KR20210141544A - 소형 배출 차단제 - Google Patents

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KR20210141544A
KR20210141544A KR1020217032763A KR20217032763A KR20210141544A KR 20210141544 A KR20210141544 A KR 20210141544A KR 1020217032763 A KR1020217032763 A KR 1020217032763A KR 20217032763 A KR20217032763 A KR 20217032763A KR 20210141544 A KR20210141544 A KR 20210141544A
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모티 하킴
안나 프리드만-드로르
드로르 알리셰케비츠
에드나 메이린
일라나 만델
테힐라 벤-모쉐
아비도르 셜먼
야이르 사피르
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비온드 바이오로직스 엘티디
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Abstract

100 킬로달톤 미만이고, 세포의 표면상의 막 면역 수용체에 결합하고 면역 수용체의 단백질 가수분해를 억제하는 제제가 제공된다. 제제를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하고 면역요법을 개선하는 방법이 또한 제공된다.

Description

소형 배출 차단제
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 30일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 62/954,802, 2019년 12월 2일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 62/942,240, 및 2019년 3월 14일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 62/818,351의 우선권 이익을 주장하고, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 면역 조절 및 면역요법 분야이다.
적응 면역 체계는 주로 항원 특이적 헬퍼 CD4+ 및 세포독성 CD8+ T 세포의 자극을 조율하여, 병원체 및 암 세포에 대한 조절 및 보호에서 중요한 역할을 한다. 항원 제시 세포 (APC)에 의한 T 세포의 오래가고 지속적인 활성화는 i) T 세포 수용체 (TCR)와 APC 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 의해 제시되는 펩티드의 결합; 및 ii) APC에 의해 또한 발현되는 B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86) 리간드에 결합하는 T 세포 상의 동시 자극 CD28 수용체를 포함한다. CD28 동시 자극의 생물학적 결과는 다양하고 면역 효과기 기능을 달성하는 데 필요한 임계값을 낮춤으로써 T 세포 주기, 확장, 분화, 뿐만 아니라 TCR 자극의 증폭의 제어를 포함한다.
활성화 동시 자극 분자 CD28와 대조적으로, 구조적 동족체, 세포독성 T 림프구 관련 4 (CTLA-4)는 CD28의 유발로 구동되는 막 발현이 있는, 억제성 동시 자극 수용체이다. CTLA-4 및 CD28 둘 다 I형 막횡단 단백질이다. 이들의 세포외 부분은 하나의 V-세트 면역글로불린 슈퍼 패밀리 (Ig-V) 도메인으로 구성되고, 이는 막횡단 영역에 근접한 IgV 도메인 외부에 위치한 시스테인 잔기에 의해 동종 공유적으로 연결된다. 유사성에도 불구하고, CTLA-4와 CD28은 친화도 및 4차 구조 배열 측면에서 상이하다. CTLA-4는 B7 분자에 대해 더 높은 결합 친화도, 및 CD28과 상이한 이량체화 모드를 가져 공유 리간드와 상이한 화학량론적 결합을 초래하는 것으로 밝혀졌다. CD28은 1가 결합 화학량론을 나타내는 반면, CTLA-4는 2가 방식으로　상호 작용한다. 따라서, CTLA-4는 CD28보다 훨씬 더 높은 친화도 및 결합성으로 B7 분자와 결합하고 결과적으로 T 세포 반응을 하향 조절하고 항원 특이적 내성의 시작을 선호한다.
일부 동시 자극 분자가 생리학적 형태를 갖는 것으로 명시되어 있다. 막-결합된 형태와 함께, 나이브 면역 세포에서 발현되는 가용성 형태가 기술되어 있어, T 세포 생물학의 복잡성을 증가시킨다. CD28의 가용성 형태 (sCD28)는 대안적으로 스플라이싱된 유전자 산물에 기인한 것으로 생각된다. 스플라이싱 이벤트는 번역 종료 전 위치 137에서 글리신 다음 2개의 글루타메이트 잔기의 첨가의 결과로 프레임 이동을 초래한다. 최종 산물은 전체 막횡단 및 세포질 영역이 결여되어 있고 중요하게는, 위치 141에서, 이량체 CD28의 이황화 결합을 매개하는, 시스테인 잔기가 결여되어 있다 (Magistrelli G., Biochem Biophy Res Commun, 1999). 단량체 CD28 가용성 형태의 생물학적 기능 및 역수용체 결합이 조사되었고 (Hebbar, M., Clin Exp Immunol, 2004) T 세포 증식을 또한 억제하는 것으로 나타났다. 여전히, 이량체 sCD28의 경우 B7 분자에 결합함으로써 T 세포 기능을 억제하는 조절 역할을 갖는 것으로 제안되었다 (Sun, Z., Centr Eur J Immunol, 2014; Hebbar, M., Clin Exp Immunol, 2004). 놀랍게도, 자가면역 장애가 있는 환자의 혈청에서 sCD28 분자 수의 증가가 보고되었다 (Wong, C.K., Rheumatol, 2005; Hamzaoui, K., Clin Exp Rheumatol, 2005; Hebbar, M., Clin Exp Immunol, 2004; Sun, Z., Clin Immunol, 2014). sCD28의 확실한 출처는 논쟁의 여지가 있다. 자가면역 환자에서 T 세포의 지속적인 염증 상태를 반영하는, T 세포 활성화의 시험관 내 모델을 사용하여, T 세포 활성화 과정 동안 대안적인 가용성 형태의 전사는 억제되고 CD28의 전장 막 형태만이 명백한 반면, 배양물에서 sCD28의 양이 증가함을 나타냈다 (Hebbar, M., Clin Exp Immunol, 2004). 이러한 현상은 CD28의 막 형태의 활성 배출이 혈청에서 상승된 가용성 분자의 원인임이 제안되도록 하였지만, 이는 아직 입증되지 않았다. T 세포 활성화 동안 활성 배출은 부착 분자의 단백질 분해에 의한 지속적인 활성화를 방해하는 조절 메커니즘으로 과거에 설명되었다.
CTLA-4가 초기 T 세포 반응의 크기를 제한하는 동안, 다른 억제 수용체, PD-1은 주변에서, T 세포 기능을 억제한다. PD-1의 발현은 T 세포의 활성화 동안 상승하고, 이의 공지된 리간드는 B7 패밀리 동족체: B7-H1 (PD-L1) 및 B7-H2 (PD-L2)이다. 이들 동족체는 APC 및 암 세포 상에서 발견되고 활성화된 T 세포를 세포 무력 상태로 유도하여, 약화된 면역 반응을 초래한다. 따라서, CTLA-4 및 PD-1/PD-L1 축에 대해 표적화된 요법은 다양한 암 유형에서 임상 활성을 나타냈다. 최근에, 연구는 CD28의 신호 전달 경로가 PD-1에 의해 표적화되고 억제되며 (Hui, E., Science, 2017) 부수적으로 온전한 활성 CD28/B7 축을 발생시키기 위해 효과적인 PD-1 요법에 대해 필수적인 것임을 나타냈다 (Kamphorst, A.O., Science, 2017).
그러나, 일반적으로 모든 환자가 PD-1 기반 면역요법 또는 면역요법에 반응하고, 자주 재발하는 것은 아니다. 따라서 암을 공격하는 환자의 면역 세포의 능력을 개선할 수 있는 방법 및 분자가 매우 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 세포 표면상의 막 CD28 (mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 100 킬로달톤보다 작은 제제를 제공한다. 제제를 투여하는 것을　포함하는 암을 치료　및 예방하는 PD-1/PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법이 또한 제공된다.
제1 양태에 따르면, 세포의 표면상의 막 CD28 (mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제가 제공되고, 상기 제제는 100 킬로달톤 (kDa)보다 작다.
다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 가용성 CD28 (sCD28) 수준을 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 방법으로서, 하기 단계 중 적어도 하나를 포함하고, 그렇게 함으로써 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 것인, 방법이 제공된다:
a. 상기 제제가 100 kDa보다 작은 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
b. 세포 표면상의 mCD28에 대해 수득한 제제의 결합을 시험하는 단계; 및
c. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계;
및
d. 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로, 상기 핵산 서열은 하기 단계에 의해 선택된 제제의 것인 단계:
i. 제제가 100 kDa보다 작은 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 세포 표면상의 mCD28에 대해 수득된 제제의 결합을 시험하는 단계; 및
iii. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생산된 제제가 제공된다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 제제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
다른 양태에 따르면, 암을 치료하고/거나 예방하고, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하거나, 이를 필요로 하는 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 적어도 하나의 제제를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 CD28에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자 및 펩티드로부터 선택된다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 50 kDa보다 작다.
일부 구현에 따르면, 상기 단일 도메인 항체는 낙타과 또는 상어 항체이다.
일부 구현에 따르면, 상기 낙타과 항체는 하기 3개의 CDR를 포함한다:
CDR1은 서열 번호 33 (INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 34(AISGGGDTYYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 35(DLYGSDYWD)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
CDR1은 서열 번호 36(INAMA)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 37(AITSSGSTNYANSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 38(DEYGSDYWI)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 또는
CDR1은 서열 번호 33(INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 39(AITSGGSTNYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 40 (DLYGEDYWI)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 낙타과 항체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다:
a.EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열 번호 30);
b.EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 31); 및
c.QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 32).
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하고, 여기서:
CDR-H1은 서열 번호 17(GFTFSSYYMS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열 번호 18(TISDGGDNTYYAGTVTG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3는 서열 번호 19 (IHWPYYFDS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 서열 번호 20(RASSSVSYMN)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열 번호 21 (ATSDLAS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 CDR-L3는 서열 번호 22 (QQWSSHPPT)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 인간화된다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 CD28 작용제가 아니다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 CD28 길항제가 아니다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 mCD28을 저하하거나 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 억제하지 않는다.
일부 구현에 따르면, 상기 항체의 항원 결합 단편은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하지 않는다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 CD28의 줄기 영역 내에 결합한다.
일부 구현에 따르면, 상기 줄기 영역은 아미노산 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 9) 또는 KGKHLCPSPLFPGPS (서열 번호 27)를 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 줄기 영역은 아미노산 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 10)로 이루어진다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 적어도 하나의 프로테아제에 대한 절단 부위에 결합한다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 단백질 가수분해를 억제한다.
일부 구현에 따르면, 상기 적어도 하나의 프로테아제는 적어도 하나의 메탈로프로테아제이다.
일부 구현에 따르면, 상기 적어도 하나의 메탈로프로테아제는 MMP-2, MMP-13, 또는 이의 조합이다.
일부 구현에 따르면, 상기 대상체는 암을 앓고 있다.
일부 구현에 따르면, 상기 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 신장, 위 및 대장암로부터 선택된다.
일부 구현에 따르면, 상기 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 및 대장암으로부터 선택된다.
일부 구현에 따르면, 상기 방법은 mCD28을 약화시키거나 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않는다.
일부 구현에 따르면, 상기 투여 전 대상체의 혈액은 적어도 5 ng/ml sCD28을 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 수득하는 단계는 50 kDa보다 작은 제제를 수득하는 것이고, 상기 수득된 제제는 50 kDa보다 작다.
일부 구현에 따르면, 상기 방법은 세포 표면상의 mCD28의 프로테아제에 의한 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 프로테아제는 MMP-2, 및 MMP-13으로부터 선택된다.
일부 구현에 따르면, 상기 제제를 수득하는 단계는 하기 단계 중 적어도 하나를 포함한다:
a. 상어 또는 낙타과를 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화시키고 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 단계; 및
b. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하기 위한 제제의 라이브러리를 선별하고 결합하는 제제를 선택하는 단계.
일부 구현에 따르면, 상기 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편은 이량체 또는 단량체이다.
일부 구현에 따르면,
a. 항체를 수집하는 단계는 면역화된 상어 또는 낙타과의 비장으로부터 B 세포를 추출하는 것을 포함하거나; 또는
b. 결합하는 제제를 선택하는 단계는 선택된 제제를 서열분석하고 서열로부터 제제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함한다
일부 구현에 따르면, 상기 방법은 수득된 제제의 존재하에 mCD28 다운스트림 신호전달을 분석하는 것 및 mCD28 신호전달에 실질적으로 작용하거나 실질적으로 길항작용하지 않는 적어도 하나의 제제를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현에 따르면, 상기 키트는 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다:
a. 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법; 및
b. 본 발명의 제제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지.
추가 구현예 및 본 발명 적용의 전 범위는 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 분명해질 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시의 목적으로 제공되는　것으로 이해되어야 한다.
도 1. 가용성 CD28은 PBMC의 자극 동안 생성되고 프로테아제 억제제 (PI)의 첨가에 의해 상쇄된다. 인간 CD28 ELISA (상단 패널)로 정량화된 SEB (0.5 ng/mL, 좌측) 또는 CMV 펩티드 (0.5 μg/mL, 우측)로 자극된 PBMC의 배양물에서 가용성 CD28 양의 막대 차트. 프로테아제 억제제의 칵테일은 표시된 농도로 첨가되었다. 전반적인 건강 및 효과기 활동은 인터페론 감마의 분비에 의해 조사되었다 (하단 패널).
도 2. 가용성 CD28은 PHA에 의한 T 세포의 자극 동안 생성되고 프로테아제 억제제의 첨가에 의해 상쇄된다. 고정된 농도 (2 μM)의 프로테아제 억제제 칵테일의 존재하에 증가하는 농도의 PHA (1-4 μg/mL, 상단 차트)로 자극된 저캇 세포 (좌측 상단) 또는 단리된 인간 CD4 T 세포 (우측 상단)의 막대 차트. 다른 설정에서 PHA 농도는 저캇 T 세포 (1 μg/mL PHA, 좌측 하단) 또는 인간 CD4 T 세포 (2 μg/mL PHA, 우측 하단)를 자극하기 위해 고정되었고 프로테아제 억제제 칵테일의 농도는 적정되었다 (0.5-2 μM). 상청액에서 인간 CD28의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA로 정량화되었다.
도 3a-3b. 특이적 ADAM-10 및 ADAM-17 억제제는 이들의 생존을 방해하지 않으면서 SEB에 의한 인간 PBMC 활성화 동안 가용성 CD28의 축적을 제거한다. (3a-b) 다양한 농도 (0.01-1 μM)에서 (3a) ADAM-10 특이적 억제제 (GI254023X) 및 (3b) ADAM-17 특이적 억제제 (TMI-1)의 존재하에 SEB (1 ng/mL)로 자극된 인간 PBM의 막대 차트. 상이한 처리에서 세포의 생존력은 MTT 분석을 사용하여 평가되었다 (상단 패널). 상청액에서 인간 CD28 (하단 패널)의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA로 정량화되었다.
도 4a-4d. 가용성 CD28은 PBMC 자극 동안 생성된다. (4a) CMV가 없거나 (검은색 막대) CMV 펩티드가 없는 (진한 회색 막대) 동일한 공여자로부터의 CD3 T 세포와 1:5 비율로 혼합된 미성숙 수지상 세포의 막대 차트. 단독 또는 CMV가 있는 각 세포 집단의 대조군은 연한 회색 막대이다. 상청액에서 인간 CD28의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA로 정량화되었다. (4b-d) ADAM-10 및 ADAM-17 억제제의 존재하에 (4b) CMV 또는 (4c) SEB 또는 (4d) SEB로 24시간 동안 자극되고, 그런 다음 깨끗한 배양물로 이동된 인간 PBMC의 막대 차트. 도 4d의 측정은 세포가 이동된 후 120시간이다.
도 5. 가용성 CD28은 효과기 사이토카인 분비를 억제한다. 표시된 농도에서 재조합 인간 CD28이 없거나 (검은색 막대) 있는 (회색 막대) CMV (0.5 μg/mL)로 자극된 인간 PBMC의 막대 차트. CMV 자극이 없는 나이브 샘플은 연한 회색 막대로 표시된다. 상청액에서 인간 IFN 감마의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화되었다.
도 6. 가용성 CD28은 IL-6 사이토카인 분비를 증가시킨다. 표시된 농도에서 재조합 인간 가용성 CD28이 없거나 (검은색 막대) 있는 (회색 막대) CMV (0.5 μg/mL)로 자극된 인간 PBMC의 막대 차트. CMV 자극이 없는 나이브 샘플은 연한 회색 막대로 표시된다. 상청액에서 인간 IL-6의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화되었다.
도 7a-7e. (7a) 표시된 농도에서 재조합 인간 가용성 CD28 (회색 삼각형) 또는 재조합 인간 가용성 CTLA-4 (검은색 원)의 존재하에 CMV (0.5 μg/mL)로 자극된 인간 PBMC의 선 그래프. 상청액에서 인간 IL-6, IFN 감마 및 IL-4의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화되었다. 상청액에서 인간 IL-8, IL-12p(40) 및 IL-10의 농도는 Magpix 시스템 (Millipore)을 사용하는 다중 분석으로 정량화되었다. (7b) 자가 단핵구 및 CD3 MLR로부터 사이토카인 분비의 막대 그래프. CMV 자극이 없는 나이브 샘플은 연한 회색 막대로 표시된다. 단독 또는 IgG 대조군이 있는 CMV는 검은색 막대로 표시된다. 증가하는 농도의 sCD28은 진한 회색 막대로 표시된다. (7c) 재조합 인간 가용성 CD28 (회색 원) 또는 대조군 IgG (회색 삼각형)의 존재하에 SEB로 자극된 인간 PBMC의 선 그래프 림프구 클러스터 형성. (7d) 재조합 인간 sCD28 유무로 처리된 단핵구로부터의 카이누레닌 ELISA 키트로 측정된 배양물로의 IDO 분비의 막대 그래프. (7e) 재조합 인간 sCD28 유무로 처리된 단핵구에서 IDO에 대한 세포간 FACS의 산포도.
도 8a-8c. 가용성 CD28은 항-PD1 처리를 저해한다. (8a) 항-PD1 (MK3475, 5 μg/mL, 검은색 막대) 또는 재조합 인간 가용성 CD28 (2 및 10 μg/mL, 회색 막대) 또는 둘의 조합 (점선 막대)의 존재하에 SEB (200 ng/mL, 좌측 차트) 또는 CMV 펩티드 (0.5 μg/mL, 우측 차트)로 3일 동안 자극된 인간 PBMC의 막대 차트. (8b) 단핵구 MLR 설정으로부터 사이토카인 분비의 막대 차트, 나이브-흰색 막대, CMV 단독-연한 회색 막대, sCD28-검은색 막대, MK-3475-어두운 회색, sCD28+MK-3475-격자 막대. 상청액에서 인간 IFN 감마, TGF 베타 및 IL-2의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화되었다. (8c) 대조군 및 sCD28과 함께 배양한 후 단핵구에서 표면 PD-L1 (왼쪽) 및 PD-L2 (오른쪽) 발현의 히스토그램.
도 9a-9c. 암 환자의 가용성 CD28. (9a) 가용성 인간 CD28의 존재에 대해 조사된 각각의 10개의 암 적응증 및 건강한 공여자에서 20개 혈장 샘플을 나타내는 도트 플롯. 가용성 CD28 함량이 높은 샘플을 여러 희석 인자로 반복적으로 검사하였다. 상청액에서 인간 CD28의 농도는 인간 혈장 샘플의 판독값을 수용하도록 내부적으로 보정된 표준화된 샌드위치 ELISA로 정량화되었다. (9b) sCD28, MK-3475 및 둘의 조합의 존재하에 암 환자 (한 명의 육종 환자-좌측 상단, 신장암 환자-우측 상단, 및 2명의 상이한 두경부암 환자-하단)의 PBMC를 자극한 SEB로부터 샌드위치 ELISA에 의해 측정된 IFN 감마 분비의 막대 차트. (9c) 단핵구와 공동 배양에서, IL-6와 함께, 단독 또는 단핵구 및 sCD28과 공동 배양에서 암 세포 SCC-25 생존 및 증식의 막대 차트.
도 10a-10b. (10a) 일정한 CD80-Fc 수준 및 가용성 CD28의 적정의 존재하에 항-CD3로 자극된 단리된 CD3 T 세포로부터의 IFN 감마 분비의 막대 그래프. (10b) 일정한 sCD28 수준 및 CD80-Fc 적정의 존재하에 CMV 로 자극된 단리된 PBMC.
도 11a-11b. (11a-b) 재조합 마우스 CD28을 투여하지 않은 (11a) 및 투여한 (11b) 항-PD-1 항체로 처리된 면역적격성 마우스에서 접종된 H22 세포의 종양 체적의 선 그래프.
도 12a-12c. (12a) BSA 접합된 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드 (오른쪽) 및 재조합 인간 CD28 단백질 (왼쪽)에 대한 클론 M9의 연속 희석에 의한 항원 결합을 나타내는 선 그래프. 항원은 maxisorp ELISA 플레이트에 고정화되었다. 클론 M9의 희석 시리즈를 수행하고 결합된 항체의 검출을 당나귀 항 마우스 IgG (H&L)-HRP 및 TMB로 발달시켜 수행하였다. (12b) 재조합 인간 sCD28 (왼쪽) 및 SEB로 활성화된 인간 PBMC로부터 배출된 sCD28 (오른쪽)의 ELISA 검출의 막대 그래프. ELISA는 양성 대조군으로서 항체 #3 (2 μg/mL, 회색 막대), 음성 대조군으로서 관련 없는 항체 M39 (10 μg/mL, 진한 회색 막대) 및 항-절단 항체 M9 (10 μg/mL, 검은색 막대)을 사용하였다. 재조합 CD28 또는 배출된 CD28의 검출을 HRP (0.5 μg/mL)에 접합된 ELISA 키트 검출 항체를 사용하여 수행하였다. (12c) 마우스 HEK293 세포에서 발현된 인간 CD28에 대해 10 μg/ml의 고정 농도 (검은색 히스토그램)에서 항체 M9 (상단) 및 대조군 항체 CD28.2 (하단)의 결합을 나타내는 히스토그램. 다클론 마우스 IgG를 음성 대조군 (10 μg/ml)으로 사용하였고 회색 히스토그램으로 도시한다. Alexa Fluor 647-접합 염소 항-마우스의 이차 배양에 의해 검출을 수행하였다.
도 13. ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 서열에 대한 결합. 상이한 VHH 클론의 연속 희석에 의한 항원 결합의 분석. 항원으로 작용하는 비오틴 접합 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트에 고정화시켰다. VHH 클론의 연속 희석을 수행하고 결합된 VHH의 검출을 항 His 태그-HRP 접합 항체로 수행하고 TMB로 발달을 수행하였다.
도 14. 막 인간 CD28에 대한 VHH#2A1의 결합. FITC 접합 VHH 클론 2A1 (50 μg/mL, 검은색 히스토그램) 및 FITC 접합 동형 대조군 (mIgG, 50 μg/mL, 회색 히스토그램)을 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포와 배양하였다. 결합을 FACS 분석에 의해 평가하였다.
도 15. 항 CD28 줄기 영역 VHH 클론은 막 CD28에 대한 리간드 결합을 차단하지 않는다. 인간 CD28을 과발현하는 HEK293 세포를 AlexaFlour 647에 대한 이차 항 인간 Fc 항체 접합을 사용하여 CD86-Fc (2 μg/mL) 결합에 대해 유세포 분석법으로 모니터링하였다. CD86-Fc에 대한 항 CD28 VHH 클론의 첨가 (30 μg/mL, 검은색 히스토그램)는 CD86 결합의 크기를 변화시키지 않는 반면, 시판 항체 클론 CD28.2의 첨가 (10 μg/mL, 좌측 상단 차트, 검은색 히스토그램)는 결합을 유의하게 감소시켰다.
도 16. 항-CD28 VHH 클론의 작용제 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포를 양성 대조군으로서 항-CD28 작용제 항체 클론 28.2 (2 μg/mL, 진한 회색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 또는 관련 없는 VHH 클론 (20 μg/mL, 검은색 막대)의 존재하에 2일 동안 플레이트 결합된 항-CD3 (OKT3, 2 μg/mL, 연한 회색 막대)로 자극하였다. 상청액으로 분비된 인간 IFN 감마의 농도를 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화하였다.
도 17. VHH 클론에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 MMP-2 매개 절단의 시험관 내 차단. c-Myc 접합 및 비오틴화 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드 (1 μM)를 MMP-2 억제제 (TMI-1, 50 nM), M9 Fab 또는 표시된 VHH 클론의 존재하에 5시간 동안 다양한 농도 (0.4-10 μg/mL)에서 50 ng rhMMP-2와 배양하였다. 화합물을 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트에 로딩한 후 광범위 세척하고 항-cMyc HRP-접합 항체에 의한 온전한 펩티드의 검출 및 발달을 TMB로 수행하였다.
도 18. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포에서 CD28 배출을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 48시간 배양 후 인간 CD28을 안정하게 발현하는 HEK 세포의 배양 배지에서 측정하였다. 가용성 CD28의 수준에 대한 다양한 농도 (3.3-100 μg/mL)에서 상이한 처리의 MMP 억제제 (TMI-1, 1 μM, 진한 회색 막대), 관련 없는 VHH의 음성 대조군 (왼쪽 상단 차트, 검은색 막대) 또는 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 (검은색 막대)의 효과를 도시한다. 상청액에서 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화된 샌드위치 ELISA (R&D system)로 정량화하였다.
도 19. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 PHA 및 IL2에 의해 활성화된 단리된 CD4 T 세포에서 CD28 배출을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 5 μg/mL PHA 및 200 IU/mL IL-2로 자극된 단리된 인간 CD4 T 세포의 배양 배지에서 측정하였다 (연한 회색 막대). 가용성 CD28의 양에 대한 다양한 농도 (0.4-50 μg/mL)에서 상이한 처리의 MMP 억제제 (TMI-1, 1 μM, 진한 회색 막대), 관련 없는 VHH의 음성 대조군 (왼쪽 상단 차트, 검은색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 또는 항체 M9 클론의 Fab 형식 (검은색 막대)의 효과를 도시한다. 상청액에서 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화된 샌드위치 ELISA (R&D system)로 정량화하였다.
도 20. 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1 및 4A4는 초항원에 의해 활성화된 PBMC에서 CD28 배출을 억제한다. 가용성 CD28의 수준을 1 ng/mL SEB로 자극된 단리된 PBMC의 배양 배지에서 특정하였다 (연한 회색 막대). 가용성 CD28의 양에 대한 다양한 농도 (0.4-50 μg/mL)에서 상이한 처리의 MMP 억제제 (TMI-1, 1 μM, 진한 회색 막대), 관련 없는 VHH의 음성 대조군 (왼쪽 상단 차트, 검은색 막대), 항-CD28 줄기 영역 VHH 클론 또는 M9 클론의 Fab 형식 (검은색 막대)의 효과를 도시한다. 상청액에서 가용성 인간 CD28의 수준을 표준화된 샌드위치 ELISA (R&D system)로 정량화하였다.
도 21. 항-CD28 VHH 클론의 길항제 효과 평가. 인간 단리된 CD3 세포를 CD28 공동-자극에 대한 리간드로서 작용하는 재조합 CD80-Fc 단백질 (5 μg/mL, 진한 회색 막대)의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3 (OKT3, 2 μg/mL, 연한 회색 막대)로 24시간 동안 자극하였다. 관련 없는 VHH 클론 (왼쪽 상단 차트) 또는 항-CD28 줄기 영역 VHH는 다양한 농도 (3.75-30 μg/mL, 검은색 막대)에서 첨가되었다. 상청액에서 인간 IL-2의 농도는 표준화된 샌드위치 ELISA (Biolegend)로 정량화되었다.
도 22. MMP-13에 의한 인간 CD28 줄기 영역의 절단에 대한 VHH 클론 2A1의 시험관 내 차단 활성. c-Myc 및 비오틴화 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드 (1 μM)를 5시간 동안 다양한 농도 (0.62-10 μg/mL)에서 MMPi (TMI-1, 50 nM, 진한 회색 막대), 관련 없는 VHH 클론 (왼쪽 차트의 검은색 막대), 또는 VHH 클론 2A1 (오른쪽 차트의 검은색 막대)의 존재하에 50 ng rhMMP-13 (연한 회색 막대)와 배양하였다. 혼합물을 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트에 로딩한 후 광범위 세척하고 항 cMyc-HRP 접합 항체에 의한 온전한 펩티드의 검출 및 발달을 TMB로 수행하였다.
도 23. 항 CD28 줄기 영역 VHH 클론 2A1, 4A1 및 4A4는 인간 CD28의 MMP 절단 부위에 특이적으로 결합한다. 직접 ELISA에 의한 인간 CD28 줄기 영역 WT 서열 또는 L145K 돌연변이 서열에 대한 VHH 클론의 특이적 결합 비교. 비오틴 접합 야생형 또는 L145K CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트에 고정화시켰다. VHH 클론 (0.2-5 μg/mL) 및 관련 없는 VHH 클론 (왼쪽 상단 차트)의 희석 시리즈를 수행하고 결합된 VHH의 검출을 항 His tag -HRP 접합 항체로 수행하고 TMB로 발달을 수행하였다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 표면상의 막 CD28 (mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질 가수분해를 억제하는 100 킬로달톤 (kDa)보다 작은 제제를 제공한다. 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하고, PD-1/PD-L1 기반 면역요법을 개선하고, 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 제제 및 방법은 mCD28의 절단 부위에 대한 전체 크기 항체가 막 근위 영역에 접근하기에는 너무 커서 배출을 억제할 수 없다는 놀라운 발견에 기초한다. 오히려 세포 표면상의 mCD28에 특이성을 갖는 더 작은 제제가 필요하다. 게다가, 다수의 암 환자는 sCD28 배출에 의해 유발된 이들 혈류에서 상승된 sCD28 수준을 갖는다. 이러한 sCD28은 면역억제제로 작용하므로, 배출의 감소는 sCD28에 의한 억제 감소 및 mCD28 신호전달을 통한 면역 활성화 증가의 이중 이점이 있다. 게다가, sCD28이 PD-1/PD-L1 기반 면역요법을 억제할 수 있다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
제제
제1 양태에 따르면, 막 CD28 (mCD28)에 결합하고 mCD28의 단백질 가수분해를 억제하는 제제가 제공된다.
일부 구현예에서, mCD28은 세포 표면상에 있다. 일부 구현예에서, mCD28은 막에 있다. 일부 구현예에서, 제제는 전체 크기 항체가 아니다. 일부 구현예에서, 제제는 IgG가 아니다. 일부 구현예에서, 제제는 100 킬로달톤 (kDa)보다 작다. 일부 구현예에서, 제제는 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 또는 15 kDa보다 작다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 제제는 50 kDa보다 작다. 일부 구현예에서, 제제는 25 kDa보다 작다. 일부 구현예에서, 제제는 20 kDa보다 작다. 일부 구현예에서, 제제는 15 kDa보다 작다.
일부 구현예에서, CD28은 포유동물 CD28이다. 일부 구현예에서 CD28은 인간 CD28이다. 일부 구현예에서, 인간 CD28은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호 1). 일부 구현예에서, 성숙한 CD28은 신호 펩티드가 결여되고 하기 서열을 포함한다: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호 2).
일부 구현예에서, 전장 인간 CD28을 코딩하는 DNA 코딩 서열은 하기 서열을 포함한다: ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA (서열 번호 3).
본원에 사용된 바와 같이, sCD28은 막횡단 도메인을 포함하지 않음으로써 막에 통합될 수 없는 임의의 CD28 단편 또는 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, CD28 막횡단 도메인은 아미노산 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열 번호 4)를 포함한다. 일부 구현예에서, sCD28은 막 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, sCD28은 용액 상태이다. 일부 구현예에서, sCD28은 혈중 CD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 TME 중 CD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 체액 중 CD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 CD28의 엑손 3이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, sCD28은 CD28의 엑손 3을 스플라이싱 아웃시키는 대안적 스플라이싱으로부터 발생하는 스플라이스 변이체이다. 일부 구현예에서, sCD28은 막 CD28 (mCD28)으로부터의 절단 생성물이다. 일부 구현예에서, sCD28은 절단된 CD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 전장 CD28의 세포질 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, sCD28은 이량체 sCD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 단량체 sCD28이다. 일부 구현예에서, sCD28은 CD28의 대안적 스플라이싱으로부터 발생하는 스플라이스 변이체가 아니다. 일부 구현예에서, 대안적 스플라이싱은 CD28의 엑손 3을 스플라이싱 아웃시킨다. 일부 구현예에서, sCD28은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE (서열 번호 5). 일부 구현예에서, sCD28은 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, sCD28은 신호 펩티드가 결여되고 하기 서열을 포함한다: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGEE (서열 번호 6). 일부 구현예에서, sCD28은 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, sCD28은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열 번호 48). 일부 구현예에서, sCD28은 서열 번호 48의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, sCD28은 신호 펩티드가 결여되고 하기 서열을 포함한다: NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP (서열 번호 49). 일부 구현예에서, sCD28은 서열 번호 49의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 인간 sCD28에 대해 코딩하는 DNA 코딩 서열은 하기 서열을 포함한다: ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTGA (서열 번호 7).
면역 세포에 대한 sCD28의 효과는 당 업계에 잘 알려져 있고, 비제한적 예시로서, IL-10 또는 TGF β와 같은 항-염증 사이토카인의 면역 세포 유도, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO)의 면역 세포 발현, 및 전염증성 사이토카인, 예를 들어 IL-2 또는 IFN-γ의 면역 세포 하향 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 막 CD28의 단백질 가수분해를 억제하는 제제는 sCD28의 생성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, sCD28의 생성 억제는 면역 세포에 대한 sCD28의 효과를 억제하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 가수분해를 억제하는 것은 mCD28의 단백질 가수분해의 임의의 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 억제는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100%의 절단의 감소이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 단백질 가수분해를 억제하는 것은 면역 세포에 대한 mCD28의 수준을 유지한다. 일부 구현예에서, 단백질 가수분해를 억제하는 것은 면역 세포에 대한 mCD28의 수준을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 단백질 가수분해를 억제하는 것은 면역 자극에 적합한 mCD28의 수준을 유지한다.
일부 구현예에서, 단백질 가수분해의 감소는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 절단의 감소이다. 일부 구현예에서, 단백질 가수분해의 감소는 적어도 하나의 메탈로프로테아제에 의한 절단의 감소이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17, MMP-13 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2 또는 MMP-13이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, MMP-13 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 제제는 단편 항체의 항원 결합, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제제는 Fab 단편이다. 일부 구현예에서, 제제는 단일 사슬 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28에 특이적으로 결합하는 펩티드이다.
일부 구현예에서, 제제는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 제제는 Fc 도메인이 결여된 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 제제는 낙타과, 상어 또는 나노바디이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 다른 단백질 또는 단백질의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 또는 단편은 특히 혈청에서, 반감기를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 단백질은 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 제제는 반감기를 향상시키는 변형을 생산하는 화학물질에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 PEG화이고 화학물질은 폴리에틸렌 글리콜이다. 당업자는 임의의 반감기 연장 단백질 또는 화학 작용제,　또는 당업계에 공지된 변형이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
제제의 예시는 항체, 단편 항체의 항원 결합, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩티드 및 DARPin을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 항체, 단편 항체의 항원 결합, Fab 단편, 나노바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 펩티드 및 DARPin으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제제는 항체, 단편 항체의 항원 결합, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자, 및 CD28에 대해 특이적 결합을 하는 펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제제는 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 나노바디이다. 일부 구현예에서, 제제는 VHH 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체", "나노바디" 및 "VHH 항체"는 동의어이고 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 펩티드는 CD28에 대한 특이적 결합을 한다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28에 대해 특이적 결합을 하는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 항체, 단편 항체의 항원 결합, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일-도메인 항체, 나노바디, VHH 항체 및 항체 모방체로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 모방체"는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 유기 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체 모방체는 항체와 구조적으로 관련되지 않는다. 항체 모방체의 예시는 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 파이노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 모노바디, 및 나노CLAMPS를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 모방체는 DARPin이다. 이들 제제 모두는 당 업계에 잘 알려져 있고 수용체와 이들의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는데 유용한 것으로 알려져 있다. mCD28에 결합할 수 있는 소분자 및 단백질은 절단 부위를 막거나 방해를 일으키거나 프로테아제에 대한 접근을 손상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 모방체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DARPin"은 설계된 안키린 반복 단백질을 지칭한다. DARPin은 일반적으로 이들의 단백질 표적에 대해 매우 특이적인 유전자 조작된 항체 모방체 단백질이다. 따라서, CD28에 대한 DARPin은 제제의 예가 될 수 있다.
일부 구현예에서, Fab 단편은 약 50 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 100 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 80 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 70 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 50 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 50 kDa 이하의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 약 25 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 50 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 40 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 30 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 25 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 25 kDa 이하의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 약 15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 10-17 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 10-16 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 10-15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 12-15 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 12-16 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 12-17 kDa의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 25 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 20 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 15 kDa 미만의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 15 kDa 이하의 크기를 포함한다 이의 작은 크기, 및 단 3개의 CDR로 인해 단일 도메인 항체는 볼록한 모양을 포함하고 한쪽에서만 이의 에피토프에 결합한다. 이에 비해 Fab 단편 및 단일-사슬 항체는 6개의 CDR을 포함하고 적어도 2개의 측면에서 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 단 3개의 CDR과의 결합은 6개의 CDR과의 결합과 비교하여 mCD28 줄기 영역에 대해 우수한 접근을 허용한다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체 결합의 기하구조는 mCD28 줄기 영역에 접근하기에 우수하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 내부 표면 형상이 있는 3차원 결합 공간 및 항원의 항원 결정기의 특징에 대해 상보적인 전하 분포를 하는 폴리펩티드 사슬의 접힘으로부터 형성되는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 그룹을 지칭한다. 항체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"를 갖는, 사량체 형태를 갖는다.　각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 가용성 또는 결합된 형태로 표지될 수 있는 올리고클론, 다클론, 단일클론, 키메라, 낙타화, CDR 이식, 다중 특이적, 이중 특이적, 촉매, 인간화, 완전 인간, 항-이디오타입 및 항체뿐만 아니라, 단독으로 또는 다른 아미노산 서열과 조합하는, 에피토프-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체를 포함하는 단편일 수 있다. 항체는 모든 종에서 유래할 수 있다.　용어 항체는 또한 Fv, Fab, Fab', F(ab')2　단일 가닥 항체 (scFv), 이량체 가변 영역 (디아바디) 및 이황화 결합된 가변 영역 (dsFv)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 항체 단편은 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다른 면역글로불린 도메인에 융합되거나 융합되지 않을 수 있다.　당업자는 또한 scFv- Fc 융합체, 가변 영역 (예를 들어, VL 및 VH)~ Fc 융합체 및 scFv-scFv-Fc 융합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다른 융합 산물이 생성될 수 있음을 이해할 것이다.
면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
자연 발생 항체 구조의 기본 단위는, 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되고, 둘 다 비공유 결합 이황화 결합에 의해 함께 연결된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질 복합체이다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬 내 이황화 가교를 갖는다. 5가지 인간 항체 클래스 (IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE)가 존재하고, 이들 클래스 내에서, 다양한 서브클래스는 단일 항체 분자 내의 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위의 이황화 가교 구조, 및 사슬 길이 및 순서의 차이와 같은, 구조적 차이에 기초하여 인식된다. 항체의 클래스 및 서브클래스는 이의 동형이다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 또는 50 kDa 미만의 크기를 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 50 kDa 미만의 크기를 갖는다.
중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 영역은 카르복시 말단 영역보다 서열이 더 다양하고, 따라서 가변 도메인으로 지칭한다. 항체 구조의 이 부분은 항체의 항원 결합 특이성을 부여한다. 중가변 (VH) 도메인 및 경가변 (VL) 도메인은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성하므로, 따라서, 기본 면역글로불린 단위는 2개의 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다 (Chothia 등, J. Mol. Biol. 186, 651-63 (1985); Novotny 및 Haber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4592-4596).
중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단 부분은 불변 도메인 즉 CH1, CH2, CH3, CL을 형성한다. 이러한 도메인의 다양성은 훨씬 적지만, 동물 종마다 차이가 있으며, 게다가, 동일한 개체 내에서 각각 상이한 기능을 갖는, 여러 가지 상이한 동형의 항체가 있다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 아미노산 잔기 이외인, 항체의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는, 항체의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. FR 및 CDR의 범위는 정확하게 정의되어 있다 (Kabat 등 참조).
면역글로불린 가변 도메인은 또한 CDR을 포함하는, 가변 영역 세그먼트를 식별하기 위해 IMGT 정보 시스템 (www://imgt.cines.fr/) (IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, Brochet, X. 등, Nucl. Acids Res. J6:W503-508 (2008) 참조.
Chothia 등은 또한 모든 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 가변 도메인 서열에 대해 "초티아 넘버링"의 이 시스템을 모호하지 않게 할당할 수　있다. 본원에 사용된 바와 같이, "초티아 넘버링"은 Chothia 등, Journal of Molecular Biology, "Canonical Structures for the Hypervariable regions of immunoglobulins" (1987) 및 Chothia 등, Nature, "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions" (1989)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 항체" 및 "단일 사슬 가변 단편"은 동의어로 사용되고 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서 단일 사슬 항체는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20 kDa 미만의 크기를 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 25 kDa 미만의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체의 링커는 10 내지 25개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 1 -40, 5-40, 10-40, 1-35, 5-35, 10-35, 1-30, 5-30, 10-30, 1-25, 5-25 또는 10-25개 아미노산이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 항체 M9의 CDR을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체", "나노바디" 및 "VHH"는 동의어로 사용되고 단일 단량체 가변 항체 도메인을 이루는 항체 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 낙타과 항체이다. 일부 구현예에서, 낙타과는 낙타, 알파카　또는 라마이다. 일부 구현예에서, 낙타과는 낙타이다. 일부 구현예에서, 낙타과는 알파카이다. 일부 구현예에서, 낙타과는 라마이다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 상어 항체이다.
또한, 본원에 이미 표시된 대로, 나노바디의 아미노산 잔기는 Riechmann 및 Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-195의 논문에서 낙타과의 VHH 도메인에 적용된; 또는 본원에 언급된 바와 같이, Kabat 등에 의해 VH에 대한 소정의 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다 ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91). 이 넘버링에 따르면, 나노바디의 FR1은 위치 1-30에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31-35에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36-49에서 아미노산을 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50-65에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3는 위치 66-94에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3는 위치 95-102에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103-113에서 아미노산 잔기를 포함한다. 이 점에서,―VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당 업계에 잘 알려진 바와 같이―각 CDR의 아미노산 잔기의 총 수는 다를 수 있고 카밧 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수와 일치하지 않을 수 있다 (즉, 카밧 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 카밧 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다)는 점을 유의해야 한다. 이는 일반적으로, 카밧에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링과 일치하거나 일치하지 않을 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 그러나, 카밧의 넘버링에 따라 그리고 CDR의 아미노산 잔기의 수에 상관없이, 카밧 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 시작에 해당하고 그 반대도 마찬가지이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 시작에 해당하고 그 반대도 마찬가지이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 시작에 해당하고 그 반대도 마찬가지이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 시작에 해당하고 그 반대도 마찬가지라고 말할 수 있다.
낙타과로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링에 대한 대안적인 방법은 Chothia 등 (Nature 342, 877-883 (1989))에 의해 기술된 방법, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"이다. 그러나, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서, 양태 및 도면에서, Riechmann 및 Muyldermans가 VHH 도메인에 대해 적용한 카밧에 따른 넘버링을 따를 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 그의 단백질 서열이 인간 항체에 대한 유사도를 증가시키기 위해 변형된 비인간 종으로부터의 항체를 지칭한다. 인간화된 항체는 인간 항체와 유사한 서열로 둘러싸인 비인간 항체의 CDR을 코딩하는 재조합 DNA의 생산에 의해 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화는 본 발명의 CDR의 인간 항체 스캐폴드 또는 골격으로의 삽입을 포함한다. 인간화된 항체는 당 업계에 잘 알려져 있고 본 발명의 CDR을 보유하는 임의의 생산 방법이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 동종 항체, 즉, 단일클론 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재하는, 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 단일클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 장점이 있다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 항체의 동종 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고 임의의 특정 제조 방법에 의해 생성되는　것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 제공된 방법에 따라 사용되는 단일클론 항체는 Kohler 등, Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 높은 역가의 mAb는 개별 하이브리도마로부터의 세포를 고농도의 원하는 mAb를 함유하는 복수액을 생성하기 위해 본래의 프라이밍된 Balb/c 마우스로 복강 내로 주입하는 생체 내 생산에서 얻을 수 있다. 동형 IgM 또는 IgG의 mAb는 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 이러한 복수액으로부터 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
"항체 단편"은 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 등, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 외팔 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니 바디, 단일-사슬 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, 또는 탠덤 (di,tri)-scFv를 포함하지만, 이에 한정되지 않음); 및 이중 특이적 T-세포 인게이저 (BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라는, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 그 이름이 쉽게 결정화되는 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수　있는 F(ab')2　단편을 생산한다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한, 비공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. VH-VL　이량체의 세 표면이 있는 이러한 구성이다. 종합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기를 첨가함으로써 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
모든 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다라는, 2개의 분명하게 명백한 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 온전한 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 항체의 상이한 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각, a, 델타, e, 감마, 및 마이크로라고 한다. 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH　및 VL　도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL　도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 검토는 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)의 Pluckthun 참조.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하고, 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH　- VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬의 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 만들도록 강제한다. 디아바디 생산은 당　업계에 공지되어 있고 Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 기술되어 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 특히 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 대한 결합하는, 둘 이상의 VL　및 VH　도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 대해 결합하는 둘 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편 예를 들어 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼작용성 항체, 공유 또는 비공유 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 둘 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
본 발명의 단일클론 항체는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예시는 Kohler, G. 및 Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor 등, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole 등, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)의 pg. 77-96에서와 같은, 다양한 기법을 포함한다.
생체 내에서 항체를 상승시키는 종래의 방법 외에, 항체는 항체 파지 디스플레이 기술을 사용하여 시험관 내에서 생성될 수 있다. 이러한 재조합 항체의 생산은 기존의 항체 생산에 비해 훨씬 빠르고 엄청난 수의 항원에 대해 생산할 수 있다. 또한, 기존의 방법을 사용할 때, 많은 항원이 비면역원성이거나 극도로 독성이 있는 것으로 판명되어, 동물에서 항체를 생성하는 데 사용할 수 없다. 더욱이, 재조합 항체의 친화도 성숙 (즉, 친화도 및 특이성 증가)은 매우 간단하고 상대적으로 빠르다. 마지막으로, 하나의 선택 절차에서 특정 항원에 대한 많은 수의 서로 다른 항체를 생성할 수 있다. 재조합 단일클론 항체를 생성하기 위해, 상이한 항원 인식 부위를 갖는 대규모 항체 풀을 생성하기 위해 디스플레이 라이브러리를 기반으로 하는 모든 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 라이브러리는 여러 가지 방식으로 만들 수 있다: 한 가지는 중쇄 생식계열 유전자 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하여 합성 레퍼토리를 생성할 수 있으므로, 따라서 다양한 특이성을 가진 재조합 항체 단편을 선택할 수 있는 큰 항체 레퍼토리를 생성할 수 있다. 항체 라이브러리의 구축을 위한 출발 물질로 인간의 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 나이브 레퍼토리를 구축하는 것이 가능하므로 따라서 큰 다양성의 인간 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 상이한 항원에 대한 다수의 항체를 선택하는 데 성공적으로 널리 사용되었다. 박테리오파지 라이브러리 구축 및 재조합 항체 선택을 위한 프로토콜은 잘 알려진 참조 교과서 Current Protocols in Immunology, Colligan 등 (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1에서 제공된다.
비인간 항체는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 한 방법에서, 비인간 상보성 결정 영역 (CDR)은 인간 항체 또는 공통 항체 프레임워크 서열로 삽입될 수 있다. 그런 다음 친화도 또는 면역원성을 조절하기 위해 항체 프레임워크로 추가 변화가 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 및 이의 일부는 다음을 포함한다: 항체, 항체의 단편, Fab 및 F(ab')2, 단일-도메인 항원 결합 재조합 단편 및 천연 나노바디. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFV 또는 scFV2 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 일부를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 면역글로불린 분자 사슬, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하고, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직하다.
폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 다른 폴리펩티드는 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab'과 같은 항원 결합 항체 단편을 포함하고 CHI 및 CK　또는 CL　도메인은 제외된다. 미니바디는 기존 항체보다 작기 때문에 임상/진단 용도에서 더 나은 조직 침투를 달성해야 하지만 2가이므로 이들은 1가 항체 단편, 예를 들어 dAb보다 더 높은 결합 친화도를 유지해야 한다. 따라서, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라, 상기 논의된 유형의 항원 결합 항체 단편도 포함한다. 암호화된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용체 프레임워크에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용체 프레임워크 영역에 대해 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개시된 단백질 산물을 포함하는 개별 아미노산의 특성을 감안할 때, 일부 합리적인 치환은 숙련된 작업자에 의해 인식될 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은 예를 들어, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.
적절하게는, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 단리되고/거나 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비자연 발생" 물질, 조성물, 개체, 및/또는 물질, 조성물, 또는 개체의 임의의 조합, 또는 이의 임의의 문법적 변이는 "자연 발생"인 것으로 당업자에게 잘 이해되는, 또는 언제든지, 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생"인 것으로 결정되거나 해석될 수 있는 물질, 조성물, 개체, 및/또는 물질, 조성물, 또는 개체의 임의의 조합의 그런 형태를 명시적으로 배제하지만, 배제하는 조건부 용어이다.
다른 양태로, 3개의 CDR을 포함하는 제제가 제공되고, 여기서 CDR1은 서열 번호 33(INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 34(AISGGGDTYYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 35(DLYGSDYWD)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태로, 3개의 CDR을 포함하는 제제가 제공되고, 여기서 CDR1은 서열 번호 36 (INAMA)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 37 (AITSSGSTNYANSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 38 (DEYGSDYWI)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태로, 3개의 CDR을 포함하는 제제가 제공되고, 여기서 CDR1은 서열 번호 33 (INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 39 (AITSGGSTNYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 40 (DLYGEDYWI)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CDR은 Abm 넘버링 방법에 따라 넘버링된다. 일부 구현예에서, CDR은 초티아 넘버링 방법에 따라 넘버링된다. 일부 구현예에서, CDR은 카밧 넘버링 방법에 따라 넘버링된다.
일부 구현예에서, CDR1은 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열 (INAMX1)을 포함하고, 여기서 X1은 G 또는 A이다. 일부 구현예에서, CDR2는 서열 번호 42 (AIX1X2X3GX4TX5YAX6SVKG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X1은 S 또는 T이고, X2는 G 또는 S, X3는 G 또는 S이고, X4는 D 또는 S이고, X5는 Y 또는 N이고, 그리고 X6는 D 또는 N이다. 일부 구현예에서, CDR3는 서열 번호 43 (DX1YGX2DYWX3)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고, X2는 E 또는 S이고, 그리고 X3는 D 또는 I이다. 일부 구현예에서, CDR3는 서열 번호 44 (DX1YGSDYWX2)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고, 그리고 X2는 D 또는 I이다.
일부 구현예에서, 제제는 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 VHH 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 낙타과 항체이다. 일부 구현예에서, 낙타과는 라마이다. 일부 구현예에서, 제제는 상기 언급된 CDR이외의 다른 CDR을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제제는 EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열 번호 30)를 포함하고/거나 이로 이루어지는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 31)를 포함하고/거나 이로 이루어지는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 32)를 포함하고/거나 이로 이루어지는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VHH 서열은 His 태그를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, His 태그는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 히스티딘 잔기이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, His 태그는 6개 히스티딘 잔기로 이루어진다. 일부 구현예에서, His 태그는 링커를 통해 VHH에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 반복 링커이다. 일부 구현예에서, 알라닌 반복은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 알라닌 잔기를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 알라닌 반복 링커는 3개의 알라닌 잔기로 이루어진다. 일부 구현예에서, His-태그는 6개의 His 태그이다.
일부 구현예에서, 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하고 His 태그를 포함하는 것으로 밝혀진 VHH 서열은 하기와 같다: EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 45, 클론 2A1); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 46, 클론 4A4); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 47, 클론 4A1).
다른 양태로, 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하는 제제가 제공되고, 여기서: CDR-H1은 서열 번호 11 (GYTLTNY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열 번호 12 (NTYTGK)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3는 서열 번호 13 (GDANQQFAY)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 서열 번호 14 (KASQDINSYLS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열 번호 15 (RANRLVD)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 CDR-L3는 서열 번호 16 (LQYDEFPPT)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 이 항체는 본원에서 M9로 지칭된다.
일부 구현예에서, 제제는 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하고, 여기서: CDR-H1은 서열 번호 17 (GFTFSSYYMS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열 번호 18 (TISDGGDNTYYAGTVTG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3는 서열 번호 19 (IHWPYYFDS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 서열 번호 20 (RASSSVSYMN)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열 번호 21 (ATSDLAS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 CDR-L3는 서열 번호 22 (QQWSSHPPT)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 아미노산 서열 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCVASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGDNTYYAGTVTGRFTISRDFAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCARIHWPYYFDSWGQGTTLTVSS (서열 번호 23)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄의 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하고/거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제제는 하기 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 중쇄를 포함한다: GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATAAGTGATGGTGGTGATAACACCTACTACGCAGGCACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGACCTCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATTCATTGGCCTTACTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (서열 번호 24). 일부 구현예에서, 중쇄는 서열 번호 24로 이루어진다. 항체 M9을 서열 분석하고 서열 번호 24로 이루어진 중쇄를 갖는 것을 발견하였다. 초티아 계획을 사용하여 결정된, 이 중쇄의 CDR은 서열 번호 17-19이다.
일부 구현예에서, 제제는 아미노산 서열 QFVLSQSPAILSASPGEMLTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGGGTKLEIR (서열 번호 25)을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄의 가변 영역은 서열 번호 25를 포함하고/거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제제는 하기 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 경쇄를 포함한다: CAATTTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCCGGGGAGATGCTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCGACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGA (서열 번호 26). 일부 구현예에서, 경쇄는 서열 번호 26으로 이루어진다. 항체 M9을 서열 분석하고 서열 번호 26으로 이루어진 경쇄를 갖는 것을 발견하였다. 초티아 계획을 사용하여 결정된, 이 경쇄의 CDR은 서열 번호 20-22이다.
일부 구현예에서, 제제는 단량체로서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 이량체로서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체 및/또는 이량체로서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 이량체로서 결합하지만, mCD28을 가교 및/또는 활성화하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 이량체로서 결합하지만, CD28의 단일 분자에만 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체 CD28에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 이량체 CD28에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체 및/또는 이량체 CD28에 결합한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD28 작용제가 아니다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28 길항제가 아니다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28 작용제 또는 길항제가 아니다.
용어 "작용제"는 일반적으로 수용체에 결합하고, 완전히 또는 부분적으로, 수용체를 활성화하는 분자, 화합물 또는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 작용제는 천연 리간드와 동일한 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, 작용제는 천연 리간드의 결합 부위와 상이한 알로스테릭 부위에서 결합한다. 용어 "길항제"는　일반적으로 작용제와 동일한 부위 또는 다른 부위에서 수용체에 결합하고, 수용체를 활성화하지 않고 다음 중 하나 이상을 수행하는 분자, 화합물 또는 제제를 지칭한다: 천연 리간드에 의한 수용체의 활성화를 간섭하거나 차단, 수용체 작용제에 의한 수용체의 활성화를 방해하거나 차단. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 mCD28에 결합하지만 수용체를 활성화하거나 수용체의 활성화를 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 이들은 CD86에 의한 활성화를 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 mCD28에 결합하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "직접 작용제/길항제"는 수용체 (mCD28)에 결합하고 결합에 의해 그 분자에 의한 신호전달을 증가/감소시키는 분자를 지칭한다. mCD28의 경우 작용제는 mCD28에 결합하고 결합에 의해 세포에서 mCD28 신호전달을 증가시킬 것이다. 일부 구현예에서, 작용제는 T 세포 활성화를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 작용제는 T 세포 증식을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 작용제는 전염증성 사이토카인 분비를 증가시킨다. 전염증성 사이토카인은 당업계에 잘 알려져 있고 활성화된 T 세포에 의해 분비되는 것으로 알려져 있다. 전염증성 사이토카인의 예는 TNFα, IFNγ, IL-1B, IL-2, 및 IL-6을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 IFNγ이다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 IL-2이다. mCD28의 경우 길항제는 mCD28에 결합하고 결합에 의해 세포에서 mCD28 신호전달을 감소시킬 것이다. 일부 구현예에서, 길항제는 T 세포 활성화를 감소시키고, T 세포 증식을 감소시키고/거나 전염증성 사이토카인 분비를 감소시킨다. 수용체 신호전달을 수정하기 위해 이의 리간드를 접촉, 억제제를 접촉, 공수용체를 접촉 또는 문제의 수용체 이외의 임의의 분자와 접촉함으로써 수용체의 신호전달에 영향을 주는 분자는 직접 작용제/길항제로서 간주되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제제는 혈청에서 sCD28과 접촉하여 세포 상에서 mCD28을 통한 증가된 신호전달을 허용한다. 그 결과 mCD28 신호전달이 증가하지만 항체는 이의 mCD28에 대한 결합이 수용체 신호전달을 증가시키지 않기 때문에 mCD28 작용제 또는 직접 작용제가 아니다.
일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 리간드 결합 도메인을 보기 어렵게 하거나 이에 대한 접근을 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 sCD28의 IgV 도메인에 결합하거나, 보기 어렵게 하거나 이에 대한 접근을 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, IgV 도메인은 리간드 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 28-137을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 아미노산 서열 MLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG (서열 번호 8)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제제는 리간드에 대한 sCD28의 결합을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, CD28 리간드는 CD80, CD86 및 ICOSL로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD28 리간드는 CD86이다. 일부 구현예에서, CD28 리간드는 CD80이다. 일부 구현예에서, CD28 리간드는 ICOSL이다. 일부 구현예에서, CD86은 CD86-Fc이다. 일부 구현예에서, CD80은 CD80-Fc이다.
일부 구현예에서, 제제는 CD28의 줄기 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 막 근위 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 줄기 영역은 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 9)를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 영역은 서열 KGKHLCPSPLFPGPS (서열 번호 27)를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 영역은 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 10)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체 sCD28에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 이량체 sCD28에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체 sCD28, 이량체 sCD28 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 단량체에 결합하지만 이량체 CD28에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, CD28 세포 외 도메인의 단편은 줄기 영역이다. 일부 구현예에서, CD28에 결합하는 제제는 CD28의 절단을 방지한다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28에 결합하는 제제는 세포로부터 CD28의 배출을 방지한다.
일부 구현예에서, 제제는 줄기 영역에 있는 절단 부위에서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28 내의 절단 부위에서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 프로테아제의 절단 부위에서 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 MMP-2의 절단 부위에서 결합한다.
일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 리간드 결합 도메인을 보기 어렵게 하거나 이에 대한 접근을 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 절단 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 절단 부위를 보기 어렵게 하거나, 폐색시키거나 이에 대한 접근을 차단한다. 일부 구현예에서, 제제는 프로테아제 절단 부위에 결합하거나, 차단하거나, 폐색시키거나 보기 어렵게 한다. 일부 구현예에서, 제제는 프로테아제 절단 부위에 결합하지 않지만 부위를 폐색시킨다. 일부 구현예에서, 제제는 프로테아제 절단 부위에 대한 접근을 차단한다. 일부 구현예에서, 제제는 프로테아제 절단 부위를 차단하는 입체 장애를 생성한다. 일부 구현예에서, 제제는 프로테아제 절단 부위에 결합하지 않지만 제제의 결합은 프로테아제 절단 부위를 차단하는 mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 구현예에서, 제제의 결합은 프로테아제 절단 부위를 차단하는 mCD28에 대한 입체형태적 변화를 생성한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 MMP-2이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 MMP-13이다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 절단 모티프이다. 일부 구현예에서, MMP-2 절단 모티프는 PXX/X, 여기서 마지막 X는 소수성 잔기이다. 일부 구현예에서, CD28의 PXX/X 모티프는 PSP/L이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 서열 번호 1의 아미노산 142-145 (PSPL)이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 서열 번호 2의 아미노산 127-130 (PSPL)이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 서열 번호 10의 아미노산 9-12 (PSPL)이다. 일부 구현예에서, 제제는 절단 부위에 대한 프로테아제의 접근을 차단한다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 줄기 도메인에서 PSPL에 결합한다.
일부 구현예에서, 절단 부위는 류신 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 발린 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 방향족 아미노산 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 류신, 발린 및/또는 방향족 아미노산 앞에 있다. 일부 구현예에서, 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 티로신 및 히스티딘으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 서열 번호 1의 히스티딘 134, 발린 135, 히스티딘 139, 류신 140, 류신 145, 및 페닐알라닌 146 중 어느 하나 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 서열 번호 1의 히스티딘 134, 발린 135, 히스티딘 139, 류신 140, 류신 145, 또는 페닐알라닌 146 앞에 있다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 서열 번호 1의 류신 145 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 서열 번호 1의 류신 145 앞에 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 서열 번호 2의 류신 127 앞에 있다.
일부 구현예에서, 제제는 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역은 프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역은 메탈로프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제에 대한 기질이 아니다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제 2 (MMP-2)에 대한 기질이 아니다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위가 있는 CD28의 줄기 영역은 매트릭스 메탈로프로테아제 13 (MMP-13)에 대한 기질이 아니다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위는 서열 번호 1의 류신 145의 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 절단 부위는 서열 번호 1의 류신 145에 대한 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서 서열 번호 1의 류신 145에 대한 아미노산 치환은 라이신이다.
일부 구현예에서, 제제는 CD28 기능 및/또는 신호전달을 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28을 저하시키지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28 저하를 유도하거나 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, 신호전달은 mCD28-매개 면역 세포 활성화이다. 일부 구현예에서, 제제는 면역 세포 활성화를 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 CD28 수용체 내재화 또는 재순환을 유도하지 않는다. mCD28을 통한 동시 자극은 T-세포의 면역 활성화에 필수적이다. 단백질 가수분해는 막에 남아 있는 단백질의 막횡단 및 세포질 부분으로부터 CD28의 세포 외 영역의 리간드 결합 도메인을 제거하였다. 따라서, 절단된 CD28은 신호를 보낼 수 없고 T 세포 활성화에 기여할 수 없다. 따라서, 절단을 차단하고, 또한 길항제인 제제는 mCD28 활성화를 허용하지 않는다. 유사하게, 절단을 차단하지만, 또한 작용제인 제제는 비정상적인 T-세포 활성화, 및 잠재적으로 자가면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 면역 세포 상의 mCD28의 표면 수준을 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 표면 수준을 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7, 5, 3, 2 또는 1% 미만으로 감소시킨다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포에 대한 제제의 결합은 세포를 사멸시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포에 대한 제제의 결합은 세포의 사멸을 초래하지 않는다. 일부 구현예에서 제제는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 ADCC 및/또는 CDC를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 항체이고 IgG2 또는 IgG4 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG2 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG4 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체의　결합에 의해 매개되는　세포　사멸을 감소시키도록 돌연변이된 IgG1 또는 IgG3를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 Fc 수용체 결합 도메인을 돌연변이시킨다. 일부 구현예에서, 항체의 Fc 도메인은 CDC, ADCC 또는 둘 다를 감소시키도록 조작되거나 돌연변이된다. Fc 조작은 당업계에 잘 알려져 있고, 체 매개 세포 사멸을 감소시키는 것으로 알려진 임의의 돌연변이 또는 아미노산 변화가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 제제는 Fc 도메인이 결여된 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 제제는 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 제제는 낙타과, 상어 또는 나노바디이다.
일부 구현예에서, 제제는 비-항체 단백질이다. 일부 구현예에서, 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서 제제는 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, 제제는 합성 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제제는 합성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 합성 펩티드는 비-항체 스캐폴드를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 제제는 항체 모방체이다. 일부 구현예에서, 항체 모방체는 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 또는 20 kDa 미만의 몰 질량을 갖는다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 제제는 핵산 압타머이다. 일부 구현예에서, 압타머는 DNA이다. 일부 구현예에서, 압타머는 RNA이다. 일부 구현예에서, 압타머는 DNA 또는 RNA이다. 항체 모방체의 예는 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 파이노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 모노바디, 및 나노CLAMPS를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 모방체는 DARPin이다.
일부 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 프로테아제에 의해 단백질 가수분해를 억제한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 메탈로프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 트레오닌 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린, 시스테인 또는 트레오닌 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 글루타민 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 아스파르트산, 글루타민, 세린, 시스테인 및 트레오닌 프로테아제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 아스파라긴 펩티드 분해효소이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 쉐다제이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 엑소펩티다아제이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 엔도펩티다아제이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 엑소펩티다아제 또는 엔도펩티다아제이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 아연 촉매화된다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 코발트 촉매화된다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 매트릭스 메탈로프로티나제-2 (MMP-2)이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 매트릭스 메탈로프로티나제-13 (MMP-13)이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10, MMP-2, 및/또는 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 ADAM10, MMP-2, MMP-13 및/또는 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-2, MMP-13, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다.
사용 방법
다른 양태로, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는 방법이 제공되고, 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태로, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역요법을 개선하는 방법이 제공되고, 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태로, 이를 필요로 하는 대상체에서 sCD28을 감소시키는 방법이 제공되고, 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역요법은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 기반 면역요법은 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 요법은 PD-1 체크포인트의 차단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역요법은 대상체에 동종이형, 공통유전자 또는 자가 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역요법을 필요로 하는 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 암은 sCD28 양성 암이다. 일부 구현예에서, 암은 sCD28가 높은 암이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암 발생 위험이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 질환, 장애, 또는 병태의 "치료" 또는 "치료하는 것"은 이의 적어도 하나의 증상의 완화, 이의 중증도의 감소, 또는 이의 진행의 억제를 포함한다. 치료는 질환, 장애, 또는 병태가 완전히 치유되었음을 의미할 필요는 없다. 효과적인 치료가 되기 위해, 본원의 유용한 조성물은 질환, 장애, 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 이와 관련된 증상의 중증도를 감소시키거나, 환자 또는 대상체의 삶의 질에 개선을 제공하기만 하면 된다.
일부 구현예에서, 감소는 본 발명의 적어도 하나의 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는," "투여," 및 유사한 용어는 건전한 의료 관행에서, 치료 효과를 제공하는 방식으로 활성제를 함유하는 조성물을 대상체에게 전달하는 임의의 방법을 지칭한다. 본 주제의 한 양태는 치료적 유효량의 본 발명의 제제를 이를 필요로 하는 환자에게 경구 투여하는 것을 제공한다. 다른 적절한 투여 경로는 여 비경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 또는 복강내를 포함할 수 있다.
다른 양태로, 본 발명의 제제 및 치료적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 투여는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담체," "부형제," 또는 "보조제"는 활성 성분이 아닌 약학 조성물의 임의의 구성 성분을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 무독성, 불활성 고체, 반고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 유형의 제제 보조제, 또는 단순히 염수와 같은 멸균 수성 매질을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예를 들어 락토오스, 글루코스 및 수크로스, 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아, 젤라틴, 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일;글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르, 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 무발열원 물; 등장 식염수, 링거 용액; 에틸 알코올 및 인산염 완충 용액,뿐만 아니라 약제학적 제제에 사용되는 다른 무독성 호환 물질이다. 본원에서 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적 예시는 설탕, 전분, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 분말 트라가칸트, 맥아, 젤라틴, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 황산칼슘, 식물성 오일, 폴리올, 알긴산, 무발열원 물, 등장 식염수, 인산염 완충액, 코코아 버터(좌약 기제), 유화제뿐만 아니라 및 다른 약제학적 제형에 사용되는 다른 무독성 약제학적 호환 물질을 포함한다. 라우릴황산나트륨과 같은 습윤제 및 윤활제,뿐만 아니라 착색제, 향미제, 부형제, 안정제, 산화방지제, 및 방부제가 또한 존재할 수 있다. 임의의 무독성, 불활성, 및 효과적인 담체가 본원에서 고려되는 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 및 희석제는 당 업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 The Merck Index, Thirteenth Edition, Budavari 등, Eds., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (2001); CTFA (화장품, 세면용품 및 향료 협회) International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Tenth Edition (2004); 및 "Inactive Ingredient Guide," 미국 식품의약국 (FDA) 의약품 평가 및 연구 센터 (CDER) 관리 사무소에 기술되어 있고, 이 모든 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 조성물에 유용한 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및 희석제의 예는 증류수, 생리식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크액, 및 DMSO를 포함한다. 이들 추가의 불활성 성분, 뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 표준 교과서, 예를 들어 Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Gilman 등 Eds. Pergamon Press (1990); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., (2005)에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 현재 기재된 조성물은 리포솜, ISCOMS, 서방성 입자, 및 혈청 내 펩티드 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 다른 비히클과 같은 인공적으로 생성된 구조에 함유될 수 있다. 리포솜은 에멀젼, 폼, 미셀, 불용성 단일층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함한다. 현재 기재된 펩티드와 함께 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 리포솜 크기 및 혈액 내 안정성과 같은 고려 사항에 의해 결정된다. 리포솜 제조에 사용 가능한 다양한 방법은 예를 들어, Coligan, J. E. 등, Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., New York에 검토되었고, 또한 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369를 참조한다.
담체는 전체적으로, 본원에 제시된 약학 조성물의 중량 기준으로 약 0.1% 내지 약 99.99999%를 구성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 mCD28를 저하시키거나 저하를 초래하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역 세포에서 mCD28 수준을 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체의 면역 세포에서 mCD28 수준을 유지한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체의 면역 세포에서 mCD28 수준을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 감소는 sCD28의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99% 감소이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 감소는 혈청 sCD28에 있다. 일부 구현예에서, 감소는 sCD28의 혈액 수준에 있다. 일부 구현예에서, 감소는 종양 미세환경 (TME)에서 sCD28의 수준에 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 감소 전의 대상체의 혈액은 상승된 수준의 sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 수준은 건강한 대상체의 수준 이상으로 상승된다. 일부 구현예에서, 대상체의 sCD28 수준은 건강한 대상체의 수준 이상으로 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 상승한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 수준은 혈액의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng/ml 초과로 상승된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 수준은 5 ng/ml 초과로 상승된다. 일부 구현예에서, 수준은 10 ng/ml 초과로 상승된다. 일부 구현예에서, 수준은 20 ng/ml 초과로 상승된다. 일부 구현예에서, 대상체의 혈액은 혈액 ml당 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng sCD28을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 감소 전 대상체의 혈액은 혈액 ml당 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng sCD28을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체의 혈액은 적어도 5 ng/ml sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체의 혈액은 적어도 10 ng/ml sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체의 혈액은 적어도 20 ng/ml sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 5 ng/ml sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 10 ng/ml sCD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 감소 전 대상체의 혈액은 적어도 20 ng/ml sCD28을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 암은 PD-1/PD-L1 요법으로 치료될 수 있는 암이다. 일부 구현예에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법을 받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대한 무반응자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 PD-1/PD-L1 요법에 대해 경험이 없다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법과 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 PD-1/PD-L1 요법 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체에 다른 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다른 면역요법은 체크포인트 억제제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 및/또는 PD-L1 억제제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 일부 구현예에서, 다른 면역요법은 키메라 항원 수용체 (CAR) 기반 면역요법이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-T이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-NK이다. 일부 구현예에서, 다른 면역요법은 암 백신이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CAR-T 세포" 및 "CAR-NK 세포"는 적어도 하나의 관심 단백질 (예를 들어 후성유전학적 변형제로 처리 후 증가된 발현을 갖는 면역원성 단백질)에 대해 특이성을 갖고 면역 효과기 세포 (T 세포 또는 NK 세포) 상에 이식된 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포는 T-세포 상에 이식된 단일클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, CAR-NK 세포는 NK-세포 상에 이식된 단일클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 세포독성 T 림프구 및 조절 T 세포로부터 선택된다.
CAR-T 및 CAR-NK 세포 및 이들의 벡터는 당 업계에 잘 알려져 있다. 이러한 세포는 수용체가 결합하는 단백질을 표적화하고 이에 세포독성을 나타낸다. 일부 구현예에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 적어도 하나의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 복수의 바이러스 단백질을 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 후성유전학적 변형제와의 접촉으로 인해 증가된 발현을 갖는 바이러스 단백질을 표적화한다.
CAR-T 세포의 작제는 당 업계에 잘 알려져 있다. 하나의 비제한적 예에서, 바이러스 단백질에 대한 단일클론 항체가 제조될 수 있고 그런 다음 항체를 코딩하는 벡터가 작제될 것이다. 벡터는 또한 공동자극 신호 영역을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호 영역은 알려진 T 세포 또는 NK 세포 자극 분자의 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다: CD3Z, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD- 1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원- 1 (LFA- 1), CD2, CD 7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드. 일부 구현예에서, 벡터는 또한 CD3Z 신호전달 도메인을 포함한다. 그런 다음 이 벡터는 예를 들어 렌티바이러스 감염에 의해, T-세포로 형질감염된다.
일부 구현예에서, 암은 sCD28 수준이 상승된 암이다. 일부 구현예에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 상승된 및/또는 높은 sCD28 수준은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 ng/ml 및/또는 초과 수준이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 암은 높은 sCD28 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 상승된 및/또는 높은 sCD28 수준은 건강한 대상체의 수준의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75% 및/또는 초과 수준이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서 암은 유방암이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 신장, 위 및 대장암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 및 대장암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 신장, 위 또는 대장암이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
키트
다른 양태로, 본 발명의 적어도 하나의 제제, 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 제제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료법이 본 발명의 항체 또는 약학 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함한다.
다른 양태로, 본 발명의 항체 또는 약학 조성물과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지를 포함하는 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 암을 치료하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 진단 키트이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 sCD28의 혈청 수준을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 제제 또는 약학 조성물로 치료될 대상체의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 항-PD-1/PD-L1 기반 면역요법으로 치료될 대상체의 적합성을 결정하는데 사용하기 위한 것이다.
제제 생성 방법
다른 양태로, 세포 표면상의 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제제를 생성하는 방법으로,
a. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 여기서 제제는 100 kDa보다 작고;
b. 세포 표면상의 mCD28에 대한 수득된 제제의 결합을 시험하는 단계; 및
c. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계를 포함하고,
그렇게 함으로써 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 방법이 제공된다.
다른 양태로, 세포 표면상의 mCD28의 단백질분해 절단을 억제하는 제제를 생성하는 방법으로,
a. 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기서 핵산 서열은 하기 단계에 의해 선택된 제제의 것이고:
i. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 여기서 제제는 100 kDa보다 작고;
ii. 세포 표면상의 mCD28에 대한 수득된 제제의 결합을 시험하는 단계; 및
iii. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계를 포함하고,
그렇게 함으로써 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 표면상의 mCD28의 프로테아제에 의한 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 항-절단제이다. 일부 구현예에서, 제제는 항-배출제이다. 일부 구현예에서, 제제는 대상체에서 sCD28의 배출을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제제는 mCD28의 절단을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제제는 대상체에서 mCD28의 절단을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 프로테아제는 MMP-2이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 MMP-13이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 ADAM10이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 MMP-2, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다. MMP-2, MMP-13, ADAM10, ADAM17 또는 이의 조합이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD28의 세포 외 도메인"은 막횡단 도메인 전에 오는 CD28의 N-말단 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인은 sCD28이다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인은 CD28a이다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인은 CD28 줄기 도메인이다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인은 CD28의 줄기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인은 서열 NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 28)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편은 이량체이다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편은 단량체이다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편은 이량체 또는 단량체이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단편"은 더 큰 단백질 또는 단백질 도메인의 일부를 구성하는 부분 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 단편은 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90 또는 100개 아미노산을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, CD28의 세포 외 도메인의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 것은 CD28 줄기 도메인에 특이적으로 결합하는 제제를 수득하는 것이다.
일부 구현예에서, 방법은 수득된 제제의 존재하에 mCD28 다운스트림 신호전달을 분석하는 단계 및 mCD28 신호전달에 실질적으로 작용하지 않거나 실질적으로 길항하지 않는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 선택은 mCD28 신호전달에 길항하지 않는 적어도 하나의 제제를 선택하는 것이다. 암 치료의 경우 CD28 신호전달에 작용하는 것은 해롭지 않을 수 있지만, 신호전달에 길항하는 것은 역효과를 낼 수 있다는 것이 숙련된 기술자에 의해 이해될 것이다.
일부 구현예에서, 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 것은 제제의 존재 및 부재하에 활성화된 면역 세포의 혈청에서 sCD28을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단을 차단하는 제제의 능력을 시험하는 것은 제제, 프로테아제 및 절단 부위를 포함하는 CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편의 혼합을 포함한다. 일부 구현예에서, 시험은 단절 및/또는 절단을 확인하기 위해 CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편을 서열분석하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 시험은 절단에 의한 크기 변화를 측정하기에 충분히 민감한 겔 상에 CD28의 세포 외 도메인 또는 이의 단편을 검사하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 시험은 제제 및 프로테아제의 존재하에 mCD28을 발현하는 세포로부터 sCD28의 생산을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 상어 또는 낙타과를 상기 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화시키고 상기 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하기 위한 제제의 라이브러리를 선별하고 결합하는 제제를 선택하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체를 수집하는 것은 면역화된 상어 또는 낙타과의 비장으로부터 B 세포를 추출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, B 세포는 흑색종 세포와 융합되어　하이브리도마를 생성한다. 일부 구현예에서, 항체는 하이브리도마의 배양 배지로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 유기체를 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화시키고, 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기체는 마우스이다. 일부 구현예에서, 유기체는 토끼, 마우스, 랫트, 상어, 낙타과, 닭, 염소 및 파지로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 낙타과는 낙타 및 라마로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 수집은 채혈을 포함한다. 일부 구현예에서, 수집은 하기 단계를 포함한다:
a. 면역화된 유기체의 비장으로부터 B 세포를 추출하는 단계;
b. 추출된 B 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계; 및
c. 하이브리도마로부터 항체를 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하기 위한 제제의 라이브러리를 선별하고 결합하는 제제를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 비장 B 세포로부터 유래된 면역화된 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 IgG 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 Fab 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 VHH 항체의 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 단일 사슬, 단일 도메인 또는 나노바디의 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 제제를 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제를 수득하는 것은 제제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서 제제를 선택하는 것은 제제를 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제를 선택하는 것은 제제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 형태는 제제의 서열로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 방법은 제제를 인간화하는 것을 추가로 포함한다.
세포 내에서 제제를 암호화하는 핵산 분자의 발현은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이는 많은 방법 중에서, 형질감염, 바이러스 감염, 또는 세포 게놈의 직접 변경에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터에 있다. p16-Ink4a를 함유하는 발현 벡터의 한 가지 그러한 예는 Addgene으로부터　입수　가능한 포유동물 발현 벡터 pCMV p16 INK4A이다.
벡터 핵산 서열은 일반적으로 세포에서 증식을 위한 적어도 하나의 복제 기점 및 선택적으로 추가 요소, 예를 들어 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 제어　요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선별 마커 (예를 들어, 항생제 내성), 폴리-아데닌 서열을 포함한다.
벡터는 비바이러스 방법을 통해 또는 바이러스 방법을 통해 전달되는 DNA 플라스미드일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포에서 활성일 수 있다. 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있다.
일부 구현예에서, 제제를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예를 들어 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포에서) 조절 요소 또는 요소들에 연결됨을 의미하고자 의도된다.
일부 구현예에서, 벡터는 전기천공 (예를 들어, From 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)에 기술된 바와 같음), 열 쇼크, 바이러스　벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내에서, 또는 표면상에서 핵산을 갖는 작은 입자의 고속 탄도 침투 (Klein 등, Nature 327. 70-73 (1987)), 및/또는 등을 포함하는 표준 방법으로 세포에 도입된다.
본원에서 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소 즉, RNA 중합효소 II에 대한 개시 위치 주위에 클러스터된 전사 제어 모듈의 그룹을 지칭한다. 프로모터는 각각 대략 7-20 bp의 DNA로 이루어지고, 전사 활성인자 또는 억제자 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 별개의 기능 모듈로 구성된다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 RNA 중합효소 II (RNAP II 및 Pol II)에 의해 전사된다. RNAP II는 진핵 세포에서 발견되는 효소이다. 이는 mRNA의 전구체 및 대부분의 snRNA 및 마이크로RNA를 합성하기 위해 DNA의 전사를 촉매한다.
일부 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3, pcDNA3.1 (±), pGL3, pZeoSV2(±), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, 이는 Invitrogen으로부터 입수 가능하고, Promega로부터 입수 가능한 pCI, Strategene으로부터 입수가능한 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, Clontech으로부터 입수 가능한 pTRES, 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스와 같은 진핵 세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 본 발명에 의해 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 구현예에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시하에 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 측면 감염 및 특이성 표적화와 같은 장점을 제공하는, 재조합 바이러스 벡터는 생체 내 발현을 위해 사용된다. 한 구현예에서, 측면 감염은 예를 들어, 레트로바이러스의 수명 주기에 내재되어 있고 단일 감염된 세포가 발아하고 주변 세포를 감염시키는 많은 자손 비리온을 생성하는 과정이다. 한 구현예에서, 결과는 넓은 영역이 빠르게 감염된다는 것이고, 그 대부분은 초기에 원래의 바이러스 입자에 의해 감염되지 않는다. 한 구현예에서, 측면으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터가 생성된다. 한 구현예에서, 이 특성은 원하는 목적이 특정 유전자를 국부화된 수의 표적 세포에 도입하는 것인 경우에 유용할 수 있다.
다양한 방법이 세포에 본 발명의 발현 벡터를 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), ectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa 등. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있고 예를 들어, 안정 또는 일시적 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및　재조합 바이러스 벡터로의　감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해 미국 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992 참조.
삽입된 코딩 서열 (폴리펩티드를 암호화함)의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 것보다, 본 발명의 발현 작제물은 또한 안정성, 생산, 정제, 발현된 폴리펩티드의 수율 또는 활성을 최적화하도록 조작된 서열을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
다른 양태로, 본 발명의 방법에 의해 생산된 제제가 제공된다.
다른 양태로, 본 발명의 방법에 의해 생성된 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값과 결합될 때 기준치의 플러스 및 마이너스 10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000 나노미터 (nm)의 길이는 1000 nm+- 100 nm의 길이를 지칭한다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수 지시어를 포함함을 유의한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 다수의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하고 "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드 및 당업자에게 공지된 이의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 단독", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 역할을 하기 위한 것이다.
"A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업자가 관례를 이해할 수 있는 의미에서 의도된다 (예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B가 함께, A 및 C가 함께, B 및 C가 함께, 및/또는 A, B, 및 C가 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않음). 명세서, 청구범위, 또는 도면에서든지 둘 이상의 대안적 용어를 제시하는 사실상 모든 이접적 단어 및/또는 구절은 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나 또는 두 용어 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 구절 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 기술된, 본 발명의 소정의 특징은 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있음을 알 수 있다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 속하는 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 그 요소의 모든 하위 조합이 또한 본 발명에 구체적으로 포함되고 마치 각각 및 모든 이러한 하위 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규한 특징은 제한되는 것으로 의도되지 않는, 하기 실시예를 조사할 경우 당업자에게 명백해질 것이다. 추가로, 위에서 설명한 바와 같고 아래의 청구항 섹션에서 주장한 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 양태 각각은 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
위에서 설명한 바와 같고 아래의 청구항 섹션에서 주장한 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험 절차는 분자생물학, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 제시된 바와 같은 방법론; " Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); Freshney의 "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique", Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등 (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) 참조; 이들 모두는 참고로 포함된다. 다른 일반 참고 문헌은 본 문서에 걸쳐 제공된다.
재료 및 방법
항체- 시판 마우스 단일클론 항-CD28 클론 #CD28.2 (Biolegend, 카달로그 번호 302902) 및 FITC 접합 (Biolegend, 카달로그 번호 302906). 염소 다클론 항-CD28 (R&D system, 카달로그 번호 AF-342-PB). FITC 접합 항-인간 PD-L1 (BD bioscience, 카달로그 번호 558065). APC 접합 항-인간 PD-L2 (Biolegend, 카달로그 번호 345508). PE 접합 항-인간 IDO (R&D system, 카달로그 번호 IC6030P). 염소 항 마우스 IgG Alexa Fluor 647 (Biolegend, 카달로그 번호 405322). 당나귀 항 인간 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 (Jackson immune research, 카달로그 번호 709-605-149). 염소 항 마우스 IgG HRP (Jackson immune research, 카달로그 번호 115-035-071). 항-인간 CD3 클론 OKT3 (Biolegend, 카달로그 번호 317304). 항-인간 PD-1 펨브롤리주맙 (MK-3475). 인간 IgG (Sigma, 카달로그 번호 I4506).
인간 CD28 수용체의 줄기 영역을 표적화하는 VHH의 단리 - 나이브 비-면역화된 라마로부터 유래된, 말초 B 세포의 유전자 코드를 C-말단 His6-Myc 태그를 갖는 융합 단백질로서 개별 VHH를 발현하는 입자로 구성된 파지 라이브러리를 구축하기 위해 사용하였다. 나이브 라이브러리를 인간 CD28의 줄기 영역에 결합하는 능력을 갖는 나노바디를 선택하기 위해 사용하였다. C-말단에 비오틴 첨가된 "HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 10)"의 서열을 갖는 비오틴화 재조합 CD28-Fc 키메라 또는 산화된 이량체 펩티드로 선별을 수행하였다. 각각의 항원을 탈지유로 차단된 스트렙타비딘 자성 비드에 결합시켰다. 파지의 용액 내 선택을 파지 투입량 및 항원 농도를 변화시키면서 3회의 연속적인 선택 라운드에 걸쳐 동일한 항원을 사용하여 수행하였다. 항원이 없는 차단된 비드를 대조군으로 사용하였다. 결합된 파지의 용출을 트립신으로 20분 동안 수행하였다. 용액 내 선택 동안의 농축 비율을 항원 선택 조건이 없는 조건에서 용출된 파지 수에 대한 CD28 항원 선택 조건에서 용출된 파지 수 사이의 비율로 계산하였다. 파지 또는 주변 세포질 형식에서, 선택된 산출의 279개의 개별 파지 모노-클론을 ELISA에 의해 항원 결합에 대해 확인하였고 유세포 분석에 의해 막 CD28에 대한 결합에 대해 특성화하였다. 72개 클론은 주변 세포질 형식에서 줄기 영역 펩티드에 특이적인 결합을 보였고, 22개는 독특한 CDR 서열을 갖는 것으로 입증되었고 6개만이 특징적인 CDR3 패밀리에 속하는 것으로 밝혀졌다. 6개의 VHH는 c-말단 His 태그를 갖는 CHO 세포에서 재조합 단백질로 생산되었고 항-배출 활성 및 세포 결합에 대해 평가되었다. 형질감염 - CD28wt (전장 CD28 전사체를 암호화함) 플라스미드를 DNA 서열을 PCDNA3.1 벡터로 클로닝하여 생성하였다. 형질감염을 Jet Pei 형질감염제 (PolyPlus Transfections)를 사용하여 수행하였다. 안정한 형질감염체를 G418-함유 배지에서 선택하였다.
ELISA - 시판 ELISA 키트를 인간 인터페론-감마 (Biolegend, 카달로그 번호 430103), 인간 인터루킨 2 (Biolegend, 카달로그 번호 431802), 인간 인터루킨 6 (Biolegend, 카달로그 번호 430502), 인간 인터루킨 10 (Biolegend, 카달로그 번호 430603), 인간 종양 성장 인자 베타 1 (Biolegend, 카달로그 번호 436708), 인간 인터루킨 베타 1 (Biolegend, 카달로그 번호 437004) 및 인간 CD28 (R&D system, 카달로그 번호 DY342)의 양의 정량화를 위해 사용하였다. 세포 증식 및 생존율 (MTT 분석)을 제조사 지침에 따라 수행하였다 (Roche, 카달로그 번호 11465007001). 카이누레닌 (IDO 활성) ELISA 키트를 제조사 지침에 따라 수행하였다 (ImmuSmol, 카달로그 번호 BA E-2200).
CD28 줄기 영역 결합 분석 - 비오틴 접합 야생형 또는 L145K CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 ELISA maxi-sorb 플레이트 상에 고정화하였다. VHH 클론 (0.2-5 μg/mL)의 연속 희석을 수행하였고 결합된 VHH의 검출을 항 His 태그-HRP 접합 항체로 수행하고 TMB로 발달을 수행하였다.
사이토카인 멀티플렉스 - 여러 사이토카인의 동시 평가를 Magpix 시스템 (Millipore) 상에 ProcartaPLex (Invitrogen, 카달로그 번호 PPX-07-MXXGPY2)를 사용하여 수행하였다.
유세포 분석 - 일반적으로, 세포를 모든 단계 동안 얼음 위에서 보관하였다. 염색하기 전, 5Х105 세포를 15분 동안 FACS 완충액 (0.1 % BSA를 갖는 PBS)에서 50 μg/mL 인간 IgG (Sigma, 카달로그 번호 I4506)로 차단하였다. 항체를 제조사가 권장하는 농도로 사용하고 어둠 속에서 30분 동안 배양하였다. 배양을 96-웰 U 바닥 플레이트에서 100 μL의 부피로 수행하였다. 세포를 200 μL의 FACS 완충액으로 2회 세적하고 분석을 위해 150 μL의 FACS 완충액 중 FACS 튜브로 옮겼다. 세포를 Gallios 유세포 분석 획득 소프트웨어에 대한 칼루자를 사용하여 Gallios 유세포 분석기 (Beckman Coulter)에서 분석하였다.
세포주 및 인간 면역 세포의 단리 - 저캇 백혈병 T-세포 림프모구 세포주 클론 E6.1 및 SCC-25 혀 편평 세포 암종을 ATCC로부터 수득하였다. PBMC를 표준 림프구 분리 배지 (MBP, 카달로그 번호 850494)를 사용하여 건강한 공여자의 신선한 혈액 샘플에서 단리하였다. CD3 세포를 음성 선택 방법에 의해 RossetteSEP™ 인간 T 세포 농축 키트 (STEM세포, 카달로그 번호 15061)를 사용하여 건강한 공여자의 신선한 혈액 샘플에서 단리하였다. CD4 세포를 음성 선택 방법에 의해 EasySep™ 인간 CD4 T 세포 농축 키트 (STEM세포, 카달로그 번호 19059)를 사용하여 건강한 공여자의 신선한 혈액 샘플에서 단리하였다. 단핵구를 음성 선택 방법에 의해 EasySep™ 인간 단핵구 농축 키트 (STEM세포, 카달로그 번호 17952)를 사용하여 건강한 공여자의 신선한 혈액 샘플에서 단리하였다. 모든 세포를 10% HI-FCS 및 pen/strep 혼합물로 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다.
CD86 차단 FACS - 인간 CD28로 안정적으로 형질감염된 0.5Х106 HEK293 세포를 실온에서 30분 동안 항 CD28 항체 (CD28.2, 10 μg/mL) 또는 VHH 클론 (30 μg/mL)없이 또는 이와 함께 2 μg/mL CD86-Fc (R&D systems, 카달로그 번호 141-B2)로 배양하였다. 세포를 세척하고 얼음 위에서 20분 동안 1:5000 희석도로 형광단에 접합된 항-인간 중쇄 및 경쇄 항체를 사용하여 2차 결합을 위해 취하였다.
수지상 세포 분화 - 단핵구를 3일 및 6일에 재생되는 성장 인자를 갖는 RPMI 배지에서 1Х106/mL의 밀도로 배양하였다. 미성숙한 수지상 세포 (iDC)를 50 ng/mL GM-CSF 및 20 ng/mL IL-4로 6일 동안 유도시켰다. 필요할 때 iDC를 48시간 동안 100 ng/mL LPS을 첨가하여 성숙한 수지상 세포로 추가로 분화시켰다. 생성된 세포 집단은 관련 마커의 FACS 분석 및 특징적인 분석 사이토카인 분비 분석에 의해 표시된 표현형에 대해 시험되었다.
메탈로프로티나제 - 시판 재조합 인간 메탈로프로티나제 MMP-2를 Anaspec (카달로그 번호 AS-72005) 또는 R&D system (카달로그 번호 902-MP) 둘 다로부터 사용하였다. 시판 재조합 인간 메탈로프로티나제 MMP-13을 R&D system (카달로그 번호 511-MM)으로부터 구매하였다. Pro-MMP2 및 Pro-MMP-13을 제조사 프로토콜에 따라 37℃에서 1-2시간 동안 1 mM p-아미노페닐수은 아세테이트 (APMA)로 활성화시켰다.
프로테아제 억제제 - 프로테아제 억제제를 각 실험의 시작시에 지정된 농도로 첨가하였다. 1주 동안의 분석에서 억제제의 또 다른 부분은 최종 농도에서　3일　후에 추가되었다. 사용된 프로테아제 억제제는 TAPI-1 (Cayman, 카달로그 번호 18505), GM6001 (Santa Cruz, 카달로그 번호 SC-203979), TMI-1 (Sigma, 카달로그 번호 PZ0336) 및 GI254023X (Sigma, 카달로그 번호 SML0789)였다. 언급된 곳에서 프로테아제 칵테일은 TAPI-1 및 GM6001의 혼합물로 등몰비로 구성되었다.
합성 펩티드 - "DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 41)-비오틴"의 최종 형태를 갖는 기질 펩티드를 5개의 글리신 서열 및 C-말단 비오틴 접합이 이어지는 N-말단 cMyc 태그 사이에 인간 CD28 줄기 영역의 아미노산 서열 (His134-Pro152)을 포함하도록 설계하였다. 펩티드는 Gencust Europe에 의해 맞춤 합성되었다. 위치 141에서 시스테인 잔기를 이황화 결합에 의해 이량체 펩티드를 생성하기 위해 사용하였다. 절단 부위에서 돌연변이, 위치 145에서 류신에서 라이신으로의 치환을 갖는 CD28 줄기 영역 펩티드는 "DYKDDDDKGGGGGHVKGKHLCPSPKFPGPSKP (서열 번호 42)-비오틴"의 최종 형태와 유사하게 합성되었다.
시험관 내 절단 분석- 50 ng의 정제된 재조합 MMP-2 또는 MMP-13을 MMP 억제제 (TMI-1, 50 nM), M9 Fab 또는 표시된 VHH 클론의 존재 또는 부재하에 5시간 동안 다양한 농도 (0.4-10 μg/mL)에서 0.125 μM 이량체 c-Myc-태그된 비오틴화 기질 펩티드와 배양하였다. 분석을 50mM 트리스, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05% Brij-35, pH 7.5에서 수행하였다. 5시간 후 절단 반응 혼합물을 펩티드의 최종 1 nM 농도로 희석하고 펩티드에 결합하기 위해 뉴트라비딘 플레이트에 로딩하였다. 실온에서 1시간 배양 후 플레이트를 세척하고, 절단되지 않은 펩티드의 검출을 HRP에 대한 항-cMyc 항체 접합을 사용하여 수행하였다.
가용성 CD28의 생성을 위한 CD4 T 세포 또는 저캇 T 세포주의 PHA 활성화 - 1Х105 저캇 세포 또는 CD4 T 세포를 표시된 농도의 식물적혈구응집소 (Sigma, 카달로그 번호 L8902) 및 다양한 프로테아제 억제제로 추가 5일 (저캇) 또는 7일 (CD4 T 세포) 동안 배양하였다.
가용성 CD28의 생성을 위한 PBMC의 SEB 또는 CMV 활성화 - 0.3Х106 PBMC를 48 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 프로테아제 억제제 유무로 37℃에서 5-7일 동안 0.5 ng/mL SEB (Sigma, 카달로그 번호 S4881)로 자극하였다. 대안적으로, 0.1Х106 PBMC를 96 웰 플레이트 형식 분석에서 0.5 ng/mL SEB로 자극하였다. CMV 자극을 위해 0.5Х106 PBMC를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 프로테아제 억제제 유무로 37℃에서 2-5일 동안 0.5 μg/mL CMV 펩티베이타 (Milteny Biotec, 카달로그 번호 130-093-435)로 자극하였다. 연속 배출 실험을 위해 PBMC를 24시간 동안 24 웰 플레이트에서 SEB 또는 CMV로 자극하고, 세포를 취하고 자극제 없이 RPMI로 3회 세척하고 96 웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 표시된 시간에 샘플을 채취하고 가용성 CD28에 대한 검사까지　동결 조건　하에 두었다.
VHH의 항 배출 활성을 평가하는 세포 분석 -PBMC의 SEB 활성화를 위해, 0.1Х106 PBMC를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리 유무로 37℃에서 5-7 일 동안 2 ng/mL SEB (Sigma, 카달로그 번호 S4881)로 자극하였다. PHA 활성화된 T 세포를 위해, 0.1Х106 CD4 T 세포를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리 유무로 37℃에서 5-7일 동안 표시된 농도의 식물적혈구응집소 (Sigma, 카달로그 번호 L8902) 및 200 IU/mL의 IL-2 (프로루킨)와 함께 배양하였다. HEK 자발적 CD28 배출 분석을 위해, 0.1Х105 HEK 세포를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 다양한 처리 유무로 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
혼합 림프구 반응 - 1Х105 미성숙한 DC를 6일 동안 5Х105 단리된 자발적 CD3 T 세포와 혼합하였다.
이소성 재조합 인간 CD28, 인간 CTLA-4 및 인간 CD80을 사용하는 SEB 또는 CMV 자극 분석 - CMV 자극을 위해 (건강한 또는 암 환자 공여자로부터의) 0.5Х106 PBMC를 96 웰 플레이트에서 표시된 농도의 재조합 인간 CD28 (R&D systems, 카달로그 번호 342-CD), 인간 CTLA-4 (R&D systems, 카달로그 번호 434-CT), 인간 CD80 (R&D systems, 카달로그 번호 140-B1) 유무로 37℃에서 2-5일 동안 0.5 μg/mL CMV 펩티베이터 (Milteny Biotec, 카달로그 번호 130-093-435)로 자극하였다. SEB 설정을 위해, 1Х105 PBMC를 72시간 동안 표시된 농도의 재조합 인간 CD28의 존재하에 0.5 ng/mL 스타필로코칼 엔테로톡신 B (SEB) (Sigma, 카달로그 번호 S4881) 농도로 배양하였다. 명시된 경우, 항-PD1 또는 인간 IgG를 5 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다.
자가 단핵구 CD3 MLR - 0.5Х106 T 세포를 동일한 CMV 반응성 공여자로부터의 0.5Х105 단핵구와 혼합하고 표시된 농도의 처리 유무로 37℃에서 6일 동안 0.5 μg/mL CMV 펩티베이터로 자극하였다.
재조합 인간 CD28를 사용하는 단핵구 자극 -1.5Х106 단핵구를 48시간 동안 표시된 농도에서 재조합 인간 CD28의 존재하에 100-100 U/ml IFN 감마 (R&D system, 카달로그 번호 285-IF)가 있는 RPMI 배지의 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 생성된 세포 집단은 관련 마커 (IDO, PD-L1 및 PD-L2)의 FACS 분석 및 특징적인 사이토카인 (IL-6)의 분비 분석에 의해 표시된 표현형에 대해 시험되었다.
OKT3을 사용한 T 세포 자극 - (건강한 공여자로부터의) 0.1Х106 단리된 CD3 T 세포를 37℃에서 48-72시간 동안 표시된 양의 항-CD3 클론 OKT3로 자극하였다. 명시된 경우 재조합 인간 CD80-Fc (2 μg/mL, R&D system)를 가용성 형태로 첨가하였다. 항체 또는 CD28에 대한 VHH 또는 대조군을 가용성 형태로 표시된 농도에서 첨가하였다.
트랜스 웰 기반 분석에서의 단핵구와 SCC-25 암 세포주의 공동 배양 - 4Х104 SCC-25 세포를 혈청이 없는 기아 배지에서 4일 동안 표시된 처리 유무로 세포 배양 삽입 (Millipore, 카달로그 번호 MCHT241148)에 놓인 1Х105 단핵구를 갖는 24 웰 플레이트의 바닥에 플레이팅하였다.
암 환자의 혈장에서 가용성 인간 CD28의 검출 - 10개의 상이한 암 적응증 및 건강한 공여자 각각의 20개의 동결 혈장 샘플을 DxBiosamples (San Diego, CA, USA)로부터 구매하였다. 혈장 샘플을 1:20으로 희석하고 ELISA에 의해 가용성 인간 CD28에 대해 분석하였다. 높은 sCD28을 갖는 샘플을 적절한 희석으로 다시 분석하였다.
직접 CD28 EIA - 달리 논의하지 않는 한, 코닝 고 결합 플레이트 또는 등가물을 선별을 위해 사용하였다. 각 웰은 200-300 ng의 인간 CD28-Ig 키메라 (R&D, 카달로그 번호 342-CD), 마우스 CD28-Ig 키메라 (R&D, 카달로그 번호 483-CD) 또는 CD28의 줄기 영역 아미노산 서열 (Gly137-Pro152)로 구성된 BSA 접합 이량체 펩티드로 코팅되었다. 플레이트를 PBS 중 5% 우유 또는 1% 카제인을 사용하여 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBST를 사용하여 3회 세척하고 1:5000으로 희석된 염소 항 마우스 HRP Fc 특이적 검출 후 조사된 항체와 함께 배양하였다. 양성 대조군은 마우스 항 인간 CD28 클론 28.2 또는 면역화된 마우스로부터의 마우스 혈청이다. 하이브리도마 상청 배양액을 희석하지 않고 선별하였다.
항체 서열분석. 항체를 아미노산 서열분석을 위해 Rapid Novor 회사로 공급하였다. 서열분석을 6가지 효소 (펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, Lys C 및 Asp N)로 효소 소화　후　수행된 LC-MS 분석을 포함하는, 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 이황화물 환원, 및 알킬화로 소화를 수행하였다. LC-MS/MS 분석을 Thermo-Fisher Q-exactive 질량 분석기를 사용하여 수행하였다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 모두에서 아미노산 잔기의 100%는 상당한 지지 단편 이온과 함께, 적어도 5개의 펩티드 스캔으로 덮여 있었다. CDR은 초티아 계획을 사용하여 결정하였다.
실시예 1: 인간 CD28은 만성 자극 동안 단백질분해 배출을 겪는다
가용성 CD28 (sCD28)을 만성적으로 자극된 인간 PBMC의 배양에서 ELISA에 의해 검출하였다 (도 1, 상단 차트). 현상은 자극, 인공 (SEB) 또는 생리학적 (CMV) 성질에 관계없이 명백하고, 현상의 견고함을 나타낸다. 가용성 CD28의 기원은 TAPI-1 및 GM6001 (광범위 MMP 및 ADAM17 억제제) 처리가 용량 의존적 방식으로 sCD28의 양을 감소시키기 때문에, 막 형태의 배출에서 비롯된다 (도 1, 상단 차트). 배출된 CD28의 세포원은 도 2에서 볼 수 있는 것처럼 T 세포이다. 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터의 저캇 T 세포주 또는 인간 CD4 T 세포의 PHA의 만성 자극은 용량 의존적 방식으로 sCD28의 생성을 초래한다 (도 2, 상단 차트). TAPI-1 및 GM6001 처리가 각 PHA 농도 (도 2, 상단 차트)에서 및 고정된 PHA 농도에서 용량 의존적 방식으로 sCD28의 양을 감소시킨다 (도 2. 하단 차트).
고도로 특이적인 ADAM-10 억제제인 GI254023X로의 처리는 용량 의존적 방식으로 활성화된 면역 세포로부터 sCD28 방출의 거의 완전한 억제를 초래하였다 (도 3a, 하단 패널). 유사한 결과가 DAM-17 특이적 억제제 TMI-1에서도 관찰되었다 (도 3b, 하단 패널). 면역 세포의 생존력은 배양물에서 세포의 대사 활성을 확인하는 MTT 분석에 의해 모니터링되었다. 결과는 ADAM 억제제를 사용하거나 사용하지 않는 처리 간에 유의한 차이가 없음을 나타냈고, 낮은 sCD28 수준이 프로테아제 활성의 차단에 의해 유발되고 프로테아제 억제제에 의해 유발된 세포 사멸의 인공물이 아님을 암시한다 (도 3a-b, 상단 패널).
sCD28의 생성은 더욱 생리학적인 시스템에서도 확인되었다. 우선, 항원 제시 세포에 의한 T 세포의 생리학적 자극을 모방하는 단리된 자가 수지상 세포 및 CD4 T 세포를 이용하였다. sCD28의 상승은 두 세포 집단을 혼합할 때 CMV가 배양물에 첨가되었을 때 훨씬 더 뚜렷해졌다 (도 4a). 이는 인간 CD28 단백질이 만성 자극이 발생할 때 단백질분해 배출 과정을 경험한다는 것을 나타낸다.
다음으로, 인간 PBMC를 24시간 동안 CMV 펩티드 (도 4b), 또는 SEB (도 4c)로 자극하였다. 그 후, 세포를 세척하여 자극제를 제거하고 다양한 시간 동안 자극 신호 없이 다시 플레이팅하였다. 이어서 배양 배지에서 sCD28의 존재를 조사하였다. sCD28의 축적은 시간이 지남에 따라 명확하게 보인다. 게다가, 축적은 도 4d에서 볼 수 있는 것처럼 ADAM-10 및 ADAM-17의 활성의 의존성이다. SEB 자극 후, 상이한 농도에서 특이적 억제제의 첨가는 120시간 후 정량화된 sCD28의 양 감소를 초래하였다. 이 연구는 CD28 배출이 T 세포의 일차 활성화시 발생하고 일정하거나 반복적인 자극이 필요하지 않기 때문에, 환자의 혈액에서 많은 양의 가용성 CD28의 존재를 설명할 수 있다.
실시예 2: 가용성 인간 CD28은 면역 억제 활성을 갖는다
도 1 (하단 차트)에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로테아제 억제제 칵테일을 사용한 sCD28 수준의 저하는 분비된 IFN 감마의 수준에 의해 나타나는 바와 같이 T 세포 활성화의 상승과 직접적으로 관련되고, sCD28이 면역억제 기능을 가짐을 시사한다. 프로테아제 억제제 칵테일 농도의 증가는 세포의 배지에서 더 낮은 수준의 sCD28을 유도하고 이러한 낮은 수준의 sCD28은 더 높은 수준의 분비된 IFN 감마와 반비례 관계가 있었다. sCD28에 의한 면역 억제를 추가로 조사하기 위해, 막횡단 및 세포질 도메인이 결여된 재조합 인간 CD28을 CMV로 자극된 인간 PBMC의 배양물에 추가하였다. 이는 IFN 감마 분비의 용량-의존적 억제를 초래하였다 (도 5). 이 면역 억제 효과는 상이한 인간 PBMC 공여자에서 관찰되었고, sCD28에 의해 차단되는 이 신호전달 축의 견고성을 확인시킨다.
동시에, 인터루킨-6 분비 (도 6 및 7a) 및 인터루킨-10 (도 7a)의 상승이 분명하였다. 이들 사이토카인은 면역 효과기 활성 (IL-10)의 억제 및 STAT-3 신호전달 (IL-6)을 통해 암 증식 및 혈관신생을 지원할 수 있는 유형-2 면역 반응에 대한 면역계의 편향을 나타내는 것으로 보고되었다. 또한, 가용성 CTLA-4 (아바타셉트 모방 - 자가 면역 질환에 대한 등록된 치료법)와의 비교를 수행하였고 사이토카인 분비 프로필에 관하여 면역계에 전반적으로 유사한 영향을 드러냈다 (도 7a).
다음으로, 인간 PBMC를 재조합 인간 CD28 없이 또는 이의 존재하에 SEB (1 ng/mL)로 자극하였다. 인간 IgG를 대조군으로 사용하였다. 림프구 클러스터링, 면역 활성화의 특징은 IncuCyte® S3 Live-Cell을　사용하여　12시간마다 사진을 촬영하여 모니터링하였다. 도 7c에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 인간 sCD28이 존재하면 SEB는 림프구에 본질적으로 아무런 영향을 미치지 않았다. 시험관 내 면역 반응 동안 항원 제시 세포 (APC)가 서로 및 다른 세포 유형과 클러스터링되고, 클러스터링이 휴지기 림프구의 항원 특이적 활성화에 필수적이라는 것은 잘 확립되어 있다. 가용성 CD28은 SEB 면역 반응 동안 클러스터 형성의 양 및 크기를 감소시키는 것으로 보이고, 이는 이것이 APC에 의한 T 세포 특이적 활성화의 제1단계를 억제한다는 것을 의미한다.
단리된 자가 단핵구 및 CD3 T 세포를 혼합된 림프구 반응 (MLR)에서 공동 배양하였을 때 유사한 결과가 관찰되었다. 혼합된 세포를 증가하는 농도의 재조합 인간 sCD28 유무로 CMV 펩티드 (0.5 μg/mL)로 5일 동안 자극하였다. 다시 한번 sCD28이 IL-1B, TGF 베타 및 IL-10의 분비를 동시에 증가시키면서, IFN 감마 분비를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (도 7b).
sCD28은 단핵구에 유사한 면역 억제 효과를 갖는다. 효소 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO)는 필수 아미노산 트립토판을 이화작용하는 그 능력을 통해 면역 조절에 관여한다. 이는 상이한 면역 세포 및 또한 많은 암 세포에 의해 발현된다. 트립토판 부족은 T 림프구 성숙 및 증식을 억제하는 반면, 카이누레닌, 트립토판 이화 작용의 최종 생성물은 다양한 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 면역 내성을 촉진하는 면역억제 대사물질로도 알려져 있다. IDO에 대한 sCD28의 효과를 시험하기 위해, 단리된 인간 단핵구를 인간 IgG의 존재하에 IFNγ (1000 U/mL) 대조군 또는 재조합 인간 CD28 (10 μg/mL)로 48시간 동안 자극하였다. 배양 후, 단핵구를 인간 IDO에 대해 세포 내로 염색하였다 (도 7e). 세포 내 염색을 용이하게 하기 위해 세포를 고정하고 BD Cytofix/Cytoperm 완충액 키트로 투과 가능하게 만들었다. 상이한 처리의 배양 배지를 ImmuSmol 특이적 카이누레닌 ELISA 키트를 사용하여 IDO 활성에 대해 평가하였다 (도 7d). sCD28은 단핵구에서 IDO 발현을 강하게 향상시켰다.
게다가, sCD28이 항-PD1 면역 요법의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. MK-3475 (펨브롤리주맙 또는 키트루다, Merck)은 여러 암 적응증에서 전례 없는 효능을 가진 승인된 약물이다. PMBC 배양에 대한 첨가는 전염증성 사이토카인 분비 (IFN 감마 및 IL-2)를 증가시켰으나, sCD28의 존재가 이러한 면역 활성화 효과를 완전히 폐기시켰다 (도 8a).
유사한 결과가 MLR 설정에서 다시 관찰되었다. MLR을 sCD28 유무로 및 항-PD1 항체 (MK3475, 5 μg/mL) 유무로만 이전과 같이 실행하였다 (도 8b). 예상대로, MK-3475는 IFN 감마 분비를 증가시키고 TGF 베타 분비를 감소시켰다. 특히, sCD28의 존재하에 MK-3475의 효과는 상당히 감소되었다.
sCD28이 항-PD-1 요법의 친활성화 효과를 억제하는 메커니즘을 설명하기 위해, sCD28의 존재하에 면역 세포에서 PD-1 리간드의 발현을 조사하였다. 단리된 인간 단핵구를 대조군 인간 IgG (10 μg/mL)의 존재하에 IFNγ (1000 U/mL) 또는 재조합 인간 CD28 (10 μg/mL,)로 48시간 동안 자극하였다. 배양 후 단핵구를 PD-L1 (도 8c, 왼쪽) 및 PD-L2 (도 8c, 오른쪽)에 대해 염색하였다. 두 리간드 모두 sCD28 과 함께 배양된 단핵구에서 상향 조절되었고, sCD28이 항-PD-1 면역요법의 효과를 우회할 수 있는 한 가지 가능한 방법을 제안한다.
실시예 3: 가용성 인간 CD28이 암 환자의 혈장에서 발견된다
암에서 sCD28의 수준은 소수의 유방암 환자에게서만 나타났고 건강한 개인에서 관찰된 것보다 약간만 높은 것으로 밝혀졌다 (Isitmangil, G., In vivo, 2016). 저자는 sCD28이 유방암의 표지자로 사용될 수 있다고 제시하지만, 기능적 관계는 제시되지 않는다. 이제 가용성 CD28이 면역계의 암 회피를 실제로 향상시킬 수 있다는 것을 알고, 10가지 상이한 암 적응증을 포함하는 220개 샘플 및 건강한 공여자의 20개 샘플에 대한 조사가 수행되었다. 조사는 여러 암에서 높은 sCD28 수준을 발견하였고, 이 수준은 건강한 대조군 또는 유방암 환자에게서 볼 수 있는 것보다 몇 배 더 높았다 (도 9a). 실제로, 일부 흑색종, 대장, 난소, NSCLC 및 두경부암 환자에서 발견되는 sCD28 수준과 비교해 볼 때, 유방암 환자의 수준은 건강한 개인과 유사한 것으로 보인다.
암에서 sCD28의 역할을 추가로 설명하기 위해 PBMC를 상이한 적응증을 갖는 암 환자로부터 단리하였다. 세포를 단독으로, MK-3475와 함께, 재조합 인간 sCD28과 함께, 또는 두 분자의 조합으로 3일 동안 SEB (5 ng/mL)로 자극하였다. 모든 공여자로부터의 세포로부터의 상청액에서 인간 IFN 감마의 농도는 MK-3475가 존재하는 경우에도, sCD28의 존재하에 크게 감소하였다 (도 9b). 실제로, sCD28은 MK-3475의 효과를 존재하지 않게 만들었다.
다음으로, 두경부암 세포주 SCC-25의 세포를 트랜스 웰 분석에서 단독 또는 단핵구와 함께 배양하였다. 단독 성장 SCC-25 세포에 양성 대조군으로 IL-6을 투여하였고, 실제로 MTT에 의해 측정된 (도 9c, 상단) 및 % 컨플루언시에 의해 측정된 (도 9c, 하단), 세포 증식은 증가하였다. 단핵구의 존재하에 암 세포를 성장시키면 증식도 증가했지만, sCD28을 포함하는 공동 배양일 때 훨씬 더 큰 증가가 관찰되었다. 이 데이터는 sCD28이 암 예방 효과가 있음을 추가로 뒷받침한다.
실시예 4: sCD28은 CD80-Fc 효능을 억제한다
CD80은 CD86과 함께 mCD28에 대한 두 가지 주요 리간드 중 하나이다. Fc 모이어티에 융합된 CD80의 세포 외 도메인은 면역 자극 분자로서 사용되고 암 치료법으로서 조사 중에 있다. CD80-Fc 효능에 대한 sCD28의 효과를 조사하기 위해, 단리된 CD3 인간 T 세포를 2 μg/mL 가용성 재조합 인간 CD80-Fc의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3 항체 (OKT3, 2 μg/mL)로 자극하였다. 예상한 대로, CD80-Fc는 IFN 감마 분비를 증가시켰다. 그러나, sCD28의 첨가는 CD80-Fc의 이차 활성화 효과를 상쇄시켰다 (도 10a). 유사하게, 단리된 PBMC를 3일 동안 CMV 펩티드로 자극한 다음 sCD28과 함께 배양시켰을 때 증가된 양의 CD80-Fc가 예상되는 면역 반응을 생성하기 위해 필요하였다 (도 10b).
실시예 5: 생체 내 암에 대한 sCD28의 효과
마우스는 mCD28을 절단하지 않기 때문에, sCD28의 효과는 마우스 모델에서 용이하게 시험될 수 없다. 가장 가까운 옵션은 상승된 sCD28 수준의 상황을 모방하기 위해 마우스에 재조합 sCD28을 투여하는 것이다. 이는 H22 공통유전자 마우스 모델에서 조사되었다. Balb/c 완전 면역적격성 마우스 H22 간세포 암종 세포의 동종이식을 받았다. 세포는 심지어 완전 면역적격성 마우스에서 성장하였고, 항-PD-1 치료법의 첨가는 거의 완전하게 종양 성장을 폐기시켰다 (도 11a). 재조합 인간 sCD28을 첨가하면 항-PD-1 치료법의 효과는 마우스 중 2마리에서 거의 완전하게 폐기되었다 (도 11b). 이는 일부 대상체에서, 증가된 sCD28 수준이 암 진행에 매우 해로운 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 항-배출 항체-기반 제제의 특성화
인간 CD28이 ADAM10 및 ADAM17에 의한 단백질분해 과정을 겪는다는 발견은 단백질분해 배출에 대해 잠재적 감수성을 나타내는 후보 영역에 대한 그 폴리펩티드 서열의 조사를 촉발하였다. 연구는 ADAM10 및 ADAM17은 P1' 부위에서 류신, 발린 및 방향족 잔기를 선호함을 제시하였다. 인간 CD28에서 가장 매력적인 서열 영역은 구형 IgV 도메인을 막횡단 영역에 연결하는, 히스티딘 134 내지 프롤린 152 (서열 번호 10 (HVKGKHLCPSPLFPGPSKP)) 범위인 줄기 부분이다. 이 영역은 총 3개 류신 및 발린 잔기, 뿐만 아니라 페닐알라닌 잔기를 보유하고 프로테아제의 접근을 방해할 수 있는 임의의 이차 구조 요소가 없는 것으로 예측된다. 특히, 줄기 영역은 또한 CD28의 동종 이량체화를 촉진하는 이황화간 결합을 형성하는 시스테인 141을 함유한다. CD28의 올리고머 구조 및 기능 타협을 피하면서 CD28을 배출하기 위해 CD28 줄기 영역에 특이적으로 결합하고 상이한 프로테아제의 결합을 잠재적으로 차단하는 항체 또는 항체 단편의 생성을 목표로, CD1 마우스를 CD28 줄기 영역을 모방하는 이량체 펩티드로 면역화시켰다. 면역화에 사용된 펩티드 서열은 서열 번호 29, GKHLCPSPLFPGPSKPK이고, 히드라지드 화학을 사용하는 KLH 또는 BSA 접합을 허용하기 위해 유리 아미노기를 갖도록 C-말단 라이신을 첨가하였다. 접합을 히드라지드-말단 CD28 펩티드 및 S-4FB 변형된 BSA 사이에서 수행하였고, 이는 부위-특이적 접합을 위한 유리 알데하이드를 생성한다. 이량체화는 비-변성 겔 상에서 펩티드를 실행하여 확인하였다.
직접 CD28 EIA에 의해 측정된 재조합 인간 CD28에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 발견되었다. 이 항체는 M9으로 지칭되고 이 항체의 서열은 위에 제공된다. 항체 M9의 연속 희석을 재조합 인간 sCD28 및 줄기 영역 펩티드에 대한 이의 특이적 결합을 확인하기 위해 사용하였다 (도 12a). 흥미롭게도, 항체가 재조합 인간 sCD28을 검출할 수 있는 반면 면역 세포로부터 실제적으로 배출된 sCD28을 검출할 수 없었다 (도 12b). 이는 항체가 절단 부위에 결합하고, 항체가 결합하는 동위원소가 절단된 형태로 불완전하다는 것을 강력하게 시사한다.
다음으로 세포 표면상의 mCD28에 결합하는 항체의 능력을 조사하였다. 세포로부터 sCD28의 배출을 감소시키기 위해 항체는 용액에 있는 재조합 단백질뿐만 아니라 단백질의 막 형태에 실제로 결합해야 한다. 인간 전장 CD28을 과발현하는 HEK293 세포를 분석하였다. 마우스 CD28은 가용성 형태로 절단되는 것으로 보이지 않으므로 (활성화된 쥐의 비장 세포는 sCD28을 생성하지 않는 것으로 나타남) 인간 단백질을 조사해야 한다. 양성 대조군으로서 M9 항체 및 CD28.2 항체를 사용하여 유세포 분석으로 세포를 분석하였다. 놀랍게도, M9는 표면 mCD28에 결합하는 것으로 보이지 않았다　(도 12c). 이는 막이 인접해 있을 때 입체적 장애 및 줄기 영역에 대한 제한된 접근으로 인한 것일 수 있다.
실시예 7: 단일-도메인 항체는 세포 표면으로부터 sCD28 배출을 억제한다
세포의 표면상의 mCD28에 결합하고 sCD28의 배출을 차단할 수 있는 소형 제제를 설계하였다. 전체 크기 항체는 약 150 kDa 크기이고, 항체로부터 유래된 Fab 단편은 약 50 kDa의 크기지만, 단일 사슬 항체 (단일 사슬 가변 단편, scFv라고도 함)는 약 25 kDa의 크기이고 단일 도메인 항체 (VHH 항체, scFv, 및 DARPin이라고도 함)는 단지 12-15 kDa의 크기이다.
단일 도메인 항체를 나이브 라마 유래된 VHH의 파지 라이브러리를 사용하여 단리하였다. 라이브러리는 나이브 비-면역화된 라마로부터 취한, 즉, B 세포를 추출하고 VHH CDR의 전체 가용 레퍼토리를 서열분석한 VHH 서열로 구성되었다. 이들 CDR은 라이브러리를 생성하기 위해 파지에 구현되었다. ELISA 및 유세포 분석을 사용하여, 라이브러리를 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 재조합 CD28 세포 외 도메인 및 이량체 줄기 영역 펩티드에 대해 선별하였다. 인간 CD28의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 VHH 서열은 다음과 같다: EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 45, 클론 2A1); EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 46, 클론 4A4); 및 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSSAAAHHHHHH (서열 번호 47, 클론 4A1). VHH는 CHO 세포에서 재조합 단백질로서 생산된 다음 하기에 기술된 바와 같이 세포 결합 및 항-배출 활성에 대해 평가되었다. C-말단에서 His-태그는 정제를 위해 사용되었고 삼중 알라닌 반복을 통해 연결되었다. 3개의 조사된 클론의 CDR이 표 1에 제공되어 있다.
표 1
Figure pct00001
인간 CD28 줄기 영역 서열에 대한 VHH 클론의 결합을 VHH 클론의 연속 희석을 사용하는 ELISA로 처음 확인하였다 (도 13). 세포 수준 상의 막 인간 CD28에 대한 결합을 표지된 VHH 클론 및 CD28 과발현 HEK 세포를 사용하는 FACS 분석으로 확인하였다 (도 14). 막 CD28 결합은 CD28 막 근위 영역에 대한 접근을 입증한다. 이전의 실험은 CD28 줄기 영역 펩티드에 결합할 수 있는 전체-크기 항체가 세포 상의 CD28 줄기 영역에 결합할 수 없기 때문에, 제제의 크기가 이 영역에 대한 접근에 중요한 것으로 나타났다. 특히, VHH 클론은 MMP 절단 부위 내에 위치하는 아미노산 잔기 145에서 L-K 치환을 갖는 인간 CD28 줄기 영역 서열에 결합할 수 없었다 (도 23).
항-배출 활성을 펩티드 및 세포 수준 모두에서 확인하였다. VHH 클론이 MMP-2 (도 17), 및 MMP-13 (도 22)에 의해 인간 CD28 줄기 영역의 절단을 차단함을 확인하기 위해 온전한 인간 CD28 줄기 영역 이량체 펩티드를 검출하기 위해 ELISA 기법을 사용하였다. M9 Fab은 MMP-2에 의해 CD28 줄기 영역 펩티드 절단을 차단하는 능력을 나타내는 반면, 위에서 기술한 바와 같이 세포 상의 CD28 줄기 영역에 결합할 수 없고 세포막으로부터 CD28 배출을 억제할 수 없다. 세포 수준에서, 표준 샌드위치 ELISA를 인간 CD28을 과발현하는 HEK 세포 (도 18), PHA 및 IL-2에 의해 활성화된 단리된 CD4 T 세포 (도 19) 및 초항원에 의해 활성화된 PBMC (도 20)의 상청액에서 인간 sCD28의 수준을 측정함으로써 sCD28 배출을 억제하는 VHH 클론의 효능을 확인하기 위해 사용하였다. 예상한 대로, M9 Fab은 상청액에서 sCD28 수준을 감소시키지 않았고, 실제로 배출을 차단하는 이의 능력에 대한 차단제의 크기 및 구조의 중요성을 더욱 강조한다.
냉정하게, VHH 클론은 인간 CD28 기능성을 손상시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 유세포 분석법을 사용하여, VHH 클론은 막에 대한 CD86 결합의 크기를 변경하지　않는 것으로 밝혀졌다 (도 15.). 표준 샌드위치 ELISA를 VHH 클론이 염증 사이토카인 인터페론 감마의 분비된 수준에 의해 측정된 바와 같이 CD28에 작용하지 않음을 나타내는데 사용하였다 (도 16). 활성화 항체 CD28.2를 양성 대조군으로 사용하였다. 유사하게, 표준 샌드위치 ELISA를 사이토카인 IL-2의 분비된 수준에 의해 측정된 바와 같이, VHH 클론이 CD28을 통해 CD80-Fc 자극에 길항작용하지 않음을 나타내기 위해 사용하였다 (도 21).
실시예 8: 세포 표면으로부터 sCD28 배출을 억제하기 위한 다른 소형 제제의 설계
Fab 단편 생성은 시판 키트, 또는 시판되는 서비스를 사용하여 수행된다. 항체 M9의 CDR 영역은 적절한 동위원소에 결합하는 것으로 나타났기 때문에 Fab 생성에 사용된다. 생성된 Fab 단편의 효능은 이 결합이 유지되는지 확인하기 위해 결합 재조합 인간 CD28 및 이량체 줄기 영역 펩티드에 대한 결합 검정에 의해 우선 시험된다. 표면 mCD28에 대한 결합은 인간 CD28을 발현하는 마우스 세포 및 인간 면역 세포에 대한 FACS에 의해 분석된다. 항체 CD28.2는 양성 대조군으로 사용된다. sCD28 배출의 직접 억제는 자극 후 면역 세포 배양에서 시험된다. 배양 배지에서 sCD28은 세포가 Fab 단편의 존재 및 부재하에 있을 때 샌드위치 ELISA에 의해 측정된다. 배출 억제 작용이 있는 Fab 단편은 CD28 신호전달에 대한 이들의 효과에 대해 분석된다. 첫째, 작용을 T 세포로부터 전염증성 사이토카인, 예를 들어 인터페론 감마의 분비를 유도하는 Fab 단편의 능력을 분석하여 시험한다. 둘째, CD80-Fc (작용제)의 결합을 차단하는 능력은 Fab 단편의 길항 특성을 시험하는데 사용한다.
M9 CDR을 사용하는 단일 사슬 항체 생성을 시판 서비스를 사용하는 표준 방법을 사용하여, 또는 CDR을 scFv 골격에 삽입하여 수행한다. 정제를 수행하고 생성된 항체는 Fab 단편에 대해 기술된 것과 동일한 검정에 의해 평가한다.
단일 도메인 항체를 두 가지 전략 중 하나에 의해 생성한다. 1) 나이브 라이브러리 - 나이브 라마 유래된 VHH의 파지 라이브러리의 사용 - 라이브러리는 나이브 라마 비장으로부터 취한, 즉, B 세포를 추출하고 VHH CDR의 전체 가용 레퍼토리를 서열분석한 VHH 서열로 구성된다. 파지로 구현된 이들 CDR은 라이브러리를 생성한다. sCD28에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 재조합 CD28 세포 외 도메인 및 이량체 줄기 영역 펩티드에 대해 라이브러리를 선별한다. 2) 면역 라이브러리 - CD28을 과발현하는 세포로 라마 또는 다른 낙타과 또는 상어를 면역화. 세포 면역화 후 비장을 추출하고 VHH CDR의 가용 레퍼토리를 서열분석한다. 하이브리도마를 추출된 비장 B 세포로부터 제조한다. 생성된 항체를 라이브러리를 생성하기 위해 파지로 구현하고 sCD28에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 재조합 CD28 세포 외 도메인 및 이량체 줄기 영역 펩티드에 대해 라이브러리를 선별한다. 특이적 결합을 하는 단일 도메인 항체를 배출 차단에 대해 평가하고 작용/길항작용을 Fab 단편 및 단일 사슬 항체에 대해 평가한다.
비록　본 발명이 그 특정 구현예와 관련하여 기술되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위에 속하는 그러한 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biond Biologics Ltd. <120> SMALL SHEDDING BLOCKING AGENTS <130> BDB-P-008-PCT <150> 62/954802 <151> 2019-12-30 <150> 62/942,240 <151> 2019-12-02 <150> 62/818351 <151> 2019-03-14 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe 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Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val 130 135 140 Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 145 150 155 160 Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met 165 170 175 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 180 185 190 Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 195 200 <210> 3 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60 attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120 aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180 agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240 aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300 aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660 tga 663 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 5 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Glu Glu 130 135 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Glu Glu 115 120 <210> 7 <211> 538 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60 attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120 aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180 agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240 aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300 aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg tgaggagtaa 420 gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac 480 ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctcctga 538 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu 20 25 30 Asp Ser Ala Val Glu Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln 35 40 45 Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr 65 70 75 80 Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu 85 90 95 Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly 100 105 110 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ser Lys Pro <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Asn Thr Tyr Thr Gly Lys 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gly Asp Ala Asn Gln Gln Phe Ala Tyr 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val Thr 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr 1 5 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile His Trp Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 gacgtgaagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cactttcagt agctattaca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcgacc ataagtgatg gtggtgataa cacctactac 180 gcaggcactg tgacgggccg attcaccatc tccagagact ttgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga acagtctgac ctctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagaattcat 300 tggccttact attttgactc ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Gln Phe Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Met Leu Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 26 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 caatttgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctcccgggga gatgctcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tatatgaact ggtatcagca gaagccagga 120 tcttccccca aaccctggat ttatgccaca tccgacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtcacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaga 318 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro 130 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 Lys <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Stnthetic <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 33 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 34 Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 35 Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 36 Ile Asn Ala Met Ala 1 5 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 37 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is G or A <400> 41 Ile Asn Ala Met Xaa 1 5 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is S or T <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is G or S <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is G or S <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is D or S <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is Y or N <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> X is D or N <400> 42 Ala Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Xaa Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is E or L <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is E or S <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is D or I <400> 43 Asp Xaa Tyr Gly Xaa Asp Tyr Trp Xaa 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is E or L <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is D or I <400> 44 Asp Xaa Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Xaa 1 5 <210> 45 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 46 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Glu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 47 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Arg Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Val Asp Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 48 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu 145 <210> 49 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 115 120 125

Claims (40)

  1. 세포의 표면상의 막 CD28 (mCD28)에 결합하고 상기 mCD28의 단백질 가수분해를 억제하는 제제로서, 상기 제제는 100 킬로달톤 (kDa)보다 작은 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 단편 항체의 항원 결합, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 소분자 및 CD28에 특이적으로 결합하는 펩티드로부터 선택되는, 제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제제는 50 kDa보다 작은, 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 낙타과 또는 상어 항체인, 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 낙타과 항체는 3개의 CDR을 포함하고, 여기서:
    CDR1은 서열 번호 33 (INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 34 (AISGGGDTYYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 35 (DLYGSDYWD)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDR1은 서열 번호 36 (INAMA)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 37 (AITSSGSTNYANSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 38 (DEYGSDYWI)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    CDR1은 서열 번호 33 (INAMG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 번호 39 (AITSGGSTNYADSVKG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3는 서열 번호 40 (DLYGEDYWI)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 낙타과 항체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 제제:
    a.EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSIASINAMGWYRQAPGSQRELVAAISGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVVDLYGSDYWDWGQGTQVTVSS (서열 번호 30);
    b.EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSLFSINAMAWYRQAPGKQRELVAAITSSGSTNYANSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCVVDEYGSDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 31); 및
    c.QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRERVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLEPRDAGVYYCVVDLYGEDYWIWGQGTQVTVSS (서열 번호 32).
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 3개의 중쇄 CDR (CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR (CDR-L)을 포함하고, 여기서:
    CDR-H1은 서열 번호 17 (GFTFSSYYMS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열 번호 18 (TISDGGDNTYYAGTVTG)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3는 서열 번호 19 (IHWPYYFDS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 서열 번호 20 (RASSSVSYMN)으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열 번호 21 (ATSDLAS)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 CDR-L3는 서열 번호 22 (QQWSSHPPT)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 인간화된 것인,　제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 CD28 작용제가 아닌, 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 CD28 길항제가 아닌, 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 상기 mCD28을 저하시키지 않고 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 억제하지 않는, 제제.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편 항체의 항원 결합은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하지 않는, 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 CD28의 줄기 영역 내에 결합하는, 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 줄기 영역은 아미노산 서열 GKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 9) 또는 KGKHLCPSPLFPGPS (서열 번호 27)를 포함하는, 제제.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 줄기 영역은 아미노산 서열 HVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 10)로 이루어진, 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나의 프로테아제에 대한 절단 부위에 결합하는, 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 단백질 가수분해를 억제하는, 제제.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로테아제는 적어도 하나의 메탈로프로테아제인, 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 적어도 하나의 메탈로프로테아제는 MMP-2, MMP-13, 또는 이의 조합인, 제제.
  20. 가용성 CD28 (sCD28) 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 암의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  22. PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법의 개선을 필요로 하는 대상체에서 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제20항 또는 제22항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고　있는 것인, 방법.
  24. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 신장, 위 및 대장암으로부터 선택되는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 두경부, 비소세포폐암, 난소, 및 대장암으로부터 선택되는 것인, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 mCD28을 저하시키지 않거나 mCD28-매개 면역 세포 활성화를 감소시키지 않는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 전의 상기　대상체의 혈액이 적어도 5 ng/ml sCD28을 포함하는, 방법.
  28. 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 방법으로서, 하기 단계 중 적어도 하나를 포함하고, 그에 의해 세포 표면상의 mCD28의 단백질 분해를 억제하는 제제를 생성하는 것인, 방법:
    a. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계로, 여기서 상기 제제는 100 kDa보다 작은 것인 단계;
    b. 상기　수득된　제제의 세포 표면상의 mCD28에 대한 결합을 시험하는 단계; 및
    c. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계;
    및
    d. 제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로, 상기 핵산 서열은 하기 단계에 의해 선택된 제제의 핵산 서열인 단계:
    iv. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계로, 상기 제제는 100 kDa보다 작은 것인 단계;
    v. 상기 수득된 제제의 세포 표면상의 mCD28에 대한 결합을 시험하는 단계; 및
    vi. 세포 표면 mCD28에 결합하는 제제를 선택하는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 상기 수득은 50 kDa보다 작은 제제를 수득하는 것이고, 상기 수득된 제제는 50 kDa보다 작은 것인, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 세포 표면상의 mCD28의 프로테아제에 의한 절단을 차단하는 상기 제제의 능력을 시험하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 프로테아제는 MMP-2, 및 MMP-13으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제를 수득하는 것은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
    a. 상어 또는 낙타과를 상기 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편으로 면역화시키고 상기 면역화된 유기체로부터 항체를 수집하는 단계; 및
    b. CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편에 결합하기 위한 제제의 라이브러리를 선별하고 결합하는 제제를 선택하는 단계.
  33. 제32항에 있어서, 상기 CD28 세포 외 도메인 또는 이의 단편은 이량체 또는 단량체인, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    a. 상기 항체를 수집하는 단계는 상기 면역화된 상어 또는 낙타과의 비장으로부터 B 세포를 추출하는 것을 포함하거나; 또는
    b. 상기 결합하는 제제를 선택하는 단계는 상기 선택된 제제를 서열분석하고 상기 서열로부터 상기 제제의 재조합 형태를 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 제제의 존재하에 mCD28 다운스트림 신호전달을 분석하고 mCD28 신호전달을 실질적으로 작용하지도 실질적으로 길항하지도 않는 적어도 하나의 제제를 선택하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제28항　내지 제35항　중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 제제.
  37. 제1항 내지 제19항 및 제36항 중 어느 한 항의 제제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  38. 암을 치료하고/거나 예방하거나, PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법을 개선하거나, 이를 필요로 하는 대상체에서 sCD28 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제37항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제1항 내지 제19항 및 제36항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 제제를 포함하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 키트:
    a. 항-PD-1 및/또는 PD-L1 면역요법; 및
    b. 본 발명의 제제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 면역요법과 함께 사용하기 위한 것임을 나타내는 표지.
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