KR20220108137A - Mmp 억제의 용도 - Google Patents

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KR20220108137A
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모티 하킴
안나 프리드만-드로르
이라나 만델
테히라 벤-모세
야이르 사피르
아비도르 슐만
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비온드 바이오로직스 엘티디
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Abstract

매트릭스 메탈로프로테아제를 억제하는 것을 포함하는, CD28의 쉐딩을 감소시키고, 가용성 CD28의 수준을 감소시키고, 암을 치료하고 면역요법을 개선하는 방법이 제공된다. 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 방법이 또한 제공된다.

Description

MMP 억제의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 12월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/942,240, 2019년 12월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/954,802 및 2020년 3월 12일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/IL2020/050297의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 모두 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 면역 조절 및 면역요법의 분야에 있다.
일부 공동-자극 분자는 여러 생리학적 형태를 갖는 것으로 알려져 있다. 막-결합 형태와 함께 순수 면역 세포에서 발현되어, T 세포 생물학의 복잡성을 증가시키는 가용성 형태가 기술되었다. CD28의 가용성 형태(sCD28)는 대안적으로 스플라이싱된 유전자 산물과 CD28의 막 형태(mCD28)의 활성 쉐딩에 기인한다. 스플라이싱 이벤트는 번역 종료 전에 위치 137에서 글리신 후에 2개의 글루타메이트 잔기를 추가한 결과로 프레임 시프트를 초래한다. 최종 생성물은 전체 막횡단 및 세포질 영역이 결여되어 있고 중요하게는 위치 141에서 이량체 CD28의 이황화 연결을 매개하는 시스테인 잔기를 결하고 있다(Magistrelli G., Biochem Biophy Res Commun, 1999). 대조적으로, CD28 쉐딩(shedding)의 기전과 정확한 절단의 부위에 대해서는 훨씬 덜 알려져 있고, 쉐딩된 sCD28 분자의 서열도 알려져 있지 않다.
sCD28은 암에 대한 면역 반응을 억제하는 것으로 나타났고 자가면역 중증도와 상관관계가 있다. 더욱이, sCD28은 PD-1 및 PD-L1 기반 면역요법의 효과를 억제한다. 이와 같이 sCD28 생성을 억제하는 방법이 크게 요구된다. 특히, sCD28의 쉐딩을 차단하는 방법 및 조성물이 크게 요구된다. sCD28 쉐딩의 차단은 면역 세포에서 sCD28을 감소시키고 mCD28을 증가시킨다는 점에서 이중 효과가 있다. 이들 두 가지 효과는 모두 암에 대한 면역 감시를 증강시킨다.
발명의 요약
본 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 및/또는 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13)을 억제하는 것을 포함하는, CD28의 쉐딩을 감소시키고 가용성 CD28 수준을 감소시키고 암을 치료하고 면역요법을 개선하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 방법이 또한 제공된다.
제1 양태에 따르면, 막 CD28(mCD28)을 발현하는 세포의 표면으로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13) 억제제 또는 둘 모두와 접촉시켜, 이에 의해 세포의 표면으로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 가용성 CD28(sCD28) 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 면역요법이 필요한 대상체는 암을 앓고 있다.
일부 실시형태에 따르면, 대상체는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법에 반응하지 않거나 낮게 반응한다.
일부 실시형태에 따르면, 감소 이전의 대상체의 혈액은 적어도 5ng/mL sCD28을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 암은 흑색종, 요로상피암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 및 결장직장암으로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 세포의 표면 또는 대상체에서 mCD28 발현을 증가시키고/시키거나, 세포 또는 대상체에서 mCD28-매개된 면역 세포 활성화를 증가시킨다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 MMP-2 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 MMP-2에 특이적이다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 CD28의 MMP-2 유도된 쉐딩에 특이적이다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 MMP-13 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 MMP-13에 특이적이다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 CD28의 MMP-13 유도된 쉐딩에 특이적이다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 mCD28의 P144와 L145 사이에서 mCD28의 유도된 절단을 억제한다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 mCD28에 결합하고 CD28의 MMP-2 유도된 쉐딩을 억제한다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 mCD28에 결합하고 CD28의 MMP-13 유도된 쉐딩을 억제한다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 mCD28의 줄기 영역에 결합하며, 여기서 줄기 영역은,
a. 아미노산 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 7), KGKHLCPSPLFPGPS(서열번호: 8) 또는 KGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 9)를 포함하거나;
b. 아미노산 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 10)로 구성되거나; 또는
c. (a) 및 (b) 둘 모두이다.
일부 실시형태에 따르면, 억제제는 줄기 영역에서 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두의 절단 부위 PX1X2/X3를 결합, 폐색 또는 차단하며 여기서 X3은 소수성 잔기이다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 PSPL이고 MMP-2/MMP-13은 P와 L 사이를 절단한다.
일부 실시형태에 따르면, 발명의 방법은 대상체에게 또 다른 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 면역요법은
a. 체크포인트 억제제;
b. 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 요법; 및
c. 암 백신으로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 체크포인트 억제제는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법이다.
또 다른 양태에 따르면, 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제를 수득하고, MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제의 능력을 시험하고, MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것; 또는
작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것으로, 여기서 핵산 서열은
i. CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제의 수득;
ii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제 능력의 시험; 및
iii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제의 선택
에 의해 선택된 작용제의 핵산 서열인 것
을 포함하고, 이에 의해 본 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 작용제의 수득은 CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제의 수득이다.
일부 실시형태에 따르면, CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제는 CD28 줄기 도메인에서 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두의 절단 부위에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에 따르면, CD28 줄기 도메인에서 절단 부위는 PSPL이다.
일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 수득된 작용제의 존재에서 mCD28 다운스트림 시그널링을 검정하는 것 및 mCD28 시그널링을 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것, 및 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것, 또는 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것과 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 선택된 작용제의 것이다.
일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것, 및 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것, 또는 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것과 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 선택된 작용제의 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 작용제가 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 발명의 작용제, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 실시형태 및 적용가능성의 전체 범주는 이하에 주어진 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명의 사상 및 범주 내의 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 발명의 바람직한 실시예를 나타내면서 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a-1e. (1a-1e) (1a) 다양한 재조합 인간 셰다제(sheddase), (1b) 다양한 농도의 rhMMP-2, (1c) MMP-2 및 다양한 농도의 MMP-2 특이적 억제제 ARP-100, (1d) 다양한 농도의 rhMMP-13, 또는 (1e) MMP-13 및 광범위한 MMP 억제제 TMI-1과 함께 인큐베이션된 인간 CD28 줄기 영역의 켄칭된 형광성 펩티드로부터의 형광의 선 그래프.
도 2a-2b. (2a-2b) (2a) SEB 또는 (2b) CMV 자극된 인간 PBMC의 배양물에서 sCD28 수준의 막대 그래프. 다양한 수준의 MMP-2 억제제 ARP-100을 첨가하고, 억제제의 첨가 없이 비자극된 PBMC 및 자극된 PBMC를 사용하여 가용성 CD28의 기저 수준을 나타내었다.
도 3a-3d. (3a-3c) (3A) MMP-2로 줄기 펩티드의 인큐베이션, (3b) 줄기 펩티드 단독 및 (3c) MMP-2 단독으로부터 질량 분석 판독값의 스펙트럼. (3d) 관련 피크의 분석이 있는 3a의 히스토그램 및 절단의 위치를 나타내는 줄기 펩티드의 다이어그램.
도 4a-4d. 돌연변이 Leu145는 CD28 줄기 영역의 절단을 폐지한다 . (4a-4b) 30ng의 (4a) MMP-2 또는 (4b) MMP-13과 함께 인큐베이션된 WT 또는 L145K CD28 줄기 영역(2.5μM)의 켄칭된 형광성 펩티드로부터 형광의 선 그래프. (4c-4d) 5시간 동안 (4c) rhMMP-2(25 또는 50ng/반응 또는 (4d) rhMMP-13(25 또는 50 ng/반응)으로 인큐베이션에 이은 CD28 줄기 영역(62.5nM)의 WT 또는 L145K 비오틴화 및 myc 태그된 이량체 펩티드로부터 잔존하는 온전한 펩티드의 %의 막대 차트. 각 효소가 없는 인큐베이션을 대조군으로 사용했다. 잔존하는 펩티드는 효소가 있는 신호를 펩티드 단독 신호가 있는 신호로 나누고 100을 곱하여 계산했다.
도 5: ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 서열에 대한 결합. 상이한 VHH 클론의 일련의 희석에 의한 항원 결합의 분석. 항원으로 작용하는 비오틴 접합된 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA 맥시-소르브 플레이트 상에 고정화시켰다. VHH 클론의 일련의 희석이 수행되었고 결합된 VHH의 검출은 항 His 태그-HRP 접합된 항체로 수행되었고 전개는 TMB로 수행되었다.
도 6: 막 인간 CD28에 대한 VHH#2A1의 결합. FITC 접합된 VHH 클론 2A1(50μg/mL, 검은색 히스토그램) 및 FITC 접합된 이소타입 대조군(mIgG, 50μg/mL, 회색 히스토그램)을 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포와 함께 인큐베이션했다. 결합은 FACS 분석에 의해 평가되었다.
도 7: 항 CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1, 4A1 및 4A4는 인간 CD28의 MMP 절단 부위에 특이적으로 결합한다. 직접 ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 WT 서열 또는 L145K 돌연변이된 서열에 대한 VHH 클론의 특이적 결합의 비교. 비오틴 접합된 야생형 또는 L145K CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA 맥시-소르브 플레이트 상에 고정시켰다. VHH 클론(0.2-5μg/mL) 및 무관한 VHH 클론(좌측 상단 차트)의 희석 시리즈가 수행되었고 결합된 VHH의 검출이 항 His 태그-HRP 접합된 항체로 수행되었고 전개는 TMB로 수행되었다.
도 8: VHH 클론에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 MMP-2-매개된 절단의 시험관내 차단. c-Myc 접합된 및 비오틴화된 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드(1μM)를 5시간 동안 다양한 농도(0.4-10μg/mL)에서 MMP-2 억제제(TMI-1, 50nM) 또는 표시된 VHH 클론의 존재에서 50ng rhMMP-2와 함께 인큐베이션했다. 혼합물은 뉴트라비딘 코팅된 ELISA 맥시-소르브 플레이트 상에 장입된 후 광범위한 세정 및 항-cMyc HRP-접합된 항체에 의한 온전한 펩티드의 검출을 하고 전개는 TMB로 수행되었다.
도 9: MMP-13에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 절단에 대한 VHH 클론 2A1의 시험관내 차단 활성. c-Myc 및 비오틴화된 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드(1μM)를 5시간 동안 다양한 농도(0.62-10μg/mL)에서 MMPi(TMI-1, 50nM, 짙은 회색 막대), 무관한 VHH 클론(왼쪽 차트에서 검은색 막대) 또는 VHH 클론 2A1(오른쪽 차트에서 검은색 막대)의 존재에서 50ng rhMMP-13(밝은 회색 막대)과 함께 인큐베이션했다. 혼합물은 뉴트라비딘 코팅된 ELISA 맥시-소르브 플레이트 상에 장입된 후 광범위한 세정 및 항 cMyc-HRP 접합된 항체에 의한 온전한 펩티드의 검출을 하고 전개는 TMB로 수행되었다.
도 10: 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준은 48시간 인큐베이션 후 인간 CD28을 안정적으로 발현하는 HEK 세포의 배양 배지에서 측정되었다. 가용성 CD28의 수준에 대한 다양한 농도(3.3-100μg/mL)에서 MMP 억제제(TMI-1, 1μM, 짙은 회색 막대), 무관한 VHH의 음성 대조군(왼쪽 상단 차트, 검은색 막대) 또는 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론(검은색 막대)의 상이한 처리의 효과가 묘사된다. 상등액에서 가용성 인간 CD28의 수준은 표준화된 샌드위치 ELISA(R&D 시스템)로 정량화되었다.
도 11: 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 PHA 및 IL2에 의해 활성화된 단리된 CD4 T 세포에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준은 5μg/mL PHA 및 200IU/mL IL-2(밝은 회색 막대)로 자극된 단리된 인간 CD4 T 세포의 배양 배지에서 측정되었다. 가용성 CD28의 양에 대한 다양한 농도(0.4-50μg/mL)에서 MMP 억제제(TMI-1, 1 μM, 짙은 회색 막대), 무관한 VHH의 음성 대조군(좌측 상단 차트, 검은색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 또는 항체 M9 클론의 Fab 형식(검은색 막대)의 상이한 처리의 효과가 묘사된다. 상등액에서 가용성 인간 CD28의 수준은 표준화된 샌드위치 ELISA(R&D 시스템)로 정량화되었다.
도 12: 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 초항원에 의해 활성화된 PBMC에서 CD28 쉐딩을 억제한다. 가용성 CD28의 수준은 1ng/mL SEB(밝은 회색 막대)로 자극된 단리된 PBMC의 배양 배지에서 측정되었다. 가용성 CD28의 양에 대한 다양한 농도(0.4-50μg/mL)에서 MMP 억제제(TMI-1, 1μM, 짙은 회색 막대), 무관한 VHH의 음성 대조군(좌측 상단 차트, 검은색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론(검은색 막대)의 상이한 처리의 효과가 묘사된다. 상등액에서 가용성 인간 CD28의 수준은 표준화된 샌드위치 ELISA(R&D 시스템)로 정량화되었다.
도 13: 항 CD28 줄기 영역 VHH 클론은 막 CD28에 대한 리간드 결합을 차단하지 않는다. 인간 CD28을 과발현하는 HEK293 세포는 AlexaFlour 647에 접합된 2차 항 인간 Fc 항체를 사용하여 CD86-Fc(2μg/mL) 결합에 대한 유세포측정법에 의해 모니터링되었다. CD86-Fc에 항 CD28 VHH 클론의 추가(30μg/mL, 검정 히스토그램)는 CD86 결합의 크기를 변경하지 않은 반면 상용 항체 클론 CD28.2의 추가(10μg/mL, 왼쪽 상단 차트, 검정 히스토그램)는 결합을 유의하게 감소시켰다.
도 14: 항-CD28 VHH 클론의 효능제(agonist) 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포는 양성 대조군으로 역할을 하는 항-CD28 효능제 항체 클론 28.2(2μg/mL, 어두운 회색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 또는 무관한 VHH 클론(20μg/mL, 검은색 막대)의 존재에서 플레이트 결합된 항-CD3(OKT3, 2μg/mL, 밝은 회색 막대)으로 2일 동안 자극되었다. 상등액 안으로 분비되는 인간 IFN 감마의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA(Biolegend)로 정량화되었다.
도 15: 항-CD28 VHH 클론의 길항제 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포를 CD28 공동-자극에 대한 리간드로 작용하는 재조합 CD80-Fc 단백질(5μg/mL, 짙은 회색 막대)의 존재에서 플레이트 결합된 항-CD3(OKT3, 2μg/mL, 밝은 회색 막대)으로 24시간 동안 자극했다. 무관한 VHH 클론(좌측 상단 차트) 또는 항-CD28 줄기 영역 VHH가 다양한 농도(3.75-30μg/mL, 검은색 막대)로 추가되었다. 상등액에서 인간 IL-2의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA(Biolegend)로 정량화되었다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2), 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13) 또는 둘 모두를 억제하는 것을 포함하는, CD28의 쉐딩을 감소시키고, 가용성 CD28 수준을 감소시키고, 암을 치료하고 그리고 면역요법을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 MMP-2가 가용성 CD28(sCD28)을 생성하는 막 CD28(mCD28)의 절단을 담당하고 이에 필수적인 프로테아제라는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명의 방법은 더욱이 MMP-13이 또한 절단을 담당한다는 놀라운 발견에 기초한다. 더욱이, CD28의 줄기 영역에서 MMP-2 및 MMP-13의 정확한 절단 부위가 발견되어 MMP-2/MMP-13 절단 및 CD28의 쉐딩을 특이적으로 차단하는 작용제의 생산을 허용한다.
항-절단 분자는 이중 이점을 갖는다. mCD28의 단백질분해 절단을 차단하여 T 세포의 세포 표면 상에 CD28의 양을 높게 유지한다. 이것은 절단으로 인해 표면 CD28의 수준이 떨어지면 손상될 수 있는, 신속하고 효과적인 T 세포 활성화를 허용한다. 더욱이, 절단의 감소는 대상체의 혈류에서 sCD28의 감소로 이어지고, 따라서 암과 싸우는 대상체의 능력 및 면역요법의 효과에 대한 sCD28의 해로운 영향에서 감소를 초래한다.
제1 양태에 의해, 세포로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13) 억제제, 또는 둘 모두와 접촉시키고, 이에 의해 세포로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 세포로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키기 위한 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13) 억제제 또는 둘 모두의 용도가 제공된다.
또 다른 양태에 의해, 가용성 CD28(sCD28) 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 가용성 CD28(sCD28) 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키기 위한 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두의 용도가 제공된다.
또 다른 양태에 의해, 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두의 용도가 제공된다.
또 다른 양태에 의해, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하고, 이에 의해 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하기 위한 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두의 용도가 제공된다.
일부 실시형태에서, MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두는 MMP-2 억제제이다. 일부 실시형태에서, MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두는 MMP-13 억제제이다. 일부 실시형태에서, MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두는 MMP-2 억제제 및 MMP-13 억제제 둘 모두이다. 일부 실시형태에서, 둘 모두는 MMP-2를 억제하는 것 및 MMP-13을 억제하는 것의 2가지 억제제이다. 일부 실시형태에서, 둘 모두는 MMP-2 및 MMP-13 둘 모두를 억제하는 단일 억제제이다.
일부 실시형태에서, CD28은 포유동물 CD28이다. 일부 실시형태에서 CD28은 인간 CD28이다. 일부 실시형태에서, 인간 CD28은 아미노산 서열: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열번호: 1)을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 성숙한 CD28은 신호 펩티드를 결하고 서열: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열번호: 2)을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서, 전장 인간 CD28을 코딩하는 DNA 코딩 서열은 서열: ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA (서열번호: 3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD28은 sCD28이다. 일부 실시형태에서, CD28은 mCD28이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, sCD28은 막횡단 도메인을 포함하지 않고 따라서 막에 합체될 수 없는 임의의 CD28 단편 또는 변이체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD28 막횡단 도메인은 아미노산 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열번호: 4)를 포함한다. 일부 실시형태에서, sCD28은 막 결합되지 않는다. 일부 실시형태에서, sCD28은 용액 상태이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 혈액 내 CD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 TME 내 CD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 체액 내 CD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 막 CD28(mCD28)로부터의 절단 생성물이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 절단된 CD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 전장 CD28의 세포질 도메인을 결한다. 일부 실시형태에서, sCD28은 이량체 sCD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 단량체 sCD28이다. 일부 실시형태에서, sCD28은 CD28의 대안적 스플라이싱으로부터 발생하는 스플라이스 변이체가 아니다. 일부 실시형태에서, sCD28은 아미노산 서열: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열번호: 5)을 포함한다. 일부 실시형태에서, sCD28은 신호 펩티드를 결하고 서열: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열번호: 6)을 포함한다. 일부 실시형태에서, sCD28은 서열번호: 5로 구성된다. 일부 실시형태에서, sCD28은 서열번호: 6으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 프로테아제 활성을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 셰다제 활성을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2가 CD28에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2가 mCD28에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2에 특이적이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적"은 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두를 실질적으로 억제/결합하고 다른 프로테아제를 실질적으로 억제/결합하지 않는 억제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 이외의 임의의 프로테아제를 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2를 직접적으로 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 이외의 임의의 프로테아제에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 이외의 다른 프로테아제에 결합하지만 그들 다른 프로테아제를 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 비-억제는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하의 억제이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2와 ADAM 10 및 ADAM 17 중 적어도 하나에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2와 MMP-13, ADAM 10 및 ADAM 17 중 적어도 하나에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 및 MMP-13에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-2 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-2 유도된 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-2 매개된 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-2 절단은 CD28의 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서, P144 및 L145는 서열번호: 1의 것이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-2 절단은 서열번호: 1의 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-2 절단은 서열번호: 2의 P129와 L130 사이이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 프로테아제 활성을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 셰다제 활성을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13이 CD28에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13이 mCD28에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 이외의 임의의 프로테아제를 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13을 직접으로 억제한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 이외의 임의의 프로테아제에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 이외의 다른 프로테아제에 결합하지만 이들 다른 프로테아제를 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13과 ADAM 10 및 ADAM 17 중 적어도 하나에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13과 MMP-2, ADAM 10 및 ADAM 17 중 적어도 하나에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 및 MMP-9에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 ADAM10 또는 ADAM17을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13, MMP-2 및 MMP-9에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13, MMP-2 및 MMP-3에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-13 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-13 유도된 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 MMP-13 매개된 절단에 특이적이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-13 절단은 CD28의 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서, P144 및 L145는 서열번호: 1의 것이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-13 절단은 서열번호: 1의 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서, mCD28의 MMP-13 절단은 서열번호: 2의 P129와 L130 사이이다.
일부 실시형태에서, MMP-2 억제제만이 투여된다. 일부 실시형태에서, MMP-13 억제제만이 투여된다. 일부 실시형태에서, MMP-13 억제제가 아닌 MMP-2 억제제가 투여된다. 일부 실시형태에서, MMP-2 억제제가 아닌 MMP-13 억제제가 투여된다. 일부 실시형태에서, ADAM10 또는 ADAM17 억제제 어느 것도 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서, ADAM10 억제제는 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서, ADAM17 억제제는 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서, MMP-2 억제제만이 접촉된다. 일부 실시형태에서, MMP-13 억제제만이 접촉된다. 일부 실시형태에서, MMP-13 억제제가 아닌 MMP-2 억제제가 접촉된다. 일부 실시형태에서, MMP-2 억제제가 아닌 MMP-13 억제제가 접촉된다. 일부 실시형태에서, ADAM10 또는 ADAM17 억제제 어느 것도 접촉되지 않는다. 일부 실시형태에서, ADAM10 억제제는 접촉되지 않는다. 일부 실시형태에서, ADAM17 억제제는 접촉되지 않는다.
일부 실시형태에서, 억제는 적어도 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100% 억제이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 억제는 완전한 억제이다. 일부 실시형태에서, 억제는 차단이다. 일부 실시형태에서, 억제는 부분적 억제이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 소분자 억제제이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2의 소분자 억제제이다. MMP-2 억제제의 예는 ARP-100, 바티마스타트, 마리마스타트, 타노마스타트, 레비마스타트, 프리노마스타트, 및 네오바스타트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2의 모노클로날 항체 억제제이다. 항체-기반 MMP-2 억제제의 예는 DX-2400, SDS3 및 SDS4를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, MMP-2의 소분자 억제제는 ARP-100이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13의 소분자 억제제이다. MMP-13 억제제의 예는 CL82198 하이드로클로라이드, 4-N,6-N-비스[(4-플루오로-3-메틸페닐)메틸]피리미딘-4,6-디카르복사미드, 및 WAY170523을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13의 모노클로날 항체 억제제이다. 항체-기반 MMP-13 억제제의 예는 C-3 및 MM0019-12E10을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 및 MMP-13의 소분자 억제제이다. 양 단백질의 억제제의 예는 PD166793을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-9 및 MMP-13의 소분자 억제제이다. 양 단백질의 억제제의 예에 N-하이드록시-1-(4-메톡시페닐)술포닐-4-(4-비페닐카르보닐)피페라진-2-카르복사미드 및 3-[(하이드록시아미노)카르보닐]-4-[(4-메톡시페닐)술포닐]-1-피페라진카르복실산 페닐메틸 에스테르(204139-85-5)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 억제제는 소분자 범 MMP 억제제이다. 범-MMP 억제제의 예는 악티노닌, MMP 억제제 V, N'-하이드록시-N-[1-(메틸카르바모일)-3-페닐-프로필]-2-(2-메틸프로필)부탄디아미드 및 CP471474를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 ADAM10을 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 ADAM17을 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 ADAM10 또는 ADAM17을 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 ADAM 억제제가 아니다. 소분자 억제제 및 항체 억제제는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Santa Cruz Biotechnology에서 상업적으로 구입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 단편은 또 다른 단백질 또는 단백질의 단편에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 단백질 또는 단편은 반감기를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 반감기는 혈청 반감기이다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 단백질은 인간 혈청 알부민이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 반감기를 향상시키는 변형을 생성하는 화학물질에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 PEG화이고 화학물질은 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 PEG화된다. 당업자는 임의의 반감기 연장 단백질 또는 화학물질 작용제, 또는 당업계에 공지된 변형이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 단량체로서 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체로서 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체 및/또는 이량체로서 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체로서 결합하지만 mCD28을 가교 및/또는 활성화하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체로서 결합하지만, CD28의 단일 분자에만 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체성 CD28에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체성 CD28에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체성 및/또는 이량체성 CD28에 결합한다.
일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 효능제가 아니다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 길항제가 아니다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 효능제도 길항제도 아니다.
일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 리간드 결합 도메인에 대한 접근을 불명료하게 하거나 차단하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 절단 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 절단 부위에 대한 접근을 불명료하게 하거나, 폐색하거나 차단한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 절단 부위에 결합하거나, 차단하거나, 폐색하거나 또는 불명료하게 한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 절단 부위에 결합하지 않지만 부위를 폐색한다. 일부에서 억제제는 MMP-2 절단 부위에 대한 접근을 차단한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 절단 부위를 차단하는 것보다 입체 장애를 생성한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-2 절단 부위에 결합하지 않지만 억제제의 결합은 MMP-2 절단 부위를 차단하는 mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시형태에서, 억제제의 결합은 MMP-2 절단 부위를 차단하는 CD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 줄기 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 세포외 도메인에 결합하지만 줄기 도메인에는 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, MMP-2 절단 모티프는 PX1X2/X3(서열번호: 14)이고, 여기서 마지막 X3은 소수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, CD28의 PX1X2/X3 모티프는 PSP/L이다. 일부 실시형태에서, PX1X2/X3 모티프는 PSP/L(서열번호: 15)이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호: 1의 아미노산 142-145(PSPL)이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호: 2의 아미노산 127-130(PSPL)이다. 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 서열번호: 10의 아미노산 9-12(PSPL)이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 MMP-2이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 MMP-13이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 MMP-2 또는 MMP-13이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 MMP-2 및 MMP-13이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 절단 부위에 대한 프로테아제의 접근을 차단한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28의 줄기 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 절단 부위에 결합하거나, 차단하거나, 폐색하거나 또는 불명료하게 한다. 일부에서 억제제는 MMP-13 절단 부위에 대한 접근을 차단한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 절단 부위에 결합하지 않지만 부위를 폐색한다. 일부에서 억제제는 MMP-13 절단 부위에 대한 접근을 차단한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 절단 부위를 차단하는 것보다 입체 장애를 생성한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 MMP-13 절단 부위에 결합하지 않지만 억제제의 결합은 MMP-13 절단 부위를 차단하는 mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시형태에서, 억제제의 결합은 MMP-13 절단 부위를 차단하는 CD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 실시형태에서, MMP-13 절단 모티프는 PX1X2/X3(서열번호: 14)이고, 여기서 마지막 X3은 소수성 잔기이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 줄기 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 막 근위 영역에 결합한다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호: 7)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열 KGKHLCPSPLFPGPS (서열번호: 8)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열 KGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호: 9)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 10)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열번호: 7로 구성된다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열번호: 8로 구성된다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열번호: 9로 구성된다. 일부 실시형태에서, 줄기 영역은 서열번호: 10으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체성 sCD28에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체성 sCD28에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체성 sCD28, 이량체성 sCD28 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단량체성 sCD28에 결합하지만 이량체성 sCD28에는 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 이량체성 sCD28에 결합하지만 단량체성 sCD28에는 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 sCD28에 결합하지 않는다.
mCD28에 결합하는 억제제의 예는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩티드 및 DARPin을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩티드 및 DARPin으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 억제제는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 특이적 결합을 갖는 펩티드로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 억제제는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 나노바디이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 VHH 항체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 VNAR이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 낙타류 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 상어 항체이다. 본 명세서에 사용된 용어 "단일 도메인 항체" 및 "나노바디"는 동의어이고 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 CD28에 대한 특이적 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28에 특이적 결합을 갖는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 항체, 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일-도메인 항체, 나노바디, VHH 항체, VNAR 및 항체 모방체로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체 모방체"는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 유기 화합물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 항체와 구조적으로 관련되지 않는다. 항체 모방체의 예는 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디 및 nanoCLAMPS를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 DARPin이다. 이들 작용제 모두는 당업계에 잘 알려져 있고 단백질-단백질 상호작용, 예를 들어 수용체와 그 리간드 사이의 상호작용을 차단하는데 유용한 것으로 알려져 있다. mCD28에 결합할 수 있는 소분자 및 단백질은 절단 부위를 폐색하거나 프로테아제에 대한 접근을 방해하거나 손상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체 모방체이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체 모방체"는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 유기 화합물을 지칭한다 "DARPin"은 설계된 안키린 반복 단백질을 지칭한다. DARPin은 일반적으로 그의 단백질 표적에 대해 고도로 특이적인 유전적으로 조작된 항체 모방체 단백질이다. 따라서, CD28에 대한 DARPin은 작용제의 일 예가 될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 항원의 항원 결정기의 특징에 상보적인 내부 표면 형상 및 전하 분포를 갖는 3-차원 결합 공간을 갖는 폴리펩티드 사슬의 접힘으로부터 형성된 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 군을 지칭한다. 항체는 전형적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬의 쌍을 포함하는 4량체 형태를 가지며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"를 갖는다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 올리고클로날, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 카멜화, CDR-그라프팅, 다중-특이적, 이중-특이적, 촉매적, 인간화, 완전 인간, 항-유전자형일 수 있고, 가용성 또는 결합된 형태뿐만 아니라, 단독으로 또는 다른 아미노산 서열과 조합하여 에피토프-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 단편에 표지될 수 있는 항체일 수 있다. 항체는 모든 종에서 유래할 수 있다. 용어 항체는 또한 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 단일 가닥 항체(svFC), 이량체 가변 영역(Diabody) 및 이황화물-연결된 가변 영역(dsFv)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 항체 단편은 Fc 영역 또는 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 면역글로불린 도메인에 융합되거나 융합되지 않을 수 있다. 당업자는 scFv-Fc 융합체, 가변 영역(예를 들어, VL 및 VH)~Fc 융합체 및 scFv-scFv-Fc 융합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 융합체 생성물이 생성될 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG2 또는 IgG4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG4를 포함한다.
자연적으로 발생하는 항체 구조의 기본 단위는 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질 복합체로, 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되며, 비공유 결합 및 이황화 결합 둘 모두에 의해 함께 연결된다. 각각의 중쇄 및 경쇄에는 또한 규칙적으로 이격된 사슬-내 이황화 다리가 있다. 5개 인간 항체 부류(IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)가 존재하고, 이들 부류, 다양한 하위부류 내에서, 단일 항체 분자 내 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위의 이황화 다리 구조, 및 사슬 길이와 서열에서 차이와 같은 구조적 차이에 기반하여 인식된다. 항체의 부류 및 하위부류는 그 이소타입이다.
중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 영역은 카르복시 말단 영역보다 서열이 더 다양하므로 가변 도메인으로 명명된다. 항체 구조의 이 부분은 항체의 항원-결합 특이성을 부여한다. 중가변(VH) 도메인과 경가변(VL) 도메인이 함께 단일 항원-결합 부위를 형성하므로 기본 면역글로불린 단위는 2개의 항원-결합 부위를 갖는다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다(Chothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-63 (1985); Novotny and Haber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4592-4596).
중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단 부분은 불변 도메인, 즉 CH1, CH2, CH3, CL을 형성한다. 이들 도메인에서 다양성은 훨씬 적지만 동물 종마다 차이가 있고, 더 나아가 동일한 개체 내에서 각각 다른 기능을 갖는 여러 가지 다른 이소타입의 항체가 있다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 본 명세서에 정의된 초가변 영역 아미노산 잔기 이외의 것인 항체의 가변 도메인 내의 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 가변 도메인 내 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. FR 및 CDR의 범위는 정확하게 정의되었다(Kabat et al. 참조).
면역글로불린 가변 도메인은 또한 CDR을 포함하는 가변 영역 세그먼트를 동정하기 위해 IMGT 정보 시스템(www://imgt. cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, Brochet, X. et al, Nucl. Acids Res. J6:W503-508 (2008)을 참고한다.
Chothia 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의했다. 당업자는 서열 자체를 넘어서 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 도메인 서열에 "Chothia 넘버링"의 이 시스템을 모호하지 않게 할당할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "Chothia 넘버링"은 Chothia et al., Journal of Molecular Biology, "Canonical Structures for the Hypervariable regions of immunoglobulins" (1987) 및 Chothia et al., Nature, "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions" (1989)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간화된 항체"는 인간 항체에 대한 유사성을 증가시키도록 단백질 서열이 변형된 비-인간 종의 항체를 지칭한다. 인간화된 항체는 인간 항체와 유사한 서열로 둘러싸인 비-인간 항체의 CDR에 대해 코딩하는 재조합 DNA의 생산에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 인간화는 인간 항체 스캐폴드 또는 백본 내로 발명의 CDR의 삽입을 포함한다. 인간화된 항체는 당업계에 잘 알려져 있고, 발명의 CDR을 보유하는 것을 생산하는 임의의 방법이 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상 단일 결정인자에 대해 지향된다. 모노클로날항체는 그 특이성 외에도 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 이점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고 임의의 특정 제조 방법에 의해 생성되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 제공된 방법에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler et al, Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류의 것일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다. mAb의 높은 역가는 개별 하이브리도마로부터의 세포를 원래의 프라이밍된 Balb/c 마우스 안으로 복강내로 주사하여 원하는 mAb의 고농도를 함유하는 복수액을 생성하는 생체내 생산에서 얻어질 수 있다. 이소타입 IgM 또는 IgG의 mAb는 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 이러한 복수액으로부터 또는 배양 상등액으로부터 정제될 수 있다.
"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디(taDb), 선형 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 원-아암의 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-사슬 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, Db- Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv 또는 탠덤 (di,tri)-scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 및 이중-특이적 T-세포 인게이저(BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 단리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 하는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 쉽게 결정화하는 그 능력을 반영하는 이름의 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비-공유 연관에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이 구성에서 VH-VL 이량체의 세 표면이 있다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올 기를 담지하는 Fab'에 대한 본 명세서에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다라고 하는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 온전한 항체의 5가지 주요 부류인: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇 가지는 하위부류(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분할될 수 있다. 다른 부류의 항체에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 a, 델타, e, 감마 및 마이크로로 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3-차원 배열은 잘 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시형태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토에 대해서는 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)를 참고한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH - VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이에 페어링을 허용하지 않음으로써 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디 생산은 당업계에 공지되어 있고 Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 기술되어 있다.
용어 "다중특이성 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로는 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 커버한다. 이러한 다중특이성 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체로, 여기서 VHVL 단위는 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 둘 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이성 디아바디, 트리아바디, 삼중-기능 항체, 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예는 Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)에서의 것들과 같은 다양한 기술을 포함한다.
생체내에서 항체를 생성하는 통상적인 방법 외에, 항체는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 이러한 재조합 항체의 생산은 통상적인 항체 생산에 비해 훨씬 빠르고 엄청난 수의 항원에 대해 생산할 수 있다. 더욱이, 통상적인 방법을 사용할 때 많은 항원이 비-면역원성이거나 극도로 독성이 있는 것으로 판명되고 따라서 동물에서 항체를 생성하는 데 사용될 수 없다. 더욱이, 재조합 항체의 친화도 성숙(즉, 친화도 및 특이성 증가)은 매우 간단하고 비교적 빠르다. 마지막으로, 특정 항원에 대한 많은 수의 서로 다른 항체가 하나의 선택 절차에서 생성될 수 있다. 재조합 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 디스플레이 라이브러리를 기반으로 하는 모든 다양한 방법을 사용하여 상이한 항원 인식 부위를 갖는 대규모 항체 풀을 생성할 수 있다. 이러한 라이브러리는 여러 가지 방법으로 만들 수 있다: 하나는 중쇄 생식계열 유전자의 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하고 따라서 다양한 특이성을 가진 재조합 항체 단편이 선택될 수 있는 큰 항체 레퍼토리를 생성함에 의해 합성 레퍼토리를 생성할 수 있다. 하나는 항체 라이브러리의 구축을 위한 출발 물질로 인간의 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 순수 레퍼토리를 구축하고 따라서 큰 다양성의 인간 라이브러리를 만드는 것이 가능하다. 이 방법은 다른 항원에 대한 다수의 항체를 선택하는 데 성공적으로 널리 사용되었다. 박테리오파지 라이브러리 구성 및 재조합 항체의 선택을 위한 프로토콜은 잘-알려진 참조 텍스트인 Current Protocols in Immunology, Colligan et al (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1에 제공되어 있다.
비-인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 한 방법에서, 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 항체 또는 공통 항체 프레임워크 서열 안으로 삽입된다. 그런 다음 항체 프레임워크 안으로 추가 변화를 도입하여 친화성 또는 면역원성을 조절할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 및 그의 부분은 항체, 항체의 단편, Fab 및 F(ab')2, 단일-도메인 항원-결합 재조합 단편 및 천연 나노바디를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFV 또는 scFV2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 경쇄 또는 중쇄와 같은 전체 면역글로불린 분자 사슬을 인코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하며, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직하다.
폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편 예컨대 단일 도메인 항체("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 CHI 및 CK를 포함하거나 또는 CL 도메인은 절단되었다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 임상/진단 용도에서 더 나은 조직 침투를 달성해야 하지만 2가이므로 dAb와 같은 1가 항체 단편보다 더 높은 결합 친화성을 유지해야 한다. 따라서, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포괄한다. 인코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용체 프레임워크에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용체 프레임워크 영역에 비해 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개시된 단백질 생성물을 포함하는 개별 아미노산의 특성을 감안할 때, 일부 합리적인 치환은 숙련된 작업자에 의해 인식될 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다.
적합하게는, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에 사용된 용어 "비-자연적으로 발생하는" 물질, 조성, 개체, 및/또는 물질, 조성 또는 개체의 임의의 조합, 또는 이의 문법적 변형은 명시적으로 배제하는 조건부 용어이지만, 단지 해당 분야의 숙련가가 "자연적으로-발생하는" 것으로 잘 이해되거나, 또는 판사나 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연적으로-발생하는" 것으로 언제든지 결정되거나 해석될 수 있는 물질, 조성, 개체 및/또는 물질, 조성 또는 개체의 모든 조합의 형태는 제외한다.
일부 실시형태에서, sCD28 수준 감소는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 또는 99%까지이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, sCD28 수준 감소는 건강한 개체의 것에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50ng/mL로 감소시킨다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 혈액 수준을 최대 5ng/mL로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 혈액 수준을 최대 10ng/mL로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 혈액 수준을 최대 20ng/mL로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 건강한 개체의 수준으로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50ng/mL 미만으로 감소시킨다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 5ng/mL 미만으로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 10ng/mL 미만으로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감소는 sCD28 수준을 20ng/mL 미만으로 감소시킨다.
일부 실시형태에서, sCD28 수준은 대상체에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 대상체의 혈액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 축소 또는 감소는 대상체의 혈액, 말초혈 또는 TME에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 축소 또는 감소는 혈액에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 축소 또는 감소는 말초 혈액에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 축소 또는 감소는 TME에서 발생한다.
일부 실시형태에서, sCD28 수준은 ELISA에 의해 측정된 바와 같다. 일부 실시형태에서, ELISA는 샌드위치 ELISA이다. 일부 실시형태에서, ELISA는 표준화된 샌드위치 ELISA이다. 일부 실시형태에서, ELISA는 Bender MedSystems ELISA이다. 일부 실시형태에서, ELISA는 Bender MedSystems ELISA 키트 BMS290이다. 일부 실시형태에서, ELISA는 발명의 작용제로 수행된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질분해 절단 감소, 쉐딩 감소 및 절단 감소는 모두 동의어로 사용되고 mCD28의 단백질분해 절단에서의 임의의 축소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 감소는 억제이다. 일부 실시형태에서, 감소는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100%의 절단에서의 감소이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 세포 상에 mCD28의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 세포 상에 mCD28의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단을 억제하하는 것은 면역 세포 상에 mCD28 수준이 증가한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역 세포 상에 mCD28의 수준을 증가한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단을 억제하는 것은 면역-자극에 적합한 mCD28의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 대상체에 있다.
일부 실시형태에서, 쉐딩 감소는 세포의 표면으로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 세포는 mCD28을 발현하는 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 기능 및/또는 시그널링을 조절하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 기능 및/또는 시그널링을 감소시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 기능 및/또는 시그널링을 증가시킨다. 당업자는 면역 세포 상의 mCD28의 양을 증가시킴에 의해 세포에서의 CD28 시그널링이 증가될 것임을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 시그널링에서 증가는 간접적인 증가이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 기능 및/또는 시그널링을 직접적으로 증가시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 효능제가 아니고 절단의 억제는 세포에서 CD28 시그널링을 증가시키는 세포 표면 상의 mCD28 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28을 분해하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28 분해를 유도하거나 촉진하지 않는다. 일부 실시형태에서, 시그널링은 mCD28-매개된 면역 세포 활성화이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 면역 세포 활성화를 억제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 억제제는 CD28 수용체 내재화 또는 재순환을 유도하지 않는다. mCD28을 통한 공동-자극은 T-세포의 면역 활성화에 필수적이다. 단백질분해 절단은 CD28의 세포외 영역 내 리간드-결합 도메인을 막에 남아 있는 단백질의 막횡단 및 세포질 부분에서 제거했다. 따라서, 절단된 CD28은 신호를 보낼 수 없고 T 세포 활성화에 기여할 수 없다. 따라서, 절단을 차단하고 길항제이기도 한 작용제는 mCD28 활성화를 허용하지 않는다. 유사하게, 절단을 차단하지만 또한 효능제이기도 한 작용제는 비정상적인 T-세포 활성화 및 잠재적으로 자가면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제제는 항-CD28 항체 MAB342가 아니다. 일부 실시형태에서, 억제제는 항-CD28 항체 클론 #37407이 아니다.
일부 실시형태에서, 억제제는 면역 세포 상의 mCD28의 표면 수준을 감소시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 mCD28의 표면 수준을 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7, 5, 3, 2 또는 1% 미만만큼 감소시킨다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 PD-1 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 PD-L1 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, PD-1/PD-L1 기반 면역요법은 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 요법은 PD-1 체크포인트의 차단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 CD80 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 CD86 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 대상체에게 동종이계, 동계 또는 자가 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역요법이 필요한 대상체는 암을 앓고 있다.
본 명세서에 사용된 용어, 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "치료하는"은 이의 적어도 하나의 증상의 완화, 이의 중증도의 감소, 또는 이의 진행의 억제를 포괄한다. 치료가 질환, 장애 또는 병태가 완전히 치유되었음을 의미할 필요는 없다. 효과적인 치료가 되기 위해, 본 명세서에서 유용한 조성물은 질환, 장애 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 이와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나, 환자 또는 대상체의 삶의 질에 개선을 제공하기만 하면 된다.
일부 실시형태에서, 감소는 발명의 적어도 하나의 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "투여하는", "투여" 및 유사한 용어는 건전한 의료 관행에서 치료적 효과를 제공하는 방식으로 활성 작용제를 함유하는 조성물을 대상체에게 전달하는 임의의 방법을 지칭한다. 본 주제의 일 양태는 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적으로 유효한 양의 발명의 작용제의 경구 투여를 제공한다. 다른 적절한 투여의 경로는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 감소는 CD28의 MMP-2 결합 또는 절단 모티프를 포함하는 펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 단량체성이다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 이량체성이다. 일부 실시형태에서, CD28은 인간 CD28이다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 절단 부위에 대한 프로테아제의 접근을 억제한다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 절단 부위를 차단하는 자가항체의 생성을 유도한다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 서열 PSPL을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 서열 PSPL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 감소 이전의 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수준은 건강한 대상체의 수준 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서, 대상체의 sCD28 수준은 적어도 건강한 대상체 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 초과만큼 상승된다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 수준은 혈액 중 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng/mL 초과로 상승된다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 수준은 5ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서, 수준은 10ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서, 수준은 20ng/mL 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 혈액의 mL당 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng sCD28을 포함한다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 감소 이전 대상체의 혈액은 혈액의 mL당 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng sCD28을 포함한다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 적어도 5ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 적어도 10ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 적어도 20ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 감소 이전 대상체의 혈액은 적어도 5ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 감소 이전 대상체의 혈액은 적어도 10ng/mL sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 감소 이전 대상체의 혈액은 적어도 20ng/mL sCD28을 포함한다.
일부 실시형태에서 대상체의 혈액은 건강한 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 상승된 수준을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체의 혈액은 혈액의 mL당 최대 0, 1, 2, 3, 4 또는 5ng sCD28을 포함한다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체 혈액은 5ng/mL 미만의 sCD28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체 혈액은 2ng/mL 미만의 sCD28을 포함한다. 대상체의 혈액에 상승된 sCD28이 없을 때 MMP-2/MMP-13 억제제의 투여는 방지적 또는 예방적 조치인 것으로 이해될 것이다. 이러한 예방적 조치는 암이 없는 대상체, 암을 앓고 있지만 sCD28 수준이 상승하지 않은 대상체, 암 퇴행에 있는 대상체 및 다른 암 요법을 동시에 받고 있는 대상체에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 암은 PD-1/PD-L1 요법으로 치료될 수 있는 암이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법을 받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대한 비-반응자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대해 순수하다. 일부 실시형태에서, 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법과 함께 수행된다. 일부 실시형태에서, 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법 전에 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 또 다른 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 또 다른 면역요법은 체크포인트 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 및/또는 PD-L1 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 일부 실시형태에서, 또 다른 면역요법은 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 면역요법이다. 일부 실시형태에서, CAR은 CAR-T이다. 일부 실시형태에서, CAR은 CAR-NK이다. 일부 실시형태에서, 또 다른 면역요법은 암 백신이다.
본 명세서에 사용된 용어 "CAR-T 세포" 및 "CAR-NK 세포"는 적어도 하나의 관심있는 단백질(예를 들어, 후성유전학적 변형 작용제로 처리한 후 증가된 발현을 갖는 면역원성 단백질)에 대해 특이성을 갖고 면역 이펙터 세포(T 세포 또는 NK 세포) 상에 그라프팅된 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR-T 세포는 T-세포 상에 그라프팅된 모노클로날 항체의 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAR-NK 세포는 NK-세포 상에 그라프팅된 모노클로날 항체의 특이성을 갖는다.일부 실시형태에서, T 세포는 세포독성 T 림프구 및 조절 T 세포로부터 선택된다.
CAR-T 및 CAR-NK 세포 및 이의 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 세포는 수용체가 결합하는 단백질을 표적으로 하고 이에 대해 세포독성이다. 일부 실시형태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 적어도 하나의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 실시형태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 복수의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 실시형태에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 후성유전학적 변형 작용제와의 접촉으로 인해 증가된 발현을 갖는 바이러스 단백질을 표적화한다.
CAR-T 세포의 구축은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 바이러스 단백질에 대한 모노클로날 항체가 만들어질 수 있고, 그 다음 항체를 코딩하는 벡터가 작제될 것이다. 벡터는 또한 공동자극 신호 영역을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 공동자극 신호 영역은 공지된 T 세포 또는 NK 세포 자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다: CD3Z, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD 7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드. 일부 실시형태에서, 벡터는 또한 CD3Z 시그널링 도메인을 포함한다. 그런 다음 이 벡터는, 예를 들어, 렌티바이러스 감염에 의해 T-세포 안으로 형질감염된다.
일부 실시형태에서, 암은 상승된 sCD28 수준을 갖는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 상승된 sCD28 수준을 특징으로 하는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상승된 및/또는 높은 sCD28 수준은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100ng/mL이고/이거나 그 초과인 수준이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상승된 및/또는 높은 sCD28 수준은 건강한 대상체에서의 수준의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000%이고/이거나 그 초과인 수준이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암이 아니다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 요로상피암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 및 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 요로상피암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암 및 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 요로상피암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 또는 결장직장암이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 방법은 생체내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 생체외에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 감소는 생체내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 감소는 시험관내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 감소는 생체외에서 수행된다.
또 다른 양태에 의해, 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법 및/또는 CD80 및/또는 CD86 기반 면역요법을 받기에 적합하지 않은 대상체를 적합하게 만드는 방법이 제공되며, 상기 방법은 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 적합하지 않은 대상체에게 투여함에 의해 이들을 적합하게 만드는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법 및/또는 CD80 및/또는 CD86 기반 면역요법을 받기에 적합하지 않은 대상체를 적합하게 만들기 위한 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두의 용도가 제공된다.
일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 방법을 수행함에 의해 적합하지 않은 대상체를 적합하게 만드는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법을 받기에 적합하지 않다. 일부 실시형태에서, 대상체는 CD80 및/또는 CD86 기반 면역요법을 받기에 적합하지 않다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체를 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법을 받기에 적합하게 만드는 방법이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체를 CD80 및/또는 CD86 기반 면역요법을 받기에 적합하게 만드는 방법이다.
일부 실시형태에서, 적합하지 않은 대상체는 상승된 sCD28 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서 상승된 수준은 건강한 대상체에서의 수준 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서 상승된 수준은 미리 결정된 역치에서의 수준 초과로 상승된다. 일부 실시형태에서, 상승된 수준은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng/mL 초과의 sCD28 수준이다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng/mL 초과의 sCD28 수준은 대상체가 치료되기에 적합하지 않다는 것을 나타낸다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 10ng/mL 초과의 sCD28 수준은 대상체가 치료되기에 적합하지 않다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 20ng/mL 초과의 sCD28 수준은 대상체가 치료되기에 적합하지 않다는 것을 나타낸다.
CD80 및 CD86 면역요법은 당업계에 잘 알려져 있고 면역 반응을 자극하기 위해 CD80/CD86 및/또는 이의 모의체, 유도체 또는 모방체를 투여하는 것을 포함한다. CD80-Fc는 현재 비-제한적인 예로 항암 면역치료제로서 임상 시험 중에 있다.
일부 실시형태에서, 미리결정된 역치를 초과하는 sCD28의 수준은 대상체가 발명의 방법으로 치료하기에 적합하다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 미리결정된 역치를 초과하는 sCD28의 수준은 대상체가 조합된 면역요법 및 발명의 방법에 적합하다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암이 발병할 위험이 있다.
또 다른 양태에 의해, 발명의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제의 수득; 및
b. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제의 능력의 시험 및 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제의 선택
을 포함하고, 이에 의해 발명의 작용제를 제조하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 발명의 작용제를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포의 배양을 포함하되, 여기서 핵산 서열은
i. CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제의 수득;
ii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제 능력의 시험; 및
iii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제의 선택;
에 의해 선택된 작용제의 핵산 서열인 것이고, 이에 의해 발명의 작용제를 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 작용제는 항-절단 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항-쉐딩 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 대상체에서 sCD28의 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 작용제는 mCD28의 절단을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 작용제는 대상체에서 mCD28의 절단을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 시험은 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제의 능력을 시험하는 것이다. 일부 실시형태에서, 시험은 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제의 능력을 시험하는 것이다 일부 실시형태에서, 시험은 MMP-2 및 MMP-13 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 작용제의 능력을 시험하는 것이다. 일부 실시형태에서, 선택은 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것이다. 일부 실시형태에서, 선택은 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것이다. 일부 실시형태에서, 선택은 MMP-2 및 MMP-13 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것이다.
일부 실시형태에서, MMP-2에 의한 절단은 줄기 도메인에 있다. 일부 실시형태에서, MMP-2에 의한 절단은 MMP-2 절단 모티프에 있다. 일부 실시형태에서, 절단 모티프는 PXX/X(서열번호: 14)이고, 여기서 마지막 X는 소수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, CD28에서 절단 모티프는 PSP/L이다. 일부 실시형태에서, MMP-2에 의한 절단은 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서 P144 및 L145는 서열번호: 1의 것이다. 일부 실시형태에서, MMP-2에 의한 절단은 서열번호: 2의 P129와 L130 사이이다.
일부 실시형태에서, MMP-13에 의한 절단은 줄기 도메인에 있다. 일부 실시형태에서, MMP-13에 의한 절단은 MMP-13 절단 모티프에 있다. 일부 실시형태에서, 절단 모티프는 PXX/X(서열번호: 14)이고, 여기서 마지막 X는 소수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, CD28에서 절단 모티프는 PSP/L이다. 일부 실시형태에서, MMP-13에 의한 절단은 P144와 L145 사이이다. 일부 실시형태에서 P144 및 L145는 서열번호: 1의 것이다. 일부 실시형태에서, MMP-13에 의한 절단은 서열번호: 2의 P129와 L130 사이이다.
본 명세서에 사용된 용어 "CD28의 세포외 도메인"은 막횡단 도메인 앞에 오는 CD28의 N-말단 부분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인은 sCD28이다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인은 CD28 줄기 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인은 CD28의 줄기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인은 서열 NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호: 11)을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편은 이량체성이다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편은 단량체성이다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편은 이량체성 또는 단량체성이다.
본 명세서에 사용된 "단편"은 더 큰 단백질 또는 단백질 도메인의 일부를 구성하는 부분 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단편은 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단편은 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, CD28의 세포외 도메인의 단편에 결합하는 작용제를 수득하는 것은 CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제를 수득하는 것이다. 일부 실시형태에서, CD28 세포외 도메인을 결합하는 것은 CD28 세포외 도메인의 특이적 결합이다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 임의의 다른 표적이 아닌 CD28의 결합이다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 임의의 다른 표적을 실질적으로 결합하는 것이 아닌 CD28의 결합이다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 CD28을 결합하는 것이고 임의의 다른 표적의 절단을 차단하지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 수득된 작용제의 존재에서 mCD28 다운스트림 시그널링을 검정하는 것 및 mCD28 시그널링을 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택은 mCD28 시그널링을 길항하지 않는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것이다. 암 치료의 경우 CD28 시그널링을 작용화하는 것은 해롭지 않을 수 있지만 시그널링을 길항하는 것은 역효과를 낳는다는 것이 숙련된 기술자에 의해 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포의 표면 상의 mCD28에 대한 결합을 검정하는 것 및 세포 표면 상의 mCD28에 결합하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 결합이 검정된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 결합은 가용성 펩티드에 대한 결합이 아니다.
일부 실시형태에서, 절단을 차단하는 작용제의 능력을 시험하는 것은 작용제, 프로테아제 및 절단 부위를 포함하는 CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편의 혼합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험은 절두 및/또는 절단을 확인하기 위해 CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편을 서열화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험은 절단으로 인한 크기 변화를 측정하기에 충분하게 민감한 겔 상에서 CD28의 세포외 도메인 또는 그의 단편을 실행하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험은 작용제 및 프로테아제의 존재에서 mCD28을 발현하는 세포로부터 sCD28의 생산을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 숙주 세포로부터 작용제를 단리 및/또는 추출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 숙주 세포의 배양 배지로부터 작용제를 단리 및/또는 추출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 작용제를 정제하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 작용제를 수득하는 것은 유기체를 CD28 세포외 도메인 또는 그의 단편으로 면역화하고, 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유기체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 토끼, 마우스, 랫트, 상어, 낙타과, 닭, 염소 및 파지로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 낙타과는 낙타, 알파카 및 라마로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 수집은 채혈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수집은
a. 면역화된 유기체의 비장으로부터 B 세포의 추출;
b. 추출된 B 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 생산; 및
c. 하이브리도마로부터 항체 수집을 포함한다.
일부 실시형태에서, 작용제를 얻는 것은 CD28 세포외 도메인 또는 그의 단편에 결합하기 위한 작용제의 라이브러리를 스크리닝하고 그렇게 결합하는 작용제를 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 비장 B 세포로부터 유래된 면역화된 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 IgG 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 Fab 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 VHH 항체의 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 단일 사슬, 단일 도메인 또는 나노바디의 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 작용제를 얻는 것은 작용제를 서열화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제를 얻는 것은 작용제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제를 선택하는 것은 작용제를 서열화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제를 선택하는 것은 작용제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 형태는 작용제의 서열로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 방법은 작용제를 인간화하는 것을 추가로 포함한다.
세포 내에서 작용제를 인코딩하는 핵산 분자를 발현시키는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 많은 방법 중에서 형질감염, 바이러스 감염 또는 세포 게놈의 직접적인 변경을 통해 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터에 있다. p16-Ink4a를 함유하는 발현 벡터의 한 가지 그러한 예는 Addgene으로부터 이용가능한 포유동물 발현 벡터 pCMV p16 INK4A이다.
벡터 핵산 서열은 일반적으로 세포에서 증식을 위한 적어도 복제의 기점 및 선택적으로 추가 요소, 예컨대 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리-아데닌 서열을 함유한다.
벡터는 비-바이러스 방법 또는 바이러스 방법을 통해 전달된 DNA 플라스미드일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포에서 활성일 수 있다. 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 작용제를 인코딩하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 관심있는 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 안으로 도입될 때 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소 또는 요소들에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 전기천공법(예를 들어, From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)에 기재된 바와 같음), 열 쇼크, 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내에서 또는 표면 상의 핵산으로 작은 입자에 의한 고속 탄도 침투(Klein et al., Nature 327. 70-73 (1987)) 및/또는 등을 포함하는 표준 방법에 의해 세포 내로 도입된다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제, 즉 RNA 폴리머라제 II에 대한 개시 부위 주위에 클러스터링된 전사 제어 모듈의 그룹을 지칭한다. 프로모터는 각각 대략적으로 7-20bp의 DNA로 구성되고 전사 활성화인자 또는 억제인자 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유하는 별개의 기능 모듈로 구성된다.
일부 실시형태에서, 핵산 서열은 RNA 폴리머라제 II(RNAP II 및 Pol II)에 의해 전사된다. RNAP II는 진핵 세포에서 발견되는 효소이다. 그것은 mRNA의 전구체와 대부분의 snRNA 및 microRNA를 합성하기 위해 DNA의 전사를 촉매한다.
일부 실시형태에서, 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3, pcDNA3.1(±), pGL3, pZeoSV2(±), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81로, Invitrogen에서 이용가능한 것, pCI로, Promega에서 이용가능한 것, pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV로, Strategene에서 이용가능한 것, pTRES로 Clontech에서 이용가능한 것 및 그 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 레트로바이러스와 같은 진핵 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터가 본 발명에 의해 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤어라인 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 다면체 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시 하에 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 측면 감염 및 표적화 특이성과 같은 이점을 제공하는 재조합 바이러스 벡터가 생체내 발현에 사용된다. 일 실시형태에서, 측면 감염은 예를 들어 레트로바이러스의 생활 주기에 내재되어 있고 단일 감염된 세포가 주변 세포를 싹트게 하고 감염시키는 많은 자손 비리온을 생성하는 과정이다. 일 실시형태에서, 그 결과는 대부분이 초기에 원래의 바이러스 입자에 의해 감염되지 않은 넓은 영역이 빠르게 감염된다는 것이다. 일 실시형태에서, 측면으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터가 생성된다. 일 실시형태에서, 이 특성은 원하는 목적이 특정 유전자를 단지 국소화된 수의 표적 세포 안으로 도입하는 것인 경우에 유용할 수 있다.
다양한 방법을 사용하여 본 발명의 발현 벡터를 세포 안으로 도입할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있고, 예를 들어, 안정 또는 일시적 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터로의 감염을 포함한다. 부가하여, 양성-음성 선택 방법에 대한 미국 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992를 참고한다.
삽입된 코딩 서열(폴리펩티드를 인코딩함)의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 것 외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 폴리펩티드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하도록 조작된 서열을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
또 다른 양태에 의해, 발명의 방법에 의해 생성된 작용제가 제공된다.
또 다른 양태에 의해, 발명의 방법에 의해 생성된 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 투여는 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "담체", "부형제" 또는 "보조제"는 활성 작용제가 아닌 약학적 조성물의 임의의 성분을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 무-독성, 불활성 고체, 반-고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 유형의 제형 보조제, 또는 단순히 염수와 같은 멸균 수성 배지를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당, 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아, 젤라틴, 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르, 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원-없는 물; 등장 식염수, 링거 용액; 에틸 알코올 및 인산염 완충 용액, 뿐만 아니라 약학적 제형에 사용되는 기타 비-독성 호환가능한 물질이다. 본 명세서에서 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 비-제한적인 예는 설탕, 전분, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 분말 트라가칸트, 맥아, 젤라틴, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 설페이트, 식물성 오일, 폴리올, 알긴산, 발열원-없는 물, 등장 식염수, 인산염 완충 용액, 코코아 버터(좌약 기제), 유화제 뿐만 아니라 기타 약학적 제형에 사용되는 기타 비-독성 호환가능한 물질을 포함한다. 라우릴황산나트륨과 같은 습윤제 및 윤활제 뿐만 아니라 착색제, 향미제, 부형제, 안정제, 항산화제 및 방부제가 또한 존재할 수 있다. 임의의 비-독성, 불활성 및 효과적인 담체를 사용하여 본 명세서에서 고려되는 조성물을 제형화할 수 있다. 이와 관련하여 적합한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 The Merck Index, Thirteenth Edition, Budavari et al., Eds., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (2001); CTFA (Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Tenth Edition (2004); 및 "Inactive Ingredient Guide," U.S. Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Office of Management에 기술된 것들과 같이, 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이 모든 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 조성물에 유용한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및 희석제의 예는 증류수, 생리식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크액 및 DMSO를 포함한다. 이들 추가의 불활성 성분, 뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당업계에 잘 알려져 있고 Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Gilman et al. Eds. Pergamon Press (1990); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., (2005)와 같은 표준 교과서에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 현재 기재된 조성물은 또한 리포솜, ISCOMS, 서방성 입자, 및 혈청에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 기타 비히클과 같은 인공적으로 생성된 구조에 함유될 수 있다. 리포솜은 에멀젼, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함한다. 현재 기술된 펩티드와 함께 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 리포솜 크기 및 혈액 내 안정성과 같은 고려사항에 의해 결정된다. 예를 들어, Coligan, J. E. et al, Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., New York에 의해 검토된 바와 같이 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하고, 또한 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369를 참고한다.
담체는 본 명세서에 제시된 약학적 조성물의 중량 기준으로 통틀어 약 0.1% 내지 약 99.99999%을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 의해, 발명의 방법에 의해 생성된 적어도 하나의 작용제, 또는 발명의 약학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 발명의 방법에 의해 생성된 작용제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제와 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료제가 발명의 방법에 의해 생성된 작용제 또는 약학적 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 발명의 작용제를 검출하기 위한 검출 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 분자는 2차 검출 분자이다. 일부 실시형태에서, 검출 분자는 작용제에 결합한다. 검출 분자는 당업계에 잘 알려져 있고, 형광 부분 및 분자, 염료, 및 2차 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에 의해, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제가 발명의 방법에 의해 생성된 작용제 또는 약학적 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함하는, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역치료제를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 발명의 키트는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 발명의 키트는 진단 키트이다. 일부 실시형태에서, 발명의 키트는 혈청 수준 결정을 필요로 하는 대상체에서 sCD28의 혈청 수준을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 발명의 키트는 발명의 작용제 또는 약학적 조성물로 치료될 대상체의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 항-PD-1/PD-L1 기반 면역요법으로 치료될 대상체의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 값과 조합될 때 기준 값의 플러스 및 마이너스 10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000나노미터(nm)의 길이는 1000nm+-100nm의 길이를 지칭한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 다수의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하고 "폴리펩티드"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 폴리펩티드 및 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 따라서, 이 진술은 청구항 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등의 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 작용하는 것으로 의도된다.
"A, B, C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관습이 사용된 이들 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업계에서 숙련자가 관례를 이해할 수 있는 의미에서 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B, C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다). 상세한 설명, 청구범위, 또는 도면에 있든지 간에 둘 이상의 대안적인 용어를 제시하는 실질적으로 임의의 분리 단어 및/또는 구는 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나 또는 용어 둘 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 기술 내에서 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
명료함을 위해 별도의 실시형태의 맥락에서 설명된 발명의 특정 특징은 단일 실시형태에서 조합하여 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시형태의 맥락에서 설명된 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위-조합으로 제공될 수도 있다. 발명에 속하는 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되고, 마치 각각 및 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다. 부가하여, 다양한 실시형태의 모든 하위-조합 및 그 요소도 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되고, 마치 각각 및 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본 명세서에 개시되어 있는 것처럼 본 명세서에 개시된다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점, 및 신규 특징은 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 부가적으로, 상기에서 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태 각각은 다음 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
상기에서 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태는 다음 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
실시예
일반적으로, 본 명세서에 사용된 명명법 및 본 발명에 이용된 실험실 절차는 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 제시된 바와 같은 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참고하며; 이들 모두는 참조로 포함된다. 기타 일반 참조는 이 문헌 전체에 제공된다.
재료 및 방법
매트릭스 메탈로프로테이나제 및 ADAM - 상업용 재조합 인간 메탈로프로테이나제 MMP-1(카탈로그 번호 AS-55575), MMP-9(카탈로그 번호 AS-55576), MMP-10(카탈로그 번호 AS-72067), MMP-12(카탈로그 번호 AS-55525) 및 MMP-13(카탈로그 번호 AS-72257)은 AnaSpec의 제품이다. 재조합 인간 ADAM-10(카탈로그 번호 936-AD) 및 ADAM-17(카탈로그 번호 930-ADB)은 R&D 시스템에서 구입했다. 재조합 인간 MMP-2는 Anaspec(카탈로그 번호 AS-72005) 및 R&D 시스템(카탈로그 번호 902-MP)으로부터의 둘 모두를 사용하였다. Pro-MMP-2 및 pro-MMP-10은 제조업체 프로토콜에 따라 37℃에서 1시간 동안 1mM p-아미노페닐수은 아세테이트(APMA)로 활성화되었다.
프로테아제 억제제 - 프로테아제 억제제는 각 실험 시작 시 표시된 농도로 첨가되었다. 세포의 주간 긴 검정에서 억제제의 또 다른 부분은 최종 농도에서 3일 후에 추가되었다. 사용된 프로테아제 억제제는 ARP-100(Tocris, 카탈로그 번호 2621)이다.
합성 켄칭된 펩티드 - 인간 CD28 줄기 영역의 아미노산 서열에 상응하는 형광 기질, 4-(4-디메틸아미노페닐) 디아제닐벤조산(DABCYL)― KGKHLSPSPLFPGPSKP-Glu-5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-설폰산(EDANS)-NH2는 Gencust Europe에 의해 맞춤 합성되었다. 위치 141에서 시스테인 잔기는 용해도 문제로 인해 세린으로 돌연변이되었다.
형광 검정 - 검정은 50mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05% Brij-35, pH 7.5 내 표시된 MMP(10 또는 30ng) 또는 25mM Tris, 2.5mM ZnCl2 및 0.005% Brij-35, pH 9 내 ADAM10/ADAM17(5μg/mL)로 수행했다. 형광성 기질(10μM)의 절단은 Biotek Synergy H1 분광형광계를 사용하여 Ex340/Em490nm에서 측정되었다.
MALDI-TOF-질량 분광계 분석 - 질량 분석은 AutoFlex Speed I 질량 분석기(Bruker Daltonics) 상에서 수행했다. 샘플을 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 아세토니트릴의 용액에 희석하였다. 질량 스펙트럼은 500-2500 질량-대-전하 비율(m/z) 범위에서 반사체 네거티브 모드에서 수득되었다. MALDI-TOF 질량 분광계 스펙트럼은 Bruker Daltonics로부터 FlexAnalysis 소프트웨어를 사용하여 처리되었다.
ELISA - 상업용 ELISA 키트를 가용성 인간 CD28(R&D, 카탈로그 번호 DY342)의 양을 정량화하기 위해 사용했다. 세포 증식 및 생존율(MTT 검정)은 제조사 지침(Roche, 카탈로그 번호 11465007001)에 따라 수행되었다.
인간 면역 세포의 단리 - PBMC를 표준 림프구 분리 배지(MBP, 카탈로그 번호 850494)를 사용하여 건강한 공여자의 신선한 혈액 샘플에서 단리했다. 모든 세포는 10% HI-FCS 및 펜/스트렙 혼합물이 보충된 완전한 RPMI-1640 배지에서 성장되었다.
가용성 CD28의 생성을 위한 PBMC의 SEB 또는 CMV 활성화 - 0.1×106 PBMC를 0.5ng/mL SEB(Sigma, 카탈로그 번호 S4881)로 96 웰 플레이트에서 다양한 프로테아제 억제제의 표시된 농도 유무에 관계없이 37℃에서 7일 동안 자극했다. CMV 자극을 위해 0.5×106 PBMC를 0.5μg/mL CMV 펩티베이터(Milteny Biotec, 카탈로그 번호 130-093-435)로 96 웰 플레이트에서 다양한 프로테아제 억제제의 표시된 농도 유무에 관계없이 37℃에서 7일 동안 자극했다.
합성 비오틴화 및 Myc 태깅된 펩티드 - "EQKLISEEDLGGGGHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 17)-비오틴"의 최종 형태를 갖는 기질 펩티드는 N-말단 cMyc 태그(EQKLISEEDL, 서열번호: 18)에 이어 4개의 글리신 서열과 C-말단 비오틴 접합 사이의 인간 CD28 줄기 영역(His134-Pro152)의 아미노산 서열을 포함하도록 설계되었다. L145K 돌연변이된 펩티드는 위치 145의 류신 잔기를 라이신 잔기(EQKLISEEDLGGGGHVKGKHLCPSPKFPGPSKP, 서열번호: 19)로 단독 대체로 동일한 디자인으로 합성되었다. 이것은 PSPK(서열번호: 20)의 돌연변이 절단 부위를 생성한다. 펩티드는 GeneCust Europe에서 맞춤 합성되었다. 위치 141에서 시스테인 잔기를 사용하여 이황화 연결에 의한 이량체성 펩티드를 생성하였다.
시험관내 절단 검정 - 25 또는 50ng pf 정제된 재조합 MMP-2 또는 MMP-13을 62.5nM 이량체성 기질 펩티드(WT 또는 L145K 돌연변이체)와 함께 인큐베이션하였다. 검정은 pH 7.5에서 50mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05% Brij-35에서 수행되었다. 5시간의 반응 시간 후 혼합물을 펩티드의 최종 1nM 농도로 희석하고 펩티드를 결합하기 위해 뉴트라비딘 플레이트 상에 장입하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후 플레이트를 세정하고, HRP에 접합된 항-cMyc 항체(Biolegend, 카탈로그 번호 626802)로 절단되지 않은 펩티드의 검출을 수행하였다.
실시예 1: 인간 CD28은 MMP-2에 의해 매개된 단백질분해 쉐딩을 겪는다
TAPI와 같은 광범위한 프로테아제 억제제가 만성적으로 자극된 인간 PBMC에 의해 생성된 sCD28의 수준을 감소시킬 수 있음이 이전에 밝혀졌다(국제 특허 출원 WO2019/175885, 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨). 이 억제의 효과는 용량 의존적이고 면역 세포가 활성 쉐딩에 의해 sCD28을 생성한다는 것을 입증한다. 이것은 Jurkat T 세포주와 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 인간 CD4 T 세포 둘 모두에서 관찰되었다.
ADAM-10 및 ADAM-17이 이 쉐딩에서 역할을 수행할 수 있다고 가정되었다. 인간 CD28의 줄기 영역의 활성 절단을 직접적으로 시험하기 위해, 다양한 재조합 인간 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)와 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 함유 단백질(ADAM)을 줄기 영역의 켄칭된 형광성 펩티드와 함께 인큐베이션하는 시험관내 검정을 수행했다. T 세포에 의해 발현되는 것으로 보고된 프로테아제만 검정되었다. 사용된 펩티드의 서열은 KGKHLSPSPLFPGPSKPE(서열번호: 16)이었다. Cys141에서 세린으로의 돌연변이가 이루어지고 글루탐산 잔기가 단백질의 용해도를 증가시키고 형광단의 접합을 수용하기 위해 추가되었다. 켄쳐 DABCYL은 N-말단에 접합되었고 형광단 EDANS는 C-말단에 접합되었다. 온전한 경우 펩티드 상의 형광색소가 켄칭되고 형광이 측정되지 않는다. 펩티드의 절단은 형광색소가 켄쳐로부터 분리되도록 하고 형광은 전용 판독기로 측정할 수 있다. 6개의 MMP와 ADAM-10 및 ADAM-17이 모두 시험되었다. 셰다제가 첨가되지 않은 펩티드 단독을 판독값을 정규화하기 위한 대조군으로 사용하였다. 도 1a에서 명확하게 볼 수 있듯이 MMP-2는 줄기 도메인 펩티드를 절단하는 반면 ADAM-10 및 ADAM-17은 절단하지 않는다. MMP-13은 또한 줄기 도메인을 절단하지만 MMP-2보다 훨씬 낮은 속도와 효율성으로 절단한다. 이 결과는 ADAM-10 및 ADAM-17 특이적 억제제가 CD28 절단을 부분적으로 억제하는 것으로 나타났기 때문에 매우 예상치 못한 것이다. 어느 한 이론에 얽매이지 않고, 이들 프로테아제는 CD28 절단에서 지원 역할을 하거나 가능하기로는 단백질 자체를 능동적으로 절단하지 않으면서 CD28 절단을 초래하는 캐스케이드의 일부일 가능성이 있다.
MMP-2의 단백질분해 효과는 특이적 억제를 나타내는 것이 프로테아제의 적정에 의해 추가로 밝혀졌다. 다양한 양의 MMP-2가 시험되었고, 펩티드의 절단이 용량 의존적임이 확인되었다(도 1b). 유사하게, MMP-2 특이적 억제제 ARP-100의 용량이 증가함에 따라 절단이 용량 의존적 방식으로 감소하는 것으로 나타났다(도 1c).
MMP-13의 단백질분해 효과는 또한 특이적 억제를 나타내는 것이 프로테아제의 적정에 의해 추가로 밝혀졌다. 다양한 양의 MMP-13이 시험되었고, 펩티드의 절단이 용량 의존적임이 확인되었다(도 1d). 유사하게, 광범위 MMP 억제제 TMI-1의 용량이 증가함에 따라 절단이 용량 의존적 방식으로 감소하는 것으로 나타났다(도 1e).
실시예 2: MMP-2 억제제는 CD28 절단을 억제한다
생체내 CD28 절단에 대한 MMP-2 특이적 억제제의 효과를 시험하였다. 건강한 인간 공여자로부터 PBMC를 6일 동안 SEB 또는 CMV로 활성화하여 sCD28의 생산을 자극했다. MMP-2 특이적 억제제 ARP-100에 의한 용량-의존적 억제를 시험하고 sCD28 수준을 특이적 ELISA로 측정하였다(도 2a-b). 이들 결과는 이 특정 억제제가 CD28 절단 및 sCD28 생성을 억제할 수 있음을 확인시켜 주었다.
실시예 3: 줄기 도메인 내 MMP-2/MMP-13 절단의 위치
MMP-2/MMP-13 절단의 부위를 결정하기 위해, 줄기 도메인 펩티드(서열번호: 9)를 MMP-2로 5시간 동안 인큐베이션하고 생성된 절단 생성물을 MALDI-TOF 질량 분광계에 의해 분석하였다. 얻어진 분석(도 3a)을 온전한 펩티드의 분석(도 3b) 및 MMP-2 효소의 분석(도 3c)과 비교함에 의해 2개의 절단 산물을 나타내는 4개의 새로운 피크가 동정되었다. 이들 두 생성물의 분자량의 분석은 이들이 KGKHLSPSP(서열번호: 12) 및 LFPGPSKPE(서열번호: 13)인 것으로 결정되었다. 2개의 추가 피크는 나트륨 이온과 연관된 이들 2개의 절단 생성물을 나타낸다. 이것은 MMP-2가 도메인의 제2 P와 제2 L 사이의 줄기 도메인을 절단한다는 것을 나타낸다(도 3d). 이들 잔기는 CD28의 프롤린 144 및 류신 145에 해당한다(서열번호: 1 참조). MMP-2에 대한 공통 표적 모티프는 PXX/Xhydro(서열번호: 14)이며 여기서 마지막 X는 소수성이고; 따라서 PSP/L(서열번호: 15)은 MMP-2에 대한 표적으로 적합하다.
절단 부위의 위치를 확인하기 위해, 류신을 라이신으로 전환하는 L145에서 돌연변이를 갖는 형광성 펩티드를 생성하였다. 돌연변이 펩티드 상의 서열이 PSPK이기 때문에 PSPL로 식별된 절단 부위는 이제 폐지된다. 라이신은 소수성이 아니기 때문에 특별하게 선택되었다. 상기에서 기술된 바와 같이, 절단 검정(도 1b 및 1d)은 WT 및 돌연변이 펩티드(2.5μM) 및 30ng의 MMP-2(도 4a) 또는 30ng의 MMP-13(도 4b)으로 반복되었다. 예상대로, 두 효소 모두 WT 펩티드를 효율적으로 절단했고 둘 모두 돌연변이 펩티드를 완전하게 절단할 수 없었다.
절단 부위의 추가 시험에서, WT 및 돌연변이체 펩티드는 N-말단 Myc 태그 및 C-말단 비오틴 태그로 생성되었다. 이들 펩티드는 효소 없이 또는 2가지 농도(25ng 및 50ng)의 MMP-2(도 4c) 또는 MMP-13(도 4d)으로 인큐베이션되었다. 5-시간 인큐베이션에 이어서, 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 플레이트 상에 장입하여 비오틴 태깅된 펩티드를 유지하였다. 항-Myc 태그 항체를 사용하여 완전히 온전한 펩티드만 측정했다. 예상한 바와 같이, 돌연변이된 펩티드는 MMP-2 또는 MMP-13에 의해 실질적으로 절단되지 않은 반면(<5%), WT 펩티드는 용량 의존적 방식으로 절단되었다. 함께 취한 이 데이터는 CD28 줄기 도메인 내의 MMP-2 및 MMP-13 둘 모두의 절단 부위가 PSPL 모티프에 있음을 확인한다.
실시예 4: 단일-도메인 항체는 MMP-2 및 MMP-13에 의한 sCD28 절단을 억제한다
mCD28에 결합할 수 있고 MMP-2 및 MMP-13에 의한 절단을 차단할 수 있는 소형 작용제를 설계하였다. 순수 라마 유래 VHH의 파지 라이브러리를 사용하여 단일 도메인 항체를 단리하였다. 라이브러리는 순수 비-면역화된 라마에서 취한 VHH 서열, 즉 B 세포를 추출하고 VHH CDR의 전체 이용가능한 레퍼토리를 서열화하는 것으로 구성되었다. 이들 CDR은 라이브러리를 생성하기 위해 파지 안으로 실현되었다. ELISA 및 유세포분석을 사용하여, 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 재조합 CD28 세포외 도메인 및 이량체성 줄기 영역 펩티드에 대해 라이브러리를 스크리닝했다. 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 VHH 서열은 다음과 같다: EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호: 29, 클론 2A1); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호: 30, 클론 4A4); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열번호: 31, 클론 4A1). VHH는 CHO 세포에서 재조합 단백질로 생산된 다음 하기에 기술된 바와 같이 세포 결합 및 항-쉐딩 활성에 대해 평가되었다. C-말단에서 His-태그는 정제를 위해 사용되었고 삼중 알라닌 반복을 통해 연결되었다. 3개의 조사된 클론의 CDR이 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
인간 CD28 줄기 영역 서열에 대한 VHH 클론의 결합은 VHH 클론의 일련의 희석을 사용하는 ELISA로 먼저 확인되었다(도 5). 세포 수준에서 막 인간 CD28에 대한 결합은 표지된 VHH 클론 및 CD28을 과발현하는 HEK 세포를 사용한 FACS 분석으로 확인되었다(도 6). 막 CD28 결합은 CD28 막 근위 영역에 대한 접근을 입증한다. 이전 실험에서는 CD28 줄기 영역 펩티드에 결합할 수 있는 전체-크기 항체가 세포 상의 CD28 줄기 영역에 결합할 수 없었기 때문에 작용제의 크기가 이 영역에 접근하는 데 중요하다는 것을 보여주었다. 현저하게, VHH 클론은 MMP 절단 부위 내에 위치한, 아미노산 잔기 145에서 L-K 치환으로 인간 CD28 줄기 영역 서열에 결합할 수 없었다(도 7).
항-쉐딩 활성은 펩티드 및 세포 수준 상 둘 모두에서 확인되었다. VHH 클론이 MMP-2(도 8) 및 MMP-13(도 9)에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 절단을 차단한다는 것을 확인하기 위해 ELISA 기술을 사용하여 온전한 인간 CD28 줄기 영역 이량체성 펩티드를 검출했다. 세포 수준에서 표준 샌드위치 ELISA를 사용하여 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포(도 10), PHA 및 IL-2에 의해 활성화된 단리된 CD4 T 세포(도 11) 및 초항원에 의해 활성화된 PBMC(도 12)의 상등액에서 인간 sCD28의 수준을 측정함에 의해 sCD28 쉐딩을 억제하는 VHH 클론의 효능을 확인했다.
결정적으로, VHH 클론은 인간 CD28 기능성을 손상시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 유세포분석법을 사용하여, VHH 클론이 막 CD28에 결합하는 CD86의 크기를 변경하지 않는다는 것이 밝혀졌다(도 13). 표준 샌드위치 ELISA는 염증성 사이토카인 인터페론 감마의 분비된 수준에 의해 측정된 바와 같이 VHH 클론이 CD28을 효능화하지 않는다는 것을 보여주기 위해 사용되었다(도 14). 활성화 항체 CD28.2가 양성 대조군으로 사용되었다. 유사하게, 표준 샌드위치 ELISA는 VHH 클론이 사이토카인 IL-2의 분비된 수준에 의해 측정된 바와 같이 CD28을 통한 CD80-Fc 자극을 길항하지 않는다는 것을 보여주기 위해 사용되었다(도 15).
본 발명이 그의 특정한 실시형태와 관련하여 기술되었지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 당업자에게 자명할 것임이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 사상과 넓은 범주에 속하는 모든 그러한 대안, 변형 및 변화를 포용하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biond Biologics LTD. <120> USE OF MMP-2 INHIBITION <130> BDB-P-009-PCT <150> US 62/942,240 <151> 2019-12-02 <150> US 62/954802 <151> 2019-12-30 <150> PCT/IL2020/050297 <151> 2020-03-12 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val 130 135 140 Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 145 150 155 160 Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met 165 170 175 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 180 185 190 Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 195 200 <210> 3 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60 attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120 aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180 agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240 aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300 aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660 tga 663 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 5 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 <210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 115 120 125 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 1 5 10 15 Pro <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ser Lys Pro <210> 11 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro 130 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Gly Lys His Leu Ser Pro Ser Pro 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Glu 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> X1 <222> (2)..(2) <223> X1 is any amino acid <220> <221> X2 <222> (3)..(3) <223> X2 is any amino acid <220> <221> X3 <222> (4)..(4) <223> X3 is any hydrophobic amino acid <400> 14 Pro Xaa Xaa Xaa 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Ser Pro Leu 1 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 Lys Gly Lys His Leu Ser Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 1 5 10 15 Pro Glu <210> 17 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly His Val 1 5 10 15 Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 20 25 30 Pro <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly His Val 1 5 10 15 Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Lys Phe Pro Gly Pro Ser Lys 20 25 30 Pro <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 Pro Ser Pro Lys 1 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 21 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 22 Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 23 Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 Ile Asn Ala Met Ala 1 5 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 25 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 26 Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile 1 5 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 28 Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile 1 5 <210> 29 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 30 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 31 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125

Claims (33)

  1. 막 CD28(mCD28)을 발현하는 세포의 표면으로부터 CD28의 쉐딩(shedding)을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제-13(MMP-13) 억제제 또는 둘 모두와 접촉시켜, 이에 의해 세포의 표면으로부터 CD28의 쉐딩을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
  2. 가용성 CD28(sCD28) 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28(sCD28) 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 상기 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하는, 방법.
  4. PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 MMP-2 억제제, MMP-13 억제제 또는 둘 모두를 투여하여, 이에 의해 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 면역요법을 필요로 하는 상기 대상체는 암을 앓고 있는, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법에 반응하지 않거나 낮게 반응하는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소 이전의 상기 대상체의 혈액은 적어도 5ng/mL sCD28을 포함하는, 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 요로상피암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 위암 및 결장직장암으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서 또는 상기 세포의 표면 상의 mCD28 발현을 증가시키고/시키거나 상기 세포 또는 대상체에서 mCD28-매개된 면역 세포 활성화를 증가시키는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, MMP-2 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 MMP-2에 특이적인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 CD28의 MMP-2 유도된 절단에 특이적인, 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, MMP-13 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 MMP-13에 특이적인, 방법.
  15. 제1항 내지 제9항 및 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 CD28의 MMP-13 유도된 절단에 특이적인, 방법.
  16. 제12항 또는 제15항에 있어서, 상기 억제제는 mCD28의 P144와 L145 사이의 mCD28의 유도된 절단을 억제하는, 방법.
  17. 제12항 또는 제16항에 있어서, 상기 억제제는 mCD28에 결합하고 CD28의 MMP-2 유도된 쉐딩을 억제하는, 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 억제제는 mCD28에 결합하고 CD28의 MMP-13 유도된 쉐딩을 억제하는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 억제제는 mCD28의 줄기 영역에 결합하고, 여기서 줄기 영역은,
    a. 아미노산 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 7), KGKHLCPSPLFPGPS(서열번호: 8) 또는 KGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 9)를 포함하거나;
    b. 아미노산 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호: 10)로 구성되거나; 또는
    c. (a) 및 (b) 둘 모두인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 억제제는 상기 줄기 영역에서 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두의 절단 부위, PX1X2/X3를 결합, 폐색 또는 차단하며 여기서 X3은 소수성 잔기인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 절단 부위는 PSPL이고, 상기 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두는 상기 P와 상기 L 사이를 절단하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 또 다른 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 면역요법은
    a. 체크포인트 억제제;
    b. 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 요법; 및
    c. 암 백신
    으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 체크포인트 억제제는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 수행을 위한 작용제(agent)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제를 수득하고, MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하고, MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것; 또는
    작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하되, 여기서 핵산 서열은
    i. CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 작용제의 수득;
    ii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제 능력의 시험; 및
    iii. MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제의 선택
    에 의해 선택된 작용제의 핵산 서열인 것
    을 포함하고, 이에 의해 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법의 수행을 위한 작용제를 제조하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, CD28 세포외 도메인 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 작용제의 수득이 CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제의 수득인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 상기 작용제는 상기 CD28 줄기 도메인에서 MMP-2, MMP-13 또는 둘 모두의 절단 부위에 특이적으로 결합하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 CD28 줄기 도메인에서 상기 절단 부위는 PSPL인, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 작용제의 존재에서 mCD28 다운스트림 시그널링을 검정하는 것과 mCD28 시그널링을 실질적으로 효능화하지 않고 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것, 및 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것, 또는 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것과 MMP-2에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 선택된 작용제의 핵산 서열인, 방법.
  31. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것, 및 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것, 또는 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것과 MMP-13에 의한 mCD28의 절단을 차단하는 적어도 하나의 작용제를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 선택된 작용제의 핵산 서열인, 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 작용제.
  33. 제32항의 작용제, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
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