JP2022516408A - 単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を刺激し、かつ活性化するためのその使用 - Google Patents

単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を刺激し、かつ活性化するためのその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチド、より具体的には、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドであって、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２、または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される、ヒトペプチドに関する。本発明はまた、免疫寛容を誘導するための方法、移植組織拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減するための方法、ならびにＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離し、拡大するための方法、またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、その免疫抑制活性を刺激するための方法において、ペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチド、およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を刺激し、かつ活性化するためのその使用に関する。
免疫抑制レジメンは、過去数十年間で移植片の長期生存を大幅に改善しているが、それでも同種移植片の慢性移植片機能不全を防ぐことはできず、依然として移植患者の福祉にとって重大な障害である。したがって、ここ数年、主に慢性移植片拒絶、二次的効果、および非特異的免疫抑制のために、同種移植片の生存率の改善は停滞している。
高い抑制能力およびドナー抗原に対する特異性を備えた移植における免疫応答を積極的に制御する制御性細胞集団のヒトでの同定は、制御性Ｔ細胞／エフェクターＴ細胞比（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ）の調節解除を伴う複数の疾患における革命的な治療戦略を生み出した。制御性細胞を用いた細胞治療の確立が近年行われ、骨髄および固形臓器移植のみでなく、自己免疫においても有望な将来の治療法を有する。
いくつかの研究は、生存率、抑制機能の刺激、およびそのような抗原経験のあるＴｒｅｇの優位性のためのＴＣＲによる抗原認識の重要性を示している。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および固形臓器移植の第Ｉ相試験は、明らかな毒性を有さない様々なタイプ（様々なＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、マクロファージ、およびＤＣ）の制御性細胞で開始されたが、現在まで、動物モデルに関する文献は豊富にあるが、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを使用した臨床試験はない。ヒトにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの翻訳の１つの制限は、免疫応答を効率的に抑制するＣＤ４＋Ｔｒｅｇの機能において重要な遺伝子であるＦｏｘｐ３が、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇに対して明確に定義されておらず、また、他の表面マーカーまたはサイトカインによるその発現および機能が、ヒトのＣＤ８＋Ｔｒｅｇについて明確に示されていないことであり得る。
近年では、非常に抑制的なヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの新規集団が同定された（国際公開第２０１７／０４２１７０号）。この集団は、Ｆｏｘｐ３を発現し、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４、およびＴＧＦβを産生し、それらの抑制活性を媒介することを特徴とする。さらに、ＴＣＲバイアスＣＤ８＋Ｔｒｅｇによって認識される優性ＭＨＣクラスＩＩ由来抗原（Ｄｕ５１と呼ばれる）がラットにおいて同定された（国際公開第２０１５／１５０４９２号）。レシピエントラットを抗原Ｄｕ５１のみで治療することにより、ドナー特異的な同種移植片寛容の誘導が生じ、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの生成および機能に対するＴＣＲ／ペプチド／ＭＨＣ相互作用の重要性が強調された。
ここでは、本発明者らは、４つのランダムなヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子から４つの１６ａａペプチドを設計し、ＩＬ－２およびＣｐＧの存在下でＨＬＡ－Ａ２＋ｐＤＣおよび同系ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを使用する５日間の培養アッセイでこれらのペプチドの試験を個別に行った。ペプチドとのインキュベーション後にＣＤ２５およびＣＤ６９の発現がアップレギュレートされることが観察された。さらに、本発明者らは、１つのペプチドの存在下での抗原提示細胞（ＡＰＣ）による拡大が、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの１０倍の拡大をもたらすことを示した。重要なことに、ペプチド拡大ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、新鮮なＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと同様に、同種異系免疫応答の抑制に効果的であった。したがって、本発明は、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチド、免疫寛容を誘導するための、および移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させるためのその使用、ならびにＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを刺激し、拡大するためのその使用、およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を活性化するためのその使用に関する。
本発明は、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチド、およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を刺激し、拡大し、かつ活性化するためのその使用に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
したがって、本発明は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドであって、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２、または配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される、ヒトペプチドに関する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）であるか、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、本発明のペプチドに抱合されたかまたは融合された抗体を含む免疫抱合体に関する。一実施形態では、抗体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面抗原に対して向けられている。
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのペプチドを含むナノ粒子に関する。一実施形態では、ナノ粒子は、リポソームである。本発明はまた、本発明のペプチド、本発明の免疫抱合体、または本発明のナノ粒子を含むワクチン組成物に関する。
本発明はまた、本発明のペプチドがロードされたＭＨＣクラスＩ多量体に関する。本発明はまた、本発明のペプチドまたは本発明のＭＨＣクラスＩ多量体に特異的に結合する抗体に関する。
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明のペプチド、本発明の免疫抱合体、本発明のナノ粒子、または本発明のワクチン組成物に関する。本発明はまた、それを必要とする患者において、移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させる際に使用するための本発明のペプチド、本発明の免疫抱合体、本発明のナノ粒子、または本発明のワクチン組成物に関する。
本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、その免疫抑制活性を刺激するための方法にさらに関し、本方法は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下で、本発明のペプチドを含む培養培地、または本発明のＭＨＣクラスＩ多量体を含む培養培地で培養するステップを含む。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、および／または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）である。
本発明はまた、本発明のペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を、単離し、かつ拡大するための方法に関し、本方法は、本発明のＭＨＣクラスＩを用いたＭＨＣ／ペプチド多量体染色によって本発明のペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離するステップと、次に、ポリクローナル刺激により、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの単離された集団を拡大するステップと、を含む。一実施形態では、ポリクローナル刺激は、抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ ｍＡｂによる刺激である。
本発明はまた、本発明の方法によって得られる、または得られやすいＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団に関する。本発明はまた、それを必要とする患者における移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させる際に使用するためのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団に関する。

定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
数字の前の「約」には、その数字の値のプラスマイナス１０％以下を含む。「約」という用語が指す値は、それ自体も具体的に、好ましくは開示されることを理解されたい。
「同種異系（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」または「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）」とは、材料が導入されるかまたは移植される対象とは同じ種の異なる対象から得られた、または由来した任意の材料（例えば、細胞、組織、器官、移植片、移植組織）を指す。１以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２以上の対象は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の対象由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するためには、遺伝的に十分に異なっている可能性がある。
「自己」とは、後に再導入される同じ対象から得られた、または由来する任意の材料（例えば、細胞、組織、移植片、移植組織）を指す。
「ドナー」は、移植組織または移植片の由来である対象、好ましくはヒト対象を指す。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されたときに有害、アレルギーまたは他の有害な反応を生じない賦形剤または担体を指す。これらの賦形剤または担体としては、例えば、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などの任意のあらゆる溶媒が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤または担体とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤補助剤を指す。ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡまたはＥＭＡなどの規制当局が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たす必要がある。
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。本発明の一実施形態では、患者は、移植組織または移植片、特に同種異系移植組織または移植片を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトである。したがって、一実施形態では、患者は、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態では、患者は男性である。別の実施形態では、患者は女性である。一実施形態では、患者は成人である。本発明によれば、成人は、１８歳、１９歳、２０歳、または２１歳を超える患者である。別の実施形態では、患者は子供である。本発明によれば、子供は、２１歳、２０歳、１９歳、または１８歳未満の患者である。
「レシピエント」とは、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者、好ましくはヒトの患者を指す。
「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療を必要とする患者に有意な負の副作用または有害な副作用を引き起こすことなく、患者に免疫寛容を誘導すること、および／または免疫応答を低減させること、特に移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させることを目的とする、本明細書で定義される単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドの量または濃度を指す。
「治療すること」または「治療」は、治療的治療、予防的または防止的治療、または治療的治療と予防的もしくは防止的治療の両方を指し、その目的は、免疫寛容を誘導すること、すなわち、免疫応答、例えば移植組織または移植片に対する免疫応答を防止する、遅くする（減少させる）、または低減することである。一実施形態では、目的は、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者において、移植組織または移植片に対する寛容または部分寛容を誘導することである。したがって、一実施形態では、この目的は、移植組織または移植片拒絶を防止するかまたは低減することである。一実施形態では、目的は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減することである。一実施形態では、本明細書で定義される単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドの治療有効用量を受けた後、患者は次の少なくとも１つを示す場合、患者は奏効して「治療」されている。ａ）免疫応答のレベルの低下、特に移植組織または移植片に対する免疫応答、例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答のレベルの低下、Ｂ細胞媒介性免疫応答のレベルの低下、および／またはドナー特異的抗体のレベル低下；ｂ）免疫応答、特に移植組織もしくは移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延、またはｃ）免疫応答、特に移植組織もしくは移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行のリスクの低下。疾患の治療の奏効および改善を評価するための上記のパラメータは、医師が精通している日常的な手順によって容易に測定可能である。
本明細書で使用されるとき、「Ｔｅｆｆ」（複数可）は、それぞれ、エフェクターＴ細胞（複数可）を指す。Ｔｅｆｆは、例えば細胞傷害性Ｔ細胞などの特定の免疫応答を開始できるＴ細胞である。
本明細書で使用されるとき、「Ｔｒｅｇ（複数可）」は、それぞれ、制御性Ｔ細胞（複数可）を指す。制御性Ｔ細胞は、異常または過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容において任意の役割を果たすＴ細胞の特殊な亜集団である。制御性Ｔ細胞は、常にではないが、典型的には、フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３＋）制御性Ｔ細胞および／またはＣＤ４５ＲＣｌｏｗ制御性Ｔ細胞である。
本発明の第一の目的は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドであって、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２、または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される、ヒトペプチドに関する。
本明細書で使用されるとき、モチーフＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）において、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、２０の標準アミノ酸（Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶ）のいずれかを指す。
一実施形態によれば、本明細書に記載の本発明の単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、単離されたドナーＭＨＣ由来ヒトペプチドまたは単離されたレシピエントＭＨＣ由来ヒトペプチドである。一実施形態では、本明細書に記載される本発明の単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、単離されたドナーＭＨＣ由来ヒトペプチドである。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、および配列番号１、配列番号２、または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１、配列番号２、または配列番号４の２つのアミノ酸の置換を有する任意のペプチドからなる群から選択され、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、および配列番号１、配列番号２、または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号１、配列番号２、または配列番号４の１つのアミノ酸の置換を有する任意のペプチドからなる群から選択され、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）およびＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）からなる群から選択される。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１または配列番号２と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号２または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである。一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）または配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の２つのアミノ酸の置換を有するペプチドであり、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）または配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つのアミノ酸の置換を有するペプチドであり、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）である。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号２と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである。
一実施形態では、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドは、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである。
「単離された」ペプチドによって、ペプチドは、炭水化物、脂質、または自然界のポリペプチドに関連する他のタンパク質性不純物などの汚染細胞成分を本質的に含まないことが意図されている。典型的には、単離されたペプチドの調製物は、高度に精製された形態、すなわち、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、または９５％を超える純度、例えば９６％、９７％、または９８％以上の純度、または９９％を超える純度のペプチドを含む。特定のタンパク質調製物には単離されたペプチドが含まれていることを示す１つの方法は、タンパク質調製物のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現によるものである。あるいは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または質量分析（ＭＳ）などの他の分析化学技術を使用して純度を決定することもできる。調製物中に存在する主要な種であるペプチドは、実質的に精製されている。
「同一性」または「同一」という用語は、２つ以上のポリペプチドのアミノ酸配列間の関係で使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。こうした方法は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１年；およびＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８年）に記載されているものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、テストされた配列間で最大の一致を与えるように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０年））などのＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の情報源から公開されている（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。
本発明によれば、本発明のペプチドは、従来の自動化ペプチド合成法によって、または組換え発現によって産生され得る。タンパク質を設計し、製造するための一般的な原理は、当業者に周知である。例えば、ペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成器が市販されており、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ；Ｔａｍら、１９８３年；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８６年およびＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，１９７９年に記載されている既知のプロトコルに従って使用できる。本発明のペプチドはまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．からのモデル４３３Ａなどの例示的なペプチド合成器を使用する固相技術によって合成され得る。自動ペプチド合成または組換え法によって生成された任意の所与のペプチドの純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的信頼性は、当業者に周知の任意の方法によって確立することができる。自動ペプチド合成の代替として、選択したペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換するかまたはトランスフェクトし、以下に開示する発現に好適である条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。
本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドをコードする核酸分子に関する。
一実施形態では、本発明の核酸分子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択されるペプチドをコードする。
一実施形態では、本発明の核酸分子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドをコードする。一実施形態では、本発明の核酸分子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドをコードし、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「核酸分子」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。しかし、この用語は、これらに限定されないが、次のようなＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を表現する；４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロ（ｆｉｕｏｒｏ）ウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチル－アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノ－メチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５′－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、および２，６－ジアミノプリン。
一実施形態では、本発明の核酸分子は、本明細書の上記のペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスゲノムである。一実施形態では、本発明の核酸分子は、上記のペプチドをコードする核酸配列を含む組換えウイルスゲノムである。
本発明のさらなる目的は、上記のような核酸分子を含むベクターに関する。
ベクターの例としては、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、特に組換えウイルスが挙げられる。
一実施形態では、本発明のベクターは、ウイルス、特に組換えウイルスである。したがって、本発明はまた、上記のようにペプチドをコードする核酸分子を含むウイルス、特に組換えウイルスに関する。
ウイルスの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスが挙げられる。
一実施形態によれば、本発明のペプチドは、抗体に融合させるかまたは抱合され、したがって「免疫抱合体」を形成する。
典型的には、本発明のペプチドが融合されるかまたは抱合される抗体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面抗原に対して向けられ、その結果、本発明のペプチドは、免疫応答（例えば、寛容）を誘発するために細胞を標的とする。本明細書で使用されるとき、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞を指し、これらに限定されないが、特定のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体は、樹状細胞の表面抗原に対して向けられる。「樹状細胞」（ＤＣ）は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーを指す。これらの細胞は、その独特の形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現を特徴とする（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１（１９９１年）；そのような細胞の説明のために参照により本明細書に組み込まれる）。これらの細胞は、本明細書に開示される複数の組織源から、かつ好都合なことに、末梢血から単離することができる。
したがって、一実施形態では、抗体は、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ－４４、ＣＭＲＦ－５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ－ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ－６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ－２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ－２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン－１、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＦＮ－γ受容体およびＩＬ－２受容体、ＩＣＡＭ－１、フェイ受容体、ＬＯＸ－１、および／またはＡＳＰＧＲに特異的に結合する抗体から選択される。
いくつかの実施形態では、抗体は、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、およびＢ細胞から選択される専門のＡＰＣの細胞表面マーカーに特異的である。
一実施形態では、抗体は、樹状細胞の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ８３、ＣＭＲＦ－４４またはＣＭＲＦ－５６に特異的である。
一実施形態では、抗体は、Ｂ細胞またはマクロファージなどの別の専門の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに特異的であり得る。例えば、ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞、および他の抗原提示細胞で発現するため、より多くの抗原提示細胞が動員されることになる。一実施形態では、抗体はＣＤ４０に特異的である。
分子を抗体に抱合させるための技術は、当技術分野において周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、編、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５年）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」 Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｉｋｅｒ，Ｉｎｃ．，第２版、１９８７年）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｉｎｃｈｅｒａら、編、１９８５年）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｂａｌｄｗｉｎら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８５年）；およびＴｈｏｒｐｅら、１９８２年，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８を参照のこと。また、例えば、ＰＣＴ国際公開第８９／１２６２４号を参照のこと）。典型的には、核酸分子は、それぞれＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはマレイミド官能基を介して、抗体のリジンまたはシステインに共有結合により接着する。遺伝子操作されたシステインを使用した抱合方法または非天然アミノ酸の取り込み方法は、抱合体の均質性を改善することが報告されている（Ａｘｕｐ，Ｊ．Ｙ．，Ｂａｊｊｕｒｉ，Ｋ．Ｍ．，Ｒｉｔｌａｎｄ，Ｍ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｋａｚａｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｈａｌｄｅｒ，Ｒ．，Ｆｏｒｓｙｔｈ，Ｊ．Ｓ．，Ｓａｎｔｉｄｒｉａｎ，Ａ．Ｆ．，Ｓｔａｆｉｎ，Ｋら、（２０１２年），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９，１６１０１－１６１０６．；Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｌａｇｅｌｌａ，Ｋ．Ｍ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ａ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｈａ，Ｅ．，Ｒａａｂ，Ｈ．，Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，Ｄｕｇｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｌｉ，Ｇら、（２０１０年），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｉｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＤＭ１ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６，４７６９－４７７８）。Ｊｕｎｕｔｕｌａら（２００８年）は、「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的抱合体を開発した。これは、従来の抱合方法と比較して、改善された治療指数を示すことが主張されている。抗体に組み込まれている非天然アミノ酸への抱合も、抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）について調査されているが、このアプローチの一般性は、まだ確立されていない（Ａｘｕｐら、２０１２年）。特に、当業者はまた、アシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、Ｇｉｎ含有ペプチドタグまたはＱ－タグ）、またはポリペプチド操作によって反応性にされる内因性グルタミン（例えば、ポリペプチドのアミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異を介して）により操作されたＦｃ含有ポリペプチドをも想定することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミン供与剤（例えば、反応性アミンを含むか、または反応性アミンに接着した小分子）と共有結合により架橋して、アシル供与体グルタミン含有タグまたはアクセス可能／露出／反応性内因性グルタミンを介して、Ｆｃ含有ポリペプチドに部位特異的抱合するアミン供与剤と抱合する操作されたＦｃ含有ポリペプチドの安定、かつ均質な集団を形成することができる（国際公開第２０１２／０５９８８２号）。
本発明のさらなる目的は、本発明の少なくとも１つのペプチドを含むナノ粒子に関する。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドを含み、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子」という用語は、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約２～約５００ｎｍ、さらにより好ましくは約５～約３００ｎｍのサイズの粒子を意味する。ほとんどのナノ粒子の場合、ナノ粒子のサイズとは、ナノ粒子内の２つの最も離れた点の間の距離である。チューブウィスカまたはシリンダーなどの異方性ナノ粒子の場合、直径のサイズは、ナノ粒子が内接する最小のシリンダーの直径である。ナノ粒子のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）、走査型移動度粒径測定装置（ＳＭＰＳ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などの様々な方法で決定できる（Ｏｒｔｓ－Ｇｉｌ，Ｇ．，Ｋ．Ｎａｔｔｅら、（２０１１年），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３（４）：１５９３－１６０４；Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ，Ｐ．ａｎｄ Ｂ．Ｌｉｎｄｍａｎ（２０００年），Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｌ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅ（１９８７年），Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄ ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ）。ナノ粒子は、異なる化学的性質、異なるサイズ、および／または異なる形状で作製され得る。ナノ粒子は、球、針、フレーク、プレートレット、チューブ、ファイバー、キューブ、プリズム、ウィスカの形態をとることができ、または不規則な形状を有し得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、固体ナノ粒子の中から選択される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、無機、有機、または混合であり得る。
一実施形態では、ナノ粒子は鉱物ナノ粒子である。鉱物ナノ粒子の中で、金属酸化物、アルミナ、シリカ、カオリン、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、マイカ、石英などのケイ酸塩、ヘクトライト、ラポナイト、モンモリロナイト、ベントナイト、スメクタイトなどのゼオライトまたは粘土に言及され得る。鉱物粒子としては、これに限定されないが、金属粒子を挙げることができる。一実施形態では、ナノ粒子は金属ナノ粒子である。金属粒子は、金属合金またはアルカリ土類金属、遷移金属、希土類金属、およびそれらの合金から選択される金属のみで形成された粒子を包含する。いくつかの実施形態では、金属は、アルミニウム、銅、カドミウム、セレン、銀、金、インジウム、鉄、白金、ニッケル、モリブデン、シリコン、チタン、タングステン、アンチモン、パラジウム、亜鉛、スズ、およびそれらの合金であり得る。一実施形態では、これらの金属粒子は、それらの表面にグラフトされた化学成分を有するか、またはそれらの表面上に有機硫黄化合物などの化合物の自己組織化単分子膜を有する金属有機修飾ナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄（ＦｅＯ、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）、酸化セリウム（ＣｅＯ）、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、チタン酸塩（ＢａＴｉＯ３、Ｂａ０．５Ｓｒ０．５ＴｉＯ３、ＳｒＴｉＯ３）、酸化インジウム（Ｉｎ２Ｏ３）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、酸化アンチモン（Ｓｂ２Ｏ３）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、酸化マンガン（Ｍｎ３Ｏ４、ＭｎＯ２）、酸化モリブデン（ＭｏＯ３）、シリカ（ＳｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）、オキシ塩化ビスマス、酸化銅（ＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏ）のナノ粒子であり得る。一実施形態では、ナノ粒子はまた、有機金属ナノ粒子であり得る：これらは、有機材料によってコーティングされたかまたはグラフトされた、金属または金属酸化物、炭化物、窒化物、ホウ化物、硫化物および水酸化物のナノ粒子である。一実施形態では、ナノ粒子は、金属無機塩の中から選択され得る。無機塩としては、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸水素マグネシウム（糖部分を含む）が挙げられる。
一実施形態では、ナノ粒子は有機物である。ナノ粒子は有機物である場合、通常は有機ポリマーである。有機ポリマーには、これらに限定されないが、ポリスチレン、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（メチルスチレン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリロニトリル）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（アクリル酸ブチル）、ポリ（アクリル酸）、スチレンとＣ１～Ｃ４アルキル（メタ）アクリレートの共重合体、スチレンとアクリルアミドの共重合体、スチレンとアクリロニトリルの共重合体、スチレンと酢酸ビニルの共重合体、アクリルアミドとＣ１～Ｃ４アルキル（メタ）アクリレートの共重合体、アクリロニトリルとＣ１～Ｃ４アルキル（メタ）アクリレートからの共重合体、アクリロニトリルとアクリルアミドの共重合体、スチレン、アクリロニトリルおよびアクリルアミドからのターポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、共重合体スチレン／ブタジエン、スチレン／アクリル酸、スチレン／ビニルピロリドンおよびブタジエン／アクリロニトリル、またはメトキシポリ（エチレングリコール）－ポリ（ラクチド）共重合体（ＭＰＥＧ－ＰＬＡ）を包含する。ポリマー粒子は、架橋されてもよく、また架橋されなくてもよい。例えば、有機粒子としては、これらに限定されないが、ナイロン（例えばＡＴＯＣＨＥＭにより販売）、ポリエチレン粉末（例えば、ＰＬＡＳＴ ＬＡＢＯＲにより販売）、ポリ－２－アラニン粉末、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、ＤＵＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳにより販売）などのポリフッ素化粉末、アクリル共重合体粉末（例えば、ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡにより販売）、ポリスチレン粉末（例えば、ＰＲＥＳＰＥＲＥＳＥにより販売）、ポリエステル粉末、熱可塑性材料の膨張ミクロスフェア（例えば、ＥＸＰＡＮＣＥＬにより販売）、シリコン樹脂のマイクロボール（例えば、ＴＯＳＨＩＢＡにより販売）、ポリアクリレートなどの合成親水性ポリマー粉末（例えば、ＭＡＴＳＵＭＯＴＯにより販売）、アクリルポリアミド（例えば、ＯＲＩＳにより販売）、不溶性ポリウレタン（例えば、ＴＯＳＨＮＵにより販売）、セルロースの多孔質ミクロスフェア、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）のマイクロまたはナノ粒子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、多糖、すなわち、２つ以上の単糖単位を含む分子でできている。典型的には、多糖類は、デキストラン、プルラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態では、多糖は、プルラン／デキストランの混合物である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は無機物である。一実施形態では、ナノ粒子は、粘土、ケイ酸塩、アルミナ、シリカ、カオリン、カーボンナノチューブ、セルロースナノ結晶、ヒドロキシアパタイトのほか、酸化鉄などの磁性ナノ粒子、炭酸カルシウム、および酸化鉄コア／シリカシェル粒子などのコアシェル粒子から選択される。一実施形態では、小分子またはポリマー鎖をグラフトして、必要に応じて懸濁液中のナノ粒子を安定化させることができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の少なくとも一部はシリカナノ粒子である。
典型的には、本発明のペプチドは、好ましくは、例えば、カルボジイミドまたはスクシンイミドカップリングによって、またはペプチドを共有結合により連結させる別の方法によって、ナノ粒子に共有結合により連結させている。一実施形態では、本発明のペプチドは、ナノ粒子の外側に局在している。ペプチドはまた、ナノ粒子に非共有結合により会合していてもよい。
本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子」という用語には、リポソーム、ポリマーミセル、ポリマー－ＤＮＡ複合体（ポリ複合体）、ナノスフェア、ナノファイバ、ナノチューブ、およびナノカプセルを包含する。これらのナノ粒子は、すべて当技術分野において公知である。このようなナノ粒子の表面は、多くの場合、ＰＥＧブラシによって修飾される（ＰＥＧ化、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がナノ粒子の表面に付着する）。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子はナノカプセルである。本明細書で使用されるとき、「ナノカプセル」という用語は、薬物、すなわち本発明のペプチドが、独特の高分子膜に取り囲まれている空洞に閉じ込められている小胞系を指す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子はナノスフェアである。本明細書で使用されるとき、「ナノスフェア」という用語は、薬物、すなわち本発明のペプチドが物理的かつ均一に分散されているマトリックス系を指す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。
したがって、本発明のさらなる目的は、上記のような少なくとも１つのペプチドを含むリポソームに関する。
一実施形態では、本発明のリポソームは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２または配列番号４と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む。
一実施形態では、本発明のリポソームは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む。一実施形態では、本発明のリポソームは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドを含み、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「リポソーム」という用語は、１つ以上の容積を取り囲む脂質二重層から構成される任意の構造を指し、その容積は、水性区画であり得る。リポソームは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の脂質二重層からなる。「脂質二重層」という用語としては、これらに限定されないが、リン脂質二重層、非イオン性界面活性剤からなる二重層が挙げられる。リン脂質二重層からなるリポソームは、混合脂質鎖を有する天然由来のリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）、またはＤＯＰＥ（ジオレオリル（ｏｌｅｏｌｙｌ）ホスファチジル－エタノールアミン）のような純粋な成分から構成することができるが、これらの成分に限定されない。リポソームとしては、これらに限定されないが、エマルジョン、フォーム、ミセル、エクソソーム、ベシクル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられる。「リポソーム」という用語はまた、ある容積を取り囲む、脂質単層または二重層を含む従来のリポソームの表面に付着した水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））からなる、いわゆる「ステルスリポソーム」（例えば、いわゆるペグ化リポソーム）を含む。本発明における血液脳関門を標的とするのに好適であるリポソームを調製するための多種多様な方法が利用可能である。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０年），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．（１９８４年）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号、および同第５，０１９，３６９号を参照のこと。これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。リポソームの調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲およびリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようにサイズ決定され得る。
本発明によるペプチドをリポソームに連結する方法は、一般に、リポソーム脂質とペプチドとの間の共有結合架橋を含む。別のアプローチでは、本発明によるペプチドは、脂肪酸などの疎水性アンカーで共有結合により誘導体化されており、予め形成された脂質に組み込まれている。
本明細書に開示のペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子は、１つ以上の医薬組成物の一部として投与され得る。したがって、本発明の１つの目的は、上記のペプチド、上記の免疫抱合体、または上記のナノ粒子と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチド（ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする）と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の組成物、特に、本発明によるペプチド、本発明による免疫抱合体または本発明によるナノ粒子、またはその薬学的に許容される塩を、担体および／または賦形剤などの他の剤と共に含む組成物を指す。本明細書で提供される医薬組成物として、典型的には、薬学的に許容される担体が挙げられる。「薬学的に許容される担体」という用語としては、望ましい特定の剤形に適合した、任意のすべての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤などが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０年）には、医薬組成物の配合に使用される様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示している。例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生み出すことによって、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な方法で相互作用することによって、任意の従来の担体媒体が本発明のペプチドと適合しない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることを意図する。薬学的に許容される担体として機能できる材料のいくつかの例としては、これらに限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；オイル、例えば、ピーナッツオイル、綿実油；ベニバナ油、胡麻油；オリーブオイル；コーン油および大豆油；グリコール；例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、および、他の非毒性適合潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；ならびに、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、風味剤および香料が挙げられ、配合者の判断によって、防腐剤および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。
特に、本明細書に開示されているペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子は、ワクチン組成物を調製するのに特に好適である。したがって、本発明の１つの目的は、上記のペプチド、上記の免疫抱合体、または上記のナノ粒子と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物に関する。
一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチド（ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする）と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
本発明の目的のために、「ワクチン組成物」という用語は、免疫応答を誘導するためにヒトまたは動物に投与することができる組成物を指す。この免疫応答は、特定の細胞、特に抗原提示細胞、ＴｒｅｇなどのＴリンパ球、およびＢリンパ球の活性化をもたらすことができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含む。一実施形態では、「アジュバント」という用語は、単独で投与された有意な活性を欠いているが、別の治療剤の活性を増強することができる化合物を指す。いくつかの実施形態では、アジュバントは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）または他の油性アジュバントである。一実施形態では、アジュバントは、３０～７０％、好ましくは４０～６０％、より好ましくは４５～５５重量％の重量比（ｗ／ｗ）で存在する。
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。
本発明の医薬組成物およびワクチン組成物は、多種多様な投与経路または投与様式を使用して患者に送達することができる。好適な投与経路としては、これらに限定されないが、吸入、経皮、経口、直腸、経粘膜、腸および非経口投与、例えば筋肉内、皮下および静脈内注射が挙げられる。
本発明のさらなる目的は、薬剤として使用するための上記のペプチド、上記のナノ粒子、上記の免疫抱合体、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物である。
一実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドに関し、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本発明のペプチド、ナノ粒子、免疫抱合体、医薬組成物またはワクチン組成物は、免疫寛容を誘導するのに特に好適である。したがって、本発明の１つの目的は、免疫寛容の誘導に使用するための上記のペプチド、上記のナノ粒子、上記の免疫抱合体、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物に関する。
一実施形態では、本発明は、免疫寛容の誘導に使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、免疫寛容の誘導に使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドに関し、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「免疫寛容」という用語は、免疫応答を誘発する能力を有する物質または組織に対して免疫系が無反応である状態を指す。
したがって、一実施形態では、上記のペプチド、上記のナノ粒子、上記の免疫抱合体、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物は、免疫応答を低下させるのに使用するためのものである。一実施形態では、本発明は、免疫応答を低下させるのに使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、免疫応答を低下させるのに使用するための、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドに関し、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本発明のペプチドは、移植組織の移植時に移植組織に対する寛容または部分寛容を達成するために有用である。本明細書で使用されるとき、「部分寛容」は、免疫応答の低下をもたらす部分免疫寛容である。本明細書で使用されるとき、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞性細胞毒性が挙げられ、さらに、免疫応答という用語としては、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞の活性化、例えば、マクロファージが挙げられる。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞およびＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞）などのリンパ球、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞などの専門の抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球が挙げられる。例えば、免疫応答は、移植片拒絶、ならびに例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症、または血管炎などのそのような免疫応答の付随する生理学的結果に関与している。
一実施形態では、免疫寛容は、患者における移植組織または移植片の移植時の移植組織または移植片に対する患者の寛容または部分寛容である。換言すると、一実施形態では、免疫寛容は、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者における移植組織または移植片に対する寛容または部分寛容である。したがって、一実施形態では、免疫寛容は、患者の免疫応答、特に、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者の移植組織または移植片に対する免疫応答の低下である。一実施形態では、免疫寛容は、ドナー特異的またはレシピエント特異的免疫寛容である。
一実施形態では、免疫寛容は、ドナー特異的免疫寛容である。本明細書で使用されるとき、「ドナー特異的免疫寛容」は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）ハプロタイプを有するドナーからの移植組織または移植片に対する免疫寛容を指す。一実施形態では、「ドナー特異的免疫寛容」は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含むＭＨＣクラスＩＩハプロタイプを有するドナーからの移植組織または移植片に対する免疫寛容を指す。
一実施形態では、免疫寛容は、レシピエント特異的免疫寛容である。本明細書で使用されるとき、「レシピエント特異的免疫寛容」は、ドナーからレシピエントへの移植組織または移植片内で誘導される免疫寛容を指し、レシピエントは、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）ハプロタイプを有する。一実施形態では、「レシピエント特異的免疫寛容」は、ドナーからレシピエントへの移植組織または移植片内で誘導される免疫寛容を指し、レシピエントは、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含むＭＨＣクラスＩＩハプロタイプを有する。
したがって、一実施形態では、特に未治療の患者と比較して、本発明のペプチド、免疫抱合体、ナノ粒子、医薬組成物、またはワクチン組成物により治療された患者は、以下の生理学的特徴の少なくとも１つを示す：ａ）移植組織に対する免疫応答のレベルの低下（少なくとも部分的にはＢ細胞媒介性免疫応答、より具体的にはドナー特異的抗体によって媒介され得る）；ｂ）移植組織に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延；またはｃ）移植組織に対する免疫応答の開始もしくは進行のリスクの低下。
したがって、本発明のペプチド、免疫抱合体、ナノ粒子、医薬組成物またはワクチン組成物は、それを必要とする患者における移植組織または移植片拒絶を防止するかまたは低減させる方法に特に好適である。
一実施形態では、本発明のペプチド、免疫抱合体、または医薬組成物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減する方法に特に適している。
一実施形態では、ＧＶＨＤは、細胞、好ましくは多能性造血幹細胞、特にドナーの骨髄または末梢血に由来する多能性造血幹細胞の移植に続く。
したがって、本発明の１つの目的は、それを必要とする患者において、移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止または低減に使用するための、上記のペプチド、上記の免疫抱合体、上記のナノ粒子、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物に関する。
本発明はまた、それを必要とする患者における移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させるための方法に関し、本方法は、上記のペプチド、上記の免疫抱合体、上記のナノ粒子、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物を患者に投与することを含む。
本発明はまた、それを必要とする患者における移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するかまたは低減させるための薬剤を製造するための上記のペプチド、上記の免疫抱合体、上記のナノ粒子、上記の医薬組成物、または上記のワクチン組成物の使用に関する。
上記のとおり、一実施形態では、ペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）であるか、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである。一実施形態では、ペプチドは、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）であるか、または配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドであり、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「移植組織」および「移植片」という用語は、レシピエント対象、すなわちそれを必要とする患者に挿入される、または挿入される予定のドナー対象（例えば、細胞、組織、器官またはその断片）からの任意の材料を指す。一実施形態では、移植組織または移植片は、器官、組織または細胞である。より具体的には、本明細書で使用されるとき、「移植組織」は、好ましくは、組織または器官またはその断片からなるドナー対象からの材料を指す。より具体的には、本明細書で使用されるとき、「移植片」は、好ましくは、細胞からなるドナー対象からの材料を指す。
一実施形態では、移植組織または移植片は、骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞、および心筋細胞、ベータ膵臓細胞、肝細胞、ニューロンなど、異なる細胞系統の万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）（すなわち、胚性幹細胞（ＥＳ）または人工万能性幹細胞（ｉＰＳ））または多能性幹細胞由来の分化細胞を含むか、またはそれらからなる群から選択される細胞からなる。一実施形態では、細胞からなる移植組織または移植片は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のために使用され、したがって、通常、骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞を含む。ＨＳＣＴは、白血病またはリンパ腫に罹患している患者を治癒し得る。しかし、ＨＳＣＴ、特に同種異系ＨＳＣＴの重要な制限は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症であり、この治療を受けた患者の約３０～５０％において、重症形態で生じる。
一実施形態では、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群；リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫など）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および多発性骨髄腫を含む、またはそれらからなる群から選択された疾患に罹患している。
一実施形態では、それを必要とする患者は、ドナーの細胞、好ましくは多能性造血幹細胞、特にドナーの骨髄または末梢血に由来する多能性造血幹細胞からなる移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している。
一実施形態では、移植組織または移植片は同系であり、すなわち、ドナー対象およびレシピエント対象は遺伝的に同一である。一実施形態では、移植組織または移植片は同種異系である、すなわち、ドナー対象およびレシピエント対象は、異なる遺伝的起源であるが、同じ種である。一実施形態では、移植組織または移植片は異種であり、すなわち、ドナー対象およびレシピエント対象は異なる種に由来する。
一実施形態では、移植組織または移植片は、ヒトドナーからのものである。移植組織のヒトドナーは、生きているドナーまたは死亡したドナー、すなわち死体ドナーであり得る。
一実施形態では、移植組織または移植片は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）ハプロタイプを有するヒトドナーからのものである。一実施形態では、移植組織または移植片は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含むＭＨＣクラスＩＩハプロタイプを有するヒトドナーからのものである。
一実施形態では、移植組織または移植片、特に、造血幹細胞などの幹細胞は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）ハプロタイプを有するヒトレシピエントに挿入するか、挿入する予定である。一実施形態では、移植組織または移植片は、特に、造血幹細胞などの幹細胞は、本明細書に記載のペプチド、特に、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含むＭＨＣクラスＩＩハプロタイプを有するヒトレシピエントに挿入するか、挿入する予定である。
本明細書で使用されるとき、「移植組織拒絶」または「移植片拒絶」という用語は、急性および慢性の両方の移植組織または移植片拒絶を包含する。「急性拒絶反応」は、移植組織または移植片組織が免疫学的に外来性である場合のレシピエントの免疫系による拒絶反応である。急性拒絶反応は、レシピエントの免疫細胞による移植組織または移植片組織の浸潤を特徴とし、免疫細胞は、それらのエフェクター機能を実行し、移植組織または移植片組織を破壊する。急性拒絶反応の発症は、急速であり、一般的に移植手術後数週間以内にヒトで生じる。一般に、急性拒絶反応は、ラパマイシン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬物により阻害され得るかまたは抑制され得る。「慢性拒絶反応」は、一般に、急性拒絶反応の免疫抑制が奏効した場合であっても、生着後数ヶ月から数年以内にヒトで生じる。線維症は、すべての種類の臓器移植の慢性拒絶反応の一般的な要因である。
典型的には、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、治療有効量で対象に投与されるか、または投与されることになっている。「治療有効量」とは、寛容を誘導するか、または任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で免疫応答を低下させるのに十分な量の本発明の有効成分を意味する。本発明の化合物および組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の対象に対する特定の治療上有効用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事；投与期間、投与経路、および使用した特定の化合物の排泄率；治療期間；使用される特定のポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医療分野において周知である同様の要因など、様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当技術分野の技術の十分な範囲内である。しかし、製品の１日の投薬量は、成人１名あたり１日０．０１～１，０００ｍｇの広い範囲で変化し得る。一実施形態では、本発明のペプチドは、約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０または５００ｍｇの用量で、好ましくは１日用量で使用されるか、または使用される予定である。一実施形態では、本発明のペプチドは、約１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０または６００ｍｇの用量で、好ましくは１日用量で使用されるか、または使用される予定である。薬剤は、典型的には、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分、特に１ｍｇ～約１００ｍｇの有効成分を含む。一実施形態では、本発明のペプチドの有効量は、０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重／日～約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、特に約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日～約７ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の投薬量レベルで投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明のペプチドの有効量は、０．４ｍｇ／ｋｇ／日（１日あたり体重１ｇあたりのｍｇ）～約４０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量レベルで投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植前に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植前に、それを必要とする患者に少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日または３１日投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植前少なくとも１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月前に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植後に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植と同時に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、移植に付随して、その後継続的に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、本発明の有効成分（すなわち、本明細書に開示されるペプチド、免疫抱合体、およびナノ粒子）は、少なくとも１つの免疫抑制剤と共に、それを必要とする患者に投与されるか、または投与される予定である。
免疫抑制剤の例としては、これらに限定されないが、ブデソニド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイド；シクロスポリン；タクロリムス；シロリムス；アザチオプリンが挙げられる。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤は、コルチコステロイドである。
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ多量体にロードされる。典型的には、ＭＨＣクラスＩ多量体は当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、二量体、四量体、五量体、ストレプタマー、デキストラマーおよび八量体が挙げられる。
したがって、本発明はまた、ＭＨＣ／ペプチド複合体としても公知であるＭＨＣ／ペプチド多量体に関する。ここで、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記のようにペプチドがロードされたＭＨＣクラスＩ多量体である。
一実施形態では、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドをロードしたＭＨＣクラスＩ多量体である。一実施形態では、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドをロードしたＭＨＣクラスＩ多量体であって、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
本明細書で使用されるとき、「主要組織適合性複合体」（ＭＨＣ）という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）など、異なる種において記載されている組織適合性抗原系を包含することを意味する総称である。本明細書で使用されるとき、「ＭＨＣ／ペプチド多量体」という用語は、本発明のペプチドがロードされた主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質サブユニットから構成される安定な多量体複合体を指す。本発明によれば、ＭＨＣ／ペプチド多量体（本明細書ではＭＨＣ／ペプチド複合体とも呼ばれる）としては、これらに限定されないが、ＭＨＣ／ペプチド二量体、三量体、四量体または五量体が挙げられる。ヒトには、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする３つの主要な異なる遺伝子座：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃが存在する（ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される）。ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、およびＨＬＡ－Ａ＊１１は、これらの遺伝子座から発現できる様々なＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。さらに、ＨＬＡ－Ｅ（マウスの機能的相同体はＱａ－１ｂと呼ばれる）およびＭＩＣＡ／Ｂ分子などの非古典的ヒトＭＨＣクラスＩ分子も本発明の文脈に含まれることに留意されたい。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＨＬＡ－Ａ／ペプチド多量体、ＨＬＡ－Ｂ／ペプチド多量体、ＨＬＡ－Ｃ／ペプチド多量体、ＨＬＡ－Ｅ／ペプチド多量体、ＭＩＣＡ／ペプチド多量体およびＭＩＣＢ／ペプチド多量体からなる群から選択されるＨＬＡ／ペプチド多量体である。ＭＨＣ／ペプチド四量体を取得するための方法は、参照により組み込まれる国際公開第９６／２６９６２号および国際公開第０１／１８０５３号に記載されている。ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣの重鎖がビオチン化されている多量体であり得る。これにより、ストレプトアビジンとの四量体としての組み合わせが可能になる。このようなＭＨＣペプチド四量体は、適切なＴＣＲ担体Ｔリンパ球に対して高結合力を有するため、免疫蛍光法によって反応性集団を可視化するために使用できる。多量体は、常磁性粒子または磁性ビーズに付着させて、非特異的結合レポーターの除去および細胞選別を容易にすることもできる。そのような粒子は、商業的供給源から容易に入手可能である（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ）。多量体染色は、標識された細胞を殺傷することはない。したがって、細胞の完全性は、さらなる分析のために維持される。いくつかの実施形態では、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体は、（フローサイトメトリーアッセイにおいて）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離するかまたは同定するために特に好適である。
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離し、拡大するための方法に関し、本方法は、本発明のＭＨＣクラスＩ多量体によるＭＨＣ／ペプチド多量体染色によりＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離するステップ、および次にポリクローナル刺激によりＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの単離された集団を拡大するステップを含む。
一実施形態では、ＭＨＣ／ペプチド多量体染色は、本発明のＭＨＣクラスＩ多量体によるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの染色およびその後の染色されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを選別することを含み、好ましくは、選別することは、例えば、ＦＡＣＳ ＡｒｉａソーティングなどのＦＡＣＳソーティングである。
ポリクローナル刺激（ポリクローナル活性化とも呼ばれる）の例としては、これらに限定されないが、抗ＣＤ３抗体（Ａｂ）および抗ＣＤ２８抗体（Ａｂ）による刺激、特に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による刺激；抗ＣＤ３抗体（Ａｂ）による刺激、特に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による刺激、フィトヘマグルチニンによる刺激が挙げられる。
一実施形態では、ポリクローナル刺激は、抗ＣＤ３ Ａｂおよび抗ＣＤ２８ Ａｂによる刺激、特に抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ ｍＡｂによる刺激である。
一実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団は、ドナー対象（すなわち、移植組織または移植片が由来する対象）またはレシピエント患者（すなわち、移植組織または移植片を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者）から単離される。
一実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団は、ドナー対象から、特に固形臓器移植の元となる対象から単離される。一実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団は、レシピエント患者、特に造血幹細胞などの幹細胞を受け取った、受け取っている、または受け取るのを待機している患者から単離される。
本明細書に開示されているペプチドおよび多量体はまた、その免疫抑制活性においてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するのに好適である。換言すれば、本明細書に開示されているペプチドおよび多量体はまた、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団の免疫抑制活性を刺激するのに好適である。
したがって、本発明のさらなる目的は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団をその免疫抑制活性において拡大し、刺激するための方法に関し、本方法は、樹状細胞の集団などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下で、本発明のペプチドを含む培養培地を用いてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を培養するステップを含む。
したがって、本発明のさらなる目的は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大するため、およびその免疫抑制活性を刺激するための方法であり、本方法は、樹状細胞の集団などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下で、本発明のペプチドを含む培養培地を用いてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を培養するステップを含む。
ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇまたはＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／－Ｔｒｅｇに関連して本明細書で使用されるとき、「ｌｏｗ」または「ｌｏｗ／－」という用語は、当技術分野において周知であり、目的の細胞マーカー、すなわちＣＤ４５ＲＣのＴｒｅｇによる発現レベルであって、全体として分析されているＴｒｅｇの集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して低い発現レベルを指す。より具体的には、「ｌｏｗ」または「ｌｏｗ／－」という用語は、細胞マーカー、すなわち、ＣＤ４５ＲＣを、１つ以上の他の別個のＴｒｅｇ集団よりも低いレベルで発現する別個のＴｒｅｇ集団を指す。
したがって、本発明で使用される場合、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／－Ｔｒｅｇの集団と呼ばれることがある。したがって、一実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／－Ｔｒｅｇの集団である。
本明細書で使用されるとき、「拡大する」という用語は、所与の細胞集団（例えば、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇなどのＴｒｅｇ）を変換し、かつ／または増幅するプロセスを指す。
特定の実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、その免疫抑制活性を刺激するための本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。
一実施形態では、免疫抑制活性においてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するための本発明の方法は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を、樹状細胞の集団などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下で、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチド、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドを含む培養培地で培養するステップを含む。
一実施形態では、免疫抑制活性において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するための本発明の方法は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を、樹状細胞の集団などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下において、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチドを含む培養培地で培養するステップを含み、ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする。
一実施形態では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団は、樹状細胞、単球、および／または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団である。
本明細書で使用される「人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）」は、本発明のヒトＭＨＣ由来ヒトペプチドなどの目的のペプチドをロードすることができるＭＨＣ－Ｉを発現する細胞株を指す。例えば、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７年３月１５日；１３（６）：１８５７－６７に記載されている。したがって、ａＡＰＣの例としては、Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７年３月１５日；１３（６）：１８５７－６７に記載されているａＡＰＣ３３細胞株が挙げられる。
一実施形態では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団は、樹状細胞の集団である。
一実施形態では、樹状細胞の集団は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の集団である。いくつかの実施形態では、ｐＤＣは成熟ｐＤＣである。
本明細書で使用されるとき、「培養培地」という用語は、Ｔ細胞の制御性Ｔ細胞への成長および分化を支援することができる任意の培地を指す。典型的には、栄養素（炭素、アミノ酸の供給源）、ｐＨ緩衝液、および塩を含む基本培地で構成され、成長因子および／または抗生物質を補充され得る。一実施形態では、基本培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ－ＶＩＶＯまたはＡＩＭ－Ｖ培地であり得、これらはすべて、市販の標準培地である。一実施形態では、基本培地は、Ｔｅｘｍａｃｓ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ－ＶＩＶＯまたはＡＩＭ－Ｖ ＬｙｍｐｈｏＯｎｅ、ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ、またはＰｒｉｍｅ ＸＶ培地であり得、これらはすべて市販の標準ＧＭＰ培地（適正製造基準）である。ナイーブＴ細胞の制御性Ｔ細胞への成長および分化を支援する好ましい培地製剤としては、化学的に定義された培地（ＣＤＭ）が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「化学的に定義された培地」（ＣＤＭ）という用語は、特定の成分、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含む細胞を培養するための栄養溶液を指す。化学的に定義された培地は、無血清および／またはフィーダー非含有培地である。一実施形態では、培養培地には、精製されたヒトアルブミン（Ｖｉａｌｅｂｅｘ）またはＣＴＳオプティマイザー血清代替物が補充されてもよい。
ｐＤＣの集団の存在下において本発明のペプチドと共にＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を培養するステップは、ｐＤＣによるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇへのペプチドの提示に必要な時間の間実行されるものとする。典型的には、ｐＤＣの集団の存在下での本発明のペプチドを用いたＣＤ８＋Ｔｒｅｇの集団の培養は、１日から１週間以上にわたって行われなければならない。
いくつかの実施形態では、この方法は、このように生成されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離する追加のステップを含み得る。
あるいは、本発明は、その免疫抑制活性においてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するための方法に関し、本方法は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地で培養するステップを含む。
いくつかの実施形態では、多量体はナノ粒子上にコーティングされている。
免疫抑制活性においてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するための方法は、移植組織もしくは移植片拒絶またはＧＶＨＤを防止するための養子Ｔ細胞移植に特に有用である。
本発明の別の目的は、上記の免疫抑制活性において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、刺激するための方法によって、得られやすい、または得ることができるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団である。
本発明の別の目的は、薬剤として使用するために、本発明の方法によって得られやすい、または得ることができるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団である。
本発明の別の目的は、免疫寛容を誘導するのに使用するため、および／または免疫応答を低減するのに使用するために、本発明の方法によって得られやすい、または得ることができるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団である。
本発明のさらなる目的は、移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止または低減に使用するために、本発明の方法によって得られやすい、または得ることができるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団である。
本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドまたは多量体に特異的に結合する抗体に関する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドに特異的に結合するか、またはペプチドのうちの１つがロードされたＭＨＣクラスＩ多量体に特異的に結合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）ペプチドまたは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１の１つまたは２つのアミノ酸の置換を有するペプチド（ここで、この置換は、ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフ内にないものとする）に特異的に結合するか、またはペプチドのうちの１つがロードされたＭＨＣクラスＩ多量体に特異的に結合する。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、これらは、少なくとも２つの無傷の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を呈する抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、イントラボディ、および上記のいずれかのエピトープ結合断片から形成される。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち、抗原結合部位を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
本明細書で使用されるとき、「結合する」という用語は、抗体がペプチドに対して親和性を有することを示す。本明細書で使用されるとき、「親和性」という用語は、エピトープへの抗体の結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって求められ、式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８年），Ｃｏｌｉｇａｎら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２年，１９９３年）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３年）に見出すことができ、これらの参照は、その全体が、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野において周知である１つの好ましい標準的な方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置の使用である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリン産生細胞によって汚染されていないハイブリドーマ細胞によって合成され得るという点で有利である。代替的産生方法は、当業者に公知であり、例えば、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子で安定的にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞によって産生され得る。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法を使用して生成され得る（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５年）。本発明において有用であるモノクローナル抗体を調製するために、マウスまたは他の適切な宿主動物は、適切な抗原形態（例えば、本発明のペプチドまたは多量体）で、好適な間隔（例えば、週２回、週１回、月２回、または月１回）で免疫化される。動物は、屠殺から１週間以内に抗原の最終的な「ブースト」を投与され得る。多くの場合、免疫化中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましい。好適な免疫学的アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アラム、Ｒｉｂｉアジュバント、ＨｕｎｔｅｒのＴｉｔｅｒｍａｘ、ＱＳ２１またはクイルＡなどのサポニンアジュバント、またはＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の好適なアジュバントは、この分野において周知である。動物は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内または他の経路によって免疫化され得る。所与の動物は、複数の経路によって複数の形態の抗原で免疫化され得る。免疫化レジメン後、リンパ球は、動物の脾臓、リンパ節、または他の器官から単離され、ポリエチレングリコールなどの剤を使用して好適な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を、ハイブリドーマの成長を許容するが、融合パートナーの成長を許容しない培地に標準的な方法を用いて置く。ハイブリドーマの培養後、細胞上清は、所望の特異性の抗体、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。好適な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、およびウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は、この分野において周知である。好ましい技術は、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、および免疫沈降など、立体配座的に無傷の、天然に折り畳まれた抗原への抗体の結合を確認するものである。
いくつかの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、特にキメラマウス／ヒト抗体である。本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」という用語は、非ヒト抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む抗体を指す。いくつかの実施形態では、本発明のヒトキメラ抗体は、前述のようにＶＬおよびＶＨドメインをコードする核配列を得ることによって、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することにより、ヒトキメラ抗体発現ベクターを構築することによって、および発現ベクターを動物細胞に導入することによりコード配列を発現させることによって、生成され得る。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのＩｇＧクラスに属するサブクラスのうちのいずれか１つでも利用され得る。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、Ｉｇに属する任意の領域であり得、カッパクラスまたはラムダクラスのものを使用できる。キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えＤＮＡを伴い、遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野において周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬら、（１９８４年）および米国特許第５，２０２，２３８号；および同第５，２０４，２４４号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特に、ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、および存在する場合は任意によりヒト定常ドメイン、ならびにマウスＣＤＲなどの非ヒトドナーＣＤＲを含む。本発明によれば、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体からの可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが、以前の非ヒト抗体のＣＤＲを保持する抗体を指す。本発明のヒト化抗体は、前述のように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ることによって、（ｉ）ヒト抗体と同一の重鎖定常領域、および（ｉｉ）ヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することにより、ヒト化抗体発現ベクターを構築することによって、および発現ベクターを動物細胞に導入することにより遺伝子を発現させることによって、産生され得る。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデムタイプ）のいずれかであり得る。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、ならびに動物細胞における抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現レベルのバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づいてヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌら、１９８８年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳら、１９８５年を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許出願公開第２３９，４００号；ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許出願公開第５９２，１０６号；欧州特許出願公開第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭら、（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡら、（１９９４年））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）など、当技術分野において公知である様々な技術を使用してヒト化できる。そのような抗体を調製するための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願公開第１２５０２３号および国際公開第９６／０２５７６号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかし、本明細書で使用されるとき「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図するものではない。ヒト抗体は、当技術分野において公知である様々な技術を使用して産生できる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５；３６８－７４（２００１年）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０；４５０－４５９（２００８年）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して無傷のヒト抗体、またはヒト可変領域を有する無傷の抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。このような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部を含むか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダムに組み込まれる。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法のレビューについては、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３；１１１７－１１２５（２００５年）を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術について記載している米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号、ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載している米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載している米国特許第７，０４１，８７０号、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成された無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾させ得る。ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法でも作製できる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株について記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：３００１（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１年）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体は、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトｉｇＭ抗体の産生について記載）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６年）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５年）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５年）にも記載されている。完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも誘導され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓら、１９９１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているとおり）。ファージディスプレイ技術は、繊維状バクテリオファージの表面に抗体レパートリーを表示することにより免疫選択を模倣し、その後、選択した抗原に結合することによってファージを選択する。そのような技術の１つは、ＰＣＴ国際公開第９９／１０４９４号に記載されている。本明細書に記載のヒト抗体はまた、免疫化時にヒト抗体応答を生成することができるように、ヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製することができる。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７号に記載されている。
本明細書に開示されている抗体は、移植組織または移植片拒絶またはＧＶＨＤを防止するのに特に好適である。特に、本発明の多量体に特異的に結合する抗体は、本発明のペプチドを提示する樹状細胞を枯渇させるのに好適であろう。
本明細書で使用されるとき、樹状細胞に関して「枯渇する」という用語は、対象における樹状細胞の数の測定可能な減少を指す。減少は、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、この用語は、対象またはサンプル中の樹状細胞の数が検出可能な限界を下回る量まで減少することを指す。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を媒介する。本明細書で使用されるとき、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞で結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。特定のあらゆる作用機序に限定されることを望むものではないが、ＡＤＣＣを媒介するこれらの細胞傷害性細胞は、一般にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃにはＪ鎖が含まれ得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣｇａｍｍａ２およびＣｇａｍｍａ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣｇａｍｍａ１（Ｃγ１）とＣｇａｍｍａ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までの残基を含むように定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔら（１９９１年，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）のようにＥＵインデックスに従っている。「Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックス」は、上記のＫａｂａｔらに記載されているヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。Ｆｃは、単離しているこの領域を指してもよく、抗体、抗体断片、またはＦｃ融合タンパク質の文脈でこの領域を指す場合もある。Ｆｃバリアントタンパク質は、抗体、Ｆｃ融合物、またはＦｃ領域を含む任意のタンパク質またはタンパク質ドメインであり得る。特に好ましいのは、バリアントＦｃ領域を含むタンパク質であり、これらは、Ｆｃ領域の天然に存在しないバリアントである。天然に存在しないＦｃ領域（本明細書では「バリアントＦｃ領域」とも呼ばれる）のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失を含む。挿入または置換の結果としてバリアントＦｃ領域の配列内に現れる任意の新しいアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基と呼ばれ得る。注記：多型は、これらに限定されないが、Ｋａｂａｔ ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８など、複数のＦｃ位置で観察されており、したがって、提示された配列と先行技術の配列との間にわずかな違いが存在し得る。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７－９２（１９９１年）に要約されている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実行できる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的にまたは追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９５：６５２－６５６（１９９８年）に開示されているものなど、動物モデル内で評価され得る。本明細書で使用されるとき、「エフェクター細胞」という用語は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球を指す。細胞は、少なくともＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＩｇＧ３抗体である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＶに対して増加した親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含むバリアントＦｃ領域を含み、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入または欠失により、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＶに対する親和性の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含むバリアントＦｃ領域を含み、少なくとも１つのアミノ酸残基は、残基２３９、３３０、および３３２からなる群から選択され、アミノ酸残基は、ＥＵインデックスに従って番号が付けられている。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、および１３３２Ｅからなる群から選択され、アミノ酸残基は、ＥＵインデックスに従って番号が付けられている。
いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾されている。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を含まない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるように変更することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。追加的または代替的に、フコシル残基の量が減少しているか全くない低フコシル化または非フコシル化抗体、または二等分ＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体など、変更されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、そのような細胞株内で発現する抗体は、低フコシル化を呈するか、またはフコシル残基を欠いている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、低フコシル化または非フコシル化パターンを呈する細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が不十分である哺乳動物細胞株における組換え発現によって産生され得る。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）連結炭水化物にフコースを接着させる能力が低下し、また、その宿主細胞内で発現する抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞について記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００２年Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照のこと）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号には、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について記載している。これにより、操作された細胞株内に発現した抗体は、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈し、その結果抗体のＡＤＣＣ活性が増加するようになる（Ｕｍａｎａら、１９９９年Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照のこと）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓはさらに、フコシル残基を欠く哺乳動物のグリコシル化パターンの変化を有する抗体を産生できる遺伝子操作されたＣＨＯ哺乳類細胞について記載している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、哺乳動物のようなグリコシル化パターンのために操作され、かつグリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生できる酵母または糸状菌内で産生され得る（例えば、欧州特許第１２９７１７２Ｂ１号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、補体依存性細胞毒性を媒介する。「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、補体活性化を開始し、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）が同族の抗原と複合体を形成した分子（例えば、抗体）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイは、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔａｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６年）に記載のとおり、実施され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性食作用を媒介する。本明細書で使用されるとき、「抗体依存性食作用」または「オプソニン化」という用語は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応を指す。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、治療部分、すなわち、薬物に抱合されている。治療部分は、例えば、細胞毒素、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解性ペプチド、または放射性同位元素であり得る。このような抱合体は、本明細書では「抗体薬物抱合体」または「ＡＤＣ」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞毒性部分に抱合されている。細胞毒性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；メイタンシンなどのチューブリン阻害剤またはその類似体もしくは誘導体；有糸分裂阻害剤、例えばモノメチルオーリスタチンＥまたはＦなど、またはその類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０または１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１－デヒドロテストステロン；糖質コルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシンまたはその類似体または誘導体；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、またはクラドリビン；アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ；白金誘導体、例えばシスプラチンまたはカルボプラチン；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、またはその類似体もしくは誘導体；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））；ピロロ［２，ｌ－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素および関連分子、例えば、ジフテリアＡ鎖およびその活性断片およびハイブリッド分子、リシン毒素、例えば、リシンＡまたは脱グリコシル化されたリシンＡ鎖毒素、コレラ毒素、志賀様毒素、例えばＳＬＴＩ、ＳＬＴ ＩＩ、ＳＬＴ ＩＩＶ、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマン－バークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン（ｇｅｌａｎｉｎ）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロティン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅ Ｉ；ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリン毒素；ならびにシュードモナスエンドトキシンからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、オーリスタチンまたはそのペプチド類似体、誘導体またはプロドラッグに抱合される。オーリスタチンは、微小管のダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の分裂を妨げ（Ｗｏｙｋｅら（２００１年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０－３５８４）、抗癌活性（ＵＳ５６６３１４９）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１－２９６５）を有することが示されている。例えば、オーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成することができる。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、およびＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。好適なオーリスタチンおよびオーリスタチン類似体、誘導体およびプロドラッグ、ならびにオーリスタチンのＡｂへの抱合のための好適なリンカーは、例えば、米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号および同第６，２１４，３４５号、国際公開第０２０８８１７２号、同第２００４０１０９５７号、同第２００５０８１７１１号、同第２００５０８４３９０号、同第２００６１３２６７０号、同第０３０２６５７７号、同第２００７００８６０号、同第２０７０１１９６８号、および同第２０５０８２０２３号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ピロロ［２，ｌ－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。好適なＰＤＢおよびＰＤＢ誘導体、ならびに関連する技術は、例えば、Ｈａｒｔｌｅｙ Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０年；７０（１７）：６８４９－６８５８；Ａｎｔｏｎｏｗ Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２００８年；１４（３）：１５４－１６９；Ｈｏｗａｒｄ Ｐ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００９年；１９：６４６３－６４６６、およびＳａｇｎｏｕら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２０００年；１０（１８）：２０８３－２０８６に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アントラサイクリン、メイタンシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、イリノテカン、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、ＰＤＢ、および任意のそれらの類似体、誘導体、またはプロドラッグからなる群から選択される細胞毒性部分に抱合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アントラサイクリンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、メイタンシンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、カリケアマイシンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、デュオカルマイシンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ドラスタチン１０またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ドラスタチン１５またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、モノメチルオーリスタチンＥまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、モノメチルオーリスタチンＦまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ピロロ［２，ｌ－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。いくつかの実施形態では、抗体は、イリノテカンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに抱合される。
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかし、これらの例および図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
設計されたＨＬＡクラスＩＩペプチド（ＭＨＣクラスＩＩペプチドとも呼ばれる）の詳細を示すスキームである。 ＭＨＣクラスＩＩペプチドの存在下でのＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性化のプロトコルを示すスキームである。 ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現によって分析されたヒトペプチドに応答したＣＤ８＋Ｔｒｅｇの活性化を示す図である。図３Ａは、ＭＨＣクラスＩＩペプチドと共にインキュベートしたＣＤ８＋Ｔｒｅｇにおける活性化マーカーＣＤ２５（黒）およびＣＤ６９（白）の発現を示すグラフである。バーは、ペプチド刺激後のマーカー陽性細胞のパーセンテージと、ペプチドを含まない対照条件におけるマーカー陽性細胞のパーセンテージとの間の比率を表す（＋／－ ＳＥＭ）。＊ｐ＜０．０５。各ペプチドについてｎ＝９～１４。図３Ｂおよび図３Ｃは、対照ペプチド、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（Ｈｐｅｐ２）または抗ＣＤ／２８刺激の存在下でのＣＤ２５（図３Ｂ）およびＣＤ６９（図３Ｃ）の発現の代表的なヒストグラムである。 Ｈｐｅｐ２ペプチドによるＣＤ８＋Ｔｒｅｇ拡大のプロトコルを示すスキームである。ＣＤ８ Ｔｒｅｇは、同系のＨＬＡ－Ａ２＋ＡＰＣ、Ｈｐｅｐ２ペプチド、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＣｐＧ ＯＤＮによって０日目および７日目に刺激した。サイトカインは週に２回添加した。 Ｈｐｅｐ２または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｍＡｂとの１４日間の培養後の総Ｔｒｅｇ倍数の拡大を示すグラフである（０日目に対して）。 ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制活性を示す図である。図６Ａは、同じドナーからのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと共培養された分裂中のＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の割合を示すグラフである。Ｈｐｅｐ２ペプチドまたはポリクローナル刺激の１４日後、拡大されたＴｒｅｇは、新鮮なＴｒｅｇと比較して、３名の健康なボランティアからプールされた同種異系ＡＰＣで刺激された同系ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞に対する抑制活性について試験した。ｎ＝２～５。図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、および図６Ｅは、上記の条件でのＣＦＳＥ染色の代表的なヒストグラムである。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを含まない対照条件（図６Ｂ）；ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下でＨｐｅｐ２ペプチドで拡大（図６Ｃ）；ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ポリクローナル刺激）で拡大（図６Ｄ）；新鮮なＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下（図６Ｅ）。 Ｈｐｅｐ２拡大ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ポリクローナル拡大ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと比較して同様のマーカー発現を示すことを示すグラフである。ＣＤ８＋ＴｒｅｇをＨｐｅｐ２または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｍＡｂで１４日間拡大させ、Ｆｏｘｐ３、ＧＩＴＲ、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ１、ＩＬ－３４、およびＩＦＮγの発現レベルをフローサイトメトリーで分析した。ｎ＝６～１４。実施例材料および方法材料ヒトサンプル
血液は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（Ｎａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で収集した。ヘパリン化血液サンプルは、関連機関の倫理委員会によって承認されたインフォームドコンセントに署名した後、健康なボランティアから採取した（＃Ｎ°ＣＰＤＬ－ＰＬＥＲ－２０１８ １８０）。ドナーの性別は入手できなかった。

方法
ペプチドライブラリ
１６－ａａペプチドは、ラット配列（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）とのアラインメントに基づいて、ヒトＭＨＣ－ＩＩ対立遺伝子上でランダムに設計した。純度は９０％超であった。ヒトペプチドを上記のように溶解し、かつ保存し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用するためにＴｅｘｍａｃｓ培地で１２０μｇ／ｍｌに希釈した。
細胞精製
ＰＢＭＣは、ブレーキなく室温で２０分間、２０００ｒｐｍでＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離した。残りの赤血球および血小板は、低張液との５分間のインキュベーション、および４℃で１０分間の１０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して除去した。ｐＤＣおよびＴ細胞の選別では、それぞれ、抗ＣＤ１９（クローン：ＨＢＩ１９、ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１４（クローン：Ｍ５Ｅ２、ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）、および抗ＣＤ１６（クローン：３Ｇ８、精製）ｍＡｂを使用することによって、Ｂ細胞、単球、およびＮＫ細胞を磁気的に枯渇させた（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。濃縮されたＰＢＭＣは、ＣＤ８α＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＮｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ－１＋ｐＤＣを選別するために、抗ＣＤ４５ＲＣ－ＦＩＴＣ（クローン：ＭＴ２、ＩＱ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、抗ＣＤ８α－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＲＰＴ８、ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）および抗Ｎｒｐ１－ＰＥ（クローン：ｕ２１－１２８３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により染色した。濃縮されたＰＢＭＣは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｅｆｆ細胞を選別するための抗ＣＤ３－ＰｅＣｙ７（クローンＳＫ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン：ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローン：Ｍ－Ａ２５１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ｍＡｂで染色した。ＡＰＣは、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３精製、５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂ（増殖アッセイでＴｅｆｆを刺激するため）でＴ細胞を磁気的に枯渇させるか、または抗ＣＤ３－ＰＥ（クローン：ＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別中にＴ細胞をゲートアウトすることにより、ＰＢＭＣから得た（活性化および拡大試験のため）。選別にはＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用した。純度は、９８％より高かった。
ペプチド刺激アッセイ
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞および同じ健康なＨＬＡ－Ａ２＋ドナーからの自己ｐＤＣを、Ｔｒｅｇ：ｐＤＣの比が４：１で５日間、ＩＬ－２（２５Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（０．５μＭ）および様々な合成ペプチド（１２０μｇ／ｍｌ）を補充した無血清Ｔｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で共培養した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ活性化は、ＣＤ６９およびＣＤ２５マーカーの発現に基づいて分析した。陰性対照として、また結果を正規化するために、陰性ペプチドを使用した（ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ）。Ｄａｐｉは、生存マーカーとして使用した。陽性対照として、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン：ＣＤ２８．２；１μｇ／ｍｌ）で刺激した。結果は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０）を使用して分析した。
抑制アッセイ
同じ健康なボランティア（ＨＬＡ－Ａ２＋）からのＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＴｅｆｆおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、５％ヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で、３名の異なる健康なドナー（ＨＬＡ－Ａ２－）からの同種異系ＡＰＣのプールと共培養した。培養は、Ｖ底９６ウェルプレートで３回、１：１：１の比率（１＝５ｘ１０４細胞／ウェル）で５日間行った。ＣＤ４＋ＣＤ２５－レスポンダーＴ細胞の増殖は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋生細胞（ＤＡＰＩ陰性）をゲーティングし、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０）を使用することによって、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））によって分析した。
細胞外および細胞内染色
Ｔｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で最後の４時間のブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＧＩＴＲ（クローン：ＤＴ５Ｄ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｆｏｘｐ３（クローン：２５９Ｄ／Ｃ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－１０（クローン：ＪＥＳ３－９Ｄ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－３４（クローン：ＩＣ５２６５Ｐ、Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ１（クローン：ＴＷ４－９Ｅ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＦＮγ（クローン：Ｂ２７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を分析するために、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で５時間刺激した。生細胞を選択するために、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦ５０６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を生存マーカーとして使用した。Ｆｃ受容体は、染色前にブロックさせ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、細胞は細胞内染色のためにＦｉｘ／Ｐｅｒｍキット（Ｅｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した。細胞表現型は、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ．Ｉｎｃ．ＵＳＡ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０）を使用したフローサイトメトリーによって分析した。
ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大
５ｘ１０５ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナーからの２ｘ１０６自己ＡＰＣを、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｒｈＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣｐＧ（０．５μＭ）、およびＨＬＡ－ＩＩ分子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に由来する様々なペプチド（１２０μｇ／ｍｌ）を補充したＴｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の２４ウェルプレートに播種した。陰性対照として、無関係な陰性ペプチド（ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ）を使用した。陽性対照として、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇをプレートコーティングした抗ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）ｍＡｂおよび可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン：ＣＤ２８．２；１μｇ／ｍｌ）で刺激した。７日目に、Ｔｒｅｇをカウントし、再拡大させた。サイトカインは、週に２回新たに添加した。最後に、１４日目に細胞を実験に使用した。
定量化および統計分析
ペプチド活性化検定では、カラムの中央値を仮想値１．０と比較するノンパラメトリックウィルコクソン符号順位検定を実行した。分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して行った。
結果
４つの１６ａａペプチドは、Ｄｕ５１ペプチド（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ）および重複する１２－ｍｅｒペプチドＢｕ３１－１０（ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲ）の配列に基づいて（両方ともＣ末端にＳＤＶＧＥＹＲモチーフを担持している（図１））、４つのランダムなヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子：Ｈｐｅｐ１（ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ－配列番号１）、Ｈｐｅｐ２（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ－配列番号２）、Ｈｐｅｐ３（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＶＹＲ－配列番号３）およびＨｐｅｐ４（ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ－配列番号４）から設計した。５日間の培養アッセイにおいて、無血清Ｔｅｘｍａｃｓ培地でインターロイキン－２（ＩＬ－２）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（またはＣｐＧ ＯＤＮ）の存在下で、同じ個体からの同系ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよび自己ＨＬＡ－Ａ２＋ｐＤＣを使用して（図２）、位置２、５、６、１４、または１５で異なるこれらのペプチドを個別にテストした。図３Ａ～図３Ｃに示すとおり、ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現は、Ｈｐｅｐ１、Ｈｐｅｐ２、およびＨｐｅｐ４ペプチドとのインキュベーション後にＴｒｅｇでアップレギュレートした。これらの３つのペプチドは、保存されたＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７ａａモチーフを共有しているが、Ｈｐｅｐ３はさらにペプチドの１４位にグルタミン酸（Ｅ）の代わりにバリン（Ｖ）を有し、これがおそらくＴＣＲ認識に影響を与える。
これらのペプチドから、より短いペプチドをさらに同定した：ＮＲＥＥＹＡＲＦＤ（配列番号５）、ＲＥＥＹＡＲＦＤＳ（配列番号６）、ＥＥＹＡＲＦＤＳＤ（配列番号７）、ＥＹＡＲＦＤＳＤＶ（配列番号８）、ＹＡＲＦＤＳＤＶＧ（配列番号９）、ＡＲＦＤＳＤＶＧＥ（配列番号１０）、ＲＦＤＳＤＶＧＥＦ（配列番号１１）およびＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（配列番号１２）。
このＭＨＣ－ＩＩ由来ペプチドを使用してＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを拡大できるかを判断するために、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＣｐＧ ＯＤＮの存在下で、Ｈｐｅｐ２ペプチドを使用して同じ個体からの選別済みのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／－ＴｒｅｇおよびＡＰＣを使用して拡大プロトコルを設定し、同様の条件でポリクローナル刺激（抗ＣＤ３／２８）と比較した（図４）。ＡＰＣおよびＨｐｅｐ２による拡大により、１４日間でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの１０倍の拡大となった（図５）が、０日目に存在する小さいＨｐｅｐ２特異的Ｔｒｅｇ画分の実際の拡大は、はるかに高い可能性がある。重要なことに、図６Ａ～図６Ｅに示すとおり、Ｈｐｅｐ２および抗ＣＤ３／２８拡大ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはいずれも、新鮮なＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと同様に、同種異系免疫応答の抑制に効果的であった。興味深いことに、ペプチド刺激Ｔｒｅｇは、ポリクローナルＴｒｅｇよりも抑制性が高い傾向があり、治療のために抗原特異的Ｔｒｅｇを拡大することの潜在的な利点を示唆している。図７に示すとおり、Ｈｐｅｐ２または抗ＣＤ３／２８拡大ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３、ＧＩＴＲ、ＩＬ－１０、ＩＦＮγ、およびＩＬ－３４の発現レベルに有意差は観察されなかった。
まとめると、これは、コンセンサスＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７ａａモチーフを保持するヒトＨＬＡクラスＩＩペプチドが抑制性ヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇを効率的に活性化し、拡大できることを示唆している。

参考文献
本出願を通して、様々な参考文献は、本発明が関係する最新技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞および同じ健康なＨＬＡ－Ａ２＋ドナーからの自己ｐＤＣを、Ｔｒｅｇ：ｐＤＣの比が４：１で５日間、ＩＬ－２（２５Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（０．５μＭ）および様々な合成ペプチド（１２０μｇ／ｍｌ）を補充した無血清Ｔｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で共培養した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ活性化は、ＣＤ６９およびＣＤ２５マーカーの発現に基づいて分析した。陰性対照として、また結果を正規化するために、陰性ペプチドを使用した（ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ（配列番号１４））。Ｄａｐｉは、生存マーカーとして使用した。陽性対照として、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン：ＣＤ２８．２；１μｇ／ｍｌ）で刺激した。結果は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０）を使用して分析した。
抑制アッセイ
５ｘ１０５ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナーからの２ｘ１０６自己ＡＰＣを、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｒｈＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣｐＧ（０．５μＭ）、およびＨＬＡ－ＩＩ分子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に由来する様々なペプチド（１２０μｇ／ｍｌ）を補充したＴｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の２４ウェルプレートに播種した。陰性対照として、無関係な陰性ペプチド（ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ（配列番号１４））を使用した。陽性対照として、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇをプレートコーティングした抗ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）ｍＡｂおよび可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン：ＣＤ２８．２；１μｇ／ｍｌ）で刺激した。７日目に、Ｔｒｅｇをカウントし、再拡大させた。サイトカインは、週に２回新たに添加した。最後に、１４日目に細胞を実験に使用した。
定量化および統計分析
４つの１６ａａペプチドは、Ｄｕ５１ペプチド（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号１５））および重複する１２－ｍｅｒペプチドＢｕ３１－１０（ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号１６））の配列に基づいて（両方ともＣ末端にＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号１７）モチーフを担持している（図１））、４つのランダムなヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子：Ｈｐｅｐ１（ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ－配列番号１）、Ｈｐｅｐ２（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ－配列番号２）、Ｈｐｅｐ３（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＶＹＲ－配列番号３）およびＨｐｅｐ４（ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ－配列番号４）から設計した。５日間の培養アッセイにおいて、無血清Ｔｅｘｍａｃｓ培地でインターロイキン－２（ＩＬ－２）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（またはＣｐＧ ＯＤＮ）の存在下で、同じ個体からの同系ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよび自己ＨＬＡ－Ａ２＋ｐＤＣを使用して（図２）、位置２、５、６、１４、または１５で異なるこれらのペプチドを個別にテストした。図３Ａ～図３Ｃに示すとおり、ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現は、Ｈｐｅｐ１、Ｈｐｅｐ２、およびＨｐｅｐ４ペプチドとのインキュベーション後にＴｒｅｇでアップレギュレートした。これらの３つのペプチドは、保存されたＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７ａａモチーフを共有しているが、Ｈｐｅｐ３はさらにペプチドの１４位にグルタミン酸（Ｅ）の代わりにバリン（Ｖ）を有し、これがおそらくＴＣＲ認識に影響を与える。

Claims (15)

  1. ＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）７アミノ酸モチーフを含む、単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドであって、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）、ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ２－配列番号２）、ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（Ｈｐｅｐ４－配列番号４）、およびＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、かつ配列番号１、配列番号２、または配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有する任意のペプチドからなる群から選択される、ヒトペプチド。
  2. 前記ペプチドが、ＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（Ｈｐｅｐ１－配列番号１）であるか、またはＳＤＶＧＥ－Ｘ－Ｒ（配列番号１３）モチーフを含み、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する長さ１６のアミノ酸を有するペプチドである、請求項１に記載の単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチド。
  3. 請求項１または請求項２に記載のペプチドをコードする核酸分子。
  4. 請求項１または請求項２に記載のペプチドに抱合されたかまたは融合された抗体を含む免疫抱合体。
  5. 前記抗体が抗原提示細胞の表面抗原に対して向けられている、請求項４に記載の免疫抱合体。
  6. 請求項１または請求項２に記載の少なくとも１つのペプチドを含むナノ粒子であって、好ましくは、リポソームである、ナノ粒子。
  7. 請求項１または請求項２に記載のペプチド、請求項４または請求項５に記載の免疫抱合体、または請求項６に記載のナノ粒子を含むワクチン組成物。
  8. 請求項１または請求項２に記載のペプチドをロードしたＭＨＣクラスＩ多量体。
  9. 請求項１または請求項２に記載のペプチド、または請求項８に記載のＭＨＣクラスＩ多量体に特異的に結合する抗体。
  10. 薬剤として使用するための請求項１または請求項２に記載のペプチド、請求項４または請求項５に記載の免疫抱合体、請求項６に記載のナノ粒子、または請求項７に記載のワクチン組成物。
  11. それを必要とする患者において、移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止または低減に使用するための請求項１または請求項２に記載のペプチド、請求項４または請求項５に記載の免疫抱合体、請求項６に記載のナノ粒子、または請求項７に記載のワクチン組成物。
  12. ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大し、その免疫抑制活性を刺激するための方法であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団の存在下で請求項１または請求項２のペプチドを含む培養培地、または請求項８に記載のＭＨＣクラスＩ多量体を含む培養培地で、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を培養するステップを含む、方法。
  13. 請求項１または２に記載のペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離し、拡大するための方法であって、請求項８に記載のＭＨＣクラスＩ多量体を用いたＭＨＣ／ペプチド多量体染色によりＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離するステップと、次に、ポリクローナル刺激で前記単離されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を拡大するステップと、を含む、方法。
  14. 請求項１２または請求項１３の方法によって得ることができるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団。
  15. それを必要とする患者において移植組織もしくは移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止または低減に使用するための、請求項１４に記載のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団。
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