DE69326017T2 - Antibiotische zubereitung und die verwendung gegen bakterielle infektionen - Google Patents
Antibiotische zubereitung und die verwendung gegen bakterielle infektionenInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Biochemie und Medizin und insbesondere eine Liposomenformulierung. Genauer betrifft sie eine Liposomenformulierung, die ein Aminoglycosid enthält, ihr Herstellungsverfahren und ihre Verwendung. Diese Erfindung bezieht sich auf Formulierungen mit verringerter Toxizität, längerer Stabilität und besserer Wirksamkeit. Diese Erfindung betrifft weiterhin Liposomenformulierungen, die Amikacin enthalten und ihre Verwendung für die Behandlung medikamtentempfindlicher und medikamentenresistenter Stämme bakterieller Infektionen.
- Die Entdeckung der Aminoglycoside begann in den 40er Jahren mit der Isolierung von Strepotomycin aus Streptomyces griseus. Seit den 40er Jahren sind weitere Aminoglycoside entdeckt und synthetisiert worden. Diese umfassen Neomycin, welches aus Streptomyces fradiae erhalten oder isoliert wird; Kanamycin, das aus Streptomyces kanamyceticus isoliert wird; Gentamicin, das aus Micromonospora purpurea synthetisiert wird; Tobramycin, das aus Streptomyces tenedrarius isoliert wird; Sisomicin, isoliert aus micromonospora inyoesis; Amikacin, welches ein semisynthetisches Derivat von Kanamycin A ist; und Netilmicin, welches ein semisynthetisches Derivat von Sisomicin ist. Von allen Aminoglycosiden besitzt Amikacin das breiteste Spektrum antimikrobieller Aktivität. Es besitzt außerdem eine einzigartige Widerstandsfähigkeit gegenüber den immunoglycosidinaktivierenden Enzymen.
- Die Aminoglycoside sind polare Kationen, die aus zwei oder mehr Aminozuckern bestehen, die in glycosidischer Bindung mit einem Hexosekern, normalerweise in zentraler Stellung, verbunden sind. Die Aminoglycoside werden in erster Linie verwendet, um durch gram-negative Bakterien verursachte Infektionen zu behandeln. In den letzten Jahren sind jedoch Aminoglycoside auch verwendet worden, um Bakterien des Genus Mycobacterium zu behandeln. Es hat sich z. B. gezeigt, daß Amikacin gegen Mycobacterium tuberculosis wirksam ist. Die Aminoglycoside wurden auch erprobt gegen M. avium- Infektionen, einschließlich M. avium-intracellulare-Komplex (MAC), der aus einer Gruppe verwandter säurebeständiger Organismen besteht, die nur geringfügig schneller als M. tuberculosis wachsen und in eine Anzahl Serotypen unterteilt werden können. Beginn des 20ten Jahrhunderts war Tuberkulose die vorherrschende Todesursache in den Vereinigten Staaten. Ende der 40er Jahre, mit Einzug des Streptomycins, hatten die Tuberkuloseinfektionen deutlich abgenommen. Seit Mitte der 80er Jahre, mit dem Auftreten von AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) trat die Tuberkulose wieder als ein Hauptgesundheitsproblem in Erscheinung. Außerdem zeigten sich die neuen Tuberkulosefälle gegen viele der zur Verfügung stehenden Antibiotikatherapien resistent. Auf ähnliche Weise ist das früher als selten betrachtete MAC nun eine der meistverbreiteten systemischen Bakterieninfektionen bei Patienten, die unter AIDS leiden. Die Suche nach einem wirksamen Antibiotikum hat sich seither intensiviert.
- Obwohl die Aminoglycoside bei der Behandlung von Infektionen nutzbringend verwendet werden können, ist die Verwendung dieser Antibiotika nicht frei von toxischen Effekten und Nebenwirkungen. Aminoglycoside können eine irreversible vestibulare, cochleare und renale Toxizität hervorrufen. Die beiden toxischen Hauptwirkungen der Aminoglycoside sind Ototoxizität und Nephrotoxizität. Untersuchungen haben ergeben, daß die Aminoglycosid-Antibiotika Polyurie, verminderte Harnosmolalität, Proteinurie, Enzymurie, Glycosurie, sowie eine Abnahme der glomerulären Filtrationsgeschwindig keit verursachen können. Einige Forscher nehmen an, daß die Nephrotoxizität aus der Akkumulation der Aminoglycoside in der Nierenrinde (Cortex renes) resultiert, wegen der langen Halbwertszeit der Stoffe in diesem Gewebe.
- Liposome sind mikroskopische Vesikel, die zum Teil aus Phospholipiden bestehen und bei Dispergieren in Wasser geschlossene, flüssigkeitsgefüllte Kügelchen bilden. Phospholipidmoleküle sind polar und besitzen einen hydrophilen ionisierbaren Kopf und zwei hydrophobe Schwänze aus langen Fettsäureketten. Wenn daher genügend Phospholipidmoleküle in Wasser vorhanden sind, lagern sich die Schwänze spontan unter Wasserausschluß zusammen, während die hydrophilen Phosphatköpfe in Wechselwirkung mit dem Wasser treten. Das Ergebnis ist eine zweischichtige Membran, in der die Fettsäureschwänze in dem neugebildeten Membraninneren zusammenlaufen und die polaren Köpfe in den entgegengesetzten Richtungen zu einem wässrigen Medium hin zeigen. Diese zweischichtigen Membranen können dazu gebracht werden, geschlossene Kugeln zu bilden, die als Liposomen bekannt sind, Die polaren Köpfe an der inneren Oberfläche der Membran zeigen zu dem wässrigen Inneren des Liposoms. An der entgegengesetzten Oberfläche der kugelförmigen Membran stehen die polaren Köpfe in Wechselwirkung mit dem umgebenen wässrigen Medium. Bei Bildung der Liposome können wasserlösliche Moleküle in das wässrige Innere eingebracht werden, während lipophile Moleküle dazu neigen in die Lipiddoppelschicht eingelagert zu werden. Liposome können entweder multilamellar ausgebildet sein, wie eine Zwiebel, mit zahlreichen flüssigkeitsgetrennten Lipiddoppelschichten, oder unilamellar mit einer einzelnen Doppelschicht, die eine im Ganzen flüssige Mitte umgibt.
- Es gibt viele Arten von Liposomenherstellungsverfahren, die angewendet werden können und die verschiedene Liposomen- Typen erzeugen. Diese können je nach der Verwendung, den einzuschließenden Chemikalien und der Lipidart, die zur Bildung der Doppelschichtmembran verwendet wird, ausgewählt werden. Die Erfordernisse, die bei der Durchführung einer Liposomenpräparation berücksichtigt werden müssen, sind denen bei anderen Mechanismen für kontrollierte Freigabe ähnlich. Es sind die folgenden:
- (1) Chemikalieneinschluß mit hohem Prozentsatz; (2) erhöhte chemische Stabilität; (3) niedrige chemische Toxizität; (4) schnelles Herstellungsverfahren; und (5) reproduzierbare Größenverteilung.
- Das erste beschriebene Verfahren für die Einkapselung chemischer Stoffe in Liposomen umfaßte die Herstellung multilamellarer Vesikel (MLVs). Verfahren zum Einkapseln chemischer Substanzen in MLVs sind im Stand der Technik bekannt.
- Liposomen können auch als unilamellare Vesikel (UVs) gebildet werden, die im allgemeinen eine Größe von unter 1 um haben. Es gibt im Stand der Technik verschiedene Techniken, die verwendet werden, um unilamellare Liposomen herzustellen.
- Kleinere unilamellare Vesikel können mit einer Vielzahl von Techniken gebildet werden. Durch Auflösen von Phospholipiden in Ethanol und Injizieren dieser Lösung in einen Puffer, orientieren sich die Lipide spontan in unilamellare Vesikel um. Dies stellt ein einfaches Verfahren zur Herstellung von UVs dar, die ähnliche Innenvolumina besitzen, wie diejenigen, die durch Sonifizieren erzeugt werden (0,2 -0,5 l/mol/Lipid). Beschallung oder Extrusion (durch Filter) von MLVs ergibt ebenfalls UV-Dispersionen mit Durchmessern von bis zu 0,2 um, die als klare oder durchscheinende Suspensionen in Erscheinung treten.
- Ein weiteres übliches Verfahren zur Herstellung kleiner UVs ist die Detegentien-Entfernungstechnik. Phospholipide werden in ionischen oder nichtionischen Detergentien wie Cholsäuresalzen, Triton X, oder n-Alkylglucosiden aufgelöst. Das Medikament wird dann mit den solubilisierten Lipid- Detergentien-Micellen gemischt. Das Detergenz wird durch eines von mehreren Verfahren entfernt: Dialyse, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Zentrifugation, Ultrafiltration. Die Größenverteilung und der Einschlußgrad der auf diese Weise erzeugten UVs variiert in Abhängigkeit der Details der verwendeten Technik.
- Die therapeutische Verwendung von Liposomen umfaßt die Verabreichung von Arzneistoffen, die normalerweise in der freien Form toxisch sind. In liposomaler Form kann das toxische Mittel möglicherweise von dem empfindlichen Gewebe weggeführt und ausgewählten Gebieten gezielt zugeführt werden. Liposome können auch therapeutisch verwendet werden, um Arzneimittel über einen längeren Zeitraum freizugeben und hierdurch die Häufigkeit der Verabreichung herabzusetzen. Außerdem erhält man mit Liposomen ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion hydrophober Arzneimittel für die intravenöse Verabreichung.
- Wenn die Liposomen für eine gezielte Zuführung eingekapselter Arzneimittel zu ausgewählten Empfängergeweben und weg von empfindlichen Geweben verwendet werden (Targeting), können verschiedene Techniken Anwendung finden. Diese Verfahren umfassen die Beeinflussung der Liposomengröße, ihrer Nettooberflächenladung, sowie der Zuführungsrouten. Insbesondere umfassen die Einflußnahmemöglichkeiten auch ein Markieren der Liposomen mit Rezeptoren oder Antikörpern für bestimmte Zielorte im Körper.
- Der Zufuhrweg der Liposomen kann ihre Verteilung im Körper ebenfalls beeinflussen. Die passive Zuführung der Liposomen umfaßt die Verwendung verschiedener Verabreichungswege, z. B. intravenös, subkutan und topisch. Jede Route bewirkt Unterschiede in der Lokalisierung der Liposomen. Zwei übliche Verfahren, die verwendet werden, um die Liposomen aktiv in ausgewählte Bereiche zu richten, bestehen darin, entweder Antikörper oder spezifische Rezeptorliganden an die Oberfläche der Liposomen zu binden. Von Antikörpern ist bekannt, daß sie eine hohe Spezifität für ihr zugehöriges An tigen besitzen, und es konnte gezeigt werden, daß sie an die Oberfläche von Liposomen gebunden werden können und so die Targetspezifität des in den Liposomen eingeschlossenen Arzneimittels erhöhen.
- Da die chemische Zusammensetzung vieler Arzneimittel ihre intravenöse Verabreichung verbietet, können Liposomen sehr nützlich dabei sein, diese Arzneimittel für die intravenöse Applikation anzupassen. Viele hydrophobe Arzneimittel, einschließlich von Cyclosporinen, fallen in diese Kategorie, weil sie nicht ohne weiteres in einem Medium auf wässriger Basis aufgelöst werden können und in Alkoholen oder oberflächenaktiven Mitteln aufgelöst werden müssen, von denen sich gezeigt, hat, daß sie in vivo toxische Reaktionen auslösen. Liposomen, die aus Lipiden mit oder ohne Cholesterol bestehen, sind nicht toxisch. Da Liposomen außerdem aus amphipathischen Molekülen bestehen, können sie hydrophile Arzneistoffe in ihrem Innenraum und hydrophobe Moleküle in ihrer Lipiddoppelschicht einschließen. Obwohl Verfahren zur Herstellung von Liposomen im Stande der Technik wohlbekannt sind, ist es nicht immer möglich, eine funktionsfähige Formulierung ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand zu bestimmen.
- Liposomale Formulierungen, die Aminoglycoside enthalten, sind bereits hergestellt worden. Viele dieser Zubereitungen umfassen Aerosolformulierungen mit MLVs. Andere Formulierungen enthalten große Anteile negativ geladener Lipide, im allgemeinen mehr als 20%, um die Retentionszeit oder die Zirkulationshalbwertszeit zu erhöhen. Zu den mit Aminoglycosid-Liposomformulierungen verbundenen Problemen gehört eine kurze Retentionszeit des Systems aufgrund einer RES- Aufnahme. Im Stand der Technik versuchte Formulierungen ergaben auch instabile Aminoglycosidliposome - sowohl bei Lagerung als auch im Serum.
- Es ist daher ein erwünschtes Ziel, eine neue Formulierung bereitzustellen, die die Retentionszeit eines Aminoglyco sids in einem Säugersystem erhöhen kann und die mehr des Arzneistoffs mit größerem Wirkungsgrad bei geringerer Toxizität als bei dem freien Wirkstoff zuführen kann. Es ist außerdem erwünscht, ein Verfahren zur Verfügung zu bekommen, das die Herstellung einer klaren, stabilen und wirksamen Aminoglycosid-Liposomensuspension erlaubt, da die auf übliche Weise hergestellten, nicht in der Lage sind, eine therapeutisch wirksame, unilamellare Aminoglycosid- Liposomen-Formulierung mit einer mittleren Partikelgröße von weniger als 100 nm, vorzugsweise mit einem hohen Wirkstoff-zu-Gesamtlipidverhältnis zu erzeugen.
- Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die beigefügten Ansprüche definiert.
- Dadurch werden Liposomen verfügbar gemacht, welche ein Aminoglycosid aufweisen, wobei die Liposomen unilamellar sind und eine durchschnittliche Größe von 100 nm oder weniger besitzen. Es wird ein Liposomenformulierung bereitgestellt, welche ein Aminoglycosid umfaßt, wobei die Liposomen aus einem neutralen Lipid, einen Sterol und einem negativ geladenen Lipid bestehen. Es werden auch kleine unilamellare Vesikel bereitgestellt, bei denen der molare Anteil negativ geladener Lipide kleiner als 20% des Gesamtlipids ist. Eine bevorzugte Formulierung besteht aus Liposomen mit einem Aminoglycosid, wobei die Liposomen unimellare Vesikel mit einer durchschnittlichen Größe von 30 nm bis 100 nm sind und weiterhin aus einem Phosphatidylcholin, Cholesterol und einem Phosphatidylglycerol bestehen, wobei der molare Anteil des Phosphatidylglycerol weniger als 5% und vorzugsweise etwa 3% beträgt. Das Wirkstoff-zu-Gesamtlipidverhältnis liegt zwischen 1 : 9 und 1 : 3 mit einem bevorzugten Verhältnis von etwa 1 : 4. Auch wird eine bevorzugte Formulierung bereitgestellt, die Liposomen aufweist, welche ein Aminoglycosid umfassen, wobei die Liposomen unilamellare Vesikel mit einer durchschnittlichen Größe von weniger als 100 nm sind, wobei die Lipide gehärtetes (hydriertes) Sojaphosphatidylcholin, Cholesterol und Distearoylphosphatidyl glycerol in einem molaren Verhältnis von etwa 2 : 1 : 0,1 aufweisen.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglycosidliposomen, wie in den angefügten Ansprüchen definiert.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Behandlung bakterieller Infektionen in Säugern mit einer liposomalen Formulierung die ein Aminoglycosid umfaßt, wobei die Liposomen die oben beschriebenen sind, die zur Infektionsbehandlung verwendet werden, indem eine therapeutisch wirksame Menge der Liposomen in einen Säuger eingeführt wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher die Verwendung der liposomalen Aminoglycosidformulierungen für die Behandlung bakterieller Infektionen. Die behandelten bakteriellen Infektionen umfassen opportunistische aerobe gram-negative Bazillen, wie den Stamm Pseudomonas. Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt die Verwendung der liposomalen Formulierungen bei der Behandlung einer von P. aeroginosa verursachten bakteriellen Infektion. Das Verfahren zur Behandlung bakterieller Infektionen ist nicht auf gram-negative Infektionen beschränkt. Die Liposomenformulierungen können zur Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden, die grampositive Bazillen aufweisen, wie den Stamm Mycobacterium. Die Erfindung ist insbesondere nützlich für die Behandlung von Mycobakterien, die tuberkuloseartige Krankheiten verursachen. Mit den vorstehend beschriebenen Liposomen können zahlreiche Bakterien behandelt werden. Diese Bakterien umfaßten: M. tuberculosis, M. leprae, M. Intracellulare, M. smegmatis, M. bovis, M. kansasil, M. avium, M. scrofulcium, oder M. africanum. Liposomenformulierungen aus Aminoglycosiden sind auch besonders gut verwendbar bei der Behandlung von MAC.
- Ein besonders nützliches Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung einer medikamentenresistenten bakteriellen Infektion in einem Patienten, wel ches die Verabreichung einer wirksamen Menge an Liposomen an einen Patienten umfaßt, die ein eingekapseltes Aminoglycosid enthalten, wobei die Liposomen aus unilamellaren Vesikeln bestehen, die aus einem neutralen Lipid, Cholesterol und einem negativ geladenen Lipid bestehen und eine mittlere Größe von weniger als 100 nm besitzen. In vitro durchgeführte Experimente bestätigen, daß liposomales Amikacin medikamentenresistente M. tuberculosis inhibiert und abtötet. Die durchgeführten Experimente belegen weiter, daß liposomales Amikacin M. tuberculosis abtötet, während der freie Wirkstoff bei entsprechenden Dosen oder Konzentrationen das Wachstum der Bakterien nur inhibiert. Abtötung ist definiert als Abnahme der Anzahl kolonienbildender Bakterieneinheiten von einem vorausgegangenen Zeitpunkt an. Inhibierung ist definiert als eine Zunahme oder gleichbleibende Anzahl der kolonienbildenden Einheiten der Bakterien von einem vorausgegangenen Zeitpunkt an, die jedoch geringer ist als die Anzahl kolonienbildender Einheiten, die sich zu den entsprechenden Zeitpunkten bei unbehandelten Kulturen zeigt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher die Abtötung der Bakterien bei tolerierbaren nicht toxischen Leveln in Fällen, in denen die Bakterien gegenüber Aminoglycosiden und anderen Antibiotika resistent sind oder in welchen der freie Wirkstoff bestenfalls eine inhibierende Wirkung zeigt.
- Die vorliegende Erfindung zeigt auch, daß liposomales Amikacin signifikant länger als freies Amikacin im Blutplasma gehalten wird. Durch die vorliegende Erfindung wird eine intermittierende Behandlung nicht-kooperativer Patienten erzielt, da die vorliegende Erfindung höhere Serum- Spitzenkonzentrationen, längere Serumhalbwertszeiten und erhöhte Aufnahme und Retention durch Macrophagen bewirkt.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren für die Behandlung auf Medikamte ansprechender M. tuberculosis durch Verabreichung einer wirksamen Menge liposomalen Amikacins an einen Patienten, wobei die Konzentrationen durch die Dosen die Inhibierung oder das Abtöten bei Leveln, die gleich oder größer als bei freien Amikacinen sind, ermöglichen. Die Vorteile, die durch die verminderte Toxizität und die erhöhten Serumkonzentrationen des durch liposomales Amikacin verabreichten Amikacins bereitgestellt werden, ergeben eine vorteilhafte und nützliche Alternative zu einer Behandlung mit freiem (nicht eingekapselten) Amikacin.
- Viele, wenn nicht alle der o. g. Mycobakterieninfektionen sind schwierig zu behandeln, weil die Bakterien in Phagocyten, wie z. B. Macrophagen eindringen. Die Anwendung liposomaler ein Aminoglycosid enthaltender Formulierungen führt zu einer intrazellulären Freigabe des Wirkstoffs, die bei Verabreichung des freien Wirkstoffs normalerweise nicht eintreten würde. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher eine Behandlung infizierter Phagocyten in Säugern, indem eine therapeutische oder wirksame Menge eines Aminoglycosids mit Hilfe eines unilamellaren Liposoms mit einer mittleren Größe von 100 nm oder weniger in einen Macrophagen abgegeben wird.
- Es wird hier eine liposomale Amikacinformulierung bereitgestellt, die an einen Säuger verabreicht werden kann und die die folgenden Vorteile gegenüber freiem Amikacin aufweist: 1) deutlich höhere Dosen des Amikacins werden den Infektionsorten zugeführt; 2) erheblich geringere Toxizität; und 3) Retention im Blutplasma über einen signifikant längeren Zeitraum.
- Der Begriff "Liposom", wie hier verwendet, bezieht sich auf unilamellare Vesikel oder multilamellare Vesikel, wie z. B. in US-PS 4 753 788 und 4 935 171 beschrieben, deren Inhalt unter Bezugnahme hier miteinbezogen wird.
- Die vorliegende Erfindung stellt eine liposomale Aminoglycosidformulierung bereit, die vorzugsweise ein neutrales Lipid, wie z. B. ein Phosphatidycholin enthält, ein Phosphatidyglycerol, Cholesterol (CHOL) und Amikacin. Das bevorzugte Lipid umfaßt Lipide, die chemisch rein sind und/oder vollständig gesättigt. Die bevorzugten neutralen Lipide sind gesättigte Lipide, wie z. B. hydriertes (gehärtetes) Ei-Phosphatidylcholin (HEPC), gehärtetes Soja- Phosphatidylcholin (HSPC), Distearoyl-Phosphatidylcholin (DSPC) und Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin (DPPC). Die bevorzugten Längen der Kohlenstoffketten des neutralen Lipids reichen von C&sub1;&sub6;-C&sub1;&sub8;. Die bevorzugten negativ geladenen Lipide sind gesättigte Lipide, wie z. B. hydriertes Soja- Phosphatidylglycerol (HSPG), gehärtetes Ei- Phasphatidylglycerol (HEPG), Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), Dimyristoylphosphatidylcholin. Gehärtetes Soja- Phosphatidylcholin (HSPC) und Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG) sind die bevorzugten Lipide, die bei der Erfindung verwendet werden. Andere geeignete Phosphatidylcholine umfassen solche, die aus pflanzlichen Quellen oder Eiern erhalten werden, oder solche, die teilweise oder im Ganzen synthetisch sind. Ander Phosphatidylglycerole, die verwendet werden können, sind gesättigte semisynthetische Lipide mit Kohlenstoffkettenlänge von C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8; und umfassen Dimyristoyl-Phosphatidylglycerol (DMPG) und Dilaurylphosphatidylglycerol (DLPG).
- Die bevorzugte Formulierung umfaßt Liposomen, die ein eingekapseltes Aminoglycosid aufweisen, wobei die Liposomen unilamellare Vesikel mit einer mittleren Größe von weniger als 100 nm sind, die wenigstens zwei Wochen bei 22ºC ohne signifikante Größenänderung oder ohne Verlust von mehr als 10% des eingekapselten Aminoglycosids haltbar sind. Im allgemeinen variiert die Größe der Liposomen um nicht mehr als 30% und besonders vorzugsweise um nicht mehr als 20%. Das bevorzugte Verhältnis von HSPC : CHOL : DSPG beträgt etwa 2 : 1 : 0,1 und das Wirkstoff-zu-Gesamtlipidverhältnis beträgt etwa 1 : 4. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen DSPG in einem molaren Anteil von 0 bis 20% und besonders bevorzugt in einem molaren Anteil von weniger als 5%. Andere bevor zugte Fomulierungen umfassen Formulierungen, in denen das Wirkstoff-zu-Gesamtlipidverhältnis zwischen 1 : 9 und 1 : 3 beträgt.
- Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Herstellung einer Lösung, aus der die Liposomen gebildet werden. Eine Menge eines Phosphatidylcholins, eines Phosphatidylglycerols und von Cholesterol wird in einem organischen Lösungsmittel unter Bildung einer klaren Lösung aufgelöst, vorzugsweise in einer Mischung, einer 1 : 1 (Volumen) Mischung von Chloroform und Methanol. Ander Lösungsmittel (und Mischungen daraus), wie z. B. Ether, Ethanol und andere Alkohole können verwendet werden. Die bevorzugte Temperatur für das Auflösen der Lipide liegt zwischen Raumtemperatur und 60ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Die Lösung wird eingedampft, um einen Lipidfilm oder ein Lipidpulver zu ergeben. Für die Bildung eines Lipidfilmes werden die Lösungsmittel unter Stickstoff zwischen Raumtemperatur und 60ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur, eingedampft. Für die Bildung eines Lipidpulvers wird die Mischung der Lipide in Lösung gemäß vorstehender Beschreibung mit einem Sprühtrockner versprüht. Vorzugsweise geschieht das Sprühen unter Stickstoff.
- Ein Aminoglycosid, z. B. die freie Amikacinbase, wird in einem wässrigen Phosphatpuffer mit 9% Saccharose gelöst und der pH-Wert zwischen 6 und 8, vorzugsweise zwischen 6 und 7,5 und weiter vorzugsweise zwischen 6,2 und 6,6 eingestellt. Der bevorzugte pH-Wert beträgt etwa 6,4. Der Puffer kann auch auf einen pH-Wert von etwa 7,4 eingestellt werden. Der pH-Wert des Puffers wird mit verdünnten Säuren und Basen, vorzugsweise mit 6 N HCl und 2,5 N NaOH eingestellt. Der bevorzugte Puffer ist 10 mM Phosphatpuffer. Es können jedoch andere wässrige Puffer verwendet werden, wie z. B. Succinatpuffer (Dinatriumsuccinat-Hexahydrat). Die Aminoglycosidlösung wird entweder mit dem Lipidfilm oder dem Lipidpulver gemischt und hydratisiert, vorzugweise zwischen 40ºC und 65ºC, höchst vorzugsweise zwischen 45ºC und 65ºC.
- Die Lösung sollte über wenigstens 10 Minuten hydratisiert werden.
- Unilamellare Vesikel bilden sich durch Anwendung von Scherkräften auf die hydratisierte Lösung, z. B. durch Extrusion, Beschallung oder die Verwendung eines Homogenisierungsgeräts, wie z. B. eines Gaulin-Homogenisierers oder einer French-Press. Die Scherkraft kann auch aufgebracht werden mittels Injektion, Gefrieren und Tauen, Abdialysieren einer Detergentienlösung von den Lipiden oder anderen bekannten Methoden, die zur Herstellung von Liposomen verwendet werden. Die Größe der Liposomen kann mit Hilfe einer Vielzahl bekannter Verfahren gesteuert werden, einschließlich der Dauer der Scherkraftanwendung. Vorzugsweise wird der modifizierte Gaulin-Homogenisierer, der in US-Patent 4 753 788 beschrieben ist, für die Erzeugung unilamellarer Vesikel mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm bei einem Druck von 7000 bis 13000 psi und einer Temperatur deutlich unter der Übergangstemperatur der Lipide verwendet.
- Die vorstehend beschriebenen Formulierungen sind besonders nützlich für die Behandlung von MAC und Pseudomonas aeruginosa-Infektionen. Die Verwendung der oben beschriebenen Formulierungen zeigt, daß MAC mit bedeutend mehr Amikacin, das in einer liposomalen Formulierung verabreicht wird, behandelt werden kann, als mit dem freien Wirkstoff. Es konnte z. B. gezeigt werden, daß bis zu 320 mg Amikacin je Kilogramm Körpergewicht einer Maus verwendet werden können, was mehr als 50% mehr ist, als bei dem freien Wirkstoff toleriert wird. Die Verwendung der o. g. Formulierungen zeigt auch an, daß eine liposomale Formulierung in der Lage ist, bei der Behandlung von P. aeruginosa einem Säuger signifikant mehr Amikacin zuzuführen als von dem freien Wirkstoff.
- Mittels einer liposomalen Formulierung verabreichtes Amikacin wird auch im Plasma länger zurückgehalten als das freie Amikacin.
- Die oben beschriebenen Formulierungen sind auch wirksam bei der Inhibierung und Abtötung sowohl von drogenresistenten als auch auf Medikamte ansprechender M. tuberculosis- Stämme, wie durch in vitro-Untersuchungen belegt wurde. In einem Experiment wurde der zu M. tuberculosis zählende medikamentenresistente Stamm Vertulla untersucht. In einem weiteren Experiment wurde der auf Medikamente ansprechende Stamm H37RV untersucht. Die Experimente wurden durchgeführt wie in Beispiel 6 beschrieben. Kurz gesagt wurden von humanen Monocyten abgeleitete Macrophagen-Kulturen entwickelt und entweder mit dem medikamentenresistenten Stamm oder dem auf Medikamente ansprechenden Stamm infiziert. Liposomales Amikacin wurde, wie unten in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Liposomen enthielten HSPC, Cholesterol und DMPG in einem molaren Verhältnis von etwa 2 : 1 : 0,1. Das Wirkstoff-zu-Gesamtlipidverhältnis betrug 1 : 4 (etwa 25%). Die mittlere Größe der Liposomen lag unter 100 nm.
- Bei dem mit dem empfindlichen Stamm durchgeführten Experiment wurden liposomales und freies Amikacin in den folgenden Konzentrationen (ug/ml) zu den Kulturen zugegeben: 1, 2 und 4. Unbehandelte Kuturen und mit reinen Liposomen behandelte Kulturen wurden als Vergleichsproben verwendet. Die Kulturen wurden 0, 4 und 7 Tage nach der Infektion untersucht. Die 1 ug/ml-Konzentrationen sowohl des freien Amikacins als auch des liposomalen Amikacins inhibierten das Wachstum der Bakterien, wobei das liposomale Amikacin eine größere Inhibierung und auch Abtötung an Tag 4 zeigte. Die 2 ug/ml-Konzentrationen sowohl des freien Amikacins als auch des liposomalen Amikacins waren ebenfalls wirksam bei der Behandlung der Infektion, wobei das liposomale Amikacin an Tag 4 eine Abtötung erzielte und der freie Wirkstoff eine Inhibierung. Die 4 ug/ml-Konzentrationen sowohl des liposomalen als auch des freien Amikacins bewirkten an Tag 4 eine Abtötung, wobei das liposomale Amikacin eine stärkere Abtötung zeigte. Das liposomale Amikacin bewirkt daher eine vorteilhaftere Behandlung von M. tuberculosis, weil die vorliegende Erfindung eine wenigstens äquivalente Inhibie rung und Abtötung bei ähnlichen Konzentrationen wie das freie Amikacin bewirkt, bei geringerer Toxizität und längere Plasma-Retentionszeit.
- Bei dem an dem resistenten Stamm durchgeführten Experiment wurden liposomales und freies Amikacin den Kulturen in folgenden Konzentrationen (ug/ml) zugegeben: 4, 8 und 16. Unbehandelte Kulturen, die nur mit Liposomen behandelt wurden, wurden als Vergleichsproben verwendet. Die Kulturen wurden 0,4 und 7 Tage nach der Infektion durchgetestet. Das liposomale Amikacin erreichte bei den 4 ug/ml-, 8 ug/ml- bzw. 16 ug/ml-Konzentrationen an Tag 4 ein Bakterienwachstum von wenigstens dem 21-fachen, 64-fachen und einige 100- fachen (z. B. 563x) weniger als die unbehandelte Vergleichsprobe. Diese Aktivität war 8,7-, 12,9- und 130mal effektiver als bei den entsprechenden Konzentrationen an freiem Amikacin.
- An Tag 7 erreichte das liposomale Amikacin ein Bakterienwachstum von wenigstens dem 100-fachen (z. B. 133x), 1000- fachen (z. B. 1110x) und mehrere 1000-fachen (z. B. 5880x) weniger als die unbehandelte Kontrollprobe. Diese Aktivität war 41-, 11,9- und 46mal wirksamer als bei den entsprechenden Amikacinkonzentrationen.
- Die Ergebnisse zeigen, daß freies Amikacin das Wachstum der Infektion nur inhibieren kann, ohne eine Abtötung bei den untersuchten Konzentrationen. Das liposomale Amikacin sorgte für ein Abtöten der medikamentenresistenten Bakterien bei allen Konzentrationen am Tag 4. Das liposomale Amikacin bewirkte daher ein hohes Ausmaß an Abtötung, wo nur ein inhibierender Effekt gegenüber dem medikamentenresistenten Stamm erwartet wurde.
- Da der Praktiker auf dem Gebiet der Medizin die Dosierungsvorschriften für Aminoglycoside gut kennt, sind die Mengen der liposomalen Aminoglycosidformulierung, die für eine Infektionsbehandlung in Säugern und insbesondere Menschen wirksam sind, für den Fachmann erkennbar.
- Diese Erfindung wird noch besser verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Verdeutlichung der Erfindung dienen, die sie jedoch nicht beschränken sollen. Die Beispiele 1 bis 6 beschreiben genauer die Bildung und sowohl die chemische als auch die biologische Untersuchung der liposomalen Amikacinformulierungen gemäß der Erfindung.
- Es wurde eine Lipidmischung aus gehärtetem Soja-PC, Cholesterol und Distearoylphosphatidylglycerol in einem molaren Verhältnis von 2 : 1 : 0,1 hergestellt. Die Lipide wurden in Chloroform und Methanol (im Volumenverhältnis 1 : 1) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde gerührt bis sich die Lipide aufgelöst hatten und eine klare Lösung erhalten wurde. Die Mischung wird am besten bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch Eindampfen der organischen Lösungsmittel unter Stickstoff bei Raumtemperatur wurde ein Lipidfilm erhalten.
- Amikacin als freie Base wurde in 10 mM Phosphatpuffer mit 9% Saccharose aufgelöst und der pH-Wert mit 6,0 m HCL auf 7,4 eingestellt. Der Lipidfilm und die Amikacinlösung wurden so vermischt, daß die Konzentration des Arzneimittels etwa 250 mg/ml und die Konzentration des Lipids etwa 100 mg/ml betrug. Die erhaltene Lösung wurde 10 bis 15 Minuten lang bei 65ºC gerührt und hydratisiert. Die Lösung wurde 20 Minuten unter Verwendung eines Probensonicators (Modell 300 Sonic & Material) beschallt. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 65ºC belassen. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 10 Minuten bei 3600 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und über eine Sephadex G-50-Säule laufen gelassen, um die Liposomenformulierung von dem freien Wirkstoff zu trennen. Die Konzentration des Amikacin und der Lipidbestandteile wurde durch HPLC-Untersuchung bestimmt. Die Größe wurde durch optische Teilchengrößebestimmung festgestellt. Die Größe der Liposomen variierte von Experiment zu Experiment zwischen etwa 40 bis 100 nm. Bei einem Experiment wurde beispielsweise ein mittlerer Durchmesser von 62,1 nm beobachtet. Bei einem anderen Experiment ein mittlerer Durchmesser von 47,4 nm. Eine bevorzugte Formulierung enthält ein Wirkstoff-zu-Lipidverhältnis von 1 : 4.
- Es wurde eine Lipidlösung in Methanol und Chloroform hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. In einem Sprühtrockner wurde ein Lipidpulver erhalten (Yamamoto Pulvis Basic Unit, Model GB-21). Die folgenden Einstellungen wurden verwendet: 1) Pumpenanzeige bei 3-4, 5; 2) Absauganzeige bei 6; 3) Druck bei 1,5-2 Kgf/cm²s; 4) Einlaßtemperatur bei 50ºC; und 5) Auslaßtemperatur bei 40ºC. Das Versprühen fand zwei Stunden unter Stickstoff statt. Das Pulver wurde gesammelt und mit der Amikacinmedikamentenlösung (wie in Beispiel 1 hergestellt) zusammengetan. Die erhaltene Lösung wurde zwei Minuten mit einem starken Schermischer (Virtishear) bei 1000 Upm gemischt. Die Lösung wurde in einen Becher gegeben, in ein 40ºC-Wasserbad gesetzt und unter Rühren hydratisiert bis die Lösung 40ºC erreichte (etwa 25 Minuten). Die Lösung wurde dann für ungefähr 30 Durchgänge bei 10.000 psi in einen Homogenisator (Gaulin 15 M) gegeben, während die Einlaßtemperatur bei 40ºC gehalten wurde. Die erhaltene Lösung wurde durch einen 0,8 micron Nylonfilter filtriert. Die Lösung wurde ultrafiltriert, um nichteingekapselten Wirkstoff mit neuem Puffer zu ersetzen. Die Lösung wurde mit 7 bis 10 Volumina Puffer gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde auf 40ºC erwärmt und aufeinanderfolgend durch 0,8, 0,45 und 0,22 micron (Porengröße) Filter filtriert. Es ist daher ein überraschender Aspekt der vorliegenden Erfindung, daß die Hydratisierung der Liposomen deutlich unterhalb der Übergangstemperatur für die Formulierung (etwa 52ºC) stattfand.
- Die Erprobung des in Liposomen eingekapselten Amikacins für die Behandlung von MAC wurde mit Hilfe eines Mausmodells durchgeführt. Beige Mäuse (C57B1/6bgj/bgj) wurden mit MAC (101, Typ 1) infiziert. Die Mäuse wurden durch Injektion von 1 · 10&sup7; koloniebildenden Einheiten (cfu) in die Mäuseschwanzvene (i. v.) infiziert. Drei Experimente wurden durchgeführt. Bei dem ersten Experiment wurden 10, 80 und 120 Milligramm Amikacin (liposomal und frei) je Kilogramm Mäusekörpergewicht über 5 Tage täglich, beginnend 7 Tage nach der Infektion, i. v. gegeben. Die Tiere wurden 5 Tage nach Abschluß der Behandlung geopfert und von Leber-, Lungen- und Milzgewebe wurden Platten angelegt. Es wurde eine Quantifizierung der Organismen in Leber-, Milz- und Lungengewebe durchgeführt. Die cfu wurden durch Wachstum auf Middlebrook 7h11 Agarplatten bestimmt. Unbehandelte und leere Liposomen wurden als Kontrollproben verwendet.
- Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 1. Dieses Experiment wurde in zwei identischen Teilen durchgeführt. Die Liposomen im ersten Teil besaßen eine durchschnittliche Größe von 49,8 nm und die durchschnittliche Größe der Liposomen im zweiten Teil betrug 73,7 nm (mittlerer Durchmesser). Die Amikacinkonzentration betrug entweder 15,0 mg/ml oder 13,21 mg/ml und die Gesamtlipidkonzentration betrug entweder 121 mg/ml bzw. 55,7 mg/ml (Wirkstoff-zu- Lipidverhältnis: 0,123; 0,24). Der freie Arzneimittelwirkstoff wurde für alle Experimente in dem gleichen Puffer angesetzt, in dem die liposomalen Formulierungen enthalten waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 listet die Ergebnisse für die Milz- und Lebergewebe. Tabelle 1 Wirkungen liposomalen Amikacins auf MAC-infizierte Mäusegewebe
- Die Ergebnisse für die Lungenstudie waren wie folgt: 1) Behandlungsplan: unbehandelt waren 2,86 · 10&sup7; cfu/gram (log = 7,46);
- 2) leere Liposomen waren 2,95 · 10&sup7; cfu/gram (log = 7,47);
- 3) freies Amikacin (40 mg/kg, 80 mg/kg und 120 mg/kg) waren 1,44 · 10&sup6; (log = 6,16), 1,29 · 10&sup6; (log 6,11) und 9,94 · 10&sup5; (log = 6,00); 4) liposomales Amikacin (40 mg/kg, 80 mg/kg und 120 mg/kg) waren 2,28 · 10&sup5; (log = 5,36), 3,02 · 10&sup5; (log = 5,48) und 4,15 · 10&sup5; (log = 5,62).
- Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt wie das vorstehende (ebenfalls in zwei Teilen), außer daß die medikamentöse Therapie 5 Tage nach der Infektion begonnen wurde. Das Mittel wurde dreimal wöchentlich über 21 Tage i. v. gegeben. Die Mäuse wurden 1 bis 2 Tage nach Ende der Behandlung geopfert. Während der Behandlungsphase erhielt eine Gruppe der Mäuse 40 mg/kg, 80 mg/kg und 150 mg/kg freies Amikacin und eine andere Gruppe erhielt 40 mg/kg, 80 mg/kg und 160 mg/kg liposomales Amikacin. Die Lungengewebe wurden nicht untersucht. Ähnliche Kontrollproben wurden verwendet wie oben. Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die mittlere Größe der Liposomen betrug 66,5 nm oder 79,6 nm (mittlere Durchmesser). Die Amikacinkonzentration betrug entweder 15,98 mg/ml oder 6,74 mg/ml. Das Gesamtlipid wurde nur für den zweiten Teil des Experimentes bestimmt und betrug 27,0 mg/ml (Wirkstoff-zu-Lipidverhältnis 1 : 4,167). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 Wirkungen liposomalen Amikacins auf MAC-infizierte Mäusegewebe
- Ein drittes Experiment wurde ausgeführt wie das zweite, außer daß die mit den liposomalen Amikacin behandelten Mäuse 120 mg/kg-, 240 mg/kg- und 320 mg/kg-Dosen erhielten, während die Mäuse, die mit dem freien Amikacin behandelt wurden, nur 120 mg/kg-Dosen erhielten. Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 2, wobei die mittlere Größe der Liposomen 81,8 nm (mittlerer Durchmesser) betrug. Die Amikacinkonzentration betrug 32,02 mg/ml und die Gesamtlipidkonzentration betrug 91,5 mg/ml (Wirkstoff-zu-Lipidverhältnis: 1 : 2,941). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Wirkungen liposomalen Amikacins auf MAC-infizierte Mäusegewebe
- Die Ergebnisse aller Experimente belegen, daß ohne Steigerung der Toxizität und bei höherer Wirksamkeit signifikant höhere Dosen an Amikacin verabreicht werden können. Es ist im Stande der Technik bekannt, daß 150 mg/kg Amikacin viele der injizierten Mäuse tötet. Die Gabe von 320 mg/kg Amikacin ist daher eine deutliche Steigerung der Medikamentenmenge, die ohne lethale Toxizität verabreicht werden kann.
- Es wurde die Wirksamkeit und Toxizität liposomalen Amikacins in Pseudomonas infizierten Mäusen untersucht. Es wurden CF-1-Mäuse verwendet (Weibchen 6 bis 8 Wochen alt). Die Mäuse wurden von Jackson Labs erhalten. Ein klinisches Isolat von Pseudomonas aeruginosa wurde auf einer Mueller Hinton/MacConkey-Blutagarplatte erhalten. Die Organismen wurden auf eine Mueller Hinton-Platte übertragen und 24 Stunden wachsen gelassen. Die Kolonien wurden in Salzlösung überführt und 48 Stunden kultiviert. Die Proben wurden in Salzlösung eingefroren, die 15% fötales Kalbsserum und 1 · 10&sup8;-Organismen/ml (MacFarland Standard) enthielt. Die Kolonien wurden bei -70ºC gelagert. Die Kolonien wurden aufgetaut und auf einer Mueller Hinton-Platte 24 Stunden kultiviert. Die Bakterien wurden auf 8 · 10&sup6;-Organismen/ml in Salzlösung, die Talg enthielt, (62,5 mg/ml) eingestellt, und 1 ml wurde intraperitoneal injiziert. Eine inokulierte Kultur auf MH-Agar über 24 Stunden zeigte, daß ungefähr 7 · 10&sup6; cfu pro Maus zugeteilt worden waren. Liposomales Amikacin und leere Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 2 angegeben. Die Liposomen der Amikacinformulierung besaßen eine durchschnittliche Größe (mittlerer Durchmesser) von 62,4 nm. Die Lipidkonzentration betrug 95,31 mg/ml und die Amikacinkonzentration betrug 23,54 mg/ml (0,25 Wirkstoff/Lipid-Verhältnis). Der pH-Wert der Lösung, die die Formulierung enthielt, war 7,31. Die leeren Liposomen hatten eine durchschnittliche Größe von 66,8 nm mit 92,05 mg/ml Lipid. Die Konzentration der freien Amikacinlösung betrug 23,54 mg/ml. Der pH-Wert der Lösung mit den Liposomen war 7,33.
- Die Mäuse wurden behandelt mit 40 mg/kg (Wirkstoff pro Körpergewicht), 80 mg/kg, 120 mg/kg und 240 mg/kg liposomalem Amikacin. Es wurden auch Mäuse mit 40 mg/kg und 120 mg/kg freiem Amikacin behandelt. Die Arzneimittel wurden intravenös in die Caudalvene zugeführt. Es wurden zwei Dosen gegeben; eine vier Stunden nach der Infektion und eine 24 Stun den nach der Infektion. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Die Ergebnisse bestätigen, daß es möglich ist, mit Hilfe einer Liposomenformulierung bis zu 240 mg/kg Amikacin zu verabreichen, wobei alle Tiere überleben. Tabelle 4 Wirkung von liposomalem Amikacin auf Pseudomonas-Infektionen in Mäusen
- Es wurde der Amikacingehalt im Plasma von Mäusen (C57B1/6, weibliche Tiere 2-3 Monate alt) nach Injektion (i. v.) von freiem Amikacin oder liposomalen Amikacin (100 mg/kg) gemessen. Das liposomale Amikacin wurde zubereitet wie in Beispiel 2 beschrieben. Es wurden zu unterschiedlichen Zeiten Blutproben genommen. Die Proben wurden gesammelt, indem 100 Mikroliter Blut, retroorbital, aus nicht-anesthesierten Mäusen entnommen wurde. Die Proben wurden in heparinisierten Kapillarpipetten gesammelt, die mit Ton verschlossen wurden. Die Proben wurden 10 Minuten bei 3250 Upm (20 cm Rotor) zentrifugiert. Die Proben wurden in einem Radioimmunoassay (Diagnostic Products) analysiert. Die liposomale Amikacinformulierung enthielt Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 43,6 nm (mittlerer Druchmesser). Die Amikacinkonzentration betrug 10,09 mg/ml und die Gesamtlipidkonzentration betrug 56,8 mg/ml (Wirkstoff-zu- Lipidverhältnis 1 : 5,556). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5 Amikacingehalt in Mäusplasma
- Die Ergebnisse bestätigen, daß liposomales Amikacin im Plasma über signifikant längere Zeiten gehalten wird als freies Amikacin.
- Obwohl diese Beschreibung unter Bezugnahme auf bestimmte Anwendungen offenbart und erläutert wurde, sind die grund legenden Prinzipien auf zahlreiche andere Anwendungen, die für den Fachmann offensichtlich sind, anwendbar. Die Erfindung ist daher nur durch den Umfang der beigefügten Ansprüche beschränkt.
- In Liposomen eingekapseltes Amikacin wurde sowohl gegen medikamentenresistente als auch gegen medikamentenempfindliche Stämme von M. tuberculosis untersucht. Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Zwei Teststämme von M. tuberculosis wurden mit der Gen-Pro (San Diego) -Technik identifiziert. Ein als Vertulla bekannter Stamm war medikamentenresistent. Der andere Stamm ist bekannt als H37RV. Beide Stämme befinden sich beim Nationalen jüdischen Zentrum für Immunologie und respiratorische Medizin, Denver, Colorado. Für jedes Experiment wurde aus einem gefrorenen Aliquot eine Subkultur in 7H9- Nährbrühe zubereitet. Nach 1 bis 2 Wochen Inkubation bei 37ºC auf einer gleichmäßig rotierenden Rolltrommel wurde die Bakteriensuspension jedes Stammes durch eine 27-Gauge- Nadel gedrückt und 5 Minuten bei 250 · g zentrifugiert, um größere Bakterienklumpen zu entfernen. Peripheres Blut von gesunden gereinigten proteinderivatnegativen Donoren wurde in einer 60 ml-Spritze, die mit ungefähr 0,06 ml einer konservierungsmittelfreien Lösung, die 10.000 IU Heparin pro Milliliter enthielt (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.),vorbehandelt worden war, gesammelt. Diese Vorbehandlung ergab 10 IU/ml Blut. Die 60 ml-Blutprobe wurde in ein Röhrchen mit einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (Sigma Diagnostics, St. Louis, Mo.) eingebracht und 15 Minuten bei 800 · g bei Raumtemperatur zentrifugiert, wie vom Hersteller angegeben. Die mononucleäre Zellbande wurde gesammelt, in einen 50 ml-Falcon überführt und mit RPMI 1640 (GIBCO) mit 10 IU Heparin pro ml auf ein Gesamtvolumen von 40,00 ml verdünnt. Die Suspension wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 250 · g zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal in 10 ml Heparin-haltigem RPMI 1640 gewaschen und das Pellet wur de in RPMI 1640 wieder aufgenommen und auf 10&sup7; Zellen pro ml eingestellt. Die Suspension wurde in zwei Aufgabespots in 35 mm Plastik-Petrischalen (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, N. J.) gegeben, jeweils ein Tropfen (ungefähr 0,05 ml), was Monolayer-Schichten mit etwa 5 · 10&sup5; Zellen ergab. Die Schalen wurden bei 37ºC eine Stunde inkubiert, um die Zellen anhaften zu lassen, und wurden dann einmal mit RPMI 1640 gewaschen. Dann wurden 1,5 ml RPMI 1640 mit 3 % humanem autologen nicht-erhitzten frischen Serum für eine Inkubationsperiode von 7 Tagen bei 37ºC im Beisein von 7% CO&sub2; zu jeder Schale zugegeben. Der pH-Wert des Mediums betrug 7,2 bis 7,3.
- Die oben beschriebene Bakteriensuspension wurde 30 min bei 3500 · g in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert, und das Pellet wurde in 2,0 ml RPMI 1640 resuspendiert. Um die Anzahl säurefester Bazillen in dieser Suspension je Milliliter abschätzen zu können, wurden 0,01 ml-Proben der Suspension auf Reich-Zähldias (Bellco Biotechnologie, Vineland, N. J.) mit einer bekannten Felderzahl (unter 1000facher Vergrößerung) je Kreis aufgebracht. Die Dias wurden fixiert und angefärbt. Die aus den Counts auf diesen Dias abgeschätzte Zahl säurefester Bazillen je Milliliter stellte sich, wie zuvor gezeigt, als genau heraus. Auf Basis dieser Zähler wurde die Bakteriensuspension in RPMI 1640 auf einen Gehalt von 106 säurebeständigen Bazillen je ml eingestellt.
- Es wurde angenommen, daß die Monocyten nach 7 Tagen Inkubationszeit zu einer Makrophagen-Monolayer-Schicht gereift waren. Das Medium wurde aus den Schalen entfernt und durch 1,5 ml der Bakteriensuspension je Schale ersetzt. Nach einstündiger Inkubation wurden die Schalen dreimal gewaschen, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen. Die infizierten Makrophagen wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 1% humanem autologen Serum, inkubiert. Liposomales und freies Amikacin wurde den Kulturen in folgenden Konzentrationen zugegeben (ug/ml RPMI): 1, 2 und 4 bei den empfindlichen Stämmen und 4, 8 und 16 bei den resistenten Stämmen. Medikamentenfreie Liposomen und unbehandelte Kulturen wurden als Kontrollproben verwendet. Das Experiment wurde doppelt durchgeführt. Die Bakterien-Counts, die in dem nachfolgend beschriebenen Experiment verwendet wurden, repräsentieren nur intrazelluläre Bakterien. An den Tagen 0, 4 und 7 wurde das Medium von unterschiedlichen Schalen abgenommen und die Monolayer wurden lysiert, indem sie 10 min lang einer 0,25 %igen Lösung aus Natriumdodecylsulfat, 1,0 ml je Schale, ausgesetzt wurden. Nachdem die Suspension in ein Röhrchen überführt worden war, wurde die Schale mit 1,0 ml 7H9- Nährlösung gespült, die 20% Rinderalbumin enthielt, und das Abgespülte wurde dann in dasselbe Röhrchen zugegeben. Es wurden 10fache Reihenverdünnungen angesetzt und 7H11- Agarplatten für die darauffolgende Kolonienzählung beimpft. Die Ergebnisse wurden in der Form Anzahl cfu je Monolayer ausgedrückt. Die Anfangs-cfu (an Tag 0) ist angegeben, wie sie für die reinen Liposomen gemessen wurde (4,3 · 10³). [Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabellen 6 und 7 gezeigt] Tabelle 6 Amikacin-Aktivität (loposomal und frei) gegenüber arzneimittelresistenter TB (Vertulla)
- Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen klar, daß liposomales Amikacin ein wirksames Mittel zur Behandlung arzneimittelresistenter M. tuberculosis darstellt. Das Aktivitätsniveau gegen das Wachstum des arzneimittelresistenten Stammes ist wenigstens 8mal größer als bei freiem Amikacin und ergibt eine Aktivität von bis zu wenigstens 130mal mehr als mit freiem Amikacin bei hohen Dosen (16 ug/ml). Liposomales Amikacin erzielte bei den untersuchten Dosen eine Abtötung bei jeder Konzentration, während das freie Amikacin bestenfalls Inhibierung erzielte. Tabelle 7 Amikacin-Aktivität (loposomal und frei) gegenüber arzneimittelempfindlicher TB
- Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, daß liposomales Amikacin wirksam ist, oder sogar noch wirksamer bei der Inhibierung oder Abtötung von M. tuberculosis bei äquivalenten Dosen.
Claims (13)
1. Pharmazeutische Zusammensetzung mit
a) Liposomen, die ein gekapseltes Aminoglycosid,
Cholesterin, ein neutrales Phospholipid und ein negativ
geladenes Lipid enthalten, wobei im wesentlichen
alle der Liposome in der Zusammensetzung unilamellar
sind und eine durchschnittliche Größe von weniger
als 100 nm aufweisen und wobei das negativ geladene
Lipid weniger als 20% des molaren Gesamtlipids
ausmacht, und
b) einem geeigneten pharmazeutischen Träger.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das negativ
geladene Lipid ein Phosphatidyl-Glycerin aufweist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das negativ
geladene Lipid Di-Stearoyl-Phosphatidyl-Glycerin aufweist.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der
der molare Anteil des negativ geladenen Lipids weniger
als 5% des molaren Gesamtlipids ausmacht.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das neutrale
Phospholipid gehärtetes Sojaphosphatidylcholin aufweist,
wobei das gehärtete Sojaphosphatidylcholin, Cholesterin
und Di-Stearoyl-Phosphatidyl-Glycerin im molaren
Verhältnis von etwa 2 : 1 : 0,1 vorhanden sind und das molare
Verhältnis von Aminoglycosid zu Lipid zwischen 1 : 9 und 1 : 3
liegt.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der
das Aminoglycosid Amikacin ist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6 in Abhängigkeit von
Anspruch 5, in der die Liposome im wesentlichen aus
gehärteten Sojaphosphatidylcholin, Cholesterin und Di-
Stearoyl-Phosphatidyl-Glycerin bestehen.
8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche
zur Verwendung als Medikament zur Behandlung einer
bakteriellen Infektion eines Patienten.
9. Verfahren zur Herstellung von Aminoglycosidliposome mit
den Schritten:
a) Bildung eines Lipidpuders, bestehend aus einem
neutralen Phospholipid, einem negativ geladenen
Phospholipid und einem Sterin, wobei das negativ
geladene Phospholipid weniger als 20% des
Gesamtlipids beträgt,
b) Mischen des Puders mit einem Aminoglycosid in einem
wässrigen Puffer,
c) Hydrieren der Mischung,
d) Anwendung einer Scherkraft, wodurch Liposome
erhalten werden, die aus unilamellaren Liposomen mit
einer durchschnittlichen Größe von weniger als 100 nm
bestehen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Hydrierschritt (c)
bei einer Temperatur zwischen 40ºC und 65ºC
durchgeführt wird.
11. Verwendung von unilamellaren Liposomen, die ein
gekapseltes Aminoglycosid, Cholesterin, ein neutrales
Phospholipid und ein negativ geladenes Lipid aufweisen, wobei im
wesentlichen alle der Liposomen unilamellar sind und eine
durchschnittliche Größe von weniger als 100 nm aufweisen
und wobei der Anteil des negativ geladenen Lipids weniger
als 20% des molaren Gesamtlipids beträgt, zur
Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer
bakteriellen Infektion eines Patienten.
12. Verwendung von unilamellaren Liposomen, die Cholesterin,
ein neutrales Phospholipid und ein negativ geladenes
Lipid aufweisen, wobei im wesentlichen alle der Liposomen
unilamellar sind und eine durchschnittliche Größe von
weniger als 100 nm aufweisen und wobei der Anteil des
negativ geladenen Lipids weniger als 20% des molaren
Gesamtlipids beträgt, zur Kapselung eines Aminoclycosids
in einer Zusammensetzung zur Behandlung einer
bakteriellen Infektion eines Patienten.
13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, bei der die
bakterielle Infektion arzneimittelresistent ist.
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