在的每个框架区可包含相对于相应的人受体框架的至少一个氨基酸取代。因此，例如，框架区可总共包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一、十二、十三、十四或十五个相对于受体框架区的氨基酸取代。鉴于包含所公开的蛋白产物的个体氨基酸的特性，本领域技术人员将认识到一些合理的取代。氨基酸取代，即“保守取代”，可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行。
适当地，本文描述的多核苷酸可以是分离的和/或纯化的。在一些实施方式中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
如本文所使用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合，或其任何语法变体，是条件术语，其明确排除但仅排除本领域普通技术人员熟知为“天然存在的”或者在任何时间可能被法官、行政或司法机构确定或解释为“天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物、实体的组合的那些形式。
在一些实施方式在中，第一部分包括三个CDR，其中CDR1包括如SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:2(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:3(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式在中，第一部分包括三个CDR，其中CDR1包括如SEQ ID NO:4(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:5(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:6(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式在中，第一部分包括三个CDR，其中CDR1包括如SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO:7(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO:8(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CDR根据Abm编号方法进行编号。在一些实施方式中，CDR根据Chothia编号方法进行编号。在一些实施方式中，CDR根据Kabat编号方法进行编号。
在一些实施方式中，CDR1包括SEQ ID NO:29(INAMX1)中叙述的氨基酸序列，其中X1是G或A。在一些实施方式中，CDR2包括SEQ ID NO:30(AIX1X2X3GX4TX5YAX6SVKG)中叙述的氨基酸序列，其中X1是S或T，X2是G或S，X3是G或S，X4是D或S，X5是Y或N，和X6是D或N。在一些实施方式中，CDR3包括SEQ ID NO:31(DX1YGX2DYWX3)中叙述的氨基酸序列，其中X1是E或L，X2是E或S，和X3是D或I。在一些实施方式中，CDR3包括SEQ ID NO:32(DX1YGSDYWX2)中叙述的氨基酸序列，其中X1是E或L，和X2是D或I。
在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是单结构域抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是VHH抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是骆驼科动物抗体。在一些实施方式中，骆驼科动物是美洲驼。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者除了上文叙述的CDR外不包括其他CDR。
在一些实施方式中，第一部分包括包含以下和/或由其组成的序列EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方式中，第一部分包括包含以下和/或由其组成的序列EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方式中，第一部分包括包含以下和/或由其组成的序列QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方式中，VHH序列进一步包括His标签。在一些实施方式中，His标签是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个组氨酸残基。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，His标签由6个组氨酸残基组成。在一些实施方式中，His标签通过接头连接至VHH。在一些实施方式中，接头是肽接头。在一些实施方式中，接头是丙氨酸重复接头。在一些实施方式中，丙氨酸重复包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个丙氨酸残基。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，丙氨酸重复接头由3个丙氨酸残基组成。在一些实施方式中，His-标签是六个His标签。
在一些实施方式中，发现特异性结合人CD28的茎区并包括His标签的VHH序列是：EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:33，克隆2A1)；EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:34，克隆4A4)；和QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:35，克隆4A1)。
在一些实施方式中，VHH序列进一步包含在His标签的C末端的半胱氨酸。在一些实施方式中，半胱氨酸通过间隔子与His-标签分开。在一些实施方式中，间隔子是单个氨基酸。在一些实施方式中，间隔子是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，间隔子包含甘氨酸残基或由其组成。在一些实施方式中，发现特异性结合人CD28的茎区的包含His-标签和通过甘氨酸与His-标签分开的C末端半胱氨酸的VHH序列选自：EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC(SEQ ID NO:36)；EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC(SEQ IDNO:37)；和QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGC(SEQ ID NO:38)。
在一些实施方式中，第一部分包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包括如SEQ ID NO:39(GYTLTNY)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQ IDNO:40(NTYTGK)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:41(GDANQQFAY)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:42(KASQDINSYLS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:43(RANRLVD)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:44(LQYDEFPPT)中叙述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一部分包括三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：CDR-H1包括如SEQ ID NO:12(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包括如SEQID NO:13(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包括如SEQ ID NO:14(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包括如SEQ ID NO:15(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包括如SEQ ID NO:16(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包括如SEQ ID NO:17(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。该抗体在本文中被称为M9
在一些实施方式中，第一部分包括包含如下氨基酸序列的重链：DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCVASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGDNTYYAGTVTGRFTISRDFAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCARIHWPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:45)。在一些实施方式中，重链的可变区包括SEQ ID NO:45和/或由其组成。在一些实施方式中，试剂包括包含由如下核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链：GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATAAGTGATGGTGGTGATAACACCTACTACGCAGGCACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGACCTCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATTCATTGGCCTTACTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ IDNO:46)。在一些实施方式中，重链由SEQ ID NO:46组成。对抗体M9进行测序并发现具有由SEQ ID NO:45组成的重链。如使用Chothia方案所确定的该重链的CDR是SEQ ID NO:12-14。
在一些实施方式中，第一部分包括包含如下氨基酸序列的轻链：QFVLSQSPAILSASPGEMLTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，轻链的可变区包括SEQ ID NO:47或由其组成。在一些实施方式中，第一部分包括包含由以下核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链：CAATTTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCCGGGGAGATGCTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCGACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGA(SEQ ID NO:48)。在一些实施方式中，轻链由SEQ ID NO:48组成。抗体M9被测序并发现具有由SEQ ID NO:47组成的轻链。如使用Chothia方案所确定的该轻链的CDR是SEQ ID NO:15-17。
在一些实施方式中，第一部分结合作为单体。在一些实施方式中，第一部分结合作为二聚体。在一些实施方式中，第一部分结合作为单体和/或二聚体。在一些实施方式中，第一部分结合作为二聚体，但不交联和/或活化mCD28。在一些实施方式中，第一部分结合作为二聚体，但仅结合CD28的单个分子。在一些实施方式中，第一部分结合单体CD28。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者结合二聚体CD28。在一些实施方式中，第一部分结合单体和/或二聚体CD28。
在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不是CD28激动剂。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不是CD28拮抗剂。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合既不是CD28激动剂也不是拮抗剂。
术语“激动剂”通常是指与受体结合并完全或部分活化受体的分子、化合物或试剂。在一些实施方式中，激动剂在与天然配体相同的位点结合。在一些实施方式中，激动剂在不同于天然配体的结合位点的变构位点结合。术语“拮抗剂”通常是指在与激动剂相同的位点或另一位点结合至受体，不活化受体，并且执行以下一项或多项操作的分子、化合物或试剂：干扰或阻断天然配体对受体的活化、和干扰或阻断受体激动剂对受体的活化。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合结合mCD28但不活化或阻断受体的活化。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不阻断通过CD86的活化。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不结合mCD28。
如本文所使用，“直接激动剂/拮抗剂”是指与受体(mCD28)结合并且通过结合增加/减少该分子的信号传导的分子。在mCD28的情况下，激动剂将结合mCD28并通过结合增加细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞活化。在一些实施方式中，激动剂增加T细胞增殖。在一些实施方式中，激动剂增加促炎细胞因子分泌。促炎细胞因子是本领域公知的并且已知由活化的T细胞分泌。促炎细胞因子的实例包括，但不限于，TNFα、IFNγ、IL-1B、IL-2和IL-6。在一些实施方式中，促炎细胞因子是IFNγ。在一些实施方式中，促炎细胞因子是IL-2。在mCD28的情况下，拮抗剂将结合mCD28并通过结合减少细胞中的mCD28信号传导。在一些实施方式中，拮抗剂降低T细胞活化、降低T细胞增殖和/或降低促炎细胞因子分泌。通过接触其配体、接触抑制剂、接触共受体或接触除所讨论的受体以外的任何分子来实现受体信号传导以便改变受体信号传导的分子不被视为直接激动剂/拮抗剂。在一些实施方式中，本发明的试剂接触血清中的sCD28，并从而允许增加通过细胞上的mCD28的信号传导。尽管结果是mCD28信号传导增加，但抗体不是mCD28激动剂或直接激动剂，因为它与mCD28的结合不增加受体信号传导。
在一些实施方式中，第一部分不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不隐蔽或阻断接近配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不结合、隐蔽或阻断接近sCD28的IgV结构域。在一些实施方式中，IgV结构域是配体结合结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包括SEQID NO:20的氨基酸28-137。在一些实施方式中，配体结合结构域包括以下氨基酸序列或由其组成：MLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不抑制sCD28与配体的结合。在一些实施方式中，CD28配体选自：CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方式中，CD28配体是CD86。在一些实施方式中，CD28配体是CD80。在一些实施方式中，CD28配体是ICOSL。在一些实施方式中，CD86是CD86-Fc。在一些实施方式中，CD80是CD80-Fc。
在一些实施方式中，第一部分结合CD28的茎区。在一些实施方式中，第一部分结合mCD28的膜近侧区。在一些实施方式中，茎区包括序列GKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:50)。在一些实施方式中，茎区包括序列KGKHLCPSPLFPGPS(SEQ ID NO:51)。在一些实施方式中，茎区包括序列HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:52)或由其组成。在一些实施方式中，CD28胞外结构域的片段是茎区。在一些实施方式中，结合CD28的第一部分阻止CD28的切割。在一些实施方式中，结合CD28的第一部分阻止CD28从细胞脱落。
在一些实施方式中，第一部分在茎区中的切割位点处结合。在一些实施方式中，第一部分在mCD28内切割位点处结合。在一些实施方式中，第一部分在至少一个蛋白酶的切割位点处结合。在一些实施方式中，第一部分在MMP-2的切割位点处结合。
在一些实施方式中，第一部分不结合mCD28的配体结合结构域。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不隐蔽或阻断接近配体结合结构域。在一些实施方式中，第一部分结合切割位点。在一些实施方式中，第一部分隐蔽、阻塞或阻断接近切割位点。在一些实施方式中，第一部分结合、阻断、阻塞或隐蔽蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，第一部分不结合蛋白酶切割位点但阻塞该位点。在一些实施方式中，第一部分阻断接近蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或其组合的试剂产生阻断蛋白酶切割位点的空间位阻。在一些实施方式中，第一部分不结合蛋白酶切割位点，但试剂的结合产生阻断蛋白酶切割位点的mCD28的构象变化。在一些实施方式中，第一部分的结合产生阻断蛋白酶切割位点的mCD28的构象变化。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-13。在一些实施方式中，切割位点是切割基序。在一些实施方式中，MMP-2切割基序是PXX/X，其中最后的X是疏水残基。在一些实施方式中，CD28中的PXX/X基序是PSP/L。在一些实施方式中，蛋白酶切割位点是SEQ ID NO:20的氨基酸142-145(PSPL)。在一些实施方式中，蛋白酶切割位点是SEQ ID NO:21的氨基酸124-127(PSPL)。在一些实施方式中，蛋白酶切割位点是SEQ ID NO:52的氨基酸9-12(PSPL)。在一些实施方式中，第一部分阻断蛋白酶接近切割位点。在一些实施方式中，第一部分结合mCD28的茎结构域中的PSPL。
在一些实施方式中，切割位点在亮氨酸之前。在一些实施方式中，切割位点在缬氨酸之前。在一些实施方式中，切割位点在芳香氨基酸之前。在一些实施方式中，切割位点在亮氨酸、缬氨酸和/或芳香氨基酸之前。在一些实施方式中，芳香氨基酸选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸。在一些实施方式中，切割位点在SEQ ID NO:20的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145和苯丙氨酸146中的任一种之前。在一些实施方式中，切割位点在SEQ ID NO:20的组氨酸134、缬氨酸135、组氨酸139、亮氨酸140、亮氨酸145或苯丙氨酸146之前。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，切割位点在SEQ ID NO:20的亮氨酸145之前。在一些实施方式中，切割位点在SEQ ID NO:1的亮氨酸145之前。在一些实施方式中，切割位点在SEQ ID NO:21的亮氨酸127之前。
在一些实施方式中，第一部分不结合具有突变的切割位点的CD28的茎区。在一些实施方式中，具有突变的切割位点的CD28的茎区不是蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的切割位点的CD28的茎区不是金属蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的切割位点的CD28的茎区不是基质金属蛋白酶的底物。在一些实施方式中，具有突变的切割位点的CD28的茎区不是基质金属蛋白酶2(MMP-2)的底物。在一些实施方式中，具有突变的切割位点的CD28的茎区不是基质金属蛋白酶13(MMP-13)的底物。在一些实施方式中，突变的切割位点是SEQ ID NO:20的亮氨酸145的突变。在一些实施方式中，突变的切割位点是SEQ ID NO:20的亮氨酸145的氨基酸取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO:20的亮氨酸145的氨基酸取代是赖氨酸。
在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不调节CD28功能和/或信号传导。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不降解mCD28。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不导致或促进mCD28降解。在一些实施方式中，信号传导是mCD28-介导的免疫细胞活化。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不抑制免疫细胞活化。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合不诱导CD28受体内化或循环。通过mCD28的共刺激对T细胞的免疫活化是关键的。蛋白水解切割从保留在膜中的蛋白的跨膜和胞质部分去除CD28的胞外区中的配体结合结构域。因此，切割的CD28不能传导信号并且不能贡献于T细胞活化。因此，阻断切割并且也是拮抗剂的试剂不允许mCD28活化。类似地，阻断切割但也是激动剂的试剂可诱导异常T细胞活化，并潜在地自身免疫反应。
在一些实施方式中，试剂不减少免疫细胞上的mCD28的表面水平。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，试剂减少mCD28的表面水平小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、7％、5％、3％、2％或1％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不杀伤细胞。在一些实施方式中，试剂与细胞的结合不导致细胞的死亡。在一些实施方式中，试剂不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方式中，试剂不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，试剂不诱导ADCC和/或CDC。在一些实施方式中，试剂是抗体并且包括IgG2或IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG2结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG4结构域。在一些实施方式中，抗体包括IgG1或IgG3，其被突变以减少通过抗体的结合介导的细胞死亡。在一些实施方式中，突变使Fc受体结合结构域突变。在一些实施方式中，抗体的Fc结构域被工程化或突变以减少CDC、ADCC或两者。Fc工程化在本领域内是众所周知的，并且可以使用已知减少抗体介导的细胞杀伤的任何突变或氨基酸改变。
在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合缺少Fc结构域。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是缺少Fc结构域的抗原结合结构域。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是单结构域抗体。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是骆驼科动物抗体、鲨鱼抗体或纳米抗体。
在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是非抗体蛋白。在一些实施方式中，第一部分、第二部分或两者是小分子。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合是核酸分子。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合是合成肽。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合是合成结合蛋白。在一些实施方式中，合成肽基于非抗体支架。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合是抗体模拟物。在一些实施方式中，抗体模拟物的摩尔质量小于100、90、80、70、60、50、40、30或20kDa。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，试剂、第一部分、第二部分或其组合是核酸适配体。在一些实施方式中，适配体是DNA。在一些实施方式中，适配体是RNA。在一些实施方式中，适配体是DNA或RNA。抗体模拟物的实例包括但不限于affilins、affimers、affitins、α抗体、anticalins、avimers、DARPins、fynomers、Kunitz结构域肽、单抗体、和nanoCLAMPS。在一些实施方式中，抗体模拟物是DARPin。
在一些实施方式中，第一部分抑制通过至少一个蛋白酶的蛋白水解切割。在一些实施方式中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是基质金属蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是谷氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶是天冬酰胺肽裂解酶。在一些实施方式中，蛋白酶是脱落酶(sheddase)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是外肽酶或内肽酶。在一些实施方式中，金属蛋白酶是锌催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是钴催化的。在一些实施方式中，金属蛋白酶是基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10、MMP-2和/或ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是ADAM10、MMP-2、MMP-13和/或ADAM17。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。在一些实施方式中，金属蛋白酶是MMP-2、MMP-13、ADAM10、ADAM17或其组合。
在一些实施方式中，试剂包含多肽。在一些实施方式中，多肽与不是多肽的屏蔽分子融合。如本文所用，术语“屏蔽分子”是指保护第一部分免受降解、清除或移除的部分。在一些实施方式中，屏蔽分子是聚合物。在一些实施方式中，聚合物是共聚物。在一些实施方式中，聚合物是可生物降解聚合物。在一些实施方式中，聚合物是多糖聚合物。在一些实施方式中，聚合物是蛋白质聚合物。在一些实施方式中，蛋白质聚合物是非结构化蛋白质聚合物。聚合物的实例包含但不限于，天然多糖、半合成多糖、O-连接寡糖、N-连接寡糖、葡聚糖、琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、卡拉胶、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸、透明质酸、同氨基酸聚合物、类弹性蛋白聚合物、XTEN、PAS、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚-D,L-乳酸(PDLLA)。在一些实施方式中，聚合物是生物相容性聚合物。在一些实施方式中，屏蔽分子包含聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方式中，聚合物是PEG。在一些实施方式中，聚合物选自PEG、PLGA、PGA、PLA和PDLLA。在一些实施方式中，屏蔽分子包含PLGA分子。在一些实施方式中，屏蔽分子包含PGA分子。在一些实施方式中，屏蔽分子包含PLA分子。在一些实施方式中，屏蔽分子包含PDLLA分子。在一些实施方式中，屏蔽分子包含选自葡聚糖、琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、卡拉胶、HES、聚唾液酸和透明质酸的寡糖聚合物。在一些实施方式中，屏蔽分子包含选自XTEN和PAS的蛋白质聚合物。在一些实施方式中，屏蔽分子包含多个PEG分子。在一些实施方式中，试剂包含与PEG分子或多个PEG分子融合的多肽。在一些实施方式中，试剂包含多肽，但不包含PEG分子。在一些实施方式中，试剂包含与聚合物分子或多个聚合物分子融合的多肽。
在一些实施方式中，第二部分包含PEG分子。在一些实施方式中，第二部分包含多个PEG分子。在一些实施方式中，第二部分是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方式中，第二部分是聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方式中，第二部分包含PEG或PEG分子。在一些实施方式中，PEG是线性PEG。在一些实施方式中，PEG是链式PEG。在一些实施方式中，PEG是PEG的链。在一些实施方式中，PEG是分支的PEG。在一些实施方式中，PEG包含PEG甲醚。在一些实施方式中，PEG是PEG二甲醚。
在一些实施方式中，PEG是低分子量PEG。在一些实施方式中，PEG是高分子量PEG。在一些实施方式中，PEG包含至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000或20000克/mol的分子量。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，PEG的包含最多500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000或50000克/mol的分子量。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，PEG包含约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000，20000、25000、30000、35000、40000、45000或50000克/mol的分子量。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，PEG包含至少2KDa的摩尔质量。在一些实施方式中，PEG包括至少2KDa的大小。在一些实施方式中，PEG包含2到40KDa之间的摩尔质量。在一些实施方式中，PEG包括在2到40KDa之间的大小。在一些实施方式中，小于2KDa的PEG不产生半衰期延长。
在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在羧酸残基处附接到多肽。在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在半胱氨酸残基处附接到多肽。在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在天冬氨酸残基处附接到多肽。在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在谷氨酸残基处附接到多肽。在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在赖氨酸残基处附接到多肽。在一些实施方式中，一个或多个PEG分子在天冬氨酸残基、谷氨酸残基、赖氨酸残基或半胱氨酸残基处附接到多肽，每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，PEG经由硫醇键与半胱氨酸缀合。在一些实施方式中，PEG与第一部分的C末端缀合。在一些实施方式中，PEG与接头的C末端缀合。在一些实施方式中，PEG与在第一部分的C末端近侧的氨基酸残基缀合。在一些实施方式中，PEG与在接头的C末端近侧的氨基酸残基缀合。在一些实施方式中，近侧在10个氨基酸内。本领域技术人员将理解，接近C末端的缀合将使PEG部分远离CDR，从而降低干扰结合的机会。
如本文所用，“聚乙二醇化”是PEG与分子和宏观结构的共价和非共价附接或合并(amalgamation)的过程。聚乙二醇化的方法在本领域中是众所周知的并且在例如美国专利号7,610,156中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方式中，PEG直接缀合至第一部分。在一些实施方式中，PEG直接缀合至接头。在一些实施方式中，缀合是不可逆的缀合。在一些实施方式中，PEG与化学基团缀合并且化学基团与第一部分结合。在一些实施方式中，PEG与化学基团缀合并且化学基团与接头结合。在一些实施方式中，化学基团和第一部分或接头之间的键是可逆的。例如，被SPDP基团(2-吡啶基-二硫基，也称为OPSS-邻-吡啶二硫化物)取代的PEG可以经由所述基团与半胱氨酸残基反应以形成可逆二硫键。在一些实施方式中，PEG被不可逆缀合。在一些实施方式中，PEG被可逆缀合。
在一些实施方式中，试剂包含接头。在一些实施方式中，至少两个部分由至少一个接头分开。在一些实施方式中，至少两个部分由接头分开。在一些实施方式中，两个部分由接头分开。在一些实施方式中，两个部分通过接头连接。在一些实施方式中，试剂包含至少两个部分之间的接头。在一些实施方式中，试剂包含第一部分和第二部分之间的接头。
在一些实施方式中，接头是肽接头。在一些实施方式中，接头是挠性接头。在一些实施方式中，挠性接头包含至少一个GGGGS(SEQ ID NO:18)序列或由其组成。在一些实施方式中，挠性接头包含至少一个GGGS序列或由其组成。在一些实施方式中，挠性接头包含至少一个GGGGS重复或由其组成。在一些实施方式中，挠性接头包含1、3或7个GGGGS重复或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，挠性接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个GGGGS重复或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，挠性接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个GGGS重复或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，挠性接头包含1个GGGGS重复或由其组成。在一些实施方式中，挠性接头包含3个GGGGS重复或由其组成。在一些实施方式中，挠性接头包含7个GGGGS重复或由其组成。
在一些实施方式中，接头的长度足以允许第一部分与mCD28结合。在一些实施方式中，接头的长度足以允许第一部分与其靶表位结合。在一些实施方式中，接头的长度足以允许第一部分与细胞上的mCD28的茎区结合。技术人员将理解，保护部分与能够结合细胞表面上的mCD28的茎区的小部分的连接需要具有足够的长度，使得保护部分不生成会干扰第一部分的结合能力的空间位阻。因此，接头必须有足够的长度以允许第一部分的运动范围，从而允许它接近茎结构域。在一些实施方式中，试剂不诱导mCD28交联。在一些实施方式中，试剂不诱导mCD28交联，所述mCD28交联诱导免疫活化。
在一些实施方式中，接头包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，接头包含至少1个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至少2个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头是二肽。在一些实施方式中，二肽是GC。在一些实施方式中，接头包含半胱氨酸。在一些实施方式中，半胱氨酸是C末端半胱氨酸。在一些实施方式中，半胱氨酸在C末端近侧。在一些实施方式中，近侧在C末端的50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、3、2或1个氨基酸内。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，侧近在C末端的10个氨基酸内。在一些实施方式中，C末端是第一部分的C末端。在一些实施方式中，C末端是接头的C末端。在一些实施方式中，接头包含至少5个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至少10个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至少15个氨基酸或其组成。在一些实施方式中，接头包含至少35个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，接头包含至多5个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多15个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多20个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多30个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多35个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多40个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含至多50个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含5-100、5-75、5-50、5-35、5-15、10-100、10-75、10-50、10-35、10-30、10-20、15-100、15-75、15-50、15-35、15-30、15-20、20-100、20-75、20-50、20-35、20-30、25-100、25-75、25-50、25-35、20-30、35-100、35-75或35-50个之间的氨基酸或由其组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，接头包含5-35个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含15-35个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含5-50个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含15-50个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含35和50个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含10和20个之间氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含10和30个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含15和20个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含15和30个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含10和40个之间的氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，接头包含20和40个之间的氨基酸或由其组成。
在一些实施方式中，第一部分的C末端连接至接头。在一些实施方式中，第一部分的N末端连接至接头。在一些实施方式中，第二部分的C末端连接至接头。在一些实施方式中，第二部分的N末端连接至接头。在一些实施方式中，第一部分的C末端连接至接头，和第二部分的N末端连接至接头。在一些实施方式中，第一部分的N末端连接至接头和第二部分的C末端连接至接头。在一些实施方式中，第一部分的C末端连接至肽接头的N末端。在一些实施方式中，第一部分的N末端连接至肽接头的C末端。在一些实施方式中，第二部分的C末端连接至肽接头的N末端。在一些实施方式中，第二部分的N末端连接至肽接头的C末端。在一些实施方式中，第一部分的C末端连接至肽接头的N末端和肽接头的C末端连接至第二部分的N末端。在一些实施方式中，第一部分的N末端连接至肽接头的C末端和肽接头的N末端连接至第二接头的C末端。
如本文所用，术语“连接的”是指本领域已知的任何附接方法，通过该方法两个部分稳定连接。在一些实施方式中，连接的是共价键。在一些实施方式中，连接的是肽键。在一些实施方式中，连接的是可逆的键。在一些实施方式中，连接的是不可逆的键。在一些实施方式中，连接的是氨基键。在一些实施方式中，连接的是硫醇键。在一些实施方式中，连接的是丝氨酸键。在一些实施方式中，键是与氨基酸侧链的键。
在一些实施方式中，接头包含半胱氨酸。在一些实施方式中，接头包含至少一个半胱氨酸。在一些实施方式中，第一部分连接至接头的N末端并且半胱氨酸位于接头的C末端处。在一些实施方式中，第一部分连接至接头的C末端并且半胱氨酸位于接头的N末端处。在一些实施方式中，包含半胱氨酸的接头包含组氨酸标签。在一些实施方式中，组氨酸标签包含多个组氨酸。在一些实施方式中，组氨酸标签包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个组氨酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，组氨酸标签包含6个组氨酸。
在一些实施方式中，PEG分子附接至半胱氨酸。在一些实施方式中，第二部分附接至半胱氨酸。在一些实施方式中，第二部分经由硫醇键附接至半胱氨酸。在一些实施方式中，第二部分包含硫醇反应性基团或多个硫醇反应性基团。在一些实施方式中，第二部分包含至少一个硫醇反应性基团。硫醇反应性基团的实例包括但不限于OPSS、马来酰亚胺、乙烯基砜和碘乙酰胺官能团。在一些实施方式中，PEG分子或多个PEG分子经由硫醇键附接至半胱氨酸。在一些实施方式中，PEG分子或多个PEG分子包含硫醇反应性基团或多个硫醇反应性基团。在一些实施方式中，PEG分子或多个PEG分子包含一个硫醇反应性基团。在一些实施方式中，硫醇反应性基团选自OPSS、马来酰亚胺、乙烯基砜和碘乙酰胺官能团。
在一些实施方式中，结合mCD28的第一部分小于100k Da。在一些实施方式中，结合mCD28的第一部分小于50kDa。在一些实施方式中，结合mCD28的第一部分小于25kDa。在一些实施方式中，结合mCD28的第一部分小于20kDa。在一些实施方式中，结合mCD28的第一部分小于15kDa。
在一些实施方式中，试剂包含第二部分。在一些实施方式中，第二部分通过接头连接至第一部分。在一些实施方式中，第二部分包括屏蔽分子。在一些实施方式中，第二部分是屏蔽部分。在一些实施方式中，第二部分是保护部分。在一些实施方式中，第二部分保护第一部分。在一些实施方式中，第二部分屏蔽第一部分。在一些实施方式中，第二部分增加第一部分的稳定性。在一些实施方式中，增加稳定性是增加生理流体中的稳定性。在一些实施方式中，生理流体是生物流体。在一些实施方式中，体液选自：血液、血清、胃液、肠液、唾液、胆汁、肿瘤液、母乳、尿液、间质液和粪便。在一些实施方式中，生物流体是血液。在一些实施方式中，血液是全血或血清。在一些实施方式中，血液是血清。在一些实施方式中，增加血液稳定性包括减少从血液中清除。在一些实施方式中，减少从血液中清除是减少第一部分从血液中清除。在一些实施方式中，减少从血液中清除是减少试剂从血液中清除。在一些实施方式中，减少从血液中清除包括减少肾过滤、减少溶酶体降解或两者。在一些实施方式中，减少从血液中清除包括减少肾过滤。在一些实施方式中，减少从血液中清除包括减少溶酶体降解。在一些实施方式中，增加稳定性包括增加第一部分的半衰期。在一些实施方式中，增加稳定性包括降低降解。在一些实施方式中，降解包括蛋白酶降解。在一些实施方式中，降解包括减少溶酶体降解。在一些实施方式中，减少清除包括减少被肾系统或肾小球过滤的第一部分的比例。在一些实施方式中，第二部分增加第一部分的稳定性，减少第一部分的清除，减少第一部分的降解或其任何组合。测量受试者中蛋白质的稳定性在本领域中良好表征，并且可以执行任何方法。在一些实施方式中，在不同的时间点进行流体中分子浓度的测量，以便计算稳定性。
技术人员将理解，当第二部分的功能被称为增加、降低、增强、减少或任何比较措施时，该比较仅与第一部分相比较。还设想了与接头连接的第一部分进行比较。在一些实施方式中，增加是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000％的增加。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97、99或100％的减少。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，第二部分包含血清或血液分子或由其组成。在一些实施方式中，血清或血液分子是人类分子。在一些实施方式中，分子是蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质可被细胞上的受体结合。在一些实施方式中，通过受体结合能够摄取到细胞中。在一些实施方式中，摄取能释放回血液。在一些实施方式中，蛋白质是血清白蛋白。在一些实施方式中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方式中，第二部分包含HSA多肽或由其组成。在一些实施方式中，HSA包含氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:65)。在一些实施方式中，HSA由SEQ ID NO:65组成。
在一些实施方式中，第二部分包含结合血清蛋白的分子或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合血清蛋白的多肽或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合血清蛋白的脂质或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合血清白蛋白的多肽或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合HSA的多肽或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合血清白蛋白的脂质或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含结合HSA的脂质或由其组成。在一些实施方式中，脂质是脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方式中，第二部分包含HSA结合多肽或由其组成。在一些实施方式中，第二部分包含HSA结合脂质或由其组成。在一些实施方式中，HSA结合多肽选自抗体、抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合HSA的肽。在一些实施方式中，HSA结合多肽是Fab片段。在一些实施方式中，HSA结合多肽是单链抗体。在一些实施方式中，HSA结合多肽是单结构域抗体。在一些实施方式中，HSA结合多肽是特异性结合HSA的肽。
在一些实施方式中，HSA结合多肽包含单结构域抗体。在一些实施方式中，HSA结合多肽是单结构域抗体。在一些实施方式中，第二部分包含单结构域抗体，其包含以下序列或由其组成：EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA(SEQ ID NO:19)。在一些实施方式中，结合HSA的单结构域抗体是Alb8。
在另一方面，提供了编码本发明试剂的核酸分子。
在一些实施方式中，核酸分子是DNA分子。在一些实施方式中，核酸分子是RNA分子。在一些实施方式中，将核酸分子引入细胞中。在一些实施方式中，将核酸分子引入细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中。在一些实施方式中，将核酸分子引入人细胞。在一些实施方式中，核酸分子在表达载体上提供。在一些实施方式中，表达载体包含编码本发明试剂的核酸分子。在一些实施方式中，表达载体是哺乳动物表达载体。
术语“核酸”在本领域中是众所周知的。如本文所用，“核酸”通常是指包括核碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即，链)。核碱基包括，例如，在DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸分子”包括但不限于单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、小RNA(如miRNA、siRNA和其他短干扰核酸)、snoRNAs、snRNAs、tRNA、piRNA、tnRNA、小rRNA、hnRNA、循环核酸、基因组DNA或RNA的片段、降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源的核酸、扩增产物、修饰的核酸、质粒或细胞器核酸和人工核酸如寡核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子编码试剂的第一部分。在一些实施方式中，核酸分子编码试剂的第二部分。在一些实施方式中，核酸分子编码试剂的第一部分和第二部分两者。在一些实施方式中，核酸分子仅编码试剂的第一部分。在一些实施方式中，第一部分和第二部分的编码序列位于相同的核酸分子上。在一些实施方式中，第一部分和第二部分的编码序列位于不同的核酸分子上。在一些实施方式中，第二部分不由核酸编码。在一些实施方式中，核酸分子包含编码本发明试剂或其部分的核酸序列或多个核酸序列。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含本发明试剂的一个或多个编码序列。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含第一部分的编码序列。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含第二部分的编码序列。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含第一部分和第二部分的编码序列。在一些实施方式中，核酸分子包含第一部分和第二部分的编码序列，并且第一部分和第二部分的编码序列在框内，从而编码融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子包含由接头的编码序列分开的第一部分和第二部分的编码序列，并且第一部分、接头和第二部分的编码序列在框内，从而编码融合蛋白。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含框内的第一部分和第二部分的编码序列。在一些实施方式中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含由接头的编码序列分开的第一部分和第二部分的编码序列，并且第一部分、接头和第二部分的编码序列在框内。
在一些实施方式中，编码试剂或其部分的核酸序列可操作地连接至启动子。术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式(例如在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)与调节元件或多个调节元件连接。
使用方法
通过另一方面，提供了治疗和/或预防有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
通过另一方面，提供了改善有需要的受试者中免疫疗法的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
通过另一方面，提供了减少有需要的受试者中sCD28的方法，所述方法包括施用本发明的试剂。
在一些实施方式中，免疫疗法是基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，基于PD-1/PD-L1的免疫疗法包括施用抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在一些实施方式中，疗法包括PD-1限制点的阻断。在一些实施方式中，免疫疗法包括向受试者施用异源、同基因或自体免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，需要免疫疗法的受试者患有癌症。在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，癌症是sCD28阳性癌症。在一些实施方式中，癌症是sCD28高癌症。在一些实施方式中，受试者处于发展癌症的风险下。
如本文所使用，术语“治疗”(treatment、treating)疾病、紊乱或病症包括其至少一种症状的缓解、其严重性的降低或其进展的抑制。治疗不一定意味着疾病、紊乱或病症完全治愈。作为有效的治疗，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、紊乱或病症的严重性，降低与其相关的症状的严重性，或改善患者或受试者的生活质量即可。
在一些实施方式中，降低包括向受试者施用至少一种本发明的试剂。如本文所用，术语“施用(administering、administration)”和类似术语是指在合理的医学实践中以提供治疗效果的方式向受试者递送含有活性剂的组合物的任何方法。本主题的一方面提供向有需要的患者口服施用治疗有效量的本发明的试剂。其他合适的施用途径可以包括肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内。
通过另一方面，提供了包括本发明的试剂和药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，施用是施用本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“载体”、“赋形剂”或“佐剂”是指不是活性剂的药物组合物的任何组分。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无毒、惰性固体、半固体液体填充剂、稀释剂、包封材料、任何类型的制剂助剂，或仅仅是无菌水性介质，例如盐水。可作为药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；乙二醇类，例如丙二醇；例如多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇等；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；无热原水；等渗盐水，林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。本文中可用作载体的物质的一些非限制性实例包括糖、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、多元醇、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲溶液以及用于其他药物制剂的其他无毒药学相容物质。还可能存在润湿剂和润滑剂例如十二烷基硫酸钠、以及赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。可以使用任何无毒、惰性和有效的载体来配制本文所考虑的组合物。
载体可总共占本文呈现的药物组合物重量的约0.1％至约99.99999％。
在一些实施方式中，本发明的方法不降解或导致mCD28的降解。在一些实施方式中，本发明的方法不减少免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法不减少mCD28-介导的免疫细胞活化。在一些实施方式中，本发明的方法维持受试者中免疫细胞上的mCD28水平。在一些实施方式中，本发明的方法增加受试者中免疫细胞上的mCD28水平。
在一些实施方式中，减少是sCD28的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％减少。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是在血清sCD28方面。在一些实施方式中，减少是在sCD28的血液水平方面。在一些实施方式中，减少是在肿瘤微环境(TME)中的sCD28水平方面。
在一些实施方式中，受试者血液包括升高的sCD28水平。在一些实施方式中，受试者血液降低之前包括升高的sCD28水平。在一些实施方式中，水平升高至健康受试者的水平以上。在一些实施方式中，受试者的sCD28水平升高至健康受试者水平之上至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至血液的5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng/mL之上。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，水平升高至5ng/mL之上。在一些实施方式中，水平升高至10ng/mL之上。在一些实施方式中，水平升高至20ng/mL之上。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28/mL血液。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45或50ng sCD28/mL血液。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少5ng/mL sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少10ng/mL sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液包括至少20ng/mL sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少5ng/mL sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少10ng/mL sCD28。在一些实施方式中，受试者的血液降低之前包括至少20ng/mL sCD28。
在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，癌症是可以用PD-1/PD-L1疗法治疗的癌症。在一些实施方式中，受试者已经经历PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，受试者是对PD-1/PD-L1疗法无反应者。在一些实施方式中，受试者未进行PD-1/PD-L1疗法。在一些实施方式中，本发明的方法与PD-1/PD-L1疗法一起进行。在一些实施方式中，本发明的方法在PD-1/PD-L1疗法之前进行。
在一些实施方式中，方法进一步包括向受试者施用另一免疫疗法。在一些实施方式中，方法进一步包括施用基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。在一些实施方式中，另一免疫疗法是限制点抑制剂。在一些实施方式中，限制点抑制剂是PD-1和/或PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，限制点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，另一免疫疗法是基于嵌合抗原受体(CAR)的免疫疗法。在一些实施方式中，CAR是CAR-T。在一些实施方式中，CAR是CAR-NK。在一些实施方式中，另一免疫疗法是癌症疫苗。
如本文所使用，术语“CAR-T细胞”和“CAR-NK细胞”是指对至少一种目标蛋白具有特异性(例如，在用外遗传修饰剂治疗后具有增加表达的免疫原蛋白)并且被移植到免疫效应细胞上(T细胞或NK细胞)的工程化受体。在一些实施方式中，CAR-T细胞具有移植到T细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，CAR-NK细胞具有移植到NK-细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞和调节T细胞。
CAR-T和CAR-NK细胞以及其载体在本领域是众所周知的。这类细胞靶向受体结合的蛋白并对其是细胞毒性的。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向至少一种病毒蛋白。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向多种病毒蛋白。在一些实施方式中，CAR-T或CAR-NK细胞靶向由于与外遗传修饰剂接触而具有增加表达的病毒蛋白。
CAR-T细胞的构建是本领域众所周知的。在一个非限制性实例中，可以制造病毒蛋白的单克隆抗体，然后将构建编码抗体的载体。载体将也包括共刺激信号区。在一些实施方式中，共刺激信号区包括已知T细胞或NK细胞刺激分子的胞内结构域。在一些实施方式中，胞内结构域选自以下中的至少一种：CD3Z、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD 7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方式中，载体还包括CD3Z信号传导结构域。然后例如通过慢病毒感染将该载体转染至T细胞中。
在一些实施方式中，癌症是具有升高的sCD28水平的癌症。在一些实施方式中，癌症包括高sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高sCD28水平是处于和/或高于5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100ng/mL的水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症包括高sCD28水平。在一些实施方式中，升高的和/或高sCD28水平是处于和/或高于健康受试者中水平的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％的水平。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，癌症不是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和结肠直肠癌。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌或结肠直肠癌。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
试剂盒
通过另一方面，提供了包括本发明的至少一种试剂或本发明的药物组合物的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂。在一些实施方式中，试剂盒包括说明本发明的试剂与基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂一起使用的标签。在一些实施方式中，试剂盒包括说明基于PD-1和/或PD-L1的治疗剂与本发明的抗体或药物组合物一起使用的标签。
通过另一方面，提供了包括基于PD-1和/或PD-L1的免疫治疗剂的试剂盒，其包括说明基于PD-1和/或PD-L1的治疗剂与本发明的抗体或药物组合物一起使用的标签。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于治疗癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于确定有需要的受试者中sCD28的血清水平。在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，本发明的试剂盒用于确定将用本发明的试剂或药物组合物治疗的受试者的适合性。在一些实施方式中，试剂盒用于确定将用基于抗-PD-1/PD-L1的免疫疗法治疗的受试者的适合性。
试剂生成的方法
通过另一方面，提供了生成本发明的试剂的方法，该方法包括以下至少一种：
a.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28；
b.通过接头将第一部分连接至增强蛋白质稳定性的第二部以产生连接的试剂并测定连接的试剂与细胞表面上的mCD28的结合；和
c.选择结合细胞表面上的mCD28的连接的试剂；
从而生成本发明的试剂。
通过另一方面，提供了生成本发明的试剂的方法，其包括
培养包含一种或多种载体的宿主细胞，该载体包含编码试剂的核酸序列，其中该核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
i.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28；
ii.通过接头将第一部分连接至增强蛋白质稳定性的第二部分以产生连接的试剂并测定连接的试剂与细胞表面上的mCD28的结合；和
iii.选择结合细胞表面上的mCD28的连接的试剂；
从而生成本发明的试剂。
在一些实施方式中，连接包含将第一部分连接至接头。在一些实施方式中，连接包含将第二部分连接至接头。在一些实施方式中，第二部分连接至附接第一部分的接头。在一些实施方式中，第一部分连接至附接第二部分的接头。在一些实施方式中，连接包含键的化学过程。肽键以及化学键的方法是本领域众所周知的并且可以使用任何这样的方法。
在一些实施方式中，方法进一步包括测试阻断细胞表面上的mCD28的蛋白酶切割的能力。在一些实施方式中，试剂是抗-切割剂。在一些实施方式中，试剂是抗-脱落剂。在一些实施方式中，试剂减少受试者中sCD28的脱落。在一些实施方式中，试剂减少mCD28的切割。在一些实施方式中，试剂减少受试者中mCD28的切割。
在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM10。在一些实施方式中，蛋白酶是ADAM17。在一些实施方式中，蛋白酶是MMP-2、ADAM10、ADAM17或其组合。
如本文所使用，术语“CD28的胞外结构域”是指跨膜结构域之前到达的CD28的N末端部分。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是sCD28。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28a。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域是CD28茎结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包括CD28的茎结构域。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域包括以下序列或由其组成：NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQID NO:53)。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是单体的。在一些实施方式中，CD28的胞外结构域或其片段是二聚体的或单体的。
如本文所使用，“片段”是指构成较大蛋白或蛋白结构域的一部分的部分多肽。在一些实施方式中，片段包括至少10、20、30、40或50个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，片段包括至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，获得结合CD28的胞外结构域的片段的试剂是获得特异性结合CD28茎结构域的试剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括在获得的试剂存在的情况下测定mCD28下游信号传导，并选择既不实质激动也不实质拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。在一些实施方式中，选择是选择不拮抗mCD28信号传导的至少一种试剂。本领域技术人员将理解，对于癌症治疗，激动CD28信号传导可能没有害处，但拮抗该信号传导会适得其反。
在一些实施方式中，测试试剂阻断切割的能力包括测量在试剂存在或不存在的情况下活化的免疫细胞的血清中的sCD28。在一些实施方式中，测试试剂阻断切割的能力包括混合试剂、蛋白酶和包括切割位点的CD28的胞外结构域或其片段。在一些实施方式中，测试进一步包括为CD28的胞外结构域或其片段测序，以检查截短和/或切割。在一些实施方式中，测试进一步包括在足够灵敏的凝胶上运行CD28的胞外结构域或其片段，以测量由于切割引起的尺寸变化。在一些实施方式中，测试进一步包括测量在试剂和蛋白酶存在的情况下从表达mCD28的细胞的sCD28产生。
在一些实施方式中，方法进一步包括测定连接的试剂在血液中的稳定性。在一些实施方式中，方法进一步包括选择在血液中具有增加的稳定性的连接的试剂。在一些实施方式中，测定增加的稳定性是与单独的第一部分的稳定性相比。在一些实施方式中，测定增加的稳定性是与连接至接头的第一部分的稳定性相比。测定蛋白质稳定性的方法是本领域众所周知的并且包括本文所述的方法。在一些实施方式中，测定包括在血液或血清中温育试剂并在不同时间点测量试剂浓度。在一些实施方式中，测定包括将试剂施用于模型动物并在不同时间点测量动物血液中的试剂浓度。在一些实施方式中，模型动物是啮齿动物。在一些实施方式中，啮齿动物是小鼠。可以使用本领域已知的测定稳定性、半衰期和/或血液保留的任何方法。
在一些实施方式中，获得试剂包括用所述CD28胞外结构域或其片段免疫鲨鱼或骆驼科动物，并从所述免疫的生物收集抗体。在一些实施方式中，获得试剂包括筛选结合CD28胞外结构域或其片段的试剂文库和选择结合的试剂。
在一些实施方式中，收集抗体包括从免疫的鲨鱼或骆驼科动物的脾中提取B细胞。在一些实施方式中，B细胞与黑色素细胞融合产生杂交瘤。在一些实施方式中，从杂交瘤的培养基中收集抗体。在一些实施方式中，获得试剂包括用CD28胞外结构域或其片段免疫生物，并从免疫的生物收集抗体。在一些实施方式中，生物是小鼠。在一些实施方式中，生物选自兔、小鼠、大鼠、鲨鱼、骆驼科动物、鸡、山羊和噬菌体。在一些实施方式中，骆驼科动物选自骆驼和美洲驼。在一些实施方式中，收集包括抽血。在一些实施方式中，收集包括：
a.从免疫生物的脾脏中提取B细胞；
b.将提取的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤；和
c.从杂交瘤中收集抗体。
在一些实施方式中，获得试剂包括筛选结合CD28胞外结构域或其片段的试剂文库和选择如此结合的试剂。在一些实施方式中，文库是噬菌体展示文库。在一些实施方式中，文库是源自脾B细胞的免疫文库。在一些实施方式中，文库是IgG文库。在一些实施方式中，文库是Fab文库。在一些实施方式中，文库是VHH抗体文库。在一些实施方式中，文库是单链、单结构域或纳米抗体文库。在一些实施方式中，获得试剂包括为试剂测序。在一些实施方式中，获得试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，选择试剂包括为试剂测序。在一些实施方式中，选择试剂包括产生试剂的重组形式。在一些实施方式中，从试剂的序列产生重组形式。在一些实施方式中，方法进一步包括人源化试剂。
在细胞内表达编码试剂的核酸分子是本领域技术人员众所周知的。它可以通过转染、病毒感染或细胞基因组的直接改变等许多方法进行。在一些实施方式中，基因存在于表达载体中，诸如质粒或病毒载体。包含p16-Ink4a的表达载体的一个此类实例是可从Addgene获得的哺乳动物表达载体pCMV p16 INK4A。
载体核酸序列一般至少包含用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的附加元件，诸如异源多核苷酸序列、表达控制元件(如，启动子、增强子)、可选择标记(如，抗生素抗性)、聚腺嘌呤序列。
载体可以是通过非病毒方法或病毒方法递送的DNA质粒。病毒载体可以是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。启动子可以是在哺乳动物细胞中有活性的。启动子可以是病毒启动子。
通过另一方面，提供了通过本发明的方法生产的试剂。
通过另一方面，提供了一种药物组合物，其包括通过本发明的方法生产的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
如本文所使用，当与值组合时，术语“约”是指参考值的加减10％。例如，约1,000纳米(nm)的长度是指1,000±100nm的长度。
注意，如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“多核苷酸”包括多个这种多核苷酸，并且提及“多肽”包括提及一个或多个多肽及其本领域技术人员已知的等效物，等等。进一步注意，权利要求可以被撰写为排除任何任选要素。因此，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关联的比如“仅(solely)”、“仅仅(only)”等专有术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
在其中使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的那些情况下，一般而言，这种构造旨在在本领域技术人员将理解该约定的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有以下的系统：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，呈现两个或更多个可选术语的基本上任何转折词和/或短语都应理解为考虑包括其中一个术语、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都具体地包括在本发明中，并且在本文中被公开，就好像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方式的所有子组合及其要素也被本发明具体地包括并且在本文中被公开，就好像每个这种子组合在本文中被单独和明确地公开一样。
通过检查以下实施例，本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，这些实施例并非旨在进行限制。此外，如上所述的和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中均找到实验支持。
上文所述的和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"CurrentProtocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入本文。本文件中还提供了其他一般参考资料。
材料和方法
抗体–商业小鼠单克隆抗-CD28克隆#CD28.2(Biolegend，Cat.No.302902)和FITC缀合的(Biolegend，Cat.No.302906)。山羊多克隆抗-CD28(R&D system，Cat.No.AF-342-PB)。FITC缀合的抗-人PD-L1(BD bioscience，Cat.No.558065)。APC缀合的抗-人PD-L2(Biolegend，Cat.No.345508)。PE缀合的抗-人IDO(R&D system，Cat.No.IC6030P)。山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647(Biolegend，Cat.No.405322)。驴抗人IgG(H+L)Alexa Fluor647(Jackson immune research，Cat.No.709-605-149)。山羊抗小鼠IgG HRP(Jacksonimmune research，Cat.No.115-035-071)。抗-人CD3克隆OKT3(Biolegend，Cat.No.317304)。抗-人PD-1帕博利珠单抗(MK-3475)。人IgG(Sigma，Cat.No.I4506)。
靶向人CD28受体的茎区的VHH的分离–外周血B细胞遗传密码，来源于首次用于实验的非免疫美洲鸵，用于构建噬菌体文库，该文库由表达个体VHH的颗粒组成，VHH作为具有C末端His6-Myc标签的融合蛋白。首次用于实验的文库被用于选择具有与人CD28的茎区结合能力的纳米抗体。筛选生物素化的重组CD28-Fc嵌合体或具有“HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:52)”的序列的氧化的二聚肽，其中在C末端处具有生物素添加。每个抗原被结合至链霉亲和素磁珠，其被脱脂奶封闭。在三个连续的选择轮中使用相同的抗原，改变噬菌体输入量和抗原浓度，进行噬菌体的溶液中选择。没有抗原的封闭珠用作对照。结合的噬菌体的洗脱用胰蛋白酶进行20分钟。溶液中选择过程中的富集率计算为从CD28抗原选择条件洗脱的噬菌体数量与从无抗原选择条件洗脱的噬菌体数量之间的比率。279个选定输出的个体噬菌体单克隆，以噬菌体或周质形式，通过ELISA验证抗原结合，并通过流式细胞术表征与膜的CD28的结合。72个克隆显示与周质形式的茎区肽特异性结合，22个被证明具有独特的CDR序列，而只有6个被发现属于独特的CDR3家族。6个VHH作为重组蛋白在CHO细胞中产生，其具有c末端His标签，并评估其抗脱落活性和细胞结合。转染–通过将DNA序列克隆到PCDNA3.1载体中生成CD28wt(编码全长CD28转录物)质粒。使用Jet Pei转染试剂进行转染(PolyPlus转染)。在含有G418的培养基中选择稳定的转染剂。
ELISA–商业ELISA试剂盒用于定量以下的量：干扰素-γ(Biolegend，Cat.No.430103)，人白细胞介素2(Biolegend，Cat.No.431802)，人白细胞介素6(Biolegend，Cat.No.430502)，人白细胞介素10(Biolegend，Cat.No.430603)，人肿瘤生长因子β1(Biolegend，Cat.No.436708)，人白细胞介素β1(Biolegend，Cat.No.437004)和人CD28(R&Dsystem，Cat.No.DY342)。根据制造商的说明进行细胞增殖和生存力(MTT测定)(Roche，Cat.No.11465007001)。根据制造商的说明进行犬尿氨酸(IDO活性)ELISA试剂盒(ImmuSmol，Cat.No.BA E-2200)。
CD28茎区结合测定–生物素缀合的野生型或L145K CD28茎区二聚肽固定在中性抗生物素蛋白涂覆的ELISA maxi-sorb平板上。对VHH克隆进行系列稀释(0.2-5μg/mL)，并使用抗His标签-HRP缀合的抗体检测结合的VHH，并使用TMB进行显影。
细胞因子多倍体(multiplex)-在Magpix系统(Millipore)上使用ProcartaPlex(Invitrogen，Cat.No.PPX-07-MXXGPY2)同时评估多种细胞因子。
流式细胞术–一般地，在所有步骤中将细胞保持在冰上。染色前，用FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中50μg/mL人IgG(Sigma，Cat.No.I4506)封闭5×105个细胞15min。以指定浓度使用抗CD28 VHH构建体。当使用Alb-8构建体时，混合物中补充了重组人血清白蛋白(Sigma，Cat.No.A9731)以使Alb-8饱和。以制造商推荐的浓度使用抗体并在黑暗中温育30min。在96孔U底板中以100μL的体积进行温育。用200μL的FACS缓冲液洗涤细胞两次并转移至FACS管中150μL的FACS缓冲液中，进行分析。使用Kaluza for Gallios流式细胞仪采集软件在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析细胞。
细胞系和人免疫细胞的分离–从ATCC获得Jurkat白血病T-细胞淋巴母细胞系克隆E6.1和SCC-25舌鳞状细胞癌。使用标准淋巴细胞分离培养基(MBP，Cat.No.850494)从健康供体的新鲜血液样本中分离PBMC。通过阴性选择方法使用RossetteSEPTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.15061)从健康供体的新鲜血液样本中分离CD3细胞。通过阴性选择方法使用EasySepTM人CD4 T细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.19059)从健康供体的新鲜血液样本中分离CD4细胞。通过阴性选择方法使用EasySepTM人单核细胞富集试剂盒(STEMCELL，Cat.No.17952)从健康供体的新鲜血液样本中分离单核细胞。所有细胞都在补充有10％HI-FCS和青霉素/链霉素混合物的完全RPMI-1640培养基中生长。
CD86阻断FACS–在室温下，用人CD28稳定转染的0.5×106个HEK293细胞用不具有或具有指定浓度的抗CD28脱落纳米抗体的2μg/mL CD86-Fc(R&D systems，Cat.No.141-B2)温育30min。洗涤细胞并使用与荧光团缀合的抗人重链和轻链抗体以1:5000稀释，在冰上进行二次结合20分钟。当使用Alb-8构建体时，混合物中补充了重组人血清白蛋白(Sigma，Cat.No.A9731)以使Alb-8饱和。
转染–通过将DNA序列克隆到PCDNA3.1载体中生成CD28-FL(编码全长CD28转录物)、CD80-FL(编码全长CD80转录物)和scOKT3-CD14(编码与CD14胞外结构域融合的小鼠抗CD3 OKT3克隆的单链FV部分)质粒。使用Jet Pei转染试剂(PolyPlus Transfections)进行转染。在G418和/或含有潮霉素的培养基中选择稳定的转染子。
树突细胞分化–单核细胞在RPMI培养基中以1×106/mL的密度培养，其中生长因子在第3天和第6天补充。50ng/mL GM-CSF(R&D systems,Cat.No.215-GM)和20ng/mL IL-4(R&D systems,Cat.No.204-IL)诱导未成熟树突细胞(iDC)持续6天。当需要时，通过添加100ng/mL LPS(Sigma,Cat.No.L4391)和20ng/mL干扰素γ(R&D systems,Cat.No.285-IF)48小时，iDC进一步分化为成熟的树突细胞。通过相关标记物的FACS分析和特征细胞因子的分泌分析，对生成的细胞群进行了指定表型测试。
金属蛋白酶–使用来自Anaspec(Cat.No.AS-72005)或R&D system(Cat.No.902-MP)的商业重组人金属蛋白酶MMP-2。从R&D system(Cat.No.511-MM)购买商业重组人金属蛋白酶MMP-13。根据制造商方案在37℃下用1mM氨基苯乙酸汞(APMA)活化Pro-MMP2和Pro-MMP-13持续1-2小时。
合成肽–设计最终形式为“DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:54)-生物素”的底物肽，以包括后跟5个甘氨酸序列的N-末端cMyc标签和C-末端生物素缀合之间的人CD28茎区(His134-Pro152)的氨基酸序列。肽由Genecust Europe定制合成。第141位处的半胱氨酸残基被用于通过二硫键产生二聚肽。类似地合成在切割位点处具有突变的CD28茎区肽，在第145位处的亮氨酸取代为赖氨酸，其具有最终形式“DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPKFPGPSKP(SEQ ID NO:55)-生物素”。
体外切割测定–在MMP抑制剂(TMI-1，50nM)、M9 Fab或指定的VHH克隆以多种浓度(0.4-10μg/mL)存在或不存在的情况下，用0.125μM二聚c-Myc-标记的和生物素化的底物肽温育50ng纯化的重组MMP-2或MMP-13，持续5小时。在50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％Brij-35、pH 7.5中进行测定。5小时后，将切割反应混合物稀释至最终1nM的肽浓度并加载在中性抗生物素蛋白平板上以结合肽。在室温下温育1小时后，洗涤平板，并使用缀合至HRP的抗-cMyc抗体进行未切割肽的检测。
PBMC的SEB或CMV活化用于生成可溶性CD28–在37℃下在48孔平板中在具有/不具有指定浓度的多种蛋白酶抑制剂的情况下用0.5ng/mL SEB(Sigma，Cat.No.S4881)刺激0.3×106PBMC持续5-7天。可选地，在96孔平板格式测定中用0.5ng/mL SEB刺激0.1×106PBMC。对于CMV刺激，在37℃下在96孔平板中在具有/不具有指定浓度的多种蛋白酶抑制剂的情况下用0.5μg/mL CMV肽活化剂(peptivator)(Milteny Biotec，Cat.No.130-093-435)刺激0.5×106PBMC持续2-5天。对于连续脱落实验，在24孔平板中用SEB或CMV刺激PBMC持续24小时，取细胞并在没有刺激剂下用RPMI洗涤三次，并再次平板接种在96孔平板中。在指定时间取样品并放在冷冻条件下直到进行可溶性CD28检查。
T细胞的PHA活化以生成可溶性CD28–2×105个CD3或CD4 T细胞与浓度为5μg/mL的植物血凝素(Sigma,Cat.No.L8902)、200IU IL-2(Proleukine)温育并指定治疗7天。当使用Alb-8构建体时，混合物中补充了重组人血清白蛋白(Sigma,Cat.No.A9731)以使Alb-8饱和。
蛋白酶抑制剂–在每个实验开始时以指定浓度添加蛋白酶抑制剂。在为期一周的细胞测定中，在3天后以最终浓度添加抑制剂的另一部分。使用的蛋白酶抑制剂是GI254023X(Sigma,Cat.No.SML0789)或TMI-1(Sigma,Cat.No.PZ0336)。
评估VHH的抗脱落活性的细胞测定–对于PBMC的SEB活化，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的多种处理下用2ng/mL SEB(Sigma，Cat.No.S4881)刺激0.1×106个PBMC持续5-7天。对于PHA活化的T细胞，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的多种处理下用指定浓度的植物血凝素(Sigma，Cat.No.L8902)和200IU/mL的IL-2(Proleukine)温育0.1×106个CD4 T细胞5-7天。对于HEK自发CD28脱落测定，在37℃下在96孔平板中在进行/不进行指定浓度的多种处理下温育0.1×105个HEK细胞48小时。
混合的淋巴细胞反应–将0.1×106个T细胞与0.2×104个来自不同供体的成熟树突细胞在37℃下在进行/不进行指定浓度的处理下混合24-72小时。在补充有10％的HI-人血清和青霉素/链霉素混合物的完整RPMI-1640培养基中进行测定。
自体单核细胞CD3 MLR–将0.5×106T细胞与来自相同CMV反应性供体的0.5×105个单核细胞混合并在37℃下进行/不进行指定浓度的处理下用0.5μg/mL CMV肽活化剂刺激6天。
抗体测序–抗体被提供给Rapid Novor公司进行氨基酸测序。使用标准方法进行测序，其中简要包括用六种酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Lys C和AspN)进行酶消化后进行的LC-MS分析。用二硫化物还原和烷基化进行消化。使用Thermo-Fisher Q-exactive质谱仪进行LC-MS/MS分析。在每个抗体的重链和轻链中，至少5次肽扫描覆盖了100％的氨基酸残基，具有显著的支持片段离子。使用Chothia方案确定CDR。
重组2A1构建体的生产–将合成的密码子优化的基因亚克隆到相关的pcDNA3.1表达载体中。2A1构建体由瞬时转染的ExpiCHO细胞产生，并通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化。通过SDS-PAGE分析1x PBS pH 7.4中的蛋白质制剂在非还原条件下是否存在正确的链，并通过分析尺寸排阻色谱法(aSEC)对制剂中的单体形式进行量化。
亲本2A1分子的化学修饰–携带C末端半胱氨酸(2A1-1)的2A1构建体与不同的化学部分如线性mPEG 2K-OPSS(Nanocs,Cat PG1-20K)、线性mPEG 40kDa-Mal(Sigma Aldrich,Cat.No.JKA3123)、双-Mal-PEG11(BroadPharm,Cat.No.BP-22151)一起温育。在一些情况下，在反应前加入三(2-羰基乙基)膦盐酸盐(TCEP)(Sigma Aldrich,Cat.No.75259)以解析二聚体含量。在完成不同的修饰反应后，将反应混合物加载到SP阳离子交换柱上以去除过量的试剂，在一些情况下，还去除未反应的材料。使用Viva-spin浓缩器对制剂进行PBS脱盐，并通过质谱进行分析以进行缀合验证。在其他制剂中，用MAL-PEG(2000Da)-MAL(Nanocs,Cat.No.PG2-ML-2K)修饰HSA(Sigma,Cat.No,A9731)并通过阴离子交换柱从未反应的试剂的剩余物中纯化，在与2A1-1C温育后，产生最终产物HSA-P2K-2A1。
直接CD28 EIA–除非另有讨论，Corning高结合平板或等效物用于筛选。每个孔都包被有200ng人CD28-Fc嵌合体(R&D，Cat.No.342-CD)。在室温(RT)下，使用PBS中的1％酪蛋白封闭平板1小时。使用PBST洗涤平板3次，并在用1:5000稀释的与HRP缀合的小鼠抗His(Biolegend，Cat.No.652504)或用1:500稀释的与HRP缀合的兔抗骆驼科动物VHH Cocktail(GenScript，Cat.No.A02016)检测后与研究的抗体一起温育。当使用Alb-8构建体时，混合物中补充了重组人血清白蛋白(Sigma,Cat.No.A9731)以使Alb-8饱和。
用OKT3的T细胞刺激–在37℃下用指定量的抗CD3克隆OKT3刺激0.1×106个分离的CD3 T细胞(来自健康供体)24-48小时。当所述重组人CD80-Fc(2μg/ml，R&D system,Cat.No.141-B1)以可溶形式添加时，以可溶形式以指定浓度添加靶向CD28的抗体或VHH或对照的处理。
用A375/scOKT3人工抗原呈递细胞(aAPC)的T细胞刺激–在37℃下用0.4×104个丝裂霉素处理的aAPC(用scOKT3-CD14嵌合质粒稳定转染的A375细胞)刺激1×105个分离的CD3 T细胞(来自健康供体)24小时。以可溶形式以指定浓度添加靶向CD28的抗体或VHH或对照的处理。在补充有10％HI-人血清和青霉素/链霉素混合物的完整RPMI-1640培养基中进行测定。
用HEK/CD80/scOKT3人工抗原呈递细胞(aAPC-CD80)的T细胞刺激–在37℃下用0.5×104个丝裂霉素处理的aAPC-CD80(用CD80和scOKT3-CD14嵌合质粒稳定转染的HEK293细胞)刺激1×105个分离的CD3 T细胞(来自健康供体)24-48小时。以可溶形式以指定浓度添加靶向CD28的抗体或VHH或对照的处理。在补充有10％HI-人血清和青霉素/链霉素混合物的完整RPMI-1640培养基中进行测定。
药代动力学曲线研究–在一组12只成年雄性小鼠(雄性balb/c)中进行每个测试物品的PK研究。通过静脉注射给予每个测试物品相当于2.5-10mg/Kg的剂量。在以下时间点从3只动物身上采集血样：0.083小时(动物1-3)、1小时(动物4-6)、2小时(动物7-9)、8小时(动物10-12)、24小时(动物1-3)、48小时(动物3-6)、72小时(动物7-9)、96小时(动物10-12)和168小时(所有动物)。测试物品的浓度在K-EDTA采集的血液中进行。通过使用由以下抗体对组成的夹心ELISA对每个测试物品的浓度进行定量：如表1所述的兔抗骆驼科动物VHH(QVQ,Cat.No.QE-19)、与HRP缀合的兔抗骆驼科动物VHH(GenScript,Cat.No.A01861)、与HRP缀合的山羊抗人血清白蛋白(Abcam,Cat.No.ab19183)。
表1：夹心ELISA组分
Figure BDA0003926623600000431
实施例1:基于抗脱落抗体的试剂的表征
人CD28通过基质金属蛋白酶经历蛋白水解过程的发现促使检查其多肽序列的候选区域——显示出对蛋白水解脱落的潜在易感性。人CD28中最吸引人的序列区域是茎段，范围从组氨酸134到脯氨酸152(SEQ ID NO:52(HVKGKHLCPSPLFPGPSKP))，将球状IgV结构域连接至跨膜区。该区域含有总共3个亮氨酸和缬氨酸残基，以及苯丙氨酸残基，并预计没有任何可能阻碍蛋白酶接近的二级结构元件。值得注意的是，茎区还包含半胱氨酸141，它形成促进CD28的同二聚化的间二硫键。为了产生特异性结合CD28茎区并可能阻断不同蛋白酶接近脱落的CD28的抗体或抗体片段，同时避免任何损害CD28寡聚结构和功能，用模拟CD28茎区的二聚肽对CD1小鼠进行免疫。用于免疫的肽序列为SEQ ID NO:56，GKHLCPSPLFPGPSKPK，添加C-末端赖氨酸以便具有游离氨基以允许使用酰肼化学的KLH或BSA缀合。在酰肼终止的CD28肽和S-4FB修饰的BSA之间进行缀合，其产生用于位点特异性缀合的游离醛。通过在非变性凝胶上运行肽来确认二聚化。
发现了通过直接CD28 EIA测量的对重组人CD28具有高结合亲和力的抗体。该抗体被命名为M9并且该抗体的序列在上文中提供。抗体M9的系列稀释用于确认其与重组人sCD28和茎区肽的特异性结合(图1A)。有趣的是，虽然抗体能够检测重组人sCD28，但它无法检测到从免疫细胞中实际脱落的sCD28(图1B)。这强烈表明抗体在切割位点结合，并且它结合的去同位素(deisotope)在切割形式中是不完整的。
接下来研究了抗体结合细胞表面上的mCD28的能力。为了减少sCD28从细胞的脱落，抗体需要实际在蛋白的膜形式上结合而不仅仅是溶液中的重组蛋白。分析过表达人全长CD28的HEK293细胞。小鼠CD28似乎没有被切割成可溶形式(活化的鼠脾细胞似乎不会产生sCD28)，并因此必须研究人蛋白。使用M9抗体和作为阳性对照的CD28.2抗体通过流式细胞术分析细胞。令人惊讶的是，M9似乎没有与表面mCD28结合(图1C)。这可能是由于空间位阻和当它是膜相邻时对茎区的受限接近。
实施例2:单结构域抗体抑制sCD28从细胞表面的脱落
设计了能够结合细胞表面上的mCD28并阻断sCD28的脱落的小试剂。虽然全尺寸抗体的尺寸约为150kDa，但衍生自抗体的Fab片段具有约50kDa的尺寸，而单链抗体(也称为单链可变片段，scFvs)具有约25kDa的尺寸，并且单结构域抗体(也称为VHH抗体和DARPins)仅具有12-20kDa的尺寸。
使用首次用于实验的美洲驼来源的VHH的噬菌体文库分离单结构域抗体。文库由VHH序列组成，其取自首次用于实验的非免疫美洲驼，即，提取B细胞并对VHH CDR的整个可用库进行测序。这些CDR被导入噬菌体中以产生文库。使用ELISA和流式细胞术，针对重组CD28胞外结构域和二聚体茎区肽筛选文库，以发现特异性结合人C28的茎区的抗体。发现特异性结合人CD28的茎区的VHH序列是：EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:33，克隆2A1)；EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:34，克隆4A4)；和QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO:35，克隆4A1)。VHH作为重组蛋白在CHO细胞中产生，然后如下所述评估细胞结合和抗脱落活性。C-末端的His-标签用于纯化并通过三重丙氨酸重复连接。表2中提供了三个研究的克隆的CDR。
表2：测试的克隆的CDR序列
VHH克隆 CDR1(SEQ ID) CDR2(SEQ ID) CDR3(SEQ ID)
2A1 INAMG(1) AISGGGDTYYADSVKG(2) DLYGSDYWD(3)
4A4 INAMA(4) AITSSGSTNYANSVKG(5) DEYGSDYWI(6)
4A1 INAMG(1) AITSGGSTNYADSVKG(7) DLYGEDYWI(8)
VHH克隆与人CD28茎区序列的结合首先通过ELISA使用VHH克隆的系列稀释来确认(图2)。通过FACS分析，使用标记的VHH克隆和过表达CD28的HEK细胞确认膜的人CD28在细胞水平上的结合(图3)。膜的CD28结合证明接近CD28膜近侧区域。先前的实验表明试剂的尺寸对于接近该区域是至关重要，因为可以与CD28茎区肽结合的全尺寸抗体无法与细胞上的CD28茎区结合(图1C)。值得注意的是，VHH克隆不能结合位于潜在MMP切割位点内在氨基酸残基145处具有L-K取代的人CD28茎区序列(图4)。
在肽和细胞水平上均证实了抗-脱落活性。ELISA技术用于检测完整的人CD28茎区二聚肽以确认VHH克隆阻断MMP-2(图5)和MMP-13(图6)对人CD28茎区的切割。虽然M9 Fab表现出阻断CD28茎区肽切割的能力，但如上所述，它不能结合细胞上的CD28茎区，也不能抑制从细胞膜上CD28脱落。在细胞水平上，标准夹心ELISA被用于通过测量过表达人CD28的HEK细胞(图7)、PHA和IL-2活化的分离的CD4 T细胞(图8)和超抗原活化的PBMC(图9)的上清液中人sCD28的水平来确认VHH克隆在抑制sCD28脱落中的功效。如所预期的，M9 Fab没有降低上清液中的sCD28水平，这进一步强调了阻断剂的尺寸和架构对其实际阻断脱落能力的重要性。
至关重要的是，发现VHH克隆不会损害人CD28功能性。使用流式细胞术，发现VHH克隆不会改变CD86与膜CD28结合的幅度(图10)。标准夹心ELISA用于显示VHH克隆不激动CD28，如通过炎性细胞因子干扰素γ的分泌水平所测量的(图11)。活化抗体CD28.2用作阳性对照。类似地，标准夹心ELISA用于显示VHH克隆不通过CD28拮抗CD80-Fc刺激，如通过细胞因子IL-2的分泌水平所测量的(图12)。
实施例3:设计其他小试剂以抑制从细胞表面的sCD28脱落
Fab片段生成使用商业试剂盒或商业可用服务进行。抗体M9的CDR区用于Fab生成，因为它们已显示与合适的去同位素结合。首先通过与重组人CD28和二聚体茎区肽的结合测定测试所得Fab片段的功效以确认这种结合被保留。通过FACS测定与表达人CD28的小鼠细胞和人免疫细胞的表面mCD28的结合。抗体CD28.2用作阳性对照。刺激后在免疫细胞培养物中测试sCD28脱落的直接抑制。当细胞存在和不存在Fab片段时通过夹心ELISA测量培养基中的sCD28。测定具有脱落抑制作用的Fab片段对CD28信号传导的影响。首先，通过测定Fab片段诱导自T细胞分泌促炎细胞因子(如，干扰素γ)的能力来测试激动作用。其次，阻断CD80-Fc(激动剂)结合的能力被用于测试Fab片段的拮抗性质。
通过标准方法，使用商业服务，或通过将CDR插入scFV骨架，进行使用M9 CDR的单链抗体产生。进行纯化，并通过与Fab片段所述相同的测定评估所得抗体。
实施例4：抑制CD28从细胞表面脱落的血清稳定剂的生成
尽管VHH分子是有效的切割阻断剂，但如果施用至受试者，它们的小尺寸使它们处于降解和从血清中清除的风险。为了增强VHH分子的血清半衰期，将它们与第二部分连接，所述第二部分增加了它们的大小并增强了它们的稳定性。选择VHH 2A1用于所有缀合测试，因为它被发现是最有效的切割阻断剂。生成并测试了11种不同的分子；这些分子在表3中总结。这些分子的序列在表4中提供。由于试剂需要与细胞上CD28的茎区结合，因此将VHH连接到半衰期延长部分的接头的长度和性质至关重要。太短的接头会使第二部分靠近CD28结合部分，这可能干扰其与膜的CD28的结合。太长的接头可能会产生其中第二部分太自由而不能关于第一部分周围移动的试剂，这同样可能干扰其CD28结合活性。
首先，使用人血清白蛋白(HSA)作为半衰期延长分子。人血清白蛋白(HSA)是人血清中最丰富的蛋白质，因其大小(66KDa)导致的长半衰期和结合新生儿Fc受体(FcRn)——使其能够被细胞吸收并释放回进入循环——的能力而闻名。VHH 2A1经由含有GGGGS重复的挠性肽接头在其C末端与HSA缀合。检查了1、3和7个重复(分别为2A1-5GS-HSA、2A1-15GS-HSA和2A1-35GS-HSA)以确定仍允许VHH接近切割位点的接头的最佳大小。还测试了长度为20或30个氨基酸的刚性螺旋接头(分别为2A1-20Hel-HSA和2A1-30Hel-HSA)。
第二种测试的半衰期延长分子是Alb8，一种对HAS特异性的VHH克隆。已知HSA结合肽，例如Alb8 VHH(Maria,JWD等人,Mol Cancer Ther.2012,11,1017-1025)在用于蛋白质缀合物时增强半衰期。Alb8还经由含有1、3或7个GGGGS重复(分别为2A1-5GS-Alb8、2A1-15GS-Alb8和2A1-35GS-Alb8)的挠性肽接头缀合。
接下来，将聚乙二醇化作为半衰期延长部分进行测试。向蛋白质中添加聚乙二醇(PEG)已被广泛用于增加蛋白质大小，从而延长半衰期。为了将PEG分子附接至切割阻断VHH上，在VHH的C末端添加了游离半胱氨酸基团，这利用了如下事实：骆驼科动物来源，尤其是美洲驼来源的单结构域抗体缺乏游离半胱氨酸残基，甚至，大部分缺乏二硫键。这种具有游离硫醇基团的半胱氨酸远离结合剂的CDR定位，可用于附接多种携有硫醇反应性基团的PEG分子，包括马来酰亚胺和碘乙酸酯官能团。生成的试剂可以包含大小范围从500Da到40KDa的线性或分支PEG分子。过小的PEG可能无法半衰期延长，而过大的PEG可能会在空间上干扰与CD28的结合。PEG分子还可以附接在除C末端半胱氨酸以外的额外位置，例如赖氨酸或羧酸(谷氨酸和天冬氨酸残基)。
为了促进聚乙二醇化，将二肽GC添加到2A1 VHH的C末端。该C末端半胱氨酸与被马来酰亚胺硫醇反应性官能团取代的线性40KDa的PEG部分直接缀合(2A1-1C-L40K)，或与被SPDP官能团取代的线性20KDa的PEG部分化学缀合(2A1-1C-R20K)。SPDP基团包含与VHH的C末端半胱氨酸形成二硫键的吡啶基二硫醇部分。最后，尝试了组合方法，其中2A1 VHH通过GC二肽与HSA连接，并通过2KDa PEG部分的聚乙二醇化修饰HSA。为了促进这一点，HSA在其单一游离硫醇(半胱氨酸34)上用双-马来酰亚胺-PEG(线性2KDa的PEG)预修饰，然后暴露的马来酰亚胺基团与VHH的C末端半胱氨酸反应。虽然二硫化物可逆的且容易切割的键，但马来酰亚胺基团的结合是不可逆的且高度稳定的。
试剂是融合蛋白。融合蛋白包括6X组氨酸标签，其目的用于蛋白质纯化和被合适的结合抗体识别。基于组氨酸标签纯化的技术在本领域中是众所周知的。
表3：生产的2A1半衰期延长构建体的总结
Figure BDA0003926623600000461
Figure BDA0003926623600000471
表4：构建体的序列
Figure BDA0003926623600000472
Figure BDA0003926623600000481
Figure BDA0003926623600000491
Figure BDA0003926623600000501
Figure BDA0003926623600000511
实施例5：CD28肽的功能性结合
评估了上述试剂结合重组CD28肽的能力。将含有茎区序列并以二聚体存在的重组人CD28-Fc嵌合蛋白固定在ELISA maxi-sorb平板上。进行亲本2A1和11种半衰期延长2A1构建体的3倍稀释系列，并使用抗VHH-HRP缀合抗体进行结合VHH的检测，然后用TMB显影(图13)。使用Graph-Pad软件利用四参数非线性回归曲线计算每个构建体的EC50值，并在表5中总结。基于该分析，所有生成的2A1构建体都保留了它们结合CD28重组肽的能力。应该注意的是，由于VHH非常小，通常可干扰抗VHH抗体与VHH的结合。这可以解释EC50值的一些可变性，尽管数据显示所有VHH都是功能性结合剂。当VHH结合细胞表面上的膜的CD28时，这种干扰最为明显地观察到。由于茎区直接与质膜相邻，因此抗VHH抗体结合的VHH表位被掩埋。因此，VHH与细胞表面CD28的结合必须通过其对阻断切割(或其他功能性结果)的影响来间接测量，而不是在直接结合测定中测量。
表5：亲本2A1和半衰期延长构建体的EC50值
构建体 EC50(nM)
2A1 79.2
2A1-5GS-HSA 102.67
2A1-15GS-HSA 49.5
2A1-35GS-HSA 45.8
2A1-5GS-Alb8 137
2A1-15GS-Alb8 171.7
2A1-35GS-Alb8 55.8
2A1-20Hel-HSA 28.6
2A1-30Hel-HSA 9.4
2A1-1C-P2K-HSA N.D.
2A1-1C-R20K N.D.
2A1-1C-L40K 245.5
实施例6：测试半衰期延长构建体对CD86结合的阻断
评价上述试剂在本发明试剂存在下对天然配体与膜的CD28结合的潜在不期望的阻断。CD28的天然配体是CD86，这种结合诱导免疫活化。已经证明VHH本身不会损害CD86与CD28的结合，然而，半衰期延长部分可能会阻断或干扰CD28结合区域或以其他方式影响配体结合。损害CD86结合的构建体几乎没有价值，因为该分子旨在上调/增强免疫反应。
使HEK293细胞过度表达人CD28，然后使用与AlexaFlour 647缀合的二抗抗人Fc抗体通过流式细胞术监测CD86-Fc(2μg/mL)结合。在没有任何抗CD28分子的情况下，利用亲本VHH和11种半衰期延长构建体测试结合。VHH#10E9是CD28拮抗剂，用作阳性对照(右上图)。对于同种型对照，使用了不相关的VHH，克隆#3C04。没有发现测试的半衰期延长构建体显著损害CD86结合(图14)。CD86阻断百分比计算为每个构建体在不存在处理的情况下来自基础CD86-Fc结合的信号(中值)减少百分比，并在表6中总结。半衰期延长构建体通常被发现比得上亲本VHH，并且没有一种分子在高于同种型对照的水平上阻断CD86结合。
表6：CD86的阻断百分比
构建体 阻断CD86结合(％)
同种型 14.5
VHH#10E09 88.3
2A1-6H 8.2
2A1-5GS-HSA 14.5
2A1-15GS-HSA 5.9
2A1-35GS-HSA 6.7
2A1-5GS-Alb-8 0.0
2A1-15GS-Alb-8 0.8
2A1-35GS-Alb-8 2.4
2A1-20Hel-HSA 11.2
2A1-30Hel-HSA 0.0
2A1-1C-2K-HSA 9.4
2A1-1C-R20K 15.9
2A1-1C-L40K 13.4
实施例7：测试半衰期延长构建体的激动作用
评估了上述试剂对膜的CD28的潜在不期望的激动作用。如果构建体通常具有激动作用，则可能生成全身免疫活化的非特异性作用，这将是有害的。激动作用如下测试。分离的人CD3阳性T细胞用平板结合的抗CD3(OKT3，2μg/mL，浅灰色条)(图15A)或用scOKT3质粒转染的A375细胞(图15B)刺激24小时。这是在不相关的VHH克隆#3C04、阳性对照抗CD28激动剂抗体克隆28.2或多种不同的2A1构建体存在下进行的。通过标准化夹心ELISA(Biolegend)测量上清液中分泌的IL-2浓度，并作为CD28刺激的读数(激动作用)。测试的2A1构建体均未产生激动作用。
实施例8：测试延长半衰期构建体的拮抗作用
评估了上述试剂对膜的CD28的潜在不期望的拮抗作用。由于这些分子旨在增强自然免疫活化的可能性，因此拮抗作用是不期望的。用人CD80和scOKT3质粒(人工APC-CD80，浅灰色条)转染的HEK293细胞刺激分离的人CD3阳性T细胞24小时。这是在不相关的VHH克隆#3C04作为阴性、同种型对照，抗CD28拮抗剂克隆VHH#12B07作为阳性对照和多种2A1半衰期延长构建体的存在下进行的(图16)。如前所述，使用标准化夹心ELISA(Biolegend)定量IL-2分泌，作为免疫活化和CD28拮抗的量度。与激动和配体阻断的结果相似，没有发现半衰期延长构建体拮抗CD28。
实施例9：测试半衰期延长构建体的免疫调节作用
在生理环境中评估上述试剂的任何一般免疫调节作用。如上所述进行混合淋巴细胞反应。具体地，将分离的成熟树突细胞与同种异体CD3阳性T细胞温育24小时。这是在对照VHH(克隆#3C04，同种型)和拮抗VHH克隆(#1A07)以及亲本2A1 VHH和多种半衰期延长构建体——以多种浓度——的存在下进行的。再次使用IL-2分泌作为读数。令人惊讶的是，亲本VHH在测试的最高浓度下产生了非常小的不期望的抑制作用(图17)。这种抑制作用在多种半衰期延长的分子中被消除，事实上，这些分子中没有一种在本测定中显示出免疫调节作用(图17)。
实施例10：通过半衰期延长部分测试半衰期的延长
在确定上述所有试剂均不产生不期望的活化或抑制作用后，对其实际延长2A1VHH半衰期的能力进行了测试。Balb/C小鼠经由静脉注射以100μg每种VHH分子/小鼠的固定剂量施用(2A1-1C-P2K-HSA以50μg/小鼠施用)。其以分三次进行，在168小时内的多个时间点测量血清浓度(图18)。每个分子的半衰期(T1/2)根据测量的终点估算，并在表7中呈现。可以看出，所有半衰期延长分子都是有功能的，并确实增强了VHH的半衰期。包含VHH和聚乙二醇化的肽之间的二硫键的2A1-1C-R20K仅产生了半衰期的适度改善，这可能是由于血清中键的切割。但是，这种构建体扔将半衰期增加了8倍。所有其他构建体都非常有效，尽管如表7所示，一些构建体比其他构建体更有效。相对半衰期可总结为2A1-15GS-Alb8>2A1-1C-L40K>2A1-15GS-HAS>2A1-20HEL-HAS>2A1-1C-P2K-HAS>>2A1-1C-R20K>>2A1。
表7：多种2A1 VHH构建体的半衰期
Figure BDA0003926623600000531
实施例11：测试半衰期延长构建体对sCD28脱落的抑制
已经确定所有上述半衰期延长分子在一定程度上确实延长了半衰期，现在测试了它们阻断sCD28从细胞中脱落的能力。至关重要的是，添加半衰期延长结构域或基团不会妨碍这种基本能力，或者至少不会在太大的水平上妨碍它，以至于VHH不再发挥作用。为此，在用PHA和IL-2刺激的分离的人CD4的培养基或用SEB刺激的PBMC中测量可溶性CD28的水平。CD28脱落的抑制被计算为来自基础刺激的可溶性CD28减少的百分比。对于一些构建体，测试重复三次并在多种浓度下进行。MMP抑制剂用作阳性对照，不相关的VHH#3C04用作阴性对照(同种型对照)。上清液中可溶性人CD28的水平通过标准化夹心ELISA(R&D Systems)进行量化。如图19中可见，仅具有5个氨基酸接头的挠性接头构建体在阻断CD28脱落方面完全无效，无论它们与HSA还是ALB-8融合。类似地，其中只有单一氨基酸将VHH与聚乙二醇化的HSA分开，该分子在脱落阻断方面无效。具有35个氨基酸的非常长的挠性接头的结果仅略好一点，具有15个氨基酸的中等接头显示出最佳结果，尽管这些仅略好于同种型对照。四个构建体确实显示出显著的脱落阻断。两种具有刚性接头的构建体都产生了显著的脱落阻断，尽管水平低于亲本VHH。两种聚乙二醇化的VHH(没有HSA)也显示出显著的脱落阻断，并且实际上2A1-1C-R20K产生的脱落甚至略优于亲本VHH。阻断百分比在表8中总结。
表8：半衰期延长构建体的脱落阻断百分比
试剂 抑制(％)
MMPi 60.5
同种型对照 22.7
2A1亲本 58.9
2A1-5GS-Alb8 17.9
2A1-1C-P2K-HSA 18.1
2A1-5GS-HSA 22.8
2A1-35GS-Alb8 23.7
2A1-35GS-HSA 27.3
2A1-15GS-HSA 27.3
2A1-15GS-Alb8 30.2
2A1-30Hel-HSA 32.4
2A1-20Hel-HSA 39
2A1-1C-L40K 54.6
2A1-1C-R20K 64.6
虽然已经结合其特定实施方式描述了本发明，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，意图包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。
序列表
<110> 比昂生物制剂公司
<120> 具有增加的稳定性的脱落阻断剂
<130> BDB-P-011-PCT
<150> US 62/988,503
<151> 2020-03-12
<160> 65
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Ile Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Ile Asn Ala Met Ala
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val Thr
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Gly
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser
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<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
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Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser
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Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
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Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
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<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
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20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
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Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
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Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
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Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
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195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 21
<211> 202
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
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Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
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Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
130 135 140
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
145 150 155 160
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
165 170 175
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
180 185 190
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
195 200
<210> 22
<211> 663
<212> DNA
<213> 智人
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atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60
attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120
aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180
agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240
aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300
aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360
ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420
tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540
agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660
tga 663
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<212> PRT
<213> 智人
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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
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<211> 139
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
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Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
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Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
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Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Glu Glu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
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100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Glu Glu
115 120
<210> 26
<211> 144
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
115 120 125
<210> 28
<211> 538
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60
attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120
aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180
agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240
aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300
aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360
ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg tgaggagtaa 420
gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac 480
ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctcctga 538
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
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<223> X是G或A
<400> 29
Ile Asn Ala Met Xaa
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X是S或T
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是G或S
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> X
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<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X是D或N
<400> 30
Ala Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Xaa Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X是E或L
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是E或S
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X是D或I
<400> 31
Asp Xaa Tyr Gly Xaa Asp Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X是E或L
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X是D或I
<400> 32
Asp Xaa Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 33
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
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<210> 34
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
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<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val
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Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Gly Cys
115 120 125
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val
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Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Asn Thr Tyr Thr Gly Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gly Asp Ala Asn Gln Gln Phe Ala Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
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<211> 9
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro Thr
1 5
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 46
gacgtgaagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cactttcagt agctattaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcgacc ataagtgatg gtggtgataa cacctactac 180
gcaggcactg tgacgggccg attcaccatc tccagagact ttgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgac ctctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagaattcat 300
tggccttact attttgactc ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Gln Phe Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Met Leu Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 48
caatttgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctcccgggga gatgctcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tatatgaact ggtatcagca gaagccagga 120
tcttccccca aaccctggat ttatgccaca tccgacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtcacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaga 318
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<400> 49
Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser
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Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu
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Ser Lys Pro
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Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
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Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Gly His Val Lys
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<400> 55
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Gly His Val Lys
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Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Lys Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
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Lys
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<220>
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Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro
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Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro
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Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala
485 490 495
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Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys
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Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met
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Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 59
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser
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Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala
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Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly
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Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys
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Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe
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Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg
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Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala
355 360 365
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Ala Leu Gly Leu His His His His His His
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<213> 人工的
<220>
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180 185 190
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195 200 205
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245
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<400> 61
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
145 150 155 160
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
165 170 175
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp
180 185 190
Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His
245 250 255
His His His
<210> 62
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
260 265 270
Ala His His His His His His
275
<210> 63
<211> 727
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu
115 120 125
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Gly Ser Asp Ala
130 135 140
His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn
145 150 155 160
Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys
165 170 175
Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala
180 185 190
Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu
195 200 205
His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu
210 215 220
Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
245 250 255
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn
260 265 270
Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His
275 280 285
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys
290 295 300
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu
305 310 315 320
Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala
325 330 335
Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala
340 345 350
Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala
355 360 365
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His
370 375 380
Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala
385 390 395 400
Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys
405 410 415
Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile
420 425 430
Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala
435 440 445
Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala
450 455 460
Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His
465 470 475 480
Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu
485 490 495
Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr
500 505 510
Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn
515 520 525
Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys
530 535 540
Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val
545 550 555 560
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly
565 570 575
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu
580 585 590
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys
595 600 605
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val
610 615 620
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val
625 630 635 640
Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys
645 650 655
Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val
660 665 670
Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala
675 680 685
Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp
690 695 700
Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala
705 710 715 720
Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
725
<210> 64
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu
115 120 125
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
130 135 140
Ala Ala Lys Ala Ala Ala Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
145 150 155 160
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
165 170 175
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
180 185 190
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
195 200 205
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
225 230 235 240
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
245 250 255
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
260 265 270
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
275 280 285
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
290 295 300
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
305 310 315 320
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
325 330 335
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
340 345 350
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
355 360 365
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
370 375 380
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
385 390 395 400
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
405 410 415
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
420 425 430
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
435 440 445
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
450 455 460
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
465 470 475 480
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
485 490 495
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
500 505 510
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
515 520 525
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
530 535 540
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
545 550 555 560
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
565 570 575
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
580 585 590
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
595 600 605
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
610 615 620
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
625 630 635 640
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
645 650 655
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
660 665 670
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
675 680 685
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
690 695 700
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
705 710 715 720
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
725 730 735
Leu
<210> 65
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585

Claims (46)

1.一种试剂，其包含由接头分开的至少两个部分，其中第一部分结合细胞表面上的膜的CD28(mCD28)并抑制所述mCD28的蛋白水解切割，并且其中第二部分增加所述所述第一部分的稳定性。
2.根据权利要求1所述的试剂，所述第一部分、所述第二部分或两者小于100千道尔顿(kDa)。
3.根据权利要求2所述的试剂，其中所述试剂小于100kDa。
4.根据权利要求1至3所述的试剂，其中所述第一部分选自抗体的抗原结合片段、Fab片段、单链抗体、单结构域抗体、小分子和特异性结合CD28的肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂，其中所述第一部分包含单结构域抗体或由其组成。
6.根据权利要求5所述的试剂，其中所述单结构域抗体是骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的试剂，其中所述第一部分包含三个CDR，其中：
CDR1包含SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:2(AISGGGDTYYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:3(DLYGSDYWD)中叙述的氨基酸序列；
CDR1包含SEQ ID NO:4(INAMA)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:5(AITSSGSTNYANSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:6(DEYGSDYWI)中叙述的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO:1(INAMG)中叙述的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO:7(AITSGGSTNYADSVKG)中叙述的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO:8(DLYGEDYWI)中叙述的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的试剂，其中所述第一部分包含选自以下的序列：
a.
EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)；
b.
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)；和
c.
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂，其中所述第一部分包含三个重链CDR(CDR-H)和三个轻链CDR(CDR-L)，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:12(GFTFSSYYMS)中叙述的氨基酸序列，CDR-H2包含如SEQ IDNO:13(TISDGGDNTYYAGTVTG)中叙述的氨基酸序列，CDR-H3包含如SEQ ID NO:14(IHWPYYFDS)中叙述的氨基酸序列，CDR-L1包含如SEQ ID NO:15(RASSSVSYMN)中叙述的氨基酸序列，CDR-L2包含如SEQ ID NO:16(ATSDLAS)中叙述的氨基酸序列，和CDR-L3包含如SEQ ID NO:17(QQWSSHPPT)中叙述的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂，其中所述试剂不是CD28激动剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的试剂，其中所述试剂不是CD28拮抗剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的试剂，其中所述第一部分的所述增加的稳定性包含增加血液中的稳定性。
13.根据权利要求12所述的试剂，其中增加血液中的稳定性包含减少所述第一部分从血液中的清除。
14.根据权利要求13所述的试剂，其中减少从血液中的清除包含减少肾滤过、减少溶酶体降解或两者。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的试剂，其中所述接头是刚性肽接头。
16.根据权利要求15所述的试剂，其中所述刚性肽接头包含螺旋基序。
17.根据权利要求15或16所述的试剂，其中所述刚性肽接头包含至少15个氨基酸。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的试剂，其中所述刚性肽接头包含至多30个氨基酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的试剂，其中所述接头包含至少一个半胱氨酸残基。
20.根据权利要求19所述的试剂，其中所述至少一种半胱氨酸是C末端半胱氨酸。
21.根据权利要求19或20所述的试剂，其中所述第二部分是聚乙二醇(PEG)并经由硫醇键附接到所述半胱氨酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的试剂，其中所述第二部分是PEG并且所述PEG在所述第一部分的C末端的10个氨基酸内缀合。
23.根据权利要求22所述的试剂，其中所述接头是肽接头并且PEG与所述肽接头的氨基酸缀合。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的试剂，其中所述PEG是线性或分支PEG，其大小为2000-40,000道尔顿(Da)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的试剂，其中所述第二部分包含人血清白蛋白(HAS)多肽或由其组成。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的试剂，其中所述第二部分包含HSA结合多肽或由其组成。
27.根据权利要求26所述的试剂，其中所述HSA结合多肽是单结构域抗体。
28.根据权利要求27所述的试剂，其中所述单结构域抗体包含以下序列或由其组成：EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA(SEQ ID NO:19)。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的试剂，其中所述第一部分的C末端连接至所述接头并且所述第二部分的N末端连接至所述接头。
30.根据权利要求29所述的试剂，其中所述第一部分的C末端连接至所述接头的N末端并且所述第二部分的N末端连接至所述接头的C末端。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的试剂，其中所述试剂包含选自SEQ ID NO:63和64的氨基酸序列或由其组成。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的试剂，其中所述试剂包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且包含将PEG部分不可逆缀合至所述第一部分的C末端的10个氨基酸内的氨基酸残基。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的试剂，其中所述试剂包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且包含将PEG部分可逆缀合至所述第一部分的C末端的10个氨基酸内的氨基酸残基。
34.根据权利要求32或33所述的试剂，其中所述PEG是线性或分支PEG，其大小为2000-40,000道尔顿(Da)。
35.一种核酸分子，其编码权利要求1至34中任一项所述的试剂。
36.一种表达载体，其包含权利要求35所述的核酸分子。
37.一种生成权利要求1至34中任一项所述的试剂的方法，所述方法包含以下的至少一项：
a.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28并抑制所述mCD28的蛋白水解切割；
b.通过接头将所述第一部分连接至第二部分以产生连接的试剂并测试所述连接的试剂与细胞表面上的mCD28的结合以及对所述mCD28的蛋白水解切割的抑制；和
c.选择结合细胞表面上的mCD28并抑制所述mCD28的蛋白水解切割的连接的试剂；和
d.培养包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含编码试剂的核酸序列，其中所述核酸序列是通过以下选择的试剂的核酸序列：
i.获得第一部分，其结合细胞表面上的mCD28并抑制所述mCD28的蛋白水解切割；
ii.通过接头将所述第一部分连接至第二部分以产生连接的试剂并测试所述连接的试剂与细胞表面上的mCD28的结合以及对所述mCD28的蛋白水解切割的抑制；和
iii.选择结合细胞表面上的mCD28并抑制所述mCD28的蛋白水解切割的连接的试剂；
从而生成权利要求1至34中任一项所述的试剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其进一步包含在所述连接的试剂存在下测定mCD28下游信号传导并选择至少一种既不实质上激动也不实质上拮抗mCD28信号转导的连接的试剂。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其进一步包含测定所述连接的试剂在血液中的稳定性并选择至少一种与在血液中的所述第一部分相比包含增加的稳定性的连接的试剂。
40.一种试剂，其通过权利要求37至39中任一项所述的方法产生。
41.一种药物组合物，其包含权利要求1至23和40中任一项所述的试剂，和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
42.一种降低有需要的受试者中可溶性CD28(sCD28)水平的方法，所述方法包含施用权利要求1至34和40中任一项所述的试剂或权利要求41所述的药物组合物，从而降低受试者中的sCD28。
43.一种治疗和/或预防有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包含施用权利要求1至34和40中任一项所述的试剂或权利要求41所述的药物组合物，从而治疗和/或预防受试者中的癌症。
44.一种改善有需要的受试者中基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法的方法，所述方法包含施用权利要求1至34和40中任一项所述的试剂或权利要求39所述的药物组合物，从而改善受试者中基于PD-1和/或PD-L1的免疫疗法。
45.根据权利要求42或44所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述方法不降解mCD28、降低mCD28介导的免疫细胞活化或活化mCD28介导的免疫细胞活化。
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