CN110628816B

CN110628816B - 一种用于血友病a的双切供体及其药物组合

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Publication number: CN110628816B
Application number: CN201910863564.0A
Authority: CN
Inventors: 程涛; 张健萍; 程新新; 赵梅; 李国华; 许静; 张凤; 张孝兵
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: CN110628816A

Abstract

本发明提供一种用于血友病A的双切供体，将BDDF8定位于肝细胞中高度表达的Alb位点，同源臂两侧还设有可被Cas9‑sgAlb识别的sgAlb‑PAM序列，高压尾静脉注射新型双切HDR供体质粒编码Cas9、sgAlb和pDonor的质粒后，1‑2％的肝细胞在Alb位点精确整合了BDDF8。此外，联合使用免疫抑制剂使BDDF8在80％以上的小鼠中终生稳定表达。可以认为血友病A在大多数小鼠中得到了彻底治愈。

Description

一种用于血友病A的双切供体及其药物组合

技术领域

本发明涉及CRISPR-Cas9介导的F8基因插入肝细胞高表达的基因编辑技术，以及与免疫抑制剂联合使用提高F8活性稳定的方法。

背景技术

血友病A(HA)是最常见的遗传病之一，在美国，每5000个男婴中就有1个血友病A患者，约占血友病患者的85％¹。HA是由x染色体上编码凝血因子VIII(F8)的基因突变引起的。重组F8蛋白已广泛用于治疗HA病人，但这导致20-30％的患者产生抑制性中和抗体，限制了治疗效果²。

以腺相关病毒(AAV)为基础的血友病B(F9突变)基因治疗取得了显著进展，表达因子IX Padua(F9-r338l)的AAV载体的输注成功实现F9蛋白的持续表达。然而，由于AAV的包装限制(～4.4kb)，血友病A基因治疗进展缓慢。

F8蛋白全长为2332个氨基酸⁴,B结构域的大部分缺失使其长度减小38％⁵。目前，B结构域删除F8(B domain-deleted FVIII，BDDF8)已被用于基因治疗研究，包括我们的研究。在注射大剂量编码BDDF8的AAV5后，通过给予糖皮质激素或强的松对AAV免疫反应进行调控，多个成年患者血清F8活性达到了相对稳定的水平，最长可达一年⁴。尽管结果很有希望，但长期的安全性和有效性仍有待确定。此外，由于注射AAV不能稳定整合到基因组中，本疗法便不适用于儿童患者。需要开发新疗法，使所有年龄段的病人都能受益。

基于CRISPR-Cas9的体内基因组编辑技术已成功应用于临床前模型的多种疾病的治疗^7-11。利用单链DNA(ssDNA)供体，一些开创性的研究成功地编辑了成年小鼠肝脏中的点突变，其同源定向修复(HDR)率为0.4％～1％。使用模板AAV可使编辑效率高达6％。然而，像BDDF8(4.4kb)这样的大片段DNA的精确插入还没有实现。我们实验室的前期结果表明，新型HDR模板载体通过诱导gDNA切割和HDR模板线性化，可以精确基因插入效率提高5-10倍，即使是长片段插入。我们假设这种方法也能提高体内长DNA片段的精确插入效率。

肝脏是最容易被编辑的靶器官，因为静脉注射AAV或高压静脉注射裸质粒均可有效转染肝细胞^3,6。基因靶向肝脏可诱导对AAV等基因治疗载体和引入的治疗因子的免疫耐受。由于F8主要由内皮细胞而不是肝细胞表达¹³，因此在肝细胞中原位纠正F8不能实现治疗的目的。

发明内容

本发明中，我们试图将BDDF8定位于肝细胞中高度表达的基因白蛋白(Alb)位点，利用Alb内源性启动子启动BDDF8的高效表达以大幅度提高F8凝血活性。我们发现，高压尾静脉注射新型双切HDR供体质粒编码Cas9、sgAlb和pDonor的质粒后，1-2％的肝细胞在Alb位点精确整合了BDDF8。此外，联合使用免疫抑制剂使BDDF8在80％以上的小鼠中终生稳定表达。可以认为血友病A在大多数小鼠中得到了彻底治愈。

本发明首先提供了一种用于血友病A的双切供体(新型双切HDR供体)，同源臂之间设有报告基因、B结构域删除F8基因(BDDF8)、Wpre元件、PolyA元件，同源臂两侧还设有可被Cas9-sgAlb识别的sgAlb-PAM序列，所述同源臂分别为靶向细胞的靶向位点的上游和下游的一段序列，靶向细胞以Alb终止密码子周围片段作为靶向位点，所述sgAlb-PAM序列也具有作为靶向位点的Alb终止密码子周围片段。

其中，所述报告基因为荧光蛋白基因，所述报告基因和BDDF8之间通过自断裂多肽连接，所述靶向位点位于Alb终止密码子附近“TTTAGGCTAAGG”的一段序列上。进一步，所述sgAlb-PAM序列优选设计为SEQ ID NO:3，所述同源臂序列分别优选为SEQ ID NO:1中第24-651位和第7571-8148位的序列，所述BDDF8优选为SEQ ID NO:1中第2200-6573位的序列，所述双切供体优选设计为具有SEQ ID NO:1的序列。所述靶向细胞为肝细胞。

本发明还提供了一种用于血友病A的复合药物，包括上述双切供体质粒，还包括具有独立启动子的Cas9质粒和具有独立启动子的sgAlb质粒，sgAlb质粒表达针对Alb终止密码子周围片段的sgRNA。

其中，采用EF1启动子驱动Cas9表达，采用U6启动子驱动sgAlb表达。

进一步，所述组合物为静脉注射剂，质粒均溶解于平衡液中。

本发明还提供了一种用于血友病A的药物组合，包括上述复合药物、以及对Cas9的细胞免疫反应和对F8的体液反应具有免疫抑制作用的药物，优选为环磷酰胺和甲泼尼龙。

本发明还提供了一种用于血友病A的免疫抑制方法，采用上述复合药物、以及对Cas9的细胞免疫反应和对F8的体液反应具有免疫抑制作用的药物的联用，优选为上述复合药物和环磷酰胺以及甲泼尼龙的联用。

其中，所述环磷酰胺和甲泼尼龙采用腹腔注射，注射量均为50mg/kg/次，注射频率为每周1-2次，连用1-3周。

本发明对传统环形供体质粒进行优化设计，成功提供了一种新型双切HDR供体，通过诱导gDNA切割和HDR模板线性化，显著提高了基因插入效率，同时大大提高F8初期活性，并在进一步研究中，确认了导致F8长期稳定性下降的原因，成功采用与免疫抑制剂联用的方式改善了F8的长期稳定性，达到了持续的治疗效果。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1：高压静脉注射后，双切HDR供体在肝细胞Alb基因位点高水平基因敲入。(a)Alb终止密码子基因组编辑示意图。通过Cas9-sgAlb介导的对基因组和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-sg的同时切割，在Alb位点实现了无启动子F8表达盒的精确插入。pD-sgHDR是携带600bp同源臂的供体模板，两侧是Cas9-sgAlb识别序列。在供体中加入转录后元件Wpre和PolyA，以提高基因表达水平。内源性Alb启动子/增强子在HDR整合和转录后，通过E2A介导的核糖体跳读产生三种蛋白(Alb、tdTomato和BDDF8)。(b)高压尾静脉注射原理图。表达Cas9的质粒和靶向Alb终止密码子(sgAlb)的sgRNA以及一个HDR编辑模板均通过尾静脉注射被送到肝脏。(c)双切HDR供体在CRISPR介导的dsDNA断裂后显著提高了小鼠肝细胞的插入效率。双切供体不同于传统模板，它包含两个Cas9-sgAlb切割位点。高压尾静脉注射后1周对小鼠肝细胞进行流式细胞仪(FACS)分析。展示了代表性的FACS图。tdTomato+细胞的部分代表HDR介导的敲入效率。(d、e)采用严格的对照实验比较两种不同类型的供体模板HDR效率(d)和F8(e)的凝血活性。HA小鼠注射Cas9或sgAlb或pd-tdTomato-BDDF8(n＝12)与双切pd-tdTomato-BDDF8-sg供体，1周后，用流式细胞术分析部分tdTomato+细胞比例(n＝12)。没有任何基因编辑组件(n＝4)的处理作为阴性对照。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析；***P<0.001。(f)编辑HA小鼠肝脏共聚焦切片显示tdTomato在肝细胞形态的细胞中表达(代表n＝5只小鼠)。图片尺寸是40μm规模。

图2：BDDF8经CRISPR介导插入后针对F8和Cas9的免疫反应。(a)高压静脉注射Cas9-sgAlb质粒和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-sg质粒3周后，部分HA小鼠的F8活性下降(n＝32)。***P<0.001，Welch’spairedt-test。(b)高压静脉注射Cas9-sgAlb质粒和pD-tdTomato-BDDF8-sg质粒3周后，F8稳定组和F8下降组在小鼠肝脏的HDR效率。注射后1周(n＝14)HA小鼠的HDR效率作为对照。流式细胞术检测的tdTomato+细胞百分比表示HDR敲入效率。统计分析采用Welch’sunpairedt-test。*P<0.05；ns，无显著性差异。(c)在部分小鼠中，F8活性降低伴随着肝损伤标志物的增加。治疗3周后测定HA小鼠外周血天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)(F8稳定组，n＝5；F8下降组，n＝6)。未治疗的HA小鼠作为对照组(n＝4)。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。Ns，无显著性差异。(d)存在针对Cas9而无针对F8的的细胞免疫反应。采用高压注射后3周小鼠的脾脏淋巴细胞进行ELISPOT检测。分别用无抗原(负对照)，Cas9蛋白或F8蛋白刺激后，来确定分泌IFN-γ的细胞数量。F8稳定组(n＝17)；F8下降组(n＝15)。采用Welch’sunpairedt-test进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns，无显著性差异。(e)检测F8水平下降的小鼠对F8的体液免疫反应。高压静脉注射3周后，Bethesda实验测定小鼠血浆中F8抑制剂水平。F8稳定组(n＝17)；F8下降组(n＝15)。未治疗的HA小鼠(n＝6)作为对照组。统计分析采用Welch’sunpairedt-test。*P<0.05；ns，无显著性差异。(f)注射后3周，ELISA检测小鼠血清cas9抗体水平。抗体量采用稀释spCas9抗体制定的标准曲线法测定。F8稳定组(n＝4)vs.F8下降组(n＝5)。未治疗的HA小鼠血清(n＝13)作为阴性对照。统计分析采用Welch’sunpairedt-test。ns，无显著性差异。

图3：免疫抑制治疗后血友病A小鼠的F8活性长期稳定表达。(a)HA小鼠高压静脉注射Cas9-sgAlb质粒和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-sg质粒后，分别给与不同的免疫抑制剂方案后的F8活性：无免疫抑制剂(n＝16)或环磷酰胺+甲泼尼松治疗(CTX+MPS)，1周3次(n＝20)；3周4次(n＝25)或3周7次(n＝30)。(b)F8稳定性曲线(F8稳定定义为F8活性下降不超过50％)。P值来自aMantel-Coxtwo-sidedlog-ranktest。(c)无免疫抑制治疗(对照组，n＝12)或免疫抑制CTX+MPS治疗后(n＝12)小鼠的HDR效率。采用Cas9-sgAlb、pD-tdTomato-BDDF8-sg高压静脉注射后3周，对小鼠肝细胞进行流式细胞仪(FACS)分析。tdTomato+细胞的百分比表示HDR敲入效率。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。**P<0.001。(d)采用脾脏淋巴细胞ELISPOT法检测对F8或Cas8的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。IFN-γ分泌细胞的数量反映了细胞免疫反应。静注后3周取淋巴细胞，分别用PBS(阴性对照)或Cas9蛋白或F8蛋白刺激。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。**P<0.01；ns，无显著性差异。(e)高压静脉注射质粒3周后，用Bethesda法测定小鼠血浆中F8抑制剂的水平。小鼠未使用免疫抑制剂(对照；n＝12)或CTX+MPS，1周3次(n＝12)。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。ns，无显著性差异。(f)注射后3周ELISA法测定小鼠血清中Cas9抗体的含量。小鼠未使用免疫抑制剂(对照；n＝6)或CTX+MPS，1周3次(n＝6)。统计分析采用Welch’sunpairedt-test。**P<0.05。

图4：F8编辑的HA小鼠长期疗效和安全性。(a)HA小鼠高压静脉注射双切供体Cas9-sgAlb后的F8活性(n＝15)。单因素方差分析显示准确的P值。(b)治疗后的小鼠在剪尾挑战中存活。野生型C57BL/6(WT)小鼠(n＝5)作为阳性对照。(c)高压尾静脉注射后1年未治疗组和治疗组HA小鼠肝切片苏木精和伊红(H&E)染色。代表性图片来自n＝5只老鼠。图中的标尺为100μm。(d)治疗1年后肝毒性标志物。采用高压静脉注射编辑质粒1年后测定HA小鼠天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(TBIL)水平(n＝10)。未经处理的HA小鼠(n＝10)与HA小鼠(n＝10)之间无显著差异，采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。(e)治疗1年后未检测到针对F8和Cas9的细胞免疫反应。采用小鼠脾脏淋巴细胞进行ELISPOT检测。分别用无抗原(负对照)，Cas9蛋白，F8蛋白，或PMA+ION(正对照)刺激后，来确定分泌IFN-γ的细胞数量。采用配对t检验进行统计分析。未治疗组(n＝6)；治疗组(n＝8)。ns，无显著性差异。(f)Bethesda实验测定小鼠血浆中F8抑制剂水平。注射后1年未治疗组(n＝8)和治疗组(n＝8)。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。ns，无显著性差异。(g)1年治疗组(n＝6)与未治疗组(n＝6)的Cas9抗体没有差异。采用非配对t检验和Welch’s校正进行统计分析。ns，无显著性差异。(h)肝组织双光子成像显示tdTomato表达稳定。CD144(VE-cadherin)染色肝血管结构；编辑细胞(tdTomato+)为绿色。代表性图像来自n＝4只小鼠。

图5：Alb位点的体内基因编辑。(a)sgRNA(sgAlb)的靶位点是白蛋白基因(Alb)14号外显子上的终止密码子TAA(红色，反向编码)侧翼的序列。黑色剪刀表示预测的Cas9切割位置。PAM表示spCas9(NGG)的原受体邻近基序。(b、c)用Cas9-sgAlb质粒对A型血友病小鼠进行高压静脉注射，一周后提取肝脏基因组DNA，进行深度测序分析，确定靶向切割位点的indel(删除/插入)。(b)Cas9-sgAlb介导的具有代表性的基因indel序列。红线表示删除，红色小写字母表示插入。(c)Alb位点的肝细胞靶向切割效率的点图总结。治疗小鼠n＝5个独立的生物学重复。

图6：桑格测序显示tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg模板在Alb位点精确插入HDR。Cas9-sgAlb介导的基因组和HDR模板切割后，双切供体pD-tdTomato-BDDF8-sg完美地插入Alb位点(14外显子的终止密码子处)。左右同源臂长600bp。E2A是一个自我剪接的链接序列。细黑线表示Alb内含子；白盒表示Alb外显子；紫色方框表示自裂解肽E2A；红框表示tdTomato；橙色框表示BDDF8转基因。双链断裂(DSB)是在终止密码子TAA(用红色闪电标记)之前产生的2个bp。供体包含无启动子E2A-tdTomato-E2A-BDDF8-Wpre-PolyA表达盒，两侧有跨越小鼠Alb终止密码子的同源臂。经同源重组整合后，在终止密码子(TAA)前插入E2A-tdTomato-E2A-BDDF8-Wpre-PolyA。已知野生型Alb位点的序列和预期的目标Alb序列，分别用引物F1+R1和F2+R2PCR扩增左、右同源臂周围的序列。R1在tdTomato上，F2在PolyA上。这种设计确保引物仅扩增插入的目标序列，而不扩增带有同源重组臂的模板载体或野生型基因组序列。扩增产物被克隆到pJET载体中，然后挑取16个克隆(左臂克隆1-8个，右臂克隆9-16个)进行桑格测序。

图7：新型双切供体介导高水平的HDR效率。(a)基因编辑质粒原理示意图。Cas9的表达受EF1启动子的驱动，利用Wpre和PolyA提高Cas9的表达水平。sgAlb表达受U6启动子驱动。pD-mNeonGreen是一种传统的圆形HDR供体，pD-mNeonGreen-sg是一种双切HDR供体，其中mNeonGreen盒两侧有两个sgAlb识别序列(红色闪电符号)。(b)注射一周后小鼠肝细胞的代表性FACS图。mNeonGreen+细胞的百分比代表敲入效率。通过尾静脉注射，表达Cas9的质粒和针对不同供体的Alb位点(sgAlb)的sgRNA被传递到肝脏。(c)HDR效率总结。流式细胞仪分注射后一周基因编辑效率，每种质粒10μg。pD-mNeonGreen(n＝12)为传统的圆形HDR供体，pD-mNeonGreen-sg(n＝12)为双切HDR供体。统计分析采用非配对t检验和Welch’s校正法。***P<0.001。

图8：在HDR供体模板上加入Wpre和PolyA元素，增加了F8的表达。Cas9的表达受EF1启动子的驱动，利用Wpre和PolyA提高Cas9的表达水平。sgAlb表达受U6启动子驱动。HA表示左右同源臂长600bp。紫色的椭圆形表示自我剪接的E2A多肽序列。红色的闪电表明Cas9-sgAlb的表达会切割供体，由于双切割供体的设计，会释放线性化HDR模板。用Cas9-sgAlb和其中一个供体质粒进行高压尾静脉注射，一周后，取小鼠尾血进行F8凝血活性分析。F8的生物活性反映了F8在A型血友病小鼠体内的表达水平。pD-tdTomato-BDDF8-wpre(n＝7)vs.pD-tdTomato-F8-PolyA(n＝6)vs.pD-tdTomato-BDDF8(n＝10)vs.pD-tdTomato-BDDF8-wpre-polya供体(n＝8)。注射DNA的质量是33.3μgCas9,16.7μgsgAlb,50μgpDonor。统计分析采用非配对t检验和Welch’s校正法。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图9：B结构域的删除显著提高了F8活性表达水平。高压尾静脉注射Cas9-sgAlb和pD-tdTomato-F8-Wpre-PolyA(n＝6)或D-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyAdonor(n＝8)，一周后，尾静脉取血检测两组HA小鼠F8凝血活性水平。质粒量：50μg供体DNA,33.3μgCas9,和16.7μgsgAlb。统计分析采用非配对t检验和Welch’s校正法。***P<0.001。

图10：ELISPOT检测细胞免疫反应.图为ELISPOT实验的代表性图片。淋巴细胞与抗原孵育16h后，计数分泌IFN-γ的细胞数量(斑点)来反映针对Cas9,F8,或tdTomato的细胞免疫反应。高压静脉注射Cas9-sgAlb和pD-tdTomato-BDDF8-sg质粒3周后，Ficoll密度梯度离心法分离出脾脏淋巴细胞。2x10⁵cell/well种于96孔板，每孔分别加入不同抗原刺激：0.5μgtdTomato蛋白，0.5μgSpCas9蛋白或0.5IUF8蛋白。培养基作为负对照，PMA(500ng/ml)+Ionomycin(10μg/ml)刺激作为阳性对照，4x10⁴cell/well。

图11：双切供体中tdTomato的缺失不影响F8的表达水平。(a)Cas9的表达受EF1启动子的驱动，利用Wpre和PolyA提高Cas9的表达水平。sgAlb表达受U6启动子驱动。pD-BDDF8-Wpre-PolyA-sg是携带600bp同源臂的双切供体模板，两侧是Cas9-sgAlb识别序列(红色闪电符号)。Cas9-sgAlb的表达会切割供体，会释放线性化HDR模板。(b)我们构建了一个HDR供体质粒来研究缺失tdTomato对A型血友病小鼠F8活性的影响。分别于高压静脉注射Cas9-sgAlb和pD-BDDF8-Wpre-PolyA质粒后1周和3周检测血浆F8活性。每种质粒10μg。注射3周后，部分血友病A小鼠的F8活性下降。采用Welch’spairedTtest进行统计分析。*P<0.05。ns，无显著性差异。

图12：ELISA检测小鼠血清中SpCas9抗体。(a)小鼠血清中SpCas9抗体的定量标准曲线。96孔板(NuncMaxiSorpPlates(ThermoScientific))预先包被0.5ugSpCas9蛋白(IDT)，1×PBS稀释spCas9蛋白，4°过夜(100ul/well)。PBST(0.05％Tween20inPBS)洗3次，200ul/well，每次停留5min。每孔加入100ul1％BSA(ThermoScientific)BlockingSolution室温封闭1h。洗板3次后，每孔加入100ul的标准品，封板，室温孵育1h。标准曲线：用小鼠抗spCas9抗体(MA1-202,ThermoScientific)，浓度梯度：0.2,1,3,10,30,100,300,and1000ng/ml，各3个复孔。以小鼠抗人CD31作为对照抗体。利用Natural protein Gconjugated to HRP与捕获的抗体发生反应。KPL SureBlue TMB Microwell Substrate可产生一种650nm处测量的深蓝色。(b)ELISA检测血清中抗SpCas9抗体阴性对照和阳性对照。1％牛血清白蛋白(BSA；n＝3)，500ng非cas9抗体(小鼠抗人CD31；n＝5)，免疫缺陷NOG小鼠血清(n＝3)作为阴性对照。以Cas9诱导转基因小鼠诱导后1个月血清(n＝8)作为阳性对照。所有ELISA实验均重复进行。血清稀释10倍。

图13：F8体液和细胞反应的阳性对照。(a)高压尾静脉注射BDDF8表达载体原理图。BDDF8的表达受EF1启动子的驱动(pEF1-BDDF8)，利用Wpre和PolyA提高BDDF8的表达水平。(b)高压静脉注射20-30μgpEF1-BDDF8质粒后1周和3周检测血浆F8活性(n＝15).采用Welch’spairedt-test进行统计分析。****P＜0.0001。由于载体非整合，F8活性显著降低。(c)注射pEF1-BDDF8质粒3周后，用Bethesda法测定小鼠血浆中抗F8抑制剂的水平(n＝15)。未处理小鼠血浆为阴性对照(n＝7)，采用Mann-Whitney unpaired T test进行统计学分析。****P＜0.0001。在小鼠中观察到高水平的F8抑制物。该结果作为我们检测F8抑制剂的阳性对照。(d)ELISPOT检测对Cas9或F8的细胞免疫反应。注射pEF1-BDDF8质粒3周后，分别检测不同抗原刺激下分泌IFN-γ的细胞数量：培养基(负对照)，Cas9蛋白或F8蛋白。n＝15。采用Welch’s paired t-test进行统计分析。ns，无显著性差异。****P＜0.0001。细胞对Cas9无明显反应。大多数小鼠对F8表现出细胞反应。这些数据在我们实验室分别作为阴性和阳性对照来检测CTL对Cas9和F8的反应。

图14：单一免疫抑制剂MPS或CTX对治疗后血浆F8稳定性的影响。(a)血友病A小鼠的F8活性.高压静脉注射Cas9-sgAlb和pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg质粒后，对小鼠进行如下免疫抑制剂方案：无(n＝16)；或甲泼尼龙(MPS；n＝12)或环磷酰胺(CTX；n＝20)，每周两次，连续3周，从第0天开始。(b)MPS或CTX的使用增加了大多数小鼠F8的稳定性。F8稳定定义为2-3周内F8活性下降不超过80％。Mantel–Coxtwo-sidedlog-ranktest给出CTX处理组(n＝20)或MPS处理组(n＝12)与对照组(n＝16)的准确P值。在维持F8活性水平方面，CTX比MPS有更大的作用，但在少数接受治疗的小鼠中，凝血活性仍降至较低水平。

图15：血浆F8活性动态变化的代表性曲线.血友病A小鼠高压静脉注射Cas9-sgAlb和pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg质粒后，分别给予或不给予免疫抑制剂治疗。图为血友病A小鼠治疗后血浆F8活性在不同情况下的代表性变化：(a)无免疫抑制剂；(b)MPS，前3周7次；(c)CTX，前3周7次；(d)CTX+MPS，第1周3次；(e)CTX+MPS，前3周4次；(f)CTX+MPS，3周7次。免疫抑制剂使用从注射质粒当天开始。F8稳定定义为F8活性下降不超过80％。

图16：F8活性稳定1年(a)或1.5年(b)。高压尾静脉注射Cas9-sgAlb和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg，定期取血测定凝血活性。～80只小鼠F8活性稳定1年以上(n＝80)，其中18只小鼠随访1.5年以上并给出了单因素方差分析的精确P值。

图17：苏木精和伊红(H&E)染色检测多器官组织形态。经高压静脉注射Cas9-sgAlb和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg(治疗)后1年收获血友病A小鼠心脏、脾脏、肾脏和肺。未治疗的小鼠作为对照组。代表性图片来自n＝5只老鼠。图中的标尺为100μm。

图18：高压静脉注射CRISPR-Cas9和模板质粒后基因编辑只发生在肝脏。(a)Cas9-sgAlb靶序列深度测序代表性数据。未治疗的老鼠作为对照组。我们在注射后1年采集小鼠的主要器官进行on-target分析。只有治疗后的小鼠肝脏显示出相对较高的indel水平。(b)高压静脉注射1年后小鼠主要器官(肝、心、脾、肾、肺)Alb靶部位诱导的indel总结(n＝5)。

图19：脱靶切割深度测序的代表性结果。在高压静脉注射Cas9-sgAlb和供体模板质粒1年后收获小鼠肝脏进行分析。同时展示了Indel效率。COSMID工具(http://crispr.bme.gatech.edu)预测了最可能的20个脱靶位点。未处理小鼠的肝脏样本作为对照。

图20：高压静脉注射后残余质粒拷贝数变化。(a-e)高压静脉注射Cas9-sgAlb、双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-Poly-sg质粒后的不同时间采用qPCR技术对质粒拷贝数进行检测。分别于注射后的第3天、7天、3个月、1年获取肝脏样本(n＝6)，qPCR检测总质粒(a)Cas9质粒(b)sgAlb质粒(c)BDDF8-tdTomato供体质粒(d,e)。未注射的小鼠肝脏样本作为负对照(n＝6)。为量化Cas9,sgAlb或donor质粒拷贝数，在1μg未处理小鼠gDNA加1.7pgpEF1-Cas9-Wpre-Poly质粒，0.43pgpU6-sgAlbplasmid，和1.4pgdonor质粒pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA，相当于每个细胞一个质粒拷贝的标准样。以Gapdh作为qPCR的内参。

图21：Cas9、sgAlb、BDDF8、tdTomato在mRNA水平表达的动态变化。分别于高压尾静脉注射Cas9-sgAlb和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA–sg质粒后第3天(n＝6)、7天(n＝6)、1年(n＝4)收获小鼠肝脏提取总RNA，逆转录和qPCR。未注射质粒的小鼠肝脏样本作为负对照(n＝6)。采用miRCURY RNA Isolation Kit(Exiqon)提取总RNA。使用EasyScriptPluscDNASynthesisKit(AppliedBiologicalMaterials)进行逆转录。采用KAPASYBR Fast qPCR试剂盒(KAPA Biosystems)进行实时PCR。每个基因的RT-qPCR数据按GAPDH表达水平进行归一化。相对mRNA或sgRNA表达水平标准化至第3天。

图22：治疗一年后HDR效率及对F8和Cas9的细胞免疫反应。血友病A小鼠高压静脉注射Cas9-sgAlb、双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-Poly-sg质粒。(a)采用流式细胞仪(FACS)分析A型血友病小鼠肝脏中tdTomato+细胞的比例(n＝5)，以显示HDR编辑效率。相同年龄未治疗的HA小鼠作为阴性对照(n＝5)。(b)ELISPOT法检测F8和Cas9无细胞免疫应答。量化不同抗原刺激时分泌IFN-γ的细胞数量：培养基(负对照)，Cas9蛋白，或F8蛋白质。PMA+ION刺激为阳性对照。相同年龄未治疗的HA小鼠细胞作为阴性对照(n＝5)。

图23：双光子肝成像显示编辑后的肝细胞。经高压静脉注射Cas9-sgAlb和双切供体pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg后3周或1年，用抗CD144(VE-cadherin)-FITC冲洗HA小鼠，使血管染色。采用双光子显微镜观察tdTomato+编辑肝细胞(绿色)和血管系统(红色)。图中为n＝4只小鼠的代表。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体附图对本发明进行详细描述。

一、实验方法

1.01 Cas9-sgRNA质粒构建

我们使用CHOPCHOP网站(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)设计了针对Alb终止密码子的sgAlb(GTTGTGATGTGTTTAGGCTA)。利用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(New England Biolabs)将sgAlb克隆到pU6-sgRNA载体中，经Sanger测序(MCLAB)验证，获得pU6-sgAlb载体。pEF1-Cas9载体可以采用已发表的pEF1-Cas9-Wpre-PolyA。

1.02 Donor质粒构建

为构建以Alb终止密码子为靶点的pDonor质粒，我们从小鼠基因组DNA中扩增左右同源臂，去除终止密码子，并与E2A序列进行连接；并采用PCR从其他载体上扩增了插入物tdTomato、BDDF8、F8或mNeonGreen。将sgAlb靶序列与PAM序列(sgAlb-PAM序列，SEQ ID NO：3)分别标记在左同源臂上游和右同源臂下游。使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒将多个插入物和质粒主干连接在一起。通过核酸内切酶消化和桑格测序鉴定出正确的克隆，获得pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg(其中外源基因表达框的序列如SEQ ID NO：1)。采用相同的方法构建pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA(SEQ ID NO：1序列中不含两侧的sgAlb-PAM序列)、pD-mNeonGreen-Wpre-PolyA-sg(其中外源基因表达框的序列如SEQ ID NO：2)、pD-mNeonGreen-Wpre-PolyA(SEQ ID NO：2序列中不含两侧的sgAlb-PAM序列)、pD-tdTomato-F8-Wpre-PolyA-sg(SEQ ID NO：1序列中BDDF8基因替换为已知的F8基因)。

1.03小鼠和高压尾静脉注射

血友病A(HA)小鼠(129×B6小鼠携带F8基因16号外显子敲除)购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME)。该实验小鼠最初由H.Kazazian博士(宾夕法尼亚大学)构建¹²。小鼠饲养于天津市实验血液学国家重点实验室。动物实验按照SKLEH机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。注射用载体采用EndoFreeMaxiPrep Kits(Qiagen)制备。高压尾静脉注射的基本方法是将质粒DNA溶解在相当于小鼠体重10％的乳酸钠林格液中，从尾静脉在5-6s注射到5-8周大的HA小鼠体内。Cas9，sgAlb，pDonor质粒DNA的数量均为是10μg。为防止出血，每只小鼠与质粒同时静脉注射0.5IU F8蛋白(Xyntha；Wyeth Pharmaceuticals)。

1.04免疫抑制

为进行短暂的免疫抑制治疗，我们在质粒注射当天同时腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg/次)和/或甲泼尼龙(50mg/kg/次)，我们采用了三种免疫抑制剂方案：1)每周2次，用1周(共3次)；2)每周一次，连用3周(共4次)；3)每周2次，连用3周(共7次)。

1.05小鼠取血和血浆分离

小鼠血浆分离采用尾静脉取血法。取血前准备1.5mL EP管，提前加入10μL 3.2％柠檬酸钠溶液(即1：9)作为抗凝剂，用刀片轻轻划破尾静脉，用移液枪取至所需血量(100μL)。血样收集完成后用止血粉末(MiracleCorp)对小鼠伤口处进行止血。血液样品于2000×g，25℃离心20min，取出上清即为血浆，转移到新的试管中，立即冷冻在干冰上，并保存在-80℃。在测定F8生物活性之前，立即将血浆样品在37℃快速解冻。

1.06 F8活性检测

我们使用Sysmex CA1500系统(Sysmex,Kobe,Japan)测定F8的凝血活性。西门子试剂(Siemens；Marburg,Germany)包括Dade Actin activated cephaloplastin reagent(Siemens；B4218-1)和凝血因子viii缺陷血浆(Siemens；OTXW17)。小鼠血浆样品用DadeOwren’sVeronal Buffer(Siemens；B4234-25)稀释4倍。F8活性测定是由5μl待测样品+45μlOV Buffer+50μl F8缺乏血浆+50μl aPTT试剂，37℃孵育2min；加入50ul 25mm氯化钙后开始凝固；用Sysmex CA1500系统测定凝块形成时间；稀释人标准血浆(Siemens)制备标准曲线，正常小鼠血浆作为阳性对照。

1.07 F8抑制性抗体检测

F8抑制性抗体采用改进的Bethesda assay测定。BDDF8正常血浆样品的制备：100ul乏F8血浆+1.2ul 0.125IU/ul的BDDF8(Xyntha)，测定F8活性在100％左右波动。小鼠血浆37℃解冻，56℃孵育30分钟，灭活F8活性。100ul灭活血浆与等体积的正常血浆混合，对照组为100ul0.1 M咪唑缓冲液(PH＝7.3)与正常血浆等体积混合。37℃孵育2小时后，测定实验组与对照组的F8凝血活性的相对百分比(残余F8凝血活性)。一个Bethesda单位(BU)被定义为导致残余F8凝血活性下降50％的抑制剂的数量。当未稀释样品的残余F8活性低于25％时，用0.1M咪唑缓冲液(pH 7.4)稀释重测，直到残余F8活性在25％～75％之间。

1.08酶联免疫斑点(ELISPOT)实验

我们使用小鼠IFN-γ预包被ELISPOT kit(Dakewei；DKW22-2000-500)，通过淋巴细胞与特异性抗原过夜共培养，来检测产生IFN-γ的T细胞数量。用ELISPOT法来评估对Cas9、F8和tdTomato的细胞免疫反应。处死小鼠，用Ficoll密度梯度离心法(1.084g/ml)分离小鼠的脾脏淋巴细胞。按2×10⁵cell/well种入ELISPOT板子中，分别加入刺激物：0.5μg/well Cas9蛋白(Integrated DNA technologies)，tdTomato(Origene)，或F8蛋白(Xyntha)，各三个复孔，培养16-20hr。培养基作为负对照，PMA(500ng/ml)+Ionomycin(10μg/ml)作为阳性对照。在实验条件下，PMA+Ionomycin每4×10⁴个细胞产生>200个斑点。ELISPOT CTLReader(Cell Technology Inc,Columbia,MD)扫描板子，ELISPOT软件(AID,Strassberg,Germany)进行结果分析。

1.09 ELISA检测Cas9抗体

我们的ELISA实验是从Chew、Wang、Simhadri和Charlesworth等人的实验方法基础上优化而来，

包板：1×PBS稀释spCas9蛋白，0.5ug/well，封板，4°过夜(100ul/well)。

封闭：1×wash buffer洗板3次，200ul/well，每次停留5min，最后一次，用干净的吸水纸包裹板子倒置于桌面轻轻拍打，以充分弃净孔内残余液体。每孔加入100ul 1％BSA(Thermo Scientific)Blocking Solution for 1h at RT；(Wash buffer：PBST 1*PBS+Tween(0.05％Tween 20in PBS；Blocking buffer：1％BSA)。

加样：洗板3次后，每孔加入100ul的标准品，封板；(室温孵育1h)；1％BSA稀释。标准曲线：用小鼠抗spCas9抗体(Thermo Scientific；MA1-202)，浓度梯度：0、0.2、1、3、10、30、100、300和1000ng/ml；血清样品按1:10和1:20稀释，各2个复孔。

反应：洗板3次后，每孔加入Natural protein G conjugated to HRP(diluted 1:2,000in PBST buffer)(Abcam；ab7460),100ul/well,封板,室温放置1h。

显色：洗板4次后，每孔加入100ul SureBlueTMTMB单组分微孔过氧化物酶底物(Sera Care；5120-0075)，室温孵育7min；

终止显色：加入TMB终止显色液(Sera Care；5150-0020).，100ul/well，充分混匀，终止反应；(不要产生气泡)

测OD值：终止实验后的10min内用SpectraMax M3 microplate reader(MolecularDevices)在OD450、OD650nm下读取各孔吸光度。

1.10肝损伤标志物分析

采用眼眶取血，室温自然凝固1小时。样品以2000×g,25℃离心20分钟。吸取上层血清，转移到新的试管中，立即保存于-80℃。检测前立即将血清37℃快速解冻。采用诊断试剂盒(Beckman Coulter,Inc.Teco Diagnostics)测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和胆红素水平。采用Olympus AU5400(IDEXX Memphis,TN)测定血清ALT、AST、白蛋白和总胆红素。

1.11定量PCR检测残留质粒拷贝数

质粒注射第3天、7天和1年后，收获肝脏，提取gDNA，采用定量聚合酶链反应(qPCR)检测残余质粒拷贝数。每只小鼠的肝脏样本各取25mg，切成小块。蛋白酶K消化后，用DNeasyBlood&Tissue Kit(Qiagen)提取gDNA。未注射的HA小鼠肝脏gDNA作为负对照。为量化Cas9,sgAlb或donor质粒拷贝数，在1μg未处理小鼠gDNA加1.7pg pEF1-Cas9-Wpre-Poly质粒，0.43pg pU6-sgAlb plasmid，和1.4pgdonor质粒pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA，相当于每个细胞一个质粒拷贝的标准样。以Gapdh作为qPCR的内参。采用KAPA SYBR Fast qPCRKits(KapaBiosystems)进行实时PCR。采用质粒特异性引物real-time PCR分析质粒拷贝数(表1)，qPCR循环条件为98℃2min；99℃5s，60℃30s，40个循环。

1.12 RT-qPCR

分别于高压尾静脉注射Cas9-sgRNA和供体质粒后第3天、7天、3月、1年收获小鼠肝脏。采用miRCURY RNA Isolation Kit(Exiqon)提取总RNA。使用EasyScript Plus cDNASynthesis Kit(Applied Biological Materials)进行逆转录。qPCR操作如前所述。Cas9、F8、tdTomato、sgRNA的表达归一化为Gapdh的表达(引物见表1)，采用KAPASYBR Fast qPCR试剂盒(KAPA Biosystems)进行实时PCR。qPCR循环条件为95℃5min；95℃15s，60℃60s，40个循环。

1.13剪尾挑战实验

血友病的表型校正采用先前描述的剪尾实验进行评估。HA小鼠麻醉后在尾部直径1.5mm处剪断，每4小时检查一次小鼠存活情况。小鼠尾部血块的形成和存活超过24小时来表明血友病A小鼠表型的纠正。

1.14肝组织切片及共聚焦成像

采用共聚焦显微镜对tdTomato阳性的编辑后肝细胞进行成像。新鲜解剖的肝脏在4％多聚甲醛中固定1-4小时，然后在10％蔗糖PBS中孵育1天。切片,冷冻样本用低温切片机(莱卡)切成5-μm薄切片。切片用10％马血清在PBS中封闭1小时，然后用荧光素标记的LycopersiconEsculentum(Tomato)Lectin(LEL,TL)(Vector laboratories)染色过夜，观察内皮细胞。标本用anti-fade prolong gold(Invitrogen)固定，图像用蔡司LSM780共焦显微镜获取。

1.15流式细胞术检测肝细胞基因编辑效率

为了确定tdTomato或mNeonGreen阳性(HDR)肝细胞的比例，HA小鼠肝组织经4％多聚甲醛固定1-2小时。然后用PBS小心研磨为单细胞和并用70μm细胞滤器过滤掉细胞团块。添加DAPI后，用BD FACS Aria III流式细胞仪分析。分析至少1×10⁵个细胞。没有注射的HA小鼠肝脏作为负对照。为了分析tdTomato+或mNeonGreen+细胞，我们首先圈出DAPI+细胞，然后用未处理的小鼠肝细胞作为阴性对照，检测tdTomato+或mNeonGreen+细胞。

1.16 PCR和Sanger测序验证HDR介导的肝脏敲入

在高压尾静脉注射Cas9-sgRNA和HDR供体模板质粒3周后收获小鼠肝脏提取基因组DNA。使用同源臂长600bp的双切供体tdTomato-BDDF8-HDR时，基因编辑发生在Alb位点(14号外显子)。Cas9-sgAlb在终止密码子TAA之前2bp产生DNA双链断裂(DSB)。供体包含一个E2A-tdTomato-E2A-BDDF8-Wpre-PolyA序列，其两侧是跨越小鼠Alb终止密码子的同源臂。经同源重组整合后，在终止密码子TAA前插入E2A-tdTomato-E2A-BDDF8-Wpre-PolyA。利用引物Alb-HAL-Out-F1(CTAAGTTGGCAGTGGCATGC)和tdTomato-R1(AGCCCATGGTCTTCTTCTGC)扩增左侧同源臂。用引物PolyA-F1(ACCTCTGACACATGCAGCTC)和Alb-HAR-Out-R(TCACTGGTCCCTCAGAGTCC)扩增右侧同源臂。采用KAPA HiFi DNA聚合酶进行PCR。PCR反应程序是98℃2min；98℃5s，98℃10s，64℃10s，72℃20s，30个循环。扩增产物被克隆到pJET载体中(Thermo Fisher)。然后挑取16个克隆(左臂克隆1-8个，右臂克隆9-16个)进行桑格测序。然后使用BLAST将测序数据与预期的HDR敲入效率联合分析。

1.17深度测序对On-target和off-target进行分析

用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)分离小鼠肝脏和其他器官的基因组DNA。分别用治疗组和未治疗组血友病小鼠的DNA样本进行On-target和off-target分析。我们使用COSMID工具(http://crispr.bme.gatech.edu)预测了20个sgAlb的潜在脱靶位点。利用Primer3Plus设计引物来扩增On-target和off-target序列周围240-285bp片段(表2)。用KAPA HiFi DNA聚合酶扩增目标序列。PCR反应条件为：98℃2min；98℃5s，64℃10s，72℃5s，30个循环。所有样本的PCR产物按等摩尔比例混合后，利用Illumina测序仪进行150bp双端测序。Illumina高通量双端测序由诺禾致源完成(150bpx2)。获得测序原始数据后，上传到在线分析软件Galaxy(https://usegalaxy.org/)上，使用FLASH工具融合配对序列，使用Barcode Splitter工具调出各个编辑位点的序列。分类下载各组序列，上传到在线工具Cas-Analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#！)，可以实现快速批量化基因编辑效率和具体编辑情况的分析。

1.18双光子成像

高压尾静脉注射编辑质粒后3周和1年，血友病A小鼠尾静脉注射50μl APC-conjugated VE-cadherin抗体(APC anti-mouse CD144；Biolegend)。5分钟后处死小鼠获取肝脏组织。将不同部位的肝叶小块立即在4度的4％多聚甲醛溶液中固定6-8小时。用PBS冲洗肝组织，30％蔗糖浸泡过夜，OCT包埋，-80℃保存。利用CM1850低温切片机(Leica)，在-20℃条件下进行切割，得到肝组织厚切片，切片浸泡在PBS中，用DAPI室温染色10分钟后便可用显微镜观察。利用Olympus FV1200MPE双光子激光扫描显微镜拍摄采，405nm、561nm和640nm激光器通道，多区域、多层拍摄。

1.19统计分析

我们用Graphpad Prism 7.0(Graphpad software,San Diego,CA)绘图和统计分析。在每一次独立的实验中，都测定每治疗组的平均±S.E.M.。采用双尾韦尔奇配对t检验或韦尔奇非配对t检验(two-tailed Welch’s paired T-test or Welch’s unpaired T-test)来确定治疗组与对照组之间的显著性。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，再进行Tukey多参数比较(Tukey’s multiple comparison test)检验，比较两组间的差异。P值<0.05为显著性差异:*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

表1 qPCR引物

表2深度测序引物

二、结果分析

为了研究CRISPR-Cas9在成年动物体内基因组编辑的潜力，我们使用了血友病A(HA)小鼠模型，这是一种与x染色体相关的先天性出血疾病，由敲除F8基因的16号外显子引起¹²。为了便于分析精确编辑后的肝细胞，我们引入了tdTomato红色荧光蛋白，通过自断裂多肽2A序列连接tdTomato报告基因和BDDF8(图1a)。来源于马鼻炎病毒的E2A序列在翻译过程中，引起核糖体的跳读，产生了自断裂功能，因此一个开放阅读框就可以翻译成为多种蛋白¹³。当HDR模板载体精确整合后，Alb终止密码子将被tdTomato和BDDF8替换，Alb内源性转录机器驱动Alb、tdTomato和BDDF8等摩尔表达。

2.1新型双切供体显著提高HA小鼠肝细胞Alb基因位点的HDR效率

为了编辑Alb位点，我们使用了如下质粒：pEF1-Cas9，其中EF1启动子驱动Cas9表达；pU6-sgAlb，其中U6启动子驱动针对Alb终止密码子周围片段的sgRNA表达(图5a)。我们首先向成年小鼠肝脏高压尾静脉注射CRISPR质粒检测其切割效率(图1b)⁶。注射一周后PCR扩增靶向位点并进行深度测序显示indel的效率为2-6％(图5b,c)。

我们比较了两种供体类型：传统的环形HDR供体pD-tdTomato-BDDF8(pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA，简称pDonor)和新型双切HDR供体pD-tdTomato-BDDF8-sg(pD-tdTomato-BDDF8-Wpre-PolyA-sg，简称pDonor-sg，同源臂两侧加入可被Cas9-sgAlb识别的sgAlb-PAM序列)(图1c)。高压静脉注射一周后，流式检测肝脏中tdTomato阳性细胞的比例以此指示HDR介导的BDDF8敲入效率。结果显示，新型双切HDR供体pDonor-sg将BDDF8HDR效率从～0.1％提高到～2％(～16倍；图1c)。正如我们所料，sgRNA或Cas9质粒缺失时tdTomato阳性细胞比例为0％，这表明只有精确插入无启动子HDR模板才能通过FACS分析得到阳性信号(图1d)。为了进一步验证这一结果，我们通过PCR扩增了左右同源臂周围的连接序列，发现16个克隆中有16个都是正确的HDR编辑(图6)。

HDR整合后，血清白蛋白Alb的转录机制将驱动Alb、tdTomato、BDDF8的表达。正如所料，治疗的HA小鼠的F8活性与tdTomato阳性细胞比例的结果一致，双切供体设计将F8活性从血浆正常水平的13％提高到134％(图1e)。通过共焦成像(图1f)证实了tdTomato在编辑后的肝细胞中的表达。

我们还通过在Alb位点靶向亮绿色荧光蛋白mNeonGreen，比较了pDonor和pDonor-sg模板。我们观察到，在使用Cas9-sgRNA和供体质粒一周后，双切供体pD-mNeonGreen-sg与传统质粒HDR供体相比，mNeonGreen阳性细胞的比例提高了24倍(5.58％vs.0.22％；图7)。

在上述研究中，Wpre转录后调控元件和PolyA信号被放置在转基因下游，以增强转基因表达。为了评估这些元件的必要性，我们删除了pDonor-sg中的Wpre和/或PolyA，发现HA小鼠的F8活性显著降低了50-70％(图8)。我们还比较了插入全长F8和BDDF8对F8活性的影响。与之前的报告¹⁴一致，我们观察到使用全长F8使血浆F8活性降低了一个数量级(图9)。

因此，我们的供体质粒载体优化设计包括:1)使用BDDF8而不是全长F8；2)在表达载体下游插入Wpre和PolyA元件；3)HDR供体两侧加入Cas9-sgRNA识别序列，导致高压静脉注射一周后的小鼠体内完全恢复F8生物活性。

2.2对Cas9和转基因的免疫反应导致F8活性急剧下降

我们观察到注射Cas9-sgAlb和pD-BDDF8-sg质粒1周后，F8活性为50-200％，但是3周后，半数小鼠(15/32只小鼠)的F8水平显著下降至～16％(图2a)。F8活性的下降同时伴随着肝脏中tdTomato阳性细胞比例的降低(约1.5％vs.0.5％)(图2b)。我们还观察到在F8下降的小鼠中，肝损伤标志物，天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)轻微增加(图2c)。随着时间的推移，细胞免疫反应介导了编辑后的肝细胞的破坏，这可以解释转氨酶水平的升高和循环中F8水平的降低以及肝脏中tdTomato阳性细胞在比例的下降。

在我们的基因编辑治疗中，Cas9的瞬时转染和tdTomato-F8表达盒在Alb位点的永久插入为HA小鼠的免疫系统提供了三种外来抗原:Cas9、tdTomato和F8。为检测针对这些抗原的T细胞反应，我们进行了ELISPOT实验检测小鼠的干扰素(IFN)–γ¹⁵。我们在注射质粒3周后，从F8稳定和F8下降小鼠中分离出脾细胞。细胞分别在有或无SpCas9或F8蛋白刺激的情况下培养。ELISPOT数据显示两组均无针对F8的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或对Cas9反应明显。然而,我们观察到在F8下降组比F8稳定组的小鼠产生5倍多的(IFN)-γ阳性点(图2d和图11)。如果我们将比对照组多3倍的斑点定义为阳性反应，那么在F8稳定组20％存在针对Cas9的细胞免疫反应，而在F8下降组，80％的小鼠有针对Cas9的细胞免疫反应(Fisher’sExact test；P<0.05)。我们还观察了一些对Cas9细胞免疫反应阳性的小鼠同时产生对tdTomato的CTL反应。然而，在pD-BDDF8-sg(no tdTomato)编辑的小鼠中，我们也观察到～50％的小鼠F8活性下降(图11)，这表明对tdTomato的免疫反应并不是主要原因。因此，我们只对Cas9和F8进行了进一步的分析。

A型血友病患者治疗的一个主要并发症是产生外源BDDF8的抑制型中和抗体，因此我们用Nijmegen-Bethesda法测定F8抗体滴度(图2e)。与未治疗的HA小鼠相比，F8稳定小鼠没有检测到F8抗体，但F8下降小鼠的F8抗体明显增加，这表明F8的体液反应也导致F8活性下降。支持这一结论的是，F8急剧下降的小鼠中，约20％的小鼠F8抗体滴度较高(>1Bethesda unit)，但却无F8细胞免疫反应(图2d)。

最近，在基因治疗后的人和小鼠中，都报道存在针对SpCas9的细胞和体液反应^16-19。为检测F8活性下降是否与Cas9抗体的产生有关联，我们采用ELISA法对F8稳定组和F8下降组小鼠血清中SpCas9抗体进行定量分析。我们用抗spCas9抗体检测，能检测到的spCas9抗体灵敏度为～1ng/ml。(图12a)。我们在未处理HA，F8稳定和F8下降的小鼠中均观察到约100ng/ml的SpCas9抗体(图2f和图12b)。这些数据表明，Cas9抗体在我们饲养的小鼠中是预先存在的，而Cas9抗体的产生与F8活性下降无关。

作为对Cas9免疫反应的阴性对照和对F8免疫反应的阳性对照，我们向小鼠注射了表达BDDF8的质粒载体(图13a)。正如我们所料，当不注射Cas9时，细胞对Cas9没有明显的反应。相反，我们检测到高滴度F8抗体和针对F8的细胞免疫反应(图13b-d)。

综上所述，这些数据表明，高压静脉注射基因编辑质粒导致F8恢复到正常水平，但对Cas9的细胞免疫反应和对F8的体液反应导致50％的小鼠治疗失败。

2.3免疫抑制治疗使血友病A小鼠的F8活性长期稳定

我们追踪了Cas9-sgAlb和BDDF8供体经高压静脉注射后12周的F8凝血活性。我们首先使用糖皮质激素，它在AAV5-F8介导的HA基因治疗中被证明可以抑制严重患者的免疫反应。然而，在我们的系统中发现强的松龙是不够的(图14)。随后，我们在HA基因治疗模型中加入环磷酰胺，这是一种诱导耐受的药物。我们分别在质粒注射后腹腔注射环磷酰胺(CTX；50mg/kg)和甲泼尼龙(MPS；50mg/kg)，第1周3次，或前3周4次，使3个月F8稳定性由～20％提高到>50％(图3a、图3b及图15)。F8稳定的小鼠是指F8活性在三周内下降不超过80％的小鼠。然后我们加大免疫抑制强度，发现三周内注射7次，将3个月F8的稳定性提高到>80％(图3a、图3b、图14、图15)。

我们进一步研究了环磷酰胺和甲泼尼龙如何维持F8的稳定性。与预期一致，我们观察到编辑后的肝细胞(tdTomato+％)在免疫抑制3周后从1.0％增加到2.2％(图3c)。我们也观察到F8和Cas9对没有明显的细胞免疫反应(图3d和图10)。值得注意的是，我们发现使用环磷酰胺和甲泼尼龙使产生高F8抗体(>1BU)的小鼠比例从17％下降到0％，同时Cas9抗体滴度也显著下降(图3e、f)。这些数据表明，瞬时免疫抑制可以有效控制Cas9和F8的免疫反应，从而达到持续的治疗效果。

2.4血友病A基因治疗的长期有效性和安全性

在上述研究中，我们对治疗后HA小鼠的F8活性进行了长达3个月的跟踪。目前，我们已经对100只左右治疗过的小鼠长期观察了1年以上(图4a和图16)，其中15只小鼠已经跟踪了2年(我们的实验中中HA小鼠的最大寿命)。我们注意到，随着时间的推移，极个别小鼠的F8生物活性会出现上下波动，但这可能是由于采血和检测凝血活性等技术原因导致的。我们观察到所有治疗HA小鼠的F8活性总体维持在正常小鼠的100％左右，范围从20％到400％不等(图4a和图16)。为了确定治疗后HA小鼠的F8凝血活性功能是否恢复，我们进行了剪尾挑战实验。结果表明，未经治疗的HA小鼠因流血不止全部死亡。而经过治疗的血友病小鼠(6/6)，和正对照野生型C57BL/6小鼠一样，在创伤性出血处理后全部存活(图4b)。

在治疗1年后，我们随机选取了10只小鼠进行详细分析几个组织：心脏、脾脏、肾脏、肺和肝脏。苏木精和伊红(H&E)染色及病理学分析显示，治疗组和未治疗组小鼠在解剖学上没有差异。在肝脏组织及其他器官中均没有明显的病理变化,也没有显示增生或畸变等异常病理学改变(图4c，图17)。血清标记物如天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)(图4d)治疗组和未治疗组无差异，提示小鼠肝脏高压静脉注射CRISPR相关成分耐受良好。

我们还观察到肝脏以外的器官中没有基因插入和缺失(Indel)(图18)，这与高压静脉注射主要将DNA运送到肝细胞的报道一致。因此，我们将进一步的分析重点放在目标器官-肝脏上。值得注意的是,高压静脉注射3周与1年后在肝细胞Alb位点产生的indel比例和类型都无明显差别(比较图5b和图18(Treated-liver))，提示Alb基因编辑对肝细胞无不良影响。CRISPR-Cas9是否存在脱靶说法不一。我们预测20个最可能的小鼠基因组中潜在脱靶位点，分析了5只未处理和处理小鼠的肝脏，通过PCR扩增预测的脱靶位点，然后进行深度测序，在我们检测的20个位点中并没有发现脱靶(图19)。

我们还监测了注射后质粒拷贝数的动态变化。在高压静脉注射后3天，检测到每个二倍体基因组约有50个质粒。一周后，拷贝数降至～10。处理1年后，残留质粒拷贝数约为1。我们未检测到Cas9或sgRNAmRNA的表达，tdTomato和F8表达量较高(图20和图17)。同时，FACS分析显示肝脏中tdTomato阳性细胞的比例为1-2％(图22)。这些数据表明，大多数细胞内质粒已被降解或沉默，微量残留质粒对治疗后的小鼠无有害影响。

此外，我们未检测到针对F8和Cas9的细胞免疫反应或针对F8的体液免疫反应(图4e-f和图22)。有趣的是，我们在未经处理和处理的小鼠均检测到Cas9抗体，并且抗体滴度无明显差别(图4g)。小鼠的生长或体重在18个月的跟踪观察中没有异常变化。高压静脉注射后1年的HA小鼠肝脏双光子成像显示tdTomato阳性细胞在肝脏内分布均匀(图4h，图23)。与注射后3周无明显差异。这些结果表明，被编辑的肝细胞没有出现克隆性扩增，因此我们的治疗策略是长期安全的。

2.5讨论

我们的数据显示，利用CRISPR-Cas9系统和新型双切供体可以在小鼠肝脏中敲入大片段DNA序列。与环形供体质粒相比，使用带有两个sgRNA识别序列的新型双切供体模板载体，可以使HDR效率提高10-20倍。BDDF8与白蛋白基因的靶向整合可产生治疗水平的F8，并可纠正血友病A表型的功能。我们认为Alb在肝细胞中的高表达和可接近的染色质状态是导致靶向率高的原因。

CRISPR-Cas9基因组编辑在哺乳动物体内的长期效果需要仔细调节宿主对源自细菌的Cas9蛋白的免疫反应。最近，已经报道了人类先前对SpCas9的免疫反应，以及在传递编辑向量s27-30后不久对Cas9的新生反应。同样，我们观察到Cas9的强大免疫反应，特别是细胞毒性反应，破坏了编辑细胞，限制了长期治疗效果。然而，使用强大的免疫抑制剂可以减弱对Cas9和其他转基因的免疫反应，导致治疗因子F8终生表达。由于小鼠体积小，我们每1-2周对处理后的动物进行一次放血评估，这使得我们无法对免疫抑制剂方案进行微调。进一步研究控制Cas9免疫反应的有效药物，对于临床治疗阶段进一步推进基于CRISPR-Cas9的基因组编辑具有重要意义。我们相信，在临床试验中对免疫反应的仔细管理也可能导致稳定的F8水平。这一观点得到了血友病A基因治疗的成功临床试验的支持。

我们目前的研究为利用CRISPR-Cas9靶向肝细胞Alb位点的基因治疗方案的临床转化提供了强有力的基础。我们认为，CRISPR-Cas9靶向Alb位点是一种有吸引力的治疗方法，适用于需要定期注射治疗蛋白的多种疾病。对临床基因治疗的进一步研究将有希望终生治愈所有血友病患者。虽然多篇文献报道存在针对Cas9的免疫反应，但我们的研究证明，通过合理选择瞬时免疫抑制剂方案可以控制这种免疫反应。

本发明中涉及的参考文献如下：

1.Roth,D.A.,Tawa,N.E.,Jr.,O'Brien,J.M.,Treco,D.A.&Selden,R.F.Nonviraltransfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severehemophilia A.N Engl J Med344,1735-1742(2001).

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16.Wang,D.,et al.Adenovirus-Mediated Somatic Genome Editing of Ptenby CRISPR/Cas9 in Mouse Liver in Spite of Cas9-Specific Immune Responses.HumGene Ther26,432-442(2015).

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18.Charlesworth,C.T.,et al.Identification of preexisting adaptiveimmunity to Cas9 proteins in humans.Nat Med25,249-254(2019).

19.Simhadri,V.L.,et al.Prevalence of Pre-existing Antibodies toCRISPR-Associated Nuclease Cas9 in the USA Population.Mol Ther Methods ClinDev10,105-112(2018).

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种用于血友病A的双切供体及其药物组合

<130> XYS19004-1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> sgAlb-PAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(651)

<223> 同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (652)..(711)

<223> E2A

<220>

<221> misc_feature

<222> (712)..(2139)

<223> tdTomato

<220>

<221> misc_feature

<222> (2140)..(2199)

<223> E2A

<220>

<221> misc_feature

<222> (2200)..(6573)

<223> BDDF8

<220>

<221> misc_feature

<222> (6574)..(6581)

<223> 酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (6582)..(7164)

<223> Wpre

<220>

<221> misc_feature

<222> (7165)..(7562)

<223> PolyA

<220>

<221> misc_feature

<222> (7663)..(7570)

<223> 酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (7571)..(8148)

<223> 同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (8149)..(8171)

<223> sgAlb-PAM

<400> 1

gttgtgatgt gtttaggcta aggacacctg cttctcgact gaggtcagaa acgtttttgc 60

attttgacga tgttcagttt ccattttctg tgcacgtggt caggtgtagc tctctggaac 120

tcacacactg aataactcca ccaatctaga tgttgttctc tacgtaactg taatagaaac 180

tgacttacgt agcttttaat ttttattttc tgccacactg ctgcctatta aatacctatt 240

atcactattt ggtttcaaat ttgtgacaca gaagagcata gttagaaata cttgcaaagc 300

ctagaatcat gaactcattt aaaccttgcc ctgaaatgtt tctttttgaa ttgagttatt 360

ttacacatga atggacagtt accattatat atctgaatca tttcacattc cctcccatgg 420

cctaacaaca gtttatcttc ttattttggg cacaacagat gtcagagagc ctgctttagg 480

aattctaagt agaactgtaa ttaagcaatg caaggcacgt acgtttacta tgtcattgcc 540

tatggctatg aagtgcaaat cctaacagtc ctgctaatac ttttctaaca tccatcattt 600

ctttgttttc agggtccaaa ccttgtcact agatgcaaag acgccttagc ccagtgtact 660

aattatgctc tcttgaaatt ggctggagat gttgagagca acccaggtcc catggtgagc 720

aagggcgagg aggtcatcaa agagttcatg cgcttcaagg tgcgcatgga gggctccatg 780

aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag 840

accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc 900

ccccagttca tgtacggctc caaggcgtac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgattac 960

aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc 1020

ggtctggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcacgctgat ctacaaggtg 1080

aagatgcgcg gcaccaactt cccccccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc 1140

tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc cgcgacggcg tgctgaaggg cgagatccac 1200

caggccctga agctgaagga cggcggccac tacctggtgg agttcaagac catctacatg 1260

gccaagaagc ccgtgcaact gcccggctac tactacgtgg acaccaagct ggacatcacc 1320

tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgagc gctccgaggg ccgccaccac 1380

ctgttcctgg ggcatggcac cggcagcacc ggcagcggca gctccggcac cgcctcctcc 1440

gaggacaaca acatggccgt catcaaagag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 1500

tccatgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 1560

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 1620

ctgtcccccc agttcatgta cggctccaag gcgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 1680

gattacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 1740

gacggcggtc tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcac gctgatctac 1800

aaggtgaaga tgcgcggcac caacttcccc cccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 1860

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 1920

atccaccagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagaccatc 1980

tacatggcca agaagcccgt gcaactgccc ggctactact acgtggacac caagctggac 2040

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgctc cgagggccgc 2100

caccacctgt tcctgtacgg catggacgag ctgtacaagc agtgtactaa ttatgctctc 2160

ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac ccaggtccca tgcaaataga gctctccacc 2220

tgcttctttc tgtgcctttt gcgattctgc tttagtgcca ccagaagata ctacctgggt 2280

gcagtggaac tgtcatggga ctatatgcaa agtgatctcg gtgagctgcc tgtggacgca 2340

agatttcctc ctagagtgcc aaaatctttt ccattcaaca cctcagtcgt gtacaaaaag 2400

actctgtttg tagaattcac ggatcacctt ttcaacatcg ctaagccaag gccaccctgg 2460

atgggtctgc taggtcctac catccaggct gaggtttatg atacagtggt cattacactt 2520

aagaacatgg cttcccatcc tgtcagtctt catgctgttg gtgtatccta ctggaaagct 2580

tctgagggag ctgaatatga tgatcagacc agtcaaaggg agaaagaaga tgataaagtc 2640

ttccctggtg gaagccatac atatgtctgg caggtcctga aagagaatgg tccaatggcc 2700

tctgacccac tgtgccttac ctactcatat ctttctcatg tggacctggt aaaagacttg 2760

aattcaggcc tcattggagc cctactagta tgtagagaag ggagtctggc caaggaaaag 2820

acacagacct tgcacaaatt tatactactt tttgctgtat ttgatgaagg gaaaagttgg 2880

cactcagaaa caaagaactc cttgatgcag gatagggatg ctgcatctgc tcgggcctgg 2940

cctaaaatgc acacagtcaa tggttatgta aacaggtctc tgccaggtct gattggatgc 3000

cacaggaaat cagtctattg gcatgtgatt ggaatgggca ccactcctga agtgcactca 3060

atattcctcg aaggtcacac atttcttgtg aggaaccatc gccaggcgtc cttggaaatc 3120

tcgccaataa ctttccttac tgctcaaaca ctcttgatgg accttggaca gtttctactg 3180

ttttgtcata tctcttccca ccaacatgat ggcatggaag cttatgtcaa agtagacagc 3240

tgtccagagg aaccccaact acgaatgaaa aataatgaag aagcggaaga ctatgatgat 3300

gatcttactg attctgaaat ggatgtggtc aggtttgatg atgacaactc tccttccttt 3360

atccaaattc gctcagttgc caagaagcat cctaaaactt gggtacatta cattgctgct 3420

gaagaggagg actgggacta tgctccctta gtcctcgccc ccgatgacag aagttataaa 3480

agtcaatatt tgaacaatgg ccctcagcgg attggtagga agtacaaaaa agtccgattt 3540

atggcataca cagatgaaac ctttaagact cgtgaagcta ttcagcatga atcaggaatc 3600

ttgggacctt tactttatgg ggaagttgga gacacactgt tgattatatt taagaatcaa 3660

gcaagcagac catataacat ctaccctcac ggaatcactg atgtccgtcc tttgtattca 3720

aggagattac caaaaggtgt aaaacatttg aaggattttc caattctgcc aggagaaata 3780

ttcaaatata aatggacagt gactgtagaa gatgggccaa ctaaatcaga tcctcggtgc 3840

ctgacccgct attactctag tttcgttaat atggagagag atctagcttc aggactcatt 3900

ggccctctcc tcatctgcta caaagaatct gtagatcaaa gaggaaacca gataatgtca 3960

gacaagagga atgtcatcct gttttctgta tttgatgaga accgaagctg gtacctcaca 4020

gagaatatac aacgctttct ccccaatcca gctggagtgc agcttgagga tccagagttc 4080

caagcctcca acatcatgca cagcatcaat ggctatgttt ttgatagttt gcagttgtca 4140

gtttgtttgc atgaggtggc atactggtac attctaagca ttggagcaca gactgacttc 4200

ctttctgtct tcttctctgg atataccttc aaacacaaaa tggtctatga agacacactc 4260

accctattcc cattctcagg agaaactgtc ttcatgtcga tggaaaaccc aggtctatgg 4320

attctggggt gccacaactc agactttcgg aacagaggca tgaccgcctt actgaaggtt 4380

tctagttgtg acaagaacac tggtgattat tacgaggaca gttatgaaga tatttcagca 4440

tacttgctga gtaaaaacaa tgccattgaa ccaagaagct tctctcaaaa cccaccagtc 4500

ttgaaacgcc atcaacggga aataactcgt actactcttc agtcagatca agaggaaatt 4560

gactatgatg ataccatatc agttgaaatg aagaaggaag attttgacat ttatgatgag 4620

gatgaaaatc agagcccccg cagctttcaa aagaaaacac gacactattt tattgctgca 4680

gtggagaggc tctgggatta tgggatgagt agctccccac atgttctaag aaacagggct 4740

cagagtggca gtgtccctca gttcaagaaa gttgttttcc aggaatttac tgatggctcc 4800

tttactcagc ccttataccg tggagaacta aatgaacatt tgggactcct ggggccatat 4860

ataagagcag aagttgaaga taatatcatg gtaactttca gaaatcaggc ctctcgtccc 4920

tattccttct attctagcct tatttcttat gaggaagatc agaggcaagg agcagaacct 4980

agaaaaaact ttgtcaagcc taatgaaacc aaaacttact tttggaaagt gcaacatcat 5040

atggcaccca ctaaagatga gtttgactgc aaagcctggg cttatttctc tgatgttgac 5100

ctggaaaaag atgtgcactc aggcctgatt ggaccccttc tggtctgcca cactaacaca 5160

ctgaaccctg ctcatgggag acaagtgaca gtacaggaat ttgctctgtt tttcaccatc 5220

tttgatgaga ccaaaagctg gtacttcact gaaaatatgg aaagaaactg cagggctccc 5280

tgcaatatcc agatggaaga tcccactttt aaagagaatt atcgcttcca tgcaatcaat 5340

ggctacataa tggatacact acctggctta gtaatggctc aggatcaaag gattcgatgg 5400

tatctgctca gcatgggcag caatgaaaac atccattcta ttcatttcag tggacatgtg 5460

ttcactgtac gaaaaaaaga ggagtataaa atggcactgt acaatctcta tccaggtgtt 5520

tttgagacag tggaaatgtt accatccaaa gctggaattt ggcgggtgga atgccttatt 5580

ggcgagcatc tacatgctgg gatgagcaca ctttttctgg tgtacagcaa taagtgtcag 5640

actcccctgg gaatggcttc tggacacatt agagattttc agattacagc ttcaggacaa 5700

tatggacagt gggccccaaa gctggccaga cttcattatt ccggatcaat caatgcctgg 5760

agcaccaagg agcccttttc ttggatcaag gtggatctgt tggcaccaat gattattcac 5820

ggcatcaaga cccagggtgc ccgtcagaag ttctccagcc tctacatctc tcagtttatc 5880

atcatgtata gtcttgatgg gaagaagtgg cagacttatc gaggaaattc cactggaacc 5940

ttaatggtct tctttggcaa tgtggattca tctgggataa aacacaatat ttttaaccct 6000

ccaattattg ctcgatacat ccgtttgcac ccaactcatt atagcattcg cagcactctt 6060

cgcatggagt tgatgggctg tgatttaaat agttgcagca tgccattggg aatggagagt 6120

aaagcaatat cagatgcaca gattactgct tcatcctact ttaccaatat gtttgccacc 6180

tggtctcctt caaaagctcg acttcacctc caagggagga gtaatgcctg gagacctcag 6240

gtgaataatc caaaagagtg gctgcaagtg gacttccaga agacaatgaa agtcacagga 6300

gtaactactc agggagtaaa atctctgctt accagcatgt atgtgaagga gttcctcatc 6360

tccagcagtc aagatggcca tcagtggact ctcttttttc agaatggcaa agtaaaggtt 6420

tttcagggaa atcaagactc cttcacacct gtggtgaact ctctagaccc accgttactg 6480

actcgctacc ttcgaattca cccccagagt tgggtgcacc agattgccct gaggatggag 6540

gttctgggct gcgaggcaca ggacctctac tgagtttaaa cgtcgacaat caacctctgg 6600

attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 6660

gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 6720

tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 6780

ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 6840

ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 6900

aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 6960

attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca 7020

cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 7080

ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtctcgcc ttcgccctca 7140

gacgagtcgg atctcccttt gggcggatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg 7200

acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat 7260

tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca 7320

ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta 7380

caaatgtggt atggctgatt atgatccggc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 7440

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 7500

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 7560

aggtttaaac taaacacatc acaaccacaa ccttctcagg taactatact tgggacttaa 7620

aaaacataat cataatcatt tttcctaaaa cgatcaagac tgataaccat ttgacaagag 7680

ccatacagac aagcaccagc tggcactctt aggtcttcac gtatggtcat cagtttgggt 7740

tccatttgta gataagaaac tgaacatata aaggtctagg ttaatgcaat ttacacaaaa 7800

ggagaccaaa ccagggagag aaggaaccaa aattaaaaat tcaaaccaga gcaaaggagt 7860

tagccctggt tttgctctga cttacatgaa ccactatgtg gagtcctcca tgttagccta 7920

gtcaagctta tcctctggat gaagttgaaa ccatatgaag gaatatttgg ggggtgggtc 7980

aaaacagttg tgtatcaatg attccatgtg gtttgaccca atcattctgt gaatccattt 8040

caacagaaga tacaacgggt tctgtttcat aataagtgat ccacttccaa atttctgatg 8100

tgccccatgc taagctttaa cagaatttat cttcttatga caaagcagcc ttagcctaaa 8160

cacatcacaa c 8171

<210> 2

<211> 3020

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> sgAlb-PAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(651)

<223> 同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (652)..(711)

<223> E2A

<220>

<221> misc_feature

<222> (712)..(1422)

<223> mNeoGreen

<220>

<221> misc_feature

<222> (1423)..(1430)

<223> 酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (1431)..(2013)

<223> Wpre

<220>

<221> misc_feature

<222> (2014)..(2411)

<223> PolyA

<220>

<221> misc_feature

<222> (2412)..(2419)

<223> 酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (2420)..(2997)

<223> 同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (2998)..(3020)

<223> sgAlb-PAM

<400> 2

gttgtgatgt gtttaggcta aggacacctg cttctcgact gaggtcagaa acgtttttgc 60

attttgacga tgttcagttt ccattttctg tgcacgtggt caggtgtagc tctctggaac 120

tcacacactg aataactcca ccaatctaga tgttgttctc tacgtaactg taatagaaac 180

tgacttacgt agcttttaat ttttattttc tgccacactg ctgcctatta aatacctatt 240

atcactattt ggtttcaaat ttgtgacaca gaagagcata gttagaaata cttgcaaagc 300

ctagaatcat gaactcattt aaaccttgcc ctgaaatgtt tctttttgaa ttgagttatt 360

ttacacatga atggacagtt accattatat atctgaatca tttcacattc cctcccatgg 420

cctaacaaca gtttatcttc ttattttggg cacaacagat gtcagagagc ctgctttagg 480

aattctaagt agaactgtaa ttaagcaatg caaggcacgt acgtttacta tgtcattgcc 540

tatggctatg aagtgcaaat cctaacagtc ctgctaatac ttttctaaca tccatcattt 600

ctttgttttc agggtccaaa ccttgtcact agatgcaaag acgccttagc ccagtgtact 660

aattatgctc tcttgaaatt ggctggagat gttgagagca acccaggtcc catggtgagc 720

aagggcgagg aggataacat ggcctctctc ccagcgacac atgagttaca catctttggc 780

tccatcaacg gtgtggactt tgacatggtg ggtcagggca ccggcaatcc aaatgatggt 840

tatgaggagt taaacctgaa gtccaccaag ggtgacctcc agttctcccc ctggattctg 900

gtccctcata tcgggtatgg cttccatcag tacctgccct accctgacgg gatgtcgcct 960

ttccaggccg ccatggtaga tggctccgga taccaagtcc atcgcacaat gcagtttgaa 1020

gatggtgcct cccttactgt taactaccgc tacacctacg agggaagcca catcaaagga 1080

gaggcccagg tgaaggggac tggtttccct gctgacggtc ctgtgatgac caactcgctg 1140

accgctgcgg actggtgcag gtcgaagaag acttacccca acgacaaaac catcatcagt 1200

acctttaagt ggagttacac cactggaaat ggcaagcgct accggagcac tgcgcggacc 1260

acctacacct ttgccaagcc aatggcggct aactatctga agaaccagcc gatgtacgtg 1320

ttccgtaaga cggagctcaa gcactccaag accgagctca acttcaagga gtggcaaaag 1380

gcctttaccg atgtgatggg catggacgag ctgtacaagt aagtttaaac gtcgacaatc 1440

aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 1500

ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg 1560

ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 1620

ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt 1680

ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg 1740

ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg 1800

gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg ctgctcgcct 1860

gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 1920

cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtctcgcct 1980

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggcggatcca gacatgataa gatacattga 2040

tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 2100

tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 2160

ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 2220

aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatccggct gcctcgcgcg tttcggtgat 2280

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 2340

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 2400

gcagccatga ggtttaaact aaacacatca caaccacaac cttctcaggt aactatactt 2460

gggacttaaa aaacataatc ataatcattt ttcctaaaac gatcaagact gataaccatt 2520

tgacaagagc catacagaca agcaccagct ggcactctta ggtcttcacg tatggtcatc 2580

agtttgggtt ccatttgtag ataagaaact gaacatataa aggtctaggt taatgcaatt 2640

tacacaaaag gagaccaaac cagggagaga aggaaccaaa attaaaaatt caaaccagag 2700

caaaggagtt agccctggtt ttgctctgac ttacatgaac cactatgtgg agtcctccat 2760

gttagcctag tcaagcttat cctctggatg aagttgaaac catatgaagg aatatttggg 2820

gggtgggtca aaacagttgt gtatcaatga ttccatgtgg tttgacccaa tcattctgtg 2880

aatccatttc aacagaagat acaacgggtt ctgtttcata ataagtgatc cacttccaaa 2940

tttctgatgt gccccatgct aagctttaac agaatttatc ttcttatgac aaagcagcct 3000

tagcctaaac acatcacaac 3020

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> sgAlb

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> PAM

<400> 3

gttgtgatgt gtttaggcta agg 23

Claims

1.一种用于血友病A的双切供体，同源臂之间设有报告基因、B结构域删除F8基因(BDDF8)、Wpre元件、PolyA元件，同源臂两侧还设有可被Cas9-sgAlb识别的sgAlb-PAM序列，所述同源臂分别为靶向细胞的靶向位点的上游和下游的一段序列，靶向细胞以Alb终止密码子周围片段作为靶向位点，所述sgAlb-PAM序列也具有作为靶向位点的Alb终止密码子周围片段, 所述sgAlb-PAM序列为SEQ ID NO:3，所述同源臂序列分别为SEQ ID NO:1中第24-651位和第7571-8148位的序列，所述BDDF8为SEQ ID NO:1中第2200-6573位的序列，所述双切供体为SEQ ID NO:1的序列。

2.根据权利要求1所述的用于血友病A的双切供体，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白基因，所述报告基因和BDDF8之间通过自断裂多肽连接，所述靶向位点位于Alb终止密码子附近“TTTAGGCTAAGG”的一段序列上。

3.根据权利要求1所述的用于血友病A的双切供体，其特征在于，所述靶向细胞为肝细胞。

4.一种用于血友病A的复合药物，包括权利要求1-3任一项所述的双切供体的质粒，还包括具有独立启动子的Cas9质粒和具有独立启动子的sgAlb质粒，sgAlb质粒表达针对Alb终止密码子周围片段的sgRNA。

5.根据权利要求4所述的用于血友病A的复合药物，其特征在于，采用EF1启动子驱动Cas9表达，采用U6启动子驱动sgAlb表达；所述复合药物为静脉注射剂，质粒均溶解于平衡液中。

6.一种用于血友病A的药物组合，包括权利要求4所述的复合药物、以及对Cas9的细胞免疫反应和对F8的体液反应具有免疫抑制作用的药物。

7.根据权利要求6所述的用于血友病A的药物组合，其特征在于，所述对Cas9的细胞免疫反应和对F8的体液反应具有免疫抑制作用的药物为环磷酰胺和甲泼尼龙的组合。