ES2881473T3 - Métodos de suministro y composiciones para la modificación por ingeniería genética del genoma mediada por nucleasas - Google Patents

Abstract

Una nucleasa de dedos de zinc que escinde un gen de AAVS1 endógeno, comprendiendo la nucleasa de dedos de zinc la primera y la segunda nucleasas de dedos de zinc, en donde la primera nucleasa de dedos de zinc comprende 6 dominios de unión a ADN de dedos de zinc, comprendiendo cada dominio de unión a ADN de dedos de zinc, una región de hélice de reconocimiento en donde las regiones de la hélice de reconocimiento de los dominios de unión a ADN de dedos de zinc, se ordenan de F1 a F6 de la siguiente manera: F1: RSDHLSR (SEQ ID NO:13) F2: TSGHLSR (SEQ ID NO:14) F3: YNWHLQR (SEQ ID NO:15) F4: RSDHLTT (SEQ ID NO:16) F5: HNYARDC (SEQ ID NO: 17); y F6: QNSTRIG (SEQ ID NO:18); y en donde la segunda nucleasa de dedos de zinc comprende 6 dominios de unión a ADN de dedos de zinc, comprendiendo cada dominio de unión a ADN de dedos de zinc, una región de hélice de reconocimiento en donde las regiones de la hélice de reconocimiento de los dominios de unión a ADN de dedos de zinc, se ordenan de F1 a F6 de la siguiente manera: F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:19) F2: LKQHLTR (SEQ ID NO:20) F3: TSGNLTR (SEQ ID NO:21) F4: RRDWRRD (SEQ ID NO:22) F5: QSSHLTR (SEQ ID NO:23); y F6: RLDNRTA (SEQ ID NO:24).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de suministro y composiciones para la modificación por ingeniería genética del genoma mediada por nucleasas

Campo técnico

La presente divulgación pertenece al campo de la modificación por ingeniería genética del genoma, en particular, la modificación dirigida del genoma de una célula.

Antecedentes

Se han descrito varios métodos y composiciones para la escisión dirigida del ADN genómico. Tales eventos de escisión dirigida pueden usarse, por ejemplo, para inducir mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de a Dn celular y facilitar la recombinación dirigida en un locus cromosómico predeterminado. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 8.586.526; 8.329.986; 8.399.218; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y la solicitud de Estados Unidos N.° 14/278.903). El documento US 8.110.379 describe una nucleasa que escinde un gen AAVS1 endógeno, comprendiendo la nucleasa un dominio de unión a ADN y un dominio de escisión. La nucleasa comprende nucleasas de dedos de zinc primera y segunda que comprenden 4 dominios de unión al ADN con dedos de zinc, cada uno de los cuales contiene regiones de hélice de reconocimiento. El documento WO2013/049493 describe una composición para el suministro mediado por AAV de un producto terapéutico que comprende un vector de AAV que contiene una molécula de ácido nucleico y al menos un ablacionador que comprende una endonucleasa quimérica que comprende al menos diez copias de un dominio de dedo de zinc unido a un dominio catalítico funcional de endonucleasa en asociación operativa con un promotor. El documento WO2013/044008 describe una proteína de fusión de origen no natural que comprende una proteína con dedos de zinc que se une a un gen de albúmina endógena y un dominio de escisión, en donde la proteína con dedos de zinc comprende 4, 5 o 6 dominios de dedos de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento. Los métodos para la escisión dirigida del ADN genómico a menudo implican el uso de sistemas de escisión modificados para inducir una rotura de doble cadena (DSB, double strand break) o una muesca en una secuencia de ADN diana de tal manera que la reparación de la rotura por un proceso propenso a errores, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ, non-homologous end joining) o la reparación usando un molde de reparación (reparación dirigida por homología o HDR, homology directed repair) puede provocar la inactivación de un gen o la inserción de una secuencia de interés (integración dirigida). La escisión puede producirse mediante el uso de nucleasas específicas, tales como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN, siglas del inglés zinc finger nucleases) modificadas, activador de la transcripción como nucleasas efectoras (TALEN), que usan el sistema CRISPR/Cas con un ARNcr/ARN tracr modificado genéticamente ('ARN de guía única') para guiar la escisión específica y/o usar nucleasas basadas en el sistema Argonauta (por ejemplo, de T. thermophilus, conocidas como 'TtAgo', (Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261).

La escisión dirigida usando uno de los sistemas de nucleasas mencionados anteriormente puede aprovecharse para insertar un ácido nucleico en una ubicación diana específica usando procesos mediados por HDR o NHEJ. Sin embargo, administrar tanto el sistema de nucleasa como el donador a la célula puede ser problemático. Por ejemplo, el suministro de un donador o de una nucleasa mediante la transducción de un plásmido en la célula puede ser tóxico para la célula receptora, especialmente a una célula que es una célula primaria y, por tanto, no tan robusta como una célula de una línea celular.

Las células madre o progenitoras CD34+ son un conjunto heterogéneo de células caracterizadas por su capacidad para autorrenovarse y/o diferenciarse en las células del linaje linfoide (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales) y linaje mieloide (por ejemplo, monocitos, eritrocitos, eosinófilos, basófilos y neutrófilos). Su naturaleza heterogénea surge del hecho de que dentro de la población de células madre CD34+, hay múltiples subgrupos que a menudo reflejan la multipotencia (si el linaje está comprometido) de un grupo específico. Por ejemplo, Las células CD34+ que son CD38- son células progenitora CD34+ inmaduras más primitivas, (también denominadas progenitores hematopoyéticos a largo plazo), mientras que aquellos que son CD34+CD38+ (progenitores hematopoyéticos a corto plazo) están comprometidos con el linaje (véase Stella et al (1995) Hematologica 80:367-387). Cuando esta población luego progresa más en la vía de diferenciación, el marcador de CD34 se pierde. Las células madre CD34+ tienen un enorme potencial en la terapia celular clínica. Sin embargo, en parte debido a su naturaleza heterogénea, realizar manipulaciones genéticas como la inactivación de genes, la inserción de transgén y similares sobre las células puede ser difícil. De manera específica, estas células son mal transducidas por vectores de suministro convencionales, las células madre más primitivas son sensibles a la modificación, hay una HDR limitada después de las DSB de ADN inducidas y el mantenimiento de las HSC es insuficiente en condiciones de cultivo estándar prolongadas. Además, otras células de interés (solo como ejemplo no limitativo, cardiomiocitos, neuronas espinosas medianas, hepatocitos primarios, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y células musculares) pueden transducirse con menos éxito para la edición del genoma que otras.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de composiciones y métodos para la modificación por ingeniería genética de células CD34+ y otras células de interés que sean menos tóxicas y más eficientes.

Sumario

La presente divulgación describe composiciones y métodos para su uso en terapia génica y modificación por ingeniería genética del genoma. De manera específica, los métodos y composiciones descritos se refieren a la introducción de ácidos nucleicos en células tales como células primarias que incluyen células madre hematopoyéticas/células progenitoras (HSC/PC) y linfocitos T. Las células madre embrionarias humanas están excluidas del alcance de la presente invención. Además, los métodos y composiciones de la presente divulgación son útiles para el suministro de partículas de AAV que comprenden ^a Dⁿ de donadores de interés a tales células. Los métodos de acuerdo con la presente invención no se llevan a cabo en un cuerpo humano o animal vivo o en células madre embrionarias humanas. La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En algunos aspectos, la presente divulgación comprende el suministro de al menos una nucleasa a una célula (por ejemplo, una HSC/PC) con el propósito de modificar por ingeniería genética el genoma. En algunos aspectos, la nucleasa se suministra como un péptido, mientras que en otros se suministra como un ácido nucleico que codifica la nucleasa. En algunos aspectos, se usa más de una nucleasa. En algunos aspectos preferidos, el ácido nucleico que codifica la nucleasa es un ARNm y, en algunos casos, el ARNm está protegido. La nucleasa puede comprender una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa TALE (TALEN) o un sistema nucleasa CRISPR/Cas o TtAgo o una combinación de los mismos. En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica la(s) nucleasa(s) se suministra mediante electroporación.

En un aspecto, en el presente documento se describe un método para integrar uno o más transgenes en un genoma de una célula aislada, comprendiendo el método introducir secuencialmente el transgén y al menos una nucleasa en la célula de manera que la nucleasa medie en la integración dirigida del transgén. Por lo tanto, en determinados aspectos, el presente documento describe un método para integrar uno o más transgenes en un genoma de una célula aislada, comprendiendo el método: introducir, en la célula, (a) un vector donador que comprende uno o más transgenes y (b) al menos una nucleasa, en donde la al menos una nucleasa escinde el genoma de la célula de modo que uno o más transgenes se integran en el genoma de la célula, y además en donde (i) si el vector donador se introduce en la célula antes que la al menos una nucleasa, la al menos una nucleasa se introduce en la célula dentro de las 48 horas posteriores a la introducción del vector donador y; (ii) si la al menos una nucleasa se introduce antes que el vector donador, el vector donador se introduce en la célula dentro de las 4 horas posteriores a la introducción de al menos una nucleasa. En determinados aspectos, los métodos pueden comprender (a) introducir un vector donador que comprende uno o más transgenes en la célula; (b) cultivar la célula durante menos de 48 horas (por ejemplo, de segundos a 48 horas o en cualquier momento intermedio); y (c) introducir al menos una nucleasa en la célula, en donde la al menos una nucleasa escinde el genoma de la célula de manera que uno o más transgenes se integran en el genoma de la célula. Como alternativa, los métodos pueden comprender: (a) introducir al menos una nucleasa en la célula; (b) cultivar la célula durante menos de 24 horas (por ejemplo, de segundos a 24 horas o en cualquier momento intermedio); y (c) introducir un vector donador que comprende uno o más transgenes en la célula, en donde la al menos una nucleasa escinde el genoma de la célula de manera que uno o más transgenes se integran en el genoma de la célula. Las etapas del método se pueden repetir para la integración de transgenes adicionales en los mismos y/o diferentes loci. En determinados aspectos, la célula se cultiva (etapa (b)) durante menos de 24 horas (por ejemplo, de segundos a 24 horas o en cualquier momento entre ambos). En otros aspectos más, la célula se cultiva durante menos de 4 horas, por ejemplo, cuando se introduce(n) la(s) nucleasa(s) antes de la introducción del vector donador.

Se puede utilizar cualquier célula, por ejemplo, una célula madre hematopoyética (por ejemplo, una célula CD34+) o un linfocito T (por ejemplo, una célula CD4+ o CD8+). De acuerdo con la invención, la célula no es una célula madre embrionaria humana. El vector donador se puede introducir como vector vírico o no vírico, por ejemplo, un vector de AAV (por ejemplo, un vector quimérico de AAV6 o AAV6 como AAV2/6, etc.). La nucleasa (por ejemplo, ZFN, TALEN, TtAgo y/o CRISPR/Cas) también se pueden introducir utilizando vectores víricos o no víricos, por ejemplo en forma de ARNm. En determinados aspectos, la nucleasa se dirige a un gen de puerto seguro (por ejemplo, un gen CCR5, un gen AAVS1, un gen Rosa, un gen de la albúmina, etc.). El transgén puede codificar una proteína, por ejemplo, una proteína terapéutica que falta o es deficiente en un sujeto con un trastorno (por ejemplo, enfermedad del almacenamiento lisosómico, hemoglobinopatía, hemofilia, etc.). En determinados aspectos, se describe un método para proporcionar una o más proteínas a un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método: introducir uno o más transgenes que codifican una o más proteínas en una célula aislada según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento e introducir la célula en el sujeto de manera que se proporcionen al sujeto una o más proteínas. Los métodos llevados a cabo en un cuerpo humano o animal vivo no son objeto de la invención. En otros aspectos, el presente documento describe el suministro de un ácido nucleico donador a una célula diana. El donador se puede suministrar antes, después, o junto con el ácido nucleico que codifica la(s) nucleasa(s). En ciertos aspectos, el donador se suministra simultáneamente con la(s) nucleasa(s). En otros aspectos, el donador se suministra antes de la(s) nucleasa(s), incluyendo cualquier momento antes, por ejemplo, inmediatamente antes, 1 a 60 minutos antes (o en cualquier momento intermedio), 1 a 24 horas antes (o en cualquier momento intermedio), 1 a 48 horas (o en cualquier momento intermedio) o más de 48 horas antes. En determinados aspectos, el donador se suministra después de la nucleasa, preferentemente en 4 horas. El ácido nucleico donador comprende una secuencia exógena (transgén) para integrarse en el genoma de la célula, por ejemplo, un locus endógeno. El transgén se integra preferentemente en o cerca (por ejemplo, dentro de 1-50 pares de bases) del sitio de escisión por la(s) nucleasa(s). En algunos aspectos, el donador comprende un gen de longitud completa o un fragmento del mismo flanqueado por regiones de homología con el sitio de escisión dirigido. En algunos aspectos, el donador carece de regiones homólogas y está integrado en un locus diana mediante un mecanismo independiente de homología (es decir, NHEJ). En otros aspectos, el donador comprende una pieza más pequeña de ácido nucleico flanqueada por regiones homólogas para su uso en la célula (es decir, para la corrección génica). En algunos aspectos, el donador comprende un gen que codifica un componente funcional o estructural, como un ARNhc, ARNi, miARN o similares. En otros aspectos, el donador comprende un gen que codifica un elemento regulador que se une y/o modula la expresión de un gen de interés.

En otros aspectos, el donador se suministra mediante métodos de transferencia de genes víricos y/o no víricos. En aspectos preferidos, el donador se suministra a la célula a través de un virus adenoasociado (AAV). Se puede utilizar cualquier vector AAV, incluyendo, pero sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, a Av 7, AAV8 y combinaciones de los mismos. En algunos casos, el AAV comprende LTR que son de un serotipo heterólogo en comparación con el serotipo de la cápside (por ejemplo, ITR de del AAV2 con las cápsides del AAV5, AAV6, o AAV8). El donador se puede suministrar usando el mismo sistema de transferencia de genes que se usa para suministrar la nucleasa (incluso en el mismo vector) o se puede suministrar usando un sistema de suministro diferente que se use para la nucleasa. En determinados aspectos, el donador se suministra usando un vector vírico (por ejemplo, AAV) y la(s) nucleasa(s) se suministra(n) en forma de ARNm.

La secuencia de interés de la molécula donadora puede comprender una o más secuencias que codifican un polipéptido funcional (por ejemplo, un ADNc), con o sin promotor. En determinados aspectos, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un factor de crecimiento, un receptor (de superficie celular o nuclear), una hormona, una linfocina, una citocina, un indicador, fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores y combinaciones de los anteriores. En realizaciones en las que las secuencias codificantes del polipéptido funcional no tienen promotor, la expresión de la secuencia integrada se asegura entonces mediante la transcripción dirigida por un promotor endógeno u otro elemento de control en la región de interés. En otros aspectos, un casete en "tándem" se integra en el sitio seleccionado de esta manera, comprendiendo el primer componente del casete una secuencia sin promotor como se describe anteriormente, seguido de una secuencia de terminación de la transcripción y una segunda secuencia, que codifica un casete de expresión autónoma. Se pueden incluir secuencias adicionales (secuencias codificantes o no codificantes) en la molécula donadora entre los brazos de homología, que incluyen, pero sin limitación, secuencias que codifican un péptido 2A, un sitio SA, IRES, etc.

En otro aspecto, en el presente documento se describen métodos para integrar un ácido nucleico donador en el genoma de una célula mediante mecanismos independientes de la homología. Los métodos comprenden crear una rotura de doble cadena (DSB) en el genoma de una célula y escindir la molécula donadora usando una nucleasa, de manera que el ácido nucleico donador se integre en el sitio de la DSB. En determinados aspectos, el ácido nucleico donador se integra mediante métodos no dependientes de homología (por ejemplo, NHEJ). Tal como se ha señalado anteriormente, tras la escisión in vivo de las secuencias donadoras se puede integrar de forma dirigida en el genoma de una célula en la ubicación de una DSB. La secuencia donadora puede incluir uno o más de los mismos sitios diana para una o más de las nucleasas utilizadas para crear la DSB. Por lo tanto, la secuencia donadora puede ser escindida por una o más de las mismas nucleasas utilizadas para escindir el gen endógeno en el que se desea la integración. En determinados aspectos, la secuencia donadora incluye diferentes sitios diana de nucleasas de las nucleasas utilizadas para inducir la DSB. Las DSB en el genoma de la célula diana pueden crearse mediante cualquier mecanismo. En determinados aspectos, la DSB se crea por una o más nucleasas con dedos de zinc (ZFN), proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de zinc, que está modificada por ingeniería genética para unirse a una secuencia dentro de la región de interés, y un dominio de escisión o un semidominio de escisión. En otros aspectos, la DSB se crea mediante uno o más dominios de unión al ADN de TALE (de origen natural o no natural) fusionados a un dominio de nucleasa (TALEN). En otros aspectos adicionales, la DSB se crea usando un sistema de nucleasa CRISPR/Cas o TtAgo donde se usa un ARN guía único modificado por ingeniería genética o su equivalente funcional según sea necesario para guiar la nucleasa a un sitio diana en un genoma.

En otros aspectos, la(s) nucleasa(s) se une(n) y/o escinde(n) un gen de puerto seguro, por ejemplo, un gen CCR5, un gen PPP1R12C (también conocido como AAVS1), un gen Rosa o un gen de la albúmina en células de mamífero. Además, para ayudar en la selección en sistemas de mamíferos, se puede utilizar el locus HPRT.

En un aspecto, el donador es una proteína reguladora de interés (por ejemplo, ZFP TF, TALE TF o CRISPR/Cas TF) que se une y/o modula la expresión de un gen de interés. En un aspecto, las proteínas reguladoras se unen a una secuencia de ADN y evitan la unión de otros factores reguladores. En otros aspectos, la unión de una proteína reguladora puede modular (es decir, inducir o reprimir) la expresión de un ADN diana.

En otros aspectos, en el presente documento se describe una célula que ha sido modificada genéticamente (por ejemplo, transgénica) como se describe en el presente documento, por ejemplo, usando una nucleasa para introducir la modificación genética. Las células de acuerdo con la invención son como se definen en las reivindicaciones. En determinados aspectos, la célula se crea mediante los métodos descritos en el presente documento. En determinados aspectos, la célula comprende un transgén que está integrado en un locus de puerto seguro, tal como CCR5, AAVS1, ALB, Rosa26 y/o HPRT. Las células que comprenden el transgén integrado pueden expresar el transgén a partir de un promotor endógeno o, como alternativa, el transgén puede incluir elementos reguladores y de control tales como promotores exógenos que dirigen la expresión del transgén (por ejemplo, cuando se integra en un locus de puerto seguro). En determinados aspectos, las células que comprenden el transgén no incluyen ninguna secuencia de vector vírico integrada en el genoma. Las células pueden ser cualquier célula eucariota, por ejemplo, células madre CD34+ (por ejemplo, células madre derivadas de pacientes movilizadas en pacientes desde la médula ósea hacia la sangre periférica mediante la administración del factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) u otro agente movilizador o recolectadas directamente de la médula ósea o cordones umbilicales). Las células madre embrionarias humanas están excluidas del alcance de la invención. Las células se pueden recolectar, purificar, cultivar, y las nucleasas y/o el donador se introducen en la célula mediante cualquier método adecuado.

También se describen composiciones tales como composiciones farmacéuticas que comprenden las células modificadas genéticamente tal como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, las composiciones comprenden la población de células CD34+ HSC/PC o HSC/PC. En otros aspectos de la realización, las composiciones comprenden linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4+ y/o CD8+). En otros aspectos más, las composiciones de linfocitos T comprenden solo células CD4+ o solo CD8+.

En otro aspecto, se describen métodos para usar las células modificadas genéticamente como se describe en el presente documento. Los métodos llevados a cabo en un cuerpo humano o animal vivo están excluidos del alcance de la presente invención. En determinados aspectos, los precursores de células sanguíneas modificadas genéticamente ("HSC/PC") se administran en un trasplante de médula ósea y las HSC/PC se diferencian y maduran in vivo. En algunos aspectos, las HSC/PC se aíslan después de la movilización inducida por G-CSF, y en otros, las células se aíslan de la médula ósea humana o de los cordones umbilicales. En algunos aspectos, las HSC/PC se editan mediante tratamiento con una nucleasa diseñada para inactivar un gen específico o una secuencia reguladora. En otros aspectos, las HSC/PC se modifican con una nucleasa modificada por ingeniería genética y un ácido nucleico donador de manera que se inserta y expresa un gen de tipo silvestre u otro gen de interés y/o se corrige un gen endógeno anómalo. En algunos aspectos, las HSC/PC modificadas se administran al paciente después de un preacondicionamiento mieloablativo leve. En otros aspectos, las HSC/PC se administran después de la mieloablación completa de modo que después del injerto, el 100% de las células hematopoyéticas provienen de las HSC/PC modificadas. Por otro lado, la célula puede detenerse en la fase G2 del ciclo celular.

En algunos aspectos, la célula HSC/PC y/o el animal transgénico incluye un transgén que codifica un gen humano. En algunos casos, el animal transgénico comprende una inactivación en el locus endógeno correspondiente al transgén exógeno, permitiendo así el desarrollo de un sistema in vivo donde la proteína humana puede estudiarse de forma aislada. Dichos modelos transgénicos se pueden usar con fines de cribado para identificar moléculas pequeñas o biomoléculas grandes u otras entidades que pueden interactuar con la proteína humana de interés o modificarla. En algunos aspectos, el transgén se integra en el locus seleccionado (por ejemplo, puerto seguro) en una célula madre (por ejemplo, una célula madre embrionaria no humana, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre o precursora hematopoyética, etc.) o embrión animal obtenido por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, y luego el embrión se implanta de manera que nazca un animal vivo. A continuación, el animal se cría hasta la madurez sexual y se le permite producir descendencia en donde al menos parte de la descendencia comprende la secuencia de genes endógenos editados o el transgén integrado.

También se describe un kit, que comprende los AAV y los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. El kit puede comprender ácidos nucleicos que codifican las nucleasas (por ejemplo, moléculas de ARN o genes que codifican el sistema ZFN, TALEN, TtAgo o CRISPR/Cas contenidos en un vector de expresión adecuado) o alícuotas de las proteínas nucleasa, moléculas donadoras, modificadores de características de células madre adecuados, instrucciones para realizar los métodos del presente documento y similares. El kit también puede comprender moléculas donadoras de interés tales como marcadores de selección o cribado.

Estos y otros aspectos serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica a la luz de la divulgación en su totalidad.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, paneles A y B, representan la expresión de GFP en células CD34+ modificadas con ZFN-AAV. La Figura 1A representa la expresión de GFP en células CD34+ de sangre periférica movilizadas (mPBCD34+) que fueron transducidas con los vectores AAV indicados que contienen un transgén de eGFP dirigido por CMV. Los datos que se muestran en la Figura 1A son de células 2 días después de la transducción. A continuación, las células se recogieron a los 2 y 5 días después de la infección (ddi) y se analizaron usando un citómetro de flujo (Guava, Millipore). La Figura 1B representa el porcentaje de células en cada población que son positivas para GFP.

La Figura 2, paneles A a C, representan la inserción de un donador de AAV mediada por ZFN en células CD34+. La Figura 2A muestra una representación esquemática de la construcción del donador AAV6-R5-160-XhoI usado en el presente estudio. El AAV6 usado en estos estudios era un virus pseudotipado que comprendía ITR de AAV2 y cápsides de AAV6 (es decir, "AAV2/6"). El ADN del donador se construye entre el ITR izquierdo (L-ITR) y el ITR derecho (R-ITR) de AAV2, en donde se introduce un sitio Xhol entre los sitios de unión de ZFN específicos de CCR5. El brazo izquierdo y el brazo derecho de CCR5 indican secuencias obtenidas de la secuencia genómica del locus CCR5 que flanquean los sitios de unión de ZFN de CCR5. El segundo sitio XhoI (a la izquierda del brazo de homología izquierdo de CCR5 en la Figura 2A) no se integrará después de la integración del donador en virtud de que está fuera del brazo de homología. Las Figuras 2B y 2C representan células CD34+ transducidas con el donador AAV6-R5-160-XhoI a dosis entre 300-1e5 vg/célula, seguido de la introducción por electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard) de ARNm de ZFN específico de CCR5 (120 ug/ml) 24 horas después de la transducción. Las células se recogieron a 5 ddi para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para el ensayo RFLP posterior representado en la Figura 2B y la secuenciación profunda de Illumina representada en la Figura 2c. Las bandas de tipo silvestre (ADN no digerido) y RFLP se indican mediante flechas en la Figura 2B, al igual que el porcentaje de RFLP detectado. La Figura 2C es un gráfico que representa el porcentaje de modificación del genoma o indel encontrados por la secuenciación profunda de Illumina.

La Figura 3, paneles A y B, son gráficos que representan la modificación de la nucleasa en respuesta al momento y el orden de administración de la nucleasa y del donador. El donador AAV6-R5-160-XhoI se introdujo hasta 48 horas antes (-48 horas) a 20 horas después (+20 horas) de la electroporación (EP) de células CD34+ usando con el ARNm de ZFN específico de CCR5 un BtX ECM830 (Equipo de Harvard) (-48 horas a -6 horas en la Figura 3A y -20 horas a 20 horas en la Figura 3B). Las células se recogieron más tarde para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina. Las Figuras 3A y 3B son gráficos que muestran la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación profunda de Illumina: ya sea inserciones o deleciones ("indel"), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionado por la molécula donadora en los puntos de tiempo indicados.

La Figura 4, paneles A a D, muestra resultados de CD34+ modificadas por ZFN y donadores de AAV. La Figura 4A muestra una representación esquemática de la construcción del donador R5-pgk-GFP-pA usado en el presente estudio. El ADN del donador se construye entre la L-ITR y la R-ITR del AAV2, en donde se insertó un casete de expresión de eGFP dirigido por el promotor PGK (1,6 kb) entre los sitios de unión de ZFN de CCR5. El brazo izquierdo y el brazo derecho de CCR5 indican secuencias obtenidas de la secuencia genómica del locus CCR5 que flanquean los sitios de unión de ZFN de CCR5. La Figura 4B representa los resultados del análisis de citometría de flujo de células CD34+ que fueron transducidas con el donador AAV6-R5-pgk-GFP-pA a dosis entre 300-3e3 vg/célula. Se introdujo ARNm de ZFN específico de CCR5 (120 ug/ml) en células transducidas 24 horas después mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). Las células se recogieron para el análisis de citometría de flujo a 15 ddi. Los números en el cuadrante inferior izquierdo de los gráficos indican el porcentaje de células eGFP+ presentes en la población de células vivas (PI-). La Figura 4C representa un gel que muestra la detección de la integración dirigida del casete de GFP en el locus de CCR5 utilizando un ensayo de PCR semicuantitativa "In-Out". Se preparó un conjunto de controles estándar mediante dilución en serie de un conjunto de ADN genómico de frecuencia conocida de integración del transgén de GFP en el locus CCR5 (determinado por análisis por transferencia de Southern) con ADN genómico de tipo silvestre sin modificar. La PCR se realizó utilizando la misma cantidad de ADN genómico y un cebador presente en la región de poliA (presente en el casete eGFP) y un cebador ubicado fuera de la región del brazo homólogo de CCR5 en el lado 3' de los sitios diana de ZFN. La Figura 4D representa un gel que muestra los resultados utilizando un segundo conjunto de reacciones de PCR utilizando un par de cebadores adicional de modo que ambos cebadores de este par estuvieran en el lado 5' de los sitios diana y uno de los cuales se encuentra fuera de la región homóloga CCR5. Este segundo par se incluyó en las mismas reacciones de PCR que en la Figura 2C, de modo que había dos pares de cebadores presentes. El segundo par de cebadores se utilizó como medida de la entrada de ADN genómico. Los productos de PCR específicos de GFP-TI y los productos de PCR no específicos de ID (total) se indican mediante flechas.

La Figura 5, paneles A y B, representan la modificación por ZFN-AAV de células CD34+. La Figura 5A muestra una representación esquemática del donador AAVS1-HindIII usado en este estudio. El ADN del donador se insertó entre la L-ITR y la R-ITR del AAV2, en la que se introdujo un sitio HindIII entre los sitios de unión de un par ZFN específico de AAVS1. El brazo izquierdo y el brazo derecho de AAVS1 indican secuencias de brazo de homología obtenidas de la secuencia genómica del locus de AAVS1 que flanquean los sitios de unión de ZFN de AAVS1. La Figura 5B representa un gráfico de células CD34+ que se transdujeron con el donador AAV6-AAVS1-HindIII a 1000 o 3000 vg/ml. Se introdujo ARNm de ZFN de AAVS1 (40 ug/ml) en células transducidas 24 horas después mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). Las células se recogieron a 5 ddi para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina. El gráfico muestra la cantidad de modificación genómica medida por formación indel o integración dirigida.

La Figura 6 es un gráfico que representa la modificación por CCR5 de células CD34+ con los pares de TALEN indicados. El gráfico muestra la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación profunda de Illumina: ya sea inserciones o deleciones ("indel"), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionada por la molécula donadora.

La Figura 7, paneles A y B, son gráficos que representan la integración dirigida mediada por CRISPR/Cas9 de un RFLP (sitio HindIII) proporcionado por un donador de AAV6 en el locus de AAVS1 usando las nucleasas indicadas. La misma región de AAVS1 (los sitios de escisión están a menos de 25 pb de distancia) es la diana del par de ZFN de AAVS1 (30054:30035) y los reactivos CRISPR/Cas9 ("Cas9-ARNg-T1" y "Cas9-ARNg-T2") "T-1" y "T-2" indican diferentes ARN guía. La Figura 7A muestra el porcentaje de modificación genómica, tanto la integración dirigida ("ID") como las inserciones/deleciones ("indel") en las condiciones indicadas. La Figura 7B muestra el porcentaje de integración dirigida (% de ID) en las condiciones indicadas.

La Figura 8, paneles A y B, que representa los resultados de la integración mediada por nucleasa en linfocitos T CD4+ primarios. La Figura 8A muestra el porcentaje de modificación genómica de CCR5, tanto la integración dirigida ("ID") como las inserciones/deleciones ("indel"), tras la introducción de ZFN específico de CCR5 y un AAV2, AAV6 o IDLV que comprende un donador en las condiciones indicadas. La Figura 8B muestra el porcentaje de modificación genómica de AAVS1, tanto la integración dirigida ("ID") como las inserciones/deleciones ("indel"), tras la introducción de nucleasas AAVS1 y un donador de AAV6 en las condiciones indicadas. Se observa un aumento de la ID con el uso del donador de AAV6 en comparación con el donador de AAV2 o IDLV en estas condiciones.

La Figura 9, paneles A y B, que representa los resultados de la integración mediada por nucleasa en linfocitos T CD8+ primarios. La Figura 9A muestra el porcentaje de modificación genómica de CCR5, tanto la integración dirigida ("ID") como las inserciones/deleciones ("indel"), tras la introducción de ZFN específico de CCR5 y un AAV2, AAV6 o IDLV que comprende un donador en las condiciones indicadas. La Figura 9B muestra el porcentaje de modificación genómica de AAVS1, tanto la integración dirigida ("ID") como las inserciones/deleciones ("indel"), tras la introducción de nucleasas AAVS1 y un donador de AAV6 en las condiciones indicadas. Se observa un aumento de la ID con el uso del donador de AAV6 en comparación con el donador de AAV2 o IDLV en estas condiciones.

Descripción detallada

En el presente documento se describen composiciones y métodos para la transducción de una célula para su uso en terapia génica o modificación por ingeniería genética del genoma. En particular, la integración dirigida mediada por nucleasas (es decir, el sistema ZFN, TALEN, TtAgo o CRISPR/Cas) de una secuencia exógena o alteración del genoma mediante escisión dirigida seguida de unión de extremos no homólogos, se logra de manera eficaz en una célula. Particularmente útil para la transducción y modificación por ingeniería genética de linfocitos T y HSC/PC, sin embargo, los métodos y composiciones también pueden usarse para otros tipos de células. La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

El suministro de ZFN y el ADN molde del donador se optimizó según se detalla y los tipos de células incluyen cualquier célula madre hematopoyética o célula precursora, incluyendo células CD34+. Las células CD34+ pueden incluir subconjuntos CD34+ primitivos (CD133+CD90+ o CD90-), tempranos (CD34+, CD133+) y comprometidos (CD34+CD133-), así como linfocitos T. Los métodos descritos en el presente documento dan como resultado un injerto multilinaje a largo plazo en animales tratados con las células modificadas.

Aspectos generales

La puesta en práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones descritas en el presente documento emplean, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de la cromatina, química computacional, cultivo de células, ADN recombinante y campos relacionados como se conocen dentro del campo de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

La expresión "ácido nucleico", y los términos "polinucleótido", y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma de cadena sencilla o doble. Para los fines de la presente divulgación, estos términos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que se modifican en los restos de la base, el azúcar y/o el fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará con T.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos de origen natural.

"Unión" se refiere a la interacción específica de la secuencia, no covalente, entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su totalidad sea específica de la secuencia. Dichas interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o menos. La "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión: correlacionándose una afinidad de unión aumentada con una Kd menor.

Una "proteína de unión" es una proteína que es capaz de unirse a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse a, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión al ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteína, esta se puede unir consigo mismo (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedo de zinc tienen actividad de unión al ADN, unión al ARN y unión a proteínas.

Una "proteína de unión al ADN de dedo de zinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio con una proteína más grande, que se une al ADN de forma específica de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. La expresión proteína de unión a ADN de dedo de zinc frecuentemente se abrevia como proteína de dedo de zinc o ZFP (zinc finger protein).

Un "dominio de unión al ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más de dominios/unidades repetidas TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión de TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una "unidad de repetición" (también denominada como una "repetición") tiene normalmente de 33-35 aminoácidos de longitud y exhibe al menos homología de secuencia con otras secuencias de repetición TALE dentro de una proteína TALE de origen natural.

Los dominios de unión de dedos de zinc y TALE se pueden "modificar" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante ingeniería genética (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de un dedo de zinc o proteína TALE de origen natural. Por lo tanto, las proteínas de unión al ADN modificadas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no son de origen natural. Ejemplos no limitativos de métodos para modificar por ingeniería genética proteínas de unión a ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN modificada es una proteína que no existe en la naturaleza y cuyo diseño/composición es el resultado principalmente de criterios racionales. Los criterios lógicos para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños de ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 8.586.526; 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; véase también los documentos WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; los documentos WO 02/016536 y WO 03/016496.

Una proteína de dedo de zinc o TALE "seleccionada" es una proteína que no existe en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico, tal como la presentación en fagos, trampa de interacción o selección de híbridos. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 8.586.526; 5.789.538; US 5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084.

"TtAgo" es una proteína Argonauta procariota que se cree que está implicada en el silenciamiento génico. TtAgo deriva de la bacteria Thermus thermophilus. (Véase, por ejemplo, Swarts et al, citada anteriormente, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). Un "sistema TtAgo" tiene todos los componentes requeridos incluyendo, por ejemplo, ADN guías para la escisión por una enzima TtAgo.

"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluyen, pero sin limitación, captura de donadores por unión de extremos no homólogos (NHEj ) y recombinación homóloga. Para los fines de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble cadena en las células a través de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere una homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donadora" para reparar el molde de una molécula "diana" (es decir, el que experimentó la rotura de la doble hebra), y se conoce como "conversión génica sin entrecruzamiento" o "conversión génica de tramo corto", porque conduce a la transferencia de información genética del donador a la diana. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de errores del ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donador, y/o "hibridación de cadena dependiente de síntesis", en la que el donador se utiliza para resintetizar información genética que se convertirá en parte de la diana y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana de manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donador se incorpora al polinucleótido diana.

En los métodos de la divulgación, se pueden introducir en la célula una o más nucleasas dirigidas como se describe en el presente documento creando una rotura de doble cadena en la secuencia diana (por ejemplo, cromatina celular) en un sitio predeterminado, y un polinucleótido "donador", que tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la rotura. Se ha demostrado que la presencia de la rotura de doble cadena facilita la integración de la secuencia del donador. La secuencia del donador puede estar físicamente integrada o, como alternativa, el polinucleótido del donador se usa como molde para reparar la rotura mediante recombinación homóloga, lo que da como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donador en la cromatina celular. Por lo tanto, una primera secuencia en la cromatina celular puede alterarse y, en determinados aspectos, puede convertirse en una secuencia presente en un polinucleótido donador. Por lo tanto, el uso de los términos "reemplazar" o "reemplazo" representa el reemplazo de una secuencia de nucleótidos por otra, (es decir, el reemplazo de una secuencia en el sentido de información), y no necesariamente requiere reemplazo físico o químico de un polinucleótido por otro.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se pueden usar parejas adicionales de proteínas con dedos de zinc o TALEN para la escisión adicional de doble cadena de sitios diana adicionales dentro de la célula.

Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede usarse para la inserción de un donador de cualquier tamaño y/o la inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula mediante la integración dirigida de la secuencia donante que interrumpe la expresión del gen o genes de interés. También se proporcionan líneas celulares con genes parcial o completamente inactivados.

Por otro lado, los métodos de integración dirigida como se describe en el presente documento también se pueden usar para integrar una o más secuencias exógenas. La secuencia de ácido nucleico exógeno puede comprender, por ejemplo, uno o más genes o moléculas de ADNc, o cualquier tipo de secuencia codificante o no codificante, así como uno o más elementos de control (por ejemplo, promotores). Además, la secuencia de ácido nucleico exógeno puede producir una o más moléculas de ARN (por ejemplo, ARN de horquilla pequeña), ARN inhibidores (ARNis), microARN (miARN), etc.).

En ciertos aspectos de métodos para la recombinación dirigida y/o reemplazo y/o alteración de una secuencia en una región de interés en la cromatina celular, una secuencia cromosómica se altera por recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos "donante" exógena. Dicha recombinación homóloga es estimulada por la presencia de una rotura de la doble cadena en la cromatina celular, si están presentes secuencias homólogas a la región de la rotura.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la secuencia de nucleótidos exógena (la "secuencia donadora" o "transgén") puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a las secuencias genómicas en la región de interés, estimulando así la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por lo tanto, en determinados aspectos, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias de la región de interés exhiben entre aproximadamente el 80 y el 99 % (o cualquier número entero entre estos) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. En otros aspectos, la homología entre el donador y la secuencia genómica es superior al 99 %, por ejemplo si solo 1 nucleótido difiere entre el donador y las secuencias genómicas de más de 100 pares de bases contiguas. En determinados casos, una porción no homóloga de la secuencia donador puede contener secuencias que no están presentes en la región de interés, de modo que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga generalmente está flanqueada por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor entero entre ellas) o cualquier número de pares de bases mayor que 1.000, que son homólogas o idénticas a las secuencias en la región de interés. En otros aspectos, la secuencia donadora no es homóloga a la primera secuencia, y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homóloga.

"Escisión" se refiere a la rotura de la cadena principal de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero sin limitación, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Es posible la escisión de cadena sencilla y la escisión de cadena doble y la escisión de cadena doble puede producirse como resultado de dos eventos de escisión de cadena sencilla. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinados aspectos, los polipéptidos de fusión se usan para la escisión dirigida del ADN de doble cadena.

Un "semidominio de escisión" es una secuencia de polipéptidos que, junto con un segundo polipéptido (ya sea idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferentemente actividad de escisión de doble cadena). Las expresiones los términos "primer y segundo semidominios de escisión"; "semidominios de escisión y -" y "semidominios de escisión derecho e izquierdo" se usan indistintamente para referirse a parejas de semidominios de escisión que se dimerizan.

Un "semidominio de escisión modificado por ingeniería genética" es un semidominio de escisión que se ha modificado para formar heterodímeros obligados con otro semidominio de escisión (por ejemplo, otro semidominio modificado por ingeniería genética). Véanse, también, las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0064474, 20070218528, 2008/0131962 y 2011/0201055.

El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; pueden ser lineales, circular o ramificado y puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. El término "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donador puede tener cualquier longitud, por ejemplo entre 2 y 100.000.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre los mismos o superior a estos), preferentemente entre aproximadamente 100 y 100.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entre los mismos), más preferentemente entre aproximadamente 100 y 5.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entre ellos) e incluso más preferible, entre aproximadamente 100 y 2000 pares de bases (o cualquier valor entre ellos).

Una "secuencia homóloga, no idéntica" se refiere a una primera secuencia que comparte un grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, pero cuya secuencia no es idéntica a la de la segunda secuencia. Por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de tipo silvestre de un gen mutante es homólogo y no idéntico a la secuencia del gen mutante. En determinados aspectos, el grado de homología entre las dos secuencias es suficiente para permitir la recombinación homóloga entre ellas, utilizando mecanismos celulares normales. Dos secuencias homólogas no idénticas pueden tener cualquier longitud y su grado de no homología puede ser tan pequeño como un solo nucleótido (por ejemplo, para la corrección de una mutación puntual genómica mediante recombinación homóloga dirigida) o tan grande como 10 o más kilobases (por ejemplo, para la inserción de un gen en un sitio ectópico predeterminado en un cromosoma). No es necesario que dos polinucleótidos que comprenden las secuencias homólogas no idénticas tengan la misma longitud. Por ejemplo, un polinucleótido exógeno (es decir, polinucleótido donador) de entre 20 y 10.000 nucleótidos o pares de nucleótidos.

Las técnicas para determinar la identidad de secuencia del ácido nucleico y de los aminoácidos son conocidas en la materia. Típicamente, tales técnicas incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Las secuencias genómicas también se pueden determinar y comparar de esta manera. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótidos o aminoácidos) determinando su porcentaje de identidad usando técnicas estándar. Normalmente, el porcentaje de identidades entre secuencias es de al menos el 70-75 %, preferentemente el 80-82 %, más preferiblemente 85-90 %, incluso más preferentemente el 92 %, aún más preferentemente el 95 %, y lo más preferentemente el 98 % de identidad de secuencia.

Como alternativa, el grado de similitud de secuencia entre polinucleótidos se puede determinar mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que permitan la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de la digestión con nucleasa(s) específicas de una sola hebra y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ácidos nucleicos o dos polipéptidos son sustancialmente homólogas entre sí cuando las secuencias presentan al menos aproximadamente un 70 %-75 %, preferentemente del 80 %-82 %, más preferentemente el 85 % - 90 %, incluso más preferentemente el 92 %, aún más preferentemente el 95 %, y lo más preferentemente el 98 % de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas, tal como se determina usando los métodos convencionales conocidos en la técnica. Las condiciones para la hibridación son bien conocidas por los expertos en la técnica. La rigurosidad de la hibridación se refiere al grado en que las condiciones de hibridación desfavorecen la formación de híbridos que contienen nucleótidos mal emparejados, con mayor rigurosidad correlacionada con una menor tolerancia para híbridos no emparejados. Los factores que afectan la rigurosidad de la hibridación son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la concentración de disolventes orgánicos como, por ejemplo, formamida y dimetilsulfóxido. Tal como conocen los expertos en la materia, la rigurosidad de la hibridación aumenta con temperaturas más altas, menor fuerza iónica y menores concentraciones de disolvente.

"Cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN y proteínas, incluidas las histonas y las proteínas cromosómicas no histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados a un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN conector (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre núcleos de nucleosomas. Una molécula de histona HI generalmente se asocia con el ADN enlazador. Para los fines de la presente divulgación, el término "cromatina" pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye cromatina cromosómica y episomal.

Un "cromosoma", es un complejo de cromatina que comprende toda o parte del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, un complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas virales.

Una "región accesible" es un sitio en la cromatina celular en el que un sitio diana presente en el ácido nucleico puede unirse mediante una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, se cree que una región accesible es aquella que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura distintiva de una región accesible a menudo se puede detectar por su sensibilidad a las sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.

Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico a la que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión.

Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero puede introducirse en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto al estadio de desarrollo particular y condiciones ambientales de la célula. Por lo tanto, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula no sometida a choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, como la que se genera mediante un proceso de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípidos, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser de cadena sencilla o doble; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen aquellos capaces de formar dúplex, así como los ácidos nucleicos formadores de tríplex. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero sin limitación, proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metiladas, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico exógenos. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que está normalmente presente en la célula. Los expertos en la materia conocen los métodos para la introducción de moléculas exógenas en las células e incluyen, pero sin limitación, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, suministro de nanopartículas de biopolímero (véase Nitta y Numata (2013) Int J Mol Sci 14:1629), coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena pero derivada de una especie diferente de la que se deriva la célula. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico humano puede introducirse en una línea celular derivada originalmente de un ratón o hámster.

Por el contrario, una molécula "endógena" es aquella que normalmente está presente en una célula particular en un estadio de desarrollo particular en condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, u otro orgánulo, o un ácido nucleico episomal natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "producto de un ácido nucleico exógeno" incluye productos polinucleotídicos y polipeptídicos, por ejemplo, productos de transcripción (polinucleótidos como ARN) y productos de traducción (polipéptidos).

Una molécula de "fusión" es una molécula en donde dos o más moléculas de subunidad están unidas, preferentemente de forma covalente. Las moléculas de subunidad pueden ser del mismo tipo químico de molécula, o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y uno o más dominios de activación) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita anteriormente). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero sin limitación, una fusión entre un ácido nucleico formador de triplex y un polipéptido, y una fusión entre un ligando de unión al surco menor y un ácido nucleico.

La expresión de una proteína de fusión en una célula puede ser el resultado del suministro de la proteína de fusión a la célula o del suministro de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme en trans, la escisión de polipéptidos y la ligadura de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos de suministro de polinucleótidos y polipéptidos a las células, se presentan en otra parte de esta divulgación.

Un "gen", para los fines de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase a continuación), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, independientemente de que tales secuencias reguladoras sean o no adyacentes a las secuencias de codificación y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción, como los sitios de unión al ribosoma y los sitios internos de entrada al ribosoma, potenciadores, silenciadores, aisladores, aisladores de la cromatina, orígenes de replicación, sitios de unión de matriz y regiones de control de locus.

"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por la traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican, mediante procesos como la adición de una caperuza, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas mediante, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glucosilación.

La "modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, activación génica y represión génica. Se puede usar la edición del genoma (por ejemplo, se puede usar la edición del genoma (por ejemplo, escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una ZFP, TALE o sistema CRISPR/Cas como se describe en el presente documento. Por lo tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.

Una "región de interés" es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de o adyacente a un gen, en la cual es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser para fines de escisión dirigida del ADN y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de orgánulos (por ejemplo, un genoma de orgánulos (por ejemplo, mitocondrial, de cloroplastos), o un genoma vírico infectante, por ejemplo. Una región de interés puede estar presente en la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líderes, secuencia de remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, aguas arriba o aguas abajo de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o tener hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integral de pares de nucleótidos.

Las células "eucariotas" incluyen, pero sin limitación, células fúngicas, (tales como células de levadura), células vegetales, células animales, células de mamífero y células humanas (por ejemplo, linfocitos T).

Los "tejidos secretores" son aquellos tejidos en un animal que secretan productos de la célula individual a un lumen de algún tipo que se deriva típicamente del epitelio. Ejemplos de tejidos secretores que se localizan en el tracto gastrointestinal incluyen las células que recubren el intestino, el páncreas y la vesícula biliar. Otros tejidos secretores incluyen el hígado, tejidos asociados con el ojo y las membranas mucosas, como las glándulas salivales, glándulas mamarias, la glándula prostática, la hipófisis y otros miembros del sistema endocrino. Además, los tejidos secretores incluyen células individuales de un tipo de tejido que son capaces de secretar.

Las expresiones "enlace operativo" y "unido operativamente" (o "unido de forma operativa") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en donde los componentes están dispuestos de manera que ambos componentes funcionen normalmente y permite la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción, tal como un promotor, está operativamente unida a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción generalmente está operativamente unida en cis a una secuencia codificante, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está operativamente unida a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.

Con respecto a los polipéptidos de fusión, la expresión "unido operativamente" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función estando unido con el otro componente como lo haría si no estuviera tan unido. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión al ADN de ZFP, TALE o Cas se fusiona con un dominio de activación, el dominio de unión al ADN de ZFP, TALE o Cas y el dominio de activación están en enlace operativo si, en el péptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP, TAL o Cas puede unirse al sitio diana y/o a su sitio de unión, mientras que el dominio de activación puede regular positivamente la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión al ADN de ZFP, TALE o Cas se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión al ADN de ZFP, TALE o Cas y el dominio de escisión están en enlace operativo si, en el péptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP, TALE o Cas puede unirse al sitio diana y/o a su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en las proximidades del sitio diana (por ejemplo, 1 a 500 pares de bases o cualquier valor entre ellos en cualquier lado del sitio de ).

Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la de la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, aunque todavía mantiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de restos que la molécula nativa correspondiente y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función de la codificación, capacidad para hibridar con otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar la función de las proteínas son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, por unión al filtro, cambio de movilidad electroforética o ensayos de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel. Véase Ausubel et al., citado anteriormente. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación conjunta, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genéticos como bioquímicos. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; la patente de Estados Unidos N.° 5.585.245 y el documento PCT WO 98/44350.

Un "vector" es capaz de transferir secuencias génicas a células diana. Típicamente, "construcción de vectores", "vector de expresión", y "vector de transferencia génica", significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de genes a células diana. Por lo tanto, la expresión incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

Un "gen indicador" o "secuencia indicadora" se refiere a cualquier secuencia que produce un producto proteico que se mide fácilmente, preferentemente aunque no necesariamente en un ensayo de rutina. Los genes indicadores adecuados incluyen, pero sin limitación, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas, fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa) y proteínas que median el crecimiento celular mejorado y/o la amplificación de genes (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable. Las "etiquetas de expresión" incluyen secuencias que codifican indicadores que se pueden unir operativamente a una secuencia genética deseada para controlar la expresión del gen de interés.

Un locus de "sitio seguro" es un locus dentro del genoma en donde se puede insertar un gen sin ningún efecto nocivo sobre la célula hospedadora. Lo más beneficioso es un locus seguro en donde la expresión de la secuencia del gen insertado no se vea perturbada por ninguna expresión de ultralectura de genes vecinos. Ejemplos no limitantes de loci de puerto seguro en células de mamíferos son el gen AAVS1 (Patente de EE.UU. N.° 8.110.379), el gen CCR5 (Publicación de EE.UU. N.° 20080159996), el locus Rosa (WO 2010/065123) y/o el locus de albúmina (Publicaciones de EE.UU. N.° 20130177960 y 20130177983). Un puerto seguro en una célula vegetal es el locus ZP15 (publicación de patente de EE.UU. 20100199389).

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y hacen referencia a mamíferos, tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales, tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente" tal como se usa en el presente documento significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se pueden administrar las células madre del presente documento. Los sujetos del presente documento incluyen aquellos que han sido expuestos a una o más toxinas químicas, incluyendo, por ejemplo, una toxina nerviosa.

"Características de células madre" se refiere a la capacidad relativa de cualquier célula para actuar de manera similar a una célula madre, es decir, el grado de totipotencia, pluripotencia u oligopotencia y autorrenovación expandida o indefinida que puede tener cualquier célula madre en particular.

Nucleasas

En el presente documento se describen composiciones, particularmente nucleasas, tales como ZFN, TALE, endonucleasas de asentamiento, sistemas Ttago y/o CRISPR/Cas, que son útiles para la escisión in vivo de una molécula donadora que lleva un transgén y nucleasas para la escisión del genoma de una célula de manera que el transgén se integre en el genoma de forma dirigida. En determinados aspectos, una o más de las nucleasas son de origen natural. En otros aspectos, una o más de las nucleasas son de origen no natural, es decir, está modificada en el dominio de unión al ADN y/o el dominio de escisión. Por ejemplo, el dominio de unión al ADN de una nucleasa de origen natural puede alterarse para unirse a un sitio diana seleccionado (por ejemplo, una meganucleasa que se ha modificado por ingeniería genética para unirse a un sitio diferente al sitio de unión afín). En otros aspectos, la nucleasa comprende dominios heterólogos de unión y escisión de ADN (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc; proteínas de unión al ADN del dominio efector TAL; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de escisión heterólogos). En otros aspectos, la nucleasa comprende un sistema como el sistema CRISPR/Cas o Ttago.

A. Dominios de unión al ADN

En determinados aspectos, la composición y los métodos descritos en el presente documento emplean un dominio de unión a ADN de meganucleasa (endonucleasa autodirigida) para unirse a la molécula donadora y/o unirse a la región de interés en el genoma de la célula. Las meganucleasas naturales reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases y comúnmente se agrupan en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cyst y la familia HNH. Las endonucleasas autodirigidas ilustrativas incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, Pl-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII. Se conocen sus secuencias de reconocimiento. Véase también la patente de Estados Unidos N.° 5.420.032; la patente de Estados Unidos N.° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs.

En determinados aspectos, los métodos y composiciones descritos en el presente documento hacen uso de una nucleasa que comprende una endonucleasa autodirigida (meganucleasa) modificada (no natural). Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas y meganucleasas autodirigidas como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII son conocidas. Véase también la patente de Estados Unidos N.° 5.420.032; la patente de Estados Unidos N.° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.

280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de endonucleasas y meganucleasas autodirigidas puede modificarse por ingeniería genética para unirse a sitios diana no naturales. Véanse, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20070117128. Los dominios de unión al ADN de las endonucleasas y meganucleasas autodirigidas se pueden alterar en el contexto de la nucleasa como un todo (es decir, de manera que la nucleasa incluye el dominio de escisión afín) o se pueden fusionar a un dominio de escisión heterólogo.

En otros aspectos, el dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas utilizadas en los métodos y composiciones descritos en el presente documento comprende un dominio de unión al ADN efector de TAL de origen natural o modificado por ingeniería genética (no natural). Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.586.526. Las bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas son conocidas por provocar muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema conservado de secreción de tipo III (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran los efectores similares a los activadores de la transcripción (TAL) que imitan a los activadores transcripcionales de la planta y manipulan el transcriptoma de la planta (véase Kay et al (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación de la transcripción. Uno de los efectores TAL mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonaset et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y el documento WO2010079430). Los efectores TAL contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada repetición aproximadamente 34 aminoácidos, los cuales son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación de la transcripción ácido (para una revisión véase Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Además, en la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum se han descubierto dos genes, designados brg11 y hpx17 que son homólogos con la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa GMI1000 de R. solanacearum biovar 1 y en la cepa RS1000 biovar 4 (Véase Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Estos genes son 98,9 % idénticos en la secuencia de nucleótidos entre sí, pero difieren en una deleción de 1.575 pb en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40 % de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas. Véanse, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 8586526.

La especificidad de estos efectores TAL depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pares de bases y las repeticiones son normalmente 91-100% homólogas entre sí (Bonas et al, citada anteriormente). El polimorfismo de las repeticiones generalmente se encuentra en las posiciones 12 y 13 y parece haber una correspondencia biunívoca entre la identidad de dos restos hipervariables en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del efector TAL (véase Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326:1501 y Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512).

Experimentalmente, el código natural para el reconocimiento del ADN de estos efectores de TAL se ha determinado de modo que una secuencia de HD en las posiciones 12 y 13 conduce a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, e ING se une a T. Estas repeticiones de unión al ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones, para crear factores de transcripción artificiales que pueden interactuar con nuevas secuencias y activar la expresión de un gen indicador no endógeno en células vegetales (Boch et al., citada anteriormente). Las proteínas TAL modificadas por ingeniería genética se han asociado a un semidominio de escisión Fokl para dar una fusión de nucleasa y dominio efector TAL (TALEN) que muestra actividad en un ensayo de indicador de levadura (diana basada en plásmido). Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 8.586.526; Christian et al. ((2010)< Genetics epub 10.1534/genetics.l1o.120717).

En determinados aspectos, el dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas utilizadas para la escisión in vivo y/o la escisión dirigida del genoma de una célula comprende una proteína de dedo de zinc. Preferentemente, la proteína de dedo de zinc es una proteína de origen no natural en el sentido de que está modificada para unirse a un sitio diana de elección. Véanse, por ejemplo, Véanse, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; las Patentes de Estados Unidos N.° 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y las publicaciones de patente de Estados Unidos números 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión de dedo de zinc modificado puede tener una especificidad de unión nueva, en comparación con una proteína de dedo de zinc de origen natural. Los métodos de modificación por ingeniería genética incluyen, pero sin limitación, un diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, la utilización de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedo de zinc individuales, en las cuales cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, en las patentes estadounidenses de cotitularidad números 6.453.242 y 6.534.261.

Los ejemplos de métodos de selección, incluyendo la presentación en fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en el documento WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; y WO 01/88197. Además, la mayor especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en el documento de cotitularidad WO 02/077227.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de enlazador adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las Patentes de Estados Unidos N.° 8.772.453; 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para ejemplos de secuencias enlazadoras. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

Selección de sitios diana; Las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por un experto en la materia y se describen en detalle en las patentes de Estados Unidos números 6.140.815; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; los documentos WO 02/016536 y WO 03/016496.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de enlazador adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las Patentes de Estados Unidos N.° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para ejemplos de secuencias de enlazador de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

En determinados aspectos, el dominio de unión al ADN es parte de un sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 8.697.359, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 14/278.903. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas), que codifica los componentes del ARN del sistema, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica las proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoSComput. Biol. 1: e60) constituyen las secuencias génicas del sistema CRISPR/nucleasa Cas. Los loci CRISPR en los hospedadores microbianos contienen una combinación de genes (Cas) asociados a CRISPR, así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión del ácido nucleico mediada por CRISPR.

El CRISPR Tipo II es uno de los sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo una rotura dirigida de la doble cadena de ADN en cuatro etapas secuenciales. En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz pre-ARNcr y el ARNtracr, se transcriben desde el locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr se híbrida con las regiones repetidas del pre-ARNcr y media el procesamiento del pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espadadoras individuales. En tercer lugar, el complejo de ARNcr:ARNtracr maduro dirige a la Cas9 al ADN diana mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador del ARNcr y el protoespaciador en el ADN diana junto al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de la diana. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana para crear una rotura de doble cadena dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN extrañas en la matriz CRISPR para prevenir futuros ataques, en un proceso llamado 'adaptación', (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico extraño. Por lo tanto, en la célula bacteriana, varias de las llamadas proteínas 'Cas' están implicadas en la función natural del sistema CRISPR/Cas y desempeñan papeles en funciones tales como la inserción del ADN extraño, etc.

En determinados aspectos, La proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero sin limitación, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional para hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término "derivado" abarca variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido, modificaciones covalentes y fusiones de los mismos. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero sin limitación, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como derivados de la proteína Cas o un fragmento de los mismos, pueden obtenerse de una célula o sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce naturalmente proteína Cas, o una célula que produce naturalmente proteína Cas y está genéticamente modificada para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido de forma exógena, ácido nucleico que codifica una Cas que es igual o diferente de la Cas endógena. En algún caso, la célula no produce naturalmente la proteína Cas y está genéticamente modificada para producir una proteína Cas.

En algunos aspectos, el dominio de unión al ADN es parte de un sistema TtAgo (véase Swarts et al., citado anteriormente; Sheng et al., citado anteriormente). En eucariotas, el silenciamiento génico está mediado por la familia de proteínas Argonauta (Ago). En este paradigma, Ago está unido a ARN pequeños (19-31 nt). Este complejo de silenciamiento de proteína-ARN reconoce los ARN diana a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN pequeño y la diana y escinde endonucleolíticamente el ARN diana (Vogel (2014) Science 344:972-973). Por el contrario, las proteínas procarióticas Ago se unen a pequeños fragmentos de ADN de una sola hebra y probablemente funcionan para detectar y eliminar ADN extraño (a menudo vírico) (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts et al., citado anteriormente). Las proteínas Ago procarióticas ilustrativas incluyen las de Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides, y Thermus thermophilus.

Una de las proteínas Ago procariotas mejor caracterizadas es la de T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al., citado anteriormente). TtAgo se asocia con fragmentos de ADN monocatenario de 15 nt o 13-25 nt con grupos 5' fosfato. Este "ADN guía" unido por TtAgo sirve para dirigir el complejo proteína-ADN para que se una a una secuencia de ADN complementaria de Watson-Crick en una molécula de a Dn de terceros. Una vez que la información de la secuencia en estos ADN guía ha permitido la identificación del ADN diana, el complejo de TtAgo-ADN guía escinde el ADN diana. Dicho mecanismo también está respaldado por la estructura del complejo de ADN guía-TtAgo mientras está unido a su ADN diana (G. Sheng et al., citado anteriormente). Ago de Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) tiene propiedades similares (Olivnikov et al. citado anteriormente).

Los ADN guía exógenos de secuencia de ADN arbitraria se pueden cargar en la proteína TtAgo (Swarts et al., citado anteriormente). Dado que la especificidad de la escisión de TtAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo de TtAgo-ADN formado con un ADN guía exógeno, especificado por el investigador, dirigirá la escisión del ADN diana de TtAgo a un ADN diana complementario especificado por el investigador. De esta manera, se puede crear una rotura bicatenaria específica en el ADN. El uso del sistema de ADN guía TtAgo (o sistemas de ADN guía-Ago ortólogos de otros organismos) permite la escisión dirigida del ADN genómico dentro de las células. Tal escisión puede ser monocatenaria o bicatenaria. Para la escisión del ADN genómico de mamíferos, sería preferible utilizar una versión de TtAgo optimizada por codón para la expresión en células de mamífero. Además, podría ser preferible tratar las células con un complejo TtAgo-ADN formado in vitro donde la proteína TtAgo se fusiona con un péptido que penetra en las células. Además, podría ser preferible utilizar una versión de la proteína TtAgo que se haya alterado mediante mutagénesis para tener una actividad mejorada a 37 grados centígrados. La escisión del ^a Dⁿ mediada por ARN-Ago podría usarse para lograr una gran variedad de resultados, incluida la inactivación de genes, la adición dirigida de genes, la corrección genética, la deleción dirigida de genes usando técnicas estándar en la técnica para el aprovechamiento de roturas de ADN.

Por lo tanto, la nucleasa comprende un dominio de unión al ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen en donde se desea insertar un donador (transgén).

B. Dominios de escisión

Cualquier dominio de escisión adecuado puede unirse operativamente a un dominio de unión al ADN para formar una nucleasa. Por ejemplo, los dominios de unión a ADN de ZFP se han fusionado con dominios de nucleasa para crear ZFN, una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico a través de su dominio de unión de ADN modificado por ingeniería genética (ZFP) y hacer que el ADN se corte cerca del sitio de unión de ZFP a través de la actividad nucleasa. Véase, por ejemplo, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93(3): 1156­ 1160. Más recientemente, las ZFN se han utilizado para la modificación del genoma en una variedad de organismos. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la publicación internacional WO 07/014275. De manera análoga, los dominios de unión al ADN de TALE se han fusionado con los dominios de nucleasa para crear TALEN. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.586.526.

Tal como se ha señalado anteriormente, el dominio de escisión puede ser heterólogo respecto al dominio de unión al ADN, por ejemplo, un dominio de unión al ADN de dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión al ADN de TALEN y un dominio de escisión, o un dominio de unión al ADN de meganucleasa y un dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos se pueden obtener de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Los ejemplos de endonucleasas a partir de las cuales se puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero sin limitación, endonucleasas de restricción y endonucleasas orientadoras. Véanse, por ejemplo, el catálogo 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (por ejemplo, nucleasa S1; nucleasa de judía mungo; desoxirribonucleasa pancreática I; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se pueden usar como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.

De manera similar, un semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, tal como se ha expuesto anteriormente, que requiera la dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Como alternativa, se puede usar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede derivarse de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están dispuestos preferentemente, uno con respecto al otro, de modo que la unión de las dos proteínas de fusión a sus sitios diana respectivos coloca los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permite que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por lo tanto, en determinados aspectos, los bordes cercanos de los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios diana.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse al ADN de secuencia específica (en un sitio de reconocimiento), y escindir el ADN en o cerca del sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, Tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima Tipo IIS Fok I cataliza la escisión de doble cadena del ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982. Por lo tanto, en un aspecto, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión con dedos de zinc, que pueden estar diseñados genéticamente o no.

Un ejemplo de enzima de restricción de Tipo IIS, cuyo dominio de unión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 10,570­ 10,575. Por consiguiente, para los fines de la presente divulgación, la porción de la enzima Fokl utilizada en las proteínas de fusión desveladas se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión dirigida de la doble cadena y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de FokI-dedo de zinc, se pueden usar dos proteínas de fusión, comprendiendo, cada una, un semidominio de escisión de FokI, para reconstituir catalíticamente un dominio de escisión catalíticamente activo. Como alternativa, también se puede usar una única molécula de polipéptido que contiene un dominio de unión de dedo de zinc y dos semidominios de escisión de Fok I. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de la secuencia dirigida usando las fusiones dedo de zinc-FokI se proporcionan en otro lugar de esta divulgación.

Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier parte de una proteína que retiene la actividad de escisión, o que retiene la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.

Ejemplos de enzimas de restricción Tipo IIS se describen en la Patente de Estados Unidos 7.888.121, incorporada en el presente documento en su totalidad. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la presente divulgación. Véanse, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

En determinados aspectos, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión modificados (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o evitan la homodimerización, tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 8.772.453; 8.623.618; 8.409.861; 8.034.598; 7.914.796; y 7.888.121. Los restos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, y 538 de Fokl son todos dianas para la influencia en la dimerización de los semidominios de escisión de FokI.

Los ejemplos de semidominios de escisión modificados de FokI que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el cual un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de FokI y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos 486 y 499. Por lo tanto, en un aspecto, una mutación en 490 reemplaza Glu (E) con Lys (K); la mutación en 538 reemplaza a Iso (I) con Lys (K); la mutación en 486 reemplaza Gln (Q) con Glu (E); y la mutación en la posición 499 reemplaza Iso (I) con Lys (K). De manera específica, los semidominios de escisión modificados descritos en el presente documento se prepararon mutando las posiciones 490 (E^-K) y 538 (I^-K) en un semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión modificado designado "E490K:I538K" y mutando las posiciones 486 (Q^E) y 499 (I^-L) en otro semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión modificado designado "Q486E:I499L". Los semidominios de escisión modificados descritos en el presente documento son mutantes heterodímeros obligados en los que la escisión aberrante se minimiza o se elimina. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 7.914.796 y 8.034.598. En determinados aspectos, el semidominio de escisión modificado comprende mutaciones en las posiciones 486, 499 y 496 (numeradas en relación con Fokl de tipo silvestre), por ejemplo las mutaciones que reemplazan el resto de Gln (Q) de tipo silvestre en la posición 486 con un resto Glu (E), el resto de Iso (I) de tipo silvestre en la posición 499 con un resto Leu (L) y el resto de Asn (N) de tipo silvestre en la posición 496 con un resto Asp (D) o Glu (E) ( también denominado dominios "ELD" y "ELE", respectivamente). En otros aspectos, el semidominio de escisión modificado comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas en relación con Fokl de tipo silvestre), por ejemplo las mutaciones que reemplazan el resto de Glu (E) de tipo silvestre en la posición 490 con un resto Lys (K), el resto de Iso (I) de tipo silvestre en la posición 538 con un resto Lys (K), y el resto de His (H) de tipo silvestre en la posición 537 con un resto de Lys (K) o un resto de Arg (R) (también denominados dominios "KKK" y "KKR", respectivamente). En otros aspectos, el semidominio de escisión modificado por ingeniería genética comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numeradas en relación con Fokl de tipo silvestre), por ejemplo, mutaciones que reemplazan el resto de Glu (E) de tipo silvestre en la posición 490 con un resto de Lys (K) y el resto His (H) de tipo silvestre en la posición 537 con un resto de Lys (K) o un resto de Arg (R) (también denominados dominios "KIK" y "KIR", respectivamente). Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.772.453. En otros aspectos, el semidominio de escisión modificado por ingeniería genética comprende las mutaciones "Sharkey" y/o "Sharkey" (véase Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).

Los semidominios de escisión modificados descritos en el presente documento pueden prepararse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de semidominios de escisión de tipo silvestre (FokI) como se describe en las patentes de Estados Unidos números 8.772.453; 8.623.618; 8.409.861; 8.034.598; 7.914.796; y 7.888.121.

Como alternativa, las nucleasas se pueden ensamblar en vivo en el sitio de destino del ácido nucleico utilizando la tecnología denominada "enzima dividida" (véase, por ejemplo, publicación de patente de EE. UU. n.° 20090068164). Los componentes de tales enzimas divididas se pueden expresar en construcciones de expresión separadas, o se pueden unir en un marco de lectura abierto donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A autoescindible o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión de dedos de zinc individuales o dominios de un dominio de unión de ácido nucleico de meganucleasa.

Las nucleasas pueden seleccionarse para detectar actividad antes de su uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico basado en levadura como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 8.563.314.

La expresión de la nucleasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, por ejemplo el promotor de galactocinasa que se activa (desreprimido) en presencia de rafinosa y/o galactosa y reprimido en presencia de glucosa.

El sistema CRISPR/Cas relacionado con Cas9 comprende dos componentes no codificantes de ARN: ARNtracr y una matriz de pre-ARNcr que contiene secuencias de guía de nucleasa (espaciadores) intercaladas por repeticiones directas idénticas (RD). Para utilizar un sistema CRISPR/Cas para lograr la modificación por ingeniería genética del genoma, ambas funciones de estos ARN deben estar presentes (véase Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). En algunos aspectos, el ARNtracr y pre-ARNcr se suministran mediante construcciones de expresión independientes o como ARN independientes. En otros aspectos, se construye un ARN quimérico donde un ARNcr maduro diseñado (que confiere especificidad de la diana) se fusiona con un ARNtracr (que suministra interacción con el Cas9) para crear un híbrido cr-ARN-ARNtracr quimérico (también denominado ARN guía único). (véase Jinek citado anteriormente y Cong, citado anteriormente).

Sitios diana

Tal como se describe en detalle anteriormente, los dominios de ADN pueden modificarse para unirse a cualquier secuencia de elección. Un dominio de unión al ADN modificado puede tener una especificidad de unión nueva, en comparación con un dominio de unión al ADN natural. Los métodos de modificación por ingeniería genética incluyen, pero sin limitación, un diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, la utilización de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedo de zinc individuales, en las cuales cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véanse, por ejemplo, en las patentes estadounidenses de cotitularidad números 6.453.242 y 6.534.261. También se puede realizar el diseño racional de dominios efectores TAL. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.586.526.

Los ejemplos de métodos de selección aplicables a los dominios de unión al ADN, incluyendo la presentación en fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en el documento WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, la mayor especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en el documento de cotitularidad WO 02/077227.

Selección de sitios diana; las nucleasas y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por un experto en la materia y se describen en detalle en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 20050064474 y 20060188987.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de unión al ADN (p. ej., proteínas de dedo de zinc de múltiples dedos) pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de enlazador adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para ejemplos de secuencias de enlazador de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dominios de unión al ADN individuales de la proteína. Véanse, también, la patente de EE.UU. N.° 8.586.526. Los ejemplos no limitantes de genes diana adecuados incluyen un gen de globina beta (p) (HBB), un gen de globina gamma (8) (HBG1), un gen de linfoma/leucemia de linfocitos B 11A (BCL11A), un gen del factor 1 tipo Kruppel (KLF1), un gen CCR5, un gen CXCR4, un gen PPP1R12C (AAVS1), un gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), un gen de la albúmina, un gen del factor VIII, un gen del factor IX, un gen de la cinasa de repetición 2 rico en leucina (LRRK2), un gen de huntingina (Htt), un gen de rodopsina (RHO), un gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), un gen de la proteína B tensioactiva (SFTPB), un gen del receptor alfa de linfocitos T (TRAC), un gen del receptor beta de linfocitos T (TRBC), un gen de muerte celular programada 1 (PD1), un gen del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4), un gen del antígeno leucocitario humano (HLA) A, un gen HlA B, un gen HLA C, un gen HLA-DPA, un gen HlA-DQ, un gen HLA-DRA, un gen LMP7, un vehículo asociado con el gen de procesamiento de antígenos (TAP) 1, un gen TAP2, un gen de tapasina (TAPBP), un gen transactivador del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (CIITA), un gen de la distrofina (DMD), un gen del receptor de glucocorticoides (GR), un gen IL2RG, un gen Rag-1, un gen RFX5, un gen FAD2, un gen FAD3, un gen ZP15, un gen KASII, un gen MdH y/o un gen EPSPS.

En determinados aspectos, la nucleasa se dirige a un loci de "puerto seguro" como los genes AAVS1, HPRT, albúmina y CCR5 en células humanas, y Rosa26 en células murinas (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; 8.586.526; las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960) y el locus Zp15 en plantas (véase la Patente de Estados Unidos US 8.329.986).

Donadores

La presente divulgación se refiere a la integración dirigida mediada por nucleasa de una secuencia exógena en el genoma de una HSC/PC. Tal como se ha señalado anteriormente, inserción de una secuencia exógena (también llamada "secuencia donadora" o "donador" o "transgén"), por ejemplo, para la corrección de un gen mutante o para el aumento de la expresión de un gen de tipo silvestre o para la expresión de un transgén. Resultará fácilmente evidente que la secuencia donadora no es típicamente idéntica a la secuencia genómica donde se coloca. Una secuencia donadora puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir una HDR eficaz en la ubicación de interés. Además, las secuencias donadoras pueden comprender una molécula de vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donadora puede contener varias regiones discontinuas de homología con la cromatina celular. Por ejemplo, para la inserción dirigida de secuencias que normalmente no están presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico donador y flanqueadas por regiones de homología con la secuencia en la región de interés.

En el presente documento se describen métodos de inserción dirigida de cualquier polinucleótido para su inserción en una ubicación elegida. Los polinucleótidos para inserción también pueden denominarse polinucleótidos "exógenos", polinucleótidos o moléculas "donadoras" o "transgenes". El polinucleótido donador puede ser ADN o ARN, monocatenarios y/o bicatenarios y pueden introducirse en una célula en forma lineal o circular. Véanse, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20100047805 y 20110207221. La secuencia o secuencias donadoras también se pueden introducir en forma de ADN MC, que puede introducirse en la célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia del donador pueden protegerse (por ejemplo, de la degradación exonucleolítica) por métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se añaden uno o más restos de didesoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula lineal y/o los oligonucleótidos autocomplementarios se ligan a uno o ambos extremos. Véanse, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero sin limitación, adición de grupo(s) amino terminal y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa. Si se introduce en forma bicatenaria, el donador puede incluir uno o más sitios diana de nucleasa, por ejemplo, sitios diana de nucleasa que flanquean el transgén para integrarse en el genoma de la célula. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° 20130326645.

Se puede introducir un polinucleótido en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican la resistencia a los antibióticos. Además, los polinucleótidos del donador se pueden introducir como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico formando un complejo con un agente, tal como un liposoma, nanopartícula o poloxámero, o se pueden suministrar mediante virus (por ejemplo, adenovirus, VAA, herpesvirus, retrovirus, lentivirus y lentivirus defectuoso en integrasa (IDLV)).

En determinados aspectos, el donador bicatenario incluye secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes, también denominados transgenes) de más de 1 kb de longitud, por ejemplo entre 2 y 200 kb, entre 2 y 10 kb (o cualquier valor entre ellos). El donador bicatenario también incluye al menos un sitio diana de nucleasa, por ejemplo. En determinados aspectos, el donador incluye al menos 2 sitios diana, por ejemplo, para un par de ZFN o TALEN. Típicamente, los sitios diana de nucleasa están fuera de las secuencias transgénicas, por ejemplo, 5' y/o 3' de las secuencias transgénicas, para la escisión del transgén. El sitio o sitios de escisión de nucleasa pueden ser para cualquier nucleasa. En determinados aspectos, el sitio o sitios diana de nucleasa contenidos en el donador bicatenario son para las mismas nucleasas utilizadas para escindir la diana endógena en la que se integra el donador escindido mediante métodos independientes de la homología.

El donador generalmente se inserta de modo que su expresión sea promovida por el promotor endógeno en el sitio de integración, es decir, el promotor que promueva la expresión del gen endógeno en el que se inserta el donador (por ejemplo, globina, AAVS1, etc.). Sin embargo, será evidente que el donador puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico de tejido.

La molécula donadora puede insertarse en un gen endógeno de modo que se exprese todo, parte o nada del gen endógeno. En otros aspectos, el transgén (por ejemplo, con o sin secuencias que codifican péptidos) se integra en cualquier locus endógeno, por ejemplo, un locus de puerto seguro. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. 20080299580; 20080159996 y 201000218264.

Por otro lado, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción o de la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios de entrada del ribosoma internos, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, pueden incluirse secuencias aceptoras de corte y empalme. Las secuencias de sitios aceptores de corte y empalme ilustrativas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, solo a modo de ejemplo, CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG, (SEQ ID NO: 29) (del gen HBB humano) y TTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO: 30) (del gen de inmunoglobulina gamma humana).

Los transgenes transportados en las secuencias donadoras descritas en el presente documento pueden aislarse de plásmidos, células u otras fuentes que utilizan técnicas convencionales conocidas en la técnica tales como PCR. Los donadores para su uso pueden incluir diversos tipos de topología, incluyendo circular superenrollado, circular relajado, lineal y similares. Como alternativa, se pueden sintetizar químicamente usando técnicas estándar de síntesis de oligonucleótidos. Además, los donadores pueden estar metilados o carecer de metilación. Los donadores pueden estar en forma de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BAC o YAC).

Los polinucleótidos donadores bicatenarios descritos en el presente documento pueden incluir una o más bases y/o cadenas principales no naturales. En particular, la inserción de una molécula donadora con citosinas metiladas se puede llevar a cabo usando los métodos descritos en el presente documento para lograr un estado de quiescencia transcripcional en una región de interés.

El polinucleótido exógeno (donador) puede comprender cualquier secuencia de interés (secuencia exógena). Las secuencias exógenas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a ninguna secuencia codificadora de polipéptidos (por ejemplo, ADNc o fragmentos de los mismos), secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, etiquetas de epítopos, genes marcadores, sitios de reconocimiento de enzimas de escisión y varios tipos de construcciones de expresión. Los genes marcadores incluyen, pero sin limitación, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas, fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa) y proteínas que median el crecimiento celular mejorado y/o la amplificación de genes (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLA^g , His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable.

En un aspecto preferido, la secuencia exógena (transgén) comprende un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido cuya expresión en la célula se desee, incluyendo, pero sin limitación a anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores (de superficie celular o nucleares), hormonas, linfocinas, citocinas, polipéptidos indicadores, factores de crecimiento y fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores. Las secuencias codificantes pueden ser, por ejemplo, ADNc. Las secuencias exógenas también pueden ser un fragmento de un transgén para unirse con una secuencia de un gen endógeno de interés. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento de un transgén que comprende la secuencia en el extremo 3' de un gen de interés para corregir, mediante inserción o sustitución, de una secuencia que codifica una mutación en el extremo 3' de una secuencia génica endógena. De manera similar, el fragmento puede comprender secuencias similares al extremo 5' del gen endógeno para la inserción/sustitución de las secuencias endógenas para corregir o modificar dicha secuencia endógena. Además, el fragmento puede codificar un dominio funcional de interés (catalítico, secretor o similar) para enlazar in situ a una secuencia de genes endógenos para producir una proteína de fusión.

Por ejemplo, la secuencia exógena puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido que falta o no es funcional en el sujeto que tiene una enfermedad genética, incluyendo pero no limitado a cualquiera de las siguientes enfermedades genéticas: acondroplasia, acromatopsia, deficiencia de maltasa ácida, deficiencia de adenosina desaminasa (OMIM N.° 102700), adrenoleucodistrofia, síndrome de aicardi, deficiencia de alfa-1 antitripsina, alfatalasemia, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, síndrome de apertura ventricular derecha arritmogénica, displasia, ataxia telangiectasia, síndrome de Barth, beta-talasemia, síndrome de nevus azul, enfermedad de Canavan, enfermedades granulomatosas crónicas (EGC), síndrome del maullido del gato, fibrosis quística, enfermedad de Dercum, displasia ectodérmica, anemia de fanconi, fibrodisplasia osificante progresiva, síndrome del cromosoma X frágil, galactosemia, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis generalizada (por ejemplo, GM1), hemocromatosis, la mutación de la hemoglobina C en el 6° codón de beta-globina (HbC), hemofilia, enfermedad de Huntington, síndrome de Hurler, hipofosfatasia, síndrome de Klinefelter, enfermedad de Krabbe, síndrome de Langer-Giedion, deficiencia de adhesión de leucocitos (LAD, OMIM N.° 116920), leucodistrofia, síndrome de QT largo, síndrome de Marfan, síndrome de Moebius, mucopolisacaridosis (MPS), síndrome de rótula ungueal, diabetes insípida nefrogénica, neurofibromatosis, enfermedad de Neimann-Pick, osteogénesis imperfecta, porfiria, síndrome de Prader-Willi, progeria, síndrome de Proteus, retinoblastoma, síndrome de Rett, Síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sanfilippo, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), síndrome de Shwachman, anemia de células falciformes (anemia de células falciformes), síndrome de Smith-Magenis, Síndrome de Stickler, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de trombocitopenia ausente del radio (TAR), síndrome de Treacher Collins, trisomía, esclerosis tuberosa, síndrome de Turner, trastorno del ciclo de la urea, enfermedad de von Hippel-Landau, síndrome de Waardenburg, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP, OMIM N.° 308240).

Enfermedades ilustrativas adicionales que pueden tratarse mediante integración dirigida incluyen inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, enfermedad de Gaucher, GM1, Enfermedad de Fabry y enfermedad de Tay-Sachs), mucopolisacaridosis (por ejemplo, enfermedad de Hunter, enfermedad de Hurler), hemoglobinopatías (por ejemplo, las enfermedades de células falciformes, HbC, a-talasemia, p-talasemia) y hemofilias.

En determinados aspectos, las secuencias exógenas pueden comprender un gen marcador (descrito anteriormente), permitiendo la selección de células que se han sometido a una integración dirigida y una secuencia enlazada que codifica una funcionalidad adicional. Los ejemplos no limitantes de genes marcadores incluyen GFP, marcador(es) de selección de fármacos y similares.

Las secuencias de genes adicionales que se pueden insertar pueden incluir, por ejemplo, genes de tipo silvestre para reemplazar secuencias mutadas. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia del gen del Factor IX de tipo silvestre en el genoma de una célula madre en la que se muta la copia endógena del gen. La copia de tipo silvestre puede insertarse en el locus endógeno o, como alternativa, puede dirigirse a un locus de puerto seguro.

La construcción de tales casetes de expresión, siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, utiliza metodologías bien conocidas en la técnica de la biología molecular (véase, por ejemplo, Ausubel o Maniatis). Antes de usar el casete de expresión para generar un animal transgénico, la capacidad de respuesta del casete de expresión al inductor de estrés asociado con elementos de control seleccionados se puede probar introduciendo el casete de expresión en una línea celular adecuada (por ejemplo, células primarias, células transformadas o líneas celulares inmortalizadas).

Por otro lado, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden ser secuencias reguladoras de la transcripción o de la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios de entrada del ribosoma internos, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, los elementos de control de los genes de interés pueden unirse operativamente a genes informadores para crear genes quiméricos (por ejemplo, casetes de expresión indicadores).

También se puede lograr la inserción dirigida de la secuencia de ácido nucleico no codificante. Las secuencias que codifican ARN antisentido, ARNi, ARNhc y micro ARN (miARN) para inserciones dirigidas también se pueden usar. En aspectos adicionales, el ácido nucleico donador puede comprender secuencias no codificantes que son sitios diana específicos para diseños de nucleasas adicionales. Posteriormente, se pueden expresar nucleasas adicionales en las células de manera que la molécula donadora original se escinde y modifica mediante la inserción de otra molécula donadora de interés. De esta manera, se pueden generar integraciones reiterativas de moléculas donadoras que permitan el apilamiento de rasgos en un locus de interés particular o en un locus de puerto seguro. El donador (o donadores) se puede(n) suministrar antes, simultáneamente o después de que las nucleasas se introduzcan en una célula. En determinados aspectos, el(los) donador(es) se suministra(n) simultáneamente con la(s) nucleasa(s). En otros aspectos, los donadores se suministran antes de la(s) nucleasa(s), por ejemplo, segundos a horas o días antes de los donadores, incluyendo, pero sin limitación, 1 a 60 minutos (o en cualquier momento intermedio) antes de la(s) nucleasa(s), 1 a 24 horas (o en cualquier momento intermedio) antes de la(s) nucleasa(s) o más de 24 horas antes de la(s) nucleasa(s). En determinados aspectos, el donador se suministra después de la nucleasa, preferentemente en 4 horas.

Los donadores pueden suministrarse utilizando los mismos sistemas de suministro que los de la(s) nucleasa(s). Cuando se suministra de manera simultánea, los donadores y las nucleasas pueden estar en el mismo vector, por ejemplo, un vector de AAV (por ejemplo, AAV6). En determinados aspectos, los donadores se suministran usando un vector AAV y la(s) nucleasa(s) se suministra(n) en forma de ARNm.

Células

Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan células genéticamente modificadas, por ejemplo, células primarias HSC/PC o linfocitos T que comprenden un transgén, incluyendo un transgén que expresa una proteína funcional en la célula. También se proporcionan células producidas por los métodos descritos en el presente documento. El transgén se integra de manera dirigida en el genoma de la célula utilizando una o más nucleasas. En determinados aspectos, el transgén está integrado en un gen de puerto seguro.

A diferencia de la integración aleatoria, la integración dirigida asegura que el transgén se integre en un gen o locus específico. El transgén puede integrarse en cualquier parte del gen diana. En determinados aspectos, el transgén está integrado en o cerca del sitio de escisión de la nucleasa, por ejemplo, en 1-300 (o cualquier valor entre los mismos) pares de bases aguas arriba o aguas abajo del(los) sitio(s) de escisión, más preferentemente en 1-100 pares de bases (o cualquier valor entre los mismos) de cada lado del(los) sitio(s) de unión y/o escisión, incluso más preferentemente en 1 a 50 pares de bases (o cualquier valor entre los mismos) de cada lado del(los) sitio(s) de unión y/o escisión. En determinados aspectos, la secuencia integrada que comprende el transgén no incluye ninguna secuencia de vector (por ejemplo, secuencias de vector vírico).

Cualquier tipo de célula puede modificarse genéticamente como se describe en el presente documento, incluyendo pero no limitado a células y líneas celulares. Otros ejemplos no limitantes de células como se describen en el presente documento incluyen linfocitos T (por ejemplo, CD4+, CD3+, CD8+, etc.); células dendríticas; linfocitos B; células madre autólogas (por ejemplo, que provienen del paciente) o pluripotentes, totipotentes o multipotentes heterólogas (por ejemplo, células CD34+, incluidas las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre embrionarias o similares). En determinados aspectos, las células que se describen en el presente documento son células CD34+ que provienen de un paciente con un trastorno que se desea tratar. Las células madre embrionarias humanas están excluidas del alcance de la invención.

Las células descritas en el presente documento son útiles para tratar y/o prevenir un trastorno, por ejemplo, por terapias ex vivo. Los métodos llevados a cabo en un cuerpo humano o animal vivo están excluidos del alcance de la invención. Las células modificadas con nucleasa se pueden expandir y luego reintroducir en el paciente utilizando técnicas convencionales. Véanse, por ejemplo, Tebas et al (2014) New Eng J Med 370(10):901. En el caso de células madre, después de la infusión en el sujeto, también se produce la diferenciación in vivo de estos precursores en células que expresan el transgén funcional. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las células descritas en el presente documento. Además, las células pueden crioconservarse antes de la administración a un paciente.

Administración

Las nucleasas, los polinucleótidos que codifican estas nucleasas, los polinucleótidos donadores y las composiciones que comprenden las proteínas y/o los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden suministrarse in vivo o ex vivo mediante cualquier medio adecuado.

Las células adecuadas incluyen células eucariotas (por ejemplo, animales) y procariotas y/o líneas celulares. Los ejemplos no limitantes de dichas células o líneas celulares generadas a partir de dichas células incluyen células COS, CHO (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y perC6, así como células de insectos tales como Spodoptera fugiperda (Sf), o células fúngicas tales como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. En determinados aspectos, la línea celular es una línea celular CHO, MDCk o HEK293. Las células adecuadas también incluyen células madre, tales como, a modo de ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales y células madre mesenquimales.

Los métodos para administrar nucleasas como se describe en el presente documento se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.

Las construcciones de nucleasas y/o donadores como se describe en el presente documento, también pueden suministrarse usando vectores que contienen secuencias que codifican uno o más de los sistemas ZFN, TALEN o CRISPR/Cas. Se puede usar cualquier sistema de vectores incluyendo, pero sin limitación, vectores plasmídicos, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etc. Véanse, también, las Patentes de Estados Unidos N.° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Por otro lado, será evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento. Por lo tanto, cuando una o más nucleasas y una construcción de donador se introducen en la célula, las nucleasas y/o el polinucleótido donador pueden transportarse en el mismo vector o en diferentes vectores (MC de ADN). Cuando se usan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples nucleasas y/o construcciones de donadores.

Se pueden usar métodos convencionales de transferencia génica basados en genes víricos y/o no víricos para introducir ácidos nucleicos que codifican nucleasas y construcciones de donadores en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Los sistemas de suministro de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN o ARN, MC de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico formando un complejo con un vehículo de suministro, tal como un liposoma, nanopartícula o poloxámero. Los sistemas de suministro de vectores víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episómicos o integrados después del suministro a la célula. Para una revisión de suministro in vivo de proteínas de unión a ADN modificadas y de proteínas de fusión que comprenden estas proteínas de unión, véase, por ejemplo, Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi et al. (2007) Nature Biotech. 25(12):1444-1454, así como referencias generales de suministro de genes tales como Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, otra nanopartícula, conjugados de policationes o ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN reforzada con un agente. La sonoporación que usa, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede usar para el suministro de ácidos nucleicos. Sistemas adicionales e ilustrativos de suministro de ácido nucleico incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase, por ejemplo, el documento US6008336). La lipofección se describe en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptor incluyen los de Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024.

La preparación de los complejos lípido:ácido nucleico, incluidos los liposomas dirigidos tales como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.

52:4817-4820 (1992); patentes de Estados Unidos números 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).

Como métodos adicionales de suministro se incluyen el uso del empaquetamiento de los ácidos nucleicos que se van a suministrar en vehículos de suministro EnGeneIC (EDV, EnGenelC delivery vehicles). Estos e Dv se suministran específicamente a los tejidos diana utilizando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana y después el EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (véase MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

El uso de sistemas basadosen virus de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos que codifican los sistemas ZFP, TALE y/o CRISPR/Cas modificados por ingeniería genética aprovechan los procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas del cuerpo y trasladar la carga vírica útil al núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a los pacientes (in vivo) o pueden usarse para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para el suministro de las ZFP incluyen, pero sin limitación, vectores retrovíricos, de lentivirus, adenovíricos, adenoasociados, del virus vaccinia y del herpes simple para la transferencia génica. La integración en el genoma del hospedador es posible con los métodos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus, y virus adenoasociados, lo que a menudo tiene como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse incorporando proteínas de la envoltura extrañas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y normalmente producen altos títulos víricos. La selección de un sistema de transferencia génica retrovírica depende del tejido diana. Los vectores retrovíricos están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que se utilizan a continuación para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovíricos ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de leucemia del gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700). En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se ha obtenido un alto título y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); la patente de Estados Unidos N.° 4.797.368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la patente de Estados Unidos. N.° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Actualmente existen al menos seis enfoques de vectores víricos para la transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos mediante genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovíricos que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50 % o más en vectores empaquetados en MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997). Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas prometedores de suministro de genes alternativos basados en el virus adenoasociado parvovirus de tipo 2 defectuoso y no patógeno. Todos los vectores se obtienen de un plásmido que conserva solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb del AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. La transferencia eficiente de genes y el suministro estable de transgenes debido a la integración en los genomas de la célula transducida, son características clave de este sistema de vectores. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Otros serotipos de AAV, incluyendo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAVrh.10 y cualquier serotipo de AAV novedoso también se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación. En algunos aspectos, el AAV quimérico se usa cuando los orígenes víricos de las secuencias LTR del ácido nucleico vírico son heterólogos al origen vírico de las secuencias de la cápside. Los ejemplos incluyen virus quiméricos con LTR derivados de AAV2 y cápsides derivadas de AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9 (es decir, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 y AAV2/9, respectivamente).

Los vectores adenovíricos (Ad) recombinantes deficientes en replicación pueden producirse a un título alto e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus están modificados de tal manera que un transgén reemplaza los genes Ad E1a, E1b, y/o E3; posteriormente el vector defectuoso de replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células que no se dividen, células diferenciadas, tales como las que existen en el hígado, riñón y músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico incluyó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Los ejemplos adicionales del uso de vectores para la transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Las células de empaquetamiento se usan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula hospedadora. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan AAV y adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos utilizados en la terapia génica generalmente son generados por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula vírica. Los vectores normalmente contienen las secuencias víricas mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un hospedador (si corresponde), siendo reemplazadas otras secuencias víricas por un casete de expresión que codifica la proteína a expresar. Las funciones virales que faltan se administran en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica generalmente poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del hospedador. El ADN vírico se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, concretamente rep y cap, pero que carece de las secuencias ITR. La línea celular también se infecta con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, por ejemplo, tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV. En algunos aspectos, El AAV se produce utilizando un sistema de expresión de baculovirus.

En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica se suministre con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. Por consiguiente, un vector viral puede modificarse para tener especificidad para un tipo de célula dado al expresar un ligando como una proteína de fusión con una proteína de cubierta viral en la superficie externa del virus. El ligando se elige de modo que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Ee .UU 92:9747-9751 (1995) se describe que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de virus-célula diana, en los cuales la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, se pueden modificar por ingeniería genética fagos filamentosos para mostrar fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, los mismos principios se pueden aplicar a los vectores no virales. Dichos vectores pueden modificarse para contener secuencias de captación específicas que favorecen la captación por células diana específicas.

Los vectores de terapia génica pueden suministrarse in vivo mediante la administración a un paciente individual, normalmente mediante administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, o infusión intracraneal) o aplicación tópica, como se describe a continuación. Como alternativa, los vectores se pueden suministrar a células ex vivo, tal como las células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, los linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donadores universales, seguido de reimplantación de las células en un paciente, generalmente después de la selección de células que han incorporado el vector.

Vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o construcciones de donador también se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de las células in vivo. Como alternativa, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza por cualquiera de las vías que normalmente se utilizan para introducir una molécula en contacto final con las células sanguíneas o tisulares incluyendo, pero sin limitación, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la materia y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar un camino más inmediato y más eficaz que otra vía.

Los vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos (por ejemplo, codificadores y/o donadores de nucleasas de cadena doble) descritos en el presente documento incluyen vectores de lentivirus no integrantes (IDLV). Véanse, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; publicación de patente de Estados Unidos N.° 2009/054985.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden determinarse en parte por la composición particular que se administre, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, tal como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

Será evidente que las secuencias que codifican la nucleasa y las construcciones del donador pueden suministrarse utilizando el mismo sistema o sistemas diferentes. Por ejemplo, las nucleasas y los donadores se pueden transportar en el mismo vector (por ejemplo, MC). Como alternativa, un polinucleótido donador puede ser transportado por un MC, mientras que una o más nucleasas pueden ser transportadas por un plásmido estándar o vector de AAV. Por otro lado, los diferentes vectores pueden administrarse por la misma o diferentes vías (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal y/o inyección intramuscular. Los vectores pueden suministrarse simultáneamente o en cualquier orden secuencial.

Por lo tanto, la presente divulgación incluye el tratamiento in vivo o ex vivo de enfermedades y afecciones que son susceptibles de la inserción de un transgén que codifica una proteína terapéutica, por ejemplo, el tratamiento de las hemofilias mediante la integración de factores de coagulación mediada por nucleasas, como el factor VIII (F8). Las composiciones se administran a un paciente humano en una cantidad eficaz para obtener la concentración deseada del polipéptido terapéutico en el suero o en el órgano o células diana. La administración puede ser por cualquier medio en el cual los polinucleótidos se suministren a las células diana deseadas. Por ejemplo, se contemplan los métodos in vivo y ex vivo. La inyección intravenosa en la vena porta es un método preferido de administración. Otros modos de administración in vivo incluyen, por ejemplo, inyección directa en los lóbulos del hígado o el conducto biliar e inyección intravenosa distal al hígado, incluyendo a través de la arteria hepática, inyección directa en el parénquima hepático, inyección través de la arteria hepática y/o inyección retrógrada a través del árbol biliar. Los modos de administración ex vivo incluyen transducción in vitro de hepatocitos resecados u otras células del hígado, seguido de infusión de los hepatocitos resecados, transducidos de nuevo a la vasculatura portal, el parénquima hepático o el árbol biliar del paciente humano, véase, por ejemplo, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

La cantidad eficaz de nucleasa y donador a administrar variará de un paciente a otro y de acuerdo con el polipéptido terapéutico de interés. Por consiguiente, las cantidades efectivas se determinan mejor por el médico que administra las composiciones y las dosis apropiadas se pueden determinar fácilmente por un experto en la materia. Después de permitir suficiente tiempo para la integración y la expresión (por lo general, 4-15 días, por ejemplo), el análisis del suero u otros niveles de tejido del polipéptido terapéutico y la comparación con el nivel inicial antes de la administración determinarán si la cantidad administrada es demasiado baja, está dentro del intervalo correcto o si es demasiado alta. Los regímenes adecuados para las administraciones iniciales y posteriores también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de administraciones posteriores si es necesario. Las administraciones posteriores pueden administrarse a intervalos variables, que van desde diariamente a anualmente a cada varios años. El experto en la materia apreciará que se pueden recomendar técnicas inmunosupresoras apropiadas para evitar la inhibición o el bloqueo de la transducción por inmunosupresión de los vectores de suministro, véase, por ejemplo, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

Las formulaciones para las administraciones ex vivo e in vivo incluyen suspensiones en líquidos o líquidos emulsionados. Los principios activos se mezclan a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tal como, agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, agentes estabilizantes u otros reactivos que mejoran la eficacia de la composición farmacéutica.

Los siguientes ejemplos se refieren a aspectos ilustrativos de la presente divulgación en donde la nucleasa comprende una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), un TALEN o un sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Se apreciará que esto es solo para fines ilustrativos y que se pueden usar otras nucleasas, por ejemplo, los sistemas Ttago, endonucleasas autodirigidas (meganucleasas) con dominios de unión a ADN modificados y/o fusiones de dominios de unión a ADN de endonucleasas autodirigidas (meganucleasas) de origen natural y dominios de escisión heterólogos y/o fusiones de meganucleasas y proteínas TALE.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensamblaje de nucleasas de dedo de zinc

Las ZFN se ensamblaron contra los genes CCR5 y AAVS1 humanos y se probaron mediante ensayos ELISA y CEL1 como se describe en Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785. Para ZFN específicas de CCR5, véase la patente de EE.UU. N.° 7.951.925 y para las ZFN específicas de AAVS1, véase la patente de EE.UU. N.° 8.110.379.

Ejemplo 2: Suministro de donador AAV-GFP a células CD34+

Para probar el AAV como vehículo para el suministro de moléculas donadoras a células CD34+, se evaluaron cuatro serotipos de AAV diferentes. Los vectores AAV se construyeron con un transgén de eGFP dirigido por CMV insertado entre las LTR específicas de serotipo. Los serotipos de AAV probados, incluidos AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 y AAV2. En estos vectores de AAV, toda la secuencia de ácido nucleico que codifica la ZFN está flanqueada por las ITR de AAV2 y luego se encapsula utilizando proteínas de la cápside de AAV5, 6 u 8, respectivamente. (véase Grimm y Kay (2003) Current Gene Therapy 3: 281-304).

La producción del donador que contenía partículas de virus se realizó mediante preparación usando un sistema de HEK293 usando métodos estándar en la técnica (Véase Li et al, citada anteriormente, véase, por ejemplo, el documento US6723551). Las células CD34+ de sangre periférica movilizada (mPBCD34+), que son de leucocitaféresis movilizada con G-CSF y purificadas por selección positiva usando el sistema Milenyi CliniMACS (Miltenyi Biotech, Alemania) se transdujeron con los vectores de AAV indicados que contienen el transgén de eGFP dirigido por CMV cultivando las células en presencia de vectores de AAV. A continuación, las células se recogieron a los 2 y 5 días después de la infección (ddi) y se analizaron para determinar la expresión de GFP usando un citómetro de flujo (Guava, Millipore) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Los resultados, como se muestra en la Figura 1, demostraron que las partículas donadoras de AAV2/6-GFP fueron capaces de generar más de 6 veces más GFP que expresa CD34+ HSC/PC que las células transducidas con los otros serotipos de AAV en estas condiciones.

Ejemplo 3: Suministro de un transgén vehículo de RFLP usando AAV2/6

Para probar la integración dirigida en células CD34+, se generó un donador de AAV6-R5-160-XhoI. En el inserto transgénico en este vector vírico, se introdujo un sitio de la enzima de restricción Xhol entre dos sitios de unión de ZFN específicos de CCR5 (Figura 2A), Par ZFN 8267:20505 (también denominado 8196z). El sitio Xhol está flanqueado por brazos de homología cuya secuencia es homóloga a las regiones del genoma que flanquean el sitio de escisión de ZFN en el genoma. De manera específica, el brazo de homología derecho tiene aproximadamente 1351 pares de bases mientras que el brazo de homología izquierdo tiene aproximadamente 509 pares de bases. El donador de AAV6-R5-160-XhoI se transdujo en células CD34+ como se describió anteriormente a dosis entre 300-1e5 vg/célula. Un día después, se introdujo ARNm que codificaba la ZFN específica de CCR5 (120 pg/ml) en células transducidas mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). El ARNm se fabricó por Asuragen (Austin, TX) como una construcción 2A (8267-2A-2050) y se usó a 120 ug/ml.

Las células se recogieron 5 días después de la infección (ddi) para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para el posterior ensayo RFLP (Figura 2B) y secuenciación profunda de Illumina (Figura 2C). El ADN genómico se aisló usando un kit NucleoSpin Tissue XS (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA). El ensayo de RFLP se realizó utilizando un enfoque de PCR anidado en el que la región que rodea el sitio de escisión de z Fn se amplificó por primera vez utilizando los siguientes cebadores: 5'-CTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGC-3' (SEQ ID NO:1) y 5'-CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC-3' (SEQ ID NO:2). Los productos de la PCR se purificaron en gel y se amplificaron nuevamente por PCR con el siguiente par de cebadores: 5'-AAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCC-3' (SEQ ID NO:3) y 5'-CAAAGTCCCACTGGGCG-3' (SEQ ID NO:4).

A continuación, el ADN amplificado se sometió a análisis de restricción con XhoI y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel. Tal como se muestra en la Figura 2B, el análisis demostró la presencia del transgén que contiene XhoI a niveles de hasta aproximadamente el 18 por ciento de las moléculas de ADN presentes, pero solo en muestras de CD34+ que habían sido tratadas tanto con el donador de AAV6 como con el ARNm que codifica la ZFN específica de CCR5.

La secuenciación profunda de Illumina permitió la detección simultánea de la modificación del genoma inducida por ZFN por las vías NHEJ (típicamente pequeñas inserciones y/o deleciones conocidas como "indel") y HDR (ID) (Figura 2C). Brevemente, la región que rodea el sitio de escisión de la ZFN de CCR5 se amplificó primero usando cebadores ubicados fuera de los brazos homólogos, que son los siguientes: 5'-CTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGC-3' (SEQ ID NO:1) y 5'-CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC-3' (SEQ ID NO:2). Los productos de PCR se purificaron en gel y luego se amplificaron por PCR usando un par de cebadores fusionados, que contienen tanto secuencias específicas de diana como adaptadores para la secuenciación profunda de Illumina: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGGTTGAGCA GGTAGATG-3' (SEQ ID NO:5) y 5' AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT-3' (SEQ ID NO:6). Finalmente, se agregaron códigos de barras de muestra en una reacción de PCR final utilizando el siguiente par de cebadores: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT-3' (SEQ ID NO:7) y 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGAC GTGTGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO:8). Los productos de PCR finales se procesaron en un sistema MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Los datos se analizaron mediante un comando personalizado.

Se observó un aumento de la frecuencia de ID dependiente de la dosis del donador de AAV6. El nivel máximo de ID (22%) se alcanzó a 10.000 vg/ml de donador de AAV6 (Figura 2C). Además, la frecuencia de indel exhibió una correlación invertida con las dosis de las frecuencias de donador de AAV6 e ID.

Ejemplo 4: Optimización del momento y el orden del tratamiento del donador y ZFN

Se examinaron el momento y el orden óptimos de la transducción de AAV6 y la electroporación de ARNm de ZFN para maximizar la integración dirigida del transgén por HDR. El donador AAV6-R5-160-XhoI se introdujo en células CD34+ hasta 48 horas antes (-48 horas) a 20 horas después (+20 horas) de la electroporación (EP) con el ARNm de ZFN específico de CCR5. Las células se recogieron y procesaron en un momento posterior para la purificación del ADNg y la posterior secuenciación profunda de Illumina.

Tal como se muestra en las Figuras 3A y B, el tratamiento corto (dentro de las 6 horas) con un donador AAV6-R5-160-XhoI antes de la electroporación con el ARNm que codifica la ZFN de CCR5 indujo más del 20 % de integración dirigida. Se observó una eficacia ligeramente menor a las 16, 20 o 24 horas de pretratamiento, mientras que se observó una caída significativa en la eficacia de la ID si se usaba un pretratamiento de 48 horas. Tal como se muestra en la Figura 3B, las nucleasas estimularon la integración dirigida eficaz en las células CD34+ incluso si el donador se proporcionó después (dentro de 1 hora) de la transfección de nucleasa. Sin embargo, se observó una reducción significativa en la eficacia de la ID cuando se proporcionó el donador 4 horas después de la transfección de nucleasa, y casi no se observó ID cuando se proporcionó el donador 20 horas después de la transfección de nucleasa. Los datos sugirieron que la transducción de células CD34+ con un donador de AAV6 dentro de las 24 horas antes o una hora después de la electroporación con ARNm de ZFN es óptima para la modificación eficaz del genoma por HDR.

Ejemplo 5: Integración de transgenes más grandes

Para probar si el suministro de un donador mediado por AAV6 también es eficaz para la integración dirigida de un fragmento más grande de ADN heterólogo, tal como un casete de expresión transgénica completo, un donador R5-pgk-GFP-pA, en el que se insertó un casete de expresión de eGFP dirigido por el promotor pgk (1,6 kb) entre los brazos homólogos de CCR5 (Figura 4A).

Las células CD34+ se trataron con el donador AAV6-R5-pgk-GFP-pA y el ARNm de ZFN de CCR5 como se describió anteriormente, y luego se recogieron para el análisis de citometría de flujo.

Tal como se muestra en la Figura 4B, aproximadamente el 15% de células GFP+ estaban presentes en las muestras tratadas tanto con el donador (1000 y 3000 vg/ml) como con ZFN, pero no con el donador solo a 15 ddi (Figura 4B) o en puntos de tiempo anteriores.

La presencia de integración dirigida del casete de GFP en el locus CCR5 se confirmó aún más utilizando un ensayo de PCR semicuantitativo In-Out. Se preparó un conjunto de controles estándar mediante dilución en serie de un conjunto de ADNg de frecuencia conocida de integración del transgén de GFP en el locus CCR5 (determinado por análisis por transferencia de Southern) con ADNg de tipo silvestre sin modificar. La PCR se realizó utilizando la misma cantidad de ADNg y un cebador presente en la región de poliA (presente en el casete eGFP) y un cebador ubicado fuera de la región del brazo homólogo de CCR5 en el lado 3' de los sitios diana de ZFN (Figura 4C). A continuación se muestran los cebadores usados: 5-GAGGATTGGGAAGACAATAGCAG-3' (SEQ ID NO:9) y 5'-CCAGCAATAGATGATCCAACTCAAATTCC-3' (SEQ ID NO:10).

En un segundo conjunto de reacción de PCR, un par de cebadores adicional, con ambos ubicados en el lado 5' de los sitios diana y uno de los cuales está fuera de la región homóloga de CCR5, también se incluyeron (2 pares de cebadores) en las mismas reacciones de PCR. El segundo par de cebadores se utilizó como medida de la entrada de ADNg. Este par de cebadores adicionales se muestra a continuación: 5'-GATTTGCACAGCTCATCTGGC-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-CCATCTTGTTCCACCCTGTGC-3' (SEQ ID NO:12).

Según la intensidad de las bandas GFP-TI (Figura 4C) y la intensidad relativa de las bandas GFP-TI en comparación con las bandas de CCR5 totales (Figura 3D), Las c D34+ HSC/PC tratadas con 1000 o 3000 vg/ml de donador de AAV6 y ARNm de CCR5 ZFN tenían más del 10 % de integración dirigida en GFP en el locus CCR5.

Tomados en conjunto, los resultados confirmaron que el uso de un donador de AAV6 también es muy eficaz para la integración dirigida de un fragmento de ADN más grande con este método.

Ejemplo 6: Integración dirigida en una segunda ubicación en el genoma

Para excluir la posibilidad de que dicha integración dirigida de alta eficacia sea específica del locus CCR5, se construyó un donador -HindIII específico de AAVS1 en el que el sitio HindIII se introdujo entre los sitios de unión del par de direccionamiento de ZFB de AAVS1 30035:30054, incluyendo proteínas de dedo de zinc con 6 dedos como se muestra en la Tabla 1 a continuación. Las regiones de la hélice de reconocimiento de cada dedo se muestran como F1-F6 de una sola fila de la Tabla 1 y los sitios diana unidos por las ZFP que se muestran en la primera columna de la Tabla 1. Véase, también, la patente de Estados Unidos N.° 8.110.379. En la secuencia diana, los nucleótidos unidos por ZFN se muestran en mayúsculas y los no unidos se muestran en minúsculas.

T l 1: ZFN ífi AAV 1 i ñ n i i n

Las CD34+ HSPC se trataron con donador AAV6-AAVS1 -HindIII y ARNm de ZFN de AAVS1. Las células se recogieron 5 días después y se procesaron para la secuenciación profunda de Illumina como se describió anteriormente usando cebadores específicos de Aa VSI.

Tal como se muestra en la Figura 5B, más del 30 % de los alelos tenían integración dirigida (ID) utilizando la dosis más baja de donador de AAV6 (1000 vg/ml), mientras que más del 50 % de los alelos tenían ID utilizando la dosis más alta de donador de AAV6 en presencia de ZFN de AAVS1.

Ejemplo 7: Integración dirigida mediada por TALEN

Se transdujeron células CD34+ con el donador AAV6-R5-160-XhoI (2000 vg/célula). Después de incubación a 37 °C durante 20 horas, se introdujeron ARNm de TALEN específicos de CCR5 (80 ug/ml cada uno) como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 8.586.526 en células transducidas mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). Las células se recogieron 5 días después para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina.

La Figura 6 muestra la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación: ya sea inserciones o deleciones (indel), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionada por la molécula donadora. Como se muestra, los TALEN estimularon más del 10 % de la integración dirigida del RFL^p proporcionado por el donador de AAV6 en las células CD34+ primarias.

Ejemplo 8: Integración dirigida mediada por CRISPR/Cas

Las células CD34+ se transdujeron con el donador rAAV6-AAVS1-HindIII (500 o 2000 vg/célula). Después de incubación a 37 °C durante 20 horas, se introdujeron ZFN específicos de AAVS1 (30054:30035, 40 ug/ml) o ARNm de Cas9 (20 ug/ml) y ADN de ARN guía quimérico (ARNg) específico de AAVS1 (10 - 40 ug/ml) en las células transducidas mediante electroporación utilizando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). El ARNg-T1 y el ARNg-T2 son ARN guía diseñados para unirse a las siguientes secuencias genómicas de AAVS1 respectivamente: GTCCCCTCCACCCCACAGTGGGG (SEQ ID NO:27) y GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG (SEQ ID NO:28). Las regiones PAM están subrayadas. Las células se recogieron 5 días después para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina.

La Figura 7 muestra la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación: ya sea inserciones o deleciones (indel), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionada por la molécula donadora. Como se muestra, CRISPR/Cas9 estimuló más del 1 % de la integración dirigida del RFLP proporcionado por el donador de AAV6 en células CD34+ primarias en este experimento.

Ejemplo 9: Transducción de AAV s ID en linfocitos T CD4+

Los linfocitos T CD4+ primarios se transdujeron con los vectores AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9 que contenían un transgén de eGFP dirigido por CMV en presencia de IL2 (20 ng/ml) y Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 (Life Technology). A continuación, se recogieron las células 5 días después de la infección (ddi) y se analizaron usando un citómetro de flujo (Guava, Millipore).

La frecuencia (%) de células positivas para GFP se muestra a continuación en la Tabla 2. AAV6 transdujo linfocitos T CD4+ primarios con la mayor eficacia en comparación con otros serotipos (AAV2, AAV5, AAV8 y AAV9).

Tabla 2: Transducción del indicador de GFP dependiente del serotipo de AAV en linfocitos T CD4+ Dosis

_(vg/célula) AAV2 AAV5 AAV6 AAV8 AAV9

3000 1,00 0,36 0,05 0,11 0,11

1.00E+04 3,30 1,88 0,46 0,21 0,26

3,00E+04 7,64 4,41 3,59 0,57 0,69

1.00E+05 19,19 13,27 30,52 2,10 2,49

3.00E+05 31,86 25,67 88,34 5,98 5,58

Además, Las células CD4+ se transdujeron con las dosis indicadas de rAAV2, rAAV6 o donador IDLV R5-160-XhoI. Después de incubación a 37 °C durante 20 horas, se introdujeron ARNm de ZFN específicos de CCR5 o AAVS1 (60 ug/ml) en células transducidas mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). Las células se recogieron 4 días después para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina.

La Figura 8 muestra la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación: ya sea inserciones o deleciones (indel), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionado por la molécula donadora en los linfocitos T CD4+ tratados con CCR5-nucleasa (Figura 8A) y AAVS1-nucleasa (Figura 8B). Como se muestra, Las ZFN estimularon más del 40 % de la integración dirigida del RFLP proporcionado por el donador de AAV6 en las células CD4+ primarias.

Ejemplo 10: Transducción de AAV s ID en linfocitos T CD8+

Los linfocitos T CD8+ primarios se transdujeron con vectores AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9 que contienen un transgén de eGFP dirigido por CMV en presencia de IL2 (20 ng/ml) y Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 (Life Technology). A continuación, se recogieron las células 5 días después de la infección (ddi) y se analizaron usando un citómetro de flujo (Guava, Millipore).

La frecuencia (%) de células positivas para GFP se muestra a continuación en la Tabla 3. Linfocitos T CD8+ transducidos con AAV6 con la mayor eficacia a dosis relativamente más bajas en comparación con otros serotipos (AAV2, AAV5, AAV8 y AAV9).

Tabla 3: Transducción del indicador de GFP de endiente del seroti o de AAV en linfocitos T CD8+

Además, Las células CD8+ se transdujeron con las dosis indicadas de rAAV2, rAAV6 o donador IDLV R5-160-XhoI. Después de incubación a 37 °C durante 20 horas, se introdujeron ARNm de ZFN específicos de CCR5 o AAVS1 en células transducidas mediante electroporación usando un BTX ECM830 (Equipo de Harvard). Las células se recogieron 4 días después para la purificación del ADN genómico (ADNg) y se procesaron para la posterior secuenciación profunda de Illumina. La Figura 9 muestra la cantidad de modificación del genoma detectada por la secuenciación: ya sea inserciones o deleciones (indel), o integración dirigida (ID) del RFLP proporcionado por la molécula donadora en los linfocitos T CD8+ tratados con CCR5-nucleasa (Figura 9A) y AAVS1-nucleasa (Figura 9B). Como se muestra, Las ZFN estimularon más del 30 % de la integración dirigida del RFLP proporcionado por el donador de AAV6 en las células CD8+ primarias.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una nucleasa de dedos de zinc que escinde un gen de AAVS1 endógeno, comprendiendo la nucleasa de dedos de zinc la primera y la segunda nucleasas de dedos de zinc, en donde la primera nucleasa de dedos de zinc comprende 6 dominios de unión a ADN de dedos de zinc, comprendiendo cada dominio de unión a ADN de dedos de zinc, una región de hélice de reconocimiento en donde las regiones de la hélice de reconocimiento de los dominios de unión a ADN de dedos de zinc, se ordenan de F1 a F6 de la siguiente manera:

F1: RSDHLSR (SEQ ID NO:13)

F2: TSGHLSR (SEQ ID NO:14)

F3: YNWHLQR (SEQ ID NO:15)

F4: RSDHLTT (SEQ ID NO:16)

F5: HNYARDC (SEQ ID NO: 17); y

F6: QNSTRIG (SEQ ID NO:18); y

en donde la segunda nucleasa de dedos de zinc comprende 6 dominios de unión a ADN de dedos de zinc, comprendiendo cada dominio de unión a ADN de dedos de zinc, una región de hélice de reconocimiento en donde las regiones de la hélice de reconocimiento de los dominios de unión a ADN de dedos de zinc, se ordenan de F1 a F6 de la siguiente manera:

F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:19)

F2: LKQHLTR (SEQ ID NO:20)

F3: TSGNLTR (SEQ ID NO:21)

F4: RRDWRRD (SEQ ID NO:22)

F5: QSSHLTR (SEQ ID NO:23); y

F6: RLDNRTA (SEQ ID NO:24).

2. La nucleasa de dedo de zinc de la reivindicación 1, en donde el dominio de escisión se obtiene de una endonucleasa.

3. La nucleasa de dedo de zinc de la reivindicación 1, en donde el dominio de escisión se obtiene de una enzima de restricción de Tipo IIS.

4. Una célula que comprende:

una o más nucleasas de dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

un vector donador AAV6-AAVS1 Hint 3 que comprende una secuencia exógena, en donde la secuencia exógena se integra en el gen de AAVS1 después de la escisión por la una o más nucleasas, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

5. La célula de la reivindicación 4, en donde la secuencia exógena codifica un polipéptido.

6. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un factor de crecimiento, un receptor de superficie celular, un receptor nuclear, una hormona, una linfocina, una citocina, un indicador, fragmentos funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos.

7. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la secuencia exógena se selecciona del grupo que consiste en uno o más ARNhc, una o más moléculas de ARNi, uno o más miARN y combinaciones de los mismos.

8. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la secuencia exógena comprende además un promotor.

9. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la secuencia exógena no comprende un promotor.

10. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende además regiones de homología con el gen de AAVS1 que flanquean la secuencia exógena.

11. Una célula que comprende la nucleasa de dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

12. La célula de las reivindicaciones 4 a 11, en donde la célula es una célula madre.

13. Un método para expresar al menos un producto de una secuencia de ácido nucleico exógena en una célula, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana, comprendiendo el método:

(a) introducir la nucleasa de dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la célula; y (b) poner en contacto la célula con un vector de AAV que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena en condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico exógena se integre en el genoma de la célula, en donde el método no se lleva a cabo en un cuerpo humano o animal vivo.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la secuencia de ácido nucleico exógena codifica un polipéptido.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un factor de crecimiento, un receptor de superficie celular, un receptor nuclear, una hormona, una linfocina, una citocina, un indicador, fragmentos funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en uno o más ARNhc, una o más moléculas de ARNi, uno o más miARN y combinaciones de los mismos.