TW202424186A - Rna引導核酸酶中介基因編輯用之具鎖核酸引導 rna之化學修飾 - Google Patents
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Abstract
提供包括工程化及/或化學修飾的轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)、引導RNA (gRNA)及/或CRISPR RNA (crRNA)的組成物。化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA合併橋接核酸(BNA)修飾和其他化學修飾。BNA修飾包括2',4'鎖核酸(LNA)修飾。其他化學修飾包括 2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)和硫代磷酸酯(PS)修飾。本揭露內容的工程化及/或化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA改善RNA引導的核酸酶(RGN)系統的基因編輯(包括鹼基編輯和先導編輯)效率。
Description
相關申請案之相互引用
本申請案主張2022年8月25日申請的美國臨時申請案序號63/373,498的優先權；2022年12月2日申請的美國臨時申請案序號63/385,887的優先權；以及2023年8月4日申請的美國臨時申請案序號63/517,703的優先權，該些申請案的全部揭露內容藉由引用併入本文。
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本發明與分子生物學及基因編輯領域有關。
靶向基因體編輯或修飾正迅速成為基礎及應用研究的重要工具，因為其允許基因體的修飾(例如：切割、刪除及插入核酸；取代核酸中的核苷酸；以及調節基因體中特定位置的基因表現)，及許多其他可能的修飾。使用RNA引導的核酸酶的基因體編輯系統，例如短迴文重複序列(CRISPR)-相關(Cas)細菌系統的聚集且規律間隔的CRISPR- Cas蛋白，藉由帶有引導RNA的複合核酸酶(一種切割核酸的酵素)來發揮作用。引導RNA與特定標的序列的雜交允許在基因體中的特定位置進行編輯。因此，使用RNA引導的核酸酶(RGN)的基因體編輯系統對編輯基因體序列可以是性價比高且有效，因為引導RNA是RGN系統的可編程組件，其允許藉由典型地簡單的引導RNA的設計對特定標的序列進行基因體編輯。RGN基因體編輯系統已改造自許多微生物，且這些系統分為兩類、六個類型及多個亞型。
在起源自II型及一些V型的RGN系統的微生物中，引導RNA (gRNA)表現為兩部分RNA系統：包含經由沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對辨識標的基因體序列的間隔序列的CRISPR-RNA (crRNA)，以及支架轉錄活化的crRNA (tracrRNA)。此兩部分引導RNA需要在crRNA分子區域及tracrRNA分子區域之間進行鹼基配對以形成雙引導RNA (dgRNA)。對於許多應用，可以使用嵌合單引導RNA (sgRNA)分子，其是藉由以短的柔性環物理連接crRNA及tracrRNA而形成。
可以對引導RNA的元件(例如磷酸主鏈、核糖、核鹼基)進行化學修飾以例如減少引導RNA的降解。有許多機會來描述對引導RNA的修飾的類型及/或程度，以改善RGN系統，例如增強標的序列的特異性、穩定性及編輯效率及/或減少與RGN系統毒性相關聯的發炎反應。
在此提供包括化學修飾的轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)、引導RNA (gRNA)及/或CRISPR RNA (crRNA)的組成物。化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA合併橋接核酸(BNA)修飾及/或其他化學修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括核苷酸的2′,4′鎖核酸修飾，在其中2′氧經由甲烯基橋共價地連接至4′碳。在一些實施方式中，額外的修飾包括2′-O-甲基(2'-O-Me)、2′-O-甲基3′硫代磷酸酯(MS)及硫代磷酸酯(PS)修飾。在一些實施方式中，相較於包括沒有BNA修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA的參考RGN系統，本揭露內容的化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA改善RNA引導的核酸酶(RGN)系統的基因編輯效率。在一些實施方式中，本揭露內容的化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA允許在需要單引導RNA的應用中使用雙引導RNA。在一些實施方式中，本揭露內容提供在雙引導RNA的莖環1的第一莖內使用BNA修飾及/或其他化學修飾來增強細胞中RGN系統的性能。在一些實施方式中，BNA修飾及/或其他化學修飾的使用允許使用縮短的tracrRNA、gRNA及/或crRNA。在一些實施方式中，以本揭露內容的RGN系統進行基因編輯的細胞包括初代細胞。本揭露內容的化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA可以與應用RGN系統的任何模型系統、細胞類型及標的序列一起使用。
也提供使用BNA修飾的引導RNA在細胞中實現基於RGN的基因編輯的方法以及提高基因編輯效率的方法。
在一個態樣中，本揭露內容提供核酸分子，包括轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)，其中tracrRNA包括：(a) 抗重複子；(b) 尾部；以及(c) 最接近尾部的莖環，其中tracrRNA的抗重複子包括第一莖及第二莖，且其中tracrRNA包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在抗重複子內。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾抗重複子的第一莖內。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾包括在抗重複子的第一莖內，連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾不在抗重複子的第二莖內。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾不在tracrRNA的突起內。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA的尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA的尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是cEt修飾。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA進一步包括至少一其他化學修飾。在一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的抗重複子內。在一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內。在一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的尾部內。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA的尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA的尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及抗重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，BNA修飾是LNA修飾。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的總長度。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的總長度。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖在5'區域包括來自天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的核苷酸序列或富含GC的核苷酸序列。在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖在5'區域包括富含GC的核苷酸序列，其中5'區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA包括60-80 nt、80-100 nt、100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt或超過180 nt的總長度。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383及709中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA是能夠與RGN結合的gRNA的一部分。在一些實施方式中，RGN是第II型RGN。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述tracrRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種引導RNA (gRNA)，包括CRISPR RNA (crRNA)及轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)，其中crRNA包括：i) 間隔子；以及ii) 包括第一莖及第二莖的crRNA重複子，其中tracrRNA包括：i) 尾部；以及ii) 包括第一莖及第二莖的抗重複子，以及其中crRNA以及tracrRNA的至少其中之一包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA是單一引導RNA (sgRNA)。在一些實施方式中，sgRNA包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的總長度。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA是雙引導RNA (dgRNA)。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在crRNA重複子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在crRNA重複子的第一莖內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾包括crRNA重複子的第一莖中的至少兩個連續BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾不在crRNA重複子的第二莖內。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在抗重複子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在抗重複子的第一莖內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾包括在抗重複子的第一莖內，連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，抗重複子的第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾不在抗重複子的第二莖內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾不在gRNA的突起內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在tracrRNA的尾部內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的3’區域中的至少三個末端核苷酸以及抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸缺乏化學修飾，並且抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾在間隔子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，在間隔子的5'區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，在間隔子的5'區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，間隔子的長度為18-30個核苷酸。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是cEt修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括至少一其他修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他修飾在crRNA內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他修飾在crRNA的5’區域或該3’區域內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他修飾在crRNA的5’區域或該3’區域內。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在crRNA的crRNA重複子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在crRNA重複子的第一莖內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在crRNA的間隔子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的抗重複子內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾在tracrRNA的尾部內。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，至少一其他化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，並且crRNA重複子的第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖或抗重複子的第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的總長度。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖或抗重複子的第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的總長度。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖或抗重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖或抗重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖在3'區域處或抗重複子的第一莖在5'區域處包括來自天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的核苷酸序列或富含GC的核苷酸序列。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖在3'區域處或抗重複子的第一莖在5'區域處包括富含GC的核苷酸序列，其中crRNA重複子的第一莖在3'區域處或抗重複子的第一莖在5'區域處包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子具有下列所示的核苷酸序列：(a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39有1或2個不同核苷酸者；(b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384有1或2個不同核苷酸者；(c) SEQ ID NO：385或與SEQ ID NO：385有1或2個不同核苷酸者；(d) SEQ ID NO：386或與SEQ ID NO：386有1或2個不同核苷酸者；(e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387有1或2個不同核苷酸者；或(f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397有1或2個不同核苷酸者。在上述態樣的一些實施方式中，crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383及709中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子具有下列所示的核苷酸序列：(a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300有1或2個不同核苷酸者；(b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304有1或2個不同核苷酸者；(c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308有1或2個不同核苷酸者；(d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312有1或2個不同核苷酸者；(e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320有1或2個不同核苷酸者；(f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344有1或2個不同核苷酸者；(g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348有1或2個不同核苷酸者；(h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352有1或2個不同核苷酸者；(i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356有1或2個不同核苷酸者；(j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360有1或2個不同核苷酸者；(k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388有1或2個不同核苷酸者；(l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389有1或2個不同核苷酸者；或(m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390有1或2個不同核苷酸者。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子具有下列任一者所示的核苷酸序列：(a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324有1或2個不同核苷酸者；(b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328有1或2個不同核苷酸者；(c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332有1或2個不同核苷酸者；(d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336有1或2個不同核苷酸者；(e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391有1或2個不同核苷酸者；(f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392有1或2個不同核苷酸者；以及(g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393有1或2個不同核苷酸者。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA重複子具有下列任一者所示的核苷酸序列：(a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465有1或2個不同核苷酸者；(b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469有1或2個不同核苷酸者；(c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473有1或2個不同核苷酸者；(d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477有1或2個不同核苷酸者；(e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481有1或2個不同核苷酸者；(f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508有1或2個不同核苷酸者；(g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512有1或2個不同核苷酸者；以及(h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516有1或2個不同核苷酸者。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，crRNA以及tracrRNA藉由crRNA重複子的3’末端核苷酸及抗重複子的5’末端核苷酸之間的連接子連接。在一些實施方式中，連接子包括疊氮官能基或炔官能基。在一些實施方式中，連接子是多核苷酸。在一些實施方式中，連接子具有AAAG、GAAA、ACUU或CAAAGG所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，連接子具有AAAG所示的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA是包括crRNA以及tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA包括主鏈以及間隔子，以及其中sgRNA的主鏈包括crRNA重複子、連接子及tracrRNA。在上述gRNA態樣的一些實施方式中，sgRNA的主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，sgRNA具有SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的核苷酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA能夠結合至RGN。在一些實施方式中，RGN是第II型RGN。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在上述gRNA態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種包括CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，crRNA包括：(a) 間隔子；以及(b) crRNA重複子，其中crRNA重複子能夠與tracrRNA的抗重複子雜交以形成包括莖環的引導RNA(gRNA)，莖環包括藉由crRNA重複子及抗重複子雜交形成的第一莖及第二莖，以及其中crRNA包括至少一化學修飾，其中至少一化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA修飾；以及其中至少一化學修飾在crRNA的5'區域或3'區域處的三個末端核苷酸內。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種包括CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，crRNA包括：(a) 間隔子；以及(b) crRNA重複子，包括第一莖及一第二莖，其中crRNA包括至少一化學修飾，其中至少一化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA修飾；以及其中至少一化學修飾在crRNA的5'區域或3'區域處的三個末端核苷酸內。在一些實施方式中，包括crRNA的gRNA能夠結合至為了活性需要tracrRNA的RNA引導的核酸酶(RGN)。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中RGN系統包括：a) 本文上述的轉錄活化的 crRNA (tracrRNA)；b) crRNA；以及 c) 第II型RGN多肽或包括編碼第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA及crRNA形成gRNA。在一些實施方式中，RGN系統結合標的核酸分子中的標的序列。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中RGN系統包括：a) 本文上述的gRNA；以及 b) 第II型RGN多肽或包括編碼第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，RGN系統結合標的核酸分子中的標的序列。
在仍一態樣中，本揭露內容提供一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中RGN系統包括：a) 本文上述的CRISPR RNA (crRNA)；b) tracrRNA；以及 c) 第II型RGN多肽或包括編碼第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA及crRNA形成gRNA。在一些實施方式中，RGN系統結合標的核酸分子中的標的序列。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽辨識具有NNNNCC、NNGRR、NNRYA或NGG所示的核苷酸序列的共通前間隔序列鄰近模體(PAM)。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，gRNA是包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的總長度的sgRNA。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽包括與SEQ ID NO：1、69、93或252中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的的胺基酸序列。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽及gRNA在自然界中並未發現彼此複合。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，標的序列是真核標的序列。在一些實施方式中，標的序列具有SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的核苷酸序列。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，標的序列在細胞中。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，gRNA及RGN多肽的複合物執行(direct)標的序列的切割。在一些實施方式中，切割產生雙股斷裂。在一些實施方式中，切割產生單股斷裂。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽是無核酸酶活性的。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽是切口酶。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。在一些實施方式中，鹼基編輯多肽包括去胺酶。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽與先導編輯多肽融合。在一些實施方式中，先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在一些實施方式中，DNA聚合酶包括反轉錄酶。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN多肽與可檢測標記融合。在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，RGN系統進一步包括供體多核苷酸。
在上述RGN系統態樣的一些實施方式中，包括編碼RGN的核苷酸序列的多核苷酸是mRNA。在一些實施方式中，編碼RGN多肽的核苷酸序列可操作地連接至異源啟動子。在一些實施方式中，包括編碼RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸在載體內。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種核糖核蛋白(RNP)複合物，包括本文上述的RGN系統。
在仍一態樣中，本揭露內容提供一種包括核酸分子的細胞，核酸分子包括本文上述的tracrRNA、gRNA、crRNA、RGN系統、或RNP複合物。
在上述態樣的一些實施方式中，細胞包括能夠被本文上述形成的RGN系統的gRNA/RGN多肽複合物或RNP複合物結合的標的序列。在一些實施方式中，標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，細胞是原核細胞。在一些實施方式中，細胞是真核細胞。在一些實施方式中，真核細胞是初代細胞。在一些實施方式中，初代細胞是T細胞。在一些實施方式中，真核細胞是植物細胞。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種植物，包括本文上述的植物細胞。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種種子，包括本文上述的植物細胞。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種醫藥組成物，包括藥學上可接受的載體及本文上述的tracrRNA、gRNA、crRNA、RGN系統、RNP複合物、或細胞。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種用於結合標的核酸分子中的標的序列的方法，包括將本文上述的RGN系統或RNP複合物遞送至標的序列或至包括標的序列的細胞。
在上述態樣的一些實施方式中，RGN多肽或gRNA進一步包括可檢測標記，從而允許標的序列的檢測。在上述態樣的一些實施方式中，RGN多肽或gRNA進一步包括表現調節子，從而調節包括標的序列的標的基因的表現。在上述態樣的一些實施方式中，RGN與先導編輯多肽融合。在上述態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。
在仍一態樣中，本揭露內容提供用於切割及/或修飾包括標的序列的標的核酸分子的方法，包括將本文上述的RGN系統或RNP複合物遞送至標的序列或至包括標的序列的細胞，其中發生該標的核酸分子的切割或修飾。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括：a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：i) 包括本文上述的轉錄活化的 crRNA (tracrRNA)及CRISPR RNA (crRNA)的引導RNA (gRNA)；以及ii) 第II型RGN，從而組裝RNP複合物；以及b) 使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞與組裝的RNP複合物接觸，從而以RGN結合標的序列。在方法態樣的一些實施方式中，組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。在方法態樣的一些實施方式中，RGN與先導編輯多肽融合。在方法態樣的一些實施方式中，先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在方法態樣的一些實施方式中，DNA聚合酶包括反轉錄酶。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。在方法態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。在一些實施方式中，鹼基編輯多肽包括去胺酶。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞接觸i) 包括本文上述的轉錄活化的 crRNA (tracrRNA)及CRISPR RNA (crRNA)的引導RNA (gRNA)；以及 ii) 第II型RGN或編碼第II型RGN的多核苷酸，從而以RGN結合標的序列。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA及第II型RGN的形成複合物執行該標的序列的切割。在方法態樣的一些實施方式中，RGN與先導編輯多肽融合。在方法態樣的一些實施方式中，先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在方法態樣的一些實施方式中，DNA聚合酶包括反轉錄酶。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。在方法態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。在一些實施方式中，鹼基編輯多肽包括去胺酶。在方法態樣的一些實施方式中，編碼第II型RGN的多核苷酸是mRNA。
在進一步態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括：a) 在適合形成核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：i) 本文上述的引導RNA (gRNA)；以及ii) 第II型RNA引導的核酸酶(RGN)，從而組裝RNP複合物；以及b) 使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞與組裝的RNP複合物接觸，從而以RGN結合標的序列。在方法態樣的一些實施方式中，組裝的RNP複合物執行標的序列的切割。在方法態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。在一些實施方式中，鹼基編輯多肽包括去胺酶。在方法態樣的一些實施方式中，RGN與先導編輯多肽融合。在一些實施方式中，先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在一些實施方式中，DNA聚合酶包括反轉錄酶。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。
在仍一態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞接觸i) 本文上述的引導RNA (gRNA)；以及ii) 第II型RGN或編碼第II型RGN的多核苷酸，從而以RGN結合標的序列。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA及第II型RGN的形成複合物執行標的序列的切割。在方法態樣的一些實施方式中，RGN多肽與鹼基編輯多肽融合。在一些實施方式中，鹼基編輯多肽包括去胺酶。在方法態樣的一些實施方式中，RGN與先導編輯多肽融合。在一些實施方式中，先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在一些實施方式中，DNA聚合酶包括反轉錄酶。在方法態樣的一些實施方式中，gRNA進一步包括延伸，延伸包括用於先導編輯的編輯模板。在方法態樣的一些實施方式中，編碼第II型RGN的多核苷酸是mRNA。
在進一步態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括：a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：i) 包括本文上述的CRISPR RNA (crRNA)及的引導RNA (gRNA)；以及ii) 第II型RGN，從而組裝RNP複合物；以及 b) 使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞與組裝的RNP複合物接觸，從而以RGN結合標的序列。在進一步態樣中，本揭露內容提供一種以RNA引導的核酸酶(RGN)結合標的核酸分子中的標的序列的方法，方法包括使標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞接觸i) 包括本文上述的CRISPR RNA (crRNA)及tracrRNA的引導RNA (gRNA)；以及ii) 第II型RGN或編碼第II型RGN的多核苷酸，從而以RGN結合標的序列。
在上述方法態樣的一些實施方式中，標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712的任一者所示的核苷酸序列。在上述方法態樣的一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：1、69、93或252中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種提高切割及/或修飾包括標的序列的核酸分子的效率的方法，方法包括將本文上述的RGN系統或RNP複合物遞送至標的序列或至包括標的序列的細胞，其中相較於藉由包括將參考RGN系統或RNP複合物遞送至標的序列或至包括標的序列的細胞的方法對核酸分子的切割或修飾，核酸分子的切割或修飾以更高的效率發生，其中參考RGN系統或RNP複合物中的tracrRNA、gRNA或crRNA不包括橋接核酸(BNA)修飾或不包括任何化學修飾。
在上述態樣的一些實施方式中，本文上述的RNP複合物或RGN系統的tracrRNA的抗重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。在上述態樣的一些實施方式中，在crRNA的crRNA重複子的第一莖的3’區域處的至少三個末端核苷酸包括BNA修飾。在上述態樣的一些實施方式中，BNA修飾包括LNA修飾。在上述態樣的一些實施方式中，BNA修飾包括cEt修飾。在上述態樣的一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率增加15倍至30倍。在上述態樣的一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率是藉由測量標的序列或包括標的序列的細胞的百分比來確定，其具有標的序列或由標的序列編碼的多肽的改變的表現。在上述態樣的一些實施方式中，表現是藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜系統(LC/MS)、質譜測定法或其組合來測量。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種工程化gRNA的方法，方法包括：a) 提供包括crRNA及tracrRNA的gRNA，其中crRNA包括crRNA重複子及tracrRNA包括抗重複子；以及b) 添加或取代crRNA重複子中的一或更多核苷酸以及抗重複子中的一或更多核苷酸，其中在crRNA重複子中添加或取代的一或更多核苷酸以及在抗重複子中添加或取代的一或更多核苷酸能夠彼此雜交，其中工程化gRNA的crRNA重複子的3’區域及抗重複子的5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C，並且工程化gRNA與步驟a)中提供的gRNA相比具有增加的編輯效率。
在上述態樣的一些實施方式中，一或更多核苷酸是1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。在上述態樣的一些實施方式中，添加或取代的一或更多核苷酸在crRNA重複子的3’區域及抗重複子的5’區域中，並且其中crRNA重複子的3’區域及抗重複子的5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
在上述態樣的一些實施方式中，gRNA是dgRNA。在上述態樣的一些實施方式中，gRNA是sgRNA。
在上述態樣的一些實施方式中，方法進一步包括c) 以至少一化學修飾來修飾工程化gRNA中的至少一核苷酸，至少一化學修飾選自下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA修飾。
在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾在crRNA、tracrRNA或兩者中。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾在下列中：crRNA重複子；抗重複子；tracrRNA的尾部；crRNA重複子及抗重複子；或crRNA重複子、抗重複子及tracrRNA的尾部。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾在下列中：crRNA重複子的第一莖；抗重複子的第一莖；tracrRNA的尾部；crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖；或crRNA重複子的第一莖、抗重複子的第一莖及tracrRNA的尾部。
在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的連續核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的交替核苷酸上。
在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上且在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上且在crRNA重複子的第一莖中的至少一核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上且在crRNA重複子的第一莖的3’區域處的至少三個末端核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上、在crRNA重複子的第一莖的3’區域處的至少三個末端核苷酸上、且在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸上。在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上、在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸上、且在crRNA重複子的第一莖的3’區域處的至少一個核苷酸上。
在上述態樣的一些實施方式中，至少一化學修飾包括BNA修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是cEt修飾。
在上述態樣的一些實施方式中，相較於步驟a)中提供的gRNA，工程化gRNA的編輯效率增加至少10%、至少30%、至少50%、至少70%、至少90%、至少100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。在上述態樣的一些實施方式中，相較於包括步驟a)中提供的gRNA的RGN系統，藉由包括工程化gRNA的RGN系統切割及/或修飾標的序列的效率增加至少10%、至少30%、至少50%、至少70%、至少90%、至少100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。在上述態樣的一些實施方式中，效率是藉由測量標的序列或包括標的序列的細胞的百分比來確定，其具有標的序列或由標的序列編碼的多肽的改變的表現。在上述態樣的一些實施方式中，表現是藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜系統(LC/MS)、質譜測定法或其組合來確定。
在另一態樣中，本揭露內容提供一種由本文上述的方法產生的工程化gRNA。
在仍一態樣中，本揭露內容提供一種包括CRISPR RNA (crRNA)及轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)的引導RNA (gRNA)，其中crRNA包括crRNA重複子，其中tracrRNA包括抗重複子，其中gRNA包括莖環，莖環包括第一莖及第二莖，其中第一莖包括約11個鹼基對的總長度，以及其中第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
在又一態樣中，本揭露內容提供一種包括CRISPR RNA (crRNA)及轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)引導RNA (gRNA)，其中crRNA包括crRNA重複子，其中tracrRNA包括抗重複子，其中gRNA包括莖環，莖環包括第一莖及第二莖，其中第一莖包括至少3、4、5、6或7個GC鹼基對，以及其中第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
受益於前述描述及相關圖式中呈現的教導，本領域中具有通常知識者將想到本文中闡述的本發明的許多修飾及其他實施方式。因此，應該理解，本發明不限於所揭露的特定實施方式，並且修飾以及其他實施方式預期被包括在所附實施方式的範圍內。儘管本文採用了特定術語，但這些術語僅以一般性及描述性意義使用，且並不是出於限制的目的。
I. 概述
本揭露內容特別提供與用於RNA引導的核酸酶(RGN)系統中的修飾的引導RNA (gRNA)相關的組成物及方法，以及與其相關的系統及方法。在各種實施方式中，在gRNA的某些區域內(但在一些實施方式中，不在其他區域內)包含一或更多橋接核酸(例如，鎖核酸)改善RGN系統的編輯效率。此外，此類修飾解鎖基於mRNA的雙引導系統中的編輯潛力，這之前在先前技術中可用的未修飾的雙引導RNA是不可能的。這是本領域的關鍵進步，因為新的編輯方式，例如先導編輯(也稱為反轉錄酶編輯或RT編輯)，需要非常長的gRNA模板，而使用目前的製造流程以單引導格式大規模合成非常長的gRNA模板即使不是不可能，也是很困難的。因此，本領域缺乏製造可行性極大地限制這些基於mRNA的治療劑的商業化潛力。這些及其他進步在本揭露內容中呈現。
RGN系統允許對基因體內的特定位點進行標靶操縱，且在治療及研究應用的基因標靶背景下非常有用。例如，在包括哺乳動物在內的多種生物體中，RGN系統已用於在多核苷酸中產生單或雙股斷裂、修飾多核苷酸、檢測多核苷酸內的特定位點或修飾特定基因的表現。RGN系統涉及RGN與gRNA的複合物。gRNA與特定標的序列的雜交允許將引導RNA/RGN複合物靶向基因體中的特定位置以進行編輯。
在RGN系統中，gRNA可以作為兩部分gRNA或單gRNA存在。兩部分gRNA系統包括包含間隔子序列的CRISPR RNA (crRNA)以及一個支架轉錄活化的crRNA (tracrRNA)，間隔子序列透過沃森-克里克鹼基配對來辨識標的基因體序列。crRNA與tracrRNA雜交以形成雙引導RNA (dgRNA)，其在crRNA:tracrRNA貼合區域以二聚體結合在一起。對於許多應用，可以使用嵌合單引導RNA (sgRNA)分子，其藉由以短的柔性環物理連接crRNA及tracrRNA而形成。
dgRNA及sgRNA各有優點及缺點。sgRNA通常提供相對好的編輯效率。然而，雖然作為單一化學物質有些方便，但sgRNA相對較長，通常為100 nt或以上。生產gRNA的常見方法是透過固相寡核苷酸合成，這是一種連續的合成路線。儘管每個個別步驟的高耦合效率，但隨著長度的增加，全長產物的產率及純度較低(Reese,
Org Biomol Chem,2005；Beaucage & Reese,
CurrProtoc 核酸Chem, 2009；Beaucage,
Curr Opin Drug Di De,2008；Shiba,
Nucleic Acids,2007；LeProust Nuc. Acids Res. 2010)。因此，使用較短的gRNA及/或dgRNA的能力在減少要合成寡核苷酸的最大長度方面具有一定的效用。使用dgRNA的另一個優點是tracrRNA與包含不同間隔子序列的不同crRNA配對，因此tracrRNA支架可以大量製造，並與針對特定基因體標的的個別crRNA配對。
然而，dgRNA具有相對低的基因編輯效率，尤其是在將編碼RGN的mRNA引入細胞以表現RGN的遞送方法中。crRNA及tracrRNA的額外暴露的5'及3'端以及相對於sgRNA (其中分子內組成雜交)可能較弱的二聚體強度可能導致RNA穩定性較低，從而導致表現較差。在一些實施方式中，加強二聚體可以增強及復原dgRNA的有效性。
包括2'-氟-核糖(2'-F)、2'-O-甲基(2'-O-Me)、3' 硫代磷酸酯(PS)、2'-O-Me 3' 硫代磷酸酯(MS)的多種化學修飾以及其他修飾已被用於改善gRNA穩定性，從而提高體內及體外的細胞中的編輯效率。然而，當以dgRNA轉染編碼RGN的mRNA時，這些方法無法實現有效編輯。相反，它們需要要產生的長的sgRNA。儘管有例如使用額外的引導延伸進行先導編輯的新技術，sgRNA可能無法大量生產並具有高純度。此外，雖然上述修飾保護RNA免於核酸酶降解，但其他機制也可能導致引導降解或不活化，特別是二級結構的破壞。橋接核酸(BNA)包括由於分子內鍵結或交聯而具有限制構形的核苷酸類似物。BNA的一種類型，即鎖核酸(LNA)，已用於例如PCR探針的設計中，以縮短探針的長度並增加雜交強度。LNA包括在核苷酸的核糖上2'氧與4'碳之間的共價連接，且已被證明有助於高效互補配對以改善誤配識別(mismatch discrimination)，以及提高核酸酶抗性(You et al.
Nucleic Acids Res.,2006；Vester & Wengel,
J Biochemistry, 2004)。本文提供使用以BNA修飾進行修飾的引導RNA在細胞中達到基於RGN的基因編輯的方法。本申請案中的資料證明，此類以BNA修飾進行修飾的引導RNA相較於現有技術方法是有改善的，顯著增強了引導RNA的效力，且使得雙引導RNA能夠在其他情況不適合的應用中使用，例如當gRNA與RGN編碼mRNA共轉染時。不受推測的限制，我們相信這些益處至少是因為BNA修飾穩定了藉由crRNA重複子及tracrRNA抗重複子之間的雜交而形成的莖環。在一些情況下，BNA是LNA。在一些情況下，BNA是S-限制性乙基(cEt)。在一些情況下，本文提供使用以BNA修飾及/或其他化學修飾進行修飾的引導RNA在細胞中達到基於RGN的基因編輯的方法。在各種實施方式中，本揭露內容在tracrRNA、gRNA及/或crRNA中併入BNA (例如，LNA及/或cEt)或其他化學修飾，以產生用於基於RGN的基因編輯系統的化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA。在一些實施方式中，crRNA及tracrRNA均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，crRNA或tracrRNA包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，tracrRNA包括BNA修飾，而crRNA不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，tracrRNA包括BNA修飾且crRNA包括MS修飾。在實施方式中，與具有僅在5'及3'區域的三個末端核苷酸處包括MS修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA的參考RGN系統相比，本揭露內容的化學修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA改善RGN系統的基因編輯效率。在實施方式中，本揭露內容的修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA允許dgRNA用於在其他情況下更需要sgRNA的應用中。在一些實施方式中，本揭露內容提供在dgRNA中的crRNA:tracrRNA貼合區內使用BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾來增強細胞中RGN系統的性能(例如，編輯效率)。在一些實施方式中，BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾允許縮短的crRNA:tracrRNA貼合區域。在一些實施方式中，BNA (例如，LNA)修飾與dgRNA的crRNA:tracrRNA貼合區域的工程化組合而增強細胞中RGN系統的性能。在一些實施方式中，進行基因編輯的細胞包括初代細胞。本揭露內容的修飾的tracrRNA、gRNA及/或crRNA可以與應用RGN系統的任何模型系統、細胞類型及標的序列一起使用。
不受任何理論的約束，對gRNA中的核苷酸進行化學修飾可以藉由干擾內源核酸酶對gRNA的降解來增強穩定性及/或穩定化學修飾區域中的RNA-RNA相互作用。
II. 引導 RNA
本揭露內容提供包括至少一橋接核酸(BNA) (例如，LNA及/或cEt)修飾的引導RNA。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾是在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是在tracrRNA的抗重複子的第一莖中包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的工程化的引導RNA。術語「引導RNA」是本領域已知的並且通常指可以結合RNA引導的核酸酶(RGN)並幫助將RGN靶向至標的多核苷酸(例如，DNA或mRNA分子)內特定位置(例如，基因體基因座)的RNA分子(或一組RNA分子的統稱)。在一些實施方式中，引導RNA包括具有與標的股的核苷酸序列足夠互補的核苷酸序列(即，間隔子)，以與標的股雜交並引導RGN序列專一性結合至標的核苷酸序列。在一些實施方式中，當標的核苷酸序列如DNA的情況一樣是雙股時，標的核苷酸序列包括非標的股(其包括PAM序列)及標的股，標的股與引導RNA的間隔子雜交。在這些實施方式中，引導RNA具有對雙股標的序列 (例如，標的DNA序列)的標的股足夠的互補性，使得引導RNA與標的股雜交並引導相關的RGN序列專一性結合至標的序列(例如，標的DNA序列)。因此，在一些實施方式中，除了尿嘧啶(U)替換引導RNA中的胸腺嘧啶(T)之外，引導RNA包括與非標的股的序列相同的間隔子。
RGN的各自引導RNA是一或更多RNA分子(通常，一或二)，其可以結合RGN並引導RGN結合至特定標的序列，以及在RGN具有切口酶或核酸酶活性的那些實施方式中，亦可以切割標的股及/或非標的股。一般而言，引導RNA包括CRISPR RNA (crRNA)及轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)。
術語「引導RNA」也共同涵蓋一組兩個或更多個RNA分子，其中crRNA片段及tracrRNA片段位於單獨的RNA分子中。包含crRNA及tracrRNA的天然引導RNA通常包含兩個單獨的RNA分子，其透過crRNA的重複子及tracrRNA的抗重複子彼此雜交。在某些實施方式中，crRNA及tracrRNA藉由連接子連接在一起。「連接子」可以是將兩個分子共價連接在一起的任何種類的化學鍵，例如藉由點擊化學或任何其他化學反應形成的鍵、多核苷酸、聚合物或任何可以連接兩個分子的實體。在一些實施方式中，連接crRNA及tracrRNA的連接子包含多核苷酸連接子(例如，四個核苷酸連接子)以形成單引導RNA分子，其中crRNA及tracrRNA透過crRNA的重複序列及tracrRNA的抗重複序列彼此雜交。因此，引導RNA涵蓋單引導RNA (sgRNA)，其中crRNA片段及tracrRNA片段位於相同的RNA分子或股中。
引導RNA的crRNA及tracrRNA可以藉由有機分子、基團、聚合物或化學部分連接。在一些實施方式中，引導RNA的crRNA及tracrRNA藉由點擊化學連接。點擊化學涉及經由雜原子鍵(C-X-C)將小單元連接在一起來快速產生化合物。點擊化學的主要目標是發展一組強大的、選擇性的及模組化的「模塊(block)」，其可用於小規模及大規模應用。點擊化學反應快速、模組化、有效率、通常不會產生有毒廢物、可以用水作為溶劑進行反應、以及可以設定為立體特異性的。
點擊化學是一種多功能反應，可用於合成各種接合物。事實上，任何生物分子都可以參與，並且可以輕易以小分子(例如螢光染料、生物素及其他基團)進行標記。點擊化學反應發生在兩個組分之間：疊氮官能基及炔官能基。疊氮化合物是一種線性、多原子陰離子，分子式為N
3 −，
-結構為
−N=N
+=N
−。它是疊氮酸HN3的共軛鹼。有機疊氮化合物是化學式為RN
3的有機化合物，包含疊氮官能基。炔烴是含有至少一碳-碳三鍵(-C≡C-；例如末端乙炔)的不飽和烴。只有一個三鍵且沒有其他官能基的最簡單的無環炔烴形成具有通式C
nH
2n−2的同系物系。末端炔烴的分子式為RC
2H。一個例子是甲基乙炔(使用IUPAC命名法為丙炔)。疊氮基及炔基在天然生物分子中幾乎從未見過。因此，反應可以在生物系統內發生，而不干擾其他細胞過程(即高度生物正交)且具有特異性。
已知的點擊反應是疊氮化合物與炔烴的Huisgen 1,3-偶極環加成。這種產生三唑的反應因其可靠性、特異性及生物相容性而成為點擊化學的黃金標準。當反應涉及更簡單的烯烴或疊氮化合物時，這種環加成需要高溫或高壓，因為活化能很高(ΔG‡≈+26 kcal/mol)。Cu(I)催化劑加速末端炔烴與疊氮化合物的反應，從而得到1,4-二取代-1,2,3-三唑。此反應是理想的點擊反應，且廣泛應用於材料科學、藥物化學及化學生物學。
然而，作為用於點擊反應的催化劑的過渡金屬的細胞毒性性質阻礙它們在體內的應用。已建立了具有較低活化障礙及無銅反應的替代方法。此類反應稱為「無銅點擊化學」。不是使用銅來活化炔烴，而是將炔烴引入環二氟辛炔(strained difluorooctyne，DIFO)中，其中吸電子、丙炔基(propargylic)、寶石氟(gemfluorine)與環張力一起作用，極大地破壞了炔烴的穩定性(Agard et al. (2006) ACS Chem. Biol. 1(10): 644-648)。這種不穩定作用增加反應驅動力，以及環炔解除其環張力的期望。無銅點擊化學以協同[3+2]環加成的方式進行，其機制與Huisgen 1,3-偶極環加成相同。環辛炔上也允許有氟以外的取代基，例如苯環。
點擊化學中的反應基團(例如疊氮化合物、末端炔烴、環炔烴(strained alkyne) (例如二苯並環辛炔(DBCO)))可以引入任何形式的核酸分子中，且可以透過酵素或化學方式引入。炔烴修飾及疊氮修飾的寡核苷酸可以從寡核苷酸合成場所或公司訂購。可以在RNA合成期間將核苷酸的疊氮化合物修飾型式引入至第一RNA分子中，且可以在RNA合成期間將核苷酸的炔修飾型式引入至第二RNA分子中。可以分離及純化所得到的點擊官能基化的核酸分子，以去除任何可能干擾後續點擊反應的未反應試劑或副產物。純化的點擊官能基化的核酸分子可以在支援點擊反應的反應緩衝液中混合在一起。這可以包括銅催化劑以促進疊氮化合物與炔烴之間的反應，或者可以不含銅。疊氮化合物與炔烴官能基反應形成共價鍵，將兩個核酸分子連接在一起。連接的核酸分子可以進一步純化，且可以使用例如凝膠電泳或質譜測定法的分析技術來驗證核酸分子的成功連接並評估產物的純度。
點擊化學進一步描述於例如：Kumar et al. (2007) J. Am. Chem. Soc, 129：6859-6864；El-Sagheer and Brown (2010) Chem. Soc. Rev. 39：1388-1405；Haque and Peng (2014) Sci. China Chem. 57：215-231；Wittig and Krebs 1961 Chem. Ber. 1961, 94, 3260–3275；US 7,375,234；US 7,070,941；US2013/0046084，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。
crRNA及tracrRNA的連接可以以下方式進行。藉由固相合成在crRNA上包含3'胺基修飾劑，且在tracrRNA上包含5'胺基修飾劑。在RNA寡核苷酸的合成、去保護及純化後，使用疊氮基丁酸酯的NHS酯(4-疊氮基-丁-1-酸
N-羥基琥珀醯亞胺酯；例如可從Glen Research取得，目錄編號50-1904-24)在tracrRNA的5'區域加上疊氮基團，並使用DBCO的NHS酯(二苯並環辛炔-PEG4-
N-羥基琥珀醯亞胺酯；例如可從Sigma Aldrich取得，目錄編號764019)在crRNA的3'區域加上環辛炔基團。在水性介質(具有可選擇離子強度、pH及試劑濃度的優化)中組裝允許張力促進的疊氮-炔Huisgen環加成(「無銅點擊化學」)的進行。
在一些實施方式中，藉由點擊化學連接的crRNA及tracrRNA藉由化學部分連接。在一些實施方式中，藉由化學部分連接的crRNA及tracrRNA包括在tracrRNA的抗重複子的一或更多核苷酸處的疊氮基團及在crRNA的crRNA重複子的一或更多核苷酸處的炔烴基團。在一些實施方式中，藉由化學部分連接的crRNA及tracrRNA包括在crRNA的crRNA重複子的一或更多核苷酸處的疊氮基團及在tracrRNA的抗重複子的一或更多核苷酸處的炔烴基團。一或更多疊氮修飾的核苷酸或一或更多炔修飾的核苷酸可以在引導RNA的crRNA重複子的莖、泡泡或兩者內。一或更多疊氮修飾的核苷酸或一或更多炔修飾的核苷酸可以在引導RNA的抗重複子的莖、泡泡或兩者內。在一些實施方式中，藉由化學部分連接的crRNA及tracrRNA是單引導RNA，且在連接crRNA重複子及抗重複子的核苷酸環中的一或更多核苷酸處包括疊氮修飾的核苷酸或炔烴修飾的核苷酸。
技術人員可利用各種進一步的化學反應及相應的修飾將核酸分子(例如，crRNA及tracrRNA)以共價方式彼此連接。這些修飾包括各種交聯劑，例如硫醇修飾(如硫辛酸N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯)，與一級胺(-NH2)反應的化學基團。這些一級胺在生理pH值下帶正電荷且具有親核性；這使得它們很容易與多個反應基團接合。有許多合成的化學基團會與一級胺形成化學鍵。這些包括異硫氰酸酯、異氰酸酯、醯基疊氮、NHS酯、含有磺酸酯(-SO3)基團的磺基-NHS酯(例如雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3))、磺醯氯、醛、乙二醛、環氧化物、環氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵化物、亞胺酯、碳二亞胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)或二環己基碳二亞胺(DCC))、酸酐及氟苯基酯。
如本文所述，引導RNA可以包括crRNA及tracrRNA，其中crRNA包括：i) 間隔子；以及ii) 包括第一莖及第二莖的crRNA重複子，其中tracrRNA包括：i) 尾部；以及ii) 包括第一莖及第二莖的抗重複子，以及其中crRNA以及tracrRNA的至少其中之一包括至少一BNA修飾。在一些實施方式中，抗重複子能夠與crRNA重複子雜交以形成包括第一莖及第二莖的莖環。
如本文所述，本揭露內容亦提供包括tracrRNA的核酸分子，其中tracrRNA包括：(a) 抗重複子；(b) 尾部；以及(c) 最接近尾部的莖環，其中tracrRNA的抗重複子包括第一莖及第二莖，以及tracrRNA包括至少一修飾。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子能夠與crRNA的crRNA重複子雜交以形成包括第一莖及第二莖的莖環。在一些實施方式中，包括tracrRNA的gRNA能夠結合至RGN。
如本文所述，本揭露內容亦提供包括crRNA的核酸分子，crRNA包括：(a) 間隔子；以及(b) 包括第一莖及第二莖的crRNA重複子，其中crRNA包括至少一化學修飾，其中至少一化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA修飾；以及其中至少一化學修飾是在crRNA的5'區域或3'區域處的三個末端核苷酸內。在一些實施方式中，crRNA重複子能夠與tracrRNA的抗重複子雜交以形成包括第一莖及第二莖的莖環。在一些實施方式中，包括crRNA的gRNA能夠結合至為了活性需要tracrRNA的RNA引導的核酸酶(RGN)。
如本文所述，本揭露內容提供包括tracrRNA及crRNA的gRNA，其中crRNA包括crRNA重複子，其中tracrRNA包括抗重複子，其中gRNA包括包括第一莖及一第二莖的莖環，其中第一莖包括約11個鹼基對的總長度，以及其中第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
如本文所述，本揭露內容提供包括tracrRNA及crRNA的gRNA，其中crRNA包括crRNA重複子，其中tracrRNA包括抗重複子，其中gRNA包括包括第一莖及一第二莖的莖環，其中第一莖包括至少3、4、5、6或7個GC鹼基對，以及其中第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
本發明特別提供CRISPR RNA (crRNA)或編碼CRISPR RNA的多核苷酸，CRISPR RNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。如本文所使用的，術語「crRNA」指包含間隔子及CRISPR重複子的RNA分子或其蛋白質，間隔子是直接與標的序列的標的股雜交的核苷酸序列，及CRISPR重複子包括形成被RGN分子辨識的結構的核苷酸序列，無論是其本身或與雜交的tracrRNA相關。如本文所使用的，術語「tracrRNA」或「轉錄活化的crRNA」指包括抗重複子序列的RNA分子，抗重複子序列具有互補性以雜交至crRNA的CRISPR重複子的至少一部分，以形成被RGN分子辨識的結構。在一些實施方式中，需要tracrRNA分子內的額外的二級結構(例如，莖環)來結合RGN。
在一些實施方式中，crRNA包括至少一其他化學修飾。在一些實施方式中，至少一其他化學修飾是選自由下列組成的群組：2′-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2′-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2′-氟(2′-F)修飾；2′F-4′Cα-OMe修飾；2′,4′-二-Cα-OMe修飾；2′-O-甲基3′硫代磷酸酯(MS)修飾；2′-O-甲基3′硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2′-O-甲基3′膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，至少一修飾是BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在某些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是cEt修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾是2′-O-Me修飾。在某些實施方式中，至少一化學修飾是MS修飾。
crRNA包括間隔子及CRISPR重複子。「間隔子」是直接與所關注的標的序列(例如，標的DNA序列)的標的股雜交的核苷酸序列。間隔子被工程化以與所關注的標的序列的標的股具有全部或部分互補性。在一些實施方式中，間隔子可以包括約8個核苷酸至約30個核苷酸或更多。例如，間隔子的長度可以是約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子的長度是8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子的長度是約10個至約26個核苷酸或約12個至約30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子的長度是約30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子的長度是30個核苷酸。在一些實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，間隔子與標的序列(例如，標的DNA序列)的標的股之間的互補性程度介於50%及99%或更多之間，包括但不限於約或高於約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多。在一些實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，間隔子與標的序列(例如，標的DNA序列)的標的股之間的互補性程度是50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一些實施方式中，間隔子的序列可以與標的序列的非標的股的序列完全相同。在一些標的序列是標的DNA序列的那些實施方式中，除了尿嘧啶(U)取代間隔子中的胸腺嘧啶(T)之外，間隔子的序列可以與標的DNA序列的非標的股的序列完全相同。在實施方式中，間隔子沒有二級結構，其可以使用本領域已知的任何合適的多核苷酸折疊演算法來預測，包括但不限於mFold (例如，參見Zuker and Stiegler (1981)
Nucleic Acids Res.9：133-148)及RNAfold (例如，參見Gruber et al. (2008)
Cell106(1)：23-24)。
在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括對間隔子的至少一核苷酸、至少一糖、至少一核鹼基及/或磷酸主鏈的化學修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，至少一修飾 是選自由下列組成的群組：2′-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2′-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2′-氟(2′-F)修飾；2′F-4′Cα-OMe修飾；2′,4′-二-Cα-OMe修飾；2′-O-甲基3′硫代磷酸酯(MS)修飾；2′-O-甲基3′硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2′-O-甲基3′膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA (例如，LNA)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸 (2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一LNA修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一2′-O-Me修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一MS修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一2′-O-Me修飾及至少一MS修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一其他化學修飾(例如，2′-O-Me或MS)。在一些實施方式中，本揭露內容的間隔子包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一PS修飾。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：14有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：14有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：14有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
需要澄清的是，如本文所使用的，當核苷酸序列「與SEQ ID NO有一定數量的不同核苷酸」或「與SEQ ID NO具有一定百分比的一致性」時，差異僅發生在核苷酸序列中，且其化學修飾或缺失保持不變。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：16有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：16有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：16有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：16有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：16有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：16有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：15有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：15有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：15有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：17有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：17有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：17有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：17有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：17有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：17有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序。
在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：89有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：89有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：89有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：91有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：91有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：91有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：91有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：91有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：91有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：90所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：90有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：90有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：90有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：90所示的核苷酸序。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：92所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：92有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：92有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：92有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：92有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：92有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：92有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：92所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：111所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：111有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：111有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：111有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：111所示的核苷酸序。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：113所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：113有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：113有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：113有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：113有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：113有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：113有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：113所示的核苷酸序。
在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：112所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：112有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：112有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：112有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有任何化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：112所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：114所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：114有1個至5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：114有5個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：114有4個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：114有3個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：114有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有與SEQ ID NO：114有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的間隔子具有如SEQ ID NO：114所示的核苷酸序列。
與間隔子一起，crRNA進一步包括CRISPR RNA (crRNA)重複子。crRNA重複子包括形成被RGN分子辨識的結構的核苷酸序列，無論是其本身或與雜交的tracrRNA相關。在實施方式中，crRNA重複子的長度可以包括約8個核苷酸至約30個核苷酸或更多。例如，crRNA重複子的長度可以是約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個或更多個核苷酸。在實施方式中，crRNA重複子的長度是8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個核苷酸。在實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，crRNA重複子與其對應的tracrRNA抗重複子之間的互補性程度約或高於約50%、約60%、約70%、約75%個、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多。在特定的實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，crRNA重複子與其對應的tracrRNA抗重複子之間的互補性程度是50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括對crRNA重複子的至少一核苷酸、至少一糖、至少一核鹼基及/或磷酸主鏈的化學修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾是選自由下列組成的群組：2′-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2′-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2′-氟(2′-F)修飾；2′F-4′Cα-OMe修飾；2′,4′-二-Cα-OMe修飾；2′-O-甲基3′硫代磷酸酯(MS)修飾；2′-O-甲基3′硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2′-O-甲基3′膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4’-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一LNA修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一cEt修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一MS修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一2’-O-Me修飾及至少一MS修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一其他化學修飾(例如，2’-O-Me或MS)。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一BNA (例如，LNA，在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA重複子包括至少一LNA修飾。)修飾及至少一PS修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及516中任一者的核苷酸序列，或其活性變異體或片段，當包含在引導RNA內時，其能夠將本文提供的相關RNA引導的核酸酶導向至與本發明揭露的標的序列的序列專一性結合。在一些實施方式中，活性crRNA重複子變異體包括與SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及516中任一者的核苷酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，活性crRNA重複子片段包括如SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及516任一者所示的核苷酸序列的至少5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21或22個連續核苷酸。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：2有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：2有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：2有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：70有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：70有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：70有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：94所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：94有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：94有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：94有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：94所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：241所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：241有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：241有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：241有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：241所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：253所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：253有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：253有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：253有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：253所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：538所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：538有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：538有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：538有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：538所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：39有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：384所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：384有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：384有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：384有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：384所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：385所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：385有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：385有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：385有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：385所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：386所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：386有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：386有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：386有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：386所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：387所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：387有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：387有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：387有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：387所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：300所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：300有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：300所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：304所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：304有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：304所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：308所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：308有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：308所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：312所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：312有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：312所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：320所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：320有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：320所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：344所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：344有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：344所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：348所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：348有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：348所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：352所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：352有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：352所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：356所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：356所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：360所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：360所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：388所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：388有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：388有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：388有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：388所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：389所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：389有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：389有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：389有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：389所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：390所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：390有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：390有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：390有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：390所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：324所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：324有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：324所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：328所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：328有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：328所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：332所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：332有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：332所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：336所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：336有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：336所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：391所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：391有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：391有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：391有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：391所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：392所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：392有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：392有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：392有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：392所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：393所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：393有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：393有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：393有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：393所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：397所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：397有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：397有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：397有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：397所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：465所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：465有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：465所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：469所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：469有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：469所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：473所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：473有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：473所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：477所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：477有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：477所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：481所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：481有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：481所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：508所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：508有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：508所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：512所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：512有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：512所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：516所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：516有1個或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：516所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，crRNA不是天然存在的。在一些實施方式中，在自然界中特定的crRNA重複子序列不會與工程化的間隔子序列連接，且crRNA重複子序列被認為與間隔子序列異源。在一些實施方式中，間隔子序列是天然存在的工程化序列。
在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括對crRNA的至少一核苷酸、至少一糖、至少一核鹼基及/或磷酸主鏈的化學修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾是選自由下列組成的群組：2′-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2′-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2′-氟(2′-F)修飾；2′F-4′Cα-OMe修飾；2′,4′-二-Cα-OMe修飾；2′-O-甲基3′硫代磷酸酯(MS)修飾；2′-O-甲基3′硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2′-O-甲基3′膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA (例如LNA)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一2',4' BNA修飾。在一些實施方式中，2',4' BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2'-O,4’-C-乙烯橋接核酸(2',4'-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一LNA修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一MS修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一2'-O-Me修飾及至少一MS修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一其他化學修飾(例如，2'-O-Me或MS)。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一PS修飾。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：18具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：18具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：18具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：18具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：19具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：19具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：19具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：19具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：71具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：71具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：71具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：71具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：74所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：72具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：72具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：72具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：72具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：95具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：95具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：95具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：95具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：96具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：96具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：96具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：96具有100%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：4具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：4具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：4具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：5具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：6具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：7具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：7具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：7具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：8具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：8具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：8具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：9具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：9具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：9具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：708具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：708具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：708具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：708所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：292具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：292具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：292具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：292所示的核苷酸序列，且其中參考SEQ ID NO：292。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：293具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：293具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：293具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：293所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：73具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：73具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：73具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：73所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：74具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：74具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：74具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：74所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：75具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：75具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：75具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：75所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：301所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：302所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：303具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：303具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：30具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：303所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：305所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：306所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：307所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：309所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：310所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：311所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：313所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：314所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：315所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：321所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：322所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：323所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：345所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：346所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：347所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：349所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：350所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：351所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：353所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：354所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：355所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：357所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：358所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：359所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：361所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：362所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：363所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：97具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：97具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：97具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：98具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：98具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：98具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：98所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：99具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：99具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：99具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：99所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：325所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：326所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：327所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：329所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：330所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：331所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：333所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：334所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：335所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：337所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：338所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：339所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：380所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：381所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：382所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：399具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：399具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：399具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：399所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：400具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：400具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：400具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：400所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：401具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：401具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：401具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：401所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：466所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：467所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：468所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：470所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：471所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：472所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：474所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：475所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：476所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：478所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：479所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：480所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：482所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：483所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：484所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：509所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：510所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：511所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：513所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：514所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：515所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：517所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：518所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：519所示的核苷酸序列。
本發明揭露的引導RNA包括crRNA及轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)。tracrRNA分子包括在本文稱為抗重複子的區域的核苷酸序列，其具有足夠互補性以雜交至crRNA重複子。在實施方式中，tracrRNA分子進一步包括具有二級結構(例如，莖環)的區域。在一些實施方式中，二級結構包括處於配對或未配對兩種狀態其中之一的核苷酸，其中核苷酸或鹼基配對包括兩條互補核酸股之間的鹼基–鹼基氫鍵相互作用(例如，腺嘌呤 (A)與尿嘧啶(U)配對、胞嘧啶(C)與鳥糞嘌呤(G)配對)以形成螺旋。在一些實施方式中，以未配對的單股核苷酸散佈的一或更多螺旋元件的組合構成RNA結構。
本文使用的「莖環」指二級結構的形式，包括在多核苷酸中發現的至少一「莖」及至少一「環」、「突起」或「泡泡」。莖環可以在分子內(在一個分子內，例如在tracrRNA或sgRNA內)或分子間(在兩個不同核酸之間，例如，在crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子的dgRNA中)形成。當兩個核酸序列之間至少存在一些互補性以形成配對的雙股螺旋時，就會產生莖環。具有完全互補性或有時包括G：U搖擺鹼基對(或I：U、I：A或I：C，其中I指肌苷)配對的雙股螺旋區域被稱為「莖」。術語「環」、「突起」或「泡泡」指「莖環」結構內的單股區域，其中核苷酸之間沒有互補性，不包括G：U搖擺鹼基對(或I：U、I：A或I：C，其中I指肌苷)。因此，「環」、「突起」及「泡泡」包括未配對的核苷酸。在一些實施方式中，「環」與「突起」或「泡泡」的不同在「環」位於「莖環」結構的一端，而「突起」及「泡泡」位於「莖環」結構中的兩個「莖」之間。
在某些實施方式中，莖環結構包括莖以及在莖的一端的環。在一些實施方式中，莖環結構包括第一莖及第二莖，莖之間具有泡泡。在一些實施方式中，莖環結構包括環、多個莖及莖之間的多個泡泡。在這種情況下，依照靠近環的順序的泡泡被稱為「第一泡泡」、「第二泡泡」、「第三泡泡」等，且依照靠近環的順序的莖被稱為「第一莖」、「第二莖」、「第三莖」等。在dgRNA的實施方式中，由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環不包括環，因此依照靠近tracrRNA的5’端(或crRNA的3’端)的順序的泡泡稱為「第一泡泡」、「第二泡泡」、「第三泡泡」等，且依照靠近tracrRNA的5’端(或crRNA的3’端)的順序的莖被稱為「第一莖」、「第二莖」、「第三莖」等。
術語「crRNA的crRNA重複子的第一莖」、「crRNA重複子的第一莖」或「crRNA的第一莖」意旨當與tracrRNA的抗重複子雜交時形成莖環結構的第一莖的crRNA的crRNA重複子中的區域。術語「crRNA的crRNA重複子的第二莖」、「crRNA重複子的第二莖」或「crRNA的第二莖」意旨當與tracrRNA的抗重複子雜交時形成莖環結構的第二莖的crRNA的crRNA重複子中的區域。類似地，術語「tracrRNA的抗重複子的第一莖」、「抗重複子的第一莖」或「tracrRNA的第一莖」意旨當與crRNA的crRNA重複子雜交時形成莖環結構的第一莖的tracrRNA的抗重複子中的區域。術語「tracrRNA的抗重複子的第二莖」、「抗重複子的第二莖」或「tracrRNA的第二莖」意旨當與crRNA的crRNA重複子雜交時形成莖環結構的第二莖的tracrRNA的抗重複子中的區域。
在一些實施方式中，在分子內形成的莖環是髮夾莖環。鹼基配對發生在莖環的莖部分，通常涉及鳥糞嘌呤-胞嘧啶鹼基配對及腺嘌呤-尿嘧啶(胸苷)鹼基配對，雖然鳥糞嘌呤-尿嘧啶鹼基配對也是可能的。鹼基堆積相互作用促進螺旋形成。莖環的環部分包括未配對的鹼基。在一些實施方式中，環是核酸股自身翻轉以進行核苷酸配對以產生莖的點。在一些實施方式中，長度小於三個鹼基的環在空間上是不可能的且不會形成。在一些實施方式中，最佳環長度是約4-8個鹼基長。常見具有四個核苷酸序列(例如GAAA、AAAG、ACUU或UUCG)的環已知為「四環」，且由於其組成核苷酸的鹼基堆積相互作用而特別穩定。
在一些實施方式中，與crRNA重複子完全或部分互補的tracrRNA的區域位於分子的5'端，且tracrRNA的3'端包括二級結構。此二級結構的區域通常包括幾個髮夾結構，包括與抗重複子相鄰的連接髮夾。連接形成引導RNA及RGN之間相互作用的核心，且位於引導RNA、RGN及標的序列之間的交叉點。連接髮夾通常在髮夾莖的基部具有保留的核苷酸序列，在tracrRNA的許多連接髮夾中發現模體UNANNC。在實施方式中，本揭露內容的引導RNA或RGN系統使用在其連接髮夾的髮夾莖基部中包括非典型序列的tracrRNA，包括UNANNG及CNANNC。在一些實施方式中，本揭露內容的引導RNA或RGN系統使用在連接髮夾莖的基部中包括UNANNG的非典型序列的tracrRNA。在一些實施方式中，本揭露內容的引導RNA或RGN系統使用在連接髮夾莖的基部中包括CNANNC的非典型序列的tracrRNA。tracrRNA的3'端通常有結構及數量可以有所不同的末端髮夾，但通常包括一個富含GC的Rho-獨立轉錄終止髮夾，後面是3'端的一串U。例如，參見Briner et al. (2014)
Molecular Cell56：333-339, Briner and Barrangou (2016)
Cold Spring Harb Protoc；doi：10.1101/pdb.top090902及美國公開號2017/0275648，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，除了連接髮夾，本揭露內容的tracrRNA包括額外的髮夾或莖環結構。在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一莖環。在一些實施方式中，tracrRNA包括接近抗重複子的至少一莖環及接近tracrRNA的3’端的至少一莖環。「接近」指在區域或核酸分子的末端的1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸內。在某些實施方式中，「接近」指在區域或核酸分子的末端的1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸或6個核苷酸內。「最接近」指最靠近一區域或最靠近核酸分子的末端。例如，最接近tracrRNA尾部的莖環是最靠近tracrRNA尾部的第一莖環。「遠端」指距離區域或核酸分子的末端至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少6個核苷酸、至少7個核苷酸、至少8個核苷酸、至少9個核苷酸、至少10個核苷酸或更多。在一些實施方式中，「遠端」指距離核酸分子的結構(例如，泡泡、環)至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少6個核苷酸、至少7個核苷酸、至少8個核苷酸、至少9個核苷酸、至少10個核苷酸或更多。例如，在莖環的第一泡泡遠端延長的雙引導RNA的抗重複子的第一莖是從crRNA的3’末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸延長。tracrRNA在與其對應的crRNA雜交時亦形成二級結構。tracrRNA的抗重複子區域與crRNA的crRNA重複子完全或部分互補。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子的一部份與crRNA重複子的一部份雜交並形成莖。在一些實施方式中，crRNA：tracrRNA莖包括至少一核苷酸對(即，鹼基對)，因為抗重複子及crRNA重複子的這些部分是互補的。如本文其他地方所述，形成第一莖的tracrRNA的抗重複子的一部份是抗重複子的第一莖，形成第二莖的tracrRNA的抗重複子的一部份是抗重複子的第二莖，形成第三莖的tracrRNA的抗重複子的一部份是抗重複子的第三莖等等。如本文其他地方所述，形成第一莖的crRNA的crRNA重複子的一部份是crRNA重複子的第一莖，形成第二莖的crRNA的crRNA重複子的一部份是crRNA重複子的第二莖，形成第三莖的crRNA的crRNA重複子的一部份是crRNA重複子的第三莖等等。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子的一部份與crRNA重複子的一部份彼此不互補，因此不會雜交而形成鹼基對。在一些實施方式中，抗重複子及crRNA重複子之間的非互補區域形成突起或泡泡。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子及crRNA的crRNA重複子的雜交形成包括至少一莖的二級結構。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子及crRNA的crRNA重複子的雜交形成包括至少一泡泡的二級結構。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子及crRNA的crRNA重複子的雜交形成包括至少一莖及至少一泡泡的二級結構。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子及crRNA的crRNA重複子的雜交形成包括兩個莖及在其之間的一個泡泡的二級結構。
在某些實施方式中，僅由tracrRNA的部分形成的gRNA中的莖環不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，僅由tracrRNA的部分形成的gRNA中的莖環不包括任何化學修飾。
在某些實施方式中，環、突起或泡泡中的核苷酸不包括BNA (例如，LNA)修飾。在一些實施方式中，環、突起或泡泡中的核苷酸不包括任何化學修飾。
在一些實施方式中，與crRNA重複子全部或部分互補的tracrRNA的抗重複子包括約8個核苷酸至約30個核苷酸或更多。例如，由tracrRNA抗重複子及crRNA重複子形成的莖的長度可以是約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30或更多個核苷酸。在一些實施方式中，由tracrRNA抗重複子及crRNA重複子形成的莖的長度是6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，crRNA重複子與其對應的tracrRNA抗重複子之間的互補性程度是約或高於約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多。在一些實施方式中，當使用合適的比對演算法進行最佳比對時，crRNA重複子與其對應的tracrRNA抗重複子之間的互補性程度是50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
在一些實施方式中，整個tracrRNA可以包括約60個核苷酸至超過約210個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA包括60至80個核苷酸、80至100個核苷酸、100至120個核苷酸、120至140個核苷酸、140至160個核苷酸、160至180個核苷酸、或高於180個核苷酸的總長度。例如，tracrRNA的長度可以是約60個、約65個、約70個、約75個、約80個、約85個、約90個、約95個、約100個、約105個、約110個、約115個、約120個、約125個、約130個、約135個、約140個、約150個、約160個、約170個、約180個、約190個、約200個、約210個或更多個核苷酸。在實施方式中，tracrRNA的長度是60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的長度是約70至約105個核苷酸，包括長度是約70個、約71個、約72個、約73個、約74個、約75個、約76個、約77個、約78個、約79個、約80個、約81個、約82個、約83個、約84個、約85個、約86個、約87個、約88個、約89個、約90個、約91個、約92個、約93個、約94個、約95個、約96個、約97個、約98個、約99個、約100個、約101個、約102個、約103個、約104及約105個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的長度是70至105個核苷酸，包括長度是70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個及105個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的長度是約90個至約125個核苷酸，包括長度是約90個、約91個、約92個、約93個、約94個、約95個、約96個、約97個、約98個、約99個、約100個、約101個、約102個、約103個、約104個、約105個、約106個、約107個、約108個、約109個、約110個、約111個、約112個、約113個、約114個、約115個、約116個、約117個、約118個、約119個、約120個、約121個、約122個、約123個、約124及約125個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的長度是90至125個核苷酸，包括長度是90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個及125個核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露內容的tracrRNA包括對tracrRNA的至少一核苷酸、至少一糖、至少一核鹼基及/或磷酸主鏈的化學修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的tracrRNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的tracrRNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾及至少一其他化學修飾。在一些實施方式中，至少一其他化學修飾是選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在某些實施方式中，BNA修飾包括2',4' BNA修飾。在一些實施方式中，2',4' BNA修飾是選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2'-O,4'-C-乙烯橋接核酸(2',4'-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，BNA修飾是LNA修飾。因此，在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一LNA修飾。在一些實施方式中，BNA修飾是cEt修飾。因此，在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一cEt修飾。在某些實施方式中，tracrRNA包括至少一LNA修飾及至少一其他化學修飾。在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一LNA修飾及至少一其他化學修飾，至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一LNA修飾及至少一PS修飾。在某些實施方式中，tracrRNA包括至少一cEt修飾及至少一其他化學修飾。在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一cEt修飾及至少一其他化學修飾，至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。在一些實施方式中，tracrRNA包括至少一cEt修飾及至少一PS修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713中任一者的核苷酸序列或其活性變異體或片段，當包含在引導RNA內時，其能夠將本文提供的相關RNA引導的核酸酶導向至與本發明揭露的標的序列的序列專一性結合。在一些實施方式中，活性tracrRNA序列變異體包括與SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713中任一者的核苷酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核苷酸序列。在實施方式中，活性tracrRNA序列片段包括如SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713所示的核苷酸序列的任一者的至少5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個或更多個連續核苷酸。
在一些實施方式中，tracrRNA在其5'區域或其3'區域處包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，tracrRNA在其5'區域及其3'區域處包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：3具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：3具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：3具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：3具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：76或77具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：76或77具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：76或77具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：76或77具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：100具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：100具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：100具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：100具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：242具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：242具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：242具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：242具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：254具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：254具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：254具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：254具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：539具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：539具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：539具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：539具有100%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：10具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：10具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：10具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：12具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：12具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：12具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：709具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：709具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：709具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：709所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：713具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：713具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：713具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：713所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：294具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：294具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：294具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：294所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：295具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：295具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：295具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：295所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：80具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：80具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：80具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：81具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：81具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：81具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：364所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：365所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：366所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：367所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：369所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：375所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：376所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：377所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：378所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：379所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：102具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：102具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：102具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：102所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：103具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：103具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：103具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：103所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：370所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：371所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：372所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：373所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：710所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：711所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：383所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：499所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：500所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：501所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：504所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：505所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：534所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：535所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：537所示的核苷酸序列。
本文在多核苷酸分子的上下文中使用的術語「衍生自」指使用母分子或來自母分子的資訊所產生或合成的分子。例如，本文揭露的包括至少一BNA (例如，LNA)修飾的tracrRNA、gRNA或crRNA藉由使其核苷酸的至少其中之一被BNA (例如，LNA)修飾而衍生自其各自的未修飾的tracrRNA、gRNA或crRNA。在一些實施方式中，衍生自其各自的未修飾的母tracrRNA、gRNA或crRNA的包括至少一BNA (例如，LNA)修飾的tracrRNA、gRNA或crRNA具有與母分子相同的多核苷酸序列。在crRNA、間隔子、crRNA重複子、tracrRNA、抗重複子或gRNA的上下文中的術語「未修飾的」指不包括任何修飾的核苷酸、BNA修飾、修飾的糖、修飾的核鹼基及/或修飾的磷酸主鏈或任何化學修飾的普通的 crRNA、間隔子、crRNA重複子、tracrRNA、抗重複子或gRNA。
當兩個序列在嚴格條件下彼此雜交時，可以認為這兩個多核苷酸序列實質上是互補的。同樣地，如果與RGN結合的引導RNA在嚴格條件下與標的序列結合，認為RGN以序列專一性方式與特定標的序列結合。「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」意指在兩個多核苷酸序列將彼此雜交至相較於其他序列具有較高的可檢測程度(例如，超過背景至少2倍)下的條件。嚴格條件是序列依賴的，且在不同情況下會不同。通常，嚴格條件是那些在pH 7.0至8.3下鹽濃度小於約1.5 M Na離子，通常約0.01至1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)，且對於短序列(例如，10至50個核苷酸)溫度是至少約30°C，及對於長序列(例如，大於50個核苷酸)溫度是至少約60°C的條件。還可以以添加如甲醯胺的去穩定劑來達到嚴格條件。示例性的低嚴格條件包括以30%至35%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩衝溶液在37°C下的雜交，以及在1X至2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/ 0.3 M 檸檬酸三鈉)中在50°C至55°C下的清洗。示例性的中嚴格條件包括在40%至45%甲醯胺、1.0 M NaCl、1% SDS中在37°C下的雜交，以及在0.5X至1X SSC中在55°C至60°C下的清洗。示例性的高嚴格條件包括在50%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS中在37°C下的雜交，以及在1X SSC中在60°C至65°C下的清洗。可選地，清洗緩衝液可以包括約0.1%至約1% SDS。雜交的持續時間通常小於約24小時，通常是約4小時至約12小時。清洗時間的持續時間將至少是足以達到平衡的時間長度。
Tm是50%的互補標的序列與完美匹配的序列雜交時的溫度(在定義的離子強度及pH下)。對於DNA-DNA雜交體，Tm可以由Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138：267-284的方程式進行估計：Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L；其中M是單價陽離子的莫耳濃度，%GC是DNA中鳥苷及胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是雜交溶液中甲醯胺的百分比，以及L是雜交體的長度(以鹼基對計)。通常，嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列在定義的離子強度及pH下的熱熔點(Tm)低約5°C。然而，高嚴格的條件可以在低於熱熔點(Tm) 1、2、3或4°C的溫度下進行雜交及/或清洗；中嚴格條件可以在低於熱熔點(Tm) 6、7、8、9或10°C的溫度下進行雜交及/或清洗；低嚴格條件可以利用在低於熱熔點(Tm) 11、12、13、14、15或20°C的溫度下進行雜交及/或清洗。使用方程式、雜交及清洗組成物、以及所需的Tm，具有通常知識者將理解雜交及/或清洗溶液的嚴格性的變化本質上被描述。關於核酸雜交的大量指南被發現於Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；以及 Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)。參見Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)中。
術語「序列專一性」也可以指相較於與隨機化背景序列結合，RGN多肽以更大的親和力與標的序列結合。
引導RNA可以是單引導RNA (sgRNA)或雙引導RNA (dgRNA)。sgRNA包括RNA單分子上的crRNA及tracrRNA，而dgRNA包括存在於兩條不同RNA分子上的crRNA及tracrRNA，它們透過crRNA的crRNA重複子的至少一部分及tracrRNA的抗重複子的至少一部分而彼此雜交，彼此可以完全或部分互補。tracrRNA的抗重複子與crRNA的crRNA重複子的雜交形成包括抗重複子及crRNA重複子的莖環。在一些實施方式中，莖環包括由抗重複子及crRNA重複子形成的一或更多個莖。在其中引導RNA是sgRNA的一些實施方式中，crRNA及tracrRNA被連接子核苷酸序列分離。一般而言，連接子核苷酸序列是一種不包括其本身內的互補鹼基或與sgRNA的其他部分互補的鹼基的序列，以避免在連接子核苷酸序列的核苷酸內或包括連接子核苷酸序列的核苷酸的二級結構的形成。在某些實施方式中，連接子在包括crRNA重複子及抗重複子的莖環結構中的第一莖的一端形成環。在一些實施方式中，crRNA及tracrRNA之間的連接子核苷酸序列的長度是至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12或更多個核苷酸。在某些實施方式中，sgRNA的連接子核苷酸序列的長度是至少4個核苷酸。在某些實施方式中，連接子核苷酸序列包括如AAAG、GAAA、ACUU及CAAAGG任一者所示的核苷酸序列。
引導RNA的總長度可以包括約100 nt至120 nt個、約120 nt至140 nt、約140 nt至約160 nt、約160 nt至約180 nt、約180 nt至約200 nt或更多。在一些實施方式中，引導RNA的總長度是100 nt、101 nt、102 nt、103 nt、104 nt、105 nt、106 nt、107 nt、108 nt、109 nt、110 nt、111 nt、112 nt、113 nt、114 nt、115 nt、116 nt、117 nt、118 nt、119 nt、120 nt、121 nt、122 nt、123 nt、124 nt、125 nt、126 nt、127 nt、128 nt、129 nt、130 nt、131 nt、132 nt、133 nt、134 nt、135 nt、136 nt、137 nt、138 nt、139 nt、140 nt、141 nt、142 nt、143 nt、144 nt、145 nt、146 nt、147 nt、148 nt、149 nt、150 nt、151 nt、152 nt、153 nt、154 nt、155 nt、156 nt、157 nt、158 nt、159 nt、160 nt、161 nt、162 nt、163 nt、164 nt、165 nt、166 nt、167 nt、168 nt、169 nt、170 nt、171 nt、172 nt、173 nt、174 nt、175 nt、176 nt、177 nt、178 nt、179 nt、180 nt、181 nt、182 nt、183 nt、184 nt、185 nt、186 nt、187 nt、188 nt、189 nt、190 nt、191 nt、192 nt、193 nt、194 nt、195 nt、196 nt、197 nt、198 nt、199 nt、200 nt或更多。
在一些實施方式中，化學修飾的sgRNA具有如SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的核苷酸序列。
sgRNA或dgRNA可以化學合成或經由體外轉錄合成。測定RGN及引導RNA之間的序列專一性結合的檢定法是本領域已知的，且包括但不限於表現的RGN及引導RNA之間的體外結合檢定法，其可以用可檢測標記(例如，生物素)進行標記，且用於下拉檢測檢定法，其中引導RNA：RGN複合物經由可檢測標記(例如，利用鏈黴親和素珠)捕獲。具有與引導RNA不相關的序列或結構的控制組引導RNA可以用作為RGN與RNA非特異性結合的陰性控制組。
在一些實施方式中，引導RNA可以作為RNA分子而被引入標的細胞、胞器或胚胎中。引導RNA可以化學合成。
在實施方式中，如本文所述，引導RNA可以作為核糖核蛋白複合物而被引入標的細胞、胞器或胚胎中，其中引導RNA與RGN多肽結合。
透過引導RNA至所關注的標的序列的雜交，引導RNA將相關的RGN導向至所關注的特定標的核苷酸序列。標的序列可以藉由RGN在體外或在細胞中被結合(以及在一些實施方式中，被切割)。標的序列可以包括DNA、RNA或其兩者的組合，且可以是單股或雙股。在一些實施方式中，標的序列可以是基因體DNA (即，染色體DNA)、質體DNA、游離DNA或RNA分子(例如，信使RNA、核糖體RNA、轉送RNA、微小RNA、短小干擾RNA)。在其中標的序列是染色體序列的那些實施方式中，染色體序列可以是核、質體或粒線體染色體序列。在本發明揭露的組成物及方法中，標的序列在雙股的標的核酸分子(例如，標的DNA序列)內。在一些實施方式中，標的序列在標的基因體中是獨特的。在一些實施方式中，標的序列包括標的股及非標的股，且標的序列(即，在非標的股上的序列)具有如SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的核苷酸序列。
標的序列與前間隔序列鄰近模體(PAM)相鄰，且標的序列的非標的股是包括PAM的一股。PAM緊鄰標的序列，且通常包括N，其表示任何核苷酸。在一些實施方式中，PAM包括約1個至約10個N，包括約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個或約10個N。在一些實施方式中，PAM包括1個至10個N，包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個N。PAM可以是在標的序列的非標的股上的5'或3'。在一些實施方式中，對於本發明揭露的引導RNA及RGN系統，PAM是在標的序列的非標的股上的3'。通常，PAM是約3-4個核苷酸的共通序列，但在一些實施方式中，其長度可以是2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或更多個核苷酸。
在一些實施方式中，與本發明揭露的標的序列相鄰且在其非標的股上的PAM序列包括如表1中的PAM序列的任一者所示的共通序列。在一些實施方式中，與本發明揭露的標的序列相鄰且在其非標的股上的PAM序列包括如NNNNCC、NNGRR、NNRYA及NGG的任一者所示的共通序列。在一些實施方式中，PAM序列是在標的序列的非標的股上的3'。
給定核酸酶酵素的PAM序列專一性受到酶濃度的影響是已知的(例如，參見Karvelis
et al.(2015)
Genome Biol16：253)，其可以藉由改變用於表現RGN的啟動子或改變遞送至細胞、胞器或胚胎的核糖核蛋白複合物的量來進行修飾。
在辨識其對應的PAM序列後，RGN可以在特定的切割位置切割標的序列的一條或兩條股。如本文所使用的，切割位置由標的序列內的兩個特定核苷酸組成，在這兩個特定核苷酸之間，標的序列的標的股、非標的股或兩條股被RGN切割。切割位置可以包括從PAM的5'或3'方向的1
st及2
nd、2
nd及3
rd、3
rd及4
th、4
th及5
th、5
th及6
th、7
th及8
th或8
th及9
th核苷酸。在實施方式中，切割位置可以距離PAM的5'或3'方向上超過10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個核苷酸。由於RGN可以切割標的序列導致交錯末端，在實施方式中，切割位置是基於標的序列的非標的股上的兩個核苷酸距離PAM的距離來定義的，且對於標的股，是基於距離PAM的互補者的兩個核苷酸的距離來定義的
III. 引導 RNA 的化學修飾及長度修飾
在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA的核苷酸可以包括至少一BNA (例如，LNA)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一BNA (例如，LNA)修飾的工程化的引導RNA。在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA的核苷酸包括在核糖(例如，糖)基團、磷酸基團、核鹼基或其任一組合中的修飾。在寡核苷酸或多核苷酸的上下文中的術語「化學修飾」包括但不限於(a) 末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾、(b) 包括鹼基的替換或移除的核鹼基(或「鹼基」)修飾、(c) 包括在2'、3'及/或4'位置修飾的糖修飾、以及(d) 包括磷酸二酯鍵的修飾或替換的主鏈修飾。術語「修飾的核苷酸」通常指對鹼基、糖及磷酸二酯鍵或主鏈部分(包括核苷酸磷酸)中的一或更多的化學結構具有修飾的核苷酸。術語「修飾」及「化學修飾」在本文中可互換使用。
在一些實施方式中，修飾核苷酸包括糖修飾。糖修飾的非限制性範例包括2'-去氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、2'-氟-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸)、2'-去氧-2'-去胺寡核糖核苷酸(2'-胺基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、2'-胺基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-去氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷-5'-三磷酸、2'-甲基尿苷-5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸、及其異構物(2'-阿糖胞苷-5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷-5'-三磷酸)、疊氮基三磷酸(2'-疊氮基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、2'-疊氮基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸)及其組合。
在一些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多2'-氟基、2'-胺基及/或2'-硫基修飾。在一些實施方式中，修飾是2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-腺苷、2'-氟-鳥苷、2'-胺基-胞苷、2'-胺基-尿苷、2'-胺基-腺苷、2'-胺基-鳥苷、2,6-二胺基嘌呤、4-硫基-尿苷、5-胺基-烷基-尿苷、5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-胺基嘌呤、2'-胺基-丁醯基-芘-尿苷、5-氟-胞苷及/或5-氟-尿苷。
哺乳動物RNA有超過96種天然存在的核苷酸修飾。例如，參見Limbach et al., Nucleic Acids Research, 22(12)：2183-2196 (1994)。核苷包括與糖連接的嘌呤或嘧啶鹼基(即，沒有磷酸基團的核苷酸)。核苷酸及修飾的核苷酸及核苷的製備是本領域已知的，且描述於例如美國專利號4,373,071；4,458,066；4,500,707；4,668,777；4,973,679；5,047,524；5,132,418；5,153,319；5,262,530；以及5,700,642。適用於本揭露內容的許多修飾核苷及修飾核苷酸是可從商業來源取得。核苷可以是天然存在的核苷的類似物。在一些實施方式中，核苷類似物包括二氫尿苷、甲基腺苷、甲基胞苷、甲基尿苷、甲基偽尿苷、硫尿苷、去氧胞苷及去氧尿苷。
在一些情況下，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括核鹼基修飾的核糖核苷酸，即包含至少一非天然存在的核鹼基(替代天然存在核鹼基)的核糖核苷酸。可以併入修飾核苷及修飾核苷酸的修飾的核鹼基的非限制性範例包括m5C (5-甲基胞苷)、m5U (5 -甲基尿苷)、m6A (N6-甲基腺苷)、s2U (2-硫基尿苷)、Um (2'-O-甲基尿苷)、m1A (1-甲基 腺苷)、m2A (2-甲基腺苷)、Am (2-1-O-甲基腺苷)、ms2m6A (2-甲基硫基-N6-甲基腺苷)、i6A (N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A (2-甲基硫基- N6異戊烯基腺苷)、io6A (N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)、ms2io6A (2-甲基硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)、g6A (N6-縮水甘油胺甲醯基腺苷(N6-glycinylcarbamoyladenosine))、t6A (N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)、ms2t6A (2-甲基硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)、m6t6A (N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)、hn6A (N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷)、ms2hn6A (2-甲基硫基-N6-羥基正纈胺醯基 胺甲醯基腺苷)、Ar(p) (2'-O-核糖苷腺苷(磷酸))、I (肌苷)、mIl (1-甲基肌苷)、m'Im (l,2'-O-二甲基肌苷)、m3C (3 -甲基胞苷)、Cm (2T-O- 甲基胞苷)、s2C (2-硫基胞苷)、ac4C (N4-乙醯基胞苷)、f5C (5-甲醯基胞苷(5-fonnylcytidine))、m5Cm (5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm (N4乙醯基2TO甲基胞苷)、k2C (立西啶)、m1G (1-甲基鳥苷)、m2G (N2-甲基鳥苷)、m7G (7-甲基鳥苷)、Gm (2'-0-甲基鳥苷)、m22G (N2,N2-二甲基鳥苷)、m2Gm (N2,2'-O-二甲基鳥苷)、m22Gm (N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷)、Gr(p) (2'-O-核糖苷鳥苷(磷酸))、yW (懷丁苷)、o2yW (過氧懷丁苷)、OHyW (羥基懷丁苷)、OHyW* (修飾不足的羥基懷丁苷)、imG (懷俄苷(wyosine))、mimG (甲基鳥苷)、Q (奎奧苷(queuosine))、oQ (環氧基奎奧苷)、galQ (半乳糖基-奎奧苷)、manQ (甘露糖基-奎奧苷)、preQo (7-氰基-7-脫氮鳥苷(7-cyano-7-deazaguanosine))、preQi (7-胺基甲基-7-脫氮鳥苷)、G (古嘌苷)、D (二氫尿苷)、m5Um (5,2'-0-二甲基尿苷)、s4U (4-硫基尿苷)、m5s2U (5-甲基-2-硫基尿苷)、s2Um (2-硫基-2'-0-甲基尿苷)、acp3U (3-(3-胺基-3- 羧基丙基)尿苷)、ho5U (5-羥基尿苷)、mo5U (5-甲氧基尿苷)、cmo5U (尿苷5-氧醋酸)、mcmo5U (尿苷5-氧醋酸甲基 酯)、chm5U (5-(羧基羥基甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧基羥基甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U (5-甲氧基羰基甲基尿苷)、mcm5Um (S-甲氧基羰基甲基-2- O-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫基尿苷)、nm5s2U (5- 胺基甲基-2-硫基尿苷)、mnm5U (5-甲基胺基甲基尿苷)、mnm5s2U (5-甲基胺基甲基-2-硫基尿苷)、mnm5se2U (5-甲基胺基甲基-2-硒基尿苷)、ncm5U (5-胺甲醯基甲基尿苷)、ncm5Um (5-胺甲醯基甲基-2'-0-甲基尿苷)、cmnm5U (5-羧基甲基胺基甲基尿苷)、cnmm5Um (5-羧基甲基胺基甲基-2-L-O甲基尿苷)、cmnm5s2U (5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基尿苷)、m62A (N6,N6-二甲基腺苷)、Tm (2'-O-甲基肌苷)、m4C (N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C (5-羥基甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧基甲基尿苷)、m6Am (N6,T-O-二甲基腺苷)、rn62Am (N6,N6,0-2-三甲基腺苷)、m2'7G (N2,7-二甲基鳥苷)、m2'2'7G (N2,N2,7-三甲基鳥苷)、m3Um (3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D (5-甲基二氫尿苷)、f5Cm (5-甲醯基-2'-0-甲基胞苷)、mlGm (l,2'-O-二甲基鳥苷)、m'Am (1,2-O-二甲基腺苷)亞胺基甲基尿苷)、tm5s2U (S-牛磺酸甲基-2-硫基尿苷))、imG-14 (4-去甲基鳥苷)、imG2 (異鳥苷)、或ac6A (N6-乙醯基腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-側氧-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氫尿嘧啶、偽尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-胺基尿嘧啶、5-(C
1-C
6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C
2-C
6)-烯基尿嘧啶、5-(C
2-C
6)-炔基尿嘧啶、5-(羥基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(Ci-C
6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C
2-C
6)-烯基胞嘧啶、5-(C
2-C
6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N
2-二甲基鳥糞嘌呤、7-脫氮鳥糞嘌呤、8-阿糖鳥糞嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥糞嘌呤、7-脫氮-7-(C
2-C
6)炔基鳥糞嘌呤、7-脫氮-8-取代的鳥糞嘌呤、8-羥基鳥糞嘌呤、6-硫基鳥糞嘌呤、8-側氧鳥糞嘌呤、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2,4-二胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、8-阿糖嘌呤、取代的7-脫氮嘌呤、7-脫氮-7-取代的嘌呤、7-脫氮-8-取代的嘌呤及其組合。
在一些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括在磷酸主鏈中的一或更多修飾。修飾可以包括一或更多硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯(例如，N3'-P5'-胺基磷酸酯(N3'- P5'-phosphoramidate，NP))/或甲基磷酸酯連接。在一些實施方式中，主鏈修飾包括中性主鏈修飾，包括：二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚體(PMO)及肽核酸(PNA)修飾。在一些實施方式中，主鏈修飾的所有立體異構物皆可用於本揭露內容中。
在一些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾核苷酸包括在核糖的2’位置的修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾(「B」表明本文的化學結構中的「鹼基」)：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲氧基-乙基(2'-MOE)修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-氟(2'-F)修飾：
在一些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的修飾核苷酸的一或更多者包括在核糖的2’位置及4’位置的修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'F-4'Cα-OMe修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2',4'-二-Cα-OMe修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括硫代磷酸酯(PS)修飾(例如，在主鏈中)：
在一些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的修飾核苷酸的一或更多者包括在核糖及磷酸主鏈的2’位置的修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯(MS)修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP；2'-O-甲基3'硫基PACE)修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2’-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3’硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯(PS)修飾；以及BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多MS修飾及一或更多BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多PS修飾及一或更多BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多MS修飾及一或更多2’,4’-BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多PS修飾及一或更多2’,4’-BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多MS修飾及一或更多LNA修飾。在一些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多MS修飾及一或更多cEt修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多PS修飾及一或更多LNA修飾。在某些實施方式中，本揭露內容的修飾分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)包括一或更多PS修飾及一或更多cEt修飾。
在一些實施方式中，修飾包括橋接核酸(BNA)修飾。術語「橋接核酸」指具有核酸的自由度透過分子內鍵或交聯而被限制的結構的核酸。在某些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，核糖的2′氧及4′碳透過「橋」連接。
第一代BNA修飾包括鎖核酸(LNA)修飾。LNA核苷酸包括構形限制的RNA核苷酸，其中核糖中的2'氧與4'碳形成共價鍵，誘導N型(C3'-內)糖基皺褶(sugar puckering)及偏好A型螺旋(You et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(8)：e60)，描述如下：
與RNA相比，LNA顯示改善的鹼基堆積及熱穩定性，導致與互補核酸的高效結合以及改善錯配辨別力及核酸酶抗性(You et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(8)：e60；Vester & Wengel (2004) Biochemistry 43(42)：13233-13241)。它們已成功用於從SNP檢測檢定法至siRNA的許多應用(Vester & Wengel (2004) Biochemistry 43(42)：13233-13241；Elmen et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(1)：439-447)。N-甲基取代的橋接核酸(BNA
NC[N-Me])已設計用於藉由引入更多用於DNA 結合的構形彈性來改善最初的第一代LNA支架，由於空間體積大而具有更大的核酸酶抗性，並降低細胞毒性(Rahman et al. (2008) J Am Chem Soc 130(14)：4886-4896)。
許多橋接核酸是本領域技術人員已知的，且可從商業來源取得(例如，Biosynthesis, Inc.)。在一些實施方式中，BNA包括：2'-O,4'-C-乙烯BNA (2',3'-ENA)；2'-O,4'-C-甲烯基胞苷；2'-O,4'-C-甲烯基尿苷；2',4'-BNA-1-異喹啉酮；2',4'-BNA-2-吡啶酮；2',4'-BNA-TeNA；2',4'-BNA-TrNA；2',4'-BNA
COC；2',4'-BNA
NC[NBn]；2',4'-BNA
NC[NH]；2',4'-BNA
NC[NMe]；3'-胺基-2',4'-BNA；AmNA；DpNA (3,4-二氫-2H-哌喃橋部分；EoNA；GuNA (胍BNA)；HxNA；PrNA；scpBNA (2'-O,4'-C-螺環丙烯BNA)；六元AmNA；SuNA；尿素-BNA；α-L-LNA；5-甲基-2'-O,4'-C-甲烯基尿苷；5-溴-2'-O,4'-C-甲烯基尿苷；3'-O-苯甲基-5'-O-甲磺醯基-5-甲基-2'-O,4'-C-甲烯基尿苷；以及苯亞基縮醛型BNA (BA-BNA)。
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括BNA
NC[N-Me]修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾：
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括S-限制性乙基(cEt)修飾：
其他的BNA被揭露於：美國專利號US 6,770,748；US 6,770,748；8,153,365；8,080,644；7,060,809；7,084,125；7,060,809；7,053,207；6,670,461；6,436,640；6,316,198；以及7,427,672，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。
在某些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的一或更多修飾包括本文所揭露的化學修飾的組合。
本揭露內容的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA的一或更多核苷酸可以是修飾核苷酸。在一些實施方式中，crRNA可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。在一些實施方式中，crRNA的crRNA重複子可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。在一些實施方式中，crRNA的間隔子可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。在一些實施方式中，引導RNA可以具有1個或更多個化學修飾的核苷酸，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或直至所有核苷酸都被化學修飾的更多個化學修飾的核苷酸。修飾核苷酸可以位於RNA序列的任何核苷酸位置，包括第一核苷酸位置、最後核苷酸位置及/或在第一與最後核苷酸位置之間的任何核苷酸位置。例如，對於長度為20個核苷酸的引導RNA，一或更多修飾核苷酸可以位於從引導RNA的5’端起算的核苷酸位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19及/或位置20。在某些實施方式中，本揭露內容的約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約15%至約30%、約20%至約30%或約25%至約30%的RNA分子可以包括修飾核苷酸。在其他情況下，本揭露內容的約10%至約30%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%或約30%的RNA分子或區域可以包括修飾核苷酸。
在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內。在一些實施方式中，化學修飾在一個莖環的一或更多個莖內。在一些實施方式中，化學修飾在多個莖環的一或更多個莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾不在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內，但不在莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸上及莖環的第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸上，但莖環的第二莖內沒有化學修飾。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的所有核苷酸上，但莖環的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的一個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的一個莖內的所有核苷酸上。
在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖的每一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖的每一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的每一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，在引導RNA中且其一個或多個莖中包括化學修飾的莖環是由crRNA及tracrRNA的雜交所形成。在一些實施方式中，在引導RNA中且其一個或多個莖中包括化學修飾的莖環是由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子的雜交所形成。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的「尾部」內。本文使用的術語「尾部」指最接近本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的3′端(例如，從3′端起算的十二個、十一個、十個、九個、八個、七個、六個、五個核苷酸內)的非互補區域。在一些實施方式中，tracrRNA的尾部包括從tracrRNA的3′端起算的1-12個、1-8個或1-6個核苷酸。在一些實施方式中，tracrRNA的尾部包括從tracrRNA的3′端起算的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內以及尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內，以及在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一及第二莖內，以及在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內，而莖環的第二莖沒有化學修飾，且化學修飾存在於本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖、第二莖及第三莖內，以及在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內，以及在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。
在一些實施方式中，化學修飾不存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內以及尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內以及尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一及第二莖內以及尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一、第二及第三莖內以及尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內以及尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內而不在任何其他莖內以及在尾部內，但不存在於環、突起或泡泡中。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內，且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內以及尾部內，且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內以及尾部內，且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一及第二莖內以及尾部內，且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一、第二及第三莖內以及尾部內，且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA(例如，sgRNA或dgRNA)中的由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內以及尾部內，且存在於環、突起或泡泡中。
在gRNA的某些實施方式中，第一莖是由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子之間的雜交所形成的。在一些實施方式中，crRNA及tracrRNA是兩條分離的分子，它們一起形成dgRNA。在dgRNA的實施方式中，第一莖是最接近crRNA的3′端及最接近tracrRNA的5′端的莖。在一些實施方式中，crRNA及tracrRNA在sgRNA的一個分子內。在sgRNA的實施方式中，第一莖是與由crRNA的crRNA重複子及tracrRNA的抗重複子之間的雜交所形成的莖環中的環直接相鄰的莖。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子內。在一些實施方式中，至少一BNA修飾(例如，LNA及/或cEt)在crRNA重複子的第一莖內。crRNA重複子的第一莖包括在藉由與tracrRNA的抗重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第一莖的crRNA重複子內以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第二莖內。crRNA重複子的第二莖包括在藉由與tracrRNA的抗重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第二莖的crRNA重複子內以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一及第二莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一莖內，且crRNA重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第三莖內。crRNA重複子的第三莖包括在藉由與tracrRNA的抗重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第三莖的crRNA重複子內以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一個莖的末端5’核苷酸括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一個莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一個莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一個莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一個莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，只有crRNA重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，在由crRNA重複子及抗重複子的雜交所形成的莖環中的環、突起或泡泡內的crRNA重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，但與包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。在一些實施方式中，缺乏BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的crRNA重複子與在由crRNA重複子及抗重複子的雜交所形成的莖環的第一莖中包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子內。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內。抗重複子的第一莖包括在藉由與crRNA的crRNA重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第一莖的抗重複子內以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第二莖內。抗重複子的第二莖包括在藉由與crRNA的crRNA重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第二莖的抗重複子內的以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一及第二莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第一及第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一及第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一及第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一及第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一及第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內，而tracrRNA的抗重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第三莖內。抗重複子的第三莖包括在藉由與crRNA的crRNA重複子的核苷酸的雜交而形成莖環的第三莖的抗重複子內以及如本文其他地方所述的核苷酸。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一個莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一個莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一個莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一個莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一個莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，只有tracrRNA的抗重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，在由抗重複子及crRNA重複子的雜交所形成的莖環中的環、突起或泡泡內的抗重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾或其組合。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾及從5’端的第二個核苷酸位置處的修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、及從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、及從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、及從5’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。如本文所使用的，本文揭露的RNA分子的「5'區域」包括RNA分子的5'端的第一核苷酸、前2個核苷酸、前3個核苷酸、前4個核苷酸、或前5個核苷酸。
在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾或其組合。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾及從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、及從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、及從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包含在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、及從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。如本文所使用的，本文揭露的RNA分子的「3'區域」包括RNA分子的3'端的第一核苷酸、前2個核苷酸、前3個核苷酸、前4個核苷酸、或前5個核苷酸。在一些實施方式中，單引導RNA的上下文中的crRNA的3'區域包括來自tracrRNA或連接單引導RNA的crRNA及tracrRNA的連接子的第一核苷酸、前2個核苷酸、前3個核苷酸、前4個核苷酸、或前5個核苷酸。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且crRNA不包括任何進一步的化學修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且crRNA的3’區域包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，且crRNA的3’區域包括LNA修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且crRNA的3’區域包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，且crRNA的3’區域包括LNA+PS修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’及3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，且在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處進一步包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括BNA修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt +PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸處被化學修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸被化學修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸被化學修飾，且其中crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸被化學修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，且其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四個核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
本揭露內容在RNA分子的區域「內」的化學修飾的核苷酸及/或化學修飾包括該區域中的所有核苷酸及磷酸主鏈，包括被認為是該區域的一部分的第一個及最後一個核苷酸位置。
化學修飾可以允許使用已被工程化成更短的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子及/或引導RNA。因此，在一些實施方式中，本揭露內容的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子及/或引導RNA被截斷或縮短。在一些實施方式中，相較於缺乏至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的截斷的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子及/或引導RNA，包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的截斷的crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子及/或引導RNA維持或增強基因編輯效率。工程化間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈或引導RNA的上下文中的「截斷」及「缺失」在本文中可互換使用，且指從間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈或引導RNA移除至少一核苷酸。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的間隔子，工程化的間隔子包括1核苷酸(nt)、2 nt、3 nt、4 nt或5 nt的截斷。在一些實施方式中，相較於如SEQ ID NO：14、15、89、90、111及112中任一者所示的核苷酸序列，工程化的間隔子包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt或5 nt的截斷。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt或9 nt的 截斷。在某些實施方式中，相較於如SEQ ID NO：2、70、94、241、253及538中任一者所示的核苷酸序列，工程化的crRNA重複子包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt或9 nt的截斷。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：38有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：38有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：38有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：39有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的核苷酸序列，其中參考SEQ ID NO：39。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA，工程化的crRNA包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt或14 nt的截斷。在某些實施方式中，相較於如SEQ ID NO：18、19、71、72、95或96中任一者所示的核苷酸序列，工程化的crRNA包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt或14 nt的截斷。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA具有與SEQ ID NO：40或41具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA包括與SEQ ID NO：40或41具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA包括與SEQ ID NO：40或41具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的crRNA包括與SEQ ID NO：40或41具有100%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：42具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：43具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的、截斷的crRNA具有如SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：44具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、21 nt、22 nt、23 nt、24 nt、25 nt、26 nt、27 nt、28 nt、29 nt、30 nt、31 nt、32 nt、33 nt、34 nt、35 nt、36 nt、37 nt、38 nt、39 nt、40 nt、41 nt、42 nt或43 nt的截斷。在某些實施方式中，相較於如SEQ ID NO：3、76、77、100、242、254及539中任一者所示的核苷酸序列，工程化的tracrRNA包括1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、21 nt、22 nt、23 nt、24 nt、25 nt、26 nt、27 nt、28 nt、29 nt、30 nt、31 nt、32 nt、33 nt、34 nt、35 nt、36 nt、37 nt、38 nt、39 nt、40 nt、41 nt、42 nt或43 nt的截斷。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括2個核苷酸、4個核苷酸、6個核苷酸、8個核苷酸、10個核苷酸、12個核苷酸、14個核苷酸、16個核苷酸、或18個核苷酸的截斷。
在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在抗重複子的第一莖內的1至12個核苷酸的缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在抗重複子的第一莖內的1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt或12 nt的缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在抗重複子的第一莖內的1 nt、2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt或9 nt的缺失。
在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括從尾部的核苷酸缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括從尾部的1至6個核苷酸缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括從尾部的1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸或6個核苷酸缺失。
在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括最接近尾部的莖環中的缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在最接近tracrRNA的尾部的莖環的第一莖內的1至4個核苷酸對的缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在最接近tracrRNA的尾部的莖環的第一莖內的1至3個核苷酸對的缺失。在一些實施方式中，相較於缺失前相同的化學修飾的tracrRNA，工程化的化學修飾的tracrRNA包括在最接近tracrRNA的尾部的莖環的第一莖內的1個核苷酸對、2個核苷酸對或3個核苷酸對的缺失。
在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的tracrRNA包括與SEQ ID NO：45-47中任一者具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的tracrRNA包括與SEQ ID NO：45-47中任一者具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的tracrRNA包括與SEQ ID NO：45-47中任一者具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的tracrRNA包括與SEQ ID NO：45-47中任一者具有100%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：51具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：52具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：53具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，本揭露內容的gRNA是包括主鏈的sgRNA，其中sgRNA的主鏈包括由連接子連接的crRNA重複子及tracrRNA。在一些實施方式中，連接子具有如AAAG、GAAA、ACUU或CAAAGG所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，連接子具有如AAAG所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的sgRNA具有如SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，本揭露內容的gRNA是包括主鏈的dgRNA，其中dgRNA的主鏈包括crRNA重複子及tracrRNA。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的主鏈，工程化的化學修飾的sgRNA或dgRNA的主鏈短2至30個核苷酸。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的主鏈，工程化的化學修飾的sgRNA或dgRNA的主鏈短2至18個核苷酸。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的主鏈，工程化的化學修飾的sgRNA或dgRNA的主鏈短2個核苷酸、4個核苷酸、6個核苷酸、8個核苷酸、10個核苷酸、12個核苷酸、14個核苷酸、16個核苷酸或18個核苷酸。
在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的sgRNA的主鏈具有與SEQ ID NO：32-34中任一者具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的sgRNA的主鏈具有與SEQ ID NO：32-34中任一者具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的sgRNA的主鏈具有與SEQ ID NO：32-34中任一者具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，沒有化學修飾的工程化的sgRNA的主鏈具有與SEQ ID NO：32-34中任一者具有100%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：35具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：35具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：35具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：36具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：36具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有如SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：37具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：37具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有如SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：296具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：296具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：296具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有如SEQ ID NO：296所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：297具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：297具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有與SEQ ID NO：297具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，sgRNA的工程化的化學修飾的主鏈具有如SEQ ID NO：297所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，本揭露內容的gRNA是包括間隔子及主鏈的sgRNA，其中sgRNA的主鏈包括由核苷酸連接子連接的crRNA重複子及tracrRNA。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的化學修飾的sgRNA，工程化的化學修飾的sgRNA包括間隔子中的截斷及/或主鏈中的截斷。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的sgRNA包括間隔子中的截斷。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的sgRNA包括主鏈中的截斷。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的sgRNA包括間隔子中的截斷及主鏈中的截斷。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的化學修飾的sgRNA，工程化的化學修飾的sgRNA包括1至25個核苷酸的缺失。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的化學修飾的sgRNA，工程化的化學修飾的sgRNA包括13至23個核苷酸的缺失。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的化學修飾的sgRNA，工程化的化學修飾的sgRNA包括13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、23個核苷酸、24個核苷酸或25個核苷酸的缺失。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的sgRNA具有如SEQ ID NO：60-68、298及299中任一者所示的核苷酸序列。
dgRNA的基因編輯效率可以藉由工程化crRNA重複子、crRNA及/或tracrRNA中的核苷酸取代或添加以及化學修飾來改善(參見圖20-21)。本文在工程化間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈及/或引導RNA的上下文中使用的「取代」或「替換」指以相同數量的核苷酸取代或替換特定數量的核苷酸(例如，以3個核苷酸取代3個核苷酸)，或以不同數量的核苷酸取代或替換特定數量的核苷酸。在以不同數量的核苷酸取代或替換特定數量的核苷酸的實施方式中，不同數量的核苷酸可以大於或小於特定數量的核苷酸(例如，以3個核苷取代8個核苷酸，或以8個核苷取代3個核苷酸)。本文在工程化間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈及/或引導RNA的上下文中使用的「添加」指在間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈及/或引導RNA的任一或多個位置處將至少一核苷酸添加至間隔子、crRNA重複子、crRNA、抗重複子、tracrRNA、主鏈及/或引導RNA。在一些實施方式中，本文揭露的有或沒有化學修飾的工程化允許在先導編輯中使用dgRNA。在一些實施方式中，此有或沒有化學修飾的工程化允許在先導編輯中使用dgRNA，並以mRNA遞送RNA引導的核酸酶。
在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖的3’區域處包括來自天然前驅物 CRISPR RNA (前驅crRNA)的取代或添加的核苷酸序列。天然前驅crRNA包括一連串交替crRNA重複子及間隔子，且從生物體中的CRISPR陣列轉錄而成。天然前驅crRNA進一步藉由酵素加工成用於生物體中基因體修飾的成熟的crRNA形式。因此，在一些實施方式中，天然前驅crRNA包含中間加工的或成熟的crRNA中不存在的序列。例如，用於延長APG05586 crRNA重複子的第一莖的核苷酸序列可以來自腸球菌屬(
Enterococcussp.) APG05586前驅crRNA。
在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖的3’區域處包括富含GC的取代或添加的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖的3’區域處包括富含GC的核苷酸序列，其中3’區域中G或C的含量是至少60%、至少80%或100%。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖的3’區域處包括富含GC的核苷酸序列，其中3’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖進一步包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖的3’區域處進一步包括MS、BNA或BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖的5’區域處包括來自天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖的5’區域處包括富含GC的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖的5’區域處包括富含GC的核苷酸序列，其中5’區域中G或C的含量是至少60%、至少80%或100%。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖的5’區域處包括富含GC的核苷酸序列，其中5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖進一步包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖進一步包括所有核苷酸上的BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。「富含GC的核苷酸序列」指具有至少51%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% GC含量的核苷酸序列。在一些實施方式中，富含GC的核苷酸序列指當核苷酸序列包括最多5個核苷酸時，包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：380具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：380所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：381具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：381所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：382具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：382所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化、化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化、化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：383具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：383所示的核苷酸序列。
當RNA引導的核酸酶作為mRNA被遞送時，dgRNA的化學修飾 (例如，抗重複子的第一莖處的所有核苷酸的LNA修飾)不會改善一些RGN系統的基因編輯(參見圖10B及圖10C)。在一些實施方式中，藉由將核苷酸添加至抗重複子的第一莖、將核苷酸添加至crRNA重複子的第一莖、以及化學修飾crRNA重複子及抗重複子的延長的第一莖，來改善基因編輯效率或復原基因編輯。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括在crRNA重複子的3’區域處的1個核苷酸、2個核苷酸、 3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、 9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括在crRNA重複子的3’區域處的2至6個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括在crRNA重複子的3’區域處的2個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括在crRNA重複子的3’區域處的4個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的crRNA重複子，工程化的crRNA重複子包括在crRNA重複子的3’區域處的6個核苷酸的添加。
在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖包括至少5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖包括最多5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的crRNA重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的3’區域中的核苷酸進一步包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是LNA修飾。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：300所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：300有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：300所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：304所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：304有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：304所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：308所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：308有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：308所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：312所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：312有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：312所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：320所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：320有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：320所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：344所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：344有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：344所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：348所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：348有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：348所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：352所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：352有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：352所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：356所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：356所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：360所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：360所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：324所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：324有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：324所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：328所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：328有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：328所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：332所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：332有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：332所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：336所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：336有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：336所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：465所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：465有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：465所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：469所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：469有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：469所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：473所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：473有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：473所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：477所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：477有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：477所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：481所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：481有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：481所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：508所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：508有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：508所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：512所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：512有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：512所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：516所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO：516有1或2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA重複子具有如SEQ ID NO：516所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：301具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：301所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：302具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：302所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：303具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：303具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：303具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：303所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：305具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：305所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：306具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：306所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：307具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：307所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：309具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：309所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：310具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：310所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：311具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：311所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：313具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：313所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：314具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：314所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：315具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：315所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：321具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：321所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：322具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：322所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：323具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：323所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：345具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：345所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：346具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：346所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：347具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：347所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：349具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：349所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：350具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：350所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：351具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：351所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：353具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：353所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：354具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：354所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：355具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：355所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：357具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：357所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：358具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：358所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：359具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：359所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：361具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：361所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：362具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：362所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：363具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：363所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：325具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：325所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：326具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：326所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：327具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：327所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：329具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：329所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：330具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：330所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：331具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：331所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：333具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：333所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：334具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：334所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：335具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：335所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：337具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：337所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：338具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：338所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：339具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：339所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：466具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：466所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：467具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：467所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：468具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：468所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：470具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：470所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：471具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：471所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：472具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：472所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：474具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：474所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：475具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：475所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：476具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：476所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：478具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：478所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：479具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：479所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：480具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：480所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：482具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：482所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：483具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：483所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：484具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：484所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：509具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：509所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：510具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：510所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：511具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：511所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：513具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：513所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：514具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：514所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：515具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：515所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：517具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：517所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：518具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：518所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有與SEQ ID NO：519具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的crRNA具有如SEQ ID NO：519所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括在tracrRNA的5’區域處的1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括在tracrRNA的5’區域處的2至6個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括在tracrRNA的5’區域處的2個核苷酸的添加。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA藉由在tracrRNA的5’區域處添加4個核苷酸而延長。在一些實施方式中，相較於工程化前相同的tracrRNA，工程化的tracrRNA包括在tracrRNA的5’區域處的6個核苷酸的添加。
在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖包括至少5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖包括最多5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化的抗重複子的第一莖的所有核苷酸進一步包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是cEt修飾。
在一些實施方式中，工程化的tracrRNA的尾部處的3′三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，工程化的tracrRNA的尾部處的3′三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，工程化的tracrRNA的尾部處的3′三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，工程化的tracrRNA的尾部處的3′三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，工程化的tracrRNA的尾部處的3′三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：364具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：364所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：365具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：365所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：366具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：366所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：367具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：367所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：369具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：369所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：375具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：375所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：376具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：376所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：377具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：377所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：378具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：378所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：379具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：379所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：370具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：370所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：371具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：371所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：372具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：372所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：373具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：373所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：710具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：710所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：711具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：711所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：499具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：499所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：500具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：500所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：501具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：501所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：504具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：504所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：505具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：505所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：534具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：534所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：535具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：535所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少80%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有與SEQ ID NO：537具有至少95%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化的化學修飾的tracrRNA具有如SEQ ID NO：537所示的核苷酸序列。
IV. RNA 引導的核酸酶
本文提供的是RNA引導的核酸酶系統，包括本發明揭露的引導RNA，特別是以BNA修飾(例如，以LNA修飾進行修飾的引導RNA)進行修飾的引導RNA。在一些實施方式中，RNA引導的核酸酶與本發明揭露的包括至少一橋接核酸(BNA) (例如，LNA及/或cEt)修飾的gRNA結合。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是在tracrRNA的抗重複子的第一莖中包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的工程化的引導RNA。術語RNA引導的核酸酶(RGN)指以序列專一性方式與特定標的序列(例如，標的DNA序列)結合的多肽，並藉由與多肽複合且與標的序列(例如，標的DNA序列)的標的股雜交的引導RNA分子而被導向至標的序列。天然存在的RGN的活性片段或其變異體以RNA引導的序列專一性方式維持與標的序列的結合。雖然RGN能夠在結合後切割標的序列的標的股及/或非標的股，但術語RGN亦涵蓋能夠結合但不切割標的序列的無核酸酶活性的RGN。由RGN對標的序列的標的股及/或非標的股的切割可以造成單或雙股斷裂。僅能夠切割雙股標的核酸分子的單股的RGN被稱為切口酶。
CRISPR-Cas系統是分為第1類或第2類的RGN系統。第1類及第2類系統細分為多個類型(第I型、第II型、第III型、第IV型、第V型、第VI型)，某些類型進一步分為多個次類型(例如，第II-A型、第II-V型、第II-C型、第V-A型、第V-B型)。第2類系統包括單一效應子核酸酶且包括第II型、第V型及第VI型。
在某些實施方式中，RGN是天然存在的第II型CRISPR-Cas蛋白質或其活性片段或變異體。如本文所使用的，術語「第II型CRISPR-Cas蛋白質」、「第II型CRISPR-Cas效應子蛋白質」或「第II型RNA引導的核酸酶」指需要轉錄活化RNA (tracrRNA)及包括兩個核酸酶域(即，RuvC及HNH)的RGN，兩個核酸酶域的每一個執行切割雙股DNA分子的單股。在一些實施方式中，代表性的第II型RGN包括Cas9蛋白質，例如化膿鏈球菌Cas9 (SpCas9或SpyCas9)或SpCas9切口酶，其序列分別如SEQ ID NO：279及280所示，且描述於美國專利號10,000,772及8,697,359，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，代表性的第II型RGN包括嗜熱鏈球菌(
Streptococcus thermophilus) Cas9 (StCas9)或StCas9切口酶，其序列分別如SEQ ID NO：281及282所示，且揭露於美國專利號10,113,167，其全部揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，代表性的第II型RGN包括金黃色葡萄球菌(
Streptococcus aureus) Cas9 (SaCas9)或SaCas9切口酶，其序列分別如SEQ ID NO：283及284所示，且揭露於美國專利號9,752,132，其全部揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，CRISPR-Cas蛋白質是天然存在的第V型CRISPR-Cas蛋白質或其活性片段或變異體。如本文所使用的，術語「第V型CRISPR-Cas蛋白質」、「第V型CRISPR-Cas效應子蛋白質」或「第V型RNA引導的核酸酶」指切割dsDNA且包括單RuvC核酸酶域或分裂RuvC核酸酶域及缺乏HNH域的RGN (Zetsche et al 2015,
Celldoi：10.1016/j.cell.2015.09.038；Shmakov et al 2017,
Nat Rev Microbioldoi：10.1038/nrmicro.2016.184；Yan et al 2018,
Sciencedoi：10.1126/science.aav7271；Harrington et al 2018,
Sciencedoi：10.1126/science.aav4294)。在一些實施方式中，本發明揭露的RGN蛋白質包括Cas12 (例如，Cas12a)。值得注意的是，Cas12a也稱為Cpf1，且不需要tracrRNA，儘管其他第V型CRISPR-Cas蛋白質(例如Cas12b)確實需要tracrRNA。大部分第V型效應子亦可以靶向ssDNA (單股DNA)，通常沒有PAM需求 (Zetsche et al 2015；Yan et al 2018；Harrington et al 2018)。術語「第V型CRISPR-Cas蛋白質」及「第V型RGN」涵蓋包括分裂RuvC核酸酶域的獨特RGN，例如揭露於2019年12月30日申請的美國臨時申請案號62/955,014及2020年7月29日申請的美國臨時申請案號63/058,169、以及2020年12月28日申請的PCT國際申請案號PCT/US2020/067138中的RGN，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，本發明提供RGN蛋白質，包括新兇手法蘭西斯菌(
Francisella novicida) Cas12a (FnCas12a)(其序列如SEQ ID NO：408所示，且揭露於美國專利號9,790,490，其全部揭露內容藉由引用併入本文)或美國專利號9,790,490中揭露的FnCas12a的任何核酸酶不活化突變異體。
在一些實施方式中，本發明揭露的RGN系統包括與標的序列結合的RGN，例如，本文揭露的那些RGN。在一些實施方式中，RGN辨識具有共通核苷酸序列的PAM，共通核苷酸序列包括標的序列的非標的股上的NNNNCC 3' (其中N是A、C、T或G；R是G或A)以及其活性片段或變異體。在一些實施方式中，RGN辨識具有共通核苷酸序列的PAM，共通核苷酸序列包括標的序列的非標的股上的3’處的NNGRR (其中N是A、C、T/U或G；R是G或A)及其活性片段或變異體。在一些實施方式中，RGN辨識具有共通核苷酸序列的PAM，共通核苷酸序列包括標的序列的非標的股上的3’處的NNRYA (其中N是A、C、T/U或G；R是G或A；Y是C或T/U)及其活性片段或變異體。在一些實施方式中，RGN辨識具有共通核苷酸序列的PAM，共通核苷酸序列包括標的序列的非標的股上的3’處的NGG (其中N是A、C、T/U或G)及其活性片段或變異體。在實施方式中，識別此類PAM序列的RGN的活性片段或變異體能夠結合標的序列，且在一些實施方式中，能夠切割標的序列或使標的序列有缺口。
在實施方式中，能夠結合與如NNNNCC所示的PAM共通序列相鄰的標的序列(即，能夠辨識PAM共通序列)的RGN或其活性片段或變異體被使用於本發明揭露的組成物及方法。在實施方式中，PAM序列在標的序列的非標的股上的3’處。在實施方式中，RGN結合至引導RNA，引導RNA包括如SEQ ID NO：2所示的crRNA重複子或其活性片段或變異體及如SEQ ID NO：3所示的tracrRNA或其活性片段或變異體。可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN系統的非限制性範例以及對應的crRNA序列及tracrRNA序列(如果需要)呈現於下表1中，並在本案說明書的範例1-18及圖2至圖34中進一步描述。
表1 RNA引導的核酸酶的非限制性範例及對應的crRNA重複子序列、tracrRNA序列及PAM序列
*用於APG01604的兩個tracrRNA序列
ND：未測定
N = A、C、T/U或G；R = G或A；Y = C或T/U；V = A或G或C；D = A或G或T/U；W = A或T/U
| RGN 名稱 | RGN SEQ ID NO ： | crRNA 重複子 SEQ ID NO ： | tracrRNA SEQ ID NO ： | PAM 序列 |
| APG07433.1 | 1 | 2 | 3 | NNNNCC |
| APG01604 | 69 | 70 | 76, 77* | NNGRR |
| APG05586 | 93 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG05083.1 | 117 | 118 | 119 | NNNNCC |
| APG07513.1 | 120 | 121 | 122 | NNNNCC |
| APG08290.1 | 123 | 124 | 125 | NNRNCC |
| APG05459.1 | 126 | 127 | 128 | NGG |
| APG04583.1 | 129 | 130 | 131 | NNRAATY |
| APG01688.1 | 132 | 133 | 134 | NNRNNC |
| APG00969 | 135 | 136 | 137 | NNARV |
| APG03128 | 138 | 139 | 140 | NNGGNNC |
| APG09748 | 141 | 142 | 143 | DTTN |
| APG00771 | 144 | 145 | 146 | NNRAAT |
| APG02789 | 147 | 148 | 149 | ATTN |
| APG09106 | 150 | 151 | 152 | DTTN |
| APG05733.1 | 153 | 154 | 155 | NNNNCC |
| APG06207.1 | 156 | 157 | 158 | NRRTTT |
| APG01647.1 | 159 | 160 | 161 | NNRRNGG |
| APG08032.1 | 162 | 163 | 164 | NNRAAR |
| APG05712.1 | 165 | 166 | 167 | NNRNAT |
| APG01658.1 | 168 | 169 | 170 | NNGG |
| APG06498.1 | 171 | 172 | 173 | NNNNCC |
| APG09106.1 | 174 | 175 | 176 | DTTN |
| APG09882.1 | 177 | 178 | 179 | NNNNA |
| APG02675.1 | 180 | 181 | 182 | NRRTTT |
| APG01405.1 | 183 | 184 | 185 | NNRAAT |
| APG06250.1 | 186 | 187 | 188 | NNRRNG |
| APG06877.1 | 189 | 190 | 191 | NNNNCC |
| APG09053.1 | 192 | 193 | 194 | NGG |
| APG04293.1 | 195 | 196 | 197 | NNNNC |
| APG01308.1 | 198 | 199 | 200 | NNNNNC |
| APG06646.1 | 201 | 202 | 203 | NNNNC |
| APG09624 | 204 | 205 | 206 | ND |
| APG05405 | 207 | 208 | 209 | ND |
| APG06622 | 210 | 211 | 212 | NNAARG |
| APG02787 | 213 | 214 | 215 | NNRRNA |
| APG06248 | 216 | 217 | 218 | NNRAA |
| APG06007 | 219 | 220 | 221 | NNNNTC |
| APG02874 | 222 | 223 | 224 | NNNNCC |
| APG03850 | 225 | 226 | 227 | NNNNG |
| APG07553 | 228 | 229 | 230 | NNNNGNNA |
| APG03031 | 231 | 232 | 233 | NNNNCC |
| APG09208 | 234 | 235 | 236 | NNNNC |
| APG08770 | 237 | 238 | 239 | NNRYA |
| APG08167 | 240 | 241 | 242 | NNGRR |
| APG03021 | 243 | 244 | 245 | NNNAAA |
| APG06015 | 246 | 247 | 248 | NNAAA |
| APG09344 | 249 | 250 | 251 | NAG |
| APG07991 | 252 | 253 | 254 | NGG |
| APG01868 | 255 | 256 | 257 | NGG |
| APG02998 | 258 | 259 | 260 | NGG |
| APG09298 | 261 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG06251 | 262 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG03066 | 263 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG01560 | 264 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG02777 | 265 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG05761 | 266 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG02479 | 267 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG08385 | 268 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG09217 | 269 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG06657 | 270 | 94 | 100 | NNRYA |
| APG07433.1缺失變異體 | 271 | 2 | 3 | NNNNCC |
| APG08290.1缺失變異體 | 272 | 124 | 125 | NNRNCC |
| LPG10145 | 289 | 290 | 291 | NNGG |
| APG07339 | 409 | 410 | 411 | |
| APG03003 | 412 | 413 | 414 | |
| APG09777 | 415 | 416 | 417 | |
| APG05680 | 418 | 419 | 420 | |
| APG06369 | 421 | 422 | ||
| APG03847 | 423 | 424 | 425 | |
| APG05625 | 426 | 427 | 428 | |
| APG03524 | 429 | 430 | 431 | |
| LPG10134 | 432 | 433 | 434 | NGG |
| LPG10136 | 435 | 436 | 437 | NNNNCC |
| LPG10138 | 438 | 439 | 440 | NNNNC |
| LPG10139 | 441 | 442 | 443 | NNNNC |
| LPG10141 | 444 | 445 | 446 | NGGNR |
| LPG10146 | 447 | 448 | 449 | NNRNNAY |
| LPG10147 | 450 | 451 | 452 | NNAAAT |
| LPG10150 | 453 | 454 | 455 | NNRRWC |
| LPG10155 | 456 | 457 | 458 | NNAAAT |
| LPG10159 | 459 | 460 | 461 | NRAAR |
| LPG10160 | 462 | 463 | 464 | NAAT |
可用於本發明揭露的方法及組成物的RGN的非限制性範例包括APG07433.1、APG01604、APG05586及APG07991 RNA引導的核酸酶(其胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1、69、93或252所示)及其活性片段或變異體，其保留以RNA引導的序列專一性方式結合標的序列的能力。在一些實施方式中，本文揭露的RGN的活性變異體需要tracrRNA來發揮活性。在一些實施方式中，本文揭露的RGN的活性變異體包括第II型RGN。在實施方式中，本文揭露的RGN的活性變異體包括具有與SEQ ID NO：1、69、93或252中任一者所示的胺基酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，APG07433.1 RGN的活性變異體包括如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列的至少50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個或更多個連續胺基酸殘基。在一些實施方式中，APG01604 RGN的活性變異體包括如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列的至少50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個或更多個連續胺基酸殘基。在一些實施方式中，APG05586 RGN的活性變異體包括如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列的至少50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個或更多個連續胺基酸殘基。在實施方式中，APG07991 RGN的活性變異體包括如SEQ ID NO：252所示的胺基酸序列的至少50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個或更多個連續胺基酸殘基。
本發明揭露的組成物及方法可以使用包括至少一核酸酶域(例如，DNase、RNase域)及至少一RNA辨識及/或RNA結合域的RGN以與引導RNA相互作用。可在使用於本發明揭露的組成物及方法中的RGN中發現的進一步域包括但不限於：DNA結合域、解旋酶域、蛋白質-蛋白質交互作用域及二聚合域。在實施方式中，可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN包括DNA結合域、解旋酶域、蛋白質-蛋白質交互作用域及二聚合域中的一個或多個的至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。
根據本發明，本發明揭露的標的序列被RGN結合。標的序列的標的股與與RGN相關聯的引導RNA雜交。如果多肽具有核酸酶活性，則標的序列的標的股及/或非標的股(例如，標的DNA序列)接著可以被RGN切割。術語「切割(cleave)」或「切割(cleavage)」指雙股標的序列(例如，標的DNA序列)的一條股或兩條股的主鏈內的至少一磷酸二酯鍵的水解，可以造成標的序列內的單股或雙股斷裂。本發明揭露的標的序列的切割可以造成交錯斷裂或平滑末端。
可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN可以是衍生自細菌或古細菌物種的野生型序列。替代地，RGN可以是野生型多肽的變異體或片段。例如，野生型RGN可以被修飾以改變核酸酶活性或改變PAM專一性。在實施方式中，RGN不是天然存在的。
可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN可以與其自身的同源引導RNA或與RGN異源的引導RNA一起作用。例如，APG07991 RGN (SEQ ID NO：252)可以與本文揭露的工程化且化學修飾的APG07991 crRNA及tracrRNA結合以進行標的核酸分子(例如，具有如SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480及482-484中任一者所示的核苷酸序列的APG07991 crRNA；及/或具有如 SEQ ID NO：499-501、504及505 中任一者所示的核苷酸序列的APG07991 tracrRNA；參見圖27及28)的切割或修飾。APG07991 RGN亦可以與本文揭露的工程化且化學修飾的SpyCas9 crRNA及tracrRNA結合以進行標的核酸分子(例如，具有如SEQ ID NO：509-511、513-515及 517-519中任一者所示的核苷酸序列的SpyCas9 crRNA；及/或具有如 SEQ ID NO：534、535及 537中任一者所示的核苷酸序列的SpyCas9 tracrRNA；參見圖29)的切割或修飾。
在一些實施方式中，可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN作為切口酶，僅切割雙股標的序列(例如，標的DNA序列)的單股。此類RGN具有單功能核酸酶域。在一些實施方式中，切口酶能夠切割雙股標的序列(例如，標的序列)的標的股或非標的股。在一些實施方式中，額外的核酸酶域已經突變，使核酸酶活性降低或消除。在使用切口酶的實施方式中，為了進行雙股標的序列(例如，標的DNA序列)的雙股切割，需要兩個切口酶，每一個切口酶切開雙股標的序列內的單股。
在一些實施方式中，RGN完全缺乏核酸酶活性，且在本文中被稱為無核酸酶活性的或核酸酶不活化。本領域已知的用於將突變引入胺基酸序列的任何方法(例如，PCR介導的誘變及定點誘變)可以用於產生切口酶或無核酸酶活性的RGN。例如，參見美國公開號2014/0068797及美國專利號9,790,490；其全部揭露內容藉由引用併入本文。
缺乏核酸酶活性的RGN可用於將融合多肽、多核苷酸或小分子有效載荷(payload)遞送至特定基因體位置。在實施方式中，RGN多肽或引導RNA可以與可檢測標記融合，以允許特定序列的檢測。可檢測標記或純化標籤可以直接或經由連接子間接位於RNA引導的核酸酶的N末端、C末端或內部位置。在一些實施方式中，融合蛋白的RGN組分是無核酸酶活性的RGN。在一些實施方式中，融合蛋白的RGN組分是具有切口酶活性的RGN。
可檢測標記是可以視覺化或以其他方式觀察到的分子。可檢測標記可以作為融合蛋白(例如，螢光蛋白)與RGN融合，或可以是與RGN多肽接合的小分子，可以透過視覺或其他方式檢測。可作為融合蛋白與本發明揭露的RGN融合的可檢測標記包括任何可檢測的蛋白質域，包括但不限於螢光蛋白或可用專一性抗體檢測的蛋白質域。螢光蛋白的非限制性範例包括綠色螢光蛋白(例如，GFP、EGFP、ZsGreen1)及黃色螢光蛋白(例如，YFP、EYFP、ZsYellow1)。小分子可檢測標記的非限制性範例包括放射性標記，例如
3H及
35S。
RGN多肽也可以包括純化標籤，其是可用於從混合物(例如，生物樣品、培養基)中分離蛋白質或融合蛋白質的任何分子。純化標籤的非限制性範例包括生物素、myc、麥芽糖結合蛋白(MBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)及3X FLAG標籤。
替代地，無核酸酶活性的RGN可被靶向特定的基因體位置，以改變所需基因(即，標的基因)的表現。在一些實施方式中，無核酸酶活性的RGN與標的序列的結合會藉由干擾標的基因體區域內的RNA聚合酶或轉錄因子的結合而導致標的基因的表現降低。在實施方式中，RGN (例如，無核酸酶活性的RGN)或其複合的引導RNA進一步包括表現調節子，其在與標的基因內的標的序列結合後，用於抑制或活化標的基因的表現。
在一些實施方式中，融合蛋白的表現調節子包括轉錄抑制子域，其與轉錄控制因子及/或轉錄調控蛋白質(例如，RNA聚合酶及轉錄因子)交互作用，以降低或終止至少一基因的轉錄。轉錄抑制子域是本領域已知的，且包括但不限於Sp1樣抑制子、IκB及Krüppel相關盒(KRAB)域。
在一些實施方式中，融合蛋白的表現調節子包括轉錄活化域，其與轉錄控制因子及/或轉錄調控蛋白(例如，DNA聚合酶及轉錄因子)交互作用，以增加或活化至少一基因的轉錄。轉錄活化域是本領域已知的，且包括但不限於單純疱疹病毒VP16活化域及NFAT活化域。
在一些實施方式中，表現調節子經由表觀遺傳機制調節標的序列或受調控的基因的表現。在一些實施方式中，表觀遺傳調節子共價地修飾DNA或組蛋白以改變組蛋白結構及/或染色體結構而不改變DNA序列，導致基因表現的變化(例如，向上調控或向下調控)。表觀遺傳修飾的非限制性範例包括離胺酸殘基的乙醯化或甲基化、精胺酸甲基化、絲胺酸及蘇胺酸磷酸化及組蛋白的離胺酸泛素化及類泛素化(sumoylation)，以及DNA中的胞嘧啶殘基的甲基化及羥甲基化。表觀遺傳調節子的非限制性範例包括組蛋白乙醯轉移酶、組蛋白去乙醯酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶、DNA甲基轉移酶及DNA去甲基酶。
在實施方式中，無核酸酶活性的RGN或具有切口酶活性的RGN可以被靶向至特定基因體位置，以經由與直接化學修飾(例如去胺基)核鹼基導致從一種核鹼基轉變成另一種核鹼基的鹼基編輯多肽(例如，去胺酶多肽或其活性片段或變異體)融合，來修飾標的多核苷酸的序列。鹼基編輯多肽可以在其胺基末端(N末端)或羧基末端(C末端)處與RGN融合。此外，鹼基編輯多肽可以經由胜肽連接子與RGN融合。「鹼基編輯器」是包括DNA靶向多肽(例如，RGN)及鹼基編輯多肽(例如，去胺酶)的融合蛋白。可用於此類組成物及方法的去胺酶或鹼基編輯器的非限制性範例包括胞嘧啶去胺酶、腺嘌呤去胺酶，或鹼基編輯器(例如，腺嘌呤去胺酶或描述於Gaudelli
et al. (2017)
Nature551：464-471、美國公開號2017/0121693及2018/0073012、以及國際公開號WO 2018/027078中的鹼基編輯器，或揭露於國際公開號WO 2020/139783、WO 2022/056254、WO 2022/204093、美國臨時案申請號63/382,344 (於2022年11月24日申請)及美國臨時案申請號63/485,642 (於2023年2月17日申請)中的任一種去胺酶或鹼基編輯器，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文)。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物及方法的去胺酶是揭露於國際公開號WO 2020/139783的表17中的去胺酶，其全部揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物及方法的去胺酶包括如SEQ ID NO：542、544及592-707中任一者所示的去胺酶。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物及方法的去胺酶包括與SEQ ID NO：542、544及592-707中任一者具有至少85%、90%、95%或97% 序列一致性的去胺酶。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物及方法的鹼基編輯器包括如SEQ ID NO：550-591中任一者所示的鹼基編輯器。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物及方法的鹼基編輯器包括與SEQ ID NO：550-591中任一者具有至少85%、90%、95%或97%序列一致性的鹼基編輯器。此外，本領域已知包含RGN及鹼基編輯多肽(例如，胞嘧啶去胺酶)的某些鹼基編輯器也可以包括至少一尿嘧啶穩定多肽，其藉由去胺酶增加核酸分子中胞苷、去氧胞苷或胞嘧啶突變成胸苷、去氧胸苷或胸腺嘧啶的突變率。尿嘧啶穩定多肽的非限制性範例包括揭露於PCT公開號WO 2021/217002及PCT公開號WO 2022/015969中的尿嘧啶穩定多肽，其每一者以其全部揭露內容藉由引用併入本文。本揭露內容的尿嘧啶穩定多肽包括USP2及尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI)域，其可以增加鹼基編輯效率。因此，鹼基編輯器可以包括本文揭露的RGN或其變異體、去胺酶及可選地至少一尿嘧啶穩定多肽，例如UGI或USP2。在實施方式中，與鹼基編輯多肽融合的RGN是切口酶，其切割不被鹼基編輯多肽(例如，去胺酶)作用的DNA股。
本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)可以允許在鹼基編輯系統中使用dgRNA或sgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)可以允許在鹼基編輯系統中使用dgRNA或sgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及tracrRNA的抗重複子中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)以及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及tracrRNA的抗重複子中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)可以允許在鹼基編輯系統中使用dgRNA或sgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至8-13個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至11個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至8-13個核苷酸對的總長度，其中工程化的 crRNA重複子的第一莖及工程化的抗重複子中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至11個核苷酸對的總長度，其中工程化的 crRNA重複子的第一莖及工程化的抗重複子中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包括crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至8-13個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包括crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至11個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包括crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至8-13個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。可用於鹼基編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包括crRNA及tracrRNA的sgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至11個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子中的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracrRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
在一些實施方式中，RGN可以與先導編輯多肽(例如，反轉錄酶)融合。先導編輯是一種多功能且精確的基因體編輯方法，其使用與聚合酶協同工作的核酸可編程DNA結合蛋白直接將新的遺傳資訊寫入特定的DNA位點(例如，描述於US 11,447,770B1；WO2021072328；WO2021226558；WO2020156575；WO2021042047；US11193123；其每一者的全部揭露內容藉由引用併入本文)。先導編輯系統使用作為切口酶的RGN，且系統使用先導編輯(PE)引導RNA (「PEgRNA」)進行編程。PEgRNA是引導RNA，它指定標的序列及經由工程化到引導RNA上的延伸(例如，在5'或3'末端或在引導RNA的內部)來提供用於包含編輯的替換股的聚合的模板。RGN切口酶/先導編輯多肽融合由PEgRNA引導至標的序列並切開待編輯序列上游及PAM上游的非標的股，在非標的股上產生3′瓣(flap)。PEgRNA包括引子結合位點(PBS)，其與非標的股的3′瓣互補。在一些實施方式中，PBS的長度是至少約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49或50個核苷酸。在某些實施方式中，PEgRNA包括PBS，其長度是至少5個(例如，至少5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、28個、19或20個)核苷酸。在一些實施方式中，PEgRNA可以包括長度是至少8核苷酸的PBS。PBS與非標的股的3′瓣的雜交允許包含編輯的替換股的聚合使用PEgRNA的延伸作為模板。PEgRNA的延伸可由RNA或DNA形成。在RNA延伸的情況下，先導編輯的聚合酶可以是RNA依賴性DNA聚合酶(例如，反轉錄酶)。在DNA延伸的情況下，先導編輯的聚合酶可以是DNA依賴性DNA聚合酶。
包含所需編輯(例如，單核鹼基取代)的替換股與待編輯的標的序列的非標的股(除了它包括所需編輯)共享相同序列。透過DNA修復及/或複製機制，標的序列的非標的股被新合成的包含所需編輯的替換股替換。在某些情況下，先導編輯可以被認為是一種「搜尋及替換」基因體編輯技術，因為先導編輯器不僅搜尋及定位待編輯的所需標的序列，而且同時編碼包含所需編輯的替換股，該所需編輯的替換股被設置以取代標的序列的對應非標的股。因此，在一些實施方式中，本揭露內容的引導RNA包括延伸，該延伸包括用於先導編輯的編輯模板。在一些實施方式中，可以與RGN融合的先導編輯多肽包括DNA聚合酶。在某些實施方式中，DNA聚合酶是反轉錄酶。在某些實施方式中，RGN是切口酶。
在一些實施方式中，本發明揭露的引導RNA與包括RuvC域中的突變(例如，D10A突變)的RGN切口酶結合，使得RGN只能切割核酸雙體的標的股(不包括PAM的股)。D10A切口酶不能切割DNA的非標的股，即，需要鹼基編輯的股。在這些實施方式中，RGN切開標的股，而互補的非標的股則被去胺酶修飾。細胞DNA修復機制可以使用修飾的非標的股作為模板來修復被切開的標的股，從而在DNA中引入突變。
因此，在一些實施方式中，切口酶包括不活化的RuvC域。RuvC域具有RNase H摺疊結構(例如，參見Nishimasu et al. (2014) Cell 156(5)：935-949，其全部揭露內容藉由引用併入本文)。RGN的RuvC域通常是分裂的RuvC域，包括在線性胺基酸序列內的兩個或更多個非相鄰區域。例如，化膿鏈球菌Cas9的RuvC域包括SEQ ID NO：279的胺基酸殘基1-59、718-769及909-1098。RuvC域內使其核酸酶活性不活化的突變的非限制性範例是D10A突變，其使分裂的RuvC核酸酶域中的第一個天門冬胺酸殘基突變。nAPG07433.1 (如SEQ ID NO：543所示)是APG07433.1(如SEQ ID NO：1所示)的切口酶變異體，且被描述於WO 2019/236566 (其全部揭露內容藉由引用併入本文)中。其他D10A突變(即，不活化的RuvC/活性的HNH域)切口酶包括但不限於如SEQ ID NO：546-548所示的那些。
在一些實施方式中，融合蛋白的切口酶RGN包括突變(例如，H840A突變，其中胺基酸編號是基於如SEQ ID NO：279所示的化膿鏈球菌Cas9序列)，使得RGN僅能切割核酸雙體的非標的股(包括PAM的股)。在這些實施方式中，切口酶包括不活化的HNH核酸酶域。RGN的HNH核酸酶域具有ββα-金屬摺疊(例如，參見Nishimasu et al. 2014)。例如，化膿鏈球菌Cas9的HNH核酸酶域包括SEQ ID NO：279的胺基酸殘基775-908。HNH域內使其核酸酶活性不活化的突變的非限制性範例是H840A突變，其使HNH核酸酶域的第一個組胺酸突變。H840A突變(即，活性的RuvC/不活化的HNH域)切口酶的非限制性範例包括如SEQ ID NO：549所示的那個。
不活化的RuvC/活性的HNH域(例如，D10A突變)切口酶可用於使用融合的去胺酶進行鹼基編輯，且活性的RuvC/不活化的HNH域(例如，H840A突變)切口酶可用於使用融合的反轉錄酶進行先導編輯。
將RGN的RuvC及/或HNH域不活化的方法是本領域已知的，且通常包括將RuvC域內的第一個天門冬胺酸及/或HNH域的第一個組胺酸進行突變。通常，天門冬胺酸殘基及組胺酸殘基突變成丙胺酸。RuvC域內可被突變以使該域的核酸酶活性失活的其他胺基酸殘基包括Glu762、His983及Asp986 (通常變為丙胺酸)，其中胺基酸編號是基於如SEQ ID NO：279所示的化膿鏈球菌Cas9序列。HNH域內可被突變的其他胺基酸殘基包括D839及N863 (通常變為丙胺酸)，其中胺基酸編號是基於如SEQ ID NO：279所示的化膿鏈球菌Cas9序列。
在一些實施方式中，本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA(例如，以LNA修飾進行修的gRNA)允許在先導編輯系統中使用dgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
在一些實施方式中，本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)允許在先導編輯系統中使用dgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)允許在先導編輯系統中使用dgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，本文所揭露的以BNA修飾進行修飾的gRNA (例如，以LNA及/或cEt修飾進行修飾的gRNA)允許在先導編輯系統中使用dgRNA，其中RGN作為編碼RGN的mRNA被遞送。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至約11個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。
在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾，其中crRNA重複子的第一莖及抗重複子的第一莖被工程化至約11個核苷酸對的總長度，其中工程化的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾，以及其中工程化的tracRNA的尾部處的三個末端核苷酸包括選自MS、BNA (例如，LNA及/或cEt)及BNA+PS (例如，LNA+PS及/或cEt+PS)修飾的化學修飾。在一些實施方式中，可用於先導編輯系統中以BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾進行修飾的gRNA包括包含crRNA及tracrRNA的dgRNA，其中crRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處來自天然前驅crRNA的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處來自天然前驅crRNA的重複子的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處富含GC序列的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處富含GC序列的添加或取代，其中3’區域中G或C的含量是至少60%、至少80%或100%。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖包括在3’區域處富含GC序列的添加或取代，其中3’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處來自天然前驅crRNA的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處來自天然前驅crRNA的重複子的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處富含GC序列的添加或取代。在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處富含GC序列的添加或取代，其中5’區域中G或C的含量是至少60%、至少80%或100%。在一些實施方式中，抗重複子的工程化的第一莖包括在5’區域處富含GC序列的添加或取代，其中5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括來自天然前驅crRNA的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括來自天然前驅crRNA的重複子的至少一核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括富含GC的核苷酸序列的添加或取代。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括富含GC的核苷酸序列的添加或取代，其中crRNA重複子的第一莖的3’區域中及抗重複子的第一莖的5’區域中G或C的含量是至少60%、至少80%或100%。在一些實施方式中，crRNA重複子的工程化的第一莖及抗重複子的工程化的第一莖皆包括富含GC的核苷酸序列的添加或取代，其中crRNA重複子的工程化的第一莖的3’區域及抗重複子的工程化的第一莖的5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
與多肽或域融合的RGN可由連接子分離或連接。如本文所使用的術語「連接子」指連接兩個分子或部分(例如，核酸酶的結合域及切割域)的化學基團或分子。在實施方式中，連接子連接RGN的gRNA結合域及鹼基編輯多肽，例如去胺酶。在實施方式中，連接子連接無核酸酶活性的RGN或RGN切口酶及去胺酶。通常，連接子位於兩個基團、分子或其他部分之間或兩旁，且經由共價鍵連接每個基團、分子或其他部分，從而連接兩者。在實施方式中，連接子是一個胺基酸或複數個胺基酸(例如，胜肽或蛋白質)。在實施方式中，連接子是有機分子、基團、聚合物或化學部分。在實施方式中，連接子的長度是5-100個胺基酸，例如，長度是5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、30-35個、35-40個、40-45個、45-50個、50-60個、60-70個、70-80個、80-90個、90-100個、100-150或150-200個胺基酸。也考慮更長或更短的連接子。
本發明揭露的組成物及方法可以使用包括至少一核定位訊號(NLS)的RGN來增強RGN至細胞核的運輸。核定位訊號是本領域已知的且通常包括一段鹼性胺基酸(例如，參見Lange
et al.,
J. Biol. Chem. (2007) 282：5101-5105)。在實施方式中，RGN包括2個、3個、4個、5個、6個或更多個核定位訊號。核定位訊號可以是異源NLS。可用於本發明揭露的RGN的核定位訊號的非限制性範例是SV40大T抗原、核質蛋白及c-Myc的核定位訊號(例如，參見Ray et al. (2015)
Bioconjug Chem26(6)：1004-7)。在實施方式中，RGN包括如SEQ ID NO：115或116所示的NLS序列。RGN可以在其N末端、C末端或N末端與C末端兩者處包括一或更多個NLS序列。例如，RGN可以在N末端區域處包括兩個NLS序列以及在C末端區域處包括四個NLS序列。
在實施方式中，本發明揭露的RGN包括促進RGN的細胞攝取的至少一細胞穿透域。細胞穿透域是本領域已知的且通常包括多段的帶正電荷的胺基酸殘基(即，聚陽離子細胞穿透域)、交替的極性胺基酸殘基及非極性胺基酸殘基(即，兩親性細胞穿透域)、或疏水性胺基酸殘基(即，疏水性細胞穿透域) (例如，參見Milletti F. (2012)
Drug Discov Today17：850-860)。細胞穿透域的非限制性範例是來自人類免疫缺乏病毒1的轉錄活化的轉錄活化子(TAT)。
核定位訊號及/或細胞穿透域可以位於RGN的N末端、C末端或內部位置。
V. 編碼 RNA 引導的核酸酶的多核苷酸
本揭露內容提供編碼RGN的多核苷酸。在一些實施方式中，RGN與本發明揭露的包括的至少一橋接核酸(BNA) (例如，LNA及/或cEt)修飾的gRNA結合。在一些實施方式中，至少一BNA(例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是包括在tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的工程化的引導RNA。
術語「多核苷酸」或「核酸分子」的使用不旨在將本揭露內容限制於包括DNA的多核苷酸。本領域中具有通常知識者將認可多核苷酸可包括核糖核酸(RNA)、以及核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸的組合。這種去氧核糖核酸以及核糖核苷酸包括天然存在的分子以及合成類似物兩者。這些包括胜肽核酸(PNA)、PNA-DNA嵌合體、鎖核酸(LNA)以及硫代磷酸酯連接序列。本文揭露的多核苷酸也包括所有形式的序列，包括但不限於單股形式、雙股形式、DNA-RNA雜合體、三股螺旋結構(triplex structure)、莖環結構等。
在本發明揭露的組成物及方法包括編碼RGN的核酸分子的實施方式中，核酸分子是mRNA (傳訊RNA)分子。mRNA指任何編碼所關注的多肽且能夠在體外、體內、原位或離體被轉譯以產生編碼的所關注的多肽的多核苷酸。在實施方式中，mRNA分子的基本組成至少包括編碼區、5′UTR、3′UTR、5′帽及多A尾部。在實施方式中，編碼可用於本發明揭露的方法及組成物的RGN的mRNA可以包括給予多核苷酸有用特性的一或更多結構及/或化學修飾或改變。例如，mRNA的有用特性包括對導入mRNA的細胞的先天免疫反應缺乏顯著誘導。「結構」特徵或修飾是兩個或更多個連接的核苷酸在mRNA中插入、刪除、複製、倒轉或隨機化，而對核苷酸本身沒有顯著的化學修飾。因為化學鍵必然會被打斷及重新形成以實現結構修飾，故結構修飾具有化學性質，因此是化學修飾。然而，結構修飾將導致不同的核苷酸序列。對mRNA的化學修飾可以涉及包括在mRNA中的5-甲基胞嘧啶、N1-甲基-偽尿苷、偽尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、2′氟鳥苷、2′氟尿苷、5-溴尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3(1-E-丙烯基胺基)]尿苷、α-硫胞苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷或其組合。
編碼RGN的核酸分子可以針對所關注的生物體(例如，哺乳動物)中的表現而被密碼子最佳化。「密碼子最佳化的」編碼序列是具有其密碼子使用頻率（其密碼子使用頻率被設計用於模擬特定宿主細胞的較佳密碼子使用或轉錄條件的頻率）的多核苷酸編碼序列。由於核酸層次上的一或更多密碼子的改變，使得轉譯的胺基酸序列未改變，因此特定宿主細胞或生物體中的表現提升。核酸分子可以全部或部分被密碼子最佳化。密碼子表以及提供大範圍生物體的偏好資訊的其他參考文獻在本領域中是可得的(例如，參見Gaspar
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et al.(1989)
Nucleic Acids Res.17:477-498，其藉由引用併入本文。可用於本發明揭露的組成物及方法的RGN的密碼子最佳化的編碼序列的非限制性範例是如SEQ ID NO：286-288及545中任一者所示。
編碼本文中提供的RGN的多核苷酸可以在表現卡匣中提供，以用於在體外表現或在所關注的細胞、胚胎或生物體中表現。卡匣將包括5'以及3'調節序列，該5'以及3'調節序列可操作地連接至編碼本文中提供的RGN的多核苷酸，其允許該多核苷酸的表現。卡匣可以另外含有至少一種另外的基因或遺傳元素，以共轉化至生物體中。在包括另外的基因或元素下，組分被可操作地連接。術語「可操作地連接」旨在表示兩種或更多種元素之間的功能性連接。例如，啟動子與所關注的編碼區(例如，編碼RGN的區域)之間的可操作連接是允許所關注的編碼區表現的功能性連接。可操作地連接的元素可以是連續的或非連續的。當用於指兩個蛋白質編碼區的接合時，藉由可操作地連接意指編碼區在相同的閱讀框中。替代地，可以在多個表現卡匣上提供另外的基因或元素。這樣的表現卡匣被提供有多個限制性位點及/或重組位點，以用於使多核苷酸的插入受調節區的轉錄調節。表現卡匣可以另外包含篩選標記基因。
表現卡匣在5'-3'轉錄方向將包括轉錄(以及在一些實施方式中，轉譯)起始區域(即，啟動子)、本揭露內容的編碼RGN的多核苷酸、以及在所關注的生物體中起作用的轉錄(以及在一些實施方式中，轉譯)終止區域(即，終止區域)。本揭露內容的啟動子能夠在宿主細胞中引導或驅動編碼序列的表現。調節區域(例如，啟動子、轉錄調節區域以及轉譯終止區域)對宿主細胞或彼此可以是內源的或異源的。如本文所使用的，關於序列的「異源」是源自外來物種的序列，或者，如果來自相同物種，則是藉由蓄意的人為干預從組成物及/或基因體基因座中的其天然形式而實質上被修飾的序列。如本文所使用的，嵌合基因包括可操作地連接至轉錄起始區域的編碼序列，轉錄起始區域與編碼序列是異源的。
方便的終止區域包括來自猿猴病毒(SV40)、人類生長激素(hGH)、牛生長激素(BGH)及兔β-球蛋白(rbGlob)的終止區域。同樣參見Proudfoot (1991)
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EMBO J. 7(8)：2515-2522。額外的終止區域可以從腫瘤農桿菌(
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額外的調節訊號包括但不限於轉錄起始起始位點、操作子、活化子、增強子、其他調控元素、核醣體結合位點、起始密碼子、終止訊號等。例如，參見美國專利號5,039,523以及4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)，此後稱「Sambrook 11」；Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)以及其中引用的參考文獻。
在製備表現卡匣時，可以操縱各種DNA片段，以便在適合的方向提供DNA序列，以及在適當的情況下，在適合的閱讀框中提供DNA序列。為此，可以使用轉接子或連接子來連接DNA片段，或者可以涉及其他操縱以提供方便的限制位點、除去多餘的DNA、除去限制位點等。為此目的，可涉及體外誘變、引子修復、限制、貼合、重新取代，例如轉換以及置換。
許多啟動子可用於本揭露內容的實施中。可以基於期望結果來選擇啟動子。核酸可以與組成型(constitutive)、誘導型、生長期專一性、細胞類型專一性、組織較佳的、組織專一性或其他啟動子結合，以用於在所關注的生物體中的表現。例如，參見WO 99/43838及美國專利號：8,575,425；7,790,846；8,147,856；8,586832；7,772,369；7,534,939；6,072,050；5,659,026；5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；以及6,177,611中所示的啟動子；藉由引用併入本文。
用於在本揭露內容的細胞中表現的示例性組成型啟動子包括：SV40早期啟動子；小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子；腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)；單純疱疹病毒(HSV)啟動子；巨細胞病毒(CMV)啟動子，例如，CMV立即早期啟動子區域(CMVIE)；勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子；人類泛素C啟動子(UBC)；人類U6小核啟動子(U6)；增強的U6啟動子；來自RNA聚合酶III的人類H1啟動子(H1)；人類延長因子1α啟動子(EF1A)；人類β-肌動蛋白啟動子(ACTB)；人類或小鼠磷酸甘油酯激酶1啟動子(PGK)；與CMV早期增強子耦合的雞β-肌動蛋白啟動子(CAGG)；酵母轉錄延長因子啟動子(TEF1)；等等。例如，參見Miyagishi
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對於在植物中的表現，組成型啟動子亦包括CaMV 35S啟動子(Odell
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誘導型啟動子的範例包括：壓力調控啟動子，例如Adh1啟動子、Hsp70啟動子及Hsp90啟動子(Wurm
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Proc. Natl. Acad. Sci. USA.83：5414–5418；Nover L.
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Nature.329：734–736)。化學調控的啟動子包括：安全劑誘導的In2-2啟動子(美國專利號5,364,780)；生長素誘導的、且具有絨氈層特異性、但在癒傷組織中也有活性的Axig1啟動子(PCT US01/22169)；類固醇反應啟動子(例如，參見Schena
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Sci. Signal.4(164)：rs2-rs2)；以及光誘導的蛋白質-蛋白質交互作用系統(Wang
et al. (2012)
Nat. Methods.9：266–269；Yamada
et al. (2018)
Cell. Rep.25：487–500)。
組織專一性或組織較佳的啟動子可用於靶向特定組織內的表現構築體的表現。在實施方式中，組織專一性或組織較佳的啟動子在哺乳動物組織中具有活性。組織專一性或組織較佳的啟動子的範例包括優先在某些組織(例如，白血球細胞(例如，CD4 T細胞)、心臟、腎臟、肝臟、CNS、眼、胰臟、骨骼肌、睪丸)中啟動轉錄的啟動子。在某些實施方式中，組織專一性或組織較佳的啟動子在植物組織中是有活性的。在植物中發育控制下的啟動子的範例包括在某些組織(例如葉、根、果實、種子或花)中優先啟動轉錄的啟動子。「組織專一性」啟動子是僅在某些組織中啟動轉錄的啟動子。與基因的持續型表現不同，組織專一性表現是基因調節的幾種相互作用程度的結果。因此，來自同源或密切相關的植物物種的啟動子可較佳用於在特定組織中實現轉殖基因的有效及可靠的表現。在一些實施方式中，表現包括組織較佳的啟動子。「組織較佳的」啟動子是在某些組織中優先啟動轉錄的啟動子，但不必是完全或僅在某些組織中啟動轉錄。
在實施方式中，編碼RGN的核酸分子包括細胞類型專一性啟動子。「細胞類型專一性」啟動子是主要在一或更多器官的某些細胞類型中驅動表現的啟動子。細胞(細胞類型專一性啟動子可以主要是在該細胞中有活性)的一些範例包括例如初代細胞、神經元細胞、神經膠質細胞、脂肪細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、感光細胞及視網膜神經節細胞。植物細胞(在植物中有作用的細胞類型專一性啟動子可以主要是在該植物細胞中有活性)的一些範例包括例如BETL細胞、根中的維管束細胞、葉、柄細胞以及莖細胞。核酸分子亦可包括細胞類型較佳的啟動子。「細胞類型較佳的」啟動子是主要驅動大部分在但不必完全或僅在一或更多器官中的某些細胞類型中的表現的啟動子。細胞(細胞類型較佳的啟動子可以是優先在該細胞中有活性)的一些範例包括例如初代細胞、神經元、脂肪細胞、心肌細胞、平滑肌細胞及感光細胞。植物細胞(在植物中有作用的細胞類型較佳的啟動子可以是優先在該植物細胞中有活性)的一些範例包括例如BETL細胞、根中的維管束細胞、葉、柄細胞以及莖細胞。
編碼RGN的核酸序列可以可操作地連接至由例如用於體外mRNA合成的噬菌體RNA聚合酶辨識的啟動子序列。在實施方式中，可純化體外轉錄的RNA以用於本文所述的方法。例如，啟動子序列可以是T7、T3或SP6啟動子序列、或T7、T3或SP6啟動子序列的變異體。在實施方式中，可以純化表現的蛋白質及/或RNA以用於本文所述的基因體修飾方法。
在實施方式中，編碼RGN的多核苷酸也可以與多腺苷酸化訊號(例如，SV40多A訊號及植物中有作用的其他訊號)及/或至少一轉錄終止序列連接。此外，編碼RGN的序列亦可以與編碼至少一核定位訊號、至少一細胞穿透域及/或能夠將蛋白質運輸到特定亞細胞位置的至少一訊號胜肽的序列連接，如本文中其他地方所述。
編碼RGN的多核苷酸可以存在於載體中。「載體」指用於將核酸轉移、遞送或引入宿主細胞的多核苷酸組成物。適合的載體包括質體載體、噬菌粒、黏接質體、人工/微型染色體、轉位子以及病毒載體(例如，慢病毒載體、腺相關病毒載體、桿狀病毒載體)。載體可以包括另外的表現控制序列(例如，增強子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、轉錄終止序列)、篩選標記序列(例如，抗生素抗性基因)、複製起點等。額外的資訊可以在「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubel
et al., John Wiley & Sons, New York, 2003；或 「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」Sambrook & Russell Sambrook & Russell，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，第三版，2001中找到。
載體亦可以包括用於選擇轉化細胞的篩選標記基因。篩選標記基因用於轉化的細胞或組織的選擇。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因(例如，編碼新黴素磷酸轉移酶II (NEO)以及潮黴素磷酸轉移酶(HPT)的基因)、以及賦予對除草化合物(例如，草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮以及2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D))的抗性的基因。標記基因可以包括允許選擇在特定營養物或物質上生長的基因，例如，二氫葉酸還原酶(DHFR；Simonsen and Levinson (1983)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80：2495-2499)、組胺醇去氫酶(hisD；Hartman and Mulligan (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85：8047-8051)、嘌黴素-N-乙醯基轉移酶(PAC或puro；de la Luna
et al. (1988)
Gene62：121- 126) 、胸腺激酶(TK；Littlefield (1964)
Science145：709-710)及黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶 (XGPRT或gpt；Mulligan and Berg (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.78：2072- 2076)。
如所指出的，包括編碼RGN的核苷酸序列的表現構築體可用於轉化所關注的生物體。用於轉化的方法涉及將核苷酸構築體引入所關注的生物體中。「引入」旨在以使得構築體進入宿主細胞內部的方式將核苷酸構築體引入宿主細胞。本揭露內容的方法不需要用於將核苷酸構築體引入宿主生物體的特定方法，只需要核苷酸構築體進入宿主生物體的至少一細胞的內部。宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。在實施方式中，真核宿主細胞是植物細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞或昆蟲細胞。在實施方式中，包括或表現本發明揭露的RGN的真核細胞或已經由本發明揭露的RGN進行修飾的真核細胞是人類細胞。在實施方式中，包括或表現本發明揭露的RGN的真核細胞或已經由本發明揭露的RGN進行修飾的真核細胞是初代細胞。術語「初代細胞」指的是直接從多細胞生物體分離的細胞。初代細胞通常具有經歷很少的群體倍增，因此與連續(腫瘤或人工永生化)細胞系相比，初代細胞更能代表其來源組織的主要功能成分。在一些情況下，初代細胞是已分離然後立即使用的細胞。在其他情況下，初代細胞不能無限分裂，因此無法在體外長時間培養。在一些實施方式中，初代細胞是初代T細胞。在實施方式中，包括或表現本發明揭露的RGN的真核細胞或已經由本發明揭露的RGN進行修飾的真核細胞是造血來源的細胞，例如，免疫細胞(即，先天性或適應性免疫系統的細胞)，包括但不限於B細胞、T細胞、天然殺手(NK)細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能細胞、嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞、單核球、巨噬細胞、及樹突細胞。在實施方式中，包括或表現本發明揭露的RGN的真核細胞或已經由本發明揭露的RGN進行修飾的真核細胞是眼細胞、肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞)、上皮細胞(例如，肺上皮細胞)、或病變細胞(例如，腫瘤細胞)。
用於將核苷酸構築體引入植物及其他宿主細胞內的方法是本領域已知的，其包括但不限於穩定轉化方法、短暫轉化方法及病毒介導方法。
該方法產生轉化的生物體，例如植物，包括整株植物以及植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚及其後代。植物細胞可以是分化的或未分化的(例如癒傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。在一些實施方式中，本發明揭露的方法可以導致轉化的生物體或衍生自這些轉化生物體的細胞株。
「轉基因生物體」或「轉化生物體」或「穩定轉化的」生物體或細胞或組織指已併入或整合編碼本揭露內容的RGN的多核苷酸的生物體。應當理解到，其他外源或內源核酸序列或DNA片段亦可以被併入宿主細胞內。農桿菌及基因槍介導的轉化仍然是用於植物細胞轉化的兩種主要採用的方法。然而，宿主細胞的轉化可以藉由感染、接合、轉染、顯微注射、電穿孔、微噴射(microprojection)、基因槍或粒子轟擊、電穿孔、二氧化矽/碳纖維、超音波介導、PEG介導、磷酸鈣共沉澱、聚陽離子DMSO技術、DEAE葡聚醣程序、及病毒介導、脂質體介導等等來進行。編碼RGN的多核苷酸的病毒介導的引入包括反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒及腺相關病毒介導的引入及表現、以及花椰菜病毒(例如，花椰菜嵌紋病毒)、雙生病毒(例如，菜豆金黃色花葉病毒或玉米線條病毒屬)及RNA植物病毒(例如，煙草嵌紋病毒)的使用。
轉化操作流程以及用於將多肽或多核苷酸序列引入植物內的操作流程可以根據針對轉化所靶向的宿主細胞的類型(例如，單子葉或雙子葉植物細胞)而不同。用於轉化的方法為本領域已知的，且包括美國專利號：8,575,425；7,692,068；8,802,934；7,541,517中所示的那些方法；其每一者藉由引用併入本文。例如，亦參見Rakoczy-Trojanowska, M. (2002)
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轉化可以導致核酸穩定或短暫併入細胞內。「穩定轉化」意指引入宿主細胞的核苷酸構築體整合至宿主細胞的基因體內、且能夠被其子代遺傳。「短暫轉化」意指將多核苷酸引入宿主細胞內，並且不整合至宿主細胞的基因體中。
用於葉綠體轉化的方法為本領域已知的。例如，參見Svab et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA87：8526-8530；Svab and Maliga (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA90：913-917；Svab and Maliga (1993)
EMBO J.12：601-606。該方法取決於含有篩選標記的DNA的粒子槍遞送及經由同源重組將DNA靶向質體基因體。另外，質體轉化可以藉由核編碼的及質體導向的RNA聚合酶的組織偏好表現來轉錄活化沉默的質體攜帶轉基因來實現。McBride et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA91：7301-7305已報導這樣的系統。
根據傳統方式，已轉化的細胞可以生長成轉基因生物，例如，植物。例如，參見McCormick et al. (1986)
Plant Cell Reports5：81-84。然後，可以使這些植物生長，並用相同轉化株或不同株進行授粉，並鑑定出具有編碼RGN或RGN融合體的多核苷酸的所得雜交體。可生長二代或更多代，以確保穩定維持並遺傳編碼RGN或RGN融合體的多核苷酸，然後，收穫種子，以確保編碼RGN或RGN融合體的多核苷酸的存在。以此方式，本發明提供具有穩定地併入其基因體內的本發明的核苷酸構築體(例如，本發明的表現匣)的轉化種子(亦稱為「轉基因種子」)。
在一些實施方式中，已轉化的細胞被引入生物體內。這些細胞可以源自該生物，其中細胞以離體方法被轉化。這些細胞可以是自體的(源自或返回相同個體)、異體的(供給及接受個體是相同物種)。
本文提供的序列可以用於轉化任何植物物種，包括但不限於單子葉植物及雙子葉植物。所關注的植物的範例包括但不限於玉蜀黍(玉米)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥及油菜、甘藍型油菜(Brassica sp.)、苜蓿、黑麥、小米、紅花、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲胡桃、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物以及針葉樹。
蔬菜包括但不限於番茄、萵苣、綠豆、皇帝豆、豌豆、及例如黃瓜、哈密瓜及洋香瓜之類的甜瓜(Curcumis)屬的成員。觀賞植物包括但不限於杜鵑花、繡球花、芙蓉、玫瑰、鬱金香、水仙、矮牽牛、康乃馨、耶誕紅及菊花。較佳地，本發明的植物為農作物(例如，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等)。
如本文所使用的，術語植物包括植物細胞、植物原生質體、可從其再生植物的植物細胞組織培養物、植物癒傷組織、植物叢、及在植物或植物的部分中完整的植物細胞(例如，胚胎、花粉、胚珠、種子、葉子、花、枝、果實、仁、穗、玉米穗軸、殼、莖、根、根尖、花藥等)。穀物意指由商業種植者出於生長或繁殖物種以外的目的而生產的成熟種子。再生植物的子代、變異體及突變異體亦包括於本發明的範圍內，前提條件是這些部分包括所引入的多核苷酸。進一步提供保留本文揭露的序列的經處理的植物產品或副產物，包括例如豆粕。
在一些實施方式中，編碼RGN或RGN融合的多核苷酸用於轉化任何真核物種，包括但不限於動物(例如，哺乳動物、人類、昆蟲、魚類、鳥類及爬蟲類)、植物、真菌、阿米巴原蟲、藻類及酵母。在一些實施方式中，編碼RGN或RGN融合的多核苷酸用於轉化任何原核物種，包括但不限於古細菌及細菌(例如，芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬、鏈黴菌屬、根瘤菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏桿菌屬、弧菌屬、耶爾森氏菌屬、黴漿菌屬、農桿菌屬及乳酸桿菌屬)。
傳統基於病毒及非病毒的基因轉移方法可以用於將核酸引入哺乳動物、植物、昆蟲或鳥類細胞或標的組織中。此種方法可以用於將編碼RGN系統的組成的核酸投予培養物中的細胞或宿主生物中的細胞。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、RNA (例如，本文描述的載體的轉錄本)、裸核酸、及與例如脂質體的遞送載體複合的核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有附加型或整合的基因體。非限制性範例包括利用花椰菜病毒(例如，花椰菜嵌紋病毒)、雙生病毒(例如，菜豆金黃色花葉病毒或玉米線條病毒屬)及RNA植物病毒(例如，煙草嵌紋病毒)的載體。對於基因治療程序的綜述，參見Science 256：808- 813 (1992)；Nabel & Feigner, TIBTECH 11：211-217 (1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH 11：162-166 (1993)；Dillon, TIBTECH 11：167-175 (1993)；Miller, Nature 357：455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10)：1149-1154 (1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1)：31-44 (1995)；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995)；以及 Yu et al., Gene Therapy 1：13-26 (1994)。
核酸的非病毒遞送方法包括脂質體轉染、農桿菌介導的轉化、核轉染、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸共軛物、裸DNA、人工病毒粒子及DNA的藥劑增強攝取。脂質體轉染描述於例如美國專利號5,049,386、4,946,787；以及4,897,355)，且脂質體轉染試劑是市售的(例如，Transfectam ™及Lipofectin™)。適合用於多核苷酸的有效受體識別脂質體轉染的陽離子及中性脂質包括Feigner的WO 91/17424；WO 91/16024中的那些。遞送可以是至細胞(例如，體外或離體投予)或標的組織(例如，體內投予)。脂質：核酸複合物(包括靶向的脂質體，例如免疫脂質複合物)的製備是本領域中具有通常知識者所熟知的(例如，參見Crystal, Science 270：404-410 (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2：291- 297 (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5：382-389 (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. 5：647-654 (1994)；Gao et al., Gene Therapy 2：710-722 (1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52：4817-4820 (1992)；美國專利號4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028及4,946,787)。
使用基於RNA或DNA病毒的系統來遞送核酸利用高度進化的過程將病毒靶向體內的特定細胞且將病毒負載運輸至細胞核。病毒載體可以直接投予患者(體內)或可以用於體外處理細胞，且可以可選地將經修飾的細胞投予患者(離體)。傳統基於病毒的系統可以包括用於基因轉移的反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關及單純皰疹病毒載體。用反轉錄病毒、慢病毒及腺相關病毒基因轉移方法在宿主基因體中的整合是可能的，常常導致所插入的轉基因的長期表現。另外，在許多不同細胞類型及標的組織中已經觀察到高轉導效率。
反轉錄病毒的向性(tropism)可藉由併入外來套膜蛋白而被改變，從而擴大標的細胞的潛在標的族群。慢病毒載體為能夠轉導或感染非分裂細胞且在通常情況下產生高病毒力價的反轉錄病毒載體。因此，反轉錄病毒基因轉移系統的選擇將取決於標的組織。反轉錄病毒載體由順式作用末端長重複序列構成，順式作用末端長重複序列具有達到6-10 kb的外來序列的包裝能力。最小順式作用LTR足以複製及包裝載體，然後，將其用於將治療性基因整合至標的細胞內，以提供永久性轉基因表現。廣泛使用的反轉錄病毒載體包括基於小鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫不全病毒(SIV)、人類免疫不全病毒(HIV)及其組合的那些反轉錄病毒載體(例如，參見Buchscher et al., J. Viral. 66：2731-2739 (1992)；Johann et al., J. Viral. 66：1635-1640 (1992)；Sommnerfelt et al., Viral. 176：58-59 (1990)；Wilson et al., J. Viral. 63：2374-2378 (1989)；Miller et al., J.
Viral. 65：2220-2224 (1991)；PCT/US94/05700)。
在偏好短暫表現的應用中，可以使用基於腺病毒的系統。基於腺病毒的載體在許多細胞類型中能夠有非常高的轉導效率，且不需要細胞分裂。使用這樣的載體，已經獲得了高力價及高表現水準。此載體可以在相對簡單的系統中大量產生。腺相關病毒(「AAV」)載體亦可以用於轉導具有標的核酸的細胞，例如在核酸及胜肽的體外生產中，以及用於體內及離體基因治療程序(例如，參見West et al., Virology 160：38-47 (1987)；美國專利號4,797,368；WO 93/24641；Katin, Human Gene Therapy 5：793-801 (1994)；Muzyczka, J.
Clin. Invest. 94：1351 (1994)。重組AAV載體的構築體在很多出版物中描述，包括美國專利號5,173,414；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5：3251-3260 (1985)；Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4：2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81：6466-6470 (1984)；以及 Samulski et al., J.
Viral. 63：03822-3828 (1989)。包裝細胞通常用於形成能夠感染宿主細胞的病毒顆粒。此種細胞包括包裝腺病毒的293細胞以及包裝反轉錄病毒的ψJ2細胞或PA317細胞。
基因療法中使用的病毒載體通常藉由產生將核酸載體包裝於病毒顆粒中的細胞株而被產生。載體通常含有用於包裝且隨後整合至宿主中所需的最小病毒序列、被用於將要表現的多核苷酸的表現匣替代的其他病毒序列。缺失的病毒功能通常由包裝細胞株以反式提供。例如，基因治療中使用的AAV載體通常僅具有來自包裝及整合至宿主基因體中所需的AAV基因體的ITR序列。病毒DNA被包裝於細胞株中，細胞株含有編碼其他AAV基因的輔助質體，即rep及cap，但缺少ITR序列。
亦可以用腺病毒作為輔助體(helper)來感染細胞株。輔助病毒促進AAV載體的複製及來自輔助質體中的AAV基因的表現。由於缺少ITR序列，輔助質體沒有被大量的包裝。可以藉由例如熱處理來降低腺病毒的污染，腺病毒比AAV對熱處理更敏感。用於將核酸遞送至細胞的其他方法為本領域中具有通常知識者已知的。例如，參見US20030087817，其藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，以本文描述的一或更多核酸分子或載體短暫地或非短暫地轉染宿主細胞。在一些實施方式中，細胞在其天然存在於個體中時被轉染。在一些實施方式中，被轉染的細胞取自個體。
在一些實施方式中，被轉染的細胞是真核細胞。在一些實施方式中，真核細胞是動物細胞(例如，哺乳動物、人類、昆蟲、魚類、鳥類及爬蟲類)。在一些實施方式中，被轉染的細胞是人類細胞。在一些實施方式中，被轉染的細胞是造血來源的細胞，例如免疫細胞(即，先天性或適應性免疫系統的細胞)，包括但不限於B細胞、T細胞、天然殺手(NK)細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能細胞、嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞、單核球、巨噬細胞、及樹突細胞。
在一些實施方式中，細胞源自取自個體的細胞，例如細胞株。在一些實施方式中，細胞或細胞株是原核的。在一些實施方式中，細胞或細胞株是真核的。在進一步實施方式中，細胞或細胞株源自昆蟲、鳥類、植物或真菌物種。在一些實施方式中，細胞或細胞株可以是哺乳動物，例如人類、猴子、小鼠、牛、豬、山羊、倉鼠、大鼠、貓或狗。用於組織培養的多種細胞株是本領域已知的。細胞株的範例包括但不限於C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLaS3、Huhl、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TFl、CTLL-2、CIR、Rat6、CVI、RPTE、AlO、T24、182、A375、ARH-77、Calul、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388Dl、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、lurkat、
145.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4. COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴腎上皮細胞、BALB/3T3小鼠胚胎纖維母細胞、3T3 Swiss、3T3-Ll、132-d5人胎兒纖維母細胞；10.1小鼠纖維母細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-I細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10Tl/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-Kl、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L235010、CORL23/ R23、COS-7、COV-434、CML Tl、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepalclc7、HL-60、HMEC、HT-29、lurkat、
lY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KGl、KYOl、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-l0A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCKII、MOR/ 0.2R、MONO-MAC 6、MTD-lA、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-lA/ PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THPl細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及其轉基因變異體。細胞株可以從本領域中具有通常知識者已知的多種來源獲得(例如，參見美國標準生物品收藏中心(ATCC) (馬納沙斯，維吉尼亞州))。
在一些實施方式中，以本文描述的一或更多核酸分子或載體轉染的細胞用於建立包括一或更多載體衍生序列的新細胞株。在實施方式中，以本文描述的RGN系統的組成短暫轉染的(例如，藉由一或更多載體的短暫轉染，或以RNA轉染)並經由RGN系統的活性修飾的細胞用於建立包括含有修飾但缺少任何其他外源序列的細胞的新細胞株。在實施方式中，以本文描述的一或更多載體短暫或非短暫轉染的細胞或自此種細胞取得的細胞株用於評估一或更多測試化合物。
在一些實施方式中，本文描述的一或更多載體用於產生非人類的轉基因動物或轉基因植物。在一些實施方式中，轉基因動物是昆蟲。在進一步實施方式中，昆蟲是害蟲，例如蚊子或壁蝨。在一些實施方式中，昆蟲是植物害蟲，例如玉米根蟲或草地貪夜蛾。在一些實施方式中，轉基因動物是鳥類，例如雞、火雞、鵝或鴨。在一些實施方式中，轉基因動物是哺乳動物，例如人類、小鼠、大鼠、倉鼠、猴子、猿、吐、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓或狗。
VI. 多肽及多核苷酸的變異體或片段
本揭露內容提供本發明揭露的crRNA、tracrRNA、引導RNA及RGN的活性變異體及片段。在一些實施方式中，本文揭露的crRNA、tracrRNA及引導RNA的變異體包括包含BNA修飾(例如，LNA修飾及/或cEt修飾)的crRNA、tracrRNA及引導RNA。天然存在的(即，野生型)RGN的活性變異體或片段以RNA引導的序列專一性方式結合至本文描述的標的序列。在實施方式中，本文描述的標的序列包括如SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，本文揭露的RGN的活性變異體或片段需要tracrRNA來發揮活性。在一些實施方式中，本文揭露的RGN的活性變異體或片段包括第II型RGN。在一些實施方式中，本揭露內容提供：RGN的活性變異體及片段，具有如SEQ ID NO：1、69、93及252中任一者所示的胺基酸序列；crRNA重複子的活性變異體及片段，包括如SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及516中任一者所示的序列；crRNA的活性變異體及片段，包括如SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及708中任一者所示的序列；以及tracrRNA的活性變異體及片段，包括如SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713中任一者所示的序列。在一些實施方式中，本揭露內容提供引導RNA主鏈的活性變異體及片段，包括如SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者所示的序列。在一些實施方式中，本揭露內容提供sgRNA的活性變異體及片段，包括如SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的序列。
儘管變異體或片段的活性相較於所關注的多核苷酸或多肽是可以改變的，但變異體及片段應保留所關注的多核苷酸或多肽的功能性。例如，當與所關注的多核苷酸或多肽相較時，變異體或片段可以具有增加的活性、降低的活性、不同的活性譜或活性的任何其他改變。
例如本文所揭露的天然存在的RGN多肽的片段及變異體將保留序列專一性的RNA引導的DNA結合活性。在實施方式中，例如本文所揭露的天然存在的RGN多肽的片段及變異體會保留核酸酶活性(單股或雙股)。
當例如本文所揭露的crRNA重複子的片段及變異體作為引導RNA (包括tracrRNA)的一部分時，將保留以序列專一性方式結合至RNA引導的核酸酶(與引導RNA複合)並將RNA引導的核酸酶(與引導RNA複合)靶向至標的核苷酸序列的能力。
當例如本文所揭露的tracrRNA的片段及變異體作為引導RNA (包括crRNA)的一部分時，將保留以序列專一性方式將RNA引導的核酸酶(與引導RNA複合)靶向至標的序列的能力。
例如本文所揭露的引導RNA的片段及變異體將保留以序列專一性方式將RNA引導的核酸酶(與引導RNA複合)靶向至標的序列的能力。
術語「片段」指本揭露內容的多核苷酸或多肽序列的一部分。「片段」或「生物活性部分」包括多核苷酸，多核苷酸包括足夠數量的連續核苷酸，以保留生物活性(即，當包括於引導RNA中時，以序列專一性方式結合至RGN並將RGN引導至標的序列)。「片段」或「生物活性部分」包括多肽，多肽包括足夠數量的連續胺基酸殘基，以保留生物活性(即，當與引導RNA錯合時，以序列專一性方式與標的序列結合)。RGN蛋白的片段包括由於使用替代的下游開始位點而比全長序列短的那些片段。RGN蛋白的生物活性部分可以是包括RGN的例如10個、25個、50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個、1100個、1150個、1200個、1250個、1300個、1350個、1400個、1450個、1500個、1550個、1600個、1650個、1700個或更多個連續胺基酸殘基的多肽，該RGN與本文揭露的或SEQ ID NO：1、69、93及252中任一者的標的核苷酸序列結合。此類生物活性部分可以藉由重組技術進行製備並針對序列專一性的RNA引導的DNA結合活性進行評估。crRNA重複子的生物活性片段可以包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及 516中任一者的至少8個連續核苷酸。crRNA重複子的生物活性部分可以是包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及516中任一者的例如8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個連續核苷酸的多核苷酸。tracrRNA的生物活性片段可以包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713中任一者的至少8個連續核苷酸。tracrRNA的生物活性部分可以是包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及713的例如8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個或更多個連續核苷酸的多核苷酸。crRNA的生物活性片段可以包括SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及708中任一者的至少8個連續核苷酸。crRNA的生物活性部分可以是包括SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及708中任一者的例如8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個或更多個連續核苷酸的多核苷酸。sgRNA的生物活性片段可以包括SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者的至少90個連續核苷酸。gRNA的生物活性部分可以是包括SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者的例如90個、95個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個或更多個連續核苷酸的多核苷酸。
一般來說，「變異體」旨在意指實質上相似的序列。對於多核苷酸，變異體包括天然多核苷酸中的一或更多內部位點處的一或更多核苷酸的缺失及/或添加及/或於天然多核苷酸中的一或更多位點處的一或更多核苷酸的取代。如本文所使用的，「天然」或「野生型」多核苷酸或多肽分別包括天然存在的核苷酸序列或胺基酸序列。對於多核苷酸，保留式(conservative)變異體包括因為遺傳密碼的簡併(degeneracy)而編碼所關注基因的天然胺基酸序列的那些序列。例如可使用眾所周知的分子生物學技術鑑定(例如，利用如以下概述的聚合酶連鎖反應(PCR)及雜交技術)的天然存在的等位基因變異體。變異體多核苷酸亦包括合成衍生的多核苷酸，例如那些例如藉由使用定點誘變產生的但其仍然編碼所關注的多肽或多核苷酸。通常，本文所揭露的特定多核苷酸的變異體將與如藉由本文別處描述的序列比對程式及參數所確定的那個特定多核苷酸具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性。
本文所揭露的特定多核苷酸的變異體(亦即，參考多核苷酸)亦可藉由比較由變異體多核苷酸所編碼的多肽與由該參考多核苷酸所編碼的多肽之間的序列一致性百分比來評估。可使用本文別處描述的序列比對程式及參數來計算任何二個多肽之間的序列一致性百分比。當藉由比較本文揭露的任何給定的多核苷酸對所編碼的兩個多肽共同的序列一致性百分比來評估本文揭露的任何給定的多核苷酸對時，該兩個經編碼的多肽之間的序列一致性百分比為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性。
在一些實施方式中，本發明揭露的多核苷酸編碼為了活性需要tracrRNA的RNA引導的核酸酶多肽。在一些實施方式中，本發明揭露的多核苷酸編碼為第II型RGN的RNA引導的核酸酶多肽。在特定實施方式中，本發明揭露的多核苷酸編碼RNA引導的核酸酶多肽，該RNA引導的核酸酶多肽包括的胺基酸序列與編碼RGN(其結合本文所揭露的標的序列)的胺基酸序列或與如SEQ ID NO：1、69、93和252中任一個所示的胺基酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性。
揭露內容的RGN多肽的生物活性變異體可相差少至約1-15個胺基酸殘基、少至約1-10個(例如，約6-10個)、少至5個、少至4個、少至3個、少至2個、或少至1個胺基酸殘基。在實施方式中，多肽可包括N端或C端截斷(truncation)，該截斷可至少包括從該多肽的N端或C端的10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700個或更多個胺基酸的缺失。
在實施方式中，本發明揭露的多核苷酸包括crRNA重複子，該crRNA重複子包括與SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512、以及516的任一者所示的核苷酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性的核苷酸序列。
在實施方式中，本發明揭露的多核苷酸包括crRNA，該crRNA包括與SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519、以及708的任一者所示的核苷酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性的核苷酸序列。
本發明揭露的多核苷酸可包括tracrRNA，該tracrRNA包括與SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711、以及 713的任一者所示的核苷酸序列的任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性的核苷酸序列。
本發明揭露的多核苷酸可包括sgRNA，該sgRNA包括與SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299、以及 405-407的任一者所示的核苷酸序列的任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性的核苷酸序列。
在一些實施方式中，本文所揭露的crRNA、tracrRNA和引導RNA的變異體包括包括如本文所述的修飾的核苷酸、糖、磷酸主鏈及/或核鹼基的crRNA、tracrRNA和引導RNA。 變異體crRNA、tracrRNA和引導RNA可包括修飾，該修飾包括2'-O-Me修飾；2'-F修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；MS修飾；MSP修飾；MP修飾；PS修飾；BNA修飾(例如 2',4' BNA、LNA、BNA
NC[N-Me]、2'-O,4'-C-乙烯橋接核酸(2',4'-ENA) 和 S-限制性乙基(cEt))； 或其組合。
本揭露內容的crRNA重複子、crRNA、tracrRNA或引導RNA的生物活性變異體可相差少至約1-15個胺基酸殘基、少至約1-10個(例如，約6-10個)、少至5個、少至4個、少至3個、少至2個、或少至1個核苷酸。於實施方式中，多核苷酸可包括5'或3'截斷，其可至少包括從多核苷酸的5'或3'端缺失10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、100、105、110個或更多個核苷酸。
應當理解到，可對本文提供的RGN多肽、crRNA重複子、crRNA、tracrRNA及引導RNA進行修飾，從而產生變異體蛋白及多核苷酸。人為設計的改變可經由定點誘變技術的應用而被引入。或者，在結構上及/或功能上與本文揭露的序列有關的天然的、未知的或尚未鑑定的多核苷酸及/或多肽亦可被認為落入本揭露內容的範圍內。可在不改變該RGN蛋白功能的非保留區域中進行保留式胺基酸取代。或者，可進行改良RGN活性的修飾。
變異體多核苷酸和蛋白亦包括從例如誘變及重組程序(例如DNA混排)取得的序列及蛋白。用這種程序，操縱本文所揭露的一或更多不同的RGN蛋白(例如，SEQ ID NO：1)，以產生具有期望特性的新RGN蛋白。以這種方式，重組多核苷酸庫是從包括序列區域的相關序列多核苷酸的群體產生的，該序列區域具有基本序列一致性且可在體外或體內同源地重組。例如，使用這種方法，編碼所關注域的序列模體可在本文提供的RGN序列與其他已知RGN基因之間混排，以獲得編碼具有改良的所關注的性質(例如在酵素的情況中，增加的K
m)的蛋白質的新基因。此種DNA混排的策略為本領域已知的。例如，參見Stemmer (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:10747-10751；Stemmer (1994)
Nature370:389-391；Crameri等人(1997)
Nature Biotech.15:436-438；Moore等人 (1997)
J. Mol. Biol.272:336-347；Zhang等人
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:4504-4509；Crameri等人 (1998)
Nature391:288-291；及美國專利號5,605,793及5,837,458。「混排的」核酸為藉由混排程序(例如本文闡述的任何混排程序)產生的核酸。混排的核酸為藉由例如以人工方及可選地遞迴的方式(實體地或虛擬地)重組二個或更多個核酸(或字符串)產生的。通常，混排過程中使用一或更多篩選步驟來鑑定所關注的核酸；此篩選步驟可在任何重組步驟之前或之後進行。在一些(但不是全部)混排實施方式中，期望在選擇之前執行多輪重組，以增加要篩選的池的多樣性。重組及選擇的整個過程可選地遞迴地重複。根據背景，混排可指重組及選擇的整個過程、或者可替代地可僅指整個過程的重組部分。
如本文使用的，在二個多核苷酸或多肽序列的上下文中使用的「序列一致性」或「一致性」涉及到當在指定的比較窗上比對以獲得最大對應性時為相同的二個序列中的殘基。當使用與蛋白質有關的序列一致性百分比時，應當理解到，不同的殘基位置通常因保留式胺基酸取代而不同，其中胺基酸殘基被具有類似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其他胺基酸殘基取代、且因此不會改變分子的功能特性。當序列在保留式取代方面不同時，可以向上調整序列一致性百分比，以校正取代的保留性質。藉由這種保留式取代而不同的序列被稱為具有「序列相似性」或「相似性」。用於進行此種調整的手段為本領域中具有通常知識者所熟知的。通常，此涉及將保留式取代計為部分誤配而非全部誤配，從而增加序列一致性百分比。因此，例如，在相同胺基酸被給定計分1且非保留式取代被給定計分零的情況下，保留式取代被給定0與1之間的計分。例如，以在程式PC/GENE (Intelligenetics，Mountain View，California)中實施的那樣來計算保留式取代的計分。
如本文所使用的，「序列一致性百分比」是指藉由在比較窗上比較二個最佳比對的序列所確定的值，其中比較窗中的多核苷酸序列的部位可包括相較於用於該二個序列的最佳比對的參考序列(不包括添加或缺失)的添加或缺失(亦即，缺口)。藉由下述來計算該百分比：確定在二個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數以產生匹配位置數、將匹配位置數除以比較窗中的位置總數、以及將結果乘以100以產生序列一致性百分比。
除非另有說明，否則本文提供的序列一致性/相似性值指使用利用以下參數的GAP版本10獲得的值：使用GAP權重50及長度權重3以及nwsgapdna.cmp計分矩陣的核苷酸序列的%一致性及%相似性；使用GAP權重8及長度權重2以及BLOSUM62計分矩陣的胺基酸序列的%一致性及%相似性；或其任何等效程式。「等效程式」是指任何序列比較程式，當與GAP版本10產生的對應比對進行比較時，針對所涉及的任何二個序列，該序列比較程式產生具有相同核苷酸或胺基酸殘基匹配及相同序列一致性百分比的比對。
當使用所界定的胺基酸取代矩陣(例如，BLOSUM62)、缺口存在罰分(gap existence penalty)及缺口延伸罰分(gap extension penalty)比對二個序列，以達到該對序列可能的最高分數時，二個序列被「最佳比對」。胺基酸取代矩陣及其在量化該二個序列之間的相似性中的使用為在本領域所熟知的，並且被描述於例如Dayhoff 等人 (1978) 在“Atlas of Protein Sequence and Structure,” Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.中的“A model of evolutionary change in proteins” 以及Henikoff等人 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919中。BLOSUM62矩陣通常用作序列比對操作流程中的預設計分替換矩陣。缺口存在罰分實施用於在比對序列中的一個比對序列引入單個胺基酸缺口，而缺口延伸罰分實施用於插入已經打開的缺口中的每一個另外的空胺基酸位置。藉由比對開始和結束處的每一個序列的胺基酸位置、以及可選地藉由在一個或二個序列中插入一或多個缺口來達到最高可能計分來定義比對。儘管可以手動完成最佳比對和計分，但是藉由使用電腦實施的比對演算法(例如Altschul等人在(1997)
Nucleic Acids Res. 25：3389-3402中所述、並且在國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上向公眾開放的有缺口BLAST 2.0)促進了該過程。可以使用例如經由www.ncbi.nlm.nih.gov可得的和Altschul
et al.(1997)
Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的PSI-BLAST來準備包括多重比對的最佳比對。
關於與參考序列最佳比對的胺基酸序列，胺基酸殘基「對應於」在參考序列中與該比對中的該殘基配對的位置。該「位置」由數字表示，該數字基於其相對於N-端的位置依序識別該參考序列中的每一個胺基酸。由於在確定最佳比對時必須考慮的缺失、插入、截斷、融合等，通常藉由簡單地從N端計數即可確定的測試序列中的胺基酸殘基數目，不必與在該參考序列中其對應位置的數目相同。例如，在所比對的測試序列中存在缺失的情況中，將不存在與參考序列中缺失位點處的位置對應的胺基酸。在所比對的參考序列中有插入的情況下，該插入將不對應於該參考序列中的任何胺基酸位置。在截斷或融合的情況中，該參考序列或所比對的序列中可存在不對應於相應序列中的任何胺基酸的胺基酸段(stretch)。
VII. 用於結合所關注標的序列的核糖核蛋白複合物及 RGN 系統 以及其製造方法
本揭露內容提供RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：a) 本文所描述的化學修飾的tracrRNA；b) crRNA；以及 c)第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，化學修飾的tracrRNA及crRNA形成引導RNA。
本揭露內容亦提供RGN系統，其中該RGN系統包括：a) 本文所描述的化學修飾的crRNA；b) tracrRNA；以及c)第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，化學修飾的crRNA以及tracrRNA形成引導RNA。
本揭露內容亦提供RGN系統，其中該RGN系統包括：a) 本文所描述的化學修飾的引導RNA；以及 b) 第II型RGN多肽、或包括編碼該第II型RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露內容的RGN系統結合標的核酸分子中的標的序列。在一些實施方式中，本揭露內容的RGN系統的gRNA能夠與RGN系統的第II型RGN多肽形成複合物，以引導第II型RGN多肽結合至標的序列。
在一些實施方式中，RNA引導的核酸酶系統包括本發明揭露的gRNA，該本發明揭露的gRNA包括至少一橋接核酸(BNA) (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是工程化引導RNA，該工程化引導RNA包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。如本文所使用的，RGN系統包括至少一RGN多肽或包括編碼該RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸、以及能夠與該RGN多肽形成複合物(核糖核蛋白複合物)的一或更多引導RNA。在一些實施方式中，一或更多引導RNA包括至少一BNA修飾(例如，LNA修飾及/或cEt修飾)。本發明揭露的RGN系統包括：a) 能夠使所結合的RGN多肽靶向標的序列的一或更多引導RNA；以及 b) RGN多肽或包括編碼該RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中一或更多引導RNA能夠與該RGN多肽形成複合物，以引導該RGN多肽結合至標的序列。引導RNA與標的序列的標的股雜交、且亦與RGN多肽形成複合物，由此引導RGN多肽結合至標的序列。在一些實施方式中，標的序列包括SEQ ID NO：273-278以及712的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，RGN能夠辨識PAM及結合與PAM相鄰的標的序列。在一些實施方式中，RGN包括SEQ ID NO：1、69、93及252或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，本文揭露的RGN為了活性需要tracrRNA。在一些實施方式中，本文揭露的RGN包括第II型RGN。在實施方式中，RGN包括胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%的序列一致性。在一些實施方式中，引導RNA包括crRNA重複子，該crRNA重複子包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及 516或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括crRNA，該crRNA包括SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及 708或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在實施方式中，引導RNA包括tracrRNA，該tracrRNA包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及 713或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。系統的引導RNA可為單引導RNA或雙引導RNA。在一些實施方式中，引導RNA包括sgRNA，該sgRNA包括SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及 405-407或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在實施方式中，系統包括與引導RNA異源的RNA引導的核酸酶，其中RGN和引導RNA在自然界中並未發現彼此複合(即彼此結合)。例如，APG07991 RGN (SEQ ID NO：252)與本文所揭露的工程化和化學修飾的SpyCas9 crRNA和tracrRNA (例如，具有SEQ ID NO：509-511、513-515及 517-519的任一項所示的核苷酸序列的SpyCas9 crRNA) 一起起作用；及/或具有SEQ ID NO：534、535和537中任一者所示的核苷酸序列的SpyCas9 tracrRNA；參見圖29)。在某些實施方式中，所描述的系統中的一或更多RNA序列(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、tracrRNA抗重複子、sgRNA或dgRNA等)包括本文所揭露的一或更多不同的化學修飾(例如，BNA修飾)。
在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在一個莖環的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在多個莖環的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾不在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內但不在第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸及第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於第一莖內的一或更多核苷酸上，但沒有化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾存在於第一莖內的所有核苷酸上，但沒有化學修飾存在於莖環的第二莖內。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內的所有核苷酸上。
在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖的每一者內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖的每一者內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的每一莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，引導RNA中的莖環(該莖環在其一或更多莖中包括化學修飾)是透過crRNA和tracrRNA的雜交而形成的。在一些實施方式中，引導RNA中的莖環(該莖環在其一或更多莖中包括化學修飾)是透過crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子的雜交而形成的。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內和尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖和第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內並且沒有化學修飾在第二莖內，並且化學修飾存在於本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一、第二和第三莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內。
在一些實施方式中，化學修飾不存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內和尾部內但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內以及在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖及第二莖內且在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一、第二和第三莖內及在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內以及在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內且不在任何其他莖內且在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內和尾部內且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內以及在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一和第二莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一、第二和第三莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子內。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端3’核苷酸以及末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第二莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端3’核苷酸和末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一及第二莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的末端3’核苷酸和末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一及第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在第一莖內且沒有化學修飾在crRNA重複子的第二莖內。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第三莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端3’核苷酸和末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端3’核苷酸和末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，只有crRNA重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，藉由crRNA重複子和抗重複子雜交形成的莖環中的環、突起或泡泡內的crRNA重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾、但與包括至少一個BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。在一些實施方式中，缺乏BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的crRNA重複子與在由crRNA重複子和抗重複子雜交形成的莖環的第一莖中包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子內。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端3'核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第二莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖及第二莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖及第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖及第二莖的末端3'核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖及第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖及第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖及第二莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第三莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，僅有tracrRNA的抗重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，藉由抗重複子與crRNA重複子的雜交形成的莖環中的環、突起或泡泡內的抗重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5'端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5'端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5'端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從5'端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、在從5'端的第五個核苷酸位置處的化學修飾、或其組合。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾以及在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5'端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5'端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從5'端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5'端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。
在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾、或其組合。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾以及在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，且tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS 修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個剩餘核苷酸包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及 tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及 tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt +PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括LNA修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2'-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt +PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5'區域和3'區域處的三個末端核苷酸經化學修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸經化學修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸經化學修飾，以及其中crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸和tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸經化學修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在RGN系統的實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖可在3’區域包括來自天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的取代或添加的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的取代或添加的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中3'區域中G或C的含量為至少60%、至少80%、或100%。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中3’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖進一步包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖進一步在3’區域包括MS、BNA或BNA+PS修飾。
在RGN系統的實施方式中，工程化抗重複子的第一莖可在5’區域包括來自天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5’區域包括富含GC的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中5’區域中G或C的含量為至少60%、至少80%、或100%。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中該5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖進一步包括至少一化學修飾。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖進一步在所有核苷酸上包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，RGN系統的工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，RGN系統的工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處2至6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，RGN系統的工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處2個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，RGN系統的工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處4個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，RGN系統的工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖中的核苷酸進一步包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處2至6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處2個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處4個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖的所有核苷酸進一步包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
本文提供的用於結合所關注的標的序列的系統可為核糖核蛋白複合物，其是與至少一蛋白質結合的RNA的至少一分子。本文提供的核糖核蛋白複合物包括作為RNA組成的至少一引導RNA及作為蛋白質組成的RNA引導的核酸酶。可從天然表現RGN多肽的細胞或生物體中純化此類核糖核蛋白複合物，並且此類核糖核蛋白複合物結合對所關注的標的序列專一的特定引導RNA。在一些實施方式中，從已用編碼RGN多肽的多核苷酸(例如mRNA)轉化且其中已引入合成衍生的gRNA的細胞或生物體中純化核糖核蛋白複合物。因此，提供用於製造RGN多肽或RGN核糖核蛋白複合物的方法。此類方法包括：在RGN多肽被表現的條件下，培養包括編碼RGN多肽的核苷酸序列的細胞。接著，可從所培養的細胞的溶胞產物中純化RGN多肽或RGN核糖核蛋白。在一些實施方式中，編碼RGN多肽的核苷酸序列包括mRNA (傳訊RNA)。
從生物樣本的溶胞產物中純化RGN多肽或RGN核糖核蛋白複合物的方法是本領域已知的(例如，粒徑篩析及/或親和層析法、2D-PAGE、HPLC、逆相層析法、免疫沉澱法)。在特定方法中，RGN多肽為重組產生的且包括有助於其純化的純化標籤，其包括但不限於：麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串接親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG(例如3X FLAG標籤)、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu- Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、10xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)及鈣調蛋白。通常，所標記的RGN多肽或RGN核糖核蛋白複合物是使用固定化金屬親和層析法純化的。應當理解，可單獨地或組合地使用本領域已知的其他類似方法，包括其他形式的層析法或例如免疫沉澱法。
「分離的」或「純化的」多肽或其生物活性部分實質上或基本上不含在其天然存在的環境中發現的、正常情況下與該多肽相伴或交互作用的組成。因此，分離的或純化的多肽當藉由重組技術被產生時實質上不含其他細胞物質或培養基，或當被化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質。實質上不含細胞物質的蛋白質包括具有少於約30%、20%、10%、5%或1% (以乾重計)的污染蛋白質的蛋白質製劑。當重組產生本揭露內容的蛋白質或其生物活性部分時，最佳培養基呈現少於約30%、20%、10%、5%或1% (以乾重計)的化學前驅物或所關注的非蛋白質化學物質。類似地，「分離的」多核苷酸或核酸分子從其天然存在的環境中移除。分離的多核苷酸在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質，或已透過磷酸二酯鍵的斷裂從基因體基因座中去除。分離的多核苷酸可以是物質組成物、載體的一部分、或是包括在細胞內，只要細胞不是多核苷酸的原始環境。
本文所提供的用於結合及/或切割所關注的標的序列的特定方法涉及使用體外組裝的RGN核糖核蛋白複合物。RGN核糖核蛋白複合物的體外組裝可使用本領域已知的方法進行，其中在允許RGN多肽與引導RNA結合的條件下使RGN多肽與引導RNA接觸。如本文中所使用的，「接觸(contact、contacting)」、「接觸的(contacted)」指在適合進行期望反應的條件下，將期望反應的組成放在一起。RGN多肽可從生物樣本、細胞溶胞產物或培養基中純化、經由體外轉換產生、或被化學合成。引導RNA可從生物樣本、細胞溶胞產物或培養基中純化、在體外被轉錄、或被化學合成。可使RGN多肽及引導RNA在溶液(例如，緩衝鹽溶液)中接觸以允許RGN核糖核蛋白複合物的體外組裝。
本揭露內容的一些方面提供包括本文所述的RGN系統的一或更多元素的套組，包括：化學修飾的引導RNA (例如，化學修飾的sgRNA或dgRNA，包括化學修飾的crRNA和tracrRNA)；RGN或編碼該RGN的多核苷酸；細胞；以及完整的RGN 系統。在實施方式中，套組包括用於使用RGN系統的一或更多元素(例如用於體外或體內核酸編輯)的合適試劑、緩衝液及/或說明。試劑可被提供於任何適合的容器中，例如小瓶、瓶子或管子。試劑可用於利用RGN系統的一或更多元素的製程。例如，可以包括限制酶以將編碼RGN的多核苷酸選殖到載體中。在實施方式中，套組包括關於設計和使用合適的化學修飾的引導RNA (例如，化學修飾的sgRNA或dgRNA，包括化學修飾的crRNA和tracrRNA)用於標的序列的標靶編輯的說明。試劑可為以可用於特別測定的形式、或以在使用前需要添加一或更多種其他成分的形式(例如，以濃縮或冷凍乾燥形式)被提供。緩衝液可以是任何緩衝液，包括但不限於碳酸鈉緩衝液、碳酸氫鈉緩衝液、硼酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液及其組合。在一些實施方式中，緩衝液為鹼性的。在一些實施方式中，緩衝液具有約7至約10的pH。
包括本揭露內容的RGN系統的一或更多元素的套組在多種應用中具有實用性，包括以多種細胞方式修飾(例如，刪除、插入、易位、不活化、活化、鹼基編輯、先導編輯)標的序列。細胞類型。因此，包括本揭露內容的RGN系統的一或更多元素的套組在例如基因治療、藥物篩選、疾病診斷以及預後中是有用的。
在某些實施方式中，本揭露內容的套組包括醫藥套組，該醫藥套組中包括本文所述的醫藥組成物。在實施方式中，醫藥套組可包括：(a)含有冷凍乾燥形式的本揭露內容的組成物的容器以及(b)含有用於注射的藥學上可接受的稀釋劑(例如，無菌水)的第二容器。藥學上可接受的稀釋劑可用於復原或稀釋本揭露內容的冷凍乾燥化合物。可選地，與這樣的容器相關聯的可以是監管藥品或生物製品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的通知，該通知反映用於人類投予的製造、使用或銷售的機構的批准。
VIII. 結合、切割或修飾標的核酸分子的方法
本揭露內容提供用於結合、切割及/或修飾包括標的序列(例如T 細胞受體 α恆定 (TRAC))所關注的標的核酸分子的方法。該方法包括向該標的序列或包括該標的序列的細胞、胞器或胚胎遞送包括至少一引導RNA或編碼該至少一引導RNA的多核苷酸、以及至少一RGN多肽或編碼該至少一RGN多肽的多核苷酸的系統。該方法包括將包括至少一引導RNA和至少一RGN多肽或編碼該至少一RGN多肽的多核苷酸的系統遞送至標的序列或包括該標的序列的細胞、胞器或胚胎。在一些實施方式中，引導RNA包括本文所揭露的一或更多各種化學修飾。在特定實施方式中，引導RNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是工程化引導RNA，該工程化引導RNA包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，標的序列包括SEQ ID NO：273-278以及712的任一者所示的核苷酸序列。在實施方式中，RGN能夠辨識PAM及結合與PAM相鄰的標的序列。在一些實施方式中，RGN為了活性需要tracrRNA。在一些實施方式中，RGN包括第II型RGN。在一些實施方式中，RGN包括SEQ ID NO：1、69、93及252或其活性變異體或片段的任一者所示的胺基酸序列。在一些實施方式中，RGN包括胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%的序列一致性。在實施方式中，引導RNA包括crRNA重複子，該crRNA重複子包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及 516或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括crRNA，該crRNA包括SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及 708或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括tracrRNA，該tracrRNA包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及 713或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。系統的引導RNA可為單引導RNA或雙引導RNA。在一些實施方式中，引導RNA包括sgRNA，該sgRNA包括SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在某些實施方式中，在所述方法中使用的一或更多RNA序列(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、tracrRNA 抗重複子、sgRNA、或dgRNA等)包括本文所揭露的一或更多不同的化學修飾。
系統的RGN可為無核酸酶活性的RGN、具有切口酶活性、或者可為融合多肽。在一些實施方式中，融合多肽包括鹼基編輯多肽，例如，胞嘧啶去胺酶或腺嘌呤去胺酶。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物和方法的去胺酶包括SEQ ID NO：542、544和592-707的多肽的任一者所示的去胺酶。在一些實施方式中，可用於此類本發明揭露的組成物和方法的去胺酶包括與SEQ ID NO：542、544及592-707的多肽的任一者具有至少85%、90%、95%或97%序列一致性的去胺酶。在一些實施方式中，融合多肽包括SEQ ID NO：550-591的多肽的任一者所示的鹼基編輯器。在一些實施方式中，融合多肽包括與SEQ ID NO：550-591的多肽的任一者具有至少85%、90%、95%或97%序列一致性的鹼基編輯器。在一些實施方式中，RGN融合蛋白包括先導編輯多肽，例如反轉錄酶。在一些實施方式中，RGN融合蛋白包括多肽，該多肽徵募功能性核酸修復複合物成員，例如核苷酸切除修復(NER)或轉錄偶合核苷酸切除修復(TC-NER)途徑(Wei等人, 2015,
PNAS USA112(27)：E3495-504；Troelstra等人, 1992,
Cell71：939-953；Marnef等人, 2017,
J Mol Biol429(9)：1277-1288)的成員，如2020年1月27日提出的美國臨時申請案No. 62/966,203所述，其全部內容透過引用併入。在實施方式中，RGN融合蛋白包括CSB (van den Boom等人, 2004,
J Cell Biol166(1)：27-36；van Gool等人, 1997,
EMBO J16(19)：5955-65；其一個例子如SEQ ID NO：285所示)，其為TC-NER(核苷酸切除修復)路徑的成員且在加入其他成員中產生功用。在另外的實施方式中，RGN融合蛋白包括CSB的活性域，例如，包括SEQ ID NO：285的胺基酸殘基356-394的CSB的酸性域(Teng等人, 2018,
Nat Commun9(1)：4115)。
在特定實施方式中，RGN及/或引導RNA對於該RGN及/或引導RNA (或編碼RGN的至少一者的多核苷酸)被引入到的細胞或胚胎為異源的。
在其中該方法包括遞送編碼RGN多肽的多核苷酸的一些實施方式中，細胞或胚胎可接著在RGN多肽被表現的條件下培養。在實施方式中，該方法包括使標的核酸分子與RGN核糖核蛋白複合物接觸。該RGN核糖核蛋白複合物可包括無核酸酶活性或具有切口酶活性的RGN。在實施方式中，核糖核蛋白複合物的RGN為包括鹼基編輯多肽的融合多肽。在實施方式中，核糖核蛋白複合物的RGN是包括先導編輯多肽的融合多肽。在實施方式中，該方法包括將RGN核糖核蛋白複合物引入包括標的核酸分子的細胞或胚胎中。RGN核糖核蛋白複合物可為已從生物樣本中被純化、重組產生並隨後純化、或如本文所描述的體外組裝的複合物。在其中與標的核酸分子或細胞、胞器或胚胎接觸的RGN核糖核蛋白複合物已經在體外被組裝的實施方式中，該方法可進一步包括該複合物在與該標的核酸分子、細胞或胚胎接觸之前的體外組裝。可使用本領域已知的任何方法(例如電穿孔)將純化的或體外組裝的RGN核糖核蛋白複合物引入細胞、胞器或胚胎內。
在遞送至或接觸標的核酸分子或包括標的核酸分子的細胞、胞器或胚胎時，引導RNA引導RGN以序列專一性方式與標的核酸分子中的標的序列結合。於其中RGN具有核酸酶活性的那些實施方式中，RGN多肽在結合時切割標的序列。標的序列隨後可經由例如非同源末端連接或用所提供的供體多核苷酸進行同源介導修復之類的內源修復機制而被修飾。
測量RGN多肽與標的序列的結合的方法為本領域已知的、且包括染色質免疫沉澱測定法、凝膠遷移位移測定、DNA下拉測定、報導子測定(reporter assay)、微量盤捕獲及檢測測定。同樣地，測量包括標的序列的標的核酸分子的切割或修飾的方法為本領域已知的、且包括體外或體內切割測定法，其中在有或沒有適當標記物(例如，放射性同位素、螢光物質)附接至標的序列以方便檢測降解產物的情況下，使用PCR、定序或凝膠電泳來確認切割。或者，可使用切口觸發的指數擴增反應(NTEXPAR)測定法(參見，例如，Zhang等人(2016)
Chem. Sci.7：4951-4957)。可使用Surveyor測定法來評估體內切割(Guschin等人 (2010)
Methods Mol Biol649：247-256)。
在一些實施方式中，方法涉及使用與超過一個引導RNA錯合的單一類型RGN。該超過一個引導RNA可靶向單一基因的不同區域、或者可靶向多個基因。
在其中未提供供體多核苷酸的那些實施方式中，可藉由非同源末端連接(NHEJ)修復過程來修復由RGN多肽引入的雙股斷裂。由於NHEJ的易錯性質，雙股斷裂的修復可導致對標的序列的突變。在某些實施方式中，關於標的核酸分子的「突變」是指核酸分子的核苷酸序列的變化，其可為一或更多核苷酸的缺失、插入或取代或其組合。標的核酸分子的突變包括標的序列，該標的序列可導致改變的蛋白質產物的表現或編碼序列的不活化。
在其中存在供體多核苷酸的那些實施方式中，在修復所引入的雙股斷裂的過程中，供體多核苷酸中的供體序列可被整合至標的核苷酸序列中或與標的核苷酸序列交換，導致外源供體序列的引入。因此，供體多核苷酸包括期望被引入所關注的標的序列中的供體序列。在實施方式中，供體序列改變原始標的核苷酸序列，使得新整合的供體序列將不被該RGN辨識及切割。供體序列的整合可藉由在供體多核苷酸中包括毗鄰序列來增強，該毗鄰序列與標的核苷酸序列兩側的序列具有基本的序列一致性、本文中被稱為「同源臂」，以允許同源引導的修復過程。在實施方式中，同源臂具有至少50個鹼基對、至少100個鹼基對及多達2000個鹼基對或更多個鹼基對的長度、且與其在該標的核苷酸序列內的對應序列具有至少90%、至少95%或更高序列同源性。
於其中RGN多肽引入雙股交錯斷裂的那些實施方式中，供體多核苷酸可包括側翼為相容突出部的供體序列，以允許在雙股斷裂的修復期間藉由非同源修復過程將供體序列直接連接至包括突出部的經切割的標的核苷酸序列。
於其中該方法涉及使用為切口酶(亦即，僅能夠切割雙股多核苷酸中的單股)的RGN的那些實施方式中，該方法可包括引入靶向相同或重疊的標的序列並切割該多核苷酸的不同股的二個RGN切口酶。例如，可將僅切割雙股多核苷酸的正(+)股的RGN切口酶與僅切割雙股多核苷酸的負(-)股的第二RGN切口酶一起引入。
在一些實施方式中，提供一種用於結合標的核苷酸序列並檢測該標的序列的方法，其中該方法包括將可用於本發明所揭露的組成物和方法的至少一引導RNA、以及至少一RGN多肽或編碼該至少一RGN多肽的多核苷酸引入細胞或胚胎中、表現該RGN多肽(如果編碼序列被引入)，其中該RGN多肽為無核酸酶活性的RGN且進一步包括可檢測標記，並且該方法進一步包括檢測該可檢測標記。該可檢測標記可與該RGN融合為融合蛋白(例如，螢光蛋白)、或者可為與RGN多肽接合或被併入RGN多肽中、可以用視覺或藉由其他方式檢測的小分子。
本文亦提供用於在標的序列的調控下調控包括標的序列或基因的所關注的目標基因的表現的方法。該方法包括將可用於本發明所揭露的組成物和方法的至少一引導RNA、以及至少一RGN多肽或編碼該至少一RGN多肽的多核苷酸引入細胞、胞器或胚胎中、表現RGN多肽(如果編碼序列被引入)，其中RGN多肽為無核酸酶活性的RGN。在實施方式中，無核酸酶活性的RGN為包括如本文所描述的表現調節子域(亦即，表觀遺傳修飾域、轉錄活化域、或轉錄抑制子域)的融合蛋白。
本揭露內容還提供用於結合及/或修飾包括標的序列的所關注標的核酸分子的方法。該方法包括遞送一系統至該標的序列或包括該標的序列的細胞、胞器或胚胎，該系統包括至少一引導RNA、以及至少一融合多肽或編碼該融合多肽的多核苷酸，該至少一融合多肽包括本揭露內容的RGN及鹼基編輯多肽(例如，胞嘧啶去胺酶或腺嘌呤去胺酶)。
在其中使用包括RGN和鹼基編輯多肽的融合多肽的一些實施方式中，融合蛋白至標的序列的結合導致與標的序列相鄰的一或多核苷酸的修飾。與被去胺酶修飾的標的序列相鄰的核鹼基可以是從標的序列的5'或 3'端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個鹼基對。
本領域中具有通常知識者將理解，本發明揭露的任何方法可用於靶向單一標的序列或多個標的序列。因此，這些方法包括將單一RGN多肽與可用於本發明所揭露的組成物和方法的多個不同的引導RNA組合地使用，該引導RNA可靶向單一基因及/或多個基因內的多個不同序列。例如，APG07433.1 RGN與適當的引導RNA一起使用，該引導RNA包括選自SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382和399-401的crRNA以及選自SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295和383的tracrRNA，以修飾 TRAC 基因座。本文亦包括其中與多個不同的RGN多肽組合地引入多個不同的引導RNA的方法。這些引導RNA及引導RNA/RGN多肽系統可靶向單一基因及/或多個基因內的多個不同序列。
本文亦提供的是一種提高切割及/或修飾包括標的序列的核酸分子的效率的方法。在一些實施方式中，方法包括將本文所述的RGN系統或RNP複合物遞送至標的序列或至包括標的序列的細胞。RGN系統或RNP複合物包括crRNA、tracrRNA及/或gRNA，其包括本文所述的化學修飾，使得與藉由包括將參考RGN系統或RNP複合物遞送至相同標的核酸分子的方法的標的核酸分子的切割或修飾相比，標的核酸分子的切割或修飾以更高的效率發生。在一些實施方式中，參考RGN系統或RNP複合物包括了不包括本文所述的任何BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA、gRNA或crRNA。在一些實施方式中，提高的效率包括鹼基編輯或先導編輯的提高的效率。
在一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率增加2倍至100倍、或2倍至80倍、或2倍至5倍。在一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率增加15倍至30倍。在一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施方式中，切割及/或修飾標的序列的效率是透過測量標的序列或包括標的序列的細胞的百分比來評估，該細胞包括標的序列或由標的序列編碼的多肽的改變的表現。在一些實施方式中，藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜法(LC/MS)、質譜法或其組合來測量該表現。在一些實施方式中，標的序列編碼細胞表面表現的蛋白質，並且透過測量(如藉由流式細胞分析技術測量的)包括細胞表面表現的蛋白質的減少的細胞的百分比來評估切割及/或修飾標的序列的效率。在一些實施方式中，細胞表面表現的蛋白質是T細胞受體α (TRAC)。在一些實施方式中，細胞表面表現的蛋白質是β2-微球蛋白(B2M)。
在本文所描述的不同方法的某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在一個莖環的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在多個莖環的一或更多莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾不在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內但不在第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖內的一或更多核苷酸及第二莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾存在於第一莖內的一或更多核苷酸上，但沒有化學修飾存在於莖環的第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的第一莖及第二莖內的所有核苷酸上。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾存在於第一莖內的所有核苷酸上，但沒有化學修飾存在於莖環的第二莖內。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖的一個莖內的所有核苷酸上。
在某些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖的每一者內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的兩個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中的三個莖內。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中三個莖的每一者內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的多個莖中三個莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的每一莖內的一或更多核苷酸上。在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的莖環的所有莖內的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，引導RNA中的莖環(該莖環在其一或更多莖中包括化學修飾)是透過crRNA和tracrRNA的雜交而形成的。在一些實施方式中，引導RNA中的莖環(該莖環在其一或更多莖中包括化學修飾)是透過crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子的雜交而形成的。
在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的一或更多個莖內和在尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一和第二莖內。在一些實施方式中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內並且沒有化學修飾在第二莖內，並且化學修飾存在於本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖、第二莖和第三莖內。在一些實施方式中，化學修飾在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)的尾部內以及由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內。
在一些實施方式中，化學修飾不存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，化學修飾在一或更多個莖內，但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內和尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內和尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一和第二莖內和尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖、第二莖及第三莖內和在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內和在尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內(且不在任何其他莖內)和尾部內、但不存在於環、突起或泡泡中。
在一些實施方式中，化學修飾存在於本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中的環、突起或泡泡中。在某些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的分子或區域(例如，crRNA、crRNA重複子、間隔子、tracrRNA、抗重複子或引導RNA)中，化學修飾在一或更多個莖內和尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖和第二莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的第一莖、第二莖及第三莖內和尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。在一些實施方式中，在本揭露內容的gRNA (例如，sgRNA或dgRNA)中，化學修飾在由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子形成的莖環的所有莖內和在尾部內、且存在於環、突起或泡泡中。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子中。在一些實施方式中，至少一BNA修飾(例如，LNA及/或cEt)在crRNA重複子的第一莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的末端3’核苷酸以及末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第二莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的末端3’核苷酸和末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一莖和第二莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖和第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖和第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖和第二莖的末端5’核苷酸和末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖和第二莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第一莖和第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第一莖內，且第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在crRNA重複子的第三莖內。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的第三莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的末端5’核苷酸和末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的至少兩個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，crRNA重複子的每一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，僅有crRNA重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，藉由crRNA重複子和抗重複子雜交形成的莖環中的環、突起或泡泡內的crRNA重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，crRNA重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾、但與包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。在一些實施方式中，缺乏BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的crRNA重複子與在由crRNA重複子和抗重複子雜交形成的莖環的第一莖中包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA的抗重複子雜交。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子內。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5'核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第二莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的末端5’核苷酸及末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖的所有核苷酸均包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖和第二莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖和第二莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖和第二莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖和第二莖的末端5’核苷酸和末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖和第二莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第一莖和第二莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖內，且第二莖內沒有化學修飾。
在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第三莖內。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的末端5’核苷酸和末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的第三莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子的所有莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端5’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的末端5’核苷酸和末端3’核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、或至少九個連續核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，抗重複子的每一莖的所有核苷酸包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，僅有tracrRNA的抗重複子的第一莖包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，藉由抗重複子與crRNA重複子的雜交形成的莖環中的環、突起或泡泡內的抗重複子的核苷酸不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，tracrRNA的抗重複子不包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾、或其組合。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾以及在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其5’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從5’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從5’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從5’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。
在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾、或其組合。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾以及在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾。在一些實施方式中，在其3’區域處包括至少一化學修飾的本揭露內容的RNA分子包括在從3’端的第一個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第二個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第三個核苷酸位置處的化學修飾、在從3’端的第四個核苷酸位置處的化學修飾、以及在從3’端的第五個核苷酸位置處的化學修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的剩餘核苷酸包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在本揭露內容的tracrRNA的3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt +PS修飾，以及crRNA不包括任何進一步的化學修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及crRNA的3’區域包括cEt修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及crRNA的3’區域包括LNA修飾。
在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域及3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。在一些實施方式中，在crRNA的5’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾以及crRNA的3’區域的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括2’-O-Me修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括BNA修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括MS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中剩餘核苷酸的的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括BNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’和3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt +PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括LNA修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。在一些實施方式中，crRNA在5’區域中的三個末端核苷酸處包括cEt+PS修飾，並且在3’區域中的三個末端核苷酸處包括LNA+PS修飾，並且進一步在crRNA重複子的第一莖中的剩餘核苷酸的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個處包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5'區域和3'區域處的三個末端核苷酸均經化學修飾， 以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸經化學修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸經化學修飾，以及其中crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸和tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸經化學修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，以及其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸以及tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的所有核苷酸包括2’-O-Me修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，gRNA是包括藉由多核苷酸(例如，四核苷酸)連接子連接的crRNA和tracrRNA的sgRNA，其中sgRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾，其中crRNA的crRNA重複子的第一莖中的三個末端3’核苷酸包括MS修飾，以及其中tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括cEt修飾。
在一些實施方式中，本揭露內容的方法使用工程化crRNA重複子，其中工程化crRNA重複子的第一莖可在3'區域包括來自天然前驅crRNA的取代或添加的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的取代或添加的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中3'區域中G或C的含量為至少60%、至少80%、或100%。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中該3’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖在3’區域進一步包括MS、BNA或BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，本揭露內容的方法使用工程化抗重複子，其中工程化抗重複子的第一莖在5'區域包括來自天天然前驅物前驅crRNA的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5'區域包括富含GC的核苷酸序列。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5'區域包括富含GC的核苷酸序列，其中5'區域中G或C的含量為至少60%、至少80%、或100%。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖在5’區域包括富含GC的核苷酸序列，其中該5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖進一步包括所有核苷酸處的BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，本揭露內容的方法使用工程化crRNA重複子，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，該工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處2至6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處2個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處4個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同crRNA重複子，工程化crRNA重複子包括crRNA重複子的3'區域處6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化crRNA重複子的第一莖中的核苷酸進一步包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，工程化crRNA的5’區域和3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是cEt修飾。
在一些實施方式中，本揭露內容的方法使用工程化抗重複子，相較於工程化之前的相同抗重複子，工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或更多個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處2至6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處2個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處4個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，相較於工程化之前的相同抗重複子，RGN系統的工程化抗重複子包括抗重複子的5'區域處6個核苷酸的添加或取代。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖包括約11個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的總長度。在一些實施方式中，工程化抗重複子的第一莖的所有核苷酸進一步包括BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，工程化tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，BNA修飾包括2′,4′ BNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA修飾是cEt修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括MS修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括BNA修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括LNA修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括cEt修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括BNA+PS修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括LNA+PS修飾。在一些實施方式中，工程化tracrRNA的尾部處的3’三個末端核苷酸包括cEt+PS修飾。
IX. 工程化引導 RNA 的方法
本揭露內容提供工程化gRNA的方法，包括：a)提供包括crRNA和tracrRNA的gRNA，其中該crRNA包括crRNA重複子且該tracrRNA包括抗重複子；以及b)添加或取代crRNA重複子中的一或更多核苷酸以及抗重複子中的一或更多核苷酸，其中在重複子中添加或取代的一或更多核苷酸以及在抗重複子中添加或取代的一或更多核苷酸能夠彼此雜交，其中所添加或取代的一或更多核苷酸包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C，並且其中工程化 gRNA與步驟a)中提供的gRNA相比具有增加的編輯效率。在一些實施方式中，引導RNA包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是工程化引導RNA，該工程化引導RNA包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。
在一些實施方式中，一或更多核苷酸包括1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 個核苷酸。在一些實施方式中，gRNA是dgRNA。在一些實施方式中，gRNA是sgRNA。
在crRNA重複子及/或抗重複子中添加或取代的核苷酸序列可以來自天然前驅crRNA或富含GC的序列。在一些實施方式中，添加或取代的一或更多核苷酸的G或C含量為至少51%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%，至少80 %、至少85%、至少90%、至少95%或100%。
在一些實施方式中，添加或取代的核苷酸在crRNA重複子的3'區域和抗重複子的 5' 區域中。工程化的gRNA 的抗重複子的5’區域及/或crRNA重複子的3’區域可包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
該方法可包括以另一個較短或較長的核苷酸序列取代或替換crRNA重複子的第一莖的3'區域處的1、2、3、4或5個核苷酸，以形成工程化crRNA重複子。在一些實施方式中，該方法包括在crRNA重複子的3'區域處添加或取代1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。
該方法可包括以另一個較短或較長的核苷酸序列取代或替換抗重複子的第一莖的5'區域處的1、2、3、4或5個核苷酸，以形成工程化tracrRNA。在一些實施方式中，該方法包括在抗重複子的5'區域處添加或取代1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。
該方法可進一步包括以至少一化學修飾來修飾工程化的gRNA中的至少一核苷酸，該至少一化學修飾選自下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及BNA修飾。本申請案前面部分中揭露的化學修飾的類型和位置均可用於本文所述的各種方法中。
在一些實施方式中，至少一化學修飾是BNA修飾。該BNA修飾是2′,4′ BNA修飾。2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA 是LNA修飾。在一些實施方式中，2′,4′ BNA是cEt修飾。
至少一化學修飾可在crRNA、tracrRNA或兩者中。在一些實施方式中，至少一化學修飾是在crRNA重複子中。在一些實施方式中，至少一化學修飾是在crRNA重複子的第一莖中。在一些實施方式中，至少一化學修飾是在tracrRNA的尾部中。
至少一化學修飾可在抗重複子中。在一些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中。在某些實施方式中，至少一化學修飾是在抗重複子的第一莖中的1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 個核苷酸上。至少一化學修飾可以在抗重複子的第一莖中的連續核苷酸上。至少一化學修飾可以在抗重複子的第一莖中的交替核苷酸上。「交替核苷酸」是指具有至少一化學修飾的核苷酸序列中的每隔一個核苷酸。在一些實施方式中，至少一化學修飾在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上。
在一些實施方式中，至少一化學修飾在crRNA重複子以及抗重複子中。在一些實施方式中，至少一化學修飾在crRNA重複子的第一莖以及抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，至少一化學修飾在crRNA重複子、抗重複子以及tracrRNA的尾部中。在一些實施方式中，至少一化學修飾在crRNA重複子的第一莖、抗重複子的第一莖以及tracrRNA的尾部中。
在一些實施方式中，至少一化學修飾在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上且在 tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸上。至少一化學修飾可在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上且在crRNA重複子的第一莖中的至少一核苷酸上。至少一化學修飾在抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上、在tracrRNA的尾部的3’區域處的三個末端核苷酸上、以及在crRNA重複子的第一莖的3’區域處的至少一核苷酸上。
在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化crRNA的5’區域和3’區域處的MS修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化crRNA的5’區域和3’區域處的BNA修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化crRNA的5’區域和3’區域處的BNA+PS修飾。
在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上的BNA修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的抗重複子的第一莖中的所有核苷酸上的BNA修飾以及在crRNA重複子的第一莖的3’區域處的MS修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的MS修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的BNA修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的LNA修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的cEt修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的BNA+PS修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的LNA+PS修飾。在一些實施方式中，至少一化學修飾包括工程化tracrRNA的尾部的cEt+PS修飾。
與步驟a)中提供的未經工程化的gRNA相比，工程化的gRNA具有提高的編輯效率。在一些實施方式中，與未經工程化的gRNA相比，工程化的gRNA的編輯效率增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100% 或更高。在一些實施方式中，與未經工程化的gRNA相比，工程化的gRNA的編輯效率增加至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍，至少80倍、至少85倍、至少90倍、至少95倍、至少100倍或更多。在一些實施方式中，提高的效率包括鹼基編輯或先導編輯的提高的效率。可以使用本領域普通技術人員已知的方法來確定編輯效率，該方法包括但不限於第VIII部分中描述的那些方法。
與未經工程化的gRNA相比，工程化的gRNA可以表現出更高的穩定性。在一些實施方式中，工程化的gRNA的穩定性可以透過測量工程化的gRNA的crRNA重複子和抗重複子之間形成的異源二聚體的解鏈溫度(Tm)來測量。在一些實施方式中，核酸分子的Tm取決於GC含量、核酸分子的長度和核酸分子的序列。核酸分子的Tm測定可以如下文中所述而執行：Cromwell et al. (2018) Nature Communications 9:1448。
本揭露內容也提供透過本文所述方法產生的工程化的gRNA、RGN系統、RNP複合物或包括此類工程化的gRNA的醫藥組成物、以及使用這些來結合、切割及/或修飾標的多核苷酸的方法。
X. 標的多核苷酸
本揭露內容提供修飾真核細胞中的包括標的序列的標的多核苷酸或修飾真核細胞中的標的多核苷酸的表現的方法，其可為體內、離體或體外的。該方法包括使用包括至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的引導RNA。在一些實施方式中，該至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾是在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的工程化引導RNA。在一些實施方式中，該方法包括從人類或非人類動物或植物(包括微藻類)中取樣細胞或細胞群、以及修飾該細胞或該些細胞。培養可以在離體的任何階段發生。甚至可以將該細胞或該些細胞重新引入人類或非類人動物或植物(包括微藻類)中。
使用自然變異性，植物育種者結合了大多數有用的基因以獲得所需的品質，例如產量、品質、均勻性、耐寒性以及抗害蟲性。這些所需的品質亦包括生長、日長偏好、溫度要求、花或生殖發育的起始日期、脂肪酸含量、抗蟲性、抗病性、線蟲抗性、真菌抗性、除草劑抗性、對各種環境因素(包括乾旱、熱、濕、冷、風及包括高鹽度的不利土壤條件)的耐受性。這些有用基因的來源包括天然或外來品種、原生種(heirloom variety)、野生植物近緣種、及例如以誘變劑處置植物材料的誘導突變。使用本揭露內容，為植物育種者提供誘導突變的新工具。據此，本領域中具有通常知識者可以利用本揭露內容以誘導有用基因的增加，比先前的誘變劑更精確，且因此加速並改良植物育種計劃。
本揭露內容的RGN系統的標的多核苷酸可為對真核細胞是內源或外源的任何多核苷酸。例如，該標的多核苷酸可為存在於真核細胞的細胞核中的多核苷酸。在一些實施方式中，標的多核苷酸可為編碼基因產物(例如，蛋白質)的序列或非編碼序列(例如，調節性多核苷酸或垃圾DNA (junk DNA))。不希望受理論的束縛，標的序列的非標的股應該與PAM(前間隔序列鄰近模體)相鄰，亦即，該RGN辨識的短序列。該PAM的精確序列和長度要求隨所使用的RGN而不同，但PAM通常是與前間隔序列(亦即，標的序列)相鄰的2-5個鹼基對序列。
本揭露內容的RGN系統的標的多核苷酸可包括許多疾病關聯基因及多核苷酸以及與傳訊生化路徑關聯的基因及多核苷酸。標的多核苷酸的範例包括與傳訊生化路徑關聯的序列，例如，與傳訊生化路徑關聯的基因或多核苷酸。標的多核苷酸的範例包括與疾病關聯的基因或多核苷酸。「與疾病關聯的」基因或多核苷酸指：與非疾病控制的組織或細胞相較下，在從患病組織取得的細胞中以異常水準或以異常形式產出轉錄或轉譯產物的任何基因或多核苷酸。其可為一種變得以異常高水準表現的基因；其可為一種變得以異常低水準表現的基因，其中改變的表現與疾病的發生及/或進展相關。與疾病關聯的基因亦指具有一或多個突變或基因變異的基因，具有突變或基因變異的基因為直接造成疾病病因(例如，因果突變)、或為與造成疾病病因(例如，因果突變)的基因呈連鎖不平衡。轉錄或轉譯的產物可為已知的或未知的、且還可能處於正常或異常水準。
可以使用本發明揭露的方法和組成物靶向的疾病相關基因的非限制性實例可從全球資訊網上可得的約翰霍普金斯大學(馬裡蘭州巴爾的摩)麥考斯克–納森斯遺傳醫學研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)以及國家醫學圖書館(National Library of Medicine(Bethesda, Md.))國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) (馬里蘭州貝塞斯達)獲得。
在一些實施方式中，該方法包括使包括標的序列的標的核酸分子與本揭露內容的RGN接觸，其中標的核酸分子以有效量並在適合編輯標的序列(例如，切割、修飾表現、鹼基編輯、先導編輯)的條件下與RGN接觸。在某些實施方式中，該方法包括使包括標的序列的標的核酸分子與(a)本揭露內容的RGN接觸；以及(b)將(a)的RGN靶向標的序列的gRNA接觸；其中標的核酸分子以有效量並在適合編輯標的序列的條件下與RGN和gRNA接觸。在一些實施方式中，該標的序列包括與疾病或失調關聯的序列，並且其中標的序列的編輯導致與疾病或失調無關聯的序列。在一些實施方式中，該標的序列位於農作物的對偶基因中，其中特定對偶基因與導致農藝價值較低的植物的性狀相關聯。標的序列的編輯導致與增加植物農藝價值的性狀相關聯的對偶基因。
在一些實施方式中，與該疾病或失調關聯的標的序列編碼蛋白質，且標的序列的編輯將終止密碼子引入與疾病或失調關聯的序列中，導致編碼的蛋白質的截斷。在一些實施方式中，接觸是在易患有、患有或被診斷患有疾病或失調的個體內進行。在一些實施方式中，疾病或失調為與基因體中的點突變或單鹼基突變關聯的疾病。在一些實施方式中，該疾病為遺傳性疾病、癌症、代謝疾病或溶體儲積症。
XI. 包括多核苷酸基因修飾的細胞
本文提供包括標的核酸分子的細胞和生物，該標的核酸分子已使用本文所述的RGN、crRNA、tracrRNA及/或引導RNA介導的過程進行修飾，例如其已修飾為包括至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是工程化引導RNA，該工程化引導RNA包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。在一些實施方式中，本文揭露的RGN為了活性需要tracrRNA。在一些實施方式中，本文揭露的RGN包括第II型RGN。在一些實施方式中，RGN包括SEQ ID NO：1、69、93及252或其活性變異體或片段的任一者所示的胺基酸序列。在一些實施方式中，RGN包括與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括crRNA重複子，該crRNA重複子包括SEQ ID NO：39、300、304、308、312、320、324、328、332、336、344、348、352、356、360、384-393、397、465、469、473、477、481、508、512及 516或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括crRNA，該crRNA包括SEQ ID NO：4-9、42-44、73-75、97-99、292、293、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、325-327、329-331、333-335、337-339、345-347、349-351、353-355、357-359、361-363、380-382、399-401、466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515、517-519及708或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，引導RNA包括tracrRNA，該tracrRNA包括SEQ ID NO：10、12、51-53、80、81、102、103、294、295、364-367、369-373、375-379、383、499-501、504、505、534、535、537、709-711及 713或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。系統的引導RNA可為單引導RNA或雙引導RNA。在實施方式中，引導RNA包括sgRNA，該sgRNA包括SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407或其活性變異體或片段的任一者所示的核苷酸序列。
修飾的細胞可以是真核的(例如，哺乳動物、植物、昆蟲、鳥類細胞)或原核的。原核細胞可以來自包括但不限於古細菌和細菌(例如芽孢桿菌屬、克留氏菌屬、鏈黴菌屬、根瘤菌屬、大腸桿菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、志賀桿菌屬、弧菌屬、耶氏桿菌、黴漿菌屬、農桿菌屬、乳桿菌屬)的物種。真核細胞可包括來自動物(例如，哺乳動物、人類、昆蟲、魚、鳥和爬行動物)、植物、真菌、阿米巴原蟲、藻類和酵母的細胞。在一些實施方式中，透過本發明揭露的方法修飾的細胞包括造血來源的細胞，例如免疫系統的細胞，包括但不限於B細胞、T細胞、自然殺手(NK)細胞、富潛能幹細胞、誘導的富潛能幹細胞、嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。在一些實施方式中，透過本發明揭露的方法修飾的細胞包括初代細胞。在某些實施方式中，初代細胞包括初代T細胞。
也提供了包括至少一標的序列的胚胎，該標的序列已透過利用本文所述的RGN、crRNA、tracrRNA及/或引導RNA的方法進行修飾。基因修飾的細胞、生物、胞器和胚胎對於修飾的標的序列可以是異型結合的或同型結合的。
在一些實施方式中，細胞、生物、胞器或胚胎的染色體修飾可導致改變的表現(上調或下調)、不活化或改變的蛋白質產物或整合序列的表現。在突變導致基因不活化或非功能性蛋白質產物表現的情況下，遺傳修飾的細胞、生物、胞器或胚胎被稱為「剔除」。剔除表型可以是缺失突變(即，至少一個核苷酸的缺失)、插入突變(即，至少一個核苷酸的插入)或無意義突變(即，至少一個核苷酸的取代從而引入終止密碼子)的結果。在一些實施方式中，染色體修飾導致由於標的序列中的一或多突變而缺乏或減少的蛋白質產物的表現上調。
在一些實施方式中，本揭露內容的RGN系統包括RGN和鹼基編輯多肽(例如，去胺酶)的融合或RGN和先導編輯多肽(例如，反轉錄酶)的融合，且由於這些RGN系統而引入的突變產生變異蛋白質產物。表現的變異蛋白產物可具有至少一胺基酸取代及/或至少一胺基酸的添加或缺失。與野生型蛋白質相比，變異蛋白質產物可以表現出改變的特徵或活性，包括但不限於改變的酶活性或基質特異性。在一些實施方式中，由於這些RGN系統而引入的突變產生改變的蛋白質表現模式。作為非限制性範例，控制蛋白質產物表現的調節區域中的突變可導致蛋白質產物的過度表現或下調或改變的組織或時間表現模式。在一些實施方式中，由於這些RGN系統而引入的突變導致基因表現的減少或消除。
已被修飾的細胞可以被引入生物中。在自體細胞移植的情況下，這些細胞可能源自於相同生物(例如人類)，其中細胞以離體方法被修飾。或者，在異體細胞移植的情況下，細胞源自於相同物種內的另一個生物(例如另一個人)。
XII. 醫藥組成物
提供醫藥組成物，該醫藥組成物包括：包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)及其活性變異體及片段的crRNA；包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)及其活性變異體及片段的tracrRNA；包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt) 及其活性變異體及片段的gRNA；包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)及其活性變異體及片段的RGN多肽或編碼該RGN多肽的多核苷酸；本文所述的RGN系統，包括含有至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的crRNAs、tracrRNA及/或gRNA；或包括crRNA、tracrRNA、gRNA、RGN多肽或RGN編碼多核苷酸、或RGN系統的任一者的細胞；以及藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA是單引導RNA。在一些實施方式中，包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA是雙引導RNA。在一些實施方式中，至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾是在tracrRNA的抗重複子的第一莖中。在一些實施方式中，引導RNA是工程化引導RNA，該工程化引導RNA包括tracrRNA的抗重複子的第一莖中的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾。
醫藥組成物為被用於防止、降低程度、治癒或治療標的病症或疾病的組成物，該組成物包括活性成分(亦即，crRNA、tracrRNA、gRNA、RGN多肽、RGN編碼多核苷酸、RGN系統、或包括這些中任一者的細胞)及藥學上可接受的載體。
如本文中使用的，「藥學上可接受的載體」指不對生物體引起明顯刺激且不消除該活性成分(亦即，crRNA、tracrRNA、gRNA、RGN多肽、RGN編碼多核苷酸、RGN系統、或包括這些中任一者的細胞)的活性及特性的材料。載體必須具有足夠高的純度及足夠低的毒性，以使其適合投予正被治療的個體。該載體可為惰性的，或其可具有醫藥效益。在一些實施方式中，藥學上可接受的載體包括合適對人或其他脊椎動物投予的一或更多相容固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質。在一些實施方式中，藥學上可接受的載體不為天然發生的。在一些實施方式中，在自然界中未發現該藥學上可接受的載體與該活性成分在一起。
發明揭露的方法中使用的藥學組成物可由提供合適轉移、遞送、耐受性等等的合適載體、賦形劑及其他藥劑調配。眾多適當調配物為本領域中的通常知識者所知。參見，例如，Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)。合適的調配物例如包括：粉劑、糊劑、膏劑、膠凍、蠟、油類、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)的囊泡(例如，LIPOFECTIN囊泡)、脂質奈米粒子、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水油乳及水油乳、乳液卡波蠟(emulsions carbowax) (各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠(semi-solid gel)及含有卡波蠟的半固體混合物。經口或非口服使用的藥學組成物可被製備為適於適應活性成分劑量的單位劑量的劑型。這些單位劑量的劑型例如包括錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。
在其中包括或以包括至少一BNA修飾(例如，LNA及/或cEt)的crRNA、包括至少一BNA修飾(例如，LNA及/或cEt)的tracrRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA、RGN多肽、及/或RGN編碼多核苷酸修飾的細胞被投予個體的實施方式中，這些細胞與藥學上可接受的載體一起作為懸浮劑被投予。本領域中具有通常知識者將理解到將被用於細胞組成物中的藥學上可接受的載體將不包括實質上干擾將被遞送至該個體的細胞的生存力的量的緩衝液、化合物、冷凍保存劑、保存劑、或其他製劑。包括細胞的調配物可包括例如允許細胞膜保持完整性的滲透壓緩衝液、且可選地包括在投予時保持細胞生存力或增強植入的營養素。這樣的調配物及懸浮劑為本領域中具有通常知識者所知、及/或使用例行實驗可被調適成與本文揭露的細胞一起使用。
細胞組成物亦可被乳化為或呈現為脂質體組成物，前提條件為該乳化程序不會不利地影響細胞生存力。該細胞及任何其他活性成分可以與藥學上可接受且與該活性成分相容的賦形劑、且以適合在本文揭露的治療方法中使用的量混合。
細胞組成物中包括的額外製劑可包括其內的組成的藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽包括例如與例如鹽酸或磷酸的無機酸、或與例如醋酸、酒石酸、苯乙醇酸等等的有機酸形成的酸加成鹽(與多肽的自由胺基基團形成)。與自由羧基基團形成的鹽亦可例如衍生自例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物的無機鹼、及例如異丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、組胺酸、普魯卡因等等的有機鹼。
生理學上可耐受且藥學上可接受的載體為本領域已知的。範例性液體載體為無菌水溶液，其除了活性成分及水外不含有其他材料，或其含有例如在生理pH值的磷酸鈉、生理食鹽水或二者的緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝食鹽水)。又此外，水性載體可含有一種以上的緩衝鹽以及例如氯化鈉及氯化鉀、葡萄糖、聚乙二醇及其他溶質之類的鹽。液體組成物亦可含有除了水及排除水的液相。此類額外液相的範例為甘油、例如棉花籽油之類的植物油及水油乳液。在特定失調或病症的治療中有效的細胞組成物中使用的活性化合物的量可取決於該失調或病症的本質、且可由標準臨床技術確定。
包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的crRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的tracrRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA、RGN多肽、及/或RGN編碼多核苷酸可取決於投予的特定方式及劑型而以例如載體、溶劑、穩定劑、佐劑、稀釋劑等的藥學上可接受的賦形劑調配。在一些實施方式中，這些藥學組成物被調配以達成生理學上相容的pH；且依賴於調配物及投予途徑，其範圍為約3的pH至約11的pH、約pH 3至約pH 7。在一些實施方式中，可將pH調整至約pH 5.0至約pH 8的範圍。在一些實施方式中，組成物可包括本文描述的治療有效量的至少一化合物，連同一或更多藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，組成物包括本文描述的化合物的組合、或包括治療或防止細菌生長中有用的第二活性成分(例如而不限於，抗菌或抗微生物藥劑)、或包括本揭露內容的試劑的組合。
例如，適合的賦形劑包括載體分子，該載體分子包括大型、緩慢代謝的巨分子，例如，蛋白質、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物及不活化的病毒粒子。其他範例性賦形劑可包括抗氧化劑(例如而不限於，抗壞血酸)、螯合劑(例如而不限於，EDTA)、碳水化合物(例如而不限於，糊精、羥烷基纖維素及羥烷基甲基纖維素)、硬脂酸、液體(例如而不限於，油、水、食鹽水、甘油及乙醇)、潤濕或乳化劑、pH緩衝物質等等。
在一些實施方式中，調配物以單位劑量或多劑量容器(例如，密封安瓿及小瓶(vial))被提供、且可被儲存於凍乾(冷凍乾燥)條件下，需要在立即使用之前，添加無菌液體載體(例如，食鹽水、注射用水、半液體泡沫或凝膠)。即時注射溶液及懸浮劑可自前面描述種類的無菌粉劑、顆粒及錠劑製備。在一些實施方式中，活性成分溶解於緩衝液體溶液中，其以單位劑量或多劑量容器被冷凍、且之後被解凍用於注射或被保持/穩定在冷藏下直到使用。
一或多個治療劑可被包括於受控的釋放系統中。為了延長藥物的作用，常常期望從皮下、鞘內腔、或肌肉內注射以減緩藥物的吸收。這可藉由使用具有水難溶性的結晶或非結晶材料的液體懸浮劑來完成。然後，藥物的吸收速率取決於其溶解速率，而其溶解速率又可取決於結晶大小及結晶的形式。或者，非經口投予藥物的延遲吸收藉由該藥物溶解或懸浮於油媒介中被完成。在一些實施方式中，長期持續釋放的植入劑的使用特別適合用於慢性病症的治療。長期持續釋放的植入劑為本領域中具有通常知識者所知。
在一些實施方式中，本揭露內容的組成物包括：a) 包括如本文描述的至少一BNA (例如，LNA及/或cEt)修飾的tracrRNA；b)能夠結合至tracrRNA以形成引導RNA (gRNA)的crRNA；以及 c) RGN或編碼RGN的核酸分子，其中gRNA能夠與該RGN形成複合物。在一些實施方式中，本揭露內容的組成物包括：a) 包括如本文描述的至少一BNA (例如LNA及/或cEt)修飾的gRNA；以及b) RGN或編碼RGN的核酸分子，其中gRNA能夠與RGN形成複合物。在一些實施方式中，本揭露內容的組成物包括：a) 包括如本文描述的至少一化學修飾的crRNA；b) 能夠結合至crRNA以形成gRNA的tracrRNA；以及 c) RGN或編碼RGN的核酸分子，其中gRNA能夠與該RGN形成複合物。
XIII. 治療方法
本文提供為了在需要其的個體中治療疾病的方法。該方法包括將有效量的包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的 tracrRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的crRNA、本發明揭露的RGN或編碼該RGN的多核苷酸、本發明揭露的RGN系統、或由這些組成物中任一者修飾的或包括這些組成物中任一者的細胞投予需要其的個體。
在一些實施方式中，治療包括藉由將包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的 tracrRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的crRNA、RGN或編碼該RGN的多核苷酸、及/或RGN系統投予需要其的個體的體內基因編輯。在一些實施方式中，治療包括離體基因編輯，其中細胞是以包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的 tracrRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的gRNA、包括至少一BNA修飾(例如LNA及/或cEt)的crRNA、RGN或編碼該RGN的多核苷酸、及/或RGN系統離體基因修飾、且接著將經修飾細胞投予至個體。在一些實施方式中，經基因修飾細胞源自之後被投予該修飾細胞的個體，且所移植細胞在本文中被稱為自體的。在一些實施方式中，經基因修飾細胞源自與被投予該經修飾細胞的個體(亦即，接受者)同種內的不同個體(亦即，供體)，且所移植的細胞在本文中被稱為異體的。於本文描述的一些範例中，細胞可在投予至需要其的個體之前於培養中被擴增。
在一些實施方式中，要以本發明揭露的組成物治療的疾病為可用免疫療法(例如，用嵌合抗原受體(CAR)T細胞)治療的疾病。此類疾病包括但不限於癌症。
在一些實施方式中，本發明揭露的組成物治療的疾病與遺傳缺陷有關，例如胞溶體貯積症或代謝疾病，例如I型糖尿病。因此，在一些實施方式中，本揭露內容的組成物是用於編輯導致疾病或失調或此類疾病或失調的症狀的基因體序列。例如，標的核鹼基的去胺作用導致遺傳缺陷的修正，從而修復基因產物功能的喪失。
在一些實施方式中，要以本發明揭露的組成物治療的疾病與因果突變相關聯。如本文中使用的，「因果突變」指對個體中的疾病或失調的嚴重程度或存在有貢獻的基因體中的特定核苷酸、多個核苷酸或核苷酸序列。因果突變的修正引致由疾病或失調導致的至少一個症狀改善。在一些實施方式中，因果突變的修正引致由疾病或失調導致的至少一個症狀改善。在一些實施方式中，因果突變與本文揭露的RGN所辨識的PAM位點相鄰。與因果突變關聯的疾病的非限制性範例包括囊腫纖維化、尼曼-匹克(Niemann-Pick)病、及剪接位點消除引起的疾病。疾病關聯基因及突變的額外非限制性範例可從在全球資訊網上取得的約翰•霍普金斯大學(麻省巴爾的摩)麥庫席克–內森斯遺傳醫學研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.))和美國國家醫學圖書館(馬里蘭州貝賽斯達)的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.) )取得。
在一些實施方式中，本文提供的方法用於將不活化點突變引入編碼與疾病或失調相關的基因產物的基因或對偶基因中。例如，在一些實施方式中，本文提供的方法採用RGN融合蛋白以將不活化點突變引入致癌基因中(例如，在增殖性疾病的治療中)。在一些實施方式中，不活化突變可以在編碼序列中產生過早終止密碼子，這導致截斷的基因產物(例如缺乏全長蛋白質功能的截斷蛋白質)的表現。在一些實施方式中，本文提供的方法的目的是經由基因體編輯來恢復功能異常的基因的功能。RGN融合蛋白可以在體外驗證基於基因編輯的人類療法，例如透過修正人類細胞培養物中與疾病相關的突變。本領域技術人員應理解，包括RGN和鹼基編輯多肽或包括RGN和先導編輯多肽的RGN融合蛋白可用於修正任何單點突變。
如本文所使用的，「治療」或「處理」、或「緩和」或「改善」可被互換地使用。這些術語指用於獲得有益或期望結果的方法，有益結果或期望結果包括但不限於治療性益處及/或預防性益處。藉由治療性益處意味著對治療中的一或更多疾病、病症或症狀中的任何治療相關改善或對治療中的一或更多疾病、病症或症狀上的效果。對於預防性益處，組成物可被投予處於特定疾病、病症或症狀的發展風險中的個體、或被投予報告疾病的一或更多生理症狀的個體，即使該疾病、病症或症狀可能尚未呈現徵兆。在實施方式中，可以在發展出一或更多症狀之後及/或在診斷出疾病之後投予治療。在實施方式中，可以在沒有症狀的情況下投予治療，例如以預防或延遲症狀的發作或抑制疾病的發作或進展。例如，可以在症狀出現之前對易感個體投予治療(例如，鑒於症狀病史及/或鑒於遺傳或其他易感因素)。症狀緩解後也可以繼續治療，例如，以預防或延遲其預防或復發。
術語「有效量」或「治療有效量」指足以達到有益或期望結果的藥劑量。治療有效量可取決於下列中的一或更多者而變化：被治療的個體及疾病病症、個體的重量及年齡、疾病病症的嚴重性、投予方式等，本領域中具有通常知識者可容易地對此做出確定。特定劑量可取決於下列中的一或更多者而變化：所選的特定藥劑、要遵循的給藥方案、是否與其他化合物組合地投予、投予時機及其被運載的遞送系統。
術語「投予」指藉由導致所引入的活性成分至少部分地定位於期望位點(例如，受傷或修復的位點)處的方法或途徑以將活性成分置於個體內，使得產生一或多個期望效用。在實施方式中，本揭露內容提供包括遞送本文所述的RGN多肽、核酸分子、核糖核蛋白複合物、載體、醫藥組成物及/或gRNA的任一者的方法。在實施方式中，本揭露內容也提供透過此類方法產生的細胞，以及包括此類細胞或由此類細胞產生的生物(例如動物或植物)。在實施方式中，將與引導序列組合(並且可選性地與其複合)的本文所述的RGN多肽及/或核酸分子遞送至細胞。
在其中細胞被投予的實施方式中，可藉由導致遞送至個體中的期望位置的任何適當途徑投予該細胞，其中至少一部分所移植的細胞或該細胞的組成維持存活。投予至個體後的細胞的存活期可短至幾小時(例如，二十四小時)、至幾天、至長至若干年、甚或患者的生命期，亦即，長期植入。
在實施方式中，投予包括透過病毒遞送投予。包括編碼本文所揭露的RGN多肽、核糖核蛋白複合物或載體的核酸的病毒載體可以被直接投予患者(即體內)，或者它們可以用於體外治療細胞，並且修飾的細胞可以可選地被投予患者(即離體)。常規的病毒為基礎的系統可包括但不限於用於基因轉移的反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關及單純皰疹病毒載體。透過反轉錄病毒、慢病毒和腺相關病毒基因轉移方法可以整合到宿主基因體中，通常導致插入的轉基因的長期表現。慢病毒載體是能夠轉導或感染非分裂細胞且通常產生高病毒價的反轉錄病毒載體。在較佳瞬時表現的應用中，可以使用基於腺病毒的系統。基於腺病毒的載體能夠在許多細胞類型中具有非常高的轉導效率並且不需要細胞分裂。
在實施方式中，投予包括透過核酸的其他非病毒遞送的投予。範例的非病毒遞送方法包括但不限於RNP複合物、脂轉染、核轉染、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質核酸複合物、裸DNA、人工病毒粒子和的試劑增強攝取。脂轉染被描述於例如美國專利第5,049,386號、第4,946,787號；以及第4,897,355號中，且脂轉染試劑是商業銷售的(例如，Transfectam™和Lipofectin™)。適合多核苷酸的有效受體辨識脂轉染的陽離子和中性脂質包括Feigner、WO1991/17424、WO1991/16024中的那些。遞送可以是至細胞(例如體外或離體投予)或標的組織(例如體內投予)。
投予本文所述醫藥組成物的適當途徑包括但不限於：局部、皮下、經皮、皮內、病灶內、關節內、腹膜內、膀胱內、跨黏膜、牙齦、齒內、耳蝸內、經鼓膜、器官內、硬膜外、鞘內、肌肉內、靜脈內、血管內、骨內、眼周、腫瘤內、腦內及腦室內投予。
在實施方式中，本文所述的醫藥組成物透過注射、吸入(例如氣霧的吸入)、透過導管、透過栓劑或透過植入物投予於個體，所述植入物是多孔的、無孔或凝膠狀材料，包括膜(例如矽橡膠膜)或纖維。在實施方式中，醫藥組成物被配製用於遞送至個體，以例如用於基因編輯。
在實施方式中，醫藥組成物依常規程序配製為適合靜脈或皮下投予個體(例如，人)的組成物。在實施方式中，用於透過注射投予的醫藥組成物是無菌等滲水性緩衝液中的溶液。必要時，藥物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑(例如里格卡因)以減輕注射部位的疼痛。通常，成分被單獨提供或混合在一起，例如，作為在表明活性劑的量的密封容器(如安瓿或小袋)中的乾燥的凍乾粉末或無水濃縮物。當藥物經由輸注投予時，可以用含有無菌藥物級水或鹽水的輸注瓶來分配。當醫藥組成物透過注射投予時，可以提供無菌注射水或鹽水的安瓿，以便可以在投予之前混合成分。
在實施方式中，醫藥組成物可以包含在脂質顆粒或囊泡內，例如脂質體或微晶，其也適合用於非經口投予。
儘管本文提供的醫藥組成物的描述主要涉及適合投予人類的醫藥組成物，但是本領域技術人員應理解，這樣的組成物通常適合投予所有種類的動物或生物。
如本文所使用的，術語「個體」指期望對其進行診斷、治療或療法的任何個體。在一些實施方式中，個體為動物。在一些實施方式中，個體為哺乳動物。在一些實施方式中，個體為人類。
治療效力可由熟練的臨床醫師確定。然而，如果疾病或失調的症候或症狀的任何一個或全部是以有益方式被改變(例如，至少減少10%)、或其他臨床上接受的疾病的症狀或標記被改良或改善，則該治療被認為「有效治療」。亦可藉由個體未發生如藉由住院評估的惡化、或不需要醫學介入(例如，疾病的進展被停止或至少減慢)來測量效力。測量這些指標的方法為本領域中具有通常知識者所知。治療包括：(1)抑制疾病，例如，遏止或減慢症狀的進展；或(2)減緩疾病，例如，引起症狀消退；以及(3)預防或降低症狀發展的可能性。
冠詞「一(a)」和「一(an)」在本文中用於指該冠詞的一或一個以上(亦即，至少一)的語法對象。作為範例，「一多肽」意指一或更多多肽。
說明書中提及的所有出版物及專利申請案表示本揭露內容所屬領域中具有通常知識者的層次。所有出版物及專利申請案藉由引用併入本文，如同每一個單獨出版物或專利申請案被具體且單獨地指示藉由引用而被併入本文。
雖然為了清楚理解的目的已經以說明及範例頗詳細地描述了前述發明，但顯然可在所附實施方式的範圍內實施某些改變及修飾。
非限制性實施方式包括：
1. 一種核酸分子，包括一轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)，其中該tracrRNA包括：
(a) 一抗重複子；
(b) 一尾部；以及
(c) 最接近該尾部的一莖環，
其中該tracrRNA的該抗重複子能夠與一crRNA的一CRISPR RNA (crRNA)重複子雜交以形成一引導RNA (gRNA)，該gRNA包括一莖環，該莖環包括透過該crRNA重複子和該抗重複子的雜交形成的一第一莖及一第二莖，並且其中該tracrRNA包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
2. 實施方式1的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
3. 實施方式1或2的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
4. 實施方式3的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個連續BNA修飾、至少三個連續BNA修飾、至少四個連續BNA修飾、至少五個連續BNA修飾、至少六個連續BNA修飾、至少七個連續BNA修飾、至少八個連續BNA修飾、或至少九個連續BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。
5. 實施方式3或4的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
6. 實施方式1或2的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
7. 實施方式1-6中任一者的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該tracrRNA的一突起內。
8. 實施方式1-7中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
9. 實施方式1-7中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
10. 實施方式1-7中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括 2'-O-甲基3' 硫代磷酸酯(MS)修飾。
11. 實施方式1-10中任一者的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
12. 實施方式11的核酸分子，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
13. 實施方式11或12的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
14. 實施方式11或12的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
15. 實施方式1-14中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 進一步包括至少一其他化學修飾。
16. 實施方式15的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
17. 實施方式15或16的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
18. 實施方式15的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
19. 實施方式15-18中任一者的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
20. 實施方式19的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾。
21. 實施方式20的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及該抗重複子的該第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。
22. 實施方式21的核酸分子，其中該BNA修飾包括LNA修飾。
23. 實施方式21的核酸分子，其中該BNA修飾包括cEt修飾。
24. 實施方式1-23中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
25. 實施方式1-23中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
26. 實施方式1-23中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
27. 實施方式1-23中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括 6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
28. 實施方式1-27中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5’區域包括來自一天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
29. 實施方式28的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5'區域處包括一富含GC的核苷酸序列，其中該5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
30. 實施方式1-29中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA包括60-80 nt、80-100 nt、100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt或超過180 nt的一總長度。
31. 實施方式1-30中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
32. 實施方式31的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
33. 實施方式31或32的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
34. 實施方式31-33中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有一核苷酸序列，該核苷酸序列具有SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者所示序列。
35. 實施方式1-30中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
36. 實施方式35的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
37. 實施方式35或36的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
38. 實施方式35-37中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者所示的該序列。
39. 實施方式1-30中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
40. 實施方式39的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
41. 實施方式39或40的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
42. 實施方式39-41中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者所示的該序列。
43. 實施方式1-30中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
44. 實施方式43的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
45. 實施方式43或44的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
46. 實施方式43-45中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者所示的一核苷酸序列。
47. 實施方式1-46中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA是能夠與一RGN結合的一gRNA的一部分。
48. 實施方式47的核酸分子，其中該RGN是一第II型RGN。
49. 實施方式47或48的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
50. 實施方式49的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
51. 實施方式49或50的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
52. 實施方式49-51中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：1所示的一胺基酸序列。
53. 實施方式47或48的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
54. 實施方式53的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
55. 實施方式53或54的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
56. 實施方式53-55中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：69所示的一胺基酸序列。
57. 實施方式47或48的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
58. 實施方式57的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
59. 實施方式57或58的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
60. 實施方式57-59中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：93所示的一胺基酸序列。
61. 實施方式47或48的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
62. 實施方式61的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
63. 實施方式61或62的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
64. 實施方式61-63中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：252所示的一胺基酸序列。
65. 一種核酸分子，包括一轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)，其中該tracrRNA包括：
(a) 一抗重複子；
(b) 一尾部；以及
(c) 最接近該尾部的一莖環，
其中該tracrRNA的該抗重複子包括一第一莖及一第二莖，並且其中該tracrRNA包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
66. 實施方式65的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
67. 實施方式65或66的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
68. 實施方式67的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個連續BNA修飾、至少三個連續BNA修飾、至少四個連續BNA修飾、至少五個連續BNA修飾、至少六個連續BNA修飾、至少七個連續BNA修飾、至少八個連續BNA修飾、或至少九個連續BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。
69. 實施方式67或68的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
70. 實施方式65或66的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
71. 實施方式65-70中任一者的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該tracrRNA的一突起內。
72. 實施方式65-71中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
73. 實施方式65-71中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
74. 實施方式65-71中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括 2'-O-甲基3' 硫代磷酸酯(MS)修飾。
75. 實施方式65-74中任一者的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
76. 實施方式75的核酸分子，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
77. 實施方式75或76的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
78. 實施方式75或76的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
79. 實施方式65-78中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 進一步包括至少一其他化學修飾。
80. 實施方式79的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
81. 實施方式79或80的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
82. 實施方式79的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
83. 實施方式79-82中任一者的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
84. 實施方式83的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾。
85. 實施方式83的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及該抗重複子的該第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。
86. 實施方式85的核酸分子，其中該BNA修飾包括LNA修飾。
87. 實施方式85的核酸分子，其中該BNA修飾包括cEt修飾。
88. 實施方式65-87中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
89. 實施方式65-87中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
90. 實施方式65-87中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
91. 實施方式65-87中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括 6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
92. 實施方式65-91中任一者的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5’區域包括來自一天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
93. 實施方式92的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5'區域處包括一富含GC的核苷酸序列，其中該5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
94. 實施方式65-93中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA包括60-80 nt、80-100 nt、100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt或超過180 nt的一總長度。
95. 實施方式65-94中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
96. 實施方式95的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
97. 實施方式95或96的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
98. 實施方式95-97中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者所示的該核苷酸序列。
99. 實施方式65-94中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
100. 實施方式99的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
101. 實施方式99或100的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
102. 實施方式99-101中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者所示的核苷酸序列。
103. 實施方式65-94中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及 711中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
104. 實施方式103的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及 711中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
105. 實施方式103或104的核酸分子，其中該tracrRNA 具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及 711中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
106. 實施方式103-105中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有與SEQ ID NO：102、103、及370-373、710、及711中任一者所示的核苷酸序列。
107. 實施方式65-94中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA 具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
108. 實施方式107的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
109. 實施方式107或108的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
110. 實施方式107-109中任一者的核酸分子，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者所示的該核苷酸序列。
111. 實施方式65-110中任一者的核酸分子，其中包括該tracrRNA的一gRNA能夠結合至一RGN。
112. 實施方式111的核酸分子，其中該RGN 是一第II型RGN。
113. 實施方式111或112的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
114. 實施方式113的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
115. 實施方式113或114的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
116. 實施方式113-115中任一者的核酸分子，其中該RGN具有SEQ ID NO：1所示的該胺基酸序列。
117. 實施方式111或112的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
118. 實施方式117的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
119. 實施方式117或118的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
120. 實施方式117-119中任一者的核酸分子，其中該RGN具有SEQ ID NO：69所示的該胺基酸序列。
121. 實施方式111或112的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
122. 實施方式121的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
123. 實施方式121或122的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
124. 實施方式121-123中任一者的核酸分子，其中該RGN具有SEQ ID NO：93所示的該胺基酸序列。
125. 實施方式111或112的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
126. 實施方式125的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
127. 實施方式125或126的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
128. 實施方式125-127中任一者的核酸分子，其中該RGN具有SEQ ID NO：252所示的該胺基酸序列。
129. 一種包括一CRISPR RNA (crRNA)以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)的引導RNA (gRNA)，
其中該crRNA包括一間隔子以及一crRNA重複子，
其中該tracrRNA包括一尾部以及一抗重複子，
其中該抗重複子能夠與該crRNA重複子雜交以形成包括一莖環的該gRNA，該莖環包括透過該crRNA重複子和該抗重複子雜交形成的一第一莖及一第二莖，
以及其中該crRNA以及該tracrRNA的至少其中之一包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
130. 實施方式129的gRNA，其中該gRNA是一單引導RNA (sgRNA)。
131. 實施方式130的gRNA，其中該sgRNA包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度。
132. 實施方式129的gRNA，其中該gRNA是一雙引導RNA (dgRNA)。
133. 實施方式129-132中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子內。
134. 實施方式129-133中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
135. 實施方式129-134中任一者的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
136. 實施方式129-135中任一者的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
137. 實施方式129-134中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該crRNA重複子的該第一莖中的至少兩個連續BNA修飾。
138. 實施方式129-133中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該crRNA重複子的該第二莖內。
139. 實施方式129-138中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
140. 實施方式139的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
141. 實施方式140的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。
142. 實施方式140或141的gRNA，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
143. 實施方式139的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
144. 實施方式129-143中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該gRNA的一突起內。
145. 實施方式129-144中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該tracrRNA的該尾部內。
146. 實施方式145的gRNA，其中該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
147. 實施方式145的gRNA，其中該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
148. 實施方式129-147中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域中的至少三個末端核苷酸以及該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
149. 實施方式129-147中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖中的所有核苷酸缺乏化學修飾，並且該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
150. 實施方式129-149中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該間隔子內。
151. 實施方式150的gRNA，其中在該間隔子的該5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
152. 實施方式150的gRNA，其中在該間隔子的該5'區域處的該三個末端核苷酸包括包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
153. 實施方式129-152中任一者的gRNA，其中該間隔子的長度為18-30個核苷酸。
154. 實施方式129-153中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
155. 實施方式154的gRNA，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
156. 實施方式154或155的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
157. 實施方式154或155的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
158. 實施方式129-157中任一者的gRNA，其中該gRNA 進一步包括至少一其他修飾。
159. 實施方式158的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA內。
160. 實施方式158或159的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域或該3’區域內。
161. 實施方式158或159的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域及該3’區域內。
162. 實施方式158-161中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該crRNA重複子內。
163. 實施方式158-162中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
164. 實施方式158-163中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該間隔子內。
165. 實施方式158的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA內。
166. 實施方式165的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
167. 實施方式165或166的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
168. 實施方式158的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
169. 實施方式158-168中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
170. 實施方式169的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。
171. 實施方式169或170的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，並且該crRNA重複子的該第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
172. 實施方式129-171中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
173. 實施方式129-171中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
174. 實施方式129-171中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
175. 實施方式129-171中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括 6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
176. 實施方式129-171中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括來自一天然前驅物 CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
177. 實施方式176的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括一富含GC的核苷酸序列，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
178. 實施方式169的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
179. 實施方式129-178中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：385或與SEQ ID NO：385 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：386或與SEQ ID NO：386 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387 有1或2個不同核苷酸者；或
(f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397 有1或2個不同核苷酸者。
180. 實施方式179的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
181. 實施方式179的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
182. 實施方式179的gRNA，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：39、384-387及397中任一者所示的一核苷酸序列。
183. 實施方式179-182中任一者的gRNA，其中該間隔子具有下列所示的該序列：
(a) SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16有1至5個不同核苷酸者；
或
(b) SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17有1至5個不同核苷酸者。
184. 實施方式183的gRNA，其中該間隔子具有 SEQ ID NO：16或17所示的該序列。
185. 實施方式179-184中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
186. 實施方式185的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
187. 實施方式185或186的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
188. 實施方式185-187中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者所示的該序列。
189. 實施方式179-188中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
190. 實施方式189的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
191. 實施方式189或190的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
192. 實施方式189-191中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713的任一者所示的一核苷酸序列。
193. 實施方式129-178中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348 有1或2個不同核苷酸者；
(h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352 有1或2個不同核苷酸者；
(i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356 有1或2個不同核苷酸者；
(j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360 有1或2個不同核苷酸者；
(k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388 有1或2個不同核苷酸者；
(l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389 有1或2個不同核苷酸者；或
(m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390 有1或2個不同核苷酸者。
194. 實施方式193的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸者；
(k) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：388有2個不同核苷酸者；
(l) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：389有2個不同核苷酸者；或
(m) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：390有2個不同核苷酸者。
195. 實施方式193的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
196. 實施方式193的gRNA，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：300、304、308、312、320、344、348、352、356、360及388-390中任一者所示的一核苷酸序列。
197. 實施方式193-196中任一者的gRNA，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：91所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：91有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：92所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：92有1至5個不同核苷酸者。
198. 實施方式197的gRNA，其中該間隔子具有SEQ ID NO：91或92所示的該序列。
199. 實施方式193-198中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
200. 實施方式199的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
201. 實施方式199或200的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
202. 實施方式199-201中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者所示的該序列。
203. 實施方式193-202中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
204. 實施方式203的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
205. 實施方式203或204的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
206. 實施方式203-205中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者所示的一核苷酸序列。
207. 實施方式129-178中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392 有1或2個不同核苷酸者；以及
(g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393 有1或2個不同核苷酸者。
208. 實施方式207的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
209. 實施方式207的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
210. 實施方式207的gRNA，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：324、328、332、336及 391-393中任一者所示的一核苷酸序列。
211. 實施方式207-210中任一者的gRNA，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：113所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：113有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：114所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：114有1至5個不同核苷酸者，其中關於 SEQ ID NO：114。
212. 實施方式211的gRNA，其中該間隔子具有SEQ ID NO：113或114所示的該序列。
213. 實施方式207-212中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
214. 實施方式213的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
215. 實施方式213或214的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
216. 實施方式213-215中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者所示的該序列。
217. 實施方式213-216中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
218. 實施方式217的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
219. 實施方式217或218的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
220. 實施方式217-219中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者所示的一核苷酸序列。
221. 實施方式129-178中任一者的gRNA，其中該 crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512 有1或2個不同核苷酸者；以及
(h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516 有1或2個不同核苷酸者。
222. 實施方式221的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
223. 實施方式221的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
224. 實施方式221的gRNA，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：465、469、473、477、481、508、512及516中任一者所示的一核苷酸序列。
225. 實施方式221-224中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
226. 實施方式225的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
227. 實施方式225或226的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
228. 實施方式225-227中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者所示的一核苷酸序列。
229. 實施方式225-228中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
230. 實施方式229的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
231. 實施方式229或230的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
232. 實施方式229-231中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者所示的一核苷酸序列。
233. 實施方式129-232中任一者的gRNA，其中該 crRNA以及該tracrRNA藉由該crRNA重複子的3’末端核苷酸及該抗重複子的5’末端核苷酸之間的一連接子連接。
234. 實施方式233的gRNA，其中該連接子包括一疊氮官能基或一炔官能基。
235. 實施方式233的gRNA，其中該連接子是一多核苷酸。
236. 實施方式235的gRNA，其中該連接子具有AAAG、GAAA、ACUU或CAAAGG所示的一核苷酸序列。
237. 實施方式235或236的gRNA，其中該連接子具有AAAG所示的一核苷酸序列。
238. 實施方式235-237中任一者的gRNA，其中該gRNA是包括該crRNA以及該tracrRNA的一sgRNA，其中該sgRNA包括一主鏈以及該間隔子，以及其中該sgRNA的該主鏈包括該crRNA重複子、該連接子及該tracrRNA。
239. 實施方式238的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
240. 實施方式239的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
241. 實施方式239或240的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
242. 實施方式239-241中任一者的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者所示的一核苷酸序列。
243. 實施方式238的gRNA，其中該sgRNA具有SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的該核苷酸序列。
244. 實施方式129-243中任一者的gRNA，其中該gRNA 能夠結合至一RGN。
245. 實施方式244的gRNA，其中該RGN 是一第II型RGN。
246. 實施方式244或245的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
247. 實施方式246的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
248. 實施方式246或247的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
249. 實施方式246-248中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：1所示的一胺基酸序列。
250. 實施方式244或245的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
251. 實施方式250的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
252. 實施方式250或251的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
253. 實施方式250-252中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：69所示的一胺基酸序列。
254. 實施方式244或245的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
255. 實施方式254的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
256. 實施方式254或255的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
257. 實施方式254-256中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：93所示的一胺基酸序列。
258. 實施方式244或245的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
259. 實施方式258的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
260. 實施方式258或259的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
261. 實施方式258-260中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：252所示的一胺基酸序列。
262. 實施方式129-261中任一者的gRNA，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
263. 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA)以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)，
其中該crRNA包括：i) 一間隔子；以及 ii) 包括一第一莖及一第二莖的一crRNA重複子，
其中該tracrRNA包括：i) 一尾部；以及 ii) 包括一第一莖及一第二莖的一抗重複子，
以及其中該crRNA以及該tracrRNA的至少其中之一包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
264. 實施方式263的gRNA，其中該gRNA是一單引導RNA (sgRNA)。
265. 實施方式264的gRNA，其中該sgRNA包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度。
266. 實施方式263的gRNA，其中該gRNA是一雙引導RNA (dgRNA)。
267. 實施方式263-266中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子內。
268. 實施方式263-267中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
269. 實施方式263-268中任一者的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
270. 實施方式263-268中任一者的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
271. 實施方式263-270中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該crRNA重複子的該第一莖中的至少兩個連續BNA修飾。
272. 實施方式263-271中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該crRNA重複子的該第二莖內。
273. 實施方式263-272中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
274. 實施方式273的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
275. 實施方式274的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二個、三個、四個、五個、六個或七個BNA修飾。
276. 實施方式274或275的gRNA，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
277. 實施方式273的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
278. 實施方式263-277中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該gRNA的一突起內。
279. 實施方式263-278中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該tracrRNA的該尾部內。
280. 實施方式279的gRNA，其中該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
281. 實施方式279的gRNA，其中該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
282. 實施方式263-281中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域中的至少三個末端核苷酸以及該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
283. 實施方式263-281中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖中的所有核苷酸缺乏化學修飾，並且該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
284. 實施方式263-283中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該間隔子內。
285. 實施方式284的gRNA，其中該間隔子的該5’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
286. 實施方式284的gRNA，其中在該間隔子的該5'區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
287. 實施方式263-286中任一者的gRNA，其中該間隔子的長度為18-30個核苷酸。
288. 實施方式263-287中任一者的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
289. 實施方式288的gRNA，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
290. 實施方式288或289的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
291. 實施方式288或289的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
292. 實施方式263-291中任一者的gRNA，其中該gRNA 進一步包括至少一其他修飾。
293. 實施方式292的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA內。
294. 實施方式292或293的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域或該3’區域內。
295. 實施方式292或293的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域及該3’區域內。
296. 實施方式292-295中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該crRNA重複子內。
297. 實施方式292-296中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
298. 實施方式292-297中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該間隔子內。
299. 實施方式292的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA內。
300. 實施方式299的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
301. 實施方式299或300的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
302. 實施方式292的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
303. 實施方式292-302中任一者的gRNA，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
304. 實施方式303的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。
305. 實施方式303或304的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，並且該crRNA重複子的該第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
306. 實施方式263-305中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
307. 實施方式263-305中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
308. 實施方式263-305中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
309. 實施方式263-305中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括 6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
310. 實施方式263-305中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括來自一天然前驅物 CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
311. 實施方式310的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括一富含GC的核苷酸序列，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3’區域處或該抗重複子的該第一莖在該5’區域處包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
312. 實施方式303的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
313. 實施方式263-312中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：385或與SEQ ID NO：385 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：386或與SEQ ID NO：386 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387 有1或2個不同核苷酸者；或
(f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397 有1或2個不同核苷酸者。
314. 實施方式313的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
315. 實施方式313的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
316. 實施方式313的gRNA，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：39、384-387及397中任一者所示的一核苷酸序列。
317. 實施方式313-316中任一者的gRNA，其中該間隔子具有下列所示的該序列：
(a) SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16有1至5個不同核苷酸者；
或
(b) SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17有1至5個不同核苷酸者。
318. 實施方式317的gRNA，其中該間隔子具有 SEQ ID NO：16或17所示的該序列。
319. 實施方式313-318中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
320. 實施方式319的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少90列一致性的一核苷酸序列。
321. 實施方式319或320的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
322. 實施方式319-321中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者所示的該序列。
323. 實施方式313-322中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
324. 實施方式323的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
325. 實施方式323或324的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
326. 實施方式323-325中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713的任一者所示的一核苷酸序列。
327. 實施方式263-312中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348 有1或2個不同核苷酸者；
(h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352 有1或2個不同核苷酸者；
(i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356 有1或2個不同核苷酸者；
(j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360 有1或2個不同核苷酸者；
(k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388 有1或2個不同核苷酸者；
(l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389 有1或2個不同核苷酸者；或
(m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390 有1或2個不同核苷酸者。
328. 實施方式327的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸者；
(k) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：388有2個不同核苷酸者；
(l) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：389有2個不同核苷酸者；或
(m) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：390有2個不同核苷酸者。
329. 實施方式327的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
330. 實施方式327的gRNA，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：300、304、308、312、320、344、348、352、356、360及388-390中任一者所示的一核苷酸序列。
331. 實施方式327-330中任一者的gRNA，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：91所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：91有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：92所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：92有1至5個不同核苷酸者。
332. 實施方式331的gRNA，其中該間隔子具有SEQ ID NO：91或92所示的該序列。
333. 實施方式327-332中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
334. 實施方式333的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
335. 實施方式333或334的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
336. 實施方式333-335中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者所示的該序列。
337. 實施方式327-336中任一者的gRNA，其中該 tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
338. 實施方式337的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
339. 實施方式337或338的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
340. 實施方式337-339中任一者的gRNA，其中該 tracrRNA 具有SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者所示的一核苷酸序列。
341. 實施方式263-312中任一者的gRNA，其中該 crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392 有1或2個不同核苷酸者；以及
(g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393 有1或2個不同核苷酸者。
342. 實施方式341的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
343. 實施方式341的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
344. 實施方式341的gRNA，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：324、328、332、336及 391-393中任一者所示的一核苷酸序列。
345. 實施方式341-344中任一者的gRNA，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：113所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：113有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：114所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：114有1至5個不同核苷酸者，其中關於 SEQ ID NO：114。
346. 實施方式345的gRNA，其中該間隔子具有SEQ ID NO：113或114所示的該序列。
347. 實施方式341-346中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
348. 實施方式347的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
349. 實施方式347或348的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
350. 實施方式347-349中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者所示的該序列。
351. 實施方式347-350中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
352. 實施方式351的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
353. 實施方式351或352的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
354. 實施方式351-353中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者所示的一核苷酸序列。
355. 實施方式263-312中任一者的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512 有1或2個不同核苷酸者；以及
(h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516 有1或2個不同核苷酸者。
356. 實施方式355的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
357. 實施方式355的gRNA，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
358. 實施方式355的gRNA，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：465、469、473、477、481、508、512及516中任一者所示的一核苷酸序列。
359. 實施方式355-358中任一者的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
360. 實施方式359的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
361. 實施方式359或360的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
362. 實施方式359-361中任一者的gRNA，其中該crRNA具有SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者所示的一核苷酸序列。
363. 實施方式359-362中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
364. 實施方式363的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
365. 實施方式363或364的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
366. 實施方式363-365中任一者的gRNA，其中該tracrRNA具有SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者所示的一核苷酸序列。
367. 實施方式263-366中任一者的gRNA，其中該 crRNA以及該tracrRNA 藉由該crRNA重複子的3’末端核苷酸及該抗重複子的5’末端核苷酸之間的一連接子連接。
368. 實施方式367的gRNA，其中該連接子包括一疊氮官能基或一炔官能基。
369. 實施方式367的gRNA，其中該連接子是一多核苷酸。
370. 實施方式369的gRNA，其中該連接子具有AAAG、GAAA、ACUU或CAAAGG所示的一核苷酸序列。
371. 實施方式369或370的gRNA，其中該連接子具有AAAG所示的一核苷酸序列。
372. 實施方式369-371中任一者的gRNA，其中該gRNA是包括該crRNA以及該tracrRNA的一sgRNA，其中該sgRNA包括一主鏈以及該間隔子，以及其中該sgRNA的該主鏈包括該crRNA重複子、該連接子及該tracrRNA。
373. 實施方式372的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
374. 實施方式373的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
375. 實施方式373或374的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
376. 實施方式373-375中任一者的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者所示的一核苷酸序列。
377. 實施方式372的gRNA，其中該sgRNA具有SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的該核苷酸序列。
378. 實施方式263-377中任一者的gRNA，其中該gRNA 能夠結合至一RGN。
379. 實施方式378的gRNA，其中該RGN 是一第II型RGN。
380. 實施方式378或379的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
381. 實施方式380的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
382. 實施方式380或381的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
383. 實施方式380-382中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：1所示的一胺基酸序列。
384. 實施方式378或379的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
385. 實施方式384的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
386. 實施方式384或385的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
387. 實施方式384-386中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：69所示的一胺基酸序列。
388. 實施方式378或379的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
389. 實施方式388的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
390. 實施方式388或389的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
391. 實施方式388-390中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：93所示的一胺基酸序列。
392. 實施方式378或379的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
393. 實施方式392的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
394. 實施方式392或393的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
395. 實施方式392-394中任一者的gRNA，其中該RGN包括SEQ ID NO：252所示的一胺基酸序列。
396. 實施方式263-395中任一者的gRNA，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
397. 一種包括一CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，該crRNA包括：
(a) 一間隔子；以及
(b) crRNA重複子，
其中該crRNA重複子能夠與一tracrRNA的一抗重複子雜交以形成包括一莖環的一引導RNA (gRNA)，該莖環包括透過該crRNA重複子和該抗重複子雜交形成的一第一莖及一第二莖，以及其中該crRNA包括至少一化學修飾，其中該至少一化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及一BNA修飾；以及其中該至少一化學修飾在該crRNA的該5' 區域或3' 區域處的三個末端核苷酸內。
398. 實施方式397的核酸分子，其中該至少一化學修飾是一BNA修飾。
399. 實施方式398的核酸分子，其中該BNA修飾是一 2′,4′ BNA修飾。
400. 實施方式399的核酸分子，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
401. 實施方式399或400的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
402. 實施方式399或400的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
403. 實施方式397-402中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3' 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
404. 實施方式397-402中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3' 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
405. 實施方式397-402中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’ 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
406. 實施方式397-402中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’ 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
407. 實施方式397-402中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
408. 實施方式397的核酸分子，其中該至少一化學修飾是一MS修飾。
409. 實施方式408的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的該三個末端核苷酸包括MS修飾。
410. 實施方式408或409的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的該三個末端核苷酸包括MS修飾，並且該crRNA重複子的該第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
411. 實施方式397-410中任一者的核酸分子，其中該間隔子的長度為18-30個核苷酸。
412. 實施方式397-411中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
413. 實施方式397-411中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
414. 實施方式397-411中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
415. 實施方式397-411中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
416. 實施方式397-411中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3’區域包括來自一天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
417. 實施方式416的核酸分子，其中該crRNA的該3’區域包括一富含GC的核苷酸序列，並且其中該3’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
418. 實施方式397-417中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：385或與SEQ ID NO：385 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：386或與SEQ ID NO：386 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387 有1或2個不同核苷酸者；或
(f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397 有1或2個不同核苷酸者。
419. 實施方式418的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
420. 實施方式418的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
421. 實施方式418的核酸分子，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：39及384-387中任一者所示的一核苷酸序列。
422. 實施方式418-421中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16有1至5個不同核苷酸者；
或
(b) SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17有1至5個不同核苷酸者。
423. 實施方式422的核酸分子，其中該間隔子具有SEQ ID NO：16或17所示的該序列。
424. 實施方式418-423中任一者的核酸分子，其中該crRNA包括與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
425. 實施方式424的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
426. 實施方式424或425的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
427. 實施方式424-426中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者所示的一核苷酸序列。
428. 實施方式397-417中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348 有1或2個不同核苷酸者；
(h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352 有1或2個不同核苷酸者；
(i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356 有1或2個不同核苷酸者；
(j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360 有1或2個不同核苷酸者；
(k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388 有1或2個不同核苷酸者；
(l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389 有1或2個不同核苷酸者；或
(m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390 有1或2個不同核苷酸者。
429. 實施方式428的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
430. 實施方式428的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
431. 實施方式428的核酸分子，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：300、304、308、312、320、344、348、352、356、360及388-390中任一者所示的一核苷酸序列。
432. 實施方式428-431中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：91所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：91有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：92所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：92有1至5個不同核苷酸者，其中參考SEQ ID NO：92。
433. 實施方式432的核酸分子，其中該間隔子具有SEQ ID NO：91或92所示的該序列。
434. 實施方式428-433中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
435. 實施方式434的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
436. 實施方式434或435的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
437. 實施方式428-436中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者所示的該序列。
438. 實施方式397-417中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392 有1或2個不同核苷酸者；以及
(g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393 有1或2個不同核苷酸者。
439. 實施方式438的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
440. 實施方式438的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
441. 實施方式438的核酸分子，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：324、328、332、336及 391-393中任一者所示的一核苷酸序列。
442. 實施方式438-441中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：113所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：113有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：114所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：114有1至5個不同核苷酸者。
443. 實施方式442的核酸分子，其中該間隔子具有SEQ ID NO：113或114所示的該序列。
444. 實施方式438-443中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
445. 實施方式444的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
446. 實施方式444或445的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
447. 實施方式438-446中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有 SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者所示的該核苷酸序列。
448. 實施方式397-417中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512 有1或2個不同核苷酸者；以及
(h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516 有1或2個不同核苷酸者。
449. 實施方式448的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
450. 實施方式448的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
451. 實施方式448的核酸分子，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：465、469、473、477、481、508、512及516中任一者所示的一核苷酸序列。
452. 實施方式448-451中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
453. 實施方式452的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
454. 實施方式452或453的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
455. 實施方式452-454中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者所示的一核苷酸序列。
456. 實施方式397-455中任一者的核酸分子，其中該gRNA能夠結合至一RNA引導的核酸酶(RGN)。
457. 實施方式456的核酸分子，其中該RGN是一第II型RGN。
458. 實施方式456或457的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
459. 實施方式458的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
460. 實施方式458或459的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
461. 實施方式458-460中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：1所示的一胺基酸序列。
462. 實施方式456或457的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
463. 實施方式462的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
464. 實施方式462或463的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
465. 實施方式462-464中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：69所示的一胺基酸序列。
466. 實施方式456或457的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
467. 實施方式466的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
468. 實施方式466或467的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
469. 實施方式466-468中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：93所示的一胺基酸序列。
470. 實施方式456或457的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
471. 實施方式470的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
472. 實施方式470或471的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
473. 實施方式470-472中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：252所示的一胺基酸序列。
474. 一種包括一CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，該crRNA包括：
(a) 一間隔子；以及
(b) 包括一第一莖及一第二莖的一crRNA重複子，
其中該crRNA包括至少一化學修飾，其中該至少一化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及一BNA修飾；以及其中該至少一化學修飾在該crRNA的該5' 區域或3' 區域處的三個末端核苷酸內。
475. 實施方式474的核酸分子，其中該至少一化學修飾是一BNA修飾。
476. 實施方式475的核酸分子，其中該BNA修飾是一2′,4′ BNA修飾。
477. 實施方式476的核酸分子，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA
NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
478. 實施方式476或477的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
479. 實施方式476或477的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
480. 實施方式474-479中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3' 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
481. 實施方式474-479中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3' 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
482. 實施方式474-479中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’ 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
483. 實施方式474-479中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’ 區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
484. 實施方式474-479中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
485. 實施方式474的核酸分子，其中該至少一化學修飾是一MS修飾。
486. 實施方式485的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的該三個末端核苷酸包括MS修飾。
487. 實施方式485或486的核酸分子，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的該三個末端核苷酸包括MS修飾，並且該crRNA重複子的該第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
488. 實施方式474-487中任一者的核酸分子，其中該間隔子的長度為18-30個核苷酸。
489. 實施方式474-488中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
490. 實施方式474-488中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
491. 實施方式474-488中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
492. 實施方式474-488中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子的該第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
493. 實施方式474-488中任一者的核酸分子，其中該crRNA的該3’區域包括來自一天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
494. 實施方式493的核酸分子，其中該crRNA的該3’區域包括一富含GC的核苷酸序列，且其中該3’區域包括至少2、至少3、至少4或至少5個G或C。
495. 實施方式474-494中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：385或與SEQ ID NO：385 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：386或與SEQ ID NO：386 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387 有1或2個不同核苷酸者；或
(f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397 有1或2個不同核苷酸者。
496. 實施方式495的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
497. 實施方式495的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：39有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：384有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：385有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：386有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：387有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(f) 與SEQ ID NO：397有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
498. 實施方式495的核酸分子，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：39及384-387中任一者所示的一核苷酸序列。
499. 實施方式495-498中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16有1至5個不同核苷酸者；
或
(b) SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17有1至5個不同核苷酸者。
500. 實施方式499的核酸分子，其中該間隔子具有 SEQ ID NO：16或17所示的該序列。
501. 實施方式495-500中任一者的核酸分子，其中該crRNA包括與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
502. 實施方式501的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
503. 實施方式501或502的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
504. 實施方式501-503中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者所示的該核苷酸序列。
505. 實施方式474-494中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348 有1或2個不同核苷酸者；
(h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352 有1或2個不同核苷酸者；
(i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356 有1或2個不同核苷酸者；
(j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360 有1或2個不同核苷酸者；
(k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388 有1或2個不同核苷酸者；
(l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389 有1或2個不同核苷酸者；或
(m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390 有1或2個不同核苷酸者。
506. 實施方式505的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有2個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有2個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
507. 實施方式505的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：300有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：304有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：308有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：312有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：320有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f ) 與SEQ ID NO：344有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：348有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(h) 與SEQ ID NO：352有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(i) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：356有1個不同核苷酸者；
(j) 一核苷酸序列或與SEQ ID NO：360有1個不同核苷酸者；
(k) 與SEQ ID NO：388有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(l) 與SEQ ID NO：389有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(m) 與SEQ ID NO：390有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
508. 實施方式505的核酸分子，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：300、304、308、312、320、344、348、352、356、360及388-390中任一者所示的一核苷酸序列。
509. 實施方式505-508中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：91所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：91有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：92所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：92有1至5個不同核苷酸者，其中參考SEQ ID NO：92。
510. 實施方式509的核酸分子，其中該間隔子具有SEQ ID NO：91或92所示的該序列。
511. 實施方式505-510中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
512. 實施方式511的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
513. 實施方式511或512的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
514. 實施方式505-513中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者所示的該序列。
515. 實施方式474-494中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392 有1或2個不同核苷酸者；以及
(g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393 有1或2個不同核苷酸者。
516. 實施方式515的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
517. 實施方式515的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：324有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：328有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：332有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：336有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：391有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：392有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；或
(g) 與SEQ ID NO：393有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
518. 實施方式515的核酸分子，其中該crRNA重複子具有 SEQ ID NO：324、328、332、336及 391-393中任一者所示的一核苷酸序列。
519. 實施方式515-518中任一者的核酸分子，其中該間隔子具有：
(a) SEQ ID NO：113所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：113有1至5個不同核苷酸者；或
(b) SEQ ID NO：114所示的一核苷酸序列或與SEQ ID NO：114有1至5個不同核苷酸者。
520. 實施方式519的核酸分子，其中該間隔子具有SEQ ID NO：113或114所示的該序列。
521. 實施方式515-520中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
522. 實施方式521的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
523. 實施方式521或522的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
524. 實施方式515-523中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有 SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者所示的該核苷酸序列。
525. 實施方式474-494中任一者的核酸分子，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列：
(a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465 有1或2個不同核苷酸者；
(b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469 有1或2個不同核苷酸者；
(c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473 有1或2個不同核苷酸者；
(d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477 有1或2個不同核苷酸者；
(e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481 有1或2個不同核苷酸者；
(f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508 有1或2個不同核苷酸者；
(g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512 有1或2個不同核苷酸者；以及
(h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516 有1或2個不同核苷酸者。
526. 實施方式525的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有2個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有2個不同核苷酸的一核苷酸序列。
527. 實施方式525的核酸分子，其中該crRNA重複子具有：
(a) 與SEQ ID NO：465有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(b) 與SEQ ID NO：469有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(c) 與SEQ ID NO：473有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(d) 與SEQ ID NO：477有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(e) 與SEQ ID NO：481有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(f) 與SEQ ID NO：508有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；
(g) 與SEQ ID NO：512有1個不同核苷酸的一核苷酸序列；以及
(h) 與SEQ ID NO：516有1個不同核苷酸的一核苷酸序列。
528. 實施方式525的核酸分子，其中該crRNA重複子具有SEQ ID NO：465、469、473、477、481、508、512及516中任一者所示的一核苷酸序列。
529. 實施方式525-528中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性的一核苷酸序列。
530. 實施方式529的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少90%序列一致性的一核苷酸序列。
531. 實施方式529或530的核酸分子，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少95%序列一致性的一核苷酸序列。
532. 實施方式529-531中任一者的核酸分子，其中該crRNA具有SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者所示的一核苷酸序列。
533. 實施方式474-532中任一者的核酸分子，其中包括該crRNA的一gRNA能夠結合至為了活性需要tracrRNA的一RNA引導的核酸酶(RGN)。
534. 實施方式533的核酸分子，其中該RGN 是一第II型RGN。
535. 實施方式533或534的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
536. 實施方式535的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
537. 實施方式535或536的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
538. 實施方式535-537中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：1所示的一胺基酸序列。
539. 實施方式533或534的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
540. 實施方式539的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
541. 實施方式539或540的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
542. 實施方式539-541中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：69所示的一胺基酸序列。
543. 實施方式533或534的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
544. 實施方式543的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
545. 實施方式543或544的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
546. 實施方式543-545中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：93所示的一胺基酸序列。
547. 實施方式533或534的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
548. 實施方式547的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
549. 實施方式547或548的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
550. 實施方式547-549中任一者的核酸分子，其中該RGN包括SEQ ID NO：252所示的一胺基酸序列。
551. 一種用於結合一標的核酸分子中的一標的序列的RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a) 實施方式1-128中任一者的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)；
b) 能夠與該tracrRNA雜交以形成一引導RNA (gRNA)的一crRNA；以及
c)一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸；
其中該gRNA能夠與該RGN多肽形成一複合物以引導該RGN多肽結合至該標的序列。
552. 一種用於結合一標的核酸分子中的一標的序列的RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a) 實施方式129-396中任一者的gRNA；以及
b) 一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸；
其中該gRNA能夠與該RGN多肽形成一複合物以引導該RGN多肽結合至該標的序列。
553. 一種用於結合一標的核酸分子中的一標的序列的RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a) 實施方式397-550中任一者的CRISPR RNA (crRNA)；
b) 能夠結合至該crRNA以形成一引導 RNA (gRNA)的一tracrRNA；以及
c)一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸；
其中該gRNA能夠與該RGN多肽形成一複合物，以引導該RGN多肽結合至該標的序列。
554. 實施方式551-553中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽辨識具有NNNNCC、NNGRR、NNRYA或NGG所示的一核苷酸序列的一共通前間隔序列鄰近模體 (PAM)。
555. 實施方式551-554中任一者的RGN系統，其中該gRNA 是包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度的一sgRNA。
556. 實施方式555的RGN系統，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
557. 實施方式556的RGN系統，其中該RGN多肽包括SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者所示的一胺基酸序列。
558. 實施方式551-557中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽以及該gRNA 在自然界中並未發現彼此複合。
559. 實施方式551-558中任一者的RGN系統，其中該標的序列是一真核標的序列。
560. 實施方式551-559中任一者的RGN系統，其中該標的序列具有SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的該核苷酸序列。
561. 實施方式551-560中任一者的RGN系統，其中該標的序列在一細胞中。
562. 實施方式551-561中任一者的RGN系統，其中該gRNA和該RGN多肽的一複合物執行該標的序列的切割。
563. 實施方式562的RGN系統，其中該切割產生一雙股斷裂。
564. 實施方式562的RGN系統，其中該切割產生一單股斷裂。
565. 實施方式551-561中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽是核酸酶不活化的。
566. 實施方式551-561中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽是一切口酶。
567. 實施方式551-561中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
568. 實施方式567的RGN系統，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
569. 實施方式551-561中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一先導編輯多肽融合。
570. 實施方式569的RGN系統，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
571. 實施方式570的RGN系統，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
572. 實施方式569-571中任一者的RGN系統，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
573. 實施方式551-572中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一可檢測標記融合。
574. 實施方式551-573中任一者的RGN系統，其中該RGN系統進一步包括一供體多核苷酸。
575. 實施方式551-574中任一者的RGN系統，其中包括編碼該RGN的一核苷酸序列的該多核苷酸是一mRNA。
576. 實施方式551-575中任一者的RGN系統，其中編碼該RGN多肽的該核苷酸序列可操作地連接至一異源啟動子。
577. 實施方式551-576中任一者的RGN系統，其中包括編碼該RGN多肽的一核苷酸序列的該多核苷酸在一載體內。
578. 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a) 實施方式1-128中任一者的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)；
b) crRNA；以及
c)一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
579. 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a)實施方式397-550中任一者的CRISPR RNA (crRNA)；
b) 一tracrRNA；以及
c)一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
580. 實施方式578或579的RGN系統，其中該 crRNA以及該tracrRNA形成引導RNA。
581. 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括：
a) 實施方式129-396中任一者的gRNA；以及
b) 一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
582. 實施方式578-581中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽辨識具有NNNNCC、NNGRR、NNRYA或NGG所示的一核苷酸序列的一共通前間隔序列鄰近模體 (PAM)。
583. 實施方式578-582中任一者的RGN系統，其中該gRNA 是包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度的一sgRNA。
584. 實施方式583的RGN系統，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
585. 實施方式584的RGN系統，其中該RGN多肽包括SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者所示的一胺基酸序列。
586. 實施方式578-585中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽以及該gRNA 在自然界中並未發現彼此複合。
587. 實施方式578-586中任一者的RGN系統，其中該RGN系統結合一標的核酸分子中的一標的序列。
588. 實施方式578-587中任一者的RGN系統，其中該標的序列是一真核標的序列。
589. 實施方式578-588中任一者的RGN系統，其中該標的序列具有SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的該核苷酸序列。
590. 實施方式578-589中任一者的RGN系統，其中該標的序列 在一細胞中。
591. 實施方式578-590中任一者的RGN系統，其中該gRNA和該RGN多肽的一複合物執行該標的序列的切割。
592. 實施方式591的RGN系統，其中該切割產生一雙股斷裂。
593. 實施方式591的RGN系統，其中該切割產生一 單股斷裂。
594. 實施方式578-590中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽是核酸酶不活化的。
595. 實施方式578-590中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽是一切口酶。
596. 實施方式578-590中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
597. 實施方式596的RGN系統，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
598. 實施方式578-590中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一先導編輯多肽融合。
599. 實施方式598的RGN系統，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
600. 實施方式599的RGN系統，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
601. 實施方式598-600中任一者的RGN系統，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
602. 實施方式578-601中任一者的RGN系統，其中該RGN多肽與一可檢測標記融合。
603. 實施方式578-593中任一者的RGN系統，其中該RGN系統進一步包括一供體多核苷酸。
604. 實施方式578-603中任一者的RGN系統，其中包括編碼該RGN的一核苷酸序列的該多核苷酸是一mRNA。
605. 實施方式578-603中任一者的RGN系統，其中編碼該RGN多肽的該核苷酸序列可操作地連接至一異源啟動子。
606. 實施方式578-603中任一者的RGN系統，其中包括編碼該RGN多肽的一核苷酸序列的該多核苷酸在一載體內。
607. 一種核糖核蛋白(RNP)複合物，包括實施方式551-606中任一者的RGN系統。
608. 一種細胞，包括實施方式1-128中任一者的包括一tracrRNA的核酸分子、實施方式129-396中任一者的gRNA、實施方式397-550中任一者的crRNA、實施方式551-606中任一者的RGN系統、或實施方式607的RNP複合物。
609. 實施方式608的細胞，其中該細胞包括能夠被實施方式551-606中任一者的RGN系統的一形成的crRNA/tracrRNA/RGN多肽或gRNA/RGN多肽複合物或被實施方式607的RNP複合物結合的一標的序列。
610. 實施方式608或609的細胞，其中該標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的一核苷酸序列。
611. 實施方式608-610中任一者的細胞，其中該細胞是一原核細胞。
612. 實施方式608-610中任一者的細胞，其中該細胞是一真核細胞。
613. 實施方式612的細胞，其中該真核細胞是一初代細胞。
614. 實施方式613的細胞，其中該初代細胞是一T 細胞。
615. 實施方式612的細胞，其中該真核細胞是一植物細胞。
616. 一種植物，包括實施方式615的細胞。
617. 一種種子，包括實施方式615的細胞。
618. 一種醫藥組成物 ，包括一藥學上可接受的載體以及實施方式1-128中任一者的 tracrRNA、實施方式129-396中任一者的gRNA、實施方式397-550中任一者的crRNA、實施方式551-606中任一者的RGN系統、實施方式607的RNP複合物、或實施方式608-614中任一者的細胞。
619. 實施方式618的醫藥組成物，其中該藥學上可接受的載體不是天然存在的。
620. 一種用於結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，包括將實施方式551-606中任一者的RGN系統或實施方式607的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞。
621. 實施方式620的方法，其中該RGN多肽或該gRNA進一步包括一可檢測標記，從而允許該標的序列的檢測。
622. 實施方式620或621的方法，其中該RGN多肽或該gRNA進一步包括一表現調節子，從而調節包括該標的序列的一標的基因的表現。
623. 一種用於切割及/或修飾包括一標的序列的一標的核酸分子的方法，該方法包括將實施方式551-606中任一者的RGN系統或實施方式607的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞，其中發生該標的核酸分子的切割或修飾。
624. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括：
a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：
i) 包括實施方式1-128中任一者的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)及一CRISPR RNA (crRNA)的一引導RNA (gRNA)；以及
ii) 一第II型RGN，
從而組裝一RNP複合物；
以及
b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與所組裝的RNP複合物接觸，
從而以該RGN結合該標的序列。
625. 實施方式624的方法，其中所組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
626. 實施方式620-624中任一者的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
627. 實施方式626的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
628. 實施方式627的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
629. 實施方式626-628中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
630. 實施方式620-624中任一者的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
631. 實施方式630的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
632. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與i)包括實施方式1-126中任一者的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)及一CRISPR RNA (crRNA)的一引導RNA (gRNA)；以及ii)一第II型RGN或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
633. 實施方式632的方法，其中該gRNA和該第II型RGN的一形成的複合物執行該標的序列的切割。
634. 實施方式632的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
635. 實施方式634的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
636. 實施方式635的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
637. 實施方式634-636中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
638. 實施方式632的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
639. 實施方式633的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
640. 實施方式632的方法，其中該編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
641. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括：
a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：
i) 實施方式127-386中任一者的引導RNA (gRNA)；以及
ii) 一第II型RGN，
從而組裝一RNP複合物；
以及
b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與所組裝的RNP複合物接觸，
從而以該RGN結合該標的序列。
642. 實施方式641的方法，其中所組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
643. 實施方式641的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
644. 實施方式643的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
645. 實施方式641的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
646. 實施方式645的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
647. 實施方式646的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
648. 實施方式645-647中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
649. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與i)實施方式127-386中任一者的引導RNA (gRNA)；以及ii)一第II型RGN 或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
650. 實施方式649的方法，其中該gRNA和該第II型RGN的一形成的複合物執行該標的序列的切割。
651. 實施方式649的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
652. 實施方式651的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
653. 實施方式649的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
654. 實施方式653的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
655. 實施方式654的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
656. 實施方式653-655中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
657. 實施方式649的方法，其中該編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
658. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括：
a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合：
i) 一引導RNA (gRNA)，包括實施方式397-550中任一者的一CRISPR RNA (crRNA)以及一tracrRNA；以及
ii) 一第II型RGN，
從而組裝一RNP複合物；
以及
b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與所組裝的RNP複合物接觸，
從而以該RGN結合該標的序列。
659. 實施方式658的方法，其中所組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
660. 實施方式658的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
661. 實施方式660的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
662. 實施方式658的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
663. 實施方式662的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
664. 實施方式663的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
665. 實施方式662-664中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
666. 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與i)包括實施方式387-540中任一者的CRISPR RNA (crRNA)及一tracrRNA的一引導RNA (gRNA)；以及 ii) 一第II型RGN或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
667. 實施方式666的方法，其中該gRNA和該第II型RGN的一形成的複合物執行該標的序列的切割。
668. 實施方式666的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
669. 實施方式668的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
670. 實施方式666的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
671. 實施方式670的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
672. 實施方式671的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
673. 實施方式670-672中任一者的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
674. 實施方式666的方法，其中該編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
675. 實施方式620-674中任一者的方法，其中標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712的任一者所示的該核苷酸序列。
676. 實施方式624-675中任一者的方法，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者具有至少80%序列一致性的一胺基酸序列。
677. 實施方式624-676中任一者的方法，其中該RGN包括SEQ ID NO：1、69、93及252的任一者所示的胺基酸序列。
678. 實施方式624-677中任一者的方法，其中所組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
679. 一種提高切割及/或修飾包括一標的序列的一核酸分子的效率的方法，該方法包括將實施方式551-606中任一者的RGN系統或實施方式607的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞，其中相較於藉由包括將一參考RGN系統或RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞的方法對該核酸分子的切割或修飾，該核酸分子的切割或修飾以更高的效率發生，其中該參考RGN系統或RNP複合物中的一tracrRNA、一gRNA或一crRNA不包括一橋接核酸(BNA)修飾或不包括任何化學修飾。
680. 實施方式679的方法，其中實施方式551-606中任一者的RGN系統或實施方式607的RNP複合物的tracrRNA的抗重複子的第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。
681. 實施方式680的方法，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸包括BNA修飾。
682. 實施方式681的方法，其中該BNA修飾包括LNA修飾。
683. 實施方式681的方法，其中該BNA修飾包括cEt修飾。
684. 實施方式679-683中任一者的方法，其中切割及/或修飾該標的序列的該效率增加15倍至30倍。
685. 實施方式684的方法，其中切割及/或修飾該標的序列的該效率是藉由測量該標的序列或包括該標的序列的細胞的百分比來確定，其具有該標的序列或由該標的序列編碼的一多肽的一改變的表現。
686. 實施方式685的方法，其中藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜法(LC/MS)、質譜法或其組合來測量該表現。
687. 一種工程化一gRNA的方法，該方法包括：
a) 提供包括一crRNA和一tracrRNA的一gRNA，其中該crRNA包括一crRNA重複子並且該 tracrRNA包括一抗重複子；以及
b) 添加或取代該crRNA重複子中的一或更多核苷酸以及該抗重複子中的一或更多核苷酸，其中在該重複子中添加或取代的該一或更多核苷酸以及在該抗重複子中添加或取代的該一或更多核苷酸能夠彼此雜交，其中所添加或取代的一或更多核苷酸包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C，並且其中該工程化的gRNA與步驟a)中提供的gRNA相比具有一增加的編輯效率。
688. 實施方式687的方法，其中該一或更多核苷酸是1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。
689. 實施方式687或688的方法，其中該所添加或取代的一或更多核苷酸在該crRNA重複子的該3’區域及該抗重複子的該5’區域中，並且其中該crRNA重複子的該3’區域及該抗重複子的該5’區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
690. 實施方式687-689中任一者的方法，其中該gRNA是一 dgRNA。
691. 實施方式687-689中任一者的方法，其中該gRNA 是一sgRNA。
692. 實施方式687-691中任一者的方法，進一步包括：
c) 以至少一化學修飾來修飾該工程化的gRNA中的至少一核苷酸，該至少一化學修飾選自下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及 BNA修飾。
693. 實施方式692的方法，其中該至少一化學修飾在該crRNA、該tracrRNA或兩者中。
694. 實施方式692的方法，其中該至少一化學修飾在下列中：該crRNA重複子；該抗重複子；該tracrRNA的一尾部；該crRNA重複子及該抗重複子；或該crRNA重複子、該抗重複子以及該tracrRNA的該尾部。
695. 實施方式692的方法，其中該至少一化學修飾在下列中：該crRNA重複子的一第一莖；該抗重複子的一第一莖；該tracrRNA的一尾部； 該crRNA重複子的該第一莖及該抗重複子的該第一莖；或該crRNA重複子的該第一莖、該抗重複子的該第一莖、以及該tracrRNA的該尾部。
696. 實施方式695的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中。
697. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 個核苷酸上。
698. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的連續核苷酸上。
699. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的交替核苷酸上。
700. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上。
701. 實施方式700的方法，其中該至少一化學修飾在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸上。
702. 實施方式700的方法，其中該至少一化學修飾在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上、在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸上、且在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上。
703. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上。
704. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該crRNA重複子的該第一莖中的至少一核苷酸上。
705. 實施方式696的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上、在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上、且在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少一個核苷酸上。
706. 實施方式687-6705中任一者的方法，其中該至少一化學修飾包括一BNA修飾。
707. 實施方式706的方法，其中該BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
708. 實施方式707的方法，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
709. 實施方式708的方法，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
710. 實施方式708的方法，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
711. 實施方式687-710中任一者的方法，其中相較於包括步驟a)中提供的gRNA，該工程化的gRNA的編輯效率增加至少10%、至少30%、至少50%、至少70%、至少90%、至少100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
712. 實施方式687-711中任一者的方法，其中相較於包括步驟a)中提供的gRNA的RGN系統，藉由包括該工程化的gRNA的一RGN系統切割及/或修飾一標的序列的效率增加至少10%、至少30%、至少50%、至少70%、至少90%、至少100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
713. 實施方式712的方法，其中該效率是藉由測量該標的序列或包括該標的序列的細胞的百分比來確定，其具有該標的序列或由該標的序列編碼的一多肽的一改變的表現。
714. 實施方式713的方法，其中藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜法(LC/MS)、質譜法或其組合來測量該表現。
715. 實施方式687-714中任一者的方法，其中該工程化的gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
716. 一種藉由實施方式687-715中任一者的方法產生的工程化的gRNA。
717. 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA) 以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)，
其中該crRNA包括一crRNA重複子，
其中該 tracrRNA包括一抗重複子，
其中該 gRNA包括一莖環，該莖環包括一第一莖及一第二莖，
其中該第一莖包括約11個鹼基對的一總長度，
以及其中該第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
718. 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA) 以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)，
其中該 crRNA包括一crRNA重複子，
其中該 tracrRNA包括一抗重複子，
其中該 gRNA包括一莖環，該莖環包括一第一莖及一第二莖，
其中該第一莖包括至少 3、4、5、6 或 7 個 GC 鹼基對，
以及其中該第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
提供以下範例是為了說明而不是限制。
範例
範例 1. 以修飾的雙引導 RNA (dgRNA) 對初代人類 T 細胞的基因編輯效率
在初代人類T細胞中測試修飾的雙引導RNA (dgRNA；圖3A、圖3B)的不同組合的基因編輯效率。在遞送至細胞中之前，dgRNA在室溫下與APG07433.1 RNA引導核酸酶(RGN)一起培養，以形成核糖核蛋白(RNP)。這種遞送方法—使用RGN作為其與gRNA複合的蛋白質形式—在下文中被稱為RNP遞送。每100萬個細胞總共使用60 pmol APG07433.1蛋白和60 pmol dgRNA。對於陽性控制組，使用相同量的單引導(sgRNA)和dgRNA。請注意，在控制組條件下，sgRNA和dgRNA在5'和3'端的3 nt處均以MS (2'-O-甲基和3'硫代磷酸酯修飾的組合)進行修飾(下文稱為3X MS)。此測試的標的基因為TRAC (T細胞受體α恆定)基因座；因此，以CD3抗體對T細胞進行染色後，可以透過流式細胞分析技術評估編輯。結果證明，莖環3 (最靠近gRNA的3'端的莖環)處的修飾破壞了編輯活性，而莖環1 (藉由crRNA的crRNA重複子和tracrRNA的抗重複子之間的雜交形成的莖環)處的修飾單獨保留了dgRNA的編輯能力(圖4)。
範例 2. LNA 修飾的 dgRNA 提供與 sgRNA 相似的編輯程度
進行修飾的dgRNA與控制組條件的劑量依賴性分析。在這個實驗中，100萬個初代T細胞以不同RNP量(範圍從30 pmole到90 pmole)及/或以蛋白質與gRNA的不同比例(1:2 vs 1:6)進行核轉染。標的基因和編輯評估如圖4所描述。圖5所示結果表明雖然所測試的修飾dgRNA的所有組合都可以編輯TRAC基因，但LNA修飾的tracrRNA提供比MS修飾條件更高的編輯。與5'和3'端處的3X MS的標準/原始修飾方案相比，LNA修飾提高編輯效率(圖5中標記的3x MS @ 5' + 3' dgRNA)。此外，用LNA修飾的dgRNA檢測到的最高編輯程度達到了與sgRNA條件相同的程度。
範例 3. LNA 修飾的 dgRNA 以 mRNA 遞送方法促進高基因破壞率
RGN編碼的mRNA與測試的gRNA一起被核轉染到細胞中。此遞送方法在下文中稱為mRNA遞送。標的基因和編輯評估如圖4所描述。在mRNA遞送中，APG07433.1使用標準修飾方案(在5'和3'末端的3X MS(在圖6中標記為「3x MS @ 5' + 3' dgRNA」))或甚至在莖環1的第一莖處使用額外的MS修飾(在圖6中標記為「MS/PS mod」)使用sgRNA (但不使用dgRNA)很好地編輯TRAC基因座。當用dgRNA遞送RGN編碼mRNA時，使用本文所描述的LNA修飾(在圖6中標記為「LNA mod.」)能夠實現與使用sgRNA相似的編輯程度。圖6提供了使用兩種不同間隔子序列(間隔子選項1和間隔子選項2)的數據，以證明使用了利用不同修飾方案的APG07433.1對TRAC基因座的編輯效果的一致性。
範例 4. LNA 修飾的 dgRNA 在基因編輯 / 破壞的效力
為了比較sgRNA與LNA修飾的dgRNA的效力，如圖7所表明，測試不同量的gRNA。以1 µg的恆定量遞送RGN編碼的mRNA。結果證明，LNA修飾的dgRNA即使稀釋10倍(從50 pmole至5 pmole)也能提供穩定的編輯程度，而使用相同條件時來自sgRNA的編輯下降超過50%。使用兩種不同的間隔子序列(間隔子選項1和間隔子選項2)可以看到類似的結果。
範例 5. 證明 LNA 修飾技術對多種 gRNA 和 RGN 的廣泛適用性。
莖環1的抗重複子的第一莖的LNA修飾增強對於具有RNP遞送或mRNA遞送的兩種不同RGN系統(圖8A和圖8B)的sgRNA的編輯效率。編輯評估如範例1-4中所描述。APG07433.1 RGN系統辨識NNNNCC共通PAM序列(圖8A)，而APG01604 RGN系統則辨識NNNGRR共通PAM序列(圖8B)。對於靶向TRAC(sg_1880和sg_1881)的APG07433.1 RGN系統使用兩個不同的間隔子序列以及對於靶向TRAC(sg_2275)和微球蛋白(B2M；sg_1989)的APG01604 RGN系統使用兩個不同的間隔子序列，可以看到類似的結果。用B2M抗體對T細胞進行染色後，以流式細胞分析技術評估B2M標的基因的編輯。
範例 6. 莖環 1 的 MS 修飾不會增強基因編輯，且莖環 3 的化學修飾破壞基因編輯。
莖環1的MS修飾不會增強編輯效率(圖9A和9B)。圖9A描繪出針對APG07433.1 sgRNA的莖環1及/或莖環3中2'-O-Me及/或MS修飾的八種情況。與控制組的sgRNA相比，具有2'-O-Me及/或MS修飾的測試的sgRNA均未增強sgRNA編輯(圖9B)。莖環3處的化學修飾破壞了sgRNA活性。RGN會作為與引導RNA複合的蛋白質而被遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。編輯評估如範例1-4所描述。
範例 7. 莖環 1 的 LNA 修飾量與多個 RGN 系統中的基因編輯效率相關。
LNA修飾的量與針對三種不同RGN系統的引導RNA編輯效率相關(APG07433.1，圖10A；APG01604，圖10B；APG05586，圖10C)。如範例1-5所描述，透過使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記物的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或B2M的免疫染色(用於B2M標的序列的編輯)來測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內不同量的核苷酸經LNA修飾：對於APG07433.1 dgRNA，1、3、6或11個LNA修飾的核苷酸；對於APG01604 dgRNA，3或7個LNA修飾的核苷酸；對於APG05586 dgRNA，4或9個LNA修飾的核苷酸。當形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內的所有核苷酸都經LNA修飾時，對於每個RGN系統達到最高編輯。對於每個RGN系統測試兩種不同的間隔子：針對APG07433.1的兩個TRAC間隔子；以及針對APG01604和APG05586的RAC和B2M間隔子。每個RGN作為與引導RNA複合的蛋白質而被遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。與針對APG01604和APG05586系統的mRNA遞送相比，RNP遞送的基因編輯更加穩健。這些實驗還證明，莖環1的第一莖的LNA修飾改善了辨識NNRYA共通PAM序列的第三個RGN系統(APG05586)的基因編輯效率。
範例 8. LNA 修飾維持或提高縮短的引導 RNA 的基因編輯效率。
使用APG07433.1系統評估LNA修飾對縮短的sgRNA的基因編輯效率的影響(圖11A至圖11C)。全長APG07433.1 sgRNA透過sgRNA各個區域中的截斷的組合而被縮短：從莖環1的第一莖刪除5個核苷酸(nt)對(10 nt)及從尾部刪除6 nt (-10第一莖SL1, -6尾部)；從莖環1的第一莖刪除5 nt對(10 nt)、從尾部刪除4 nt、以及從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt) (-10第一莖SL1、-4尾部、-2第一莖SL3)；以及從莖環1的第一莖刪除5個核苷酸(nt)對(10 nt)、從尾部刪除6 nt、以及從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt) (-10 第一莖SL1、-6尾部、-2第一莖SL3) (圖11A；上部)。這些縮短的APG07433.1 sgRNA在sgRNA的5'區域及3'區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾、且作為控制組以評估引入莖環1的第一莖中的其他化學修飾。在莖環1的第一莖中額外包括LNA和MS修飾以及在從3'端起的第四個核苷酸上額外包括2'-O-Me修飾的縮短的APG07433.1 sgRNA顯示於圖11A的底部。莖環1的第一莖中的LNA和MS修飾(標記為「修飾的」)維持或改善了縮短的APG07433.1 sgRNA的編輯效率(圖11B)。透過sgRNA的連續稀釋，觀察到莖環1的第一莖中的LNA和MS修飾(標記為「修飾的縮短」)增加在5’區域和3’區域的三個末端核苷酸處僅具有MS修飾的縮短的APG07433.1 sgRNA (標記為「3 MS 縮短的」)的編輯效力達到與在5’區域和3’區域的三個末端核苷酸處僅具有MS修飾的全長APG07433.1 sgRNA (標示為「3 MS全長」)相當的程度(圖11C)。這些結果表明莖環1的第一莖的LNA和MS修飾可能會減少gRNA長度及/或濃度以用於有效的基因編輯。
使用APG07433.1系統評估LNA修飾對縮短的dgRNA的基因編輯效率的影響(圖12A及圖12B)。crRNA和tracrRNA的化學修飾和縮短方案如圖12A所示。crRNA在3'區域處縮短5個末端nt、並以下列任一者進行化學修飾：在5'和3'區域的三個末端核苷酸處的MS修飾(左；O和Q代表使用的兩個範例性TRAC間隔子)，或5'和3'區域的三個末端核苷酸處的MS修飾加上形成莖環1的第一莖的crRNA重複子內的2’-O-Me修飾(右；P及R表示使用的兩個範例性TRAC間隔子)。tracrRNA是以下列方式縮短並進行化學修飾：「tracr(L)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短6 nt、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾；「tracr(M)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短4 nt、從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt)、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾；「tracr(N)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短6 nt、從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt)、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。圖12A和圖12B顯示LNA修飾維持或增加針對RNP遞送的縮短的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率。縮短和化學修飾方案「M」對於sgRNA和dgRNA表現最佳。
編輯評估如範例1-4所描述。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質而被遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。對於dgRNA，RNP遞送導致比mRNA遞送更有效率的編輯。sgRNA和dgRNA使用兩個範例性TRAC間隔子。
範例 9. 莖環 1 的抗重複子的第一莖的 LNA 修飾增強其他 RGN 系統的引導 RNA 的編輯效率。
針對APG05586系統評估莖環1的抗重複子的第一莖的LNA修飾的效果。APG05586系統辨識NNRYA共通PAM序列。如範例1-5中所描述進行編輯評估。測試兩種不同的間隔子序列(TRAC和B2M)。實驗顯示LNA修飾增加針對APG05586的sgRNA編輯的效力(圖25)。
在包括APG07991的其他RGN系統中評估莖環1的抗重複子的第一莖的LNA修飾的效果。APG07991系統辨識nGG共通PAM序列。如範例1-5中所描述進行編輯評估。針對每個RGN系統測試至少兩個不同的間隔子序列。RNP遞送和mRNA遞送均被測試。實驗示出，對於包括APG07991的其他RGN系統，LNA修飾的引導RNA的基因編輯效率增強。
範例 10. 對於不同的 RGN 系統， LNA 修飾維持或提高縮短的引導 RNA 的基因編輯效率。
針對其他RGN系統(包括APG01604、APG05586和APG07991)，評估LNA修飾對縮短的引導RNA的基因編輯效率的影響。如範例8中所描述進行引導RNA的縮短和化學修飾。如範例1-5中所描述進行編輯評估。對於每個RGN系統，測試至少兩個不同的間隔子序列。RNP遞送和mRNA遞送均被測試。實驗示出，對於其他RGN系統(包括APG01604、APG05586和APG07991)，LNA修飾的縮短引導RNA的基因編輯效率被維持或增強。
範例 11. LNA 修飾可維持或提高反轉錄酶 (RT) 介導的基因編輯中的基因編輯效率。
評估了LNA修飾的dgRNA用在反轉錄酶(RT)介導的基因編輯中的實用性(Anzalone, AV等人
Nature2019, Nelson JW等人
Nat Biotechnol2021, Chen PJ等人
Cell2021)。用於RT介導的基因編輯的引導RNA的長度往往非常長。使用LNA修飾的dgRNA具有減少要合成的最大長度的優點。RT介導的基因編輯使用與RNA引導切口酶融合的反轉錄酶，該RNA引導切口酶選擇性地切非標的股。引子結合位點(PBS)和RT模板被融合至gRNA。PBS與切口的基因體DNA雜交，使基因體DNA可作為模板化所需變化的RT模板的反轉錄的引子。RT模板的反轉錄進行後，產生包含編輯的DNA的「瓣」。修復後，其穩定地整合到基因體中。
tracrRNA的3'端延伸以包括RT模板區域，該RT模板區域為融合的RT和PBS提供模板(帶有任何期望的編輯)。或者，RT模板和PBS可以融合到crRNA的5'端。在這兩種情況下，RT模板均位於PBS的5'端。
這兩種配置均在基於細胞的測定中進行評估，RT模板引導一或多個基因體鹼基對的變化。RT介導的基因編輯組成物透過使用靶向的擴增子定序對靶向的基因體位點進行定序、透過被引入綠色螢光蛋白基因(或其他螢光蛋白)的終止密碼子的反轉、透過剔除內源基因、或透過其他方式被測試。
範例 12. 引導 RNA 的 5' 區域和 3' 區域處的三個末端核苷酸處的 LNA 和 LNA+PS 修飾與 MS 修飾一樣有效。
使用APG07433.1系統評估引導RNA 5'區和3'區三個末端核苷酸處以LNA修飾或LNA + PS修飾替換MS修飾對基因編輯效率的影響。圖13示出用於測試sgRNA格式的縮短的(「M」主鏈，參閱範例8、圖11A)、化學修飾的APG07433.1 gRNA的基因編輯效率的設計。
縮短的「M」APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率與在sgRNA的5'區域和3'區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA或LNA+PS修飾同樣有效(圖14、圖15)。
圖16A示出用於測試dgRNA格式的野生型(WT，全長)、化學修飾的APG07433.1 gRNA的基因編輯效率的設計。WT APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率與在sgRNA的5'區域和3’區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA或LNA+PS修飾同樣有效(圖16B)。所有測試的dgRNA在形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸處都具有LNA修飾。
因此，這些實驗示出sgRNA和dgRNA格式的gRNA的5'區域和3'區域的三個末端核苷酸處的LNA或LNA+PS可以取代MS修飾以用於有效率的基因編輯。
編輯評估如範例1-4所描述。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質而被遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
範例 13. 對於具有在莖環 1 的第一莖中具有少於 11 個核苷酸對的 dgRNA 的 RGN 系統，透過延長莖環 1 的第一莖並用 LNA 修飾抗重複子的延長的第一莖中的所有核苷酸，改善基因編輯效率。
使用RGN的mRNA遞送的dgRNA的基因編輯效率在RGN系統(例如APG07433.1系統，參見範例7，圖10A)中透過抗重複子的第一莖中的核苷酸的LNA修飾而增強。相較之下，對於在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對的dgRNA的RGN系統(包括APG01604、APG05586、APG08167和APG07991系統(參見圖10B、圖10C、圖27和圖28) )，此LNA修飾並未改善使用mRNA遞送的基因編輯。
因此，針對這些RGN系統，援救基因編輯的策略被探索。應注意的是，對基因編輯有效的LNA修飾的APG07433.1 dgRNA在抗重複子的第一莖中含有11個LNA修飾的核苷酸。 不受任何一種理論的束縛，更多的LNA修飾及/或莖環1的更長的第一莖可能有助於APG07433.1 dgRNA的有效性。
圖17A和圖17B示出用於援救RGN系統的基因編輯的策略，該RGN系統具有在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對的dgRNA。圖17A示出包括在APG05586 dgRNA的距莖環1的第一泡泡最遠的端處的第一莖使用APG05586前驅crRNA的天然序列延長(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)2個核苷酸對以及抗重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾的策略。圖17B示出使用各自的前驅crRNA的天然序列將APG05586 dgRNA或APG08167 dgRNA的距莖環1的第一泡泡最遠的端處的第一莖延長 (即，在crRNA的3'端及tracrRNA的5'端處延長)2個核苷酸對的策略。
對於在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對的WT(原始)dgRNA的四個RGN系統，可以透過延長距莖環1的第一泡泡最遠的端處的第一莖(即在crRNA的3'末端核苷酸和tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)並以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸(圖18、圖19和圖27)，而復原基因編輯。將莖環1的第一莖延長到至少9個核苷酸對(具有抗重複子LNA修飾的第一莖的所有9個核苷酸)或到至少11個核苷酸對(具有抗重複子LNA修飾的第一莖的所有11個核苷酸)可以復原基因編輯(圖18和圖19)。添加的核苷酸可以來自各自的前驅crRNA的天然序列或APG07433.1 gRNA序列(圖18、圖19和圖27)。對於APG07991 dgRNA，將莖環1的第一莖延長到至少11個核苷酸對(具有抗重複子LNA修飾的第一莖的所有11個核苷酸)可以復原基因編輯(圖27)。圖28清楚地證明了比較延長和LNA修飾的APG07991 dgRNA與在莖環1的第一莖處具有6個核苷酸對的WT(原始)APG07991 dgRNA的基因編輯效率，藉由延長和LNA修飾的APG07991 dgRNA對基因編輯的復原。
APG07991 RGN可以使用SpyCas9引導RNA進行基因編輯。然而，SpyCas9 dgRNA在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對、並且針對有效基因編輯提出與本範例中討論的其他RGN系統的dgRNA相同的挑戰。與針對其他dgRNA已證明的類似，使用SpyCas9 dgRNA (以及作為mRNA遞送的APG07991 RGN)的基因編輯可以透過將莖環1的第一莖延長到至少11個核苷酸對並用LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸來復原(圖29)。
值得注意的是，距莖環1的第一莖中的第一泡泡最遠的APG07433.1核苷酸對(即，最接近crRNA的3'末端核苷酸和tracrRNA的5'末端核苷酸的核苷酸)是富含G:C的(圖17B)，但基因編輯仍可透過在測試的延長和修飾的dgRNA中以非富含G:C的核苷酸序列延長莖環1的第一莖來復原(圖18、圖19和圖27-圖29)。
如範例1-5所描述，透過使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記物的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或B2M的免疫染色(用於B2M標的序列的編輯)來測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
因此，範例中討論的策略允許使用作為mRNA遞送的RGN並使用先前在此背景下基因編輯失敗的dgRNA進行基因編輯(例如，本範例中討論的RGN系統、Cas9和其他商業可得的RGN系統)。如範例11中所討論的，使用LNA修飾的dgRNA具有減少要合成的gRNA的最大長度的優點，因此，本範例的策略進一步使得dgRNA能夠在RT介導的基因編輯(即先導編輯)中使用，其中sgRNA格式中的非常長的gRNA很難生產。重要的是，該範例證明復原具有不同gRNA二級結構的dgRNA的基因編輯的方法，因為APG07433.1、APG01604、APG05586和APG08167 gRNA總共具有三個莖環(例如，參見圖10A至圖10C和圖18)，而APG07991和SpyCas9 gRNA總共具有四個莖環(例如，參見圖27至圖29)。
範例 14. crRNA 的 3' 端和 tracrRNA 的 5' 端的核苷酸取代改善縮短的 dgRNA 的基因編輯效率。
即使抗重複子的第一莖的核苷酸有LNA修飾，縮短的「M」APG07433.1 gRNA主鏈在dgRNA格式中提供低基因編輯效率，其中RGN作為mRNA遞送(範例8，圖12B)。因此，改善縮短的LNA修飾的dgRNA的基因編輯效率的策略被探索。
圖20示出透過縮短的dgRNA復原基因編輯的策略。透過以G核苷酸取代crRNA的3’3個末端核苷酸和tracrRNA的5’2個末端核苷酸，針對縮短的「M」APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率被改善(圖20、圖21)。
因此，用新的核苷酸序列取代莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖的核苷酸序列可改善針對縮短的dgRNA的基因編輯效率。不受任何理論的束縛，在莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖處工程化的新核苷酸序列可包括使莖環1更穩定的核苷酸，例如富含G:C的序列。
範例 15. 只要 tracrRNA 的抗重複子的第一莖也經 LNA 修飾， crRNA 的重複子的第一莖的 LNA 修飾就允許針對 gRNA 進行編輯。
已經觀察到，在抗重複子的第一莖中具有LNA修飾的gRNA在基因編輯中表現良好(參見例如範例1-5、7和9)。一些策略被探索，以知道對gRNA其他部分進行LNA修飾是否可以改善基因編輯效率。
圖22A示出在基因編輯中表現良好的修飾的APG07433.1 dgRNA，其在抗重複子的第一莖中具有修飾的所有11個核苷酸LNA (Tracr(J)；參見圖10A)。測試在以下處具有LNA修飾的APG07433.1 tracrRNA的基因編輯效率(圖22B)：抗重複子的第一莖和第二莖中的所有核苷酸(Tracr(Jb))；抗重複子的第二莖中的所有核苷酸(Tracr(Jc))；或抗重複子(包括第一莖、泡泡和第二莖)中的所有核苷酸(Tracr(Jd))。與抗重複子的其他LNA修飾策略相比，gRNA的tracrRNA中抗重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾對於基因編輯是最有效的(圖23)，與在先前範例所觀察到的一致。
測試在crRNA重複子的第一莖或第二莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率(圖24)。發現只要gRNA的抗重複子的第一莖的所有核苷酸也經LNA修飾，gRNA的crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸對基因編輯是有效的(圖24，下圖，右側)。gRNA的crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸的LNA修飾使具有抗重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾的gRNA的基因編輯惡化(圖24，下圖，右側)。使用兩個範例性間隔子(1880和1881)。編輯評估如範例1-4中所描述。RGN作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
範例 16. 抗重複子的第一莖的 LNA 修飾量與引導 RNA 的編輯效率和穩定性有關。
先前已觀察到，抗重複子的第一莖處的LNA修飾量與引導RNA編輯效率相關(參見範例7，圖10A)。針對APG07433.1確定DNA/tracrRNA異源二聚體(代表雜交的crRNA重複子/抗重複子)的解鏈溫度。解鏈溫度可以是雜交雙股核酸分子(例如crRNA重複子/抗重複子雜交分子)的穩定性的度量。莖環1的第一莖處的LNA修飾量與DNA/tracrRNA抗重複異源二聚體的解鏈溫度(Tm)和引導RNA編輯效率相關。當形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內的所有核苷酸經LNA修飾時，實現最高編輯和最高Tm(圖26)。
依照Cromwell等人(2018) Nature Communications 9:1448的描述，進行在抗重複子的第一莖處不同量的LNA修飾的tracrRNA解鏈溫度的確定。簡言之，將等莫耳量的含有APG07433.1 crRNA重複子的序列的單股DNA與APG07433.1 tracrRNA在退火緩衝液(30mM氯化鉀，3mM HEPES，pH 7.0)中混合至終濃度2 µM。加入SYBR Green I至最終濃度0.1X。反應在QuantStudio 3 (Thermo Fisher)中進行，程序首先將溶液在95°C下培養5分鐘，然後逐漸冷卻(0.1 ˚C s
-1) 至25°C以對兩種寡核苷酸進行退火，然後以0.1 ˚C s
-1加熱至95°C。相應的SYBR Green訊號用於確定解鏈溫度。
透過將編碼RGN和gRNA的mRNA交錯遞送至初代T細胞而進一步證明gRNA的莖環1的第一莖處的化學修飾穩定gRNA的能力(圖30)。遞送包括：gRNA遞送前8小時的mRNA遞送；mRNA與gRNA的共同遞送；mRNA遞送前8小時的gRNA遞送；以及mRNA遞送前24小時的gRNA遞送。如透過基因編輯效率評估的，與沒有LNA修飾的sgRNA相比，形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸的LNA修飾賦予sgRNA更高的穩定性(圖30)。MS/LNA修飾的dgRNA可以透過mRNA和gRNA組成的共同遞送來實現有效的基因編輯，但不如化學修飾的sgRNA穩定，如交錯遞送的情況所證明。
如範例1-4所述，透過使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除來測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。
範例 17. 化學修飾提高引導 RNA 在鹼基編輯中的效率。
使用腺嘌呤去胺酶和APG07433.1 RGN的融合來評估化學修飾(MS及/或LNA)對gRNA在鹼基編輯中的效率的影響(圖31和圖32)。腺嘌呤去胺酶和RGN多肽的融合稱為腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)。測試了兩種類型的去胺酶-RGN融合：一種融合是變異體去胺酶(SEQ ID NO：542)與APG07433.1(SEQ ID NO：543)的DllA切口酶版本的端對端融合。變異體腺嘌呤去胺酶是透過親代LPG50148腺嘌呤去胺酶(SEQ ID NO：544)的定向進化和最佳化而產生。與親代LPG50148相比，變異體腺嘌呤去胺酶具有改善的鹼基編輯活性，並且相對於親代酶具有以下突變：L35N、V81S、N156R、L162W。(親代LPG50148和進化的變異體分別揭露於WO 2022/056254和美國臨時申請案第63/382,344號(2022年11月4日申請)，其每一篇均藉由引用以其整體併入本文。)
另一種測試的去胺酶-RGN融合是「鑲嵌(inlaid)」ABE(SEQ ID NO：550)。鑲嵌ABE具有插入在RGN內的腺嘌呤去胺酶。(鑲嵌ABE在美國臨時申請案第63/485,642號(2023年2月17日申請)中揭露，其藉由引用以其整體併入本文。)
如WO 2019/236566中所描述執行測量ABE鹼基編輯活性的測定，不同之處在於每個ABE作為mRNA被遞送，並且gRNA作為具有不同化學修飾的合成gRNA提供。使用標準技術(例如電穿孔)將mRNA和gRNA轉染至人類初代細胞。核轉染後將細胞培養3天。使用標準技術分離基因體DNA。編輯效率透過對純化的基因體DNA進行下一代定序來確定，如WO 2019/236566中所描述。圖31的實驗中使用50皮莫耳(約2 µg) gRNA和1µg編碼ABE的mRNA，而圖32的實驗中使用100皮莫耳(約4µg) gRNA和2 µg編碼ABE的mRNA。兩個範例性TRAC間隔子被用於圖32的實驗。
使用兩種類型的ABE在鹼基編輯中測試以下gRNA (圖31)：(A)末端修飾的sgRNA具有在sgRNA的5'和3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾；(B) LNA修飾的sgRNA具有在5'和3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾、以及在抗重複子的第一莖的所有核苷酸上的LNA修飾；(C) MS/LNA修飾的sgRNA具有在5'和3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾、在crRNA重複子的3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾、以及在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾；以及(D) MS/LNA修飾的dgRNA具有在crRNA的5'和3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA的3'區域處的三個末端核苷酸的MS修飾。
已證明，與末端修飾的APG07433.1 sgRNA相比，莖環1的第一莖的LNA (或LNA和MS)修飾維持或增加APG07433.1 sgRNA和dgRNA的鹼基編輯效率(圖31和圖32)。此外，莖環1的第一莖中的LNA (或LNA和MS)修飾維持或增加了縮短的APG07433.1 sgRNA的鹼基編輯效率(圖32，圖中的「shrt」sgRNA)。這些結果證明，使用兩種類型的ABE，莖環1的第一莖的LNA (或LNA和MS)修飾維持或提高sgRNA、dgRNA和縮短的sgRNA的鹼基編輯效率。
範例 18. 與 LNA 修飾相比，用另一個 BNA 修飾的引導 RNA 在基因編輯方面同樣有效。
比較了在形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸處以LNA或S-限制性乙基(cEt)化學修飾的兩種dgRNA的基因編輯效率：APG07433.1 dgRNA (範例7和圖10A中描述的)；以及在莖環1的第一泡泡遠端的第一莖處延長至11個核苷酸對的APG05586 dgRNA (範例13以及圖18和圖19中描述的)。如範例1-5所描述，透過使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記物的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或B2M的免疫染色(用於B2M標的序列的編輯)來測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。
已證明，與在crRNA和tracrRNA的5'區域和3'區域處的三個末端核苷酸處具有MS修飾但在dgRNA的其他地方沒有化學修飾的控制組dgRNA相比，對於兩種不同的dgRNA，用另一橋接核酸(BNA) cEt進行的dgRNA的莖環1的抗重複子的第一莖處的所有核苷酸的修飾(例如cEt)對增強基因編輯效率同樣有效(圖33和圖34)。
範例 19. LNA 修飾改善包括延伸的 tracrRNA 的 dgRNA 的編輯效率。
進行實驗以研究添加到引導RNA上的延伸的存在(其使引導RNA更長)是否會干擾引導RNA折疊及/或功能。透過測量包括雙引導RNA+32nt延伸和RGN的系統中的基因編輯效率來評估tracrRNA的尾部處的雙引導RNA+32nt延伸的功能。原始雙引導RNA包括46 nt crRNA和79 nt tracrRNA。延伸的雙引導RNA包含46 nt crRNA和111 nt tracrRNA。與未延伸的原始雙引導RNA對應的單引導RNA被使用作為控制組。圖35(上部)示出所測試的在tracrRNA尾部處具有32nt延伸的三種化學修飾的dgRNA：(a) crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾、以及tracrRNA+32 nt延伸的5’區域的三個末端核苷酸處及3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾(3MS端)；(b) crRNA的3MS端、在tracrRNA + 32 nt延伸上莖環1 (即crRNA的crRNA重複子與tracrRNA的抗重複子雜交形成的莖環)的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA + 32 nt延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(c) crRNA的3MS端、在tracrRNA + 32 nt延伸上莖環1的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、tracrRNA + 32 nt延伸的莖環3 (即最接近尾部的莖環)的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA + 32 nt延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾。
如先前所見(參見例如圖10A)，未經LNA修飾的dgRNA不具有高基因編輯效率(具有作為mRNA的RGN的遞送)。與此一致的是，與沒有延伸的控制組單引導RNA相比，未經LNA修飾的dgRNA + 32nt延伸具有低編輯效率(圖35，(a)條)。然而，LNA修飾的dgRNA + 32nt延伸(圖35，(b)和(c)條)具有與無延伸的控制組單引導RNA相當的基因編輯效率。
因此，這些實驗示出LNA修飾可以改善具有32 nt延伸的dgRNA的編輯效率，這對於在基因編輯中使用這些長引導RNA是有希望的。
編輯評估如範例1-4中所描述。RGN作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
範例 20. crRNA 的 3' 端處和 tracrRNA 的 5' 端的 LNA 修飾和核苷酸工程化改善包括縮短的第一莖和延伸的尾部的 dgRNA 的編輯效率。
如範例14和圖20和圖21所示，在crRNA的3'端和tracrRNA的5'端處工程化核苷酸取代(例如，富含G-C的取代)改善了在形成莖環1的第一莖的抗重複子處具有LNA修飾的縮短引導RNA的基因編輯效率。較短的引導主鏈將有利於基因編輯，以最大限度地減少合成非常長的引導RNA所面臨的挑戰，例如獲得足夠純度和產量的引導RNA。因此，針對基因編輯效率測試具有工程化縮短主鏈的LNA修飾的長引導RNA (引導RNA + 32 nt 延伸)。
圖36A和圖36B示出引導RNA+延伸的示意圖，以說明在crRNA的3’端和tracrRNA的5’端處的工程化核苷酸取代允許在具有延伸的引導RNA中使用縮短的引導RNA主鏈。圖36A示出具有46 nt crRNA和111 nt tracrRNA的dgRNA+延伸，而圖36B示出縮短的dgRNA+延伸(其中莖環1的第一莖減少5 bp並且莖環3的第一莖減少1 bp)具有41 nt crRNA和104 nt tracrRNA。圖36C示出針對縮短的dgRNA+延伸在crRNA的3’端和tracrRNA的5’端處的核苷酸取代的細節。星號表示在crRNA的3’端處的3個核苷酸取代以及在tracrRNA的5’端處的2個核苷酸取代。對於圖36A和圖36B所示的兩種dgRNA+延伸，抗重複子的第一莖經LNA修飾。與沒有32 nt延伸或縮短的主鏈或核苷酸工程化的原始dgRNA對應的單引導RNA用作控制組。
與先前所見的類似(參見例如圖10A和圖35)，與沒有延伸的控制組單引導RNA相比，具有如圖36C所描述的工程化的縮短主鏈但未經LNA修飾的dgRNA+延伸具有低編輯效率(圖37，圖中的「a」)。然而，具有如圖36C所描述的工程化的縮短主鏈的LNA修飾的dgRNA+ 延伸具有與無延伸的控制組單引導RNA相當的基因編輯效率(圖37，圖中的「b」)。
因此，這些實驗示出，LNA修飾改善了具有工程化縮短主鏈和延伸的尾部的gRNA的編輯效率。
編輯評估如範例1-4中所描述。RGN作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
範例 21. tracrRNA 的抗重複子的第一莖的 LNA 修飾是具有延伸的引導 RNA 的編輯效率的關鍵。
圖38示出具有各種化學修飾的雙引導RNA+延伸的示意圖：(a)在crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾、以及在tracrRNA+延伸的5’區域的三個末端核苷酸與3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾；(b)crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(c) crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、最接近尾部的莖環(此系統的莖環3)的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及在TracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(d)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3MS端；(e)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及TracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(f)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在莖環3的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(g)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3MS端；(h)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及TracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾。(g)及(h)的dgRNA+延伸具有如圖36C所描述的工程化的縮短的主鏈。使用與沒有延伸或縮短主鏈或核苷酸工程化的原始雙引導RNA相對應的單引導RNA作為控制組。
然而，無論crRNA重複子在3'端僅具有3個MS修飾，還是在整個第一莖上具有LNA修飾，無論工程化縮短與否，在抗重複子的第一莖處具有LNA修飾的dgRNA+延伸都具有與控制組單引導RNA相當的基因編輯效率(圖38，圖中的(b)、(e)和(h)條)。一旦抗重複子的第一莖完全經LNA修飾，在莖環3的第一莖處添加LNA修飾並不會進一步改善編輯效率(圖38，比較圖中的(b)條與(c)條、(e)條與(f)條)。因此，這些實驗示出，引導RNA+延伸的抗重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾是基因編輯效率的關鍵，無論crRNA重複子在3'端僅具有3個MS修飾或在整個第一莖具有LNA修飾。對於非工程化dgRNA+延伸和工程化縮短的dgRNA+延伸都是如此。綜上所述，LNA修飾可以改善較長引導RNA (例如，包括超過80、超過100或超過120 nt的tracrRNA的引導RNA，或總長度超過110、超過120、超過130、超過140、超過150、或超過160 nt的引導RNA)的編輯效率。
編輯評估如範例1-4中所描述。RGN作為編碼RGN的mRNA而被遞送(mRNA遞送)。
表 2 ：申請案的序列N：(A、C、G、U)
2’-O-Me 殘基：(A、C、G、U)
s：硫代磷酸酯主鏈修飾
LNA (鎖核酸)修飾：Ab、Cb、Gb、Ub
S-限制性乙基(cEt)修飾：(cetA)、(cetC)、(cetG)、(cetU)
cEt:限制性乙基
dgRNA:雙引導RNA
FS:第一莖
LNA:鎖核酸
MS:2'-O-甲基3'硫代磷酸酯
PS:硫代磷酸酯
RNP:核糖核蛋白
sgRNA:單引導RNA
SL:莖環
SS:第二莖
tracrRNA:轉錄活化的 CRISPR RNA
WT:原始
圖1提供顯示crRNA及tracrRNA配對的雙引導RNA (dgRNA)的示意圖。
圖2A及圖2B顯示說明單引導(sgRNA) (圖2A)及dgRNA (圖2B)的部份的示意圖。該部分包括：間隔子；包括第一莖、第一泡泡及第二莖的莖環1；只包括第一莖的莖環2；內莖環區域(ISR)；包括環、第一莖、第一泡泡、第二莖、第二泡泡及第三莖的莖環3；以及尾部。sgRNA中的莖環1包括環，而dgRNA中的莖環1不包括環。CRISPR RNA (crRNA)重複子貼合至轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)的抗重複子以形成莖環1。
圖3A及圖3B提供用於APG07433.1 RNA引導的核酸酶的dgRNA的化學修飾的描述。圖3A顯示tracrRNA修飾方案，從左到右：「莖MS修飾」，其中莖環1的第一莖包括具有2'-O-甲基(2′-O-Me)修飾的核苷酸，及具有tracrRNA分子的5’區域處的三個末端核苷酸的2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾及3’區域處的三個末端核苷酸的MS修飾及3’端的第四個核苷酸的2′-O-Me修飾的核苷酸；「大量MS修飾」 - 除了「莖MS修飾」中的修飾外，莖環3至尾部增加2’-O-Me修飾；「莖LNA修飾」 – 莖環1的第一莖含有所有LNA修飾，且3’區域處的三個末端核苷酸具有MS修飾及3’端的第四個核苷酸具有2′-O-Me修飾；「大量LNA修飾」– 除了「莖LNA修飾」中的修飾外，在莖環3的大部分區域增加2'-O-Me修飾，其中莖環3的第一及第二莖的部分被LNA修飾。圖3B顯示在這些實驗中使用的crRNA修飾的圖 – 皆含有5′及3′ MS修飾，左側顯示的形式在第一莖上還具有2'-O-Me修飾。
圖4顯示使用修飾的crRNA和修飾的tracrRNA的不同組合在初代人類T細胞中藉由使用流式細胞分析技術剔除CD3表面標記測量的基因編輯的效率。引導RNA被設計為靶向TRAC基因。這些資料證明在莖環3處的修飾消除編輯活性，而僅在莖環1處的修飾保留dgRNA的編輯能力。以與圖3A及3B相同的方案顯示此修飾。TracrRNA如圖所示。控制組sgRNA在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處均具有MS修飾。模擬組(mock)表明沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合並經歷核轉染過程。
圖5證明LNA修飾增強具有純化的APG07433.1蛋白質的RNP複合物中的dgRNA的編輯效率，其達到與sgRNA類似的編輯程度。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。控制組sgRNA及控制組dgRNA的每一者在引導RNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處均具有MS修飾。
圖6顯示LNA修飾的dgRNA促進高基因破壞率，特別是相對於僅末端修飾的dgRNA (dgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸均具有MS修飾)或以mRNA遞送方法使用兩個示例性間隔子在莖環1處具有額外的2-O'-Me修飾(MS/PS修飾)的dgRNA。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。控制組sgRNA及控制組dgRNA的每一者在引導RNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處均具有MS修飾。
圖7證明使用兩個示例性間隔子的LNA修飾的dgRNA在基因編輯中比sgRNA有更高的效力。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。控制組sgRNA在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾。
圖8A及圖8B顯示LNA修飾對於兩種不同RNA引導的核酸酶(RGN)增強sgRNA的編輯效率，其中RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。(圖8A) APG07433.1 sgRNA。「控制組_RNP」及「控制組_mRNA」表明每個遞送方法沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。(圖8B) APG01604 sgRNA。「控制組_TRAC」及「控制組_B2M」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。控制組中的兩的不同的間隔子名稱表明在流式細胞分析技術中使用抗TRAC (2275)或B2M (1989)的抗體以建立非編輯讀出。每個RGN的sgRNA使用兩個示例性間隔子。(-)：在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾的控制組sgRNA。(+)：具有額外LNA修飾的sgRNA，如每個示意圖所示。每個引導RNA示意圖顯示形成第一莖的抗重複子的區域中的LNA修飾以及sgRNA的5'及3'區域的三個末端核苷酸的MS修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估用於TRAC標的序列的編輯的CD3表面標記的剔除或用於B2M標的序列的編輯的免疫染色B2M，測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。
圖9A及圖9B顯示莖環1的MS修飾沒有增強編輯效率。圖9A描述APG07433.1 sgRNA的莖環1及/或莖環3中的2′-O-Me及/或MS修飾的八種方案。圖9B顯示相較於控制組sgRNA，具有2'-O-Me及/或MS修飾的測試的sgRNA都沒有增強sgRNA編輯。在莖環3處的化學修飾消除sgRNA活性。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。「控制組」表明每個遞送方法沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。控制組sgRNA在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。
圖10A至圖10C顯示LNA修飾的數量與初代人類T細胞中的引導RNA編輯效率相關，其使用流式細胞分析技術藉由CD3表面標記的剔除(對於TRAC標的序列)或免疫染色B2M(對於B2M標的序列)來測量。(圖10A)在形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內具有1、3、6或11個LNA修飾的核苷酸的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率。APG07433.1 dgRNA的示意圖顯示：「0 LNA @ 莖環1」情況，其包括crRNA及tracrRNA在5’端及3’端處的MS修飾；以及「LNA-修飾」情況，其包括「0 LNA」的MS修飾加上不同數量的LNA修飾的核苷酸。當形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內的所有核苷酸被LNA修飾時，達到最高編輯。(圖10B) 在形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內具有3或7個LNA修飾的核苷酸的APG01604 dgRNA的基因編輯效率。APG01604 dgRNA的示意圖顯示：「0 LNA, -」情況，其包括crRNA及tracrRNA在5’端及3’端處的MS修飾；以及「LNA-修飾」情況，其包括「0 LNA」的MS修飾加上不同數量的LNA修飾的核苷酸。(圖10C)在形成莖環1的第一莖的抗重複子的區域內具有4或9個LNA修飾的核苷酸的APG05586 dgRNA的基因編輯效率。APG05586 dgRNA的示意圖顯示：「0 LNA, -」 情況，其包括crRNA及tracrRNA在5’端及3’端處的MS修飾；以及「LNA-mod.」情況，其包括「0 LNA」的MS修飾加上不同數量的 LNA修飾的核苷酸。相較於「0 LNA」dgRNA，LNA修飾的APG01604 dgRNA及APG05586 dgRNA的基因編輯被改善。每個RGN的dgRNA使用兩個示例性間隔子。每個RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。對於gRNA中的兩個不同的間隔子，「控制組_TRAC」及「控制組_B2M」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。
圖11A至圖11C顯示LNA修飾維持或提高縮短的APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率。(圖11A)頂部：全長APG07433.1 sgRNA藉由在sgRNA的不同區域中的截斷組合而縮短：從莖環1的第一莖刪除5個核苷酸(nt)對(10 nt)及從尾部刪除6 nt (-10第一莖SL1, -6尾部)；從莖環1的第一莖刪除5 nt對(10 nt)、從尾部刪除4 nt、以及從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt) (-10第一莖SL1, -4尾部, -2第一莖SL3)；以及從莖環1的第一莖刪除5個核苷酸(nt)對(10 nt)、從尾部刪除6 nt、以及從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt) (-10 第一莖 SL1, -6尾部, -2 第一莖SL3)。這些縮短的APG07433.1 sgRNA在 sgRNA的5'區域及3'區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，且作為控制組去評估引入莖環1的第一莖的額外化學修飾。底部：縮短的APG07433.1 sgRNA如頂部所示，但在莖環1的第一莖中包括LNA及MS修飾。(圖11B)如圖11A所示的化學修飾的縮短的APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率，與控制組的全長APG07433.1 sgRNA或控制組的縮短的APG07433.1 sgRNA相比。每個控制組全長及縮短的sgRNA在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾，但在莖環1處不包含任何化學修飾。「模擬組」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中對於每個遞送方法，細胞與核轉染溶液混合且經歷核轉染過程。sgRNA以1的稀釋因子被使用。(圖11C) LNA修飾提高縮短的APG07433.1 sgRNA的編輯效力。對sgRNA進行連續稀釋。在第4天收集資料。「3MS」全長及「3MS」縮短的sgRNA如圖11A頂部所示。修飾的縮短的sgRNA如圖11A底部所示。DF = 稀釋因子。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖12A及圖12B顯示LNA修飾維持或提高具有RNP遞送的縮短的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率。「M」縮短及化學修飾方案對於sgRNA及dgRNA表現最佳。(圖12A) crRNA及tracrRNA的化學修飾及縮短方案。crRNA在3’區域處縮短5個末端nt：左，5'及3'區域的三個末端核苷酸處的MS修飾(O及Q表示使用的兩個示例性間隔子)；右，5'及3'區域的三個末端核苷酸處的MS修飾加上形成莖環1的第一莖的重複子內的2’-O-Me修飾(P及R表示使用的兩個示例性間隔子)。tracrRNA：「tracr(L)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短6 nt、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾；「tracr(M)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短4 nt、從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt)、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾；「tracr(N)」，形成莖環1的第一莖的抗重複子在5’區域處縮短5個末端nt、形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸包括LNA修飾、尾部縮短6 nt、從莖環3的第一莖刪除1 nt對(2 nt)、以及在3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。(圖12B) 如圖12A所示的化學修飾的縮短的APG07433.1 dgRNA以及如圖11A所示的化學修飾的縮短的APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率。具有非縮短主鏈的gRNA：1，具有1880間隔子的全長sgRNA，在5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在sgRNA的其他地方沒有任何化學修飾；2，具有1880間隔子的dgRNA，在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在dgRNA的其他地方沒有任何化學修飾；3，具有1881間隔子的dgRNA，在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在dgRNA的其他地方沒有任何化學修飾；4，包括crRNA cr(3)及LNA修飾的tracrRNA tracr(4)的dgRNA (參見圖3A及圖3B)，具有1880間隔子；以及5，包括crRNA cr(3)及LNA修飾的tracrRNA tracr(4)的dgRNA (參見圖3A及圖3B)，具有1881間隔子。具有縮短主鏈的sgRNA (參見圖11A)：6，莖環1的第一莖中沒有化學修飾的縮短的(L) sgRNA；7，莖環1的第一莖中沒有化學修飾的縮短的(M) sgRNA；8，莖環1的第一莖中沒有化學修飾的縮短的(N) sgRNA；9，莖環1的第一莖中具有額外化學修飾的縮短的(L) sgRNA；10，莖環1的第一莖中具有額外化學修飾的縮短的(M) sgRNA；以及11，莖環1的第一莖中具有額外化學修飾的縮短的(N) sgRNA。具有縮短主鏈的dgRNA：縮短的且化學修飾的crRNA (O、Q、P及R)以及tracrRNA (L、M、N)如圖12A所示。「控制組」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中對於每個遞送方法，細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。「模擬組」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中對於每個遞送方法，細胞與核轉染溶液混合且經歷核轉染過程。sgRNA及dgRNA使用兩個示例性間隔子。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖13顯示用於測試sgRNA形式的縮短的(「M」主鏈，參見圖11A)、化學修飾的APG07433.1 gRNA的基因編輯效率的設計。頂部：縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA以下列方式進行修飾：在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA、或LNA+PS修飾(3MS、3LNA、3LNA/PS；3個條件)且莖環1的第一莖處沒有額外的化學修飾。底部：縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA以下列方式進行修飾：在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA、或LNA+PS修飾(3MS、3LNA、3LNA/PS；3個條件)且包括莖環1的第一莖處的MS及/或LNA修飾。
圖14顯示與沒有任何化學修飾的控制組縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA比較，如圖13所示進行化學修飾的縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。在「Mod」條下方的「MS/LNA」、「LNA」及「LNA」表明分別具有3MS、3LNA或3LNA/PS修飾的縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA中莖環1的第一莖中的額外的MS及/或LNA化學修飾。
圖15顯示與沒有任何化學修飾的控制組縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA比較，如圖13所示進行化學修飾的縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA的基因編輯效率。對sgRNA進行連續稀釋。在第4天收集資料。「3MS」、「3LNA」、「3LNA PS」縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA如圖13所示。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。在「Mod」條下方的「MS/LNA」、「LNA」及「LNA」表明分別具有3MS、3LNA或3LNA/PS修飾的縮短的「M」 APG07433.1 sgRNA中莖環1的第一莖處的額外的MS及/或LNA化學修飾。
圖16A及圖16B。在5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有不同化學修飾的dgRNA的基因編輯效率。(圖16A，左)用於測試sgRNA形式的野生型(WT，全長)、化學修飾的APG07433.1 gRNA的基因編輯效率的設計。WT APG07433.1 gRNA被顯示為具有可能的化學修飾：crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA或LNA+PS修飾；抗重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾；以及tracrRNA的3’區域的三個末端核苷酸處的MS、LNA或LNA+PS修飾。(圖16A，右)顯示crRNA中的3MS、3LNA或3LNA+PS、tracrRNA中的3MS、3LNA或3LNA+PS、以及RGN的兩種遞送模式(RNP及mRNA)的各種組合給出的測試的總共18種條件的表格。(圖16B)具有如圖16A所示的化學修飾的各種組合的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率。所有測試的dgRNA具有在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LAN修飾。使用兩個示例間隔子(1880及1881)。「控制組_TRAC」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中對於每個遞送方法，細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。控制組dgRNA (「dg1880」及「dg1881」)在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在dgRNA的其他地方沒有任何化學修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質進行遞送(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖17A及圖17B顯示用於復原在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對的dgRNA的RGN系統的基因編輯的策略。圖17A顯示包括使用APG05586前驅crRNA的天然序列將在APG05586 dgRNA的莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖延長(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)2個核苷酸對以及抗重複子的延長的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾的策略。圖17B顯示使用各別的前驅crRNA的天然序列將在APG05586 dgRNA或APG08167 dgRNA的莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖延長(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)2個核苷酸對的策略。圖17B凸顯距離莖環1的第一莖中的第一泡泡最遠的APG07433.1核苷酸對(即，最接近crRNA的3'區域及tracrRNA的5'區域的核苷酸)的富含G：C特徵。在抗重複子的第一莖的所有11個核苷酸處具有LNA修飾的WT APG07433.1 dgRNA達到最高基因編輯(參見圖10A)。因此，作為替代方法，來自距離莖環1的第一泡泡最遠的APG07433.1的核苷酸序列將被使用於延長APG05586及APG08167。
圖18顯示用於RGN系統的基因編輯被復原，RGN系統藉由延長在莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖(即，延長crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸)以及以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸，而具有在莖環1的第一莖中具有＜ 11個核苷酸對的WT (原始) dgRNA。實驗中針對兩個基因進行編輯，每個標的基因有兩個重複。「控制組」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。「未修飾組」表明在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)的dgRNA，但在dgRNA的其他地方沒有化學修飾。「LNA」表明在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾加上3MS的dgRNA。「天然序列組」表明使用來自各自前驅crRNA的天然序列而具有延長至指定核苷酸長度的莖環1的第一莖的dgRNA。「APG07433.1序列」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列而具有延長至指定核苷酸長度的莖環1的第一莖的dgRNA。(指定核苷酸長度用於抗重複子的第一莖，且在用於鹼基配對的crRNA重複子的第一莖上預期具有相同的核苷酸長度。)抗重複子的延長的第一莖的所有核苷酸以LNA進行修飾，且在莖環1的第一泡泡的遠端處延長第一莖(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)。在圖下方的莖環1的第一莖中縮短的APG01604 gRNA (APG01604.1，81 nt主鏈長度)的示意圖說明「未修飾組」 APG01604.1 gRNA。資料點上方的核苷酸序列表明原始、非延長的tracrRNA (用於「未修飾組」及「LNA」)的5’末端處的4個核苷酸的序列或增加的2個末端核苷酸(延長的tracrRNA的5’末端的2個核苷酸)的序列。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖19顯示使用來自天然前驅crRNA或來自APG07433.1 gRNA的核苷酸序列在莖環1的第一泡泡的遠端處延長(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)第一莖，以及以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸，復原具有在莖環1的第一莖中具有 ＜ 11個核苷酸對的WT (原始) dgRNA的RGN系統的基因編輯。在莖環1的第一莖中dgRNA被延長至11個核苷酸對或13個核苷酸對。「天然組」表明使用來自各自前驅crRNA的天然序列而具有延長至指定核苷酸長度的抗重複子的第一莖的dgRNA。「APG07433.1」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列而具有延長至指定核苷酸長度的抗重複子的第一莖的dgRNA。(指定核苷酸長度適用於抗重複子的第一莖，且在用於鹼基配對的crRNA重複子的第一莖上預期具有相同的核苷酸長度。)抗重複子的延長的第一莖的所有核苷酸以LNA進行修飾，且在莖環1的第一泡泡的遠端處延長第一莖(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)。資料點上方的核苷酸序列表明增加的2個末端核苷酸(延長的tracrRNA的5’末端的2個核苷酸)的序列。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖20顯示藉由縮短的dgRNA來改善基因編輯效率的策略。左：WT APG07433.1 crRNA的示意圖。中：縮短的「M」 APG07433.1 crRNA及tracrRNA的示意圖。右：crRNA的3’ 3個末端核苷酸及tracrRNA的 5’ 2個末端核苷酸分別以C及G核苷酸取代(以星號標示的核苷酸)。對於縮短的(M)及工程化縮短的(M)，抗重複子的第一莖被LNA修飾。
圖21顯示藉由圖20中所示的核苷酸取代，改善縮短的「M」 APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率。測試了兩個間隔子。「原始組」表明沒有核苷酸取代的縮短的「M」 APG07433.1 dgRNA。藉由使用流式細胞分析技術評估 CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖22A及圖22B顯示形成gRNA中tracrRNA的莖環1的抗重複子的LNA修飾的策略。圖22A顯示在基因編輯中表現良好的修飾的APG07433.1 dgRNA，具有在抗重複子的第一莖(FS)中所有11個LNA修飾的核苷酸(Tracr(J)；參見圖10A)。圖22B顯示FS中及抗重複子的第二莖(SS)中的所有核苷酸被修飾的APG07433.1 tracrRNA (Tracr(Jb)；FS+SS)；抗重複子的SS中的所有核苷酸被修飾的APG07433.1 tracrRNA (Tracr(Jc)；SS)；以及抗重複子中所有核苷酸(包括第一莖、泡泡及第二莖的核苷酸)被修飾的APG07433.1 tracrRNA (Tracr(Jd)；全莖環1)。
圖23顯示與抗重複子的其他LNA修飾的策略相比，對gRNA的tracrRNA中的抗重複子的第一莖的所有核苷酸進行LNA修飾對於基因編輯是最有效的。顯示具有LNA修飾的tracrRNA的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率(圖的右側；Tracr(J)、Tracr(Jb)、Tracr(Jc)及Tracr(Jd))，如圖22A及圖22B所示。crRNA在5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)，如圖22A所示。使用兩個示例性間隔子(1880及1881)。「控制組_TRAC」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。圖左側的控制組dgRNA在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在dgRNA的其他地方沒有任何化學修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖24顯示gRNA的crRNA中的crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸的LNA修飾對基因編輯是有效的，只要gRNA的tracrRNA中的抗重複子的第一莖的所有核苷酸也是LNA修飾的(參見上圖，右側)。gRNA的crRNA中crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸具有LNA修飾，會使抗重複子的第一莖的所有核苷酸具有LNA修飾的gRNA的基因編輯惡化(參見下圖，右側)。顯示在crRNA重複子的第一莖或第二莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的APG07433.1 dgRNA的基因編輯效率：上圖的左上及左側，具有在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的crRNA及在5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)的tracrRNA的dgRNA；上圖的右上及右側，具有在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的crRNA及在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LAN修飾的tracrRNA的dgRNA；下圖的左下及左側，具有在crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的crRNA及具有3MS的tracrRNA的dgRNA；以及下圖的右下及右側，具有在crRNA重複子的第二莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的crRNA及在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的tracrRNA的dgRNA。使用兩個示例性間隔子(1880及1881)。「控制組」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖25顯示LNA修飾提高APG05586 sgRNA的編輯效力。對sgRNA進行連續稀釋。「未修飾組 」表明在5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)且沒有其他化學修飾的sgRNA。「LNA @ SL1」表明除3MS之外，在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾的sgRNA。「MS/LNA @ SL1」表明在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾、在最接近莖環1的環的crRNA重複子的三個末端核苷酸處具有MS修飾、以及具有3MS的sgRNA。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為與引導RNA複合的蛋白質(RNP遞送)或作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。對於gRNA中的兩個不同的間隔子，「控制組(TRAC)」及「控制組(B2M)」表明沒有RGN及gRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。
圖26顯示抗重複子的第一莖處的LNA修飾的數量與DNA/tracrRNA抗重複子異源二聚體的解鏈溫度(Tm)及引導RNA編輯效率相關。APG07433.1 dgRNA的示意圖顯示在形成莖環1的第一莖的抗重複子區域內的1、3、6或11個LNA修飾的核苷酸。dgRNA包括在crRNA及tracrRNA的5′及3′端處的MS修飾。當形成莖環1的第一莖的抗重複子區域內的所有核苷酸被LNA修飾時，達到最高編輯及最高Tm。X軸顯示LNA修飾數量，縱軸顯示Tm及基因編輯效率。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。基因編輯實驗中測試兩個間隔子(1062及1881)。
圖27顯示藉由延長在莖環1的第一泡泡遠端處的第一莖(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)以及以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸，具有在莖環1的第一莖中具有＜11(6)個核苷酸對的WT (原始) dgRNA (參見左示意圖)的APG07991 RGN系統的基因編輯被復原。實驗中針對兩個基因進行編輯，每個標的基因有兩個重複。「控制組」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。「未修飾組」表明在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)的dgRNA，但在dgRNA的其他地方沒有化學修飾。「LNA」表明在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾加上3MS的dgRNA。「天然組」表明使用來自APG07991前驅crRNA的天然序列而具有延長至指定核苷酸長度的莖環1的第一莖的dgRNA。「APG07433.1」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列而具有延長至指定核苷酸長度的莖環1的第一莖的dgRNA。(指定核苷酸長度適用於抗重複子的第一莖，且在用於鹼基配對的crRNA重複子的第一莖上預期具有相同的核苷酸長度。)抗重複子的延長的第一莖的所有核苷酸以LNA進行修飾，且在莖環1的第一泡泡的遠端處延長第一莖(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)。資料點上方的核苷酸序列表明原始、非延長的tracrRNA (用於「未修飾組」及「LNA」)的5’末端處的6個核苷酸的序列或增加的2個末端核苷酸(延長的tracrRNA的5’末端處的2個核苷酸)的序列。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。
圖28顯示藉由在莖環1的第一泡泡遠端處的第一莖延長至至少11個核苷酸對(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處的延長)以及以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸，可以復原APG07991 dgRNA的基因編輯效率。「控制組」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。「sgRNA」表明具有適當間隔子(TRAC或B2M)的APG07991 sgRNA控制組，間隔子在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在sgRNA的其他地方沒有任何化學修飾。數字6、8、10、11、12及13表明莖環1的第一莖的長度。「天然序列組」表明使用來自APG07991前驅crRNA的天然序列來延長WT APG07991 dgRNA的莖環1的第一莖至指定核苷酸長度。「APG07433.1序列組」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列來延長WT APG07991 dgRNA的莖環1的第一莖至指定核苷酸長度。「-」及「+」表明抗重複子的第一莖的所有核苷酸是否都被LNA修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。APG07991 RGN作為編碼APG07991 RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。使用兩個示例性間隔子(TRAC及B2M)。
圖29顯示藉由在莖環1的第一泡泡遠端處的第一莖延長至至少11個核苷酸對(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長)以及以LNA修飾抗重複子的第一莖的所有核苷酸，可以復原與APG07991 RGN一起進行基因編輯的化膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpyCas9) dgRNA的基因編輯效率。WT (原始) SpyCas9 dgRNA的莖環1的第一莖具有4個核苷酸對(參見左示意圖)，且使用APG07991 RGN的基因編輯非常低。「控制組」表明沒有RGN及dgRNA的條件，其中細胞與核轉染溶液混合但不經歷核轉染過程。「sgRNA」表明具有適當間隔子(TRAC或B2M)的SpyCas9 sgRNA控制組，間隔子在sgRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾，但在sgRNA的其他地方沒有任何化學修飾。數字4、8、11及13表明莖環1的第一莖的長度。「天然序列組」表明使用來自SpyCas9前驅crRNA的天然序列來延長WT SpyCas9 dgRNA的莖環1的第一莖至指定核苷酸長度。「APG07433.1序列組」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列來延長WT SpyCas9 dgRNA的莖環1的第一莖至指定核苷酸長度。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。APG07991 RGN作為編碼APG07991 RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。使用兩個示例性間隔子(靶向TRAC及B2M基因)。
圖30顯示形成莖環1的第一莖的抗重複子的所有核苷酸的LNA修飾賦予sgRNA更高的穩定性。左示意圖：(A) 末端修飾的sgRNA在sgRNA的5’及3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾；(B) LNA修飾的sgRNA在5’及3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾且在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾；(C) MS/LNA修飾的sgRNA在5’及3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾、在crRNA重複子的3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾、以及在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾；以及(D) MS/LNA修飾的dgRNA在crRNA的5’及3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處具有LNA修飾、以及在tracrRNA的3’區域的三個末端核苷酸具有MS修飾。與mRNA及gRNA組成的一起遞送的MS/LNA修飾的dgRNA能夠實現有效的基因編輯，但不如化學修飾的sgRNA穩定，如交錯遞送的情況所證明的。
圖31顯示使用具有LNA修飾的gRNA提高鹼基編輯效率。測試的gRNA如圖30所述。圖中的A、B、C及D對應於左示意圖中所示的A、B、C及D。
圖32顯示使用具有LNA修飾的gRNA及具有LNA修飾的縮短的gRNA提高鹼基編輯效率。圖中沒有LNA、LNA及MS/LNA對應於左示意圖中所示的沒有LNA、LNA及MS/LNA。「shrt」表明縮短的sgRNA。使用具有兩個示例性間隔子(SGN001880及SGN001881)的gRNA。
圖33顯示以另一橋接核酸(BNA) cEt修飾的dgRNA的基因編輯效率提高至可與LNA修飾的dgRNA的基因編輯效率相比較的程度。在形成莖環1的第一莖的抗重複子內具有11個LNA修飾的核苷酸的APG07433.1 dgRNA (如左上示意圖所示，亦參見圖10A)的基因編輯效率與在形成莖環1的第一莖的抗重複子內具有11個S-限制性乙基(cEt)-修飾的核苷酸的APG07433.1 dgRNA (如左下示意圖所示)的基因編輯效率進行比較。「未修飾組」表明在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)的dgRNA，但在dgRNA的其他地方沒有化學修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色B2M (用於B2M標的序列的編輯)，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。APG07433.1 RGN作為編碼APG07433.1 RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。使用兩個示例性間隔子(TRAC及B2M)。
圖34顯示在莖環1的第一泡泡遠端的第一莖延長且以另一橋接核酸(BNA) cEt進行化學修飾的dgRNA的基因編輯效率提高至可與相同延長的且以LNA修飾的dgRNA的基因編輯效率相比較的程度。APG05586 dgRNA在莖環1的第一泡泡的遠端處的第一莖延長至11個核苷酸對(即，在crRNA的3'末端核苷酸及tracrRNA的5'末端核苷酸處延長；參見圖18及圖19)且抗重複子的第一莖的所有核苷酸以LNA (如左上示意圖所示)或以S-限制性乙基 (cEt) (如左下示意圖所示)進行修飾。「APG05586的天然序列組」表明使用來自APG05586 前驅crRNA的天然序列來延長WT APG05586 dgRNA的莖環1的第一莖至11個核苷酸。「APG07433.1序列組」表明使用來自APG07433.1 gRNA的序列來延長WT APG05586 dgRNA的莖環1的第一莖至11個核苷酸。「原始組」表明在莖環1的第一莖中具有9個核苷酸對的WT APG05586 dgRNA未被延長。「未修飾組」表明在crRNA及tracrRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸處具有MS修飾(3MS)的dgRNA，但在dgRNA的其他地方沒有化學修飾。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除(用於TRAC標的序列的編輯)或免疫染色 B2M (用於B2M標的序列的編輯)，測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。APG05586 RGN作為編碼APG05586 RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。使用兩個示例性間隔子(TRAC及B2M)。
圖35顯示LNA修飾改善具有延伸的dgRNA的基因編輯效率。圖35的上方顯示說明三中化學修飾的dgRNA的示意圖，其在tracrRNA的尾部有延伸：(a) crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾、以及tracrRNA+延伸的5’區域的三個末端核苷酸處及3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾(3MS端)；(b) crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(c) crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、最接近tracrRNA尾部的莖環(即，所示系統的莖環3)的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾。圖中標記為「單」的左側條表明對應於不具有延伸的dgRNA，在引導RNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處具有MS修飾且沒有LNA修飾的控制組的單引導RNA的基因編輯效率。控制組單引導RNA作為沒有延伸的引導RNA的基因編輯效率的基準。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。SL1 = 莖環1。SL3 = 莖環3。
圖36A至圖36C顯示具有延伸的引導RNA及縮短的引導RNA的工程細節的示意圖。圖36A，無工程化的引導RNA + 延伸具有：長度為46 nt (間隔子 + 21 nt crRNA重複子)的crRNA；以及長度為79 nt (85 nt WT 長度從尾部減去 6 nt)的tracrRNA。圖36B，縮短的引導RNA + 具有縮短的crRNA/tracrRNA 主鏈的延伸且具有：長度為41 nt (間隔子 + 16 nt 縮短的crRNA重複子)的crRNA；以及長度為72 nt 的tracrRNA。圖36C，工程化縮短的crRNA及tracrRNA (除了沒有延伸之外)的示意圖，其顯示crRNA的3′ 3個末端核苷酸及tracrRNA的 5’ 2個末端核苷酸以C及G核苷酸取代(以星號標示的核苷酸)。對於圖36A及圖36B中所示的dgRNA + 延伸，抗重複子的第一莖被LNA修飾。
圖37顯示LNA修飾改善縮短的dgRNA + 延伸的基因編輯效率，縮短的dgRNA + 延伸是在crRNA的3′端及tracrRNA的5′端處的核苷酸取代進行工程化。a，dgRNA +延伸，具有工程化縮短的主鏈，且具有在crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾，及在tracrRNA+延伸的5’區域的三個末端核苷酸與3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾；以及b，dgRNA + 延伸，具有工程化縮短的主鏈，且具有crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾。圖中標記為「單」的左側條表明不具有延伸或縮短的主鏈或核苷酸工程化、在引導RNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處具有MS修飾、以及沒有LNA修飾的控制組的單引導RNA的基因編輯效率。控制組單引導RNA作為沒有延伸或縮短的主鏈或核苷酸工程化的引導RNA的基因編輯效率的基準。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。SL1 = 莖環1。SL3 = 莖環3。
圖38顯示抗重複子的第一莖處的LNA修飾是dgRNA + 延伸的編輯效率的關鍵。(a) 在crRNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾、以及在tracrRNA+延伸的5’區域的三個末端核苷酸與3’區域的三個末端核苷酸(3MS端)處的MS修飾；(b) crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(c) crRNA的3MS端、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、最接近tracrRNA尾部的莖環(即，此系統中的莖環3)的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(d) 在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3MS端；(e)在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(f) 在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在莖環3的第一莖的4個核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾；(g) 在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及tracrRNA+延伸的3MS端；(h) 在crRNA的5’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾、在crRNA重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、在抗重複子的第一莖的所有核苷酸處的LNA修飾、以及在tracrRNA+延伸的3’區域的三個末端核苷酸處的MS修飾。(g)及(h)的dgRNA + 延伸具有如圖36C所示工程化的縮短的主鏈。圖中標記為「單」的左側條表明不具有延伸或縮短的主鏈或核苷酸工程化、在引導RNA的5’區域及3’區域的三個末端核苷酸(3MS)處具有MS修飾、以及沒有LNA修飾的控制組的單引導RNA的基因編輯效率。控制組單引導RNA作為沒有延伸或縮短的主鏈或核苷酸工程化的引導RNA的基因編輯效率的基準。藉由使用流式細胞分析技術評估CD3表面標記的剔除，以測量初代人類T細胞中的基因編輯效率。在第4天收集資料。RGN作為編碼RGN的mRNA進行遞送(mRNA遞送)。SL1 = 莖環1。SL3 = 莖環3。
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Claims (239)
- 一種核酸分子，包括一轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)，其中該tracrRNA包括： (a) 一抗重複子； (b) 一尾部；以及 (c) 最接近該尾部的一莖環， 其中該tracrRNA的該抗重複子包括一第一莖和一第二莖，以及其中該tracrRNA包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
- 如請求項1所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
- 如請求項1或請求項2所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
- 如請求項3所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二、三、四、五、六或七個BNA修飾。
- 如請求項3或請求項4所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項1或請求項2所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
- 如請求項1至請求項6中任一項所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾不在該tracrRNA的一突起內。
- 如請求項1至請求項7中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項1至請求項7中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項1至請求項9中任一項所述的核酸分子，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
- 如請求項10所述的核酸分子，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
- 如請求項10或請求項11所述的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
- 如請求項10或請求項11所述的核酸分子，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
- 如請求項1至請求項13中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA 進一步包括至少一其他化學修飾。
- 如請求項14所述的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
- 如請求項14或請求項15所述的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
- 如請求項14所述的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
- 如請求項14至請求項17中任一項所述的核酸分子，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項18所述的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾。
- 如請求項18所述的核酸分子，其中該tracrRNA的該尾部的三個末端核苷酸包括MS修飾，以及該抗重複子的該第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項20所述的核酸分子，其中該BNA修飾包括LNA修飾。
- 如請求項20所述的核酸分子，其中該BNA修飾包括cEt修飾。
- 如請求項1至請求項22中任一項所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
- 如請求項1至請求項22中任一項所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
- 如請求項1至請求項22中任一項所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
- 如請求項1至請求項22中任一項所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖包括6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
- 如請求項1至請求項26中任一項所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5'區域包括來自一天然前驅物CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
- 如請求項27所述的核酸分子，其中該抗重複子的該第一莖在該5'區域包括一富含GC的核苷酸序列，其中該5'區域包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個G或C。
- 如請求項1至請求項28中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA包括60-80 nt、80-100 nt、100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt或超過180 nt的一總長度。
- 如請求項1至請求項29中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709及713中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項1至請求項29中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項1至請求項29中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及 711中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項1至請求項29中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項1至請求項33中任一項所述的核酸分子，其中該tracrRNA是能夠與一RGN結合的一gRNA 的一部分。
- 如請求項34所述的核酸分子，其中該RGN是一第II型RGN。
- 如請求項34或請求項35所述的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項34或請求項35所述的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項34或請求項35所述的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項34或請求項35所述的核酸分子，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA)以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)， 其中該crRNA包括：i) 一間隔子；以及 ii) 包括一第一莖及一第二莖的一crRNA重複子， 其中該tracrRNA包括：i) 一尾部；以及 ii) 包括一第一莖及一第二莖的一抗重複子， 以及其中該crRNA以及該tracrRNA的至少其中之一包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
- 如請求項40所述的gRNA，其中該gRNA是一單引導RNA (sgRNA)。
- 如請求項41所述的gRNA，其中該sgRNA包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度。
- 如請求項40所述的gRNA，其中該gRNA是一雙引導RNA (dgRNA)。
- 如請求項40至請求項43中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子內。
- 如請求項40至請求項43中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
- 如請求項40至請求項43中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該crRNA重複子的該第一莖中的至少兩個連續BNA修飾。
- 如請求項45或請求項46所述的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項45或請求項46所述的gRNA，其中在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項40至請求項48中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該crRNA重複子的該第二莖內。
- 如請求項40至請求項44中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子內。
- 如請求項50所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該抗重複子的該第一莖內。
- 如請求項51所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括該抗重複子的該第一莖內連續核苷酸上的至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三個BNA修飾、或交替核苷酸上的至少二、三、四、五、六或七個BNA修飾。
- 如請求項51或請求項52所述的gRNA，其中該抗重複子的該第一莖內的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項50所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該抗重複子的該第二莖內。
- 如請求項40至請求項54中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾不在該gRNA的一突起內。
- 如請求項40至請求項55中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該tracrRNA的該尾部內。
- 如請求項56所述的gRNA，其中在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項56所述的gRNA，其中在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的該三個末端核苷酸包括BNA修飾以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項40至請求項58中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域中的至少三個末端核苷酸以及該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項40至請求項59中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖中的所有核苷酸缺乏化學修飾，並且該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項40至請求項60中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾在該間隔子內。
- 如請求項61所述的gRNA，其中在該間隔子的該5'區域處的三個末端核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項40至請求項62中任一項所述的gRNA，其中該間隔子的長度為18-30個核苷酸。
- 如請求項40至請求項63中任一項所述的gRNA，其中該至少一BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
- 如請求項64所述的gRNA，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNA NC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
- 如請求項64或請求項65所述的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
- 如請求項64或請求項65所述的gRNA，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
- 如請求項40至請求項67中任一項所述的gRNA，其中該gRNA 進一步包括至少一其他修飾。
- 如請求項68所述的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA內。
- 如請求項68或請求項69所述的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域或該3’區域內。
- 如請求項68或請求項69所述的gRNA，其中該至少一其他修飾在該crRNA的該5’區域及該3’區域內。
- 如請求項68至請求項71中任一項所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該crRNA重複子內。
- 如請求項68至請求項72中任一項所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA重複子的該第一莖內。
- 如請求項68至請求項73中任一項所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該crRNA的該間隔子內。
- 如請求項68所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA內。
- 如請求項75所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子內。
- 如請求項75或請求項76所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖內。
- 如請求項75所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾在該tracrRNA的該尾部內。
- 如請求項68至請求項78中任一項所述的gRNA，其中該至少一其他化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；以及硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項79所述的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾。
- 如請求項79或請求項80所述的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾，並且該crRNA重複子的該第一莖的剩餘核苷酸包括2'-O-Me修飾。
- 如請求項40至請求項81中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
- 如請求項40至請求項81中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括最多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的一總長度。
- 如請求項40至請求項81中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括約11個核苷酸的一總長度。
- 如請求項40至請求項81中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖或該抗重複子的該第一莖包括 6-15個核苷酸、8-13個核苷酸或10-12個核苷酸的一總長度。
- 如請求項40至請求項81中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3'區域處或該抗重複子的該第一莖在該5'區域處包括來自一天然前驅物 CRISPR RNA (前驅crRNA)的一核苷酸序列或一富含GC的核苷酸序列。
- 如請求項86所述的gRNA，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3'區域處或該抗重複子的該第一莖在該5'區域處包括一富含GC的核苷酸序列，其中該crRNA重複子的該第一莖在該3'區域處或該抗重複子的該第一莖在該5'區域處包括至少2、至少3、至少4或至少5個G或C。
- 如請求項79所述的gRNA，其中該crRNA的該5’區域及該3’區域處的三個末端核苷酸包括MS修飾、BNA修飾或BNA+PS修飾。
- 如請求項40至請求項88中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列： (a) SEQ ID NO：39或與SEQ ID NO：39有1或2個不同核苷酸者； (b) SEQ ID NO：384或與SEQ ID NO：384有1或2個不同核苷酸者； (c) SEQ ID NO：385 或與SEQ ID NO：385有1或2個不同核苷酸者； (d) SEQ ID NO：386 或與SEQ ID NO：386有1或2個不同核苷酸者； (e) SEQ ID NO：387或與SEQ ID NO：387有1或2個不同核苷酸者；或 (f) SEQ ID NO：397或與SEQ ID NO：397有1或2個不同核苷酸者。
- 如請求項89所述的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：4-9、42-44、292、293、380-382、399-401及708中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項89或請求項90所述的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：10、12、51-53、294、295、383、709以及 713中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項40至請求項88中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列所示的一核苷酸序列： (a) SEQ ID NO：300或與SEQ ID NO：300 有1或2個不同核苷酸者； (b) SEQ ID NO：304或與SEQ ID NO：304 有1或2個不同核苷酸者； (c) SEQ ID NO：308或與SEQ ID NO：308 有1或2個不同核苷酸者； (d) SEQ ID NO：312或與SEQ ID NO：312 有1或2個不同核苷酸者； (e) SEQ ID NO：320或與SEQ ID NO：320 有1或2個不同核苷酸者； (f) SEQ ID NO：344或與SEQ ID NO：344 有1或2個不同核苷酸者； (g) SEQ ID NO：348或與SEQ ID NO：348 有1或2個不同核苷酸者； (h) SEQ ID NO：352或與SEQ ID NO：352 有1或2個不同核苷酸者； (i) SEQ ID NO：356或與SEQ ID NO：356 有1或2個不同核苷酸者； (j) SEQ ID NO：360或與SEQ ID NO：360 有1或2個不同核苷酸者； (k) SEQ ID NO：388或與SEQ ID NO：388 有1或2個不同核苷酸者； (l) SEQ ID NO：389或與SEQ ID NO：389 有1或2個不同核苷酸者；或是 (m) SEQ ID NO：390或與SEQ ID NO：390 有1或2個不同核苷酸者。
- 如請求項92所述的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：73-75、301-303、305-307、309-311、313-315、321-323、345-347、349-351、353-355、357-359及 361-363中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項92或請求項93所述的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：80、81、364-367、369及375-379中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項40至請求項88中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列： (a) SEQ ID NO：324或與SEQ ID NO：324 有1或2個不同核苷酸者； (b) SEQ ID NO：328或與SEQ ID NO：328 有1或2個不同核苷酸者； (c) SEQ ID NO：332或與SEQ ID NO：332 有1或2個不同核苷酸者； (d) SEQ ID NO：336或與SEQ ID NO：336 有1或2個不同核苷酸者； (e) SEQ ID NO：391或與SEQ ID NO：391 有1或2個不同核苷酸者； (f) SEQ ID NO：392或與SEQ ID NO：392 有1或2個不同核苷酸者；以及 (g) SEQ ID NO：393或與SEQ ID NO：393 有1或2個不同核苷酸者。
- 如請求項95所述的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：97-99、325-327、329-331、333-335及337-339中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項95或請求項96所述的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：102、103、370-373、710及711中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項40至請求項88中任一項所述的gRNA，其中該crRNA重複子具有下列任一者所示的一核苷酸序列： (a) SEQ ID NO：465或與SEQ ID NO：465 有1或2個不同核苷酸者； (b) SEQ ID NO：469或與SEQ ID NO：469 有1或2個不同核苷酸者； (c) SEQ ID NO：473或與SEQ ID NO：473 有1或2個不同核苷酸者； (d) SEQ ID NO：477或與SEQ ID NO：477 有1或2個不同核苷酸者； (e) SEQ ID NO：481或與SEQ ID NO：481 有1或2個不同核苷酸者； (f) SEQ ID NO：508或與SEQ ID NO：508 有1或2個不同核苷酸者； (g) SEQ ID NO：512或與SEQ ID NO：512 有1或2個不同核苷酸者；以及 (h) SEQ ID NO：516或與SEQ ID NO：516 有1或2個不同核苷酸者。
- 如請求項98所述的gRNA，其中該crRNA具有與SEQ ID NO：466-468、470-472、474-476、478-480、482-484、509-511、513-515及517-519中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項98或請求項99所述的gRNA，其中該tracrRNA具有與SEQ ID NO：499-501、504、505、534、535及537中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項40至請求項100中任一項所述的gRNA，其中該 crRNA以及該tracrRNA藉由該crRNA重複子的3’末端核苷酸及該抗重複子的5’末端核苷酸之間的一連接子連接。
- 如請求項101所述的gRNA，其中該連接子包括一疊氮官能基或一炔官能基。
- 如請求項101所述的gRNA，其中該連接子是一多核苷酸。
- 如請求項103所述的gRNA，其中該連接子具有AAAG、GAAA、ACUU或CAAAGG所示的一核苷酸序列。
- 如請求項103或請求項104所述的gRNA，其中該連接子具有AAAG所示的一核苷酸序列。
- 如請求項103至請求項105中任一項所述的gRNA，其中該gRNA是包括該crRNA以及該tracrRNA的一sgRNA，其中該sgRNA包括一主鏈以及該間隔子，以及其中該sgRNA的該主鏈包括該crRNA重複子、該連接子及該tracrRNA。
- 如請求項106所述的gRNA，其中該sgRNA的該主鏈具有與SEQ ID NO：35-37、296及297中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一核苷酸序列。
- 如請求項106所述的gRNA，其中該sgRNA具有SEQ ID NO：25-30、60-68、86-88、108-110、298、299及405-407中任一者所示的該核苷酸序列。
- 如請求項40至請求項108中任一項所述的gRNA，其中該gRNA 能夠結合至一RGN。
- 如請求項109所述的gRNA，其中該RGN 是一第II型RGN。
- 如請求項109或請求項110所述的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項109或請求項110所述的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項109或請求項110所述的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：93具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項109或請求項110所述的gRNA，其中該RGN包括與SEQ ID NO：252具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項40至請求項114中任一項所述的gRNA，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 一種包括一CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，該crRNA包括： (a) 一間隔子；以及 (b)一crRNA重複子， 其中該crRNA重複子能夠與一tracrRNA的一抗重複子雜交以形成包括一莖環的一引導RNA (gRNA)，該莖環包括透過該crRNA重複子和該抗重複子的雜交形成的一第一莖及一第二莖，以及其中該crRNA包括至少一化學修飾，其中該至少一化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及一BNA修飾；以及其中該至少一化學修飾在該crRNA的該5' 區域或3' 區域處的三個末端核苷酸內。
- 一種包括一CRISPR RNA (crRNA)的核酸分子，包括： (a) 一間隔子；以及 (b) 包括一第一莖及一第二莖的一crRNA重複子， 其中該crRNA包括至少一化學修飾，其中該至少一化學修飾選自由下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及一BNA修飾；以及其中該至少一化學修飾在該crRNA的該5' 區域或3' 區域處的三個末端核苷酸內。
- 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括： a) 如請求項1至請求項39中任一項所述的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)； b) 一crRNA；以及 c) 一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
- 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括： a) 如請求項116或請求項117所述的CRISPR RNA (crRNA)； b) 一tracrRNA；以及 c) 一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
- 如請求項118或請求項119所述的RGN系統，其中該crRNA以及該tracrRNA 形成一引導RNA。
- 一種RNA引導的核酸酶(RGN)系統，其中該RGN系統包括： a) 如請求項40至請求項115中任一項所述的gRNA；以及 b) 一第II型RGN多肽或包括編碼該第II型RGN多肽的一核苷酸序列的一多核苷酸。
- 如請求項118至請求項121中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽辨識具有NNNNCC、NNGRR、NNRYA或NGG所示的一核苷酸序列的一共通前間隔序列鄰近模體 (PAM)。
- 如請求項118至請求項122中任一項所述的RGN系統，其中該gRNA是包括100-120 nt、120-140 nt、140-160 nt、160-180 nt、180-200 nt、或超過200 nt的一總長度的一sgRNA。
- 如請求項118至請求項123中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO：1、69、93或252中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 如請求項118至請求項124中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽以及該gRNA在自然界中並未發現彼此複合。
- 如請求項118至請求項125中任一項所述的RGN系統，其中該RGN系統結合一標的核酸分子中的一標的序列。
- 如請求項126所述的RGN系統，其中該標的序列是一真核標的序列。
- 如請求項126或請求項127所述的RGN系統，其中該標的序列具有SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的該核苷酸序列。
- 如請求項126至請求項128中任一項所述的RGN系統，其中該標的序列在一細胞中。
- 如請求項126至請求項129中任一項所述的RGN系統，其中該gRNA和該RGN多肽的一複合物執行該標的序列的切割。
- 如請求項130所述的RGN系統，其中該切割產生一雙股斷裂。
- 如請求項130所述的RGN系統，其中該切割產生一單股斷裂。
- 如請求項118至請求項129中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽是核酸酶不活化的。
- 如請求項118至請求項129中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽是一切口酶。
- 如請求項118至請求項129中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
- 如請求項135所述的RGN系統，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
- 如請求項118至請求項129中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽與一先導編輯多肽融合。
- 如請求項137所述的RGN系統，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
- 如請求項138所述的RGN系統，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
- 如請求項137至請求項139中任一項所述的 RGN系統，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 如請求項118至請求項140中任一項所述的RGN系統，其中該RGN多肽與一可檢測標記融合。
- 如請求項118至請求項132中任一項所述的RGN系統，其中該RGN系統 進一步包括一 供體多核苷酸。
- 如請求項118至請求項142中任一項所述的RGN系統，其中包括編碼該RGN的一核苷酸序列的該多核苷酸是一mRNA。
- 如請求項118至請求項142中任一項所述的RGN系統，其中編碼該RGN多肽的該核苷酸序列可操作地連接至一異源啟動子。
- 如請求項118至請求項142中任一項所述的RGN系統，其中包括編碼該RGN多肽的一核苷酸序列的該多核苷酸在一載體內。
- 一種核糖核蛋白 (RNP)複合物，包括如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統。
- 一種細胞，包括如請求項1至請求項39中任一項所述的包括一tracrRNA的核酸分子、如請求項40至請求項115中任一項所述的gRNA、如請求項116或請求項117所述的crRNA、如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統、或如請求項146所述的RNP複合物。
- 如請求項147所述的細胞，其中該細胞包括能夠被如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統的一形成的crRNA/tracrRNA/RGN多肽或gRNA/RGN多肽複合物或被如請求項146所述的RNP複合物結合的一標的序列。
- 如請求項147或請求項148所述的細胞，其中該標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712中任一者所示的一核苷酸序列。
- 如請求項147至請求項149中任一項所述的細胞，其中該細胞是一原核細胞。
- 如請求項147至請求項149中任一項所述的細胞，其中該細胞是一真核細胞。
- 如請求項151所述的細胞，其中該真核細胞是一初代細胞。
- 如請求項152所述的細胞，其中該初代細胞是一T細胞。
- 如請求項151所述的細胞，其中該真核細胞是一植物細胞。
- 一種植物，包括如請求項154所述的細胞。
- 一種種子，包括如請求項154所述的細胞。
- 一種醫藥組成物 ，包括一藥學上可接受的載體以及如請求項1至請求項39中任一項所述的 tracrRNA、如請求項40至請求項115中任一項所述的gRNA、如請求項116或請求項117所述的 crRNA、如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統、如請求項146所述的RNP複合物、或如請求項147至請求項153中任一項所述的細胞。
- 一種用於結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，包括將如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統或如請求項146所述的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞。
- 如請求項158所述的方法，其中該RGN多肽或該gRNA進一步包括一可檢測標記，從而允許該標的序列的檢測。
- 如請求項158或159所述的方法，其中該RGN多肽或該gRNA進一步包括一表現調節子，從而調節包括該標的序列的一標的基因的表現。
- 一種用於切割及/或修飾包括一標的序列的一標的核酸分子的方法，該方法包括將如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統或如請求項146所述的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞，其中發生該標的核酸分子的切割或修飾。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括： a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合： i) 包括如請求項1至請求項39中任一項所述的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)及一CRISPR RNA (crRNA)的一引導RNA (gRNA)；以及 ii) 一第II型RGN， 從而組裝一RNP複合物； 以及 b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與該組裝的RNP複合物接觸， 從而以該RGN結合該標的序列。
- 如請求項162所述的方法，其中該組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
- 如請求項158至請求項162中任一項所述的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
- 如請求項164所述的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
- 如請求項165所述的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
- 如請求項164至請求項166中任一項所述的方法，其中該gRNA 進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 如請求項158至請求項162中任一項所述的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
- 如請求項168所述的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與i)包括如請求項1至請求項39中任一項所述的轉錄活化的crRNA (tracrRNA)及一CRISPR RNA (crRNA)的一引導RNA (gRNA)；以及 ii)一第II型RGN或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
- 如請求項170所述的方法，其中該gRNA和該第II型RGN的一形成的複合物執行該標的序列的切割。
- 如請求項170所述的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
- 如請求項172所述的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
- 如請求項173所述的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
- 如請求項172至請求項174中任一項所述的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 如請求項170所述的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
- 如請求項176所述的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
- 如請求項170所述的方法，其中編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括： a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合： i) 如請求項40至請求項115中任一項所述的引導RNA (gRNA)；以及 ii) 一第II型RNA引導的核酸酶(RGN)， 從而組裝一RNP複合物； 以及 b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與該組裝的RNP複合物接觸， 從而以該RGN結合該標的序列。
- 如請求項179所述的方法，其中該組裝的RNP複合物執行該標的序列的切割。
- 如請求項179所述的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
- 如請求項181所述的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
- 如請求項179所述的方法，其中該RGN與一先導編輯多肽融合。
- 如請求項183所述的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
- 如請求項184所述的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
- 如請求項183至請求項185中任一項所述的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞i)如請求項40至請求項115中任一項所述的引導RNA (gRNA)；以及 ii)一第II型RGN或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
- 如請求項187所述的方法，該gRNA和該第II型RGN的一形成的複合物執行該標的序列的切割。
- 如請求項187所述的方法，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽融合。
- 如請求項189所述的方法，其中該鹼基編輯多肽包括一去胺酶。
- 如請求項187所述的方法，其中該RGN 與一先導編輯多肽融合。
- 如請求項191所述的方法，其中該先導編輯多肽包括一DNA聚合酶。
- 如請求項192所述的方法，其中該DNA聚合酶包括一反轉錄酶。
- 如請求項191至請求項193中任一項所述的方法，其中該gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 如請求項187所述的方法，其中編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括： a) 在適合形成一核糖核蛋白(RNP)複合物的條件下結合： i) 包括如請求項116或請求項117的一CRISPR RNA (crRNA)和一tracrRNA的一引導RNA (gRNA)；以及 ii) 一第II型RGN， 從而組裝一RNP複合物； 以及 b) 使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與該組裝的RNP複合物接觸， 從而以該RGN結合該標的序列。
- 一種以一RNA引導的核酸酶(RGN)結合一標的核酸分子中的一標的序列的方法，該方法包括使該標的核酸分子或包括該標的核酸分子的一細胞與i)包括如請求項116或請求項117的一CRISPR RNA (crRNA)和一tracrRNA的一引導RNA (gRNA)；以及 ii)一第II型RGN 或編碼一第II型RGN的一多核苷酸接觸，從而以該RGN結合該標的序列。
- 如請求項197所述的方法，其中編碼該第II型RGN的該多核苷酸是一mRNA。
- 如請求項158至請求項198中任一項所述的方法，其中該標的序列包括SEQ ID NO：273-278及712的任一者所示的該核苷酸序列。
- 如請求項162至請求項199中任一項所述的方法，其中該RGN包括與SEQ ID NO：1、69、93或252中任一者具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或100%序列一致性的一胺基酸序列。
- 一種提高切割及/或修飾包括一標的序列的一核酸分子的效率的方法，該方法包括將如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統或如請求項146所述的RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞，其中，相較於藉由包括將一參考RGN系統或RNP複合物遞送至該標的序列或至包括該標的序列的一細胞的方法對該核酸分子的切割或修飾，該核酸分子的切割或修飾以更高的效率發生，其中該參考RGN系統或RNP複合物中的一tracrRNA、一gRNA或一crRNA不包括一橋接核酸(BNA)修飾或不包括任何化學修飾。
- 如請求項201所述的方法，其中如請求項146所述的RNP複合物或如請求項118至請求項145中任一項所述的RGN系統的該tracrRNA的該抗重複子的該第一莖的所有核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項202所述的方法，其中在該crRNA的該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸包括BNA修飾。
- 如請求項201所述的方法，其中該BNA修飾包括LNA修飾。
- 如請求項201所述的方法，其中該BNA修飾包括cEt修飾。
- 如請求項201至請求項205中任一項所述的方法，其中切割及/或修飾該標的序列的該效率增加15倍至30倍。
- 如請求項206所述的方法，其中切割及/或修飾該標的序列的該效率是藉由測量該標的序列或包括該標的序列的細胞的百分比來確定，該標的序列具有由該標的序列編碼的一多肽或該標的序列的一改變的表現。
- 如請求項207所述的方法，其中藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜法(LC/MS)、質譜法或其組合來測量該表現。
- 一種工程化一gRNA的方法，該方法包括： a) 提供包括一crRNA和一tracrRNA的一gRNA，其中該crRNA包括一crRNA重複子以及該 tracrRNA包括一抗重複子；以及 b) 添加或取代該crRNA重複子中的一或更多核苷酸以及該抗重複子中的一或更多核苷酸，其中在該重複子中添加或取代的該一或更多核苷酸以及在該抗重複子中添加或取代的該一或更多核苷酸能夠彼此雜交，其中該添加或取代的一或更多核苷酸包括至少2、至少3、至少4或至少5個G或C，並且其中該工程化的gRNA與步驟a)中提供的該gRNA相比具有一增加的編輯效率。
- 如請求項209所述的方法，其中該一或更多核苷酸是1、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。
- 如請求項209或請求項210所述的方法，其中該添加或取代的一或更多核苷酸在該crRNA重複子的該3’區域中及該抗重複子的該5’區域中，並且其中該crRNA重複子的該3’區域及該抗重複子的該5’區域包括至少2、至少3、至少4或至少5個G或C。
- 如請求項209至請求項211中任一項所述的方法，其中該gRNA是一dgRNA。
- 如請求項209至請求項211中任一項所述的方法，其中該gRNA是一sgRNA。
- 如請求項209至請求項213中任一項所述的方法，進一步包括： c) 以至少一化學修飾來修飾該工程化的gRNA中的至少一核苷酸，該至少一化學修飾選自下列組成的群組：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾；2'-O-甲氧基-乙基(2'MOE)修飾；2'-氟(2'-F)修飾；2'F-4'Cα-OMe修飾；2',4'-二-Cα-OMe修飾；2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)修飾；2'-O-甲基3'硫代膦醯基乙酸酯(MSP)修飾；2'-O-甲基3'膦醯基乙酸酯(MP)修飾；硫代磷酸酯 (PS)修飾；以及BNA修飾。
- 如請求項214所述的方法，其中該至少一化學修飾在該crRNA、該tracrRNA或兩者中。
- 如請求項215所述的方法，其中該至少一化學修飾在下列中：該crRNA重複子；該抗重複子；該tracrRNA的一尾部；該crRNA重複子及該抗重複子；或該crRNA重複子、該抗重複子以及該tracrRNA的該尾部。
- 如請求項215所述的方法，其中該至少一化學修飾在下列中：該crRNA重複子的一第一莖；該抗重複子的一第一莖；該tracrRNA的一尾部；該crRNA重複子的該第一莖及該抗重複子的該第一莖；或該crRNA重複子的該第一莖、該抗重複子的該第一莖、以及該tracrRNA的該尾部。
- 如請求項217所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中。
- 如請求項218所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 個核苷酸上。
- 如請求項218所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的連續核苷酸上。
- 如請求項218所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的交替核苷酸上。
- 如請求項218所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上。
- 如請求項222所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上。
- 如請求項222所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該crRNA重複子的該第一莖中的至少一核苷酸上。
- 如請求項222所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上且在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸上。
- 如請求項222所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上、在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少三個末端核苷酸上、且在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上。
- 如請求項222所述的方法，其中該至少一化學修飾是在該抗重複子的該第一莖中的所有核苷酸上、在該tracrRNA的該尾部的該3’區域處的三個末端核苷酸上、且在該crRNA重複子的該第一莖的該3’區域處的至少一個核苷酸上。
- 如請求項214至請求項227中任一項所述的方法，其中該至少一化學修飾包括一BNA修飾。
- 如請求項228所述的方法，其中該BNA修飾包括一2′,4′ BNA修飾。
- 如請求項229所述的方法，其中該2′,4′ BNA修飾選自由下列組成的群組：鎖核酸(LNA)修飾、BNANC[N-Me]修飾、2′-O,4′-C-乙烯橋接核酸(2′,4′-ENA)修飾、以及S-限制性乙基(cEt)修飾。
- 如請求項230所述的方法，其中該2′,4′ BNA是一LNA修飾。
- 如請求項230所述的方法，其中該2′,4′ BNA是一cEt修飾。
- 如請求項209至請求項232中任一項所述的方法，其中，相較於包括步驟a)中提供的gRNA的該RGN系統，藉由包括該工程化的gRNA的一RGN系統切割及/或修飾一標的序列的效率增加至少10%、至少30%、至少50%、至少70%、至少90%、至少100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
- 如請求項233所述的方法，其中該效率是藉由測量該標的序列或包括該標的序列的細胞的百分比來確定，該標的序列具有由該標的序列編碼的一多肽或該標的序列的一改變的表現。
- 如請求項234所述的方法，其中藉由定量PCR、微陣列、RNA定序、流式細胞分析技術、免疫墨點法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白質免疫沉澱法、免疫染色、高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜法(LC/MS)、質譜法或其組合來測量該表現。
- 如請求項209至請求項235中任一項所述的方法，其中該工程化的gRNA進一步包括一延伸，該延伸包括用於先導編輯的一編輯模板。
- 一種藉由請求項209至請求項236中任一項所述的方法產生的工程化的gRNA。
- 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA)以及一轉錄活化的CRISPR RNA (tracrRNA)， 其中該crRNA包括一crRNA重複子， 其中該tracrRNA包括一抗重複子， 其中該gRNA包括一莖環，該莖環包括一第一莖及一第二莖， 其中該第一莖包括約11個鹼基對的一總長度， 以及其中該第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
- 一種引導RNA (gRNA)，包括一CRISPR RNA (crRNA)以及一轉錄活化的 CRISPR RNA (tracrRNA)， 其中該crRNA包括一crRNA重複子， 其中該tracrRNA包括一抗重複子， 其中該gRNA包括一莖環，該莖環包括一第一莖及一第二莖， 其中該第一莖包括至少3、4、5、6或7個GC鹼基對， 以及其中該第一莖包括至少一橋接核酸(BNA)修飾。
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