CN114703142B - 一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多潜能干细胞，能定向分化为内皮祖细胞。本发明还涉及该多潜能干细胞的构建方法，及其在制药上的用途。本发明要求保护的基本技术方案是：一种人诱导多潜能干细胞，其特征在于F8基因B区编码序列中突变位点附近被框内缺失，或者整个B区编码序列被靶向缺失。本发明克服F8基因表达异常的方法，是提供一种修饰过的人诱导多潜能干细胞，其中非正常表达的F8基因B区编码序列中的突变位点附近序列被框内缺失或整个B区编码序列被靶向缺失。该人诱导多潜能干细胞的获得方法中，不需要构建供体载体，只需要直接合成ssODN即可，技术上实现相对容易，不会添加任何筛选基因，且效率较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种多潜能干细胞(iPSCs)，能定向分化为内皮祖细胞。本发明还涉及该多潜能干细胞的构建方法，及其在制药上的用途。
背景技术
血友病A(Hemophilia A,HA)是一种由于缺乏功能性的FVIII引起的X连锁遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为1/5000[1,2]。其主要表现为不同程度的凝血功能障碍，临床上根据血浆FVIII 的凝血活性将其分为轻型，中间型和重型。轻型患者(FVIII凝血活性为5％-30％)一般经历创伤或大手术后出血，约占HA患者的40％；中间型患者(FVIII凝血活性为1％-5％)偶有自发出血，经历手术后出血严重，约占HA患者的10％；重型患者(FVIII凝血活性<1％)约占HA患者的50％，常会出现关节反复出血而致残，甚至可能发生颅内出血而危及生命。
目前HA尚无根治方法，临床上对于该病主要采取替代疗法，即通过输注血浆分离的FVIII或重组的FVIII蛋白来预防出血发生，或是出血后及时输注来止血。但是FVIII的半衰期极短，常需终身反复输注，还存在潜在病毒感染的风险，更重要的是长期反复输注会产生中和性抗体从而导致治疗无效[3,4]。
HA是由于F8基因突变导致其产生的FVIII分子结构缺陷或FVIII含量减少而不能发挥正常的凝血功能引起的。F8作为已克隆的最大基因之一，全长达186kb[5]，包含26个外显子，其中14号外显子是其最大的外显子(3.1kb)。F8的突变类型很多，至今人类突变数据库(The Human Gene Mutation Database,HGMD)记录的突变种类已有3231种，包括错义突变、无义突变、小片段缺失与插入等，导致FVIII功能降低或丧失[6]。
F8编码产生含2351个氨基酸的前体多肽，经过一系列加工修饰形成含2332个氨基酸的FVIII 成熟蛋白。根据序列相似性，FVIII结构可以分为几个不同的功能区域，包括3个A区，1个B区和2个C区，结构组成为N-A1-A2-B-A3-C1-C2-C(如图1所示)[7,8]。其中A区中存在钙离子的结合位点，在内源性凝血途径中发挥作用。
FVIII在分泌过程中，单链形式的蛋白会被弗林蛋白水解酶切割产生由亚铜离子连接的一条重链 (A1-A2-B)和一条轻链(A3-C1-C2)组成的异源二聚体。经过凝血酶水解，切除了B区，形成由亚铜离子连接的A1，A2，A3-C1-C2，成为有活性的FVIII，即FVIIIa，从而发挥凝血活性(如图2 所示)[7,9]。
此外，B区高度糖基化，有研究表明其与FVIII活性关系不大，缺失大部分B区并不会对FVIII 的活性产生影响[10]。尽管在蛋白功能层面上，B区并不存在于最终发挥凝血活性的FVIII中，但在已收录的所有F8基因突变中，有近500种突变发生在B区编码序列中，其中90％以上的突变造成FVIII 蛋白翻译提前终止，丧失FVIII凝血功能，导致HA[6]。
HA一直被认为是最有可能实现基因治疗的单基因遗传病之一。其中一种理想的方式是突变基因的原位修复或通过适当的原位基因编辑进行功能性矫正，即在缺陷基因的原位点通过同源重组的途径进行精确的基因修复或消除突变的致病性效应。这种方式不仅恢复了基因的功能，同时还保留了基因的原位调控元件，最大限度的将突变基因转变成跟正常人一致的生理状态。目前已有针对F8基因22 号内含子倒位型和1号内含子倒位型突变的HA基因原位修复策略[11,12]。另一种基因治疗方式是基因替代，就是将带有启动子的治疗基因随机或者定点整合到缺陷细胞中，从而达到治疗的目的。由于技术的限制，目前进行的绝大部分基因治疗研究都是采用基因替代策略，例如有通过病毒介导的随机整合策略，非病毒载体介导的基因添加策略。
病毒介导的随机整合策略，就是使用包含有F8的编码序列以及启动子序列的质粒来转染F8缺陷的细胞，F8表达框有一定几率整合到基因组中，从而表达FVIII蛋白发挥作用。其缺点有：(1) F8很大，编码序列为8kb左右，即使是B区缺失的版本也大于4kb，再加上启动子序列，这个质粒很大，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也很低；(2)如果基因随机整合到基因组中，基因的表达可能会受到位置效应的影响，有可能表达效率低，甚至不能表达；(3)如果质粒整合到其他内源性基因位点则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表达的有害基因，从而导致不好的后果。
而非病毒载体介导的基因添加策略有如下缺陷：(1)由于F8很大，编码序列为8kb左右，即使是B区缺失的版本也大于4kb，再加上启动子序列，质粒很大，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也很低，并且一般会引入外源筛选基因，外源基因片段的残留对于细胞的远期影响暂时不能明确；(2)外源基因整合至基因组的安全位点，其通过外源启动子和调控元件调控，有可能影响表达效率。
前期研究表明外源靶入B区缺失型的F8(B domain deletion F8,BDD-F8)基因可以有效的表达功能性BDD-FVIII[13-15]，而且采用重组的BDD-FVIII同样具有一定的临床治疗效果[10,16]。因此针对 F8基因B区编码序列的致病突变，本发明提出一个全新的基于原位基因编辑的治疗策略，即通过靶向基因编辑技术，将致病突变原位转变为B区编码序列微小框内缺失，从而恢复FVIII蛋白的翻译，消除这些突变造成FVIII翻译提前终止的致病性效应，恢复内源性FVIII的凝血活性。并在此基础上，进一步把框内缺失扩展至整个B区编码序列缺失，将此新型的HA原位基因治疗策略应用于所有B 区致病突变患者。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种人诱导多潜能干细胞(iPSCs)，该多潜能干细胞能定向分化为内皮祖细胞，并在人体内正常表达F8基因。
本发明的另一目的是，提供一种获得上述iPSCs的方法。
本发明的再一目的是，依据所获得的iPSCs，提供一种其用于HA治疗的用途。
本发明要求保护的基本技术方案是：一种人诱导多潜能干细胞，其特征在于F8基因B区编码序列中突变位点附近被框内缺失，或者整个B区编码序列被靶向缺失。
本申请人所获得的保藏号为：C201968和C201990的两个细胞株，这两个细胞株只是本发明所要保护的技术方案的一个具体实施例。其中一株是病人iPSCs缺失了54个碱基的细胞，分类命名为F8 基因B区编码序列定点缺失54bp的人诱导多潜能干细胞2-46，于2019年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉市，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201968，另一株是病人 iPSCs缺失了整个B区的细胞，分类命名为F8基因B区编码序列缺失的人诱导多潜能干细胞BD21，于2019年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉市，武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C201990。
因不同的框内缺失F8基因B区编码序列中突变位点或靶向缺失整个B区编码序列的方法，会使所获得的人诱导多潜能干细胞中相关基因的具体序列细节存在一定的差异，但这种差异不对相关基因的表达造成影响，则都属于本发明的技术方案的范畴。
根据本发明的实施例，其针对的突变位点为c.3167delCTGA变异。
为了高效获得原位B区编码序列框内缺失的iPSCs，参考现有技术，可行的方法包括但不限于：可以借助于人工核酸酶。目前人工核酸酶主要有成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindrome repeats,CRISPRs)基因编辑系统，锌指酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs) 和TALE核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)[17,18]。这些基因编辑工具都是通过识别切割靶DNA，造成DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)[19]。DSB主要以不精确的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径进行修复[20]，可实现高效的基因敲除[21,22]。同时DSB可以激活断裂位点附近的同源重组(homologous recombination,HR)活性，在同源修复模板存在的情况下可以显著提高基因打靶效率[23]，实现基因的添加、替换、精确基因片段缺失或点突变。
本发明需要特别提出的方法是：利用ssODN(单链寡聚脱氧核糖核苷酸)介导同源重组的优势[24]，以ssODN作为同源修复模板进行基因片段精确缺失。具体地是，通过CRISPR/Cas9与ssODN对来源于病人的HA-iPSCs进行核转，获得原位B区编码序列微小框内缺失或整个B区编码序列靶向缺失的iPSCs。
如果是只缺失突变序列附近的位置，是根据突变位点附近的序列设计最近的CRISPR/Cas9(Cas9 的设计有PAM序列的限制)的sgRNA，缺失包含突变位点碱基在内的总共3的倍数个碱基，也就是实现框内缺失。另一方面，B区内的突变类型有几百种引起HA，我们设计的整个B区缺失的策略可以针对任何一种B区内的变异，并且为了排除可能患者遗传背景的影响，我们同时也进行了正常人 iPSCs内整个B区的缺失的实验，参见实施例中第2(7)。此实验证明了整个B区的缺失不会对F8 基因的表达产生影响。
本发明中具体实施例中所采用的是比较常见的两侧留14个氨基酸的SQ型连接。如果只是针对某个特定突变位点进行缺失其附近的一部分3的倍数个碱基的话，则需要根据特定突变位点附近构建框内缺失的目的，设计不同的ssODN，具体而言，就是在框内缺失碱基的上下游分别取约40个碱基合成一条80nt左右的ssODN来介导精确基因片段缺失[25]。每一个特定病例情况不一样；如果是直接通过缺失整个B区编码序列来实现所有B区内致病突变的治疗的话，最常规的就是获得这一种SQ 连接(B区N端的Ser743与C末端的Gln1638融合)的B区缺失的类型，这样的话ssODN就可以都采用下表中的F8-BDD-ssODN序列，即SEQ IDNO.20。该ssODN可以应用于B区内所有突变，如果要构建其他类型连接的B区缺失型F8，比如RH连接(B区N端的Arg747与C末端的His1646 融合)，则要相应调整ssODN的序列。
根据本发明的实施例，HA-iPSCs是收集患者尿液细胞，并将其诱导为HA病人特异性iPSCs (HA-iPSCs)。所使用的诱导方法参考文献[11]。
获得iPSCs后，将其定向诱导分化为内皮祖细胞用于细胞移植，发挥治疗作用。关于如何定向诱导分化为内皮祖细胞，可以参考文献[26]。
对于临床实际应用而言，通常应该是采集患者的体细胞，并将其诱导为HA-iPSCs，然后采用本发明提供的方法对其中的F8基因中B区编码序列中的突变位点进行微小框内缺失或整个B区编码序列进行靶向缺失，从而获得基因矫正的人诱导多潜能干细胞，这种干细胞经过定向分化为内皮祖细胞后用于移植能减少排异反应。
本发明克服F8基因表达异常的方法，是提供一种修饰过的人诱导多潜能干细胞，其中非正常表达的F8基因B区编码序列中的突变位点附近序列被框内缺失或整个B区编码序列被靶向缺失。该人诱导多潜能干细胞的获得方法中，不需要构建供体载体，只需要直接合成ssODN即可，技术上实现相对容易，不会添加任何筛选基因，且效率较高。本发明提供的获得iPSCs的方法可以称为一种原位基因矫正，这样可以在基因原有的启动子以及调控元件下，实现基因正常表达，相对安全。
附图说明
图1为FVIII结构模式图；
图2为FVIII分子结构及活化过程的结构变化模式图；其中红色箭头表示弗林蛋白水解酶的切割位点，黄色箭头表示凝血酶切割的位点，紫色M表示将重链和轻链连接起来的金属离子。Full length FVIII表示全长FVIII，FVIIIa表示活化的FVIII；
图3为本发明提供的方法过程示意图；
图4为F8基因B区编码序列内突变iPSCs的诱导及鉴定图；其中A.收集培养的尿液细胞表达β-catenin、KRT7和ZO-1等，提示其肾小管上皮细胞来源；B.重编程获得的iPSC克隆形态；C.获得的iPSCs核型检测未见异常；D.获得的iPSCs仍保留B区的缺失突变；E.免疫荧光显示iPSCs表达多种干细胞标志性蛋白；F.体内畸胎瘤实验证实iPSCs能够在体内分化形成三个胚层来源的组织。
图5为CRISPR基因编辑系统介导F8基因B区编码序列微小框内缺失结果；其中A.CRISPR基因编辑系统介导F8基因B区框内敲除示意图；B.所构建的sgRNA效率检测分别为41.3％与18.92％，绿色碱基为sgRNA序列，蓝色碱基为PAM，虚线表示缺失，黑色箭头为插入，红色碱基为插入的碱基序列，+表示插入，△表示缺失，×表示次数。C.基因打靶实验后，通过PCR对获得的克隆进行初步鉴定。D.PCR阳性条带测序验证；
图6为N-iPSCs精确缺失54bp PCR及测序鉴定结果；其中图A为N-del 54-15-iPSCs和N-del 54-42-iPSCs经F8-E14-F/R进行PCR扩增的电泳图，N-iPSCs为对照细胞；图B为N-del 54-15-iPSCs和N-del 54-42-iPSCs的PCR产物测序结果，图中黑色竖线代表缺失片段处，N-del 54-15-iPSCs和N-del 54-42-iPSCs为缺失54bp碱基后两侧序列直接连接；
图7为HA-iPSC s经基因打靶后干细胞表面标志物鉴定；其中Nanog，Oct4标记为绿色荧光，SSEA-1， SSEA-4标记为红色荧光；DAPI用来染核；
图8为N-iPSCs经基因打靶后干细胞表面标志物鉴定；其中Nanog，Oct4标记为绿色荧光，SSEA-1， SSEA-4标记为红色荧光；DAPI用来染核；
图9为HA-iPSCs框内缺失54bp克隆核型检测；其中图A为2-6-iPSCs核型，图B为2-46-iPSCs 核型，核型分析均显示46,XY，未见异常；
图10为N-iPSCs框内缺失54bp克隆核型检测；其中图A为N-del 54-42-iPSCs核型，图B为N-del 54-15-iPSCs核型，核型分析均显示46,XY，未见异常。
图11为RT-PCR检测HA-iPSCs框内缺失54bp后的iPSCs F8转录；其中iPSCs阶段通过RT-PCR 转录水平检测F8表达，H2O为空白对照，HA-iPSCs为患者组、2-6-iPSCs和2-46-iPSCs为框内缺失组，N-iPSCs为正常对照组，GAPDH为内参，F8(E14)为精确基因缺失区扩增，F8(E23-26)为跨23-26 号外显子引物扩增；
图12为RT-PCR检测N-iPSCs框内缺失54bp后的iPSCs F8转录；其中iPSCs阶段通过RT-PCR 转录水平检测F8表达，H2O为空白对照，N-iPSCs为正常对照组，N-del 54-42-iPSCs和N-del 54-42-iPSCs为精确缺失54bp克隆组，GAPDH为内参，F8(E14)为精确基因缺失区扩增，F8(E23-26) 为跨23-26号外显子引物扩增；
图13为iPSCs阶段FVIII分泌检测；其中ELISA检测iPSCs阶段细胞裂解液与细胞培养上清中FVIII 表达；
图14为iPSCs阶段LMAN1表达检测；其中通过Western blot检测iPSCs阶段细胞内LMAN1的表达，β-actin作为内参。
图15为内皮祖细胞分化第5天细胞进行流式检测；其中上排图从左至右依次为：1.待分析细胞散点图，门内比较集中的一群细胞作为我们分析的目标群细胞进行后续分析；2.HA-iEPCs组分析结果，右上象限显示CD31/CD34双标阳性比例，为23.24％；3.2-6-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为20.85％；4.2-46-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为11.27％；下排图从左至右依次为：1.N-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为10.09％；2.N-del 54-42-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为27.37％；3.N-del 54-15-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为24.54％；
图16为内皮祖细胞分选之后流式检测；其中上排图从左至右依次为：1.分选之后的内皮祖细胞形态，增殖速度快，为上皮样细胞；2.分选后细胞流式检测散点图，门内细胞群为待分析的目标细胞群；3.单标CD34-PE组，左上象限为阳性细胞群；下排图从左至右依次为：1.单标CD31-FITC组，右下象限为阳性细胞群；2.2-6组分选细胞分析结果，双阳性细胞比例为93.24％；3.N-iPSCs组分选细胞分析结果，双阳性细胞比例为92.36％。
图17为分选后的内皮细胞免疫荧光鉴定；其中CD34标记为红色荧光；CD31标记为红色荧光； CD144标记为绿色荧光，DAPI用来染核；
图18为成熟内皮细胞免疫荧光鉴定；其中CD31标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI 用来染核；
图19为成熟内皮细胞N端FVIII免疫荧光检测；其中FVIII-N标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI染核；
图20为成熟内皮细胞C端FVIII免疫荧光检测；其中FVIII-C标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI染核；
图21为成熟内皮细胞阶段FVIII ELISA检测；
图22为内皮细胞阶段LMAN1表达检测；通过Western blot检测内皮细胞阶段细胞内LMAN1的表达，β-actin作为内参；
图23为内皮祖细胞进行小鼠体内移植后FVIII凝血活性检测；
图24为经断尾实验后小鼠生存曲线；其中HA mice(n＝9)；HA-iEPCs(n＝9)；2-6-iEPCs(n＝12)； 2-46-iEPCs(n＝10)；N-iEPCs(n＝9)；N-del 54-42-iEPCs(n＝9)。Ns，与HAmice相比较无统计学差异； ***，p<0.001，**，p<0.01，与HA-iEPCs相比较(log-ranktest)；
图25为断尾实验小鼠平均存活时间；其中经历断尾实验，在实验记录时间(48小时)之后存活的小鼠存活时间未进行统计。ns，与HA mice相比较无统计学差异。***，p<0.001，**，p<0.01，*，p<0.05，与HA-iEPCs组相比较；
图26为小鼠肝脏内人源细胞检测；其中CD31标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI染核；图27为小鼠主要器官内人源细胞检测；其中CD31标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI 染核；
图28为靶向B区编码序列缺失打靶示意图；其中黑色碱基为F8基因B区内部序列，绿色代表设计的CRISPR/Cas9的识别序列，蓝色为PAM序列，红色小箭头为切割位置，黄色阴影部分为ssODN 的上游同源序列，灰色阴影部分为ssODN的下游同源序列，橙黄色碱基为同义突变的两个位置，B 区Reframed F8(BDD F8)为原位缺失B区内序列后的F8结构示意图；
图29为针对B区编码序列靶向缺失的CRISPR/Cas9切割效率检测；其中图A为利用T载体连接PCR产物再测序方法鉴定F8-BDU-sg1的效率，indels产生比例为13.33％；图B为利用T载体连接PCR产物再测序方法鉴定F8-BDD-sg4的效率，indels产生比例为35.71％。WT示原始序列，蓝色标识部分为PAM序列，虚线示缺失的部分，红色标识碱基为突变及插入碱基，△为缺失突变碱基数， +为插入突变碱基数；
图30为测序鉴定HA-iPSCs缺失B区的克隆；其中图A为BD21-iPSCs和BD25-iPSCs经F8-E14-F/R进行PCR扩增之后电泳结果，Marker为DL 2000，HA-iPSCs为未打靶的细胞，扩增出 498bp条带，BD21-iPSCs和BD25-iPSCs未扩增出条带，N-iPSCs为正常对照，扩增出502bp条带。图B为BD21-iPSCs和BD25-iPSCs经F8-BUF/BDR进行PCR扩增之后电泳结果，Marker为DL 2000， HA-iPSCs为未打靶的细胞，扩增出3019bp条带，BD21-iPSCs和BD25-iPSCs扩增出341bp条带， N-iPSCs为正常对照，扩增出3023bp条带。图C为BD21-iPSCs和BD25-iPSCs经F8-BUF/BDR扩增的PCR产物进行Sanger测序的结果，Predicted为HA-iPSCs缺失B区(保留SQ序列)的理论序列，图中黑色竖线代表缺失片段处，峰图为BD21-iPSCs和BD25-iPSCs缺失B区内碱基后两侧序列直接连接，蓝色箭头所指处为SQ序列内引入的同义突变；
图31为N-iPSCs缺失B区PCR及测序鉴定结果；图A为N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs经 F8-E14-F/R进行PCR扩增之后电泳结果，Marker为DL 2000，N-iPSCs为正常对照，扩增出502bp 条带，N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs未扩增出条带。图B为N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs经F8-BUF/BDR进行PCR扩增之后电泳结果，Marker为DL 2000，N-iPSCs为正常对照，扩增出3023bp 条带，N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs扩增出341bp条带。图C为N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs 经F8-BUF/BDR扩增的PCR产物进行Sanger测序的结果，Predicted为N-iPSCs缺失B区(保留SQ 序列)的理论序列，图中黑色竖线代表缺失片段处，峰图为BD21-iPSCs和BD25-iPSCs缺失B区内碱基后两侧序列直接连接，蓝色箭头所指处为SQ序列内引入的同义突变。
图32为HA-iPSCs B区缺失克隆干细胞表面标志物鉴定；Nanog，Oct4标记为绿色荧光，SSEA-1， SSEA-4标记为红色荧光；DAPI用来染核。
图33为N-iPSCs B区缺失克隆干细胞表面标志物鉴定；Nanog，Oct4标记为绿色荧光，SSEA-1， SSEA-4标记为红色荧光；DAPI用来染核。
图34为HA-iPSCs B区缺失克隆核型检测；图A为BD21-iPSCs核型，图B为BD25-iPSCs核型，核型分析均显示46,XY，未见异常。
图35为N-iPSCsB区缺失克隆核型检测；图A为N-BD9-iPSCs核型，图B为N-BD14-iPSCs核型，核型分析均显示46,XY，未见异常。
图36为RT-PCR检测iPSCs阶段F8转录；iPSCs阶段通过RT-PCR转录水平检测F8表达，H2O 为空白对照，HA-iPSCs为患者组、BD21-iPSCs和BD25-iPSCs为B区缺失组，N-iPSCs为正常对照组，GAPDH为内参，F8(BD)为跨14号外显子引物扩增，F8(E23-26)为跨23-26号外显子引物扩增。
图37为RT-PCR检测iPSCs阶段F8转录；iPSCs阶段通过RT-PCR转录水平检测F8表达，H2O 为空白对照，N-iPSCs为正常对照组，N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs为B区缺失克隆组，GAPDH 为内参，F8(BD)为跨14号外显子引物扩增，F8(E23-26)为跨23-26号外显子引物扩增。
图38为iPSCs阶段FVIII分泌检测；ELISA检测iPSCs阶段细胞裂解液与细胞培养上清中FVIII 表达。
图39为iPSCs阶段LMAN1表达检测；通过Western blot检测iPSCs阶段细胞内LMAN1的表达，β-actin作为内参。
图40为分化第5天细胞进行流式检测；从左至右依次为：1.待分析细胞散点图，门内比较集中的一群细胞作为我们分析的目标群细胞进行后续分析；2.BD21-iEPCs组分析结果，右上象限显示 CD31/CD34双标阳性比例，为20.59％；3.BD25-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为16.84％； 4.N-BD9-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为19.55％；5.N-BD14-iEPCs组分析结果，右上象限双阳性比例为21.23％。
图41为分选后的内皮祖细胞免疫荧光鉴定；CD31标记为红色荧光；CD144标记为绿色荧光， DAPI用来染核。
图42为成熟内皮细胞免疫荧光鉴定；CD31标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI用来染核。
图43为RT-PCR检测iECs阶段F8转录；iECs阶段通过RT-PCR转录水平检测F8表达，H2O为空白对照，HA-iECs为患者组、BD21-iECs和BD25-iECs为B区缺失组，N-iECs为正常对照组，GAPDH 为内参，F8(BD)为跨14号外显子引物扩增，F8(E23-26)为跨23-26号外显子引物扩增。
图44为RT-PCR检测iECs阶段F8转录；iECs阶段通过RT-PCR转录水平检测F8表达，H2O为空白对照，N-iECs为正常对照组，N-BD9-iECs和N-BD14-iECs为B区缺失克隆组，GAPDH为内参， F8(BD)为跨14号外显子引物扩增，F8(E23-26)为跨23-26号外显子引物扩增。
图45为成熟内皮细胞N端FVIII免疫荧光检测；FVIII-N标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI染核。
图46为成熟内皮细胞C端FVIII免疫荧光检测；FVIII-C标记为红色荧光，vWF标记为绿色荧光，DAPI染核。
图47为成熟内皮细胞阶段FVIII ELISA检测；
图48为内皮细胞阶段LMAN1表达检测；通过Western blot检测内皮细胞阶段细胞内LMAN1的表达，β-actin作为内参。
图49为内皮祖细胞进行小鼠体内移植后FVIII凝血活性检测；***，p<0.001，与HA-iEPCs组相比较，n＝6。
图50为经断尾实验后小鼠生存曲线；ns，与HA mice相比较无统计学差异；***，p<0.001，与 HA-iEPCs相比较(log-rank test)，(n＝9)。
图51为断尾实验小鼠平均存活时间；经历断尾实验，在实验记录时间(48小时)之后存活的小鼠存活时间未进行统计。ns，与HA mice相比较无统计学差异。***，p<0.001，**，p<0.01，与HA-iEPCs 组相比较。
图52为F8-E14-sg1、F8-E14-sg2、F8-BDU-sg1、F8-BDD-sg4组的PCR扩增热循环条件图。
图53为实施例步骤4.2中CRISPR/Cas9打靶定点缺失检测PCR体系热循环条件图。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明实施例中所涉及的引物名称及序列如下表1。
表1.引物名称、序列及其对应的用途
本发明所实施的实验方法和步骤如下：
CRISPR/Cas9表达质粒构建
利用FengZhang Lab提供的Opimized CRISPR Design的方式来设计合适的的CRISPR/Cas9的短链向导RNA(sgRNA)(http://crispr.mit.edu/)[27]。订购Feng ZhangLab提供的Cas9密码子优化的 CRISPR/Cas9骨架pX330。
(1)根据实验目的设计sgRNA(20nt左右)，序列见表1中的序列SEQ ID NO.1、SEQID NO. 2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15，在sgRNA序列5'端添加Bbs I的识别序列CACC，在sgRNA互补序列的5'端添加AAAC；
(2)用BbsI酶切pX330骨架，酶切体系如下：
37℃酶切3小时，酶切产物进行琼脂糖胶电泳，电泳鉴定酶切完全，即进行胶回收产物，回收之后加12μL ddH2O溶解产物，用于连接。
(3)将上海生工生物有限公司合成的的寡核苷酸按照如下四组不同体系分别进行退火形成含有粘性末端的双链；
F8-E14-sg1退火体系如下：
95℃，5分钟之后，自然降温至室温，用于连接；
F8-E14-sg2退火体系如下：
95℃，5分钟之后，自然降温至室温，用于连接；
F8-BDU-sg1退火体系如下：
95℃，5分钟之后，自然降温至室温，用于连接；
F8-BDD-sg4退火体系如下：
95℃，5分钟之后，自然降温至室温，用于连接；
(4)连接，体系如下：
16℃过夜连接；
(5)转化与单克隆菌落挑取
从-75℃超低温冰箱中取出DH5α感受态，将10μL连接产物加入至50μL感受态中，用中枪头轻轻吹打混匀；
于冰上静置30分钟，同时将循环水浴箱预热至42℃；
将冰浴完成之后的1.5mL离心管放于42℃循环水浴中热激45秒钟后，立即于冰上静置2分钟；
在超净工作台内操作，加入500μL无抗性的液体LB培养基；
37℃空气摇床180r/min摇45分钟；
从摇床中取出菌液，以2500g离心5分钟，在超净工作台中弃去部分上清，约留取100μL菌液混匀；
将菌液加至预先倒好的氨苄抗性的LB固体平板中，用涂布棒将菌液均匀的涂布于固体LB培养皿上；倒置于37℃恒温培养箱培养12～16小时。
挑取单个菌落至500μL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃空气摇床220转生长4～6小时后送菌液去测序，测序引物为U6通用引物。
测序结果与理论结果一致的菌落再次扩大培养，将菌液接种至约60mL加有氨苄的液体LB培养基中，37℃空气摇床上以280转生长14～16小时。利用OMEGA Endofree plasmidMidi Kit抽提质粒，根据说明书操作即可获得构建成功的CRISPR/Cas9表达载体。
2.血友病A病人特异性iPSCs诱导(HA-iPSCs)
收集一例突变型为F8基因c.3167delCTGA导致p.D1055fsX5的重型HA患者尿液，分离培养其尿液细胞，利用经典四因子方法将患者尿液细胞重编程为iPSC样克隆并进行鉴定。
2.1尿液标本的采集
在患者签署知情同意书的前提下，无创性收集患者尿液，具体步骤如下：
(1)消毒尿道口，利用干净棉签蘸取碘伏，轻轻擦拭尿道口及周围，更换新的棉签重复1次，再蘸取70％酒精擦拭两次；
(2)稍等几秒晾干酒精后即可收集尿液。打开收集瓶的盖子，排尿最开始的20mL尿液排入便池，收集中段尿液至收集瓶中，尿液快排完时，最后一部分排入便池，小心盖好收集瓶的盖子。一般情况下收集100-200mL尿液。
2.2尿液细胞的培养
(1)在无菌室内将采集瓶内的尿液分装至50mL离心管中，以400g室温离心10分钟，小心弃除上清，留少于1mL残液，将所有分装至50mL离心管中的尿液离心之后的残液合并至一个50mL 离心管中，加入10mL DPBS，以200g室温离心10分钟，小心弃除上清，留200μL残液，加1mL 初始培养基重悬细胞，接种于包被好0.1％gelatin的12孔细胞培养板的一个孔中；
(2)第二天直接添加500μL新鲜的初始培养基；
(3)第三天直接添加500μL新鲜的初始培养基；
(4)第四天开始，每天用REBM完全培养基半量换液，一般情况下，接种后5天左右可以观察到少数细胞集落，观察到细胞集落之后即可全量更换REBM完全培养基，继续培养，直至细胞汇合度达50％左右时，进行传代，记为P1，以REBM完全培养基进行培养。
(5)取P1-P3代细胞，进行计数接种至六孔培养板孔中以6万细胞/孔接种两个六孔板孔。其余细胞冻存。
2.3诱导iPS细胞
诱导过程中需要进行两次逆转录病毒感染，将第一次病毒感染的时间定义为Day0.
(1)Day-3下午6点计数接种HEK293T细胞于六孔板中，以80万细胞/孔接种；
(2)Day-2包装病毒，下午4点，对昨日接种的HEK293T细胞更换1.5mL完全培养基，2小时后开始转染，转染时细胞密度应为80％左右。
配制磷酸钙转染液：
先加Milli-Q水至EP管中，再加入质粒混匀，再加入2M CaCl2混匀，最后加入2×HBS用力吹打，产生气泡。将转染液逐滴加到细胞上，尽量使转染液能覆盖到孔的所有区域；
(3)Day-1上午将转染的HEK293T小心更换2mL新鲜DMEM完全培养基(转染后12小时)；下午在六孔细胞培养板中每孔接种6万待诱导细胞，接种两个孔。Day 0，六孔板中的待诱导细胞更换2mL REGM新鲜培养基。收集包含逆转录病毒的HEK293T细胞培养上清(约转染后36小时)，用0.45μm针式过滤器过滤后加入到待诱导细胞的孔中。待诱导的孔加Oct4、Sox、Klf4和c-Myc四种病毒上清，对照的孔中只加含GFP的病毒上清，并在体系中加入终浓度为8μg/mL的polybrene以增加感染效率。HEK293T细胞每孔再加入2mL新鲜的DMEM完全培养基；
(4)Day 1，将感染过夜后将病毒上清更换为REGM以促进细胞恢复。下午第二次收集病毒上清再感染一次，操作如前，使用后的HEK293T细胞不再继续培养。Day 2上午更换为REGM培养基。 Day 3更换REGM培养基，可通过观察对照孔的GFP效率来判断病毒包装及感染效率，正常应接近 100％。Day 4更换REGM培养基，可观察到部分细胞发生形态变化，细胞变小，形态变成多边形且扁平，核质比增大同时有成团聚集生长趋势，增殖速度变快，随着培养的继续形态变化会逐渐增强，与GFP对照细胞的密度和形态形成强烈对比；
(5)一般在Day 5可转移到MEF上，预判第二天细胞会接近汇合时准备MEF，第二天用Accutase 消化细胞并计数。接种细胞至10厘米细胞培养皿，每个皿接种10万或20万细胞，以ES/DFBS 1:1 培养基进行培养，每天换液；
(6)隔天加入VPA至终浓度为1mM，连续加7天。从Day 6开始可以见到培养皿里有大量的小克隆出现，克隆表明平整边界清楚，折光度高且细胞核质比高。但是随着培养的继续从Day 9开始这些小克隆开始逐渐分化或死亡；
(7)从Day 16开始可看到一些ES形态的克隆逐渐长大，有些是单独形成的，有些是从之前分化的克隆中间长出来的，待克隆长到一个10倍物镜视野时即可用巴斯德管挑取后用于扩增及鉴定。
2.4 iPSCs复苏
(1)复苏细胞前一天，培养细胞孔板包被好Matrigel；
(2)先打开水浴箱，设置温度至37℃，待水浴箱温度稳定在37℃时，从液氮罐中取出冻存的细胞，将冻存管盖拧松，使其中残留的液氮挥发掉，再迅速拧紧冻存管盖，快速置于37℃水浴箱中，待管中冰块融化至只剩一颗绿豆大小时取出，快速进无菌室复苏；
(3)无菌室操作间铺好操作台，取一个干净的15mL离心管，加入冻存管内液体9倍体积的提前预温好的mTeSR1，再将冻存管内细胞吸至加好培养基的离心管中，以170g在室温离心5分钟；
(4)轻轻吸出上清弃去，加适量mTeSR1培养基重悬细胞沉淀，加入Y27632至终浓度为10μM，混匀后，接种至预先包被好Matrigel的孔板中，十字摇匀后置37℃细胞培养箱中培养。
2.5iPSCs培养、传代和冻存
(1)iPSCs复苏之后，维持培养需每天换液，以mTeSR1培养基培养；
(2)待细胞汇合度达到70％时，包被Matrigel，根据实验需要包被合适孔板。包被好Matrigel 后第二天传代，传代时用0.5mM EDTA消化：先吸出培养基弃去，加入能够没过培养孔底面的0.5mM EDTA漂洗两次，将残液吸干净，再加入稍多量0.5mM EDTA室温静置消化3分钟，吸干净液体，加入适量mTeSR1吹打所需量的细胞下来，接种至包被好Matrigel的孔板中，十字摇匀，置37℃细胞培养箱中培养；
(3)待细胞汇合度达到80％-90％时，可以根据需要冻存细胞，消化过程与传代一样，最后一步直接用冻存液(90％mTeSR1+10％DMSO，提前4℃预冷)重悬细胞，直接转至冻存管中，置于冻存盒中-80℃超低温冰箱过夜，然后转移至液氮罐中，做好记录。
2.6干细胞表面标志物鉴定
(1)将培养在Matrigel上的HA-iPSCs传代接种至包被有Matrigel的细胞爬片的24孔板中，继续培养2-3天时，进行免疫荧光鉴定；
(2)弃去培养基，DPBS漂洗2次，吸尽残液，加入4％多聚甲醛室温固定15分钟；
(3)吸尽残液，加入PBST(DPBS+1/1000Triton-100)透化处理15分钟；
(4)弃去PBST，DPBS漂洗2次-3次，5％BSA封闭30分钟；
(5)用封闭液以1:200稀释Oct4/Nanog/SSEA-1/SSEA-4一抗，一抗室温孵育1小时；
(6)弃去一抗，加DPBS漂洗2次-3次之后，加入DPBS洗3次，每次10分钟；再以5％BSA封闭30分钟；
(7)用封闭液以1:300稀释二抗，对应一抗种属选择合适二抗，室温避光孵育1小时；
(8)弃去液体，DPBS漂洗2次-3次之后，加入DPBS洗5次，每次5分钟；
(9)加1μg/mL DAPI室温避光孵育6min，DPBS漂洗2次-3次之后，加入DPBS洗5次，每次5分钟；
(10)超纯水漂洗一次，加90％甘油封片，指甲油封边，在激光共聚焦显微镜下拍照保存。
2.7核型检测
(1)六孔板内HA-iPSCs汇合度至80％时，向培养基中加秋水仙素至终浓度40ng/mL，37℃细胞培养箱中培养5小时；
(2)吸净培养基，加入生理盐水漂洗两次，以0.05％EDTA-胰酶37℃消化3分钟，加入培养基终止消化；
(3)收集细胞至15mL离心管中，以1200g离心5分钟；
(4)弃上清，加入8mL 0.07％KCl低渗液在37℃水浴箱中孵育10分钟进行低渗；
(5)低渗完成后加入1.5mL 37℃预热的固定液(冰醋酸与甲醇按照3:1的比例混合)轻轻吹打混匀，置37℃水浴箱中5分钟，进行预固定；
(6)预固定完成之后以1200g室温离心10分钟；
(7)弃去上清，加入8mL 37℃预热的固定液，吹打混匀；
(8)以1200g室温离心10分钟；
(9)弃去上清，重复固定一次，轻轻吸弃上清，加入适量新鲜固定液重悬细胞(至毛玻璃样浑浊)；
(10)于滴片分散仪内滴片，编号，75℃烤片3小时，进行吉姆萨染色，镜下观察，采集图像。
2.8体内三胚层分化
(1)由于细胞免疫原性的存在，异种移植会出现免疫排斥，因此将人源的iPSC皮下注射至裸鼠体内进行体内三胚层分化实验。准备2个6cm dish中汇合度达到80％以上的的HA-iPSCs；
(2)0.05％EDTA-胰酶37℃消化细胞约5分钟，mTeSR1培养基终止消化后，以1200g离心5 分钟，吸尽上清，用140μL mTeSR1培养基重悬细胞，再加入70μL Matrigel混匀，置冰上；
(3)使用6-8周龄的裸鼠，固定裸鼠后对其下肢腹股沟位置用碘伏局部消毒，使用1mL注射器将细胞悬液缓慢匀速皮下注射至裸鼠腹股沟处，注射完成后局部压迫；
(4)将裸鼠剪趾标记，并记录；
(5)约两周可见注射部位局部出现小突起，6周以后可见到明显的瘤体。约8周时，畸胎瘤长至直径1cm左右时，可手术收获畸胎瘤；
(6)连同畸胎瘤包膜一同完整取出，测量瘤体直径并拍照，4％多聚甲醛固定过夜后做石蜡组织切片并行HE染色。染色完成之后可在光学显微镜下观察并拍照。
3.CRISPR/Cas9切割活性检测
为了检测CRISPR/Cas9切割活性，我们将CRISPR/Cas9表达质粒通过核转染方式转入至 HA-iPSCs细胞中，表达CRISPR/Cas9，在其发挥切割作用产生DSB的时候，细胞通过NHEJ的机制修复，产生indels，通过检测含有indels的目的基因所占的比例即能反映该条sgRNA的切割活性。
3.1核转染
①HA-iPSCs接种至包被好Matrigel的六孔板中，利用mTeSR1培养，约六孔板孔汇合度90％时可以用来打靶；
②基因打靶前2.5小时换液，加入终浓度为10μM Y27632的新鲜培养基于37℃培养箱继续培养；
③按照Lonza公司的核转试剂Human Stem Cell Kit 2说明书进行操作，先取试剂盒中的82μL Solution II以及18μL Supplement I混合后置于室温平衡温度；室温静置15分钟，每管分别加入一条表达相应sgRNA的CRISPR/Cas9表达质粒，室温静置5分钟；
④利用TrypLE SELECT消化细胞：DPBS洗3-4次后，加入TrypLE SELECT，置37℃培养箱中消化3-5分钟，镜下观察细胞克隆边缘卷曲时，加入ES培养基终止消化，将细胞吹吸下来，转移至离心管内，利用血细胞计数板进行计数，取出含100万细胞的细胞悬液170g室温离心5分钟；
⑤离心后弃上清，吸尽培养基残液，将步骤③中加好质粒的液体加入离心管中，重悬细胞，转移至电极杯中，利用LONZA核转仪B-016程序进行核转，完成之后立即加400μLmTeSR1至电极杯中，室温静置5分钟；
⑥在预先铺好Matrigel的六孔板中加入1.5mL mTeSR1，将⑤中电极杯里的细胞转移至加好 mTeSR1的六孔板中，加入Y27632，十字摇匀之后，放37℃培养箱培养；
⑦核转12小时，换新鲜培养基，加Y27632，培养3天，抽提细胞DNA。
3.2 gDNA抽提
(1)将待抽提DNA的细胞利用DPBS漂洗3次后，37℃胰酶消化5分钟，加入ES培养基终止消化，将细胞收集至1.5mL离心管中，以5000g室温离心5分钟；
(2)离心之后弃上清，加入500μL细胞核裂解液，加1/200蛋白酶K及1/1000RNase，吹打混匀后，加入70μL 10％SDS，颠倒混匀之后，置摇床中37℃，100转过夜裂解；
(3)将过夜裂解的细胞取出，加入等体积Tris-苯酚，反复颠倒混匀，至出现细密均匀的微小油状颗粒时离心，以17000g室温离心10分钟；
(4)离心完成后，管内液体分层，将上层液体吸出至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的1:1 苯酚/氯仿混合液，反复颠倒混匀，至形成均匀乳糜状颗粒时离心，以17000g室温离心10分钟；
(5)离心完成后，管内液体分层，吸取上层液体至一新的1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，反复颠倒混匀，出现白色丝状DNA时利用低温离心机进行离心，以17000g在4℃离心 10分钟；
(6)离心完成后，倒掉上清，加入500μL提前预冷的75％无水乙醇，颠倒10次，以17000g在4℃离心10分钟；
(7)倒掉上清，点离，吸尽残液，在超净工作台中晾干，加入适量ddH20溶解。
已获得的gDNA作为模板，PCR扩增切割位点附近的序列，体系如下：(F8-E14-sg1，和F8-E14-sg2 组均以F8-E14-F/R进行扩增；F8-BDU-sg1组以F8-BU-F/R进行扩增；F8-BDD-sg4组以F8-BD-F/R 进行扩增)
热循环条件为见图52所示。
3.3利用测序方法检测
PCR产物进行电泳，胶回收目的片段，回收产物进行T载体连接，连接体系如下：
16℃水浴连接过夜后取10μL转化，且进行蓝白筛选，转化后细菌生长约14小时左右，挑取白色的菌落至加有氨苄的液体LB中，摇菌3个小时左右将菌液送测序鉴定，以通用引物T7进行测序，利用DNA star序列比对软件进行序列比对，切割位点附近出现indels者计为切开者，计算对应的 CRISPR/Cas9切割效率。
4.CRISPR/Cas9联合ssODN核转HA-iPSCs与N-iPSCs(同3.1)
对于缺失B区内微小框内缺失而言，转染质粒分两组，其中一组为4μg F8-E14-sg1与4μg F8-E14-sg2，另一组为4μg F8-E14-sg1，4μg F8-E14-sg2与50pmol F8-E14-del54-ssODN，室温静置 5分钟；
对于缺失整个B区组而言，转染质粒为1组，为4μg F8-BDU-sg1，4μg F8-BDD-sg4与50pmol F8-BDD-ssODN，室温静置5分钟；
核转之后，培养3-5天，待细胞量较多时，取10000个细胞计数接种至MEF饲养层细胞上，以获取单克隆，其余混合细胞冻存以备后续应用；
单细胞接种至MEF上后，需每天更换ES培养基培养约12天左右，克隆生长至10倍镜视野1/2 至2/3时，将单克隆挑取至铺有Matrigel的48孔板中，进行克隆扩增；抽提DNA进行PCR鉴定以获取阳性克隆。
4.1 gDNA抽提(同3.2)
4.2 PCR初步检测定点缺失
利用F8-E14-F/R引物进行B区内微小框内缺失克隆初步鉴定
CRISPR/Cas9打靶定点缺失检测PCR体系如下：
热循环条件为图52所示。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳，未打靶的HA-iPSCs或打靶未整合细胞扩增出498bp条带；阳性定点缺失克隆的PCR产物为448bp大小条带。将扩增出约448bp条带的PCR产物送测序，以F8-E14-F为测序引物，利用SeqMan软件进行序列比对，对完全精确缺失的克隆进行扩增、冻存，同时进行下一步实验。对于N-iPSCs来说，未打靶者或者未整合者可以扩增出502bp条带，阳性定点缺失克隆的PCR产物为448bp大小条带。
利用F8-BU-F/F8-BD-R引物进行整个B区靶向缺失克隆初步鉴定
CRISPR/Cas9打靶定点缺失检测PCR体系如下：
热循环条件为图53所示。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳，未打靶的HA-iPSCs或打靶未整合细胞扩增出3019bp条带；阳性定点缺失克隆的PCR产物为341bp大小条带。将扩增出约341bp条带的PCR产物送测序，以F8-BU-F为测序引物，利用SeqMan软件进行序列比对，对完全精确缺失的克隆进行扩增、冻存，同时进行下一步实验。
4.3定点精确缺失克隆干细胞细胞表面标志物鉴定，步骤同2.6。
5.RT-PCR检测F8的表达
①将HA-iPSCs以及基因打靶后的iPSCs和N-iPSCs于十二孔板中培养，待汇合度达到80％以上时以Trizol法提取细胞总RNA；将N-iPSCs缺失54bp的克隆N-del 54(N-del 54-15，N-del 54-42) 于12孔板中培养，以Trizol法提取细胞总RNA；同时将整个B区缺失的克隆(BD21，BD25)于十二孔板中培养，待汇合度达到80％以上时以Trizol法提取细胞总RNA；将N-iPSCs缺失整个B区的克隆N-BD(N-BD9，N-BD14)于12孔板中培养，以Trizol法提取细胞总RNA；
②利用Thermo ScientificTM公司的DNaseⅠ消化去除可能的存在的DNA；
③取1μg总RNA至PCR管，在PCR仪上70℃处理10分钟，置于冰上5分钟，使用Promega公司的Reverse Transcription System配制逆转录体系：
42℃，3Omin→95℃，5min→冰上5min
在PCR仪上进行逆转录，反应程序：
④以上一步逆转录的cDNA为模板，配制PCR体系如下：
内参基因GAPDH使用引物为GAPDH-F与GAPDH-R(理论大小为453bp)。对于缺失54bp克隆而言，F8转录检测通过两对RT引物：F8-E14-F/R，F8-RT-E23F与F8-RT-E26R进行PCR。对于缺失整个B区克隆而言，F8转录检测通过两对RT引物：F8-RT-BDF/R，F8-RT-E23F与F8-RT-E26R 进行PCR。热循环条件为图53所示。
取5μL产物琼脂糖凝胶电泳分析。
6.ELISA检测FVIII表达
①分别收集培养在12孔板中的HA-iPSCs、鉴定定点精确缺失克隆2-6、2-46以及正常对照人iPSCs (N-iPSCs)细胞24小时的培养上清，收集的培养上清以5000g离心5分钟后取上清，加入1/100 蛋白酶抑制剂，储存于-80℃备用。同时收集N-iPSCs缺失54bp的克隆N-del 54(N-del 54-15，N-del 54-42)的上清，收集上清后培养孔板中的细胞对应计数；对应于整个B区缺失的克隆而言，也是同样收集细胞上清并计数细胞量；
②利用CEDARLANE公司的Paired Antibodies for ELISA-Factor VIII进行检测。
7.iPSCs定向内皮细胞分化
为了检测本研究采用的基因修复策略是否有效，需要进行体内治疗效果评价，而内皮细胞是合成和分泌FVIII的主要细胞类型，因此将iPSCs定向分化为具有增殖能力的内皮祖细胞，为后续临床前研究及临床应用提供有利条件。
参照已有的文献报道[26]，通过小分子抑制剂来实现iPSCs定向分化为内皮祖细胞，实验中采用 6μM CHIR99021来进行分化，具体分化步骤如下：
(1)将培养在包被有Matrigel的六孔板中的iPSCs先用DPBS漂洗3次，再加入500μLAccutase， 37℃培养箱中静置消化5分钟，加入mTeSR1培养基终止消化，将细胞收集至无菌15mL离心管中，采用血细胞计数板进行计数，以170g室温离心5分钟，吸弃上清，加适量培养基重悬细胞，以5万个细胞/cm2接种至包被有Matrigel的培养孔板中，加入Y27632至终浓度为10μM，以mTeSR1进行培养，十字摇匀后置37℃培养箱中培养，此时记为Day-3；
(2)Day-2和Day-1只需每天更换培养基mTeSR1；
(3)Day 0时更换培养基LaSR基础培养基加6μM CHIR99021(因CHIR99021是使用DMSO配制的，故使用时新鲜加入待用的LaSR基础培养基，混匀后进行换液)；
(4)Day 1与Day 0一样更换培养基，显微镜镜下观察会发现死亡细胞增加；
(5)Day 2开始，每天更换LaSR基础培养基即可，直到Day 5；
(6)Day 5时进行流式细胞术检测内皮祖细胞表面标志物CD31和CD34，以检测分化效率；
同时Day 5还可以进行CD31磁珠分选，获得纯度较高的内皮祖细胞；
7.1内皮祖细胞分选
分化Day 5的细胞即可进行CD31磁珠分选：
(1)将分化培养基弃去，加入DPBS漂洗3-4次，吸去残液；
(2)加入Accutase，37℃消化5分钟，LaSR基础培养基终止消化；
(3)收集细胞至一干净无菌50mL离心管中，利用细胞筛过滤细胞团块，以170g室温离心5分钟；
(4)弃上清，加入预冷的MACS缓冲液10mL，重悬细胞，以170g室温离心5分钟；
(5)轻轻吸弃上清，剩少量残液时，点离，将残液吸干净；
(6)加入60μL MACS缓冲液，吹打混匀之后，再加入20μL FcR Blocking Reagent，混匀后加入 20μL CD31 MicroBeads吹打混匀；
(7)置冰箱4℃精确孵育15分钟；
(8)孵育完成后加1mL预冷的MACS缓冲液，以170g室温离心5分钟；
(9)吸弃上清，加入1mL预冷的MACS缓冲液重悬细胞；
(10)准备分选柱，将LS分选柱固定到MACS分选适配架上；
(11)先用3mL预冷的MACS缓冲液平衡分选柱，即将MACS缓冲液加入到LS分选柱中待其自然流过，准备50mL离心管收集滤液；
(12)将细胞悬液加入到平衡后的LS分选柱的中，待其自由流过，加入预冷的MACS缓冲液洗柱3mL洗3次，操作过程中须避免气泡的产生；
(13)待液体完全流完之后，将LS分选柱取下脱离磁场，准备一个无菌的15mL离心管；
(14)在LS分选柱内加入5mL预冷的MACS缓冲液，使用LS分选柱试剂盒里的无菌活塞一次性快速将缓冲液推过分选柱，并收集到15mL离心管中；
(15)将细胞悬液计数后170g室温离心5分钟，接种于包被好Collagen IV的孔板中，以EGM-2 培养。
7.2流式细胞术检测内皮祖细胞分化效率
(1)内皮祖细胞分化Day 5，进行流式检测内皮祖细胞分化效率，以DPBS漂洗分化细胞3次，加入预温的Accutase，37℃消化5分钟，LaSR基础培养基终止消化，将细胞收集至无菌干净的15mL 离心管中，以170g室温离心5分钟；
(2)离心完成后，弃去上清液，加入5mL DPBS重悬细胞，再次以170g室温离心5分钟；
(3)吸弃上清，加入400μL DPBS重悬细胞，并分装至4个干净灭菌的1.5mL离心管中，每个1.5 mL离心管中分装100μL；
(4)其中一管作为空白对照，一管加入20μL CD34-PE Antibody，轻轻吹打混匀，置冰上避光孵育 30分钟，一管加入20μL CD31-FITC Antibody，轻轻吹打混匀，置冰上避光孵育30分钟，还有一管加入20μL CD34-PE Antibody和20μL CD31-FITC Antibody，轻轻吹打混匀后，置冰上避光孵育30 分钟；
(5)抗体孵育完成之后，在每管中加入1mL DPBS，轻柔颠倒混匀之后，以5000g室温离心5分钟；
(6)离心完成之后，轻轻吸弃上清，加入300μL DPBS重悬细胞，将样品置冰上避光去湘雅医院血液科流式细胞室进行检测，利用BD FACSCaliburTM Flow Cytometer仪器中CellQuest Pro软件进行检测，统计分析数据。
7.3流式细胞术检测分选效率(步骤同7.2)
内皮祖细胞分化Day 5经过CD31磁珠标记抗体分选之后，进行流式检测内皮祖细胞分选效率。
7.4内皮细胞免疫荧光鉴定表面标志物
(1)将培养在Collagen IV上的分选之后的内皮祖细胞接种至室温包被有Matrigel的细胞爬片的24 孔板中，继续培养1天及7天时，分别进行免疫荧光鉴定，步骤同2.6，培养1天时检测的标志物为 1:100稀释的CD31/CD144/CD34一抗；培养7天时检测的标记物为1:100稀释的vWF和N端FVIII 抗体和C端FVIII抗体。
8.内皮细胞阶段F8表达的检测
8.1 RT-PCR检测F8的表达
(1)将分化而来的内皮细胞于十二孔板中培养，待汇合度达到80％以上时以Trizol法提取总RNA；其余步骤同步骤5。
8.2 ELISA检测FVIII表达
分别收集培养在12孔板中由iPSCs分化而来的内皮细胞的24小时培养上清，收集的培养上清以 5000g离心5分钟后取上清，加入1/100蛋白酶抑制剂，储存于-80℃备用。收集上清后孔中的细胞对应计数；利用CEDARLANE公司的Paired Antibodies for ELISA-Factor VIII进行检测。
9.Western blot检测细胞内LMAN1表达
9.1提取细胞总蛋白
(1)吸干净12孔板中细胞培养基，加入DPBS漂洗2-3次；
(2)加入200μL RIPA裂解液(加入1/100蛋白酶抑制剂)，于冰上静置消化5分钟，之后用中枪头将消化后的细胞裂解物刮吸至1.5mL离心管中；
(3)利用超声仪对细胞裂解物进行超声打断，将超声探头插入至液面之下，持续超声5秒钟，静置5秒钟，反复5-6次；
(4)95℃加热10分钟变性；
(5)以14000g在4℃离心10分钟，将上清吸出至一干净的1.5mL离心管中，作好标记，保存于-80℃。
9.2 BCA蛋白定量
(1)取9μL提取好的蛋白按照1:4加入RIPA裂解液对蛋白进行稀释；
(2)同时，取BSA标准品(蛋白浓度2mg/mL)按照等比稀释，共6个梯度，2mg/mL、1mg/mL、 0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0mg/mL，以RIPA裂解液进行稀释；
(3)所有样品及标准品检测均设置两个复孔，根据待检测孔数来计算好所需的BCA检测液的量，每孔需要加入200μL BCA检测液。BCA检测液分为A液和B液，工作液为A液和B液以1:50混合，颠倒混匀后，酶标板每个孔加入200μL BCA检测液，加入20μL待检样品或标准品。需要注意在加样过程中避免气泡产生；
(4)将加好待测样品和BCA检测液的酶标板置于37℃隔水式恒温培养箱中孵育30分钟；
(5)孵育完成之后，在酶标仪中以570nm吸收光波长下检测样品对应的吸光度，通过标准品作出标准曲线，结合稀释度换算出样品的浓度。标准曲线拟合曲线的R2须大于0.99，方可提示此次检测是准确的；
(6)利用RIPA裂解液将不同样品统一稀释至同一浓度，然后以5×loading buffer按照4：1与蛋白样品混匀；
(7)100℃煮10分钟，蛋白即可进行电泳。
9.3 Western blot
(1)配制聚丙烯酰胺凝胶(10％分离胶)：洗干净玻璃制胶板，将其固定于Bio-Rad制胶架上，按照下表中配方配制好分离胶，并混匀，轻柔加入胶板之间，约7mL，上层加入去离子水封胶；
(2)待分离胶凝固之后配制上层浓缩胶(5％)：按照下表中配方配制好浓缩胶，并混匀，将第(1) 步中用于封胶的去离子水倒掉，加入浓缩胶，插入梳齿；
(3)电泳：在垂直电泳槽内加入1×电泳液，将配好的胶连同胶板一起放入电泳槽内，短玻璃板朝向内侧，拔掉梳齿，取20μg加好loading buffer之后的蛋白加入点样孔中，其中一个点样孔中加入 5μL pre-stained protein ladder，以80V，约30分钟左右电泳，待蛋白样品电泳至分离胶中时，调整电压至120V，电泳约60分钟(电泳时间根据条带大小和胶的浓度来决定)；
(4)转膜：电泳结束前约20分钟配制1×转膜液，并置于-20℃预冷。电泳结束后，将胶取出，选取目的区域将周围的胶切掉，根据待转膜的PAGE胶的大小裁剪与其大小一致的PVDF膜，将PVDF 膜浸泡至甲醇中活化5分钟，之后，将胶与PVDF膜均浸泡至预冷的1×转膜液中，将转膜夹黑色放在下面，依次放置海绵垫、双层滤纸、胶、PVDF膜、双层滤纸、海绵垫，将转膜夹白色盖好夹紧，放在于转膜槽中，转膜夹黑色面与槽内黑色面对应，白色面与槽内红色对应，将-20℃预冷的Bioice 冰盒放入转膜槽中，插上电极，以252mA恒定电流转膜90分钟；
(5)一抗孵育：转膜完毕之后，将膜正面朝上，放入洗膜盒中，以0.1％TBST漂洗一次，以5％脱脂牛奶在脱色摇床上室温封闭1小时，封闭完之后，加入以5％脱脂牛奶配好的一抗在脱色摇床上 4℃轻轻震荡过夜(β-actin以1:10000稀释，LMAN1以1:1000稀释)；
(6)二抗孵育：回收一抗，以0.1％TBST在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次10分钟，加入以5％脱脂牛奶配好的二抗在脱色摇床上震荡孵育1小时(抗鼠二抗以1:10000稀释，抗兔二抗以1:10000 稀释)；
(7)显影：二抗孵育完之后，以0.1％TBST在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次10分钟，配制ECL 显影液，A液和B液以1:1混合，滴加在膜上，室温避光孵育3-5分钟，将膜放入Biorad显影仪内进行显影，根据条带亮度调整曝光时间，保存图片。
10.EPCs进行HA模型鼠体内移植
HA模型小鼠是购买自Jackson实验室的F8tm1Kaz品系[28]。该品系纯合小鼠会出现关节或软组织自发性出血，但是孕鼠怀孕生产时一般不会出血，无生产困难。该品系HA模型小鼠表现出了HA 的关键特征，为HA的研究以及探究基因治疗策略提供了一个很好的模型。
取6-8周龄雌鼠雄鼠各半，进行实验前将各实验组所需小鼠对应分笼，同一性别小鼠分配至一笼中，待小鼠适应2-3天后进行细胞移植实验。
细胞移植实验：将CD31磁珠抗体分选之后培养1-3天内的内皮祖细胞以DPBS漂洗3次后，加入Accutase，在37℃培养箱中消化5分钟，加入5％FBS/DPBS终止消化，收集细胞至无菌15mL 离心管中，采用血细胞计数板进行计数，以170g室温离心5分钟，吸弃上清，加入5mL DPBS重悬细胞，以170g室温离心5分钟，吸弃上清，点离，吸干净上层液体，每200万细胞加100μL DPBS 重悬细胞，将200万分为一管，用于HA小鼠细胞移植。
以10μL阿佛丁(25mg/mL)/g(小鼠体重)腹腔注射血友病A模型小鼠进行麻醉，注射之后约5分钟待小鼠麻醉晕倒之后，利用胰岛素针吸100μL细胞悬液即200万内皮祖细胞，注意需排干净气泡，通过眶后静脉注射至小鼠体内，将小鼠放回笼子，待其苏醒后置于IVC架子上饲养，24小时后每只小鼠腹腔注射40μL FK506进行免疫抑制，之后隔一天进行一次FK506注射。
本实验中B区部分缺失型基因矫正共分为8组：
HA模型小鼠组，不注射细胞，只注射FK506；
DPBS组，将100μL DPBS眶后静脉注射至HA模型小鼠中，其他处理均相同；
HA-iEPCs组，即注射200万HA-iEPCs组；
2-6-iEPCs组，即注射200万经过2-6-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
2-46-iEPCs组，即注射200万经过2-46-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
N-iEPCs组，即注射200万正常对照N-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
N-del 54-42-iEPCs组，即注射200万N-del 54-42-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
C57BL/6组，即野生型小鼠组，不注射细胞，只注射FK506。
本实验中B区完全缺失型基因矫正共分为8组：
HA模型小鼠组，不注射细胞，只注射FK506；
DPBS组，将100μL DPBS眶后静脉注射至HA模型小鼠中，其他处理均相同；
HA-iEPCs组，即注射200万HA-iEPCs组；
BD21-iEPCs组，即注射200万经过2-6-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
BD25-iEPCs组，即注射200万经过2-46-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
N-iEPCs组，即注射200万正常对照N-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
N-BD14-iEPCs组，即注射200万N-del 54-42-iPSCs分化而来的内皮祖细胞组；
C57BL/6组，即野生型小鼠组，不注射细胞，只注射FK506。
11.细胞移植之后凝血活性检测及断尾实验
细胞移植14天时，腹腔注射阿佛丁麻醉小鼠后，通过眼球取血，枸橼酸钠抗凝，分离血浆，检测血浆中FVIII凝血活性。同时取移植细胞14天后的小鼠，阿佛丁腹腔麻醉之后利用大头针固定四肢，75％酒精消毒腹部，剪开皮肤及腹膜，将心耳处剪开，快速从心尖处注射约25mL DPBS，待流出的液体基本上呈现透明时将DPBS换为4％多聚甲醛，从心尖处注射入小鼠体内，待小鼠出现尾巴翘起、四肢痉挛等蛋白变性的表现时停止灌注，将小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏及肾脏等主要器官取出，置于4％多聚甲醛中固定，24小时之后换成15％蔗糖脱水24小时，之后换成30％蔗糖脱水24 小时进行冰冻切片，厚度切为15-20μm，切完之后55℃烤片30分钟，片子可以用于免疫荧光染色。
断尾实验：经过细胞移植14天之后的小鼠，经阿佛丁腹腔麻醉之后，在距离小鼠鼠尾末端小鼠尾巴直径约1.5mm的部位剪断鼠尾，让其垂直自然流血5分钟，之后按压断端近心处1分钟止血，然后放回笼中观察并记录小鼠存活时间。
12.小鼠组织冰冻切片免疫荧光染色
(1)将经过烤片的冰冻组织切片取出进行免疫荧光染色，以证实人源细胞进入小鼠肝脏，由于我们注射的是内皮祖细胞，主要的表面标志物有CD31/CD144/vWF，经过前期预实验鉴定vWF抗体可以区分人源和鼠源，故本研究中免疫荧光进行抗人vWF抗体的染色；
(2)因组织已经经过多聚甲醛固定，因而可以直接进行透化处理，在玻片有组织块的位置加PBST (含有1/1000Triton-100的DPBS)透化处理17分钟；后续其余步骤同2.6。
实施例
1.针对c.3167delCTGA变异的HA患者突变位点附近缺失掉包含缺失的四个碱基共54个碱基的片段，从而使移码突变恢复正常读码：
(1)血友病A病人特异性iPSCs鉴定(HA-iPSCs)
前期收集了一例含有B区移码突变HA的患者(c.3167delCTGA导致p.D1055fsX5)尿液标本，并培养其中的上皮细胞(表达ZO-1、KRT7、β-catenin)(图4A)，进而将其重编程为iPSCs，形态为克隆样生长，且边缘规整，核质比高(图4B)；核型检测未见染色体水平变异(图4C)，对诱导而来的iPSCs进行测序，证实其依然保留患者特异的c.3167delCTGA变异(图4D)，是良好的疾病细胞模型。经过免疫荧光鉴定干细胞表面标志物，可以表达NANOG、OCT4、SSEA-4，不表达SSEA-1，符合干细胞表面标志物表达特征(图4E)；经过体内三胚层分化，发现诱导而来的iPSCs可以在裸鼠体内成畸胎瘤，HE染色显示畸胎瘤内含有内胚层的消化道上皮细胞、中胚层软骨组织以及外胚层的神经上皮样组织(图4F)。
(2)针对突变位点精确缺失54bp的CRISPR/Cas9表达质粒的构建、效率检测以及核转HA-iPSCs 获得定点精确缺失克隆
本申请人从Zhang Feng实验室引进了CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对该患者特异性变异位点设计sgRNA，并联合ssODN在B区突变型HA-iPSCs中进行原位基因治疗(如图5A)；利用T载体连接测序的方式对构建的CRISPR/Cas9进行切割效率检测(图5B)；联合构建好的CRISPR/Cas9与 ssODN对HA-iPSCs进行基因打靶，通过PCR对打靶后的克隆进行初步鉴定，随机选取两个2-6和2-46进行后续实验，PCR鉴定结果如图5C所示；对PCR产物进行Sanger测序，测序证实这两个克隆精确缺失了包含病人变异4个碱基在内的54个碱基(图5D)。
联合CRISPR/Cas9与ssODN对HA-iPSCs进行基因打靶，同时单独使用CRISPR/Cas9对HA-iPSCs 进行核转，单细胞接种至MEF饲养层上之后，挑取单克隆，扩增之后抽提DNA，通过PCR、测序鉴定，统计获得的阳性克隆数，如下表(表2)所示，联合ssODN组打靶效率为14.71％，而单独使用CRISPR/Cas9者打靶效率为2.08％。这就表明联合CRISPR/Cas9与ssODN介导精确基因片段缺失的效率更高。
表2联合CRISPR/Cas9与ssODN与单独CRISPR/Cas9核转HA-iPSCs效率比较
(3)联合CRISPR/Cas9与ssODN核转N-iPSCs精确缺失54bp
为了避免HA-iPSCs的遗传背景影响，同时对正常对照N-iPSCs进行54bp片段精确缺失。由于联合CRISPR/Cas9与ssODN介导精确基因片段缺失的效率更高，对于N-iPSCs进行精确缺失54bp 采用联合CRISPR/Cas9与ssODN的方式进行。核转之后，将混合细胞单细胞接种至MEF上，待细胞克隆生长至十倍镜视野1/2-2/3左右时，挑取单克隆，扩增、抽提DNA，PCR鉴定，PCR扩增出 448bp条带者送测序，测序鉴定为阳性者即为精确基因片段缺失的克隆，随机挑选N-del 54-15-iPSCs 和N-del 54-42-iPSCs进行后续实验(图6)。
(4)打靶获得的阳性克隆免疫荧光鉴定
对获得的阳性克隆进行干细胞表面标志物免疫荧光鉴定，打靶后获得的阳性克隆可以表达与胚胎干细胞相一致的表面标志物，Oct4、Nanog、SSEA-4表达阳性，SSEA-1表达阴性(图7和图8)，证实打靶过程对iPSCs特性未产生影响。
(5)打靶获得的阳性克隆核型检测
基因修复克隆传代10代之后进行核型检测，与打靶前一致，核型为46,XY，(图9和图10)显示在染色体水平未见明显变异。
(6)iPSCs阶段F8表达检测
在iPSCs阶段，通过RT-PCR对打靶获得的缺失54bp的阳性克隆进行F8转录水平检测(图11 和图12)，发现在iPSCs阶段，精确片段缺失克隆转录水平14号外显子处为精确缺失型，病人和修复克隆以及正常人23号外显子到26号外显子之间的转录有条带且条带大小一致，说明该病人未发生无义介导的的RNA降解，与文献报道的一致[29]。
通过ELISA检测FVIII在细胞浆内表达量和培养上清中的分泌量，发现在iPSCs阶段FVIII分泌量较低(图13)。有文献报道[30]FVIII分泌过程中需要内质网-高尔基体中间体的参与，此中间体为 LMAN1和MCFD2形成的复合体。临床上任何一个蛋白纯合突变都会导致FV和FVIII的联合缺乏，我们通过Western blot检测了LMAN1的表达(图14)，发现在iPSCs阶段细胞中未见LMAN1蛋白表达，这就可以解释iPSCs阶段FVIII分泌量较低的现象。
(7)iPSCs定向内皮祖细胞分化及内皮细胞阶段的F8表达检测
分化第5天的细胞利用CD31-FITC/CD34-PE进行流式检测，以确定内皮祖细胞分化效率。由图 15可以看出不同株细胞分化效率有差别，CD31/CD34双阳性细胞所占比例均约为10％-30％，分化而来的内皮祖细胞具有增殖能力，这为我们获得大量的可用于移植的内皮祖细胞提供了可能性。
利用CD31磁珠将内皮祖细胞分选纯化之后，利用CD31-FITC/CD34-PE进行流式检测，以确定我们所使用的分选体系的分选效果，如图16所示，分选之后的细胞从形态上观察，均为上皮样细胞典型形态，细胞均一，且增殖速度快，分选之后CD31/CD34双阳性细胞所占比例大于90％，说明我们使用的分选体系可行，分选之后获得的内皮祖细胞纯度较好，有利于进行后续的实验。
分选之后的内皮祖细胞进行免疫荧光检测相关表面标志物，如图17所示，CD31/CD144/CD34均表达阳性，进一步证实分选之后的细胞是内皮祖细胞。
分选之后的内皮祖细胞以EGM-2培养基培养6-7天时，内皮细胞的增殖速度减慢，且可检测到成熟内皮细胞标志物vWF表达(图18)。
内皮细胞可以合成FVIII，且可以合成vWF，储存在Weibel-Palade小体中，当血管发生损伤时， vWF与FVIII共同释放并结合形成稳定的vWF/FVIII，避免FVIII被快速降解，从而更有效参与止血过程。因此我们通过染色vWF与N端FVIII抗体和C端FVIII抗体来检测FVIII在细胞内的表达及定位。如图19，因为患者细胞表达FVIII提前终止，因而在HA-iPSCs诱导而来的内皮细胞内可以检测到N端FVIII阳性信号，基因修复克隆和正常人来源的成熟内皮细胞均共同表达FVIII和vWF。但是病人iPSCs诱导分化而来的成熟内皮细胞C端FVIII染色未见明显阳性信号(图20)，而基因修复克隆及正常iPSCs分化而来的内皮细胞不仅可以检测到N端FVIII，同时也可以检测到C端FVIII，这也从蛋白水平证实了本研究所采用的修复策略的有效性。
通过ELISA检测FVIII在成熟内皮细胞胞浆内表达量和培养上清中的分泌量，如图21，与iPSCs 阶段相比，成熟内皮细胞阶段FVIII分泌量增加，检测LMAN1蛋白在内皮细胞中的表达，发现LMAN1 蛋白在内皮细胞中表达(图22)，因而内皮细胞阶段FVIII分泌量高于iPSCs阶段。
(8)内皮祖细胞进行HA模型鼠体内移植
将分化而来的各组内皮祖细胞按照方法步骤中描述的分组及剂量通过眶后静脉进行小鼠体内细胞移植，移植HA-iEPCs，C-iPSCs化而来的EPCs(2-6-iEPCs和2-46-iEPCs)，正常对照N-iPSCs分化而来的EPCs(N-iEPCs)，N-iPSCs缺失54bp克隆选择其中N-del 54-42-iPSCs分化而来的N-del 54-42-iEPCs进行小鼠体内移植，共五组细胞移植组，以及一组注射DPBS作为对照组，移植14天时，取各组小鼠血浆，检测FVIII凝血活性，我们以每一组小鼠实际凝血活性占野生型小鼠凝血活性的比例来显示移植后每组的凝血活性。如图23所示，2-6-iEPCs和2-46-iEPCs移植组凝血活性明显高于 DPBS组及HA-iEPCs移植组，与N-iEPCs和N-del 54-42-iEPCs组无明显差异，体内实验证实我们使用的修复策略是有效的。
通过断尾实验来判断该策略的治疗效果，对小鼠断尾之后其存活时间，由图24和25可以看出， 2-6-iEPCs、2-46-iEPCs、N-iEPCs和N-del 54-42-iEPCs组小鼠存活时间明显长于HA-iEPCs组，值得注意的是，生存曲线可以看出，在断尾实验观察结束时(48小时)，2-6-iEPCs、2-46-iEPCs和N-del 54-42-iEPCs组中均有小鼠经历了断尾实验后存活下来，这对于疾病的治疗是非常有意义的。2-6-iEPCs 组中12只经历断尾实验的小鼠中有4只存活下来，2-46-iEPCs组中10只经历断尾实验的小鼠中有4 只存活下来，N-del 54-42-iEPCs组中9只经历断尾实验的小鼠中有1只存活下来。这就进一步证实了基因修复策略的有效性。
在小鼠体内检测移植的人源细胞
将内皮祖细胞经过眶后静脉注射至小鼠体内后，这些人源的细胞需要进入且定植于小鼠体内，才可以发挥较为持久的效果。经过灌注之后将移植细胞组小鼠的肝脏取出，进行冰冻切片，利用CD31 标记内皮细胞，再通过抗人vWF抗体进行免疫荧光染色，通过与DPBS阴性对照组相比较，观察到我们注射了细胞的小鼠肝脏切片中可以观察到vWF染色阳性的细胞，而DPBS组中未见阳性信号(图 26)。同时取小鼠的其他主要器官，心脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织，经过冰冻切片及免疫荧光染色，发现在小鼠的肺脏中也发现了人源细胞(图27)，这为该治疗策略长期有效性提供了实验基础。
2.针对c.3167delCTGA变异的HA患者iPSCs靶向缺失整个B区编码序列，从而使移码突变恢复正常读码：
(1)靶向缺失B区编码序列的CRISPR/Cas9表达质粒的构建、效率检测
按照打靶示意图(图28)中所示合成sgRNA引物序列，经过退火连接至pX330骨架中，构建两条CRISPR/Cas9-sgRNA，利用两条CRISPR/Cas9-sgRNA联合一条ssODN精确缺失B结构域，同时保留SQ序列，SQ序列为741-743位氨基酸和1638-1648位氨基酸，1638位氨基酸为谷氨酰胺，1639 位氨基酸为天冬酰胺，由于PAM序列的限制，该研究中留744位和745位氨基酸，基因序列为CAGAAT，与1638位和1639位CAAAAC编码氨基酸一致，均为谷氨酰胺和天冬酰胺，因此，相当于引入了两个同义突变。对于HA患者特异性iPSCs来说即精确缺失2678bp大小的片段，从而修正移码突变，使阅读框读码恢复正常。对于正常对照iPSCs来说即精确缺失2682bp大小的片段，构建原位B区缺失的iPSCs。
CRISPR/Cas9效率检测
利用T载体连接PCR产物再进行测序的方法检测CRISPR/Cas9产生的NHEJ比例，以此来提示CRISPR/Cas9的效率。F8-BDU-sg1的切割效率为13.33％(图29A)，F8-BDD-sg4的切割效率为35.71％ (图29B)。
(2)联合CRISPR/Cas9与ssODN对iPSCs进行基因打靶
联合CRISPR/Cas9与ssODN进行HA-iPSCs核转以获得B区精确基因片段缺失的细胞。利用 Lonza核转仪对HA-iPSCs进行核转，核转之后，将细胞计数后以单细胞接种，挑取单克隆并扩增，抽提细胞基因组DNA，PCR鉴定，同时以两对引物进行鉴定，以F8-E14-F/R扩增，B区缺失的克隆扩增不出条带，以F8-BUF/BDR进行扩增，B区缺失的克隆可以扩增出341bp大小的条带。PCR扩增出341bp条带者对PCR产物进行测序，以F8-BD-R为引物进行Sanger测序，测序鉴定为阳性者即为精确缺失B区的细胞。随机挑选两个鉴定为精确基因片段缺失的克隆BD21-iPSCs和BD25-iPSCs (图30)进行下一步实验。
为了避免HA-iPSCs的遗传背景影响，在实验中同时对正常对照N-iPSCs进行B区片段缺失。同时以两对引物进行鉴定，以F8-E14-F/R扩增，B区缺失的克隆扩增不出条带，以F8-BUF/BDR进行扩增，B区缺失的克隆可以扩增出341bp大小的条带。PCR扩增出341bp条带者对PCR产物进行测序，以F8-BD-R为引物进行Sanger测序，测序鉴定为阳性者即为精确缺失B区的细胞。随机挑选 N-BD9-iPSCs和N-BD14-iPSCs进行后续实验(图31)。
(3)打靶获得的B区缺失克隆免疫荧光鉴定和核型检测
对获得的B区缺失的阳性克隆进行干细胞表面标志物免疫荧光鉴定，打靶后获得的阳性克隆可以表达与胚胎干细胞相一致的表面标志物，Oct4、Nanog、SSEA-4表达阳性，SSEA-1表达阴性(图 32和图33)，证实打靶过程未对iPSCs干细胞特性产生影响。
B区缺失克隆传代10代之后进行核型检测，与打靶前一致，核型为46,XY(图34和图35)显示在染色体水平未见明显变异。
(4)iPSCs阶段F8表达检测
在iPSCs阶段，通过RT-PCR对打靶获得的B区缺失的阳性克隆进行F8转录水平检测(图36 和图37)，发现在iPSCs阶段，B区缺失克隆转录水平跨14号外显子引物扩增出552bp条带，而病人和正常对照未扩增出条带；病人和B区缺失克隆以及正常对照23号外显子到26号外显子之间的转录有条带且条带大小一致，说明该病人未发生无义介导的的RNA降解，有文献报道B区内移码突变导致蛋白翻译提前终止，但未发生无义介导的RNA降解，本研究与文献报道的结果一致[29]。
通过ELISA检测FVIII在细胞浆内表达量和培养上清中的分泌量，发现在iPSCs阶段FVIII分泌量较低(图38)。FVIII分泌过程中需要内质网-高尔基体中间体的参与，此中间体为LMAN1和MCFD2 形成的复合体[30]。通过Western blot检测了LMAN1的表达(图39)，在iPSCs阶段细胞中未检测到 LMAN1蛋白表达，因此，可能是由于iPSCs阶段FVIII分泌所需的相关蛋白不表达从而使iPSCs阶段FVIII分泌量较低。
(5)iPSCs定向分化为内皮祖细胞
将B区缺失的iPSCs通过添加小分子抑制剂方法[26]定向分化为内皮祖细胞，在分化第五天时通过流式检测内皮祖细胞分化效率。由图40所示，不同株细胞分化效率稍有差别，CD31/CD34双阳性细胞所占比例均约为15％-30％。由于内皮祖细胞具有增殖能力，因而可以通过培养扩增获得足够的内皮祖细胞。
利用CD31磁珠对分化而来的内皮祖细胞进行分选，分选之后的内皮祖细胞通过免疫荧光检测细胞表面标志物，如图41所示，CD31/CD144均表达阳性。
分选之后的内皮祖细胞以EGM-2培养基培养6-7天时，内皮细胞的增殖速度减慢，且可检测到成熟内皮细胞标志物vWF表达(图42)。
(6)内皮细胞阶段F8表达检测
在内皮细胞阶段，通过RT-PCR对打靶获得的B区缺失的阳性克隆进行F8转录水平检测(图 43和图44)，可以观察到在内皮细胞阶段，B区缺失克隆转录水平跨14号外显子引物扩增出552bp 条带，而病人和正常对照未扩增出条带；病人和B区缺失克隆以及正常对照23号外显子到26号外显子之间的转录有条带且条带大小一致。
内皮细胞不仅是合成FVIII的主要细胞类型[31,32]，而且可以合成vWF，储存在Weibel-Palade小体中，当血管发生损伤时，vWF与FVIII共同释放，可以避免FVIII被快速降解，从而更有效参与止血过程。在本课题中通过染色vWF与N端FVIII抗体和C端FVIII抗体来检测FVIII在细胞内的表达及定位。因为患者F8基因出现移码突变，导致翻译提前终止，如第一章检测所示在HA-iECs中可以检测到N端FVIII阳性信号，但是未能检测到C端FVIII阳性信号。而不论是来源于患者的B区缺失克隆分化而来的内皮细胞抑或是来源于正常人的B区缺失克隆分化而来的成熟内皮细胞均同时可以检测到N端FVIII(图45)和C端FVIII(图46)阳性信号。这也从蛋白水平证实了本研究所采用的B区缺失修复策略的有效性。
通过ELISA检测FVIII在成熟内皮细胞培养上清中的分泌量，如图47，与iPSCs阶段相比，成熟内皮细胞阶段FVIII分泌量增加，检测LMAN1蛋白在内皮细胞中的表达，发现LMAN1蛋白在内皮细胞中有表达(图48)，这可能是内皮细胞阶段FVIII分泌量增高的一个原因。
(7)内皮祖细胞进行HA模型鼠体内移植
将分化而来的各组内皮祖细胞通过眶后静脉进行小鼠体内细胞移植，移植HA-iEPCs，B区缺失的iPSCs分化而来的EPCs(BD21-iEPCs和BD25-iEPCs)，正常对照N-iPSCs分化而来的EPCs (N-iEPCs)，N-iPSCs进行B区缺失获得的克隆选择其中N-BD14-iPSCs分化而来的N-BD14-iEPCs 进行小鼠体内移植，共五组细胞移植组，以及一组注射DPBS作为对照组。移植14天时，取各组小鼠血浆，检测FVIII凝血活性，移植后每组的凝血活性以每一组小鼠实际凝血活性占野生型小鼠凝血活性的比例来表示。如图49，BD21-iEPCs和BD25-iEPCs移植组凝血活性明显高于DPBS组及 HA-iEPCs移植组，与N-iEPCs和N-BD14-iEPCs组无明显差异，体内实验证实我们使用的原位B区缺失策略对于血友病A治疗是有效的。
通过断尾实验来判断该原位B区缺失策略的治疗效果，对小鼠断尾之后记录其存活时间，由图 50和51可以看出，BD21-iEPCs、BD25-iEPCs、N-iEPCs和N-BD14-iEPCs组小鼠存活时间明显长于 HA-iEPCs组，值得注意的是，生存曲线可以看出，在断尾实验观察结束时(48小时)，BD21-iEPCs、 BD25-iEPCs、N-iEPCs和N-BD14-iEPCs组中均有小鼠经历了断尾实验后存活下来，这对于疾病的治疗是非常有意义的。BD21-iEPCs组中9只经历断尾实验的小鼠中有1只存活下来，BD25-iEPCs组中9只经历断尾实验的小鼠中有2只存活下来，N-iEPCs组中9只经历断尾实验的小鼠中有1只存活下来，N-BD14-iEPCs组中9只经历断尾实验的小鼠中有2只存活下来。这就进一步证实了原位B区缺失策略对于血友病A治疗的有效性。
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上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途
<130> 1
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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cactcttcgc atggagttga 20
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<213> 人工合成
<400> 22
tgagtaaagg agccatcagt aaat 24
Claims (1)
1.一种构建人诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9与ssODN对来源于血友病A病人的iPSCs进行核转，获得整个B区编码序列靶向缺失的iPSCs；所述血友病A病人的iPSCs是通过诱导所述病人尿液细胞获得的；所述靶向缺失为B区编码序列原位靶向缺失；所述ssODN的序列为SEQ ID NO.20；sgRNA的序列为SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.15。
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