CN116888260A - 病毒性疾病的基于细胞的疗法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及预防或治疗由病毒感染引起的症状和疾病，例如与SARS‑CoV‑2和流感病毒感染相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或败血性休克。该治疗基于使用经过基因工程化的间充质干细胞(MSC)，以过度表达合适的多肽，例如血管生成素‑1(ANGPT1)和IFN诱导的跨膜(IFITM)。基于MSC的疗法可以通过注射到血液系统中而施用于患者的肺部。

Description

病毒性疾病的基于细胞的疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年10月16日申请的美国临时申请序列No.63/092,572的权益，其全部内容都通过引用合并于此。

序列表

本申请包含名为G17018-00018-Seq Listing_ST25.txt的计算机可读形式的序列表，其创建于2021年10月15日，大小为约15KB，其通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容涉及关于基于细胞的疗法和病毒性疾病如冠状病毒病(COVID-19)的疗法和组合物。

背景技术

基于细胞的基因转移是一种对细胞进行离体修饰以转移核酸序列材料的技术。在此过程中，包含希望引入患者体内的基因(转基因)的核酸序列在细胞外制备，例如，通过使用分子生物学和基因工程技术制备。然后在体外培养哺乳动物细胞，例如患者自己的细胞(即自体细胞)或来自另一个个体的细胞(即同种异体细胞)并进行处理，以便以可表达的形式接受转基因。转基因对于哺乳动物细胞来说可能是外来的，细胞中已经存在的基因额外拷贝，以增加基因表达产物的量或正常基因的拷贝数，这些正常基因可能在特定患者中有缺陷或缺失，或者在特定患者中过度表达是可取的。然后将含有转基因的细胞引入患者体内，以便该基因可以在体内表达所需的基因产物，以用于治疗目的。培养细胞对外源基因的接受可通过基因工程技术实现，例如，通过利用含有基因的核酸的病毒转染细胞(例如使用病毒载体)来实现，其中该基因通过脂质转染、电穿孔或其他可接受的方式进行转移以获得转染的细胞。这之后有时会选择性培养已成功接受可表达形式的转基因的细胞，以便将细胞施用给患者可限于表达转基因的转染细胞。在其他情况下，所有经历接受过程的细胞都被施用。

该程序过去需要将含有转基因的细胞直接施用至需要用转基因的表达产物治疗的身体器官。因此，已将在适当培养基中的转染细胞直接注射到需要治疗的肝脏或肌肉中，或通过全身动脉循环进入需要治疗的器官。

以前将这种基因修饰的细胞引入患者全身动脉循环的尝试遇到了许多问题。例如，难以确保转基因细胞被特定器官或身体部位足够高的同化，在这些器官或身体部位需要基因表达产物以获得最佳治疗效果。这种特异性的缺乏导致施用过量的转基因细胞，这不仅浪费且昂贵，而且增加了副作用的风险。

2020年3月11日，世界卫生组织宣布冠状病毒病(COVID-19)为大流行病(1)。COVID-19是由新型冠状病毒，即严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。大约15％的住院患者发展为严重的病毒性肺炎，而6％的患者由于例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或败血性休克等严重并发症而发展到需要重症监护的危急阶段(2)。

COVID-19感染的标志是病毒引起的急性炎症，其导致肺损伤(肺炎和ARDS)，其特征是放射学结果为磨玻璃影。ARDS出现在严重的COVID-19病例中，伴有败血症和败血性休克，以及器官损伤和衰竭(3)。在这些患者中，宿主的功能失调的免疫反应会导致一系列内皮和凝血病反应。这些状态共同导致持续性器官损伤和/或甚至死亡(4)。ARDS会与其他合并症(例如败血症)一起出现，并且可能导致器官衰竭和死亡(5)。ARDS的发病机制是由于毛细血管内皮和肺泡上皮细胞的损伤导致毛细血管通透性增加。这导致了一条通路，在该通路中，肺泡腔内的流体排出受损会导致肺泡内流体的积聚，从而导致肺泡损伤和促炎细胞因子与中性粒细胞的释放(5)。影响COVID-19死亡率的另一个主要并发症是败血症。患者的死亡率高达20％～40％，幸存者面临与身体、认知和情绪功能障碍相关的长期发病率(6，7)。2013年，在美国，败血症住院费用中占超过240亿美元，预计2019年费用将增加到620亿美元(8)。尽管进行了数十年的临床试验，但没有一种特定的治疗药物能显著改善生存或长期预后。与ARDS类似，败血症也会导致广泛的内皮功能障碍、促凝血状态升高和血管通透性增加，所有这些累积起来将导致持续性组织损伤、器官衰竭甚至死亡(9，10)。

COVID-19感染的病理与细胞因子风暴综合征有关，由此病毒感染会触发促炎细胞因子(IL-2、IL-6、IL-7、GCSF、IP-10、MCP-1、MIP1A)和TNFα的急性释放(11)，从而会(由于继发感染)诱发肺水肿、ARDS、急性心脏损伤、败血症和败血性休克，进而导致死亡(11)。在当前全球大流行的情况下，COVID-19对美国平民和世界人口的健康造成严重和直接的威胁。目前对ICU中严重COVID-19患者的治疗只是支持性的，对病原体没有特异性(例如一般抗病毒治疗、抗生素)或具有潜在的显著副作用(例如氯喹)。目前正在研究联合抗体疗法作为一种可能的治疗选择。然而，这不会解决导致不良后果的宿主免疫反应功能失调。迫切需要一种有效的免疫调节疗法来解决COVID-19感染中的病理性免疫反应。在没有有效疗法的情况下，COVID-19感染的结果基本上取决于一个人自身的免疫反应。

本说明书涉及多个文件，其内容通过引用整体并入本文。

发明内容

本公开涉及以下条款：

1.一种间充质干细胞(MSC)，其经过基因修饰以过表达血管生成素-1(ANGPT1)多肽和INF诱导的跨膜(IFITM)多肽。

2.根据条款1所述的MSC，其中所述MSC表达重组ANGPT1多肽。

3.根据条款2所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含与SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

4.根据条款3所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含与SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

5.根据条款4所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列。

6.根据条款1至5中任一项所述的MSC，其中所述MSC包含第一外源核酸，所述第一外源核酸包含能操作地连接至启动子或启动子/增强子组合的ANGPT1多肽编码区。

7.根据条款6所述的MSC，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。

8.根据条款6所述的MSC，其中所述启动子/增强子组合是CMV启动子/增强子组合。

9.根据条款6至8中任一项所述的MSC，其中所述ANGPT1多肽编码区包含与SEQ IDNO：7或8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

10.根据条款9所述的MSC，其中所述ANGPT1多肽编码区包含SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列。

11.根据条款1至10中任一项所述的MSC，其中所述MSC表达重组IFITM多肽。

12.根据条款11所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽是重组IFITM1或IFITM3多肽。

13.根据条款12所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含与SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

14.根据条款13所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含与SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

15.根据条款14所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列。

16.根据条款11至15中任一项所述的MSC，其中所述MSC包含第二外源核酸，所述第二外源核酸包含能操作地连接至第二启动子或启动子/增强子组合的IFITM多肽编码区。

17.根据条款16所述的MSC，其中所述第二启动子是CMV启动子。

18.根据条款16所述的MSC，其中所述第二启动子/增强子组合是CMV启动子/增强子组合。

19.根据条款16至18中任一项所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含与SEQID NO：1、2、4或5的序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

20.根据条款19所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含与SEQ ID NO：1、2、4或5的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

21.根据条款20所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含SEQ ID NO：1、2、4或5的核苷酸序列。

22.根据条款18至32中任一项所述的MSC，其中所述第一和/或第二外源核酸包含在载体或质粒中。

23.根据条款22所述的MSC，其中所述第一和第二外源核酸包含在同一载体或质粒中。

24.一种药物组合物，其包含根据条款1至23中任一项所述的MSC和药学上可接受的赋形剂。

25.根据条款1至23中任一项所述的MSC或根据条款24所述的药物组合物，其作为药物供使用。

26.根据条款25所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述药物用于预防或治疗受试者的病毒性疾病。

27.根据条款26所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

28.根据条款26或27所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述受试者是人。

29.根据条款26-28中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

30.根据条款26-28中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

31.根据条款26-30中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC用于施用到肺中。

32.一种用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据条款1至23中任一项所述的MSC或根据条款24所述的药物组合物。

33.根据条款32所述的方法，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

34.根据条款32或33所述的方法，其中所述受试者是人。

35.根据条款32-34中任一项所述的方法，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

36.根据条款32-34中任一项所述的方法，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

37.根据条款32-36中任一项所述的方法，其中将所述MSC施用到所述受试者的肺中。

38.条款1至23中任一项所述的MSC或根据条款24所述的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的药物中的用途。

39.根据条款1至23中任一项所述的MSC或根据条款24所述的药物组合物用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的用途。

40.根据条款38或39所述的用途，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

41.根据条款38-40中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

42.根据条款38-41中任一项所述的用途，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

43.根据条款38-41中任一项所述的用途，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

44.根据条款38-43中任一项所述的用途，其中所述MSC用于施用到肺中。

本公开的另一个目的是通过利用新疗法(包括细胞疗法和基于细胞的基因疗法)来治疗病毒性疾病(例如COVID-19)的肺部影响。本文描述的技术是一种新型的现成的基于细胞的临床现成疗法(其用于通过其增强的抗病毒、抗炎和修复能力治疗由COVID-19等病毒性疾病引起的ARDS)解决了这一治疗差距。

在本公开的一方面，至少两种抑制病毒性疾病如COVID-19对肺部影响的重组蛋白在间充质干细胞/基质细胞(MSC)中共表达。

在一个实施方案中，这两种蛋白质可以是密码子优化的。

在另一个实施方案中，这两种蛋白质可以是并且由至少一个启动子调控。

在另一个实施方案中，血管生成素-1(Angpt1)是重组蛋白中的一种。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是干扰素诱导的跨膜蛋白(IFITM)。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM1。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM3。

在另一个实施方案中，至少两种蛋白质中每一种的表达由独立的启动子控制。

在另一个实施方案中，独立启动子是CMV启动子。

在另一个实施方案中，编码至少两种蛋白质的核酸是在同一载体中。

在本公开的另一方面，表达抑制病毒性疾病如COVID-19的肺部影响的至少两种重组蛋白的同种异体间充质干细胞被用于治疗患有病毒性疾病的受试者。

本公开还提供了一缓解COVID-19肺部症状的方法，其包括通过将转化的同种异体间充质干细胞注射到哺乳动物患者的肺循环中而施用到肺部。

本公开还提供了一种COVID-19缓解治疗剂，其包括转化的同种异体间充质干细胞，其中治疗剂通过动脉内或静脉内递送。

在一个实施方案中，表达至少两种重组蛋白的间充质干细胞被动脉内或静脉内递送。

在另一个实施方案中，这两种蛋白质可以是密码子优化的。

在另一个实施方案中，这两种蛋白质可以是并且由至少一个启动子调控。

在另一个实施方案中，Angpt1是蛋白质中的一种。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM1。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM3。

在另一个实施方案中，至少两种蛋白质中的每一种的表达由独立的启动子控制。

在另一个实施方案中，独立启动子是CMV启动子。

在另一个实施方案中，编码至少两种蛋白质的核酸是在同一载体中。

在本公开的另一方面，表达抑制COVID-19的肺部影响的至少两种重组蛋白的同种异体间充质干细胞是一种药物组合物。

在一个实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

在另一个实施方案中，这两种蛋白质可以是密码子优化的。

在另一个实施方案中，这两种蛋白质可以是并且由至少一个启动子调控。

在另一个实施方案中，Angpt1是蛋白质中的一种。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM1。

在另一个实施方案中，第二种蛋白质是IFITM3。

在另一个实施方案中，至少两种蛋白质中每一种的表达由独立的启动子控制。

在另一个实施方案中，独立启动子是CMV启动子。

在另一个实施方案中，编码至少两种蛋白质的核酸是在同一载体中。

本发明的其他目的、优点和特征在阅读以下仅作为示例并参考附图给出的具体实施方案的非限制性描述后将变得更加明显。

附图说明

现在将参考附图仅通过示例的方式描述该技术，其中：

图1是显示抗病毒基因IFITM1和IFITM3在用dsRNA预处理的MSC中上调的图。使用统计软件(GraphPad Prism版本8)的双尾t检验评估未修饰的MSC与预处理dsRNA-MSC之间的差异；

图2A和2B分别显示了IFITM1-Angptl质粒载体转基因构建体和IFITM3-Angptl质粒载体转基因构建体；

图3A-E显示了工程化MSC中蛋白质表达的量化。图3A：通过ELISA确定的绝对血管生成素-1水平；图3B：通过ELISA确定的绝对IFITM1水平；图3C：通过ELISA确定的绝对IFITM3水平；图3D：通过蛋白质印迹确定的相对IFITM1表达(未修改＝1)；图3E：通过蛋白质印迹确定的相对IFITM3表达(未修改＝1)；

图3F显示了转染后24小时IFITM3蛋白在工程化MSC中的表达。用非病毒载体转染MSC，然后在37℃的含5％CO2的加湿培养箱中培养24小时。收获细胞，对总细胞裂解物中蛋白质水平的评估显示，与未修饰的细胞相比，IFITM3蛋白质水平过表达。使用Jess^TM蛋白质检测设备(Protein Simple，Biotechne)进行蛋白质表达的检测，以实现蛋白质分离和免疫检测的自动化。来自Cell Signaling的抗体IFITM3(D8E8G)XP兔小鼠抗体(Cat#59212)和来自R&D Systems的β-肌动蛋白抗体(Cat#937215)用于检测蛋白质表达。

图4显示了来自polyIC预处理的MSC的条件培养基对假病毒SARS-COV2进入原代上皮细胞的抑制作用；

图5A和5B显示了候选物1(IFITM1-Angpt1)和候选物2(IFITM3-Angptl)的衍生条件培养基，其使用研究级转染方案和48小时条件培养基(图5A)和放大转染/制造方案(图5B)；

图5C显示，工程化MSC(候选物2)对SARS-CoV-2病毒进入的抑制作用条件培养基通过增加IFITM3封闭抗体的浓度而被消除。将工程化的MSC接种并培养48小时以收获条件培养基(CM)。将IFTIM3单克隆抗体(Abnova/Thermo Fisher Scientific，克隆4C8-1B10)连续稀释250至2000倍(0.25至2μg)，然后从工程化的MSCs添加到CM，随后将其添加到人肺泡上皮细胞，1天以后，暴露于假病毒SARS-CoV-2(用刺突蛋白与荧光报告基因假型化的杆状病毒，其在宿主细胞核中表达亮绿色荧光)。暴露于假病毒SARS-CoV-2 24小时后，通过流式细胞术(Attune声学聚焦细胞仪，Thermo Fisher Scientific)分析上皮细胞以评估荧光阳性细胞的百分比，这反映了进入细胞的假病毒数量。

图6A-C显示了工程化的MSC在甲型流感病毒(IAV)感染后两天保护小鼠免受严重后果。在这项研究中，八到十周大的C57BL/6N小鼠购自Charles River Laboratories(Saint Constant，QC,，加拿大)。根据加拿大动物保护委员会(CCAC)指南饲养动物。在笼子的料斗内提供标准饲料，并随意提供水。将动物圈养在20℃-23℃的温控室内，周期为光照12小时，黑暗12小时，湿度为40％-60％。简而言之，小鼠鼻内接受1000PFU的甲型流感毒株H1N1：A/FM/1/47-MA病毒。在病毒接种后的第二天，用载体或工程化的MSCs(候选物2，用ANGPT1和IFITM3进行工程化)处理小鼠。每天监测小鼠的存活率(图6A)、体重(图6B)和疾病评分(图6C)，直到病毒感染后7天。动物疾病评分(图6C)表示基于身体外观的评分，该外观包括面部表情、驼背、立毛、水合作用、呼吸率和呼吸质量以及行为，该行为包括意识水平、活动和对刺激的反应。分数范围从0到30，分数越高表明小鼠的状况不断恶化。

图7A-C显示了工程化的MSC在IAV感染一天后保护小鼠免受严重后果。该研究如上文针对图6A-C所描述的那样进行，不同的是1)在病毒接种后的第一天用载体或工程化的MSC(候选物2)治疗小鼠，2)直到第9天评估存活率和3)直到第10天评估体重减轻和疾病评分。每天监测小鼠的存活率(图7A)、体重(图7B)和疾病评分(图7C)。动物疾病评分(图7C)表示基于身体外观的评分，该外观包括面部表情、驼背、立毛、水合作用、呼吸率和呼吸质量以及行为，该行为包括意识水平、活动和对刺激的反应。分数范围从0到30，分数越高表明小鼠的状况不断恶化。

图8A-C显示了IFITM1的天然核苷酸序列(图8A，SEQ ID NO：1)、密码子优化的核苷酸序列(图8B，SEQ ID NO：2)和氨基酸序列(图8C，SEQ ID NO：3)；

图9显示了IFITM3的天然核苷酸序列(图9A，SEQ ID NO：4)、密码子优化的核苷酸序列(图9B，SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(图9C，SEQ ID NO：6)；以及

图10显示了ANGPT1的天然核苷酸序列(图10A，SEQ ID NO：7)、密码子优化的核苷酸序列(图10B，SEQ ID NO：8)和氨基酸序列(图10C，SEQ ID NO：9)。

具体实施方式

以下以示例的方式给出但不旨在将本公开内容限制为所描述的特定实施方案的详细描述可以结合通过引用并入本文的附图来理解。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均与该技术所属领域(例如，干细胞生物学、细胞疗法、基因疗法、细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学方面)的普通技术人员通常理解的含义相同。

在冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。

在描述技术的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个”和“该”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数，除非此处另有说明或与上下文明显矛盾。

除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意思是“包括但不限于”)。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。

此处提供的任何和所有示例或示例性语言(“例如”、“诸如”)的使用仅旨在更好地说明所要求保护的技术的实施方案并且不对范围构成限制，除非另有声明。

说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于要求保护的技术的实施方案的实践是必不可少的。

此处，术语“约”具有其通常的含义。术语“约”用于指示值包括用于确定该值的设备或方法的固有误差变化，或涵盖接近所述值的值，例如与所述值(或值范围)相差在10％以内的值(或值范围)。

除非本文另有说明，本文对值范围的列举仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。范围内的所有值子集也被并入说明书中，就好像它们在本文中被单独引用一样。

在根据马库什组或替代物列表描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开也因此根据马库什组或替代物列表的任何个体成员或成员子组描述。

除非另有说明，否则在本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是标准程序，为本领域技术人员所公知。这些技术在例如以下来源中的整个文献中都有描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:APractical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and1996),以及F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新),EdHarlow and David Lane(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbour Laboratory,(1988),and J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)。

“载体”、“赋形剂”或“佐剂”是指药物组合物中不是活性成分的任何组分。

“受试者”是脊椎动物，其包括哺乳动物纲的任何成员，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛和高等灵长类动物。

在此处描述的研究中，描述了间充质干细胞(MSC)的制备，这些细胞经过基因工程化以过度表达某些感兴趣的蛋白质。更具体地说，经基因工程化以过表达ANGPT1和IFITM蛋白(IFITM1或IFITM3)的MSC被证明可以保护上皮细胞免受SARS-CoV-2假病毒侵入，并降低疾病严重程度且提高甲型H1N1流感病毒诱导的ARDS小鼠模型的存活率。结果提供的证据表明，经基因工程化以过表达ANGPT1和IFITM蛋白的MSC可能有助于预防或治疗人类病毒性疾病，例如COVID-19或流感。

在第一方面，本公开涉及经基因工程化以过表达ANGPT1多肽和IFITM多肽(例如IFITM1或IFITM3多肽)的MSC。

经过改造以过表达基因的MSC可用于增强对宿主免疫反应和靶向疾病病理生理学的调节作用。理想的免疫调节细胞(如MSC)的基因工程代表了具有许多优点的有前途的策略，因为细胞可以在培养物中离体转染，从而提供更大的控制条件和最大化功效的能力(15)。这项工作涉及同种异体MSC(来自不相关的健康供体)的分离和培养，其可以大量储存，而MSC的免疫特权性质允许将这些细胞移植到不相关的接受者，而无需人类白细胞抗原匹配(16)。然后用治疗性转基因转染(基因转移)这些MSC，然后将其注射到静脉循环中并携带至表达和/或释放基因产物(治疗性蛋白质)的炎症部位。基于基因工程细胞的策略优于未修饰的细胞，因为可以通过引入可直接递送至损伤部位(即肺)的不同治疗性蛋白质来增强MSC的有益作用。

同种异体的、基因工程化的、现成的MSC产品有可能施用于危重病人并用于危重病人的治疗，以减轻损害并促进肺部甚至多个器官(ARDS或败血症的结果)的修复。双基因的过表达是一种创新方法，具有选择性优势，以帮助患者参与针对病毒感染的特定宿主免疫反应。由于基因工程化的MSC的多因素作用，据信抗病毒反应将伴随着SARS-COV-2引起的器官损伤的更快恢复。此处使用具有双重CMV启动子的质粒来表达Angpt1和IFITM(IFITM1或IFITM3)基因(图2A-2B)。

ANGPT1是人体内498个氨基酸的蛋白质(UniProtKB登录号Q15389，图10C)，其包括15个氨基酸的氨基末端信号肽。其包含：包含残基81-119的超聚类结构域和包含参与ANGPT1寡聚化的残基153-261的中心卷曲结构域，以及包含参与其靶受体结合的残基277-497的纤维蛋白原C末端结构域。这种分泌的糖蛋白通过诱导其二聚化和酪氨酸磷酸化，结合并激活TEK/TIE2受体酪氨酸激酶(CD202B)，其几乎只在内皮细胞中表达。位置119(A119S)的突变已被证明会降低与其受体的结合能力。已在患有原发性先天性青光眼(PCG)(与ANGPT/TEK信号传导缺陷相关)的受试者中检测到位置249(K249R)的突变，并被认为会降低其生物活性。预计五个C末端氨基酸(R494*)的缺失会破坏蛋白质的稳定性(Thomsonet al.,J Clin Invest.2017Dec 1；127(12):4421-4436)。大规模蛋白质生产具有挑战性，因为蛋白质的聚集和不溶性，并且重组ANGPT1蛋白质在体内的半衰期较短(21)，从而限制了将重组ANGPT1用于治疗应用的可能性。根据本公开内容，可以通过在MSC中过度表达ANGPT1来克服此类限制。

IFITM蛋白在25多年前就被鉴定出来，并且在爬行动物、两栖动物、鸟类和哺乳动物的基因组序列中观察到几个IFITM直向同源基因假基因。在人类中，已鉴定出五个人类IFITM基因(IFITM1、IFITM2、IFIT3、IFIM5、IFITM10)(22)。IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白在大多数细胞类型中基本表达，但这种表达可由病毒感染和/或I型和II型IFN诱导(23，24)。已经描述了不同的IFITM功能，例如骨矿化、生殖细胞和胚胎发育、肿瘤抑制和免疫功能。IFITM1表达的定位被描述为与IFITM2和IFITM3略有不同。IFITM1表达在与被IFITM-2或-3占据的细胞表面和囊泡隔室不同的细胞表面和囊泡隔室中得到证实。

人IFITM1(UniProtKB-P13164)是一种有125个氨基酸的蛋白质，包含两个胞质结构域(残基1-36和58-86)、一个膜内结构域(残基37-57)、一个跨膜结构域(残基87-107)和一个胞外结构域(残基108-125)。位置50、51和84的膜近端半胱氨酸残基可能被棕榈酰化，从而控制膜隔室中的聚集。

人IFITM3(UniProtKB–Q01628)是一种有133个氨基酸的蛋白质，其包含两个细胞质结构域(残基1-57和79-107)、一个膜内结构域(残基58-78)、一个跨膜结构域(残基108-128)和一个胞外结构域(残基129-133)。位置71、72和105的膜近端半胱氨酸残基可能被棕榈酰化，从而控制膜隔室中的聚集。在位置24(主要)、83、88和104的赖氨酸残基可能被泛素化，这会对IFITM3的活性产生负面影响。

如本文所使用的术语“过表达”是指ANGPT1和/或IFITM蛋白在基因工程化的MSC中的表达水平高于ANGPT1和/或IFITM蛋白在不包括基因改造的相应MSC中的表达水平。在一实施方案中，ANGPT1和/或IFITM蛋白在基因工程化的MSC中的表达水平比(是)不包括基因改造的相应MSC中的ANGPT1和/或IFITM蛋白的表达水平高(的)至少20％、50％、100％(2倍)、200％(3倍)、300％(4倍)、400％(5倍)、900％(10倍)、20倍、50倍或100倍。

在一个实施方案中，ANGPT1蛋白和/或IFITM蛋白的过表达通过增加MSC中内源性ANGPT1基因和/或IFITM基因的表达来实现。例如，这可以通过引入与内源性ANGPT1基因和/或IFITM基因处于转录关系(即可操作连接)的合适的启动子和/或转录调节(例如，增强子)序列来实现。替代地，这可以通过切除/灭活抑制内源性ANGPT1基因和/或IFITM基因表达的转录抑制序列来实现。启动子和/或转录调控(例如，增强子)序列的引入和转录抑制序列的切除/失活以诱导MSC中内源基因的过度表达可以使用基因组编辑技术来实现。基因组编辑技术可以通过使用人工改造的核酸酶在基因组中插入、替换或移除DNA来修改靶细胞中的基因表达。此类核酸酶的实例可包括锌指核酸酶(ZPNs)(Gommans et al.,J.Mol Biol,354(3):507-519(2005))、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)(Zhang et al.,NatureBiotechnol,29:149-153(2011))、CRISPR/Cas系统(Cheng et al.,Cell Res.,23:1163-71](2013))，以及工程化的大范围核酸酶(Riviere et al.,Gene Ther.,21(5):529-32(2014))。核酸酶在基因组中的目标位置产生特定的双链断裂(DSB)，并使用细胞中的内源机制通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)修复诱导的断裂。此类技术可用于实现MSC中内源性ANGPT1和/或IFITM基因的过表达。

当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在阅读框中连接两个蛋白质编码区。然而，由于例如增强子通常在与启动子分开几千碱基时发挥作用，并且内含子序列可能具有可变长度，因此一些核酸可能是可操作连接的但不是连续的。“转录调控序列”或“转录调控元件”是通用术语，其是指DNA序列，如起始和终止信号、增强子和启动子、剪接信号、聚腺苷酸化信号等，其诱导或控制蛋白质编码序列(DNA序列与其可操作地连接)的转录。

在另一个实施方案中，ANGPT1蛋白和/或IFITM蛋白的过表达通过在MSC中诱导重组(即，外源)ANGPT1多肽和/或重组IFITM多肽的表达来实现。因此，在另一方面，本公开涉及包含或过表达重组(即外源)ANGPT1多肽的基因工程MSC。在一个实施方案中，基因工程化的MSC还包含或过表达重组(即外源)IFITM多肽，例如重组IFITM1或IFITM3多肽。

术语“重组”是指某些东西已经重组，使得当提到核酸时，该术语是指由通过分子生物学技术连接在一起或产生的核酸序列组成的分子。当提及蛋白质或多肽时，术语“重组”是指不是从细胞的天然基因组合成的蛋白质或多肽分子，例如，其是从通过分子生物技术产生的重组核酸构建体(无论这种合成核酸构建体是否整合到细胞的基因组中)表达的。重组核酸构建体可包括核苷酸序列，该核苷酸序列连接至或被操作以连接至核酸序列(该核苷酸序列在自然界中未与该核酸序列连接或在自然界在不同位置与该核酸序列连接)。因此，将核酸构建体称为“重组体”表示核酸分子已使用基因工程进行了操作，即通过人为干预进行了操作。重组核酸构建体可以例如通过转化(例如，转导或转染)引入宿主细胞。此类重组核酸构建体可包括源自相同宿主细胞物质或不同宿主细胞物质的序列，这些序列已被分离并重新引入宿主物质的细胞中。重组核酸构建体序列可以整合到宿主细胞基因组中，或者作为宿主细胞最初转化的结果，或者作为后续重组和/或修复事件的结果。

在一个实施方案中，重组(即，外源)ANGPT1多肽包含与图10C中描绘的成熟天然人ANGPT1的氨基酸序列(残基16-498)具有至少50％、60％或70％同一性并且表现出天然人ANGPT1的生物活性(例如结合和激活TEK/TIE2受体的能力)的序列或由该序列组成。在一实施方案中，重组(即，外源)ANGPT1多肽包含与图10C中描绘的成熟天然人ANGPT1的氨基酸序列(残基16-498)具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且表现出天然人ANGPT1的生物活性的序列或由该序列组成。在一个实施方案中，重组(即，外源)ANGPT1多肽包含与图10C中描绘的全长天然人ANGPT1的氨基酸序列(残基1-498)具有至少70％同一性并且表现出天然人ANGPT1的生物活性的序列或由该序列组成。在一实施方案中，重组(即，外源)ANGPT1多肽包含与图10C中描绘的全长天然人ANGPT1的氨基酸序列(残基1-498)具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且表现出天然人ANGPT1的生物活性的序列或由该序列组成。

因此，重组(即外源)ANGPT1多肽可以是天然人ANGPT1蛋白质(全长或成熟形式)或其生物活性变体，其包含不显著干扰生物活性的氨基酸缺失、取代和/或添加。在一实施方案中，变体表现出的生物活性是天然人ANGPT1的生物活性的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一实施方案中，变体不包含参与ANGPT1寡聚化的区域中的突变，例如超聚类结构域(残基81-119)或中心卷曲结构域(残基153-261)中的突变。在另一实施方案中，变体不包含纤维蛋白原C端结构域(残基277-497)中的突变。在进一步的实施方案中，变体不包含位置119(例如，A119S)和/或位置249(例如，K249R)的突变。在另一实施方案中，变体不包含五个C-末端氨基酸的缺失。

在一实施方案中，重组(即，外源)IFITM1多肽包含与图8C中描绘的天然人IFITM1的氨基酸序列具有至少50％、60％或70％同一性并且表现出天然人IFITM1的生物活性的序列或由该序列组成。在一个实施方案中，重组(即，外源)IFITM1多肽包含与图8C中描绘的天然人IFITM1的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且表现出天然人IFITM1的生物活性的序列或由该序列组成。

因此，重组(即外源)IFITM1多肽可以是天然人IFITM1蛋白质(全长)或其生物活性变体，其包含不显著干扰生物活性的氨基酸缺失、取代和/或添加。在一实施方案中，变体表现出的生物活性是天然人ANGPT1的生物活性的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一实施方案中，变体不包含参与IFITM1棕榈酰化的一个或多个半胱氨酸残基(例如，残基50、51和/或84)的突变。

在一实施方案中，重组(即，外源)IFITM3多肽包含与图9C中描绘的天然人IFITM3的氨基酸序列具有至少50％、60％或70％同一性并且表现出天然人IFITM3的生物活性的序列或由该序列组成。在一个实施方案中，重组(即，外源)IFITM3多肽包含与图9C中描绘的天然人IFITM3的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且表现出天然人IFITM3的生物活性的序列或由该序列组成。

因此，重组(即外源)IFITM3多肽可以是天然人IFITM3蛋白质(全长)或其生物活性变体，其包含不显著干扰生物活性的氨基酸缺失、取代和/或添加。在一实施方案中，变体表现出的生物活性是天然人ANGPT3的生物活性的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一实施方案中，变体不包含参与IFITM3棕榈酰化的一个或多个半胱氨酸残基(例如，残基71、72和/或105)的突变。在另一实施例方案，该变体包含在残基中的泛素化的一个或多个残基(例如残基24、83、88和/或104)处的突变。

在一实施方案中，MSC被编码重组(即外源)ANGPT1多肽的重组核酸转化或转染。因此，在另一方面，本公开涉及包含编码ANGPT1多肽的重组(即外源)核酸的基因工程MSC。

如本文所使用的，“核酸”应指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其杂交体或修饰变体。“外源”或“重组”核酸涉及引入细胞的任何核酸，其不是细胞“原始”或“天然”基因组的组成部分。外源核酸可以是整合的或非整合的，或相关稳定转染的核酸。

重组核酸可以是包含编码重组(即外源)ANGPT1多肽和/或重组IFITM多肽的核苷酸序列的DNA或mRNA分子。将重组核酸引入细胞的方法是本领域众所周知的。此类方法的示例包括但不限于脂质、蛋白质、颗粒或其他能够促进细胞转化核酸的分子、电穿孔的使用。然而，MSC也可以在体内与编码ANGPT1多肽和/或IFITM多肽的核酸接触，例如通过基因枪进行。

在一实施方案中，编码ANGPT1的重组核酸包含与编码图10A中描绘的成熟全长人ANGPT1的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，重组核酸包含与如图10A所示的编码全长成熟形式的核苷酸序列人ANGPT1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

在一实施方案中，编码ANGPT1的核酸包含编码人ANGPT1的密码子优化的核苷酸序列，例如图10B中描绘的密码子优化的序列。不受任何特定理论或机制的束缚，据信核苷酸序列的密码子优化增加了mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可能涉及用天然密码子替代另一个编码相同氨基酸的密码子，但可以通过细胞内更容易获得的tRNA进行翻译，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少会干扰翻译的二级mRNA结构，从而提高翻译效率。合成经密码子优化的核酸的方法、工具、平台和服务是本领域众所周知的，例如来自GenScript的OptimumGene^TM平台、来自Integrated DNA Technologies的密码子优化工具、来自ThermoFisher Scientific的GeneOptimizer^TM平台、来自NCBI(Nucleic AcidsRes.2007Jul；35(Web Server issue)：W126-W131)的OPTIMIZER、密码子在线优化(COOL：Codon Optimization OnLine)(Bioinformatics，Volume 30，Issue 15，1August 2014，Pages 2210-2212)等。

在一实施方案中，编码IFITM1的重组核酸包含与编码图8A中描绘的全长人IFITM1的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，重组核酸包含与图8A中描绘的编码全长人IFITM1的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。在一实施方案中，编码IFITM1的核酸包含编码人IFITM1的密码子优化的核苷酸序列，例如图8B中描述的密码子优化的序列。

在一实施方案中，编码IFITM3的重组核酸包含与编码图9A中描绘的全长人IFITM3的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，重组核酸包含与图9A中描绘的编码全长人IFITM3的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。在一实施方案中，编码IFITM3的核酸包含编码人IFITM3的密码子优化的核苷酸序列，例如图9B中描述的密码子优化的序列。

重组核酸可以是cDNA或mRNA分子。

在一实施方案中，重组核酸存在于载体或质粒中，即重组表达载体或质粒。因此，另一方面，本公开涉及包含重组表达载体的基因工程化的MSC，所述重组表达载体包含编码如本文所述的ANGPT1多肽的核酸。在一实施方案中，基因工程化的MSC还包含重组表达载体，该载体包含如本文所述的编码IFITM多肽的核酸。在一实施方案中，编码ANGPT1和IFITM多肽的核酸存在于不同的重组表达载体中。在另一实施方案中，编码ANGPT1和IFITM多肽的核酸存在于相同的重组表达载体中。

重组表达载体或质粒可以是包含如上所述重组核酸的任何合适的重组表达载体或质粒。合适的载体包括被设计用于在MCSs中表达目的基因的那些，这是本领域众所周知的。在一实施方案中，重组表达载体或质粒是小质粒。小质粒或纳米质粒是小的(～4kb)环状质粒衍生物，其已从用作哺乳动物细胞遗传修饰的转基因载体的所有原核载体部分中释放出来(即，它们不含细菌DNA序列)。小质粒及其用途例如在Minicircle and MiniplasmidDNA Vectors:The Future of Nonviral and Viral Gene Transfer,by Dr.MartinSchleef(editor),May 2013,Wiley-Blackwell,258pages中有描述。

在一些实施方案中，重组表达载体是病毒载体。转基因病毒已广泛应用于将基因传递到包括MSC在内的干细胞中。用于本文所述的MSC遗传修饰的优选病毒载体涉及逆转录病毒载体，特别是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒(有时称为哺乳动物C型逆转录病毒)是慢病毒分枝的姊妹属，是逆转录病毒家族的正逆转录病毒亚科的成员。鼠白血病病毒(MLV或MuLV)、猫白血病病毒(FeLV)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)和长臂猿白血病病毒(GALV)是伽马(γ)逆转录病毒属的成员。技术人员了解在MSC的遗传修饰中利用伽马逆转录病毒所需的技术。例如，可以使用Maetzig et al.(Gamma retroviral vectors:biology,technology and application,2001,Viruses 3(6):677-713)中描述的载体或类似的载体。例如，小鼠白血病病毒(MLV)(一种简单的伽马逆转录病毒)在产生伽马逆转录病毒修饰的MSC和在递送给受试者后从所述MSC表达治疗性转基因的背景下，可以转化为基因治疗的有效载体。转基因病毒已广泛应用于将基因传递到干细胞中。可以应用腺病毒，或RNA病毒，例如慢病毒，或其他逆转录病毒。腺病毒已被用于生成一系列用于基因转移细胞工程的载体。最初一代的腺病毒载体是通过以下方式产生的：删除E1基因(病毒复制所需)，从而产生具有4kb克隆能力的载体。额外删除E3(负责宿主免疫反应)允许8kb的克隆能力。已经产生了包含E2和/或E4缺失的更多代。慢病毒是逆转录病毒科病毒的成员(M.Scherr et al.,Curr Gene Ther.2002Feb；2(1):45-55)。慢病毒载体是通过删除除LTR和顺式作用包装信号之外的整个病毒序列而生成的。所得载体的克隆容量为约8kb。这些载体与逆转录病毒载体的一个区别特征是它们能够转导分裂和非分裂细胞以及终末分化细胞。

重组表达载体或质粒可以包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其对载体视情况并考虑载体是基于DNA还是基于RNA的而将被引入其中的宿主类型(例如，动物如人)特异。重组表达载体或质粒可包括一种或多种标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中的互补以提供原营养等，用于重组表达载体的合适标记基因包括，例如，新霉素G418抗性基因、潮霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。重组表达载体或质粒可包含可操作地连接至编码ANGPT1和/或IFITM多肽的核酸并且在MSC中有功能的天然或正常启动子。启动子的选择，例如强启动子、弱启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育特异性启动子，在技术人员的普通技能范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子、延伸因子1(EF1)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、来自其他物种的β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α(EF1α)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、人血清白蛋白(SA)启动子、α-1抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、细胞色素P4502E1(CYP2E1)启动子等。载体也可以利用组合启动子，例如鸡β-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子，与延伸因子1α(EF1α)启动子组合的人或鼠CMV衍生增强子元件，与延伸因子1α(EF1α)启动子组合的人或鼠CMV衍生增强子元件的无CpG版本，与α胎蛋白MERII增强子结合的白蛋白启动子等等，或本领域已知的组织特异性或诱导型启动子的多样性，例如肌肉特异性启动子肌肉肌酸激酶(MCK)，以及C5-12或肝脏-特异性启动子载脂蛋白A-I(ApoAI)。各种载体编码元素的方位可以彼此相对地改变。启动子可包含增强转录因子结合的各种基序，例如启动子(INR)、基序十元件(MTE)和下游启动子元件(DPE)基序(参见，例如，Martinez,Transcription.2012；3(6):295-299)。在一个实施方案中，启动子是CMV启动子，例如包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列的启动子。在一实施方案中，该载体还包含转录增强子。在另一实施方案中，增强子是CMV增强子，例如包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列的增强子。在进一步的实施方案中，载体包含CMV启动子/增强子组合，其包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列。

同样，载体可以利用本领域已知的多种polyA信号，例如牛生长激素、SV40早期或SV40晚期polyA信号。

重组表达载体可设计用于瞬时表达、稳定表达或两者。此外，可以制备重组表达载体以用于组成型表达或诱导型表达。在本公开的上下文中有用的载体可以是“裸”核酸载体(即，具有很少或没有包裹它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)，或与其他分子复合的载体。可以与载体适当组合的其他分子包括但不限于病毒外壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒和靶向部分，例如配体、受体或靶向细胞分子的抗体。

任何给定的基因递送方法都包含在本公开内容中，并且优选地涉及如上所述的病毒或非病毒载体，以及生物或化学转染方法。这些方法可以在所使用的系统中产生稳定或瞬时的基因表达。非病毒方法包括常规质粒转移和通过使用基因组编辑技术应用靶向基因整合，如上所述。这些代表了载体转换的方法，它们的优点是既高效，又通常在整合时对位点具有特异性。将载体引入细胞的物理方法是技术人员已知的。一个示例涉及电穿孔，其依赖于使用短暂的高压电脉冲，从而通过克服其电容在膜中产生瞬时孔。这种方法的一个优点是其可用于大多数细胞类型的稳定和瞬时基因表达。替代方法涉及使用脂质体、蛋白质转导结构域或其他促进核酸进入细胞的合适试剂。适当的方法是本领域技术人员已知的并且不旨在限制本公开的实施方案。

间充质干细胞(MSC，也称为间充质基质细胞)是存在于骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰腺、大脑、肾脏、肝脏、心脏、视网膜、大脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中的细胞。MSC能够分化成不同的种系，如中胚层、内胚层和外胚层。因此，MSC能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪、骨质、软骨、弹性、肌肉和纤维结缔组织。MSC进入的特定谱系定型和分化途径取决于各种影响，包括机械影响和/或内源性生物活性因子，如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件。因此，MSC是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，这些子细胞要么是干细胞，要么是前体细胞，它们会及时不可逆地分化产生表型细胞。MSC的示例包括间充质前体细胞(MPC)。

已知MSC在施用于患者后表现出免疫逃避特性。在移植同种异体供体材料的情况下，MSC已显示出有益的免疫调节作用(Le Blanc et al.,Lancet 2004:363,p.1439)，从而减少潜在的致病性同种异体反应和排斥反应。MSCs的治疗性递送可以通过全身注射进行，随后MSC归巢并植入损伤部位(Kidd et al.,Stem Cells 2009:27,p.2614)。

在一些方面，MSC可以是子代细胞(其也可以称为扩增细胞)。子代细胞可以从干细胞的体外培养中产生。根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等，本公开的扩增细胞可具有多种表型。在某些实施方案中，子代细胞是在从亲本群体传代约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10代后获得的。然而，子代细胞可在从亲本群体传代任意次数后获得。在合适的培养基中培养可获得子代细胞。

在一个实施方案中，子代细胞是多能扩增的MSC子代(MEMP)，如WO 2006/032092中所述。WO 01/04268和WO 2004/085630中描述了用于制备可衍生后代的富集MSC群体的方法。在体外环境中，MSC很少会作为绝对纯的制剂存在，并且通常会与其他属于组织特异性定型细胞(TSCC)的细胞一起存在。WO 01/04268涉及从骨髓中以约0.1％至90％的纯度水平收获此类细胞。可以从组织来源直接收获包含衍生子代的MSC的群体，或者替代地其可以是已经离体扩增的群体。

例如，后代可获自收获的、未扩增的、基本上纯化的MSC群体，其占所在的群体的细胞总数的至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％。该水平可以通过例如选择对至少一种通常在MSC上表达的标记物(例如CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1)呈阳性，和/或对例如CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA-DR等标记物呈阴性的细胞来实现。

例如，后代可获自收获的、未扩增的、基本上纯化的MSC群体，其占所在的群体的细胞总数的至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％。该水平可以例如通过选择对选自CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1的标记物呈阳性的细胞来实现。

MSC起始群体可源自WO 01/04268或WO 2004/085630中列出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或者可能更广泛地源自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、视网膜、大脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨骼、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

MEMPS可与新鲜收获的MSC区分开来，因为它们对标记物Stro-1呈阳性，对标记物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相反，新鲜分离的MSC对Stro-1和ALP均呈阳性。在本公开的优选实施方案中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的施用细胞具有表型Stro-1⁺、ALP-。

对于给定标记物，提及细胞“阳性”(也称为“+”)意指其可能是该标记物的低表达(低或暗)或高表达(明亮，亮)，具体取决于标记在何种程度上存在于细胞表面，其中术语与荧光强度或细胞颜色分选过程中使用的其他颜色有关。低(或暗或无光泽)和亮的区别将在用于被分选的特定细胞群的标记物的上下文中理解。对于给定标记，将细胞称为“阴性”(或“-”)并不意指该细胞根本不表达该标记。这意味着该标记物在该细胞中以相对非常低的水平表达，并且当可检测标记时它会产生非常低的信号。

在一实施方案中，细胞取自患有病毒性疾病(例如COVID-19)的患者或未患有病毒性疾病的受试者，经过基因工程化以过表达ANGPT1和IFITM多肽，并任选地使用标准技术体外培养，并作为自体或同种异体移植物施用给需要治疗的患者。在替代的实施方案中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本公开的另一个有用的实施方案中，使用非人类动物的细胞(或者如果患者不是人类，则来自另一个物种)。

本技术可以使用来自任何非人类动物物种的细胞来实践，包括但不限于非人类灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔形动物、啮齿动物、鸟类和鱼类细胞。可用于进行本公开的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猴和任何其他新大陆或旧大陆猴的细胞。可用于进行本公开的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于进行本公开的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于执行本公开的兔类物种的示例包括家兔、野兔、野兔、棉尾兔、雪鞋兔和鼠兔。鸡(Gallus gattus)是可用于执行本公开的鸟类物种的示例。

MSC可以在使用前储存。用于保存和储存真核细胞，特别是哺乳动物细胞的方法和方案是本领域众所周知的(参见，例如，Pollard,J.W.and Walker,J.M.(1997)Basic CellCulture Protocols,Second Edition,Humana Press,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,Fourth Edition,Wiley-Liss,Hoboken,N.J.)。任何保持分离的干细胞例如间充质干细胞/祖细胞或其后代的生物活性的方法都可以与本公开内容结合使用。在一个优选的实施方案中，细胞通过低温保存来维持和储存。

可以使用多种技术获得MSC。例如，可以使用许多细胞分选技术，通过这些技术参考与细胞-抗体复合物相关的特性或附着在抗体上的标记物来物理分离细胞。该标记物可以是磁性颗粒或荧光分子。抗体可以交联，使得它们形成多个细胞的聚集体，这些细胞可以通过它们的密度分离。替代地，可以将抗体附着到固定基质上，所需细胞粘附到该基质上。

如本文所使用的“培养基”包括(a)含有用于培养MSC的典型组分(例如有或没有MSC的氨基酸、葡萄糖和各种盐)的培养基，和(b)从培养基分离的组合物，其包括包含在培养过程中从MSC释放的组分的组合物。培养基可包含固体、液体、气体或相和材料的混合物的组分。培养基组分包括但不限于琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。“培养基”包括旨在用于细胞培养的材料，即使它尚未与细胞接触也如此。例如，为细菌培养准备的富含营养的液体可以是培养基。

在一个实施方案中，MSC在培养/扩增期间或之后(以及在受试者中施用/使用之前)接触或暴露于一种或多种试剂以赋予它们期望的特性，例如诱导表达/分泌抗炎介质和/或抑制促炎介质的表达/分泌。例如，暴露于低浓度前列环素(例如，曲前列环素)(例如约10μg/mL的曲前列环素)的MSC已通过MSC显示出某些抗炎介质如IL-10、IL-13、IDO、iNOS、HLA和TGFβ，以及促炎介质如TNFα和IL-4的分泌减少(参见，例如，WO2018/080990)。这种对一种或多种试剂的暴露可以是持续任何合适的时间(例如至少6、12、18、24、36或48小时)以诱导期望的效果。

在另一方面，本公开涉及本文所述的基因工程化的MSC或包含它的药物组合物，其用作药物。在一个实施方案中，该药物用于预防或治疗病毒性疾病，例如受试者的呼吸道病毒性疾病，例如用于控制此类病毒性疾病(包括ARDS、败血症和/或败血性休克)的并发症。本公开还涉及一种用于预防或治疗病毒性疾病如呼吸道病毒性疾病，例如用于控制受试者的此类病毒性疾病(包括ARDS、败血症和/或败血性休克)的并发症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的基因工程化的MSC，或包含该MSC的药物组合物。本公开还涉及本文所述的基因工程化的MSC或包含该MSC的药物组合物在受试者中用于预防或治疗病毒性疾病如呼吸道病毒性疾病，例如用于控制此类病毒性疾病(包括ARDS、败血症和/或败血性休克)的并发症的用途。本公开还涉及本文所述的基因工程化的MSC或包含该MSC的药物组合物在制备在受试者中用于预防或治疗病毒性疾病如呼吸道病毒性疾病，例如用于控制此类病毒性疾病(包括ARDS、败血症和/或败血性休克)的并发症的药物中的用途。可能引起呼吸道并发症(如ARDS和肺炎)的病毒示例包括呼吸道病毒(例如，流感病毒、冠状病毒)，以及疱疹病毒科的院内病毒感染，即单纯疱疹病毒(HSV)和巨细胞病毒(CMV)。在一实施方案中，病毒性疾病是流感或COVID-19。

在一实施方案中，本文定义的方法和用途用于预防、治疗和/或控制由原始SARS-CoV-2毒株导致的感染。在另一个实施方案中，本文定义的方法和用途用于预防、治疗和/或控制由原始SARS-CoV-2毒株的变体导致的感染，所述变体例如B.1.1.7(也称为VOC-202012)/01)、501Y.V2(B.1.351)、P.1(B.1.1.28.1)或B.1.617.2(德尔塔)变体，以及其他关注的变体(VOC)，例如B.1.429、B.1.526、B.1.525和A.23.1(参见，例如，www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.html)。

如本文所使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括消除、改善、缓和或减轻疾病或病症或其一种或多种症状，无论该疾病或病症是否被认为是“治愈的”或“治愈”以及是否所有症状都已解决。这些术语还包括减少或预防疾病或病症或其一种或多种症状的进展，阻碍或预防疾病或病症或其一种或多种症状的潜在机制，以及实现任何治疗和/或预防益处。

如本文所使用的术语“预防(preventing)”、“阻止(prevent)”或“预防(prevention)”包括相对于未治疗的对照受试者降低受试者(例如处于患病毒性疾病性或其并发症的风险中的受试者)的疾病或病症或其一种或多种症状的发生和/或严重，或相对于未治疗的对照受试者延迟受试者(例如，处于患病毒性疾病或其并发症风险中的受试者)的疾病或病症的一种或多种症状的发作。

在一实施方案中，本文所述的基因工程化的MSC存在于组合物中，优选药物组合物中。因此，在另一方面，本公开提供了包含本文所述的基因工程化的MSC的药物组合物。在一实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文所述的基因工程化的MSC。

药学上可接受的载体或赋形剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体或赋形剂的使用在本领域中是众所周知的。该溶液优选是无菌的并且流动性达到易于注射的程度。优选地，该溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用防腐剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

可用作药学上可接受的载体或赋形剂的材料和溶液的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄芪；麦芽；明胶；滑石；润滑剂，例如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；抗氧化剂；抗菌剂；以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。

可用于本公开的方法的药物组合物可包含聚合物载体或细胞外基质。多种生物或合成固体基质材料(例如，固体支持基质、生物粘合剂或敷料以及生物/医学支架)适用于本公开内容。基质材料优选地是医学上可接受的用于体内应用。此类医学上可接受的和/或生物学上或生理上可接受的或相容的材料的非限制性实例包括但不限于可吸收和/或不可吸收的固体基质材料，例如小肠粘膜下层(SIS)，例如，猪源的(和其他SIS来源)；交联或非交联藻酸盐、水胶体、泡沫、胶原凝胶、胶原海绵、聚乙醇酸(PGA)网、聚乳酸(PGL)网、羊毛、泡沫敷料、生物粘合剂(例如，纤维蛋白胶和纤维蛋白凝胶)和一层或多层中的死去表皮皮肤等效物。

合适的聚合物载体包括由合成或天然聚合物形成的多孔网状物或海绵，以及聚合物溶液。一种形式的基质是聚合物网或海绵；另一种是聚合物水凝胶。可以使用的天然聚合物包括蛋白质，例如胶原蛋白、白蛋白和纤维蛋白；和多糖，例如海藻酸盐和透明质酸聚合物。合成聚合物包括可生物降解和不可生物降解的聚合物。生物可降解聚合物的示例包括羟基酸的聚合物，所述羟基酸例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈及其组合。不可生物降解的聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯和聚乙烯醇。

可形成具有延展性的离子或共价交联水凝胶的聚合物用于封装细胞。水凝胶是当有机聚合物(天然或合成)通过共价键、离子键或氢键交联以形成三维开放晶格结构(该结构会捕获水分子形成凝胶)时而形成的物质。

可用于形成水凝胶的材料的示例包括离子交联的多糖，例如海藻酸盐、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，或嵌段共聚物，例如Pluronics^TM或Tetronics^TM，聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH交联。其他材料包括纤维蛋白等蛋白质、聚乙烯吡咯烷酮等聚合物、透明质酸和胶原蛋白。

通常，这些聚合物至少部分可溶于具有带电侧基或其一价离子盐的水溶液，例如水、缓冲盐溶液或醇水溶液。具有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的示例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如如磺化聚苯乙烯。也可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的示例是羧酸基团、磺酸基团、卤化(优选氟化)醇基团、酚羟基和酸性OH基团。具有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的示例是聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和一些亚氨基取代的聚磷腈。聚合物的铵盐或季盐也可以由主链氮或亚氨基侧基形成。碱性侧基的示例是氨基和亚氨基。

在一些实施方案中，药物组合物、预防/治疗方法或用途可包含至少一种额外的治疗剂。例如，该组合物、预防/治疗方法或用途可包括镇痛剂以帮助治疗炎症或疼痛，或抗感染剂以防止用该组合物治疗的部位感染。更具体地，有用的治疗剂的非限制性示例包括以下治疗类别：镇痛剂，例如非甾体抗炎药、阿片激动剂和水杨酸盐；抗感染药，如抗蠕虫药、抗厌氧菌药、抗生素、氨基糖苷类抗生素、抗真菌抗生素、头孢菌素类抗生素、大环内酯类抗生素、杂β-内酰胺类抗生素、青霉素类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、四环素类抗生素、抗分枝杆菌类、抗结核抗分枝杆菌类、抗原虫药、抗疟原虫药、抗病毒药、抗逆转录病毒药、杀螨剂、抗炎药、皮质类固醇抗炎药、止痒药/局部麻醉药、局部抗感染药、抗真菌局部抗感染药、抗病毒局部抗感染药；电解质和肾脏药剂，例如酸化剂、碱化剂、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂利尿剂、袢利尿剂、渗透性利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂、电解质替代物和促尿酸排泄剂；酶，例如胰酶和溶栓酶；胃肠药，如止泻药、胃肠抗炎药、胃肠抗炎药、抗酸抗溃疡药、胃酸泵抑制剂抗溃疡药、胃粘膜抗溃疡药、H2阻滞剂抗溃疡药，胆石溶解剂、消化剂、催吐剂、缓泻剂和大便软化剂，以及促运动剂；全身麻醉药，如吸入麻醉药、卤化吸入麻醉药、静脉麻醉药、巴比妥类静脉麻醉药、苯二氮卓类静脉麻醉药、和阿片激动剂静脉麻醉药；激素和激素调节剂，例如堕胎药、肾上腺药物、皮质类固醇肾上腺药物、雄激素、抗雄激素、免疫生物学药物，例如免疫球蛋白、免疫抑制剂、类毒素和疫苗；局部麻醉剂，如酰胺类局部麻醉剂和酯类局部麻醉剂；矿物质；以及维生素，例如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等。

在一实施方案中，本文所述的基因工程化的MSC或包含该MSC的药剂组合物可与用于治疗SARS-CoV-2感染和/或相关疾病(如COVID-19)的药剂联合使用。此类药剂包括抗炎药、抗SARS-CoV-2中和抗体、SARS-CoV-2疫苗和抗病毒药剂。

本公开的预防剂/治疗剂和/或组合物的组合可以以任何常规剂型施用或共同施用(例如，连续、同时、在不同时间)。在本公开的上下文中共同施用是指在协调治疗过程中施用多于一种治疗剂以实现改善的临床结果。这种共同施用也可以是共同的，即在重叠的时间段期间发生。例如，可以在施用第二活性剂之前、同时、之前和之后或之后将第一药剂施用给患者。在一个实施方案中，药剂可以组合/配制在单一组合物中并因此同时施用。

可用于本公开的方法的组合物可包括细胞培养成分，例如，培养基，包括氨基酸、金属、辅酶因子，以及其他细胞的小群体，例如，其中一些可通过干细胞的后续分化产生细胞。

可用于本公开的方法的组合物可以通过例如从培养基中沉淀出受试者细胞并将它们重新悬浮在所需的溶液或材料中来制备。可以通过例如离心、过滤、超滤等从培养基中沉淀和/或改变细胞。

技术人员可以容易地确定组合物中的MSC和任选的载体的量并且在本公开的方法中施用。当然，对于要施用于动物或人的任何组合物，以及对于任何特定的施用方法，优选因此确定：毒性，例如通过确定合适的动物模型(例如，老鼠等啮齿动物)中的致死剂量(LD)和LD₅₀；以及，组合物的剂量，其中组分的浓度和施用组合物的时序，从而引起适当的反应。此类确定不需要根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文件进行过度实验。无需过度实验即可确定顺序施用的时间。

在一实施方案中，将以下量和量范围的MSC施用于受试者：(i)约1×10²至约1×10⁸个细胞/kg体重；(ii)约1×10³至约1×10⁷个细胞/kg体重；(iii)约1×10⁴至约1×10⁶个细胞/kg体重；(iv)约1×10⁴至约1×10⁵个细胞/kg体重；(v)约1×10⁵至约1×10⁶个细胞/kg体重；(vi)约5×10⁴至约0.5×10⁵个细胞/kg体重；(vii)约1×10³个细胞/kg体重；(viii)约1×10⁴个细胞/kg体重；(ix)约5×10⁴个细胞/kg体重；(x)约1×10⁵个细胞/kg体重；(xi)约5×10⁵个细胞/kg体重；(xii)约1×10⁶个细胞/kg体重；(xiii)约1×10⁷个细胞/kg体重。设想的人体重量包括但不限于约5kg、10kg、15kg、30kg、50kg、约60kg；约70kg；约80kg，约90kg；约100kg，约120kg和约150kg。MSC可以以推注形式给药，即在短时间内注射所有细胞，或者可以通过长时间连续施用(例如输注)少量细胞来完成，或者替代地通过在一段时间内多次给予有限大小的推注来完成。

可用于本公开的方法的组合物尤其可以通过局部注射(例如，在肺中)施用，包括导管施用、全身注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本文所述的治疗组合物(例如药物组合物)时，其通常将配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

实施例

通过以下非限制性实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：模拟病毒感染下的MSC

MSC使用模拟病毒感染的dsRNA进行预处理。使用通过执行的RNA测序分析了3种不同供体来源的MSC的总转录组。差异基因表达分析显示与抗病毒防御相关的几个基因显著上调，特别是IFITM1和IFITM3基因显著上调(图1)。

实施例2：转基因质粒载体的开发

图2A-B显示了IFITM1-Angpt1(图2A)和IFITM3-Angpt1(图2B)的载体图。质粒载体被设计为在两个独立的CMV启动子下共表达人类密码子优化的Angptl和IFITM蛋白。通过质粒载体转染，MSC可以有效地过表达来自同一载体的两种独立蛋白质。

实施例3：蛋白质定量

用蛋白质印迹和/或ELISA验证蛋白质的过表达。在图3A-F中，对MSC候选物1(IFITM1-Angptl)和MSC候选物2(IFITM3-Angptl)进行改造，并通过ELISA(图3A、3B和3C)、蛋白质印迹(图3D、3E)或使用Jess^TM蛋白质检测设备(Protein Simple，Biotechne)评估蛋白质表达(图3F)。n＝2个实验。

实施例4：蛋白质诱导的保护

工程化的MSC的治疗效果是使用相关的效力测定法对COVID-19患者中观察到的ARDS和败血症的病理生理学进行评估的。MSC条件培养基是通过调节未经修饰或经修饰的(dsRNA刺激或转染细胞)MSC持续24或48小时，然后高速离心以去除碎片和死细胞来制备的。在第0天，接种人原代肺泡上皮细胞(ScienCell)并让其生长过夜以附着。第1天，将培养基替换为与上皮完全生长培养基1:1混合的MSC条件培养基。对于图4所示的数据，第1天将5×10⁸假病毒-SARS-CoV-2(Montana Molecular)添加到细胞溶液中，随后在第2天进行绿色荧光流式细胞术分析。在预防模型(如图5A-5C所示)中，第2天将假病毒-SARS-CoV-2添加到细胞溶液中，第3天进行分析。

数据显示，使用A)研究级转染方案和48小时条件培养基，和B)放大转染/制造方案与24小时条件培养基衍生的MSC候选物1(IFITM1-Angpt1)和MSC候选物2(IFITM3-Angpt1)条件培养基保护上皮细胞免受冠状病毒在体外系统中诱导的假病毒-SARS-CoV2的感染。n＝3个实验用1-3个不同的供体衍生的MSC进行(条形图＝标准差的平均值)。单向方差分析，Tukey的多重比较。图5C所示的结果显示了针对IFITM3的抗体降低了来自MSC候选物2的条件培养基对感染的保护作用。

实施例5：候选MSC对ARDS小鼠模型疾病严重程度和存活率的影响(研究1，在感染后第2天施用MSC)

在ARDS和危重疾病的标准化小鼠模型：小鼠适应的甲型H1N1流感病毒(A/FM/1/47-MA病毒或FM-MA病毒)诱导的ARDS模型中评估了体内疗效。8至10周大的C57BL/6N小鼠购自Charles River Laboratories(Saint Constant,QC,加拿大)。根据加拿大动物保护委员会(CCAC)指南饲养动物。在笼子的料斗内提供标准饲料，并随意提供水。将动物圈养在20℃-23℃的温控室内，光照周期为12小时，黑暗周期为12小时，湿度为40％-60％。简而言之，小鼠鼻内接受1000PFU的甲型流感毒株H1N1：A/FM/1/47-MA病毒。在病毒接种后的第二天，用载体或工程化的MSC(候选物2，用ANGPT1和IFITM3进行工程化的)处理小鼠。每天监测小鼠的存活和健康状况、体重和疾病评分，直到病毒感染后7天。

在图6A中的数据显示了基因工程化的MSC(候选物2)在甲型H1N1流感病毒诱导的ARDS模型中相对于载体治疗组提高存活率(第7天载体组0％对候选2治疗组50％)。使用候选物MSC1和2分别获得了33％(2/6)和50％(3/6)的存活率。相对于赋形剂治疗，MSC候选物2的施用也部分地防止了体重减轻(图6B)和降低了疾病严重性(图6C)。

实施例6：MSC候选物对ARDS小鼠模型疾病严重程度和存活率的影响(研究2，在感染后第1天施用MSC)

使用与上述实施例5中描述的方案类似的方案进行第二研究，不同之处在于1)在病毒接种后的第一天用载体或工程化的MSC(候选物2)处理小鼠，2)直到第9天评估存活率以及3)评估体重减轻和疾病评分直到第10天。

图7A中所述的结果证实，在甲型H1N1流感病毒诱导的ARDS模型中，基因工程化的MSC候选物相对于赋形剂治疗组提高了存活率(赋形剂组的4％对候选物2治疗组的23％)。相对于赋形剂治疗，MSC候选物2的施用也部分地防止了体重减轻(图7B)和降低了疾病严重性(图7C)。

尽管上文已经通过其特定实施方案描述了本发明，但可以对其进行修改而不背离所附权利要求中定义的本发明的精神和性质。在权利要求中，“包含”一词用作开放式术语，实质上等同于短语“包括但不限于”。单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该”包括相应的复数指代，除非上下文另有明确规定。

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序列表

<110> 渥太华医院研究所

<120> 病毒性疾病的基于细胞的疗法

<130> G17018-00018

<150> US 63/092,572

<151> 2020-10-16

<160> 12

<170> PatentIn 版 3.5

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgcacaagg aggaacatga ggtggctgtg ctggggccac cccccagcac catccttcca 60

aggtccaccg tgatcaacat ccacagcgag acctccgtgc ccgaccatgt cgtctggtcc 120

ctgttcaaca ccctcttctt gaactggtgc tgtctgggct tcatagcatt cgcctactcc 180

gtgaagtcta gggacaggaa gatggttggc gacgtgaccg gggcccaggc ctatgcctcc 240

accgccaagt gcctgaacat ctgggccctg attctgggca tcctcatgac cattggattc 300

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<210> 2

<211> 378

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgcataagg aagaacacga ggtggccgtg ctgggacctc cacctagcac aattctgcct 60

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gagaagcggg gctactga 378

<210> 3

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met His Lys Glu Glu His Glu Val Ala Val Leu Gly Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Thr Ile Leu Pro Arg Ser Thr Val Ile Asn Ile His Ser Glu Thr Ser

20 25 30

Val Pro Asp His Val Val Trp Ser Leu Phe Asn Thr Leu Phe Leu Asn

35 40 45

Trp Cys Cys Leu Gly Phe Ile Ala Phe Ala Tyr Ser Val Lys Ser Arg

50 55 60

Asp Arg Lys Met Val Gly Asp Val Thr Gly Ala Gln Ala Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Thr Ala Lys Cys Leu Asn Ile Trp Ala Leu Ile Leu Gly Ile Leu Met

85 90 95

Thr Ile Gly Phe Ile Leu Leu Leu Val Phe Gly Ser Val Thr Val Tyr

100 105 110

His Ile Met Leu Gln Ile Ile Gln Glu Lys Arg Gly Tyr

115 120 125

<210> 4

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atgaatcaca ctgtccaaac cttcttctct cctgtcaaca gtggccagcc ccccaactat 60

gagatgctca aggaggagca cgaggtggct gtgctggggg cgccccacaa ccctgctccc 120

ccgacgtcca ccgtgatcca catccgcagc gagacctccg tgcccgacca tgtcgtctgg 180

tccctgttca acaccctctt catgaacccc tgctgcctgg gcttcatagc attcgcctac 240

tccgtgaagt ctagggacag gaagatggtt ggcgacgtga ccggggccca ggcctatgcc 300

tccaccgcca agtgcctgaa catctgggcc ctgattctgg gcatcctcat gaccattctg 360

ctcatcgtca tcccagtgct gatcttccag gcctatggat ag 402

<210> 5

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

atgaatcaca ccgtgcagac ctttttcagc cctgtgaaca gcggccagcc tccaaactac 60

gagatgctga aggaagaaca cgaggtggcc gtgctgggag cccctcataa tcctgctcct 120

cctaccagca ccgtgatcca catccggagc gagacatctg tccccgacca cgtggtgtgg 180

tccctgttca acaccctgtt tatgaacccc tgctgtctgg gcttcatcgc cttcgcctac 240

agcgtgaaaa gcagagatag aaagatggtg ggcgacgtga ccggcgccca ggcctacgcc 300

tctacagcca agtgcctgaa catctgggcc ctgatcctgg gcatcctcat gacaatcctg 360

ctgatcgtga tccccgtcct gattttccaa gcttatggct ga 402

<210> 6

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Asn His Thr Val Gln Thr Phe Phe Ser Pro Val Asn Ser Gly Gln

1 5 10 15

Pro Pro Asn Tyr Glu Met Leu Lys Glu Glu His Glu Val Ala Val Leu

20 25 30

Gly Ala Pro His Asn Pro Ala Pro Pro Thr Ser Thr Val Ile His Ile

35 40 45

Arg Ser Glu Thr Ser Val Pro Asp His Val Val Trp Ser Leu Phe Asn

50 55 60

Thr Leu Phe Met Asn Pro Cys Cys Leu Gly Phe Ile Ala Phe Ala Tyr

65 70 75 80

Ser Val Lys Ser Arg Asp Arg Lys Met Val Gly Asp Val Thr Gly Ala

85 90 95

Gln Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Lys Cys Leu Asn Ile Trp Ala Leu Ile

100 105 110

Leu Gly Ile Leu Met Thr Ile Leu Leu Ile Val Ile Pro Val Leu Ile

115 120 125

Phe Gln Ala Tyr Gly

130

<210> 7

<211> 1497

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

atgacagttt tcctttcctt tgctttcctc gctgccattc tgactcacat agggtgcagc 60

aatcagcgcc gaagtccaga aaacagtggg agaagatata accggattca acatgggcaa 120

tgtgcctaca ctttcattct tccagaacac gatggcaact gtcgtgagag tacgacagac 180

cagtacaaca caaacgctct gcagagagat gctccacacg tggaaccgga tttctcttcc 240

cagaaacttc aacatctgga acatgtgatg gaaaattata ctcagtggct gcaaaaactt 300

gagaattaca ttgtggaaaa catgaagtcg gagatggccc agatacagca gaatgcagtt 360

cagaaccaca cggctaccat gctggagata ggaaccagcc tcctctctca gactgcagag 420

cagaccagaa agctgacaga tgttgagacc caggtactaa atcaaacttc tcgacttgag 480

atacagctgc tggagaattc attatccacc tacaagctag agaagcaact tcttcaacag 540

acaaatgaaa tcttgaagat ccatgaaaaa aacagtttat tagaacataa aatcttagaa 600

atggaaggaa aacacaagga agagttggac accttaaagg aagagaaaga gaaccttcaa 660

ggcttggtta ctcgtcaaac atatataatc caggagctgg aaaagcaatt aaacagagct 720

accaccaaca acagtgtcct tcagaagcag caactggagc tgatggacac agtccacaac 780

cttgtcaatc tttgcactaa agaaggtgtt ttactaaagg gaggaaaaag agaggaagag 840

aaaccattta gagactgtgc agatgtatat caagctggtt ttaataaaag tggaatctac 900

actatttata ttaataatat gccagaaccc aaaaaggtgt tttgcaatat ggatgtcaat 960

gggggaggtt ggactgtaat acaacatcgt gaagatggaa gtctagattt ccaaagaggc 1020

tggaaggaat ataaaatggg ttttggaaat ccctccggtg aatattggct ggggaatgag 1080

tttatttttg ccattaccag tcagaggcag tacatgctaa gaattgagtt aatggactgg 1140

gaagggaacc gagcctattc acagtatgac agattccaca taggaaatga aaagcaaaac 1200

tataggttgt atttaaaagg tcacactggg acagcaggaa aacagagcag cctgatctta 1260

cacggtgctg atttcagcac taaagatgct gataatgaca actgtatgtg caaatgtgcc 1320

ctcatgttaa caggaggatg gtggtttgat gcttgtggcc cctccaatct aaatggaatg 1380

ttctatactg cgggacaaaa ccatggaaaa ctgaatggga taaagtggca ctacttcaaa 1440

gggcccagtt actccttacg ttccacaact atgatgattc gacctttaga tttttga 1497

<210> 8

<211> 1497

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

atgacagttt tcctttcctt tgctttcctc gctgccattc tgactcacat agggtgcagc 60

aatcagcgcc gaagtccaga aaacagtggg agaagatata accggattca acatgggcaa 120

tgtgcctaca ctttcattct tccagaacac gatggcaact gtcgtgagag tacgacagac 180

cagtacaaca caaacgctct gcagagagat gctccacacg tggaaccgga tttctcttcc 240

cagaaacttc aacatctgga acatgtgatg gaaaattata ctcagtggct gcaaaaactt 300

gagaattaca ttgtggaaaa catgaagtcg gagatggccc agatacagca gaatgcagtt 360

cagaaccaca cggctaccat gctggagata ggaaccagcc tcctctctca gactgcagag 420

cagaccagaa agctgacaga tgttgagacc caggtactaa atcaaacttc tcgacttgag 480

atacagctgc tggagaattc attatccacc tacaagctag agaagcaact tcttcaacag 540

acaaatgaaa tcttgaagat ccatgaaaaa aacagtttat tagaacataa aatcttagaa 600

atggaaggaa aacacaagga agagttggac accttaaagg aagagaaaga gaaccttcaa 660

ggcttggtta ctcgtcaaac atatataatc caggagctgg aaaagcaatt aaacagagct 720

accaccaaca acagtgtcct tcagaagcag caactggagc tgatggacac agtccacaac 780

cttgtcaatc tttgcactaa agaaggtgtt ttactaaagg gaggaaaaag agaggaagag 840

aaaccattta gagactgtgc agatgtatat caagctggtt ttaataaaag tggaatctac 900

actatttata ttaataatat gccagaaccc aaaaaggtgt tttgcaatat ggatgtcaat 960

gggggaggtt ggactgtaat acaacatcgt gaagatggaa gtctagattt ccaaagaggc 1020

tggaaggaat ataaaatggg ttttggaaat ccctccggtg aatattggct ggggaatgag 1080

tttatttttg ccattaccag tcagaggcag tacatgctaa gaattgagtt aatggactgg 1140

gaagggaacc gagcctattc acagtatgac agattccaca taggaaatga aaagcaaaac 1200

tataggttgt atttaaaagg tcacactggg acagcaggaa aacagagcag cctgatctta 1260

cacggtgctg atttcagcac taaagatgct gataatgaca actgtatgtg caaatgtgcc 1320

ctcatgttaa caggaggatg gtggtttgat gcttgtggcc cctccaatct aaatggaatg 1380

ttctatactg cgggacaaaa ccatggaaaa ctgaatggga taaagtggca ctacttcaaa 1440

gggcccagtt actccttacg ttccacaact atgatgattc gacctttaga tttttag 1497

<210> 9

<211> 498

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His

1 5 10 15

Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg

20 25 30

Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro

35 40 45

Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr

50 55 60

Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met

100 105 110

Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu

115 120 125

Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys

130 135 140

Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln

165 170 175

Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser

180 185 190

Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu

195 200 205

Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr

210 215 220

Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala

225 230 235 240

Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp

245 250 255

Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu

260 265 270

Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp

275 280 285

Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile

290 295 300

Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn

305 310 315 320

Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp

325 330 335

Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser

340 345 350

Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln

355 360 365

Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg

370 375 380

Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn

385 390 395 400

Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser

405 410 415

Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn

420 425 430

Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp

435 440 445

Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala

450 455 460

Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu

485 490 495

Asp Phe

<210> 10

<211> 204

<212> DNA

<213> 巨细胞病毒

<400> 10

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agct 204

<210> 11

<211> 304

<212> DNA

<213> 巨细胞病毒

<400> 11

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catg 304

<210> 12

<211> 508

<212> DNA

<213> 巨细胞病毒

<400> 12

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480

acggtgggag gtctatataa gcagagct 508

Claims (44)

1.一种间充质干细胞(MSC)，其经过基因修饰以过表达血管生成素-1(ANGPT1)多肽和INF诱导的跨膜(IFITM)多肽。

2.根据权利要求1所述的MSC，其中所述MSC表达重组ANGPT1多肽。

3.根据权利要求2所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含与SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含与SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的MSC，其中所述重组ANGPT1多肽包含SEQ ID NO：9的残基16至498的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的MSC，其中所述MSC包含第一外源核酸，所述第一外源核酸包含能操作地连接至启动子或启动子/增强子组合的ANGPT1多肽编码区。

7.根据权利要求6所述的MSC，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。

8.根据权利要求6所述的MSC，其中所述启动子/增强子组合是CMV启动子/增强子组合。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的MSC，其中所述ANGPT1多肽编码区包含与SEQ IDNO：7或8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的MSC，其中所述ANGPT1多肽编码区包含SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的MSC，其中所述MSC表达重组IFITM多肽。

12.根据权利要求11所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽是重组IFITM1或IFITM3多肽。

13.根据权利要求12所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含与SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

14.根据权利要求13所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含与SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求14所述的MSC，其中所述重组IFITM多肽包含SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的MSC，其中所述MSC包含第二外源核酸，所述第二外源核酸包含能操作地连接至第二启动子或启动子/增强子组合的IFITM多肽编码区。

17.根据权利要求16所述的MSC，其中所述第二启动子是CMV启动子。

18.根据权利要求16所述的MSC，其中所述第二启动子/增强子组合是CMV启动子/增强子组合。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含与SEQID NO：1、2、4或5的序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

20.根据权利要求19所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含与SEQ ID NO：1、2、4或5的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

21.根据权利要求20所述的MSC，其中所述IFITM多肽编码区包含SEQ ID NO：1、2、4或5的核苷酸序列。

22.根据权利要求6至21中任一项所述的MSC，其中所述第一和/或第二外源核酸包含在载体或质粒中。

23.根据权利要求22所述的MSC，其中所述第一和第二外源核酸包含在同一载体或质粒中。

24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的MSC和药学上可接受的赋形剂。

25.根据权利要求1至23中任一项所述的MSC或根据权利要求24所述的药物组合物，其作为药物供使用。

26.根据权利要求25所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述药物用于预防或治疗受试者的病毒性疾病。

27.根据权利要求26所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

28.根据权利要求26或27所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述受试者是人。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

30.根据权利要求26-28中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

31.根据权利要求26-30中任一项所述的供使用的MSC或药物组合物，其中所述MSC用于施用到肺中。

32.一种用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的MSC或根据权利要求24所述的药物组合物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述受试者是人。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

36.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中将所述MSC施用到所述受试者的肺中。

38.权利要求1至23中任一项所述的MSC或根据权利要求24所述的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的药物中的用途。

39.根据权利要求1至23中任一项所述的MSC或根据权利要求24所述的药物组合物用于预防或治疗受试者的病毒性疾病的用途。

40.根据权利要求38或39所述的用途，其中所述病毒性疾病是COVID-19或流感。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

42.根据权利要求38-41中任一项所述的用途，其中所述MSC对于所述受试者是同种异体的。

43.根据权利要求38-41中任一项所述的用途，其中所述MSC对于所述受试者是自体的。

44.根据权利要求38-43中任一项所述的用途，其中所述MSC用于施用到肺中。