CN108486152B - 转基因猪的培育方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种转基因猪的培育方法。所述转基因猪的培育方法至少包括将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使其诱导为RNA诱导性多能干细胞；在Cas9‑gRNA和CRE同源重组酶的作用下，敲除猪有毒基因的同时敲入若干个人基因片段，采用人源vWF基因原位替换猪内源vWF基因，获得PERV病毒灭活、且无人免疫排斥和凝血不兼容的基因；筛选出没有脱靶效应的干净中靶细胞系并将其培养成猪体细胞；采用体细胞核转移技术处理猪体细胞获得转基因猪。本发明获得的转基因猪具有PERV病毒永久性无法表达、对人体无免疫排斥和凝血兼容等优点，可用作人异源器官、组织、细胞的供体。

Description

转基因猪的培育方法和应用

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种转基因猪的培育方法和应用。

背景技术

器官移植是人体晚期器官衰竭的一种有效治疗手段，但是严重受限于供体器官的短缺，每年大量的人在等待器官的时候死去。此外，高昂的器官移植费用也限制了人体器官移植手术实施的数量。在解决供体器官数量以及器官移植费用方面，人们想到了异源移植，也就是考虑采用其他动物的相应器官移植至需要器官移植的人体内。在众多的动物器官中，猪器官的大小及生理功能同人相仿，因此，被公认为异种移植的最佳供体。但是，猪中存在猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)，这种PERV病毒是一种整合在猪基因组中的逆转录病毒，存在每个猪细胞中，并可以进入猪生殖细胞系稳定遗传。猪细胞可以释放病毒感染多种类型的人细胞，因此，PERV感染问题已经成为临床异种器官移植的主要问题。

此外免疫排斥和凝血不兼容亦是临床异种移植的重要障碍。猪的每个细胞都表达半乳糖抗原，会被人血中预存的抗体识别，并激活人补体系统，导致植入人体内的猪体移植物在数分钟和数小时内被排斥而失去功能。同时猪和人的凝血系统存在不兼容，例如人的血小板会被猪源的vWF因子识别而激活，导致人接受猪体移植物后的凝血异常，在人体内发生弥漫性血管内凝血而危及病人的生命。

上述障碍发生的根源在于猪的基因组序列同人的基因组存在巨大差异，在猪用于临床移植之前或者其他应用前必须对其进行基因改造，必须敲除有毒基因和敲入相应的人源性基因。

为解决目前猪体移植物存在的上述问题，申请号为200680012602.2的中国专利提供一种繁育不携带传染性微生物且PERV的拷贝数在0～30之间的猪种群的方法，具体为(a)筛选具有有益的微生物谱的雄性和雌性的奥克兰岛猪；(b)将(a)筛选的雄性和雌性猪进行交配；(c)筛选(b)产生的携带有益微生物谱且PERV的拷贝数在0～30之间的后代；由此，将(c)筛选的后代适合用于异种移植。该方法采用生物优生优育的生物进化方式获得携带有有益微生物谱且PERV的拷贝数在0～30的猪作为异种移植的主体，这种方式并不能彻底避免PERV发生变异而表达，而且筛选过程繁琐复杂。

而申请号为201510489709.7的中国专利申请提供一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，具体采用如下方式获肝细胞，(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；(4)提取所述转基因猪的肝细胞。该方法通过RNA干扰技术和CRIPRS/Cas9技术相结合，既实现了对PERV的转录前敲除，又抑制了PERV的转录后表达，有效降低了转基因猪体细胞的PERV的活性。但是，首先，这种方法获得的肝细胞，将多个gRNA和Cas9蛋白的DNA载体转染入猪细胞随机破坏PERV的序列，一方面通过此方法敲除PERV序列是完全随机并不可预测的，有可能会在基因组中产生新突变，另一方面，由于猪基因组中PERV序列存在多个拷贝数(甚至高达40多个拷贝)，此方法并不能彻底敲除所有PERV拷贝。siRNA在此专利中采用的是质粒载体瞬时表达的方法，此方法无法永久抑制PERV的转录后表达，并且siRNA并未整合入猪基因组，因此无法遗传给后代。此专利只是降低PERV表达或者可能达到不表达的效果，但会导致生物安全事故；其次，无法克服移植过程中存在的人免疫和凝血不兼容困难；第三，这种方法在核转移过程中，成纤维细胞由于端粒长度的极限和细胞老化等问题，增生和分裂能力相当有限，克隆率低下，无法进行复杂的基因编辑，导致对猪细胞的基因改造不彻底。

此外，当前进行克隆猪制备时，主要依赖猪原代成纤维细胞的核转移方法进行克隆，也就是在体外重构胚胎后植入代孕母猪。但是，这种方法中，猪的原代成纤维细胞由于端粒长度的极限以及存在细胞老化等问题，增生和分裂的能力相当的有限，因此并不能进行复杂的基因编辑。而猪的诱导性多能干细胞(inducible pluripotent stem cells，iPS)具有无限增生的能力，也有现在生产活猪个体的能力，但是，目前的猪iPS进行克隆时，形成胚胎的效率极低，其主要原因在于目前的猪iPS是通过慢病毒方法导入细胞重编程的开关基因(如Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28)而制备，这种方法将这些重编程的开关机因随机插入细胞的基因组，拷贝数无法预测，并且永久表达，使得猪iPS永久性出于多潜能干性状态，无法形成胚胎。而且猪iPS或者成纤维细胞在核转移过程中由于囊胚注射后大部分细胞很快出现凋亡，克隆率低。

发明内容

本发明针对现有人-猪异体移植物存在的PERV病毒表达、人免疫排斥及凝血不兼容等问题，以及现有解决上述问题中筛选过程繁琐、克隆率低下、基因改造不彻底、猪iPS无法形成胚胎等问题，提供一种转基因猪的培育方法。

进一步地，本发明还提供上述转基因猪的培育方法培育的转基因猪的用途。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种转基因猪的培育方法，至少包括以下步骤：

步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使所述猪原代体细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；

步骤S02.在Cas9-gRNA的作用下将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以达到破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路蛋白的基因，记为基因I；

步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；

步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；

步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞；

步骤S06.采用体细胞核转移技术处理所述猪体细胞获得转基因猪。

相应地，一种猪器官或组织或细胞，所述猪器官或者组织或者细胞取自如上所述的转基因猪的培育方法培育得到的转基因猪中。

以及，所述猪器官或组织或细胞在人异源供体领域中的用途。

本发明的有益效果在于：相对于现有技术，本发明的转基因猪的培育方法，一方面，采用非病毒非DNA非基因组整合的方式，导入细胞重编程的开关基因，使得获得的RNA诱导性多能干细胞能够在适当的条件下可以分化，确保猪诱导多能干细胞克隆成为现实；另一方面，采用同源重组系统定点敲除猪有害基因片段，同时定点敲入多个人基因片段，实现彻底对PERV进行灭活和敲除猪Asgr基因、多个猪半乳糖抗原基，同时原位替换猪内源vWF基因，从而获得全新的转基因猪。

由于本发明上述方法培育的转基因猪，具有PERV病毒永久性无法表达、对人体无免疫排斥和凝血兼容等优点，因此可以将获得的转基因猪的器官或者组织或者细胞用于人异源供体领域中，具体可用于器官移植或组织移植或细胞移植中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明PERV在猪成纤维克隆细胞1、2、3、4及野生型猪成纤维细胞、阴性对照细胞中的拷贝数对比示意图；

图2为本发明体外逆转录酶活性实验示意图；

图3为本发明体外混合人血预存抗体与人IgM结合的定性分析示意图；

图4为本发明体外混合人血预存抗体与人IgG结合的定性分析示意图；

图5为本发明体外混合人血预存抗体与人IgM、IgG结合的定量分析示意图；图6为本发明人体补体细胞毒性实验定性分析示意图；

图7为本发明人补体细胞毒性实验定量分析示意图；

图8为本发明人自然杀伤细胞毒性实验定性分析示意图；

图9为本发明人自然杀伤细胞毒性实验定量分析示意图；

图10为本发明基因敲除后转基因猪乳糖抗原基因表达示意图；

图11、12为本发明基因敲入后转基因猪人源基因表达示意图；

图13为本发明人巨噬细胞吞噬实验定性分析示意图；

图14为本发明人巨噬细胞吞噬实验定量分析示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种转基因猪的培育方法。所述转基因猪的培育方法至少包括以下步骤：

步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和miR302/367簇，使所述猪原代体细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；

步骤S02.在Cas9-gRNA的作用下将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以达到破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路蛋白的基因，记为基因I；

步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；

步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；

步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞；

步骤S06.采用体细胞核转移技术处理所述猪体细胞获得转基因猪。

下面对本发明的培育方法做详细的解释说明：

步骤S01中，将猪原代体细胞导入信使RNA(mRNA)编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，通过这种方式，使得猪原代体细胞被诱导成RNA诱导性多能干细胞。具体地，细胞重编程开关基因为Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Lin28中的至少一种。该过程，可以同时将细胞重编程开关基因与miR302/367簇加入，也可以单独加入其中之一，比如单独加入mRNA编码的细胞重编程开关基因，或者单独加入miR302/367簇。由于mRNA、miR302/367完全没有整合到基因组的可能性，外源性细胞重编程开关基因及miR302/367在细胞变成多能干细胞后停止表达，在适当的条件下生成的多能干细胞可以发生分化，进而形成胚胎，使得以猪iPS细胞进行猪的克隆成为现实。

上述涉及的猪原代体细胞，可以是猪原代成纤维细胞，也可以是猪的其他原代体细胞。

步骤S02～S03中，采用Loxp-Lox2272同源重组系统和Cas9-gRNA系统定点插入人大片段基因。具体来说，Loxp-Lox2272同源重组系统在Cas9-gRNA系统的引导下，在猪内源性逆转录病毒序列、半乳糖抗原基因序列关键编码区表达若干个人源基因，在破坏猪内源性逆转录病毒序列、半乳糖抗原基因序列等的同时表达人源基因，从而实现高效地、多层面地综合改造猪基因，使获得的改造后的猪基因与人体高度兼容。通过采用人源vWF基因原位替换猪内源vWF基因后，使得改造后的基因获得的猪器官、组织、细胞在移植至人体时，不会发生凝血系统的不兼容问题。具体是，在Cas9-gRNA的作用下，将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝(例如，大约25到28个拷贝)，彻底破坏猪基因组PERV病毒序列的同时插入人源基因的位点，并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列(例如，大约25到28个拷贝中的一个拷贝序列)。

其中所涉及的第一DNA载体、第二DNA载体、第三DNA载体，均含有Loxp位点和Lox2272位点。也就是说，所述第一DNA载体的一端含有Loxp位点，另一端含有Lox2272位点、同理，第二DNA载体、第三DNA载体的端部与第一DNA载体有相同的位点，以方便基因片段的识别与整合。

其中，人源基因包括人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、自然杀伤细胞激活通路负性蛋白等。

优选地，所述人补体调节蛋白为CD46、CD55、CD59中的至少一种；所述人免疫细胞激活通路负性蛋白为CTLA-4、PD-L1、PD-L2中的至少一种；所述凝血激活通路负性调节蛋白为CD39、EPCR中的至少一种；所述人巨噬细胞激活通路负性蛋白为CD47；所述人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白为B2M、HLAE中的至少一种。

优选地，所述第一DNA载体为pBP-CD46、pBP-CD55、pBP-CD59中的任一种；所述第二DNA载体为pBP-CTLA-4、pBP-PD-L1、pBP-CD39、pBP-EPCR、pBP-CD47中的任一种；所述第三DNA载体为pBP-B2M、pBP-HLAE、pBP-FAT-1、pBP-TNFα、pBP-Factor VII中的任一种。

各相应的人基因片段，胶回收后Golden gate反应。反应体系：BsmB I或者BSPQI0.75μL，T7ligase 0.25μL，Tango buffer 1μL，DTT(10mmol/L)1μL，ATP(10mmol/L)1μL，混合片段2μL(60ng/μL)，灭菌超纯水补齐体积至10μL。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Golden gate产物转化DH5ɑ感受态细菌，涂板。

其中，所述第三DNA载体中还组装有细胞保护基因，所述细胞保护基因为FAT-1、肿瘤坏死因子α受体中的任一种。

在具体的人源vWF基因片段原位替换猪vWF基因过程中，首先将人源vWF基因片段与载体进行构建，获得组装有人源vWF基因片段的载体，优选地，所述人源vWF基因片段的载体为pBP-vWF。

具体地，第一载体pBP-CD46改造后的猪基因序列如SEQ No.1所示；

第一载体pBP-CD55改造后的猪基因序列如SEQ No.2所示；

第一载体pBP-CD59改造后的猪基因序列如SEQ No.3所示；

第二载体pBP-CD39改造后的猪基因序列如SEQ No.4所示；

第二载体pBP-CD47改造后的猪基因序列如SEQ No.5所示；

第二载体pBP-CTLA-4改造后的猪基因序列如SEQ No.6所示；

第二载体pBP-EPCR改造后的猪基因序列如SEQ No7所示；

第二载体pBP-PD-L1改造后的猪基因序列如SEQ No.8所示；

第三载体pBP-B2M改造后的猪基因序列如SEQ No.9所示；

第三载体pBP-Factor VII改造后的猪基因序列如SEQ No.10所示；

第三载体pBP-FAT-1改造后的猪基因序列如SEQ No.11所示；

第三载体pBP-HLAE改造后的猪基因序列如SEQ No.12所示；

第三载体pBP-TNFα改造后的猪基因序列如SEQ No.13所示；

敲除CMAH基因4号外显子区域后的猪基因序列如SEQ No.14所示；

敲除B4GALNT2基因2号外显子区域后的猪基因序列如SEQ No.15所示；

敲入人源vWF基因后的猪基因序列如SEQ No.16所示。

在一般的方法中，受制于猪原代成纤维细胞的增生能力，在处理过程中，都只能敲入1～2个基因，处理单方面或者单层次的问题，但是，本发明通过上述方法，将敲入人基因片段和敲除猪有毒基因同时完成，同时实现去除PERV活性、敲除多个半乳糖抗原基因，敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、自然杀伤细胞激活通路负性蛋白等，原位替换凝血因子vWF因子等，从而实现一次性全方位、多层次处理猪-人异种移植的生物安全问题、免疫排斥和凝血不兼容的问题。

再经过步骤S04～05，得到猪体细胞。在获得猪体细胞之前，需要将基因编辑处理筛选得到的干净中靶细胞系直接或者定向分化成心肌细胞或者成纤维细胞等非干细胞。然后在导入BCL-2(B淋巴细胞瘤-2基因)和miR-125的情况下，进行核转移，获得胚胎。取胚胎分化得到的胚胎成纤维细胞在导入BCL-2和miR-125的情况下至少进行2次克隆，获得多对雌性、雄性活体猪。

在上述过程中，BCL-2和miR-125对降低猪iPS的凋亡率起到至关重要的作用，可以大幅度降低凋亡率，从而大幅度提高猪克隆率。

本发明的转基因猪，猪内源性逆转录病毒、半乳糖抗原、vWF凝血因子的基因已经被改造，从该转基因猪中获得的猪器官、组织、细胞移植至人体时，不再发生PERV感染，也不存在免疫排斥及凝血不兼容问题，因此，本发明获得的转基因猪可以作为异种组织和器官移植(如皮肤、角膜、软骨、骨、肝脏、肾脏、心脏、胰脏、血管等)的供体。当然，获得的转基因猪也可以作为其他临床前及临床疾病模型研究，还可以用于医用敷料、药物鉴定。此外，本发明获得的转基因猪，除了可以作为猪-人异源移植的供体之外，也可以作为食用猪，还可以用于做猪饲料、兽药开发的实验性猪。

为了验证本发明转基因猪的培育方法，培育得到的细胞的性能，下面通过多个实验进行验证。

(一).PERV拷贝数

将本发明获得的转基因猪成纤维细胞，如猪成纤维克隆细胞1、猪成纤维克隆细胞2、猪成纤维克隆细胞3、猪成纤维克隆细胞4和野生型猪成纤维细胞(未经基因改造)、阴性对照(采用三个独立的参考基因：ACTB、GAPDH、EB2，n＝3)进行PERV拷贝数的测定，测定结果如图1所示。

从图1中可知，CRISPR-Cas9敲除后PERV拷贝数发生了变化，经过CRISPR-Cas9敲除后的猪成纤维克隆细胞1、2、3、4号克隆中，DD PCR结果显示PERV拷贝数为零，说明、PERV已经完全从基因组中敲除，而野生型猪成纤维细胞的拷贝数最高，达到大约25个。

(二).体外逆转录酶活性实验

采用本发明获得的转基因猪成纤维细胞、野生型猪成纤维细胞进行体外逆转录酶活性实验试验。设计如下四组实验：

其中，

第1组：阳性对照，逆转录酶(RT)+来自野生型猪成纤维细胞培养液中的病毒颗粒；

第2组：阳性对照，野生型猪成纤维细胞的裂解液；

第3组：实验组，100％PERV敲除的猪成纤维细胞的裂解液；

第4组：阴性对照组无PERV病毒模板的逆转录反应。实验结果如图2。

从图2可知，第3组转基因猪成纤维细胞的上清液中，没有产生PERV病毒，而第1组和第2组的野生型猪成纤维细胞的上清液中明显有逆转录-聚合酶链反应活性，也就是具有PERV颗粒的逆转录酶活性。从中可知，本发明获得的转基因猪成纤维已经实现100％的PERV病毒的灭活，使其无法表达。

(三).体外混合人血预存抗体结合量实验验证

原理：人血清预存抗体会识别并结合猪细胞膜上相应的半乳糖抗原，利用特异识别人抗体的IgG和IgM流式细胞仪第二荧光抗体判定上述抗体-抗原结合程度，以此检测人与猪之间超急性免疫排斥反应。

实验原料：混合人血清(200人)，-70℃储备用；用前半小时取出室温融化；

猪细胞悬液(包括转基因猪细胞悬液和野生型猪细胞悬液)；

特异性识别人抗体的IgG和IgM流式细胞仪第二荧光抗体。

实验方法：(1)自-70℃冰箱中取出上述混合人血清，在室温下融化后56℃处理30min，灭活补体后用生理盐水按1:2进行稀释；

(2)将待检的大约0.5或1百万猪细胞如猪成纤维细胞同上述50％混合人血清充分混合后，室温下孵育60min；

(3)常规1000转离心后400μL生理盐水重悬细胞；

(4)按照1:200比例加入特异性识别的IgG和IgM流式细胞仪第二荧光抗体室温下培养15min；

(5)按照步骤(3)方法，采用生理盐水洗脱2遍后，用400μL生理盐水重悬细胞；

(6)流式细胞仪检测带有特异识别人抗体的IgG和IgM荧光细胞的比例和荧光强度。加入DNA染料碘化丙啶(PI)室温下培养60min；

(4)流式细胞仪检查细胞存活百分率。具体测试结果如图3、图4、图5所示。

从图3可知，IgM抗体特异性结合时，野生型猪成纤维细胞、转基因猪成纤维细胞、人成纤维细胞均会出现特异性结合，但是野生型猪成纤维细胞糖蛋白抗原与IgM的结合最强，其与人之间超急性免疫排斥反应也最强，本发明获得的转基因猪成纤维细胞的结合次之，而人成纤维细胞结合程度最弱，可以作为阴性对照，因为人与人之间没有超急性免疫排斥反应，说明本发明获得的转基因猪的细胞出现的超急性免疫排斥反应得到很好的改善。

从图4同样可知，IgG抗体特异性结合时，野生型猪成纤维细胞、转基因猪成纤维细胞、人成纤维细胞均会出现特异性结合，但是野生型猪成纤维细胞糖蛋白抗原与IgM的结合最强，其与人之间超急性免疫排斥反应也最强，本发明获得的转基因猪成纤维细胞的结合次之，而人成纤维细胞结合程度最弱，可以作为阴性对照，因为人与人之间没有超急性免疫排斥反应，说明本发明获得的转基因猪的细胞出现的超急性免疫排斥反应得到很好的改善。

从图5可知，左侧三个柱图为IgG抗体结合程度示意图，从图中可知，IgG流式细胞仪第二荧光抗体对野生型猪成纤维的细胞结合程度最高，达到75％及以上，转基因猪成纤维的结合程度较低，而人成纤维的结合程度最低；右侧三个柱图为IgG抗体结合程度示意图，从图中可知，IgM流式细胞仪第二荧光抗体对野生型猪成纤维的细胞结合程度最高，达到50％及以上，转基因猪成纤维的结合程度较低，而人成纤维的结合程度最低。

(四).人体补体细胞毒性实验

转基因猪成纤维细胞去除了抗原和表达人补体负性调控蛋白，从而抵抗人补体毒性。补体介导的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity test.)的原理是人血预存抗体与猪细胞膜上相应抗原结合后，补体激活，可以产生细胞膜损伤，细胞死亡。利用DNA染料实验判定猪细胞死活状态，死细胞着色，再使用流式细胞仪测定染色阳性细胞比例作为猪细胞死亡程度的量化指标。细胞死亡后会被DNA染料(如碘化丙啶，PI)染上颜色，因此PI信号越强，说明细胞死亡率越高。从图6可知，野生型猪成纤维细胞出现PI信号最靠右边，说明细胞死亡率最高，转基因猪成纤维细胞的死亡率次之，人成纤维细胞最靠左边，这与图7的结果相一致，图6定性分析细胞死亡情况，图7定量分析细胞死亡达到80％及以上，转基因猪成纤维细胞的死亡情况较弱，在图6中PI信号偏左侧，图7中则显示细胞死亡率为20％左右，而人成纤维细胞的死亡率最低，在图6表示则PI信号最靠近左边，而图7则显示死亡率低于7％。

(五).人自然杀伤细胞毒性实验

实验原理：在体外将人自然杀伤细胞同猪细胞混合，猪细胞膜上的分子例如猪主要组织相容性复合物I类分子可以激活自然杀伤细胞，活化后攻击猪细胞，引起细胞膜破损，导致细胞膜出现小孔，细胞死亡。利用DNA染料实验判定猪细胞死活状态，此时荧光染料可以通过细胞膜进入细胞内使死细胞被着色，通过流式细胞仪测定染色阳性细胞比例作为猪死亡程度的量化指标。细胞死亡后会被DNA染料染上颜色，因此PI信号越强(图8中X轴越往右)说明细胞死亡率越高。

实验原料：人自然杀伤细胞置于-70℃条件下储存备用，用前24h取出室温融化后培养；同时准备猪细胞悬液(包括转基因猪细胞悬液和野生型猪细胞悬液)；

实验方法：(1)自-70℃冰箱中取出人自然杀伤细胞0.5或1百万后常规5％二氧化碳细胞培养箱中培养24h；

(2)待检测的猪成纤维细胞同上述人自然杀伤细胞的比例为人自然杀伤细胞：猪细胞10～20:1；

(3)加入DNA染料碘化丙啶(PI)后常规5％二氧化碳细胞培养箱培养4h；

(4)流式细胞仪检查细胞存活百分率，具体测试结果如图8、9所示。

从图8可知，野生型猪成纤维细胞的PI信号最强，说明野生型猪成纤维细胞的死亡率最高，而转基因猪成纤维细胞的PI信号强度介于野生型猪成纤维细胞和人成纤维细胞之间，说明经过本发明方法获得的转基因猪成纤维细胞出现了表达人HLAE而能够抵抗人自然杀伤细胞的毒性。

从图9可知，野生型猪成纤维细胞的死亡率最高，超过60％，而转基因猪成纤维细胞的死亡率低于30％，作为对照的人成纤维细胞死亡率同样低于30％，而K562细胞死亡率超过60％，说明本发明方法获得的转基因猪的成纤维细胞表达人HLAE从而抵抗人自然杀伤细胞毒性。

(六).转基因猪成纤维细胞乳糖抗原实验

将待荧光标记的乳糖抗原(CGTA)抗体标记细胞，然后采用流式细胞检测信号的强度，信号越强，峰值越向右，测试结果如图10所示。

从图10可知，经过本发明获得的转基因猪成纤维细胞的其峰值位置相对于野生型猪成纤维细胞的峰值位置偏左，说明经过本发明敲除基因后得到的猪成纤维细胞表达低水平的乳糖抗原。

(七).人源基因敲入后转基因猪人源基因表达水平实验

通过带APC标记的蛋白抗体标记细胞(如CD46、CD55、CD59、CD47、CD39、THBD、PLD1、HLAE)，然后采用流式细胞仪检测信号强度，信号越强，峰值越靠右，同型抗体是非特异性识别，作为阴性对照具体测试结果如图11、图12所示。

从图11和图12可知，本发明方法获得的转基因猪成纤维细胞，由于敲入人类基因而表达高水平的人源基因CD46、CD55、CD59、CD47、CD39、THBD、PLD1、HLAE等，而阴性对照组则出现低表达水平。

(八).人巨噬细胞吞噬实验

实验原理：人自然杀伤细胞与凋亡猪细胞相遇后，凋亡的猪细胞会释放信号分子可以激活人巨噬细胞，吞噬猪细胞膜。利用非特异性细胞荧光染料例如CFSE染色猪细胞，人巨噬细胞吞噬荧光标记的猪细胞后荧光信号，再使用流式细胞仪测定染色阳性细胞比例作为猪细胞被吞噬程度的量化指标。

材料：1.人巨噬细胞-70℃储存备用，用前24h取出室温融化后培养。

2.猪细胞悬液(包括转基因猪细胞悬液和野生型猪细胞悬液)。

实验方法：

(1).自-70℃冰箱中取出人巨噬细胞细胞0.5或1百万后常规5％二氧化碳细胞培养箱培养24h；

(2).将待检的猪细胞用荧光染料CFSE染色标记；

(3).将CFSE标记好的猪成纤维细胞同上述人巨噬细胞按人巨噬细胞细胞：猪细胞10-20:1的比例混合；

(4).常规5％二氧化碳细胞培养箱培养4h；

(5).流式细胞仪检查细胞存活百分率，测试结果如图13和图14。

从图13可知，CD14是巨噬细胞的特异标记，CFSE是猪细胞标记，巨噬细胞吞噬了CFSE染色的猪细胞后也就是有CFSE的信号，而未被吞噬的猪细胞则不带CD14标记。被人巨噬细胞吞噬的猪细胞越多，信号越靠左图的右上方，反之亦然。结果显示，转基因猪成纤维细胞表达人CD47而抵抗人巨噬细胞吞噬，其信号集中表现在左下方的黑色点，而野生型猪成纤维细胞则被巨噬细胞吞噬，因此其信号集中表现在右上方的灰色点，图13的显示结果与图14的显示结果相一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 转基因猪的培育方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2023

<212> DNA

<213> 经第一载体 pBP-CD46改造后的猪基因序列信息

<400> 1

cgttggtcat ccatcggtct gggggctgcc gaacgatgtt ctccaacgca tataacttcg 60

tatagcatac attatacgaa gttatgtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 120

atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 180

gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 240

gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 300

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 360

ccgatccagc ctccggactc tagaggatcg aacccttgcg gccgctatgg agcctcccgg 420

ccgccgcgag tgtccctttc cttcctggcg ctttcctggg ttgcttctgg cggccatggt 480

gttgctgctg tactccttct ccgatgcctg tgaggagcca ccaacatttg aagctatgga 540

gctcattggt aaaccaaaac cctactatga gattggtgaa cgagtagatt ataagtgtaa 600

aaaaggatac ttctatatac ctcctcttgc cacccatact atttgtgatc ggaatcatac 660

atggctacct gtctcagatg acgcctgtta tagagaaaca tgtccatata tacgggatcc 720

tttaaatggc caagcagtcc ctgcaaatgg gacttacgag tttggttatc agatgcactt 780

tatttgtaat gagggttatt acttaattgg tgaagaaatt ctatattgtg aacttaaagg 840

atcagtagca atttggagcg gtaagccccc aatatgtgaa aaggttttgt gtacaccacc 900

tccaaaaata aaaaatggaa aacacacctt tagtgaagta gaagtatttg agtatcttga 960

tgcagtaact tatagttgtg atcctgcacc tggaccagat ccattttcac ttattggaga 1020

gagcacgatt tattgtggtg acaattcagt gtggagtcgt gctgctccag agtgtaaagt 1080

ggtcaaatgt cgatttccag tagtcgaaaa tggaaaacag atatcaggat ttggaaaaaa 1140

attttactac aaagcaacag ttatgtttga atgcgataag ggtttttacc tcgatggcag 1200

cgacacaatt gtctgtgaca gtaacagtac ttgggatccc ccagttccaa agtgtcttaa 1260

agtgctgcct ccatctagta caaaacctcc agctttgagt cattcagtgt cgacttcttc 1320

cactacaaaa tctccagcgt ccagtgcctc aggtcctagg cctacttaca agcctccagt 1380

ctcaaattat ccaggatatc ctaaacctga ggaaggaata cttgacagtt tggatgtttg 1440

ggtcattgct gtgattgtta ttgccatagt tgttggagtt gcagtaattt gtgttgtccc 1500

gtacagatat cttcaaagga ggaagaagaa aggcacatac ctaactgatg agacccacag 1560

agaagtaaaa tttacttctc tctgaggcgc gccgcgaagg gttcgatccc taccggttag 1620

taatgagttt aaacggggga ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac 1680

ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg tcgtttgttc 1740

ataacttcgt ataggatact ttatacgaag ttatgggggg ctattacagt tatattctgt 1800

cccaaagtca atttgtcagc gtccttgacc agtatggcca cagctgcgat agccttcagg 1860

catacgggcc aaccactggc tacaggatcg agcttctttg acaggtaggc aacaggtctc 1920

ctccatggtc ctagggtttg ggttaaaact ccccgggcta ctcccttacg ctcatccaca 1980

taaagggtaa agggtttagt tacgtcaggg agggccagag cag 2023

<210> 2

<211> 1990

<212> DNA

<213> 经第一载体 pBP-CD55改造后的猪基因序列信息

<400> 2

cgttggtcat ccatcggtct gggggctgcc gaacgatgtt ctccaacgca tataacttcg 60

tatagcatac attatacgaa gttatgtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 120

atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 180

gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 240

gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 300

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 360

ccgatccagc ctccggactc tagaggatcg aacccttgcg gccgctatga ccgtcgcgcg 420

gccgagcgtg cccgcggcgc tgcccctcct cggggagctg ccccggctgc tgctgctggt 480

gctgttgtgc ctgccggccg tgtggggtga ctgtggcctt cccccagatg tacctaatgc 540

ccagccagct ttggaaggcc gtacaagttt tcccgaggat actgtaataa cgtacaaatg 600

tgaagaaagc tttgtgaaaa ttcctggcga gaaggactca gtgatctgcc ttaagggcag 660

tcaatggtca gatattgaag agttctgcaa tcgtagctgc gaggtgccaa caaggctaaa 720

ttctgcatcc ctcaaacagc cttatatcac tcagaattat tttccagtcg gtactgttgt 780

ggaatatgag tgccgtccag gttacagaag agaaccttct ctatcaccaa aactaacttg 840

ccttcagaat ttaaaatggt ccacagcagt cgaattttgt aaaaagaaat catgccctaa 900

tccgggagaa atacgaaatg gtcagattga tgtaccaggt ggcatattat ttggtgcaac 960

catctccttc tcatgtaaca cagggtacaa attatttggc tcgacttcta gtttttgtct 1020

tatttcaggc agctctgtcc agtggagtga cccgttgcca gagtgcagag aaatttattg 1080

tccagcacca ccacaaattg acaatggaat aattcaaggg gaacgtgacc attatggata 1140

tagacagtct gtaacgtatg catgtaataa aggattcacc atgattggag agcactctat 1200

ttattgtact gtgaataatg atgaaggaga gtggagtggc ccaccacctg aatgcagagg 1260

aaaatctcta acttccaagg tcccaccaac agttcagaaa cctaccacag taaatgttcc 1320

aactacagaa gtctcaccaa cttctcagaa aaccaccaca aaaaccacca caccaaatgc 1380

tcaagcaaca cggagtacac ctgtttccag gacaaccaag cattttcatg aaacaacccc 1440

aaataaagga agtggaacca cttcaggtac tacccgtctt ctatctgggc acacgtgttt 1500

cacgttgaca ggtttgcttg ggacgctagt aaccatgggc ttgctgactt agggcgcgcc 1560

gcgaagggtt cgatccctac cggttagtaa tgagtttaaa cgggggaggc taactgaaac 1620

acggaaggag acaataccgg aaggaacccg cgctatgacg gcaataaaaa gacagaataa 1680

aacgcacggg tgttgggtcg tttgttcata acttcgtata ggatacttta tacgaagtta 1740

tggggggcta ttacagttat attctgtccc aaagtcaatt tgtcagcgtc cttgaccagt 1800

atggccacag ctgcgatagc cttcaggcat acgggccaac cactggctac aggatcgagc 1860

ttctttgaca ggtaggcaac aggtctcctc catggtccta gggtttgggt taaaactccc 1920

cgggctactc ccttacgctc atccacataa agggtaaagg gtttagttac gtcagggagg 1980

gccagagcag 1990

<210> 3

<211> 1231

<212> DNA

<213> 经第一载体pBP-CD59改造后的猪基因序列信息

<400> 3

cgttggtcat ccatcggtct gggggctgcc gaacgatgtt ctccaacgca tataacttcg 60

tatagcatac attatacgaa gttatgtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 120

atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 180

gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 240

gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 300

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 360

ccgatccagc ctccggactc tagaggatcg aacccttgcg gccgctatgg gaatccaagg 420

agggtctgtc ctgttcgggc tgctgctcgt cctggctgtc ttctgccatt caggtcatag 480

cctgcagtgc tacaactgtc ctaacccaac tgctgactgc aaaacagccg tcaattgttc 540

atctgatttt gatgcgtgtc tcattaccaa agctgggtta caagtgtata acaagtgttg 600

gaagtttgag cattgcaatt tcaacgacgt cacaacccgc ttgagggaaa atgagctaac 660

gtactactgc tgcaagaagg acctgtgtaa ctttaacgaa cagcttgaaa atggtgggac 720

atccttatca gagaaaacag ttcttctgct ggtgactcca tttctggcag cagcctggag 780

ccttcatccc taaggcgcgc cgcgaagggt tcgatcccta ccggttagta atgagtttaa 840

acgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac 900

ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aacttcgtat 960

aggatacttt atacgaagtt atggggggct attacagtta tattctgtcc caaagtcaat 1020

ttgtcagcgt ccttgaccag tatggccaca gctgcgatag ccttcaggca tacgggccaa 1080

ccactggcta caggatcgag cttctttgac aggtaggcaa caggtctcct ccatggtcct 1140

agggtttggg ttaaaactcc ccgggctact cccttacgct catccacata aagggtaaag 1200

ggtttagtta cgtcagggag ggccagagca g 1231

<210> 4

<211> 2362

<212> DNA

<213> 经第二载体 pBP-CD39改造后的猪基因序列信息

<400> 4

taaactgcaa aatacagact agatgataat agcatattgt ctcctctaga aatcccagag 60

gttacattta ccccattctt ctttatttca gatacattga gcattacttg gaggagttct 120

taatatctgc aaatacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gtgatgcggt 180

tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 240

accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 300

gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 360

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 420

ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatcgaaccc 480

ttgcggccgc tatggaagat acaaaggagt ctaacgtgaa gacattttgc tccaagaata 540

tcctagccat ccttggcttc tcctctatca tagctgtgat agctttgctt gctgtggggt 600

tgacccagaa caaagcattg ccagaaaacg ttaagtatgg gattgtgctg gatgcgggtt 660

cttctcacac aagtttatac atctataagt ggccagcaga aaaggagaat gacacaggcg 720

tggtgcatca agtagaagaa tgcagggtta aaggtcctgg aatctcaaaa tttgttcaga 780

aagtaaatga aataggcatt tacctgactg attgcatgga aagagctagg gaagtgattc 840

caaggtccca gcaccaagag acacccgttt acctgggagc cacggcaggc atgcggttgc 900

tcaggatgga aagtgaagag ttggcagaca gggttctgga tgtggtggag aggagcctca 960

gcaactaccc ctttgacttc cagggtgcca ggatcattac tggccaagag gaaggtgcct 1020

atggctggat tactatcaac tatctgctgg gcaaattcag tcagaaaaca aggtggttca 1080

gcatagtccc atatgaaacc aataatcagg aaacctttgg agctttggac cttgggggag 1140

cctctacaca agtcactttt gtaccccaaa accagactat cgagtcccca gataatgctc 1200

tgcaatttcg cctctatggc aaggactaca atgtctacac acatagcttc ttgtgctatg 1260

ggaaggatca ggcactctgg cagaaactgg ccaaggacat tcaggttgca agtaatgaaa 1320

ttctcaggga cccatgcttt catcctggat ataagaaggt agtgaacgta agtgaccttt 1380

acaagacccc ctgcaccaag agatttgaga tgactcttcc attccagcag tttgaaatcc 1440

agggtattgg aaactatcaa caatgccatc aaagcatcct ggagctcttc aacaccagtt 1500

actgccctta ctcccagtgt gccttcaatg ggattttctt gccaccactc cagggggatt 1560

ttggggcatt ttcagctttt tactttgtga tgaagttttt aaacttgaca tcagagaaag 1620

tctctcagga aaaggtgact gagatgatga aaaagttctg tgctcagcct tgggaggaga 1680

taaaaacatc ttacgctgga gtaaaggaga agtacctgag tgaatactgc ttttctggta 1740

cctacattct ctccctcctt ctgcaaggct atcatttcac agctgattcc tgggagcaca 1800

tccatttcat tggcaagatc cagggcagcg acgccggctg gactttgggc tacatgctga 1860

acctgaccaa catgatccca gctgagcaac cattgtccac acctctctcc cactccacct 1920

atgtcttcct catggttcta ttctccctgg tccttttcac agtggccatc ataggcttgc 1980

ttatctttca caagccttca tatttctgga aagatatggt atagggcgcg ccgcgaaggg 2040

ttcgatccct accggttagt aatgagttta aacgggggag gctaactgaa acacggaagg 2100

agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg 2160

ggtgttgggt cgtttgttca taacttcgta taggatactt tatacgaagt tatatacttc 2220

atggttggcc acaaagtcat cttttacatc atggtggatg atatctccag gatgcctttg 2280

atagagctgg gtcctctgcg ttcctttaaa gtgtttgaga tcaagtccga gaagaggtgg 2340

caagacatca gcatgatgcg ca 2362

<210> 5

<211> 1801

<212> DNA

<213> 经第二载体pBP-CD47改造后的猪基因序列信息

<400> 5

taaactgcaa aatacagact agatgataat agcatattgt ctcctctaga aatcccagag 60

gttacattta ccccattctt ctttatttca gatacattga gcattacttg gaggagttct 120

taatatctgc aaatacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gtgatgcggt 180

tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 240

accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 300

gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 360

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 420

ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatcgaaccc 480

ttgcggccgc tatgtggccc ctggtagcgg cgctgttgct gggctcggcg tgctgcggat 540

cagctcagct actatttaat aaaacaaaat ctgtagaatt cacgttttgt aatgacactg 600

tcgtcattcc atgctttgtt actaatatgg aggcacaaaa cactactgaa gtatacgtaa 660

agtggaaatt taaaggaaga gatatttaca cctttgatgg agctctaaac aagtccactg 720

tccccactga ctttagtagt gcaaaaattg aagtctcaca attactaaaa ggagatgcct 780

ctttgaagat ggataagagt gatgctgtct cacacacagg aaactacact tgtgaagtaa 840

cagaattaac cagagaaggt gaaacgatca tcgagctaaa atatcgtgtt gtttcatggt 900

tttctccaaa tgaaaatatt cttattgtta ttttcccaat ttttgctata ctcctgttct 960

ggggacagtt tggtattaaa acacttaaat atagatccgg tggtatggat gagaaaacaa 1020

ttgctttact tgttgctgga ctagtgatca ctgtcattgt cattgttgga gccattcttt 1080

tcgtcccagg tgaatattca ttaaagaatg ctactggcct tggtttaatt gtgacttcta 1140

cagggatatt aatattactt cactactatg tgtttagtac agcgattgga ttaacctcct 1200

tcgtcattgc catattggtt attcaggtga tagcctatat cctcgctgtg gttggactga 1260

gtctctgtat tgcggcgtgt ataccaatgc atggccctct tctgatttca ggtttgagta 1320

tcttagctct agcacaatta cttggactag tttatatgaa atttgtggct tccaatcaga 1380

agactataca acctcctagg aaagctgtag aggaacccct taatgcattc aaagaatcaa 1440

aaggaatgat gaatgatgaa taaggcgcgc cgcgaagggt tcgatcccta ccggttagta 1500

atgagtttaa acgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc 1560

gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat 1620

aacttcgtat aggatacttt atacgaagtt atatacttca tggttggcca caaagtcatc 1680

ttttacatca tggtggatga tatctccagg atgcctttga tagagctggg tcctctgcgt 1740

tcctttaaag tgtttgagat caagtccgag aagaggtggc aagacatcag catgatgcgc 1800

a 1801

<210> 6

<211> 1501

<212> DNA

<213> 经第二载体pBP-CTLA-4改造后的猪基因序列信息

<400> 6

taaactgcaa aatacagact agatgataat agcatattgt ctcctctaga aatcccagag 60

gttacattta ccccattctt ctttatttca gatacattga gcattacttg gaggagttct 120

taatatctgc aaatacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gtgatgcggt 180

tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 240

accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 300

gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 360

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 420

ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatcgaaccc 480

ttgcggccgc tatggcttgc cttggatttc agcggcacaa ggctcagctg aacctggcta 540

ccaggacctg gccctgcact ctcctgtttt ttcttctctt catccctgtc ttctgcaaag 600

caatgcacgt ggcccagcct gctgtggtac tggccagcag ccgaggcatc gccagctttg 660

tgtgtgagta tgcatctcca ggcaaagcca ctgaggtccg ggtgacagtg cttcggcagg 720

ctgacagcca ggtgactgaa gtctgtgcgg caacctacat gatggggaat gagttgacct 780

tcctagatga ttccatctgc acgggcacct ccagtggaaa tcaagtgaac ctcactatcc 840

aaggactgag ggccatggac acgggactct acatctgcaa ggtggagctc atgtacccac 900

cgccatacta cctgggcata ggcaacggaa cccagattta tgtaattgat ccagaaccgt 960

gcccagattc tgacttcctc ctctggatcc ttgcagcagt tagttcgggg ttgttttttt 1020

atagctttct cctcacagct gtttctttga gcaaaatgct aaagaaaaga agccctctta 1080

caacaggggt ctatgtgaaa atgcccccaa cagagccaga atgtgaaaag caatttcagc 1140

cttattttat tcccatcaat tgaggcgcgc cgcgaagggt tcgatcccta ccggttagta 1200

atgagtttaa acgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc 1260

gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat 1320

aacttcgtat aggatacttt atacgaagtt atatacttca tggttggcca caaagtcatc 1380

ttttacatca tggtggatga tatctccagg atgcctttga tagagctggg tcctctgcgt 1440

tcctttaaag tgtttgagat caagtccgag aagaggtggc aagacatcag catgatgcgc 1500

a 1501

<210> 7

<211> 1546

<212> DNA

<213> 经第二载体pBP-EPCR改造后的猪基因序列信息

<400> 7

taaactgcaa aatacagact agatgataat agcatattgt ctcctctaga aatcccagag 60

gttacattta ccccattctt ctttatttca gatacattga gcattacttg gaggagttct 120

taatatctgc aaatacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gtgatgcggt 180

tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 240

accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 300

gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 360

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 420

ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatcgaaccc 480

ttgcggccgc tatgttgaca acattgctgc cgatactgct gctgtctggc tgggcctttt 540

gtagccaaga cgcctcagat ggcctccaaa gacttcatat gctccagatc tcctacttcc 600

gcgaccccta tcacgtgtgg taccagggca acgcgtcgct ggggggacac ctaacgcacg 660

tgctggaagg cccagacacc aacaccacga tcattcagct gcagcccttg caggagcccg 720

agagctgggc gcgcacgcag agtggcctgc agtcctacct gctccagttc cacggcctcg 780

tgcgcctggt gcaccaggag cggaccttgg cctttcctct gaccatccgc tgcttcctgg 840

gctgtgagct gcctcccgag ggctctagag cccatgtctt cttcgaagtg gctgtgaatg 900

ggagctcctt tgtgagtttc cggccggaga gagccttgtg gcaggcagac acccaggtca 960

cctccggagt ggtcaccttc accctgcagc agctcaatgc ctacaaccgc actcggtatg 1020

aactgcggga attcctggag gacacctgtg tgcagtatgt gcagaaacat atttccgcgg 1080

aaaacacgaa agggagccaa acaagccgct cctacacttc gctggtcctg ggcgtcctgg 1140

tgggcagttt catcattgct ggtgtggctg taggcatctt cctgtgcaca ggtggacggc 1200

gatgttaagg cgcgccgcga agggttcgat ccctaccggt tagtaatgag tttaaacggg 1260

ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa 1320

taaaaagaca gaataaaacg cacgggtgtt gggtcgtttg ttcataactt cgtataggat 1380

actttatacg aagttatata cttcatggtt ggccacaaag tcatctttta catcatggtg 1440

gatgatatct ccaggatgcc tttgatagag ctgggtcctc tgcgttcctt taaagtgttt 1500

gagatcaagt ccgagaagag gtggcaagac atcagcatga tgcgca 1546

<210> 8

<211> 1702

<212> DNA

<213> 经第二载体pBP-PD-L1改造后的猪基因序列信息

<400> 8

taaactgcaa aatacagact agatgataat agcatattgt ctcctctaga aatcccagag 60

gttacattta ccccattctt ctttatttca gatacattga gcattacttg gaggagttct 120

taatatctgc aaatacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gtgatgcggt 180

tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 240

accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 300

gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 360

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 420

ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatcgaaccc 480

ttgcggccgc tatgaggata tttgctgtct ttatattcat gacctactgg catttgctga 540

acgcatttac tgtcacggtt cccaaggacc tatatgtggt agagtatggt agcaatatga 600

caattgaatg caaattccca gtagaaaaac aattagacct ggctgcacta attgtctatt 660

gggaaatgga ggataagaac attattcaat ttgtgcatgg agaggaagac ctgaaggttc 720

agcatagtag ctacagacag agggcccggc tgttgaagga ccagctctcc ctgggaaatg 780

ctgcacttca gatcacagat gtgaaattgc aggatgcagg ggtgtaccgc tgcatgatca 840

gctatggtgg tgccgactac aagcgaatta ctgtgaaagt caatgcccca tacaacaaaa 900

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tgagaatcaa cacaacaact aatgagattt tctactgcac ttttaggaga ttagatcctg 1140

aggaaaacca tacagctgaa ttggtcatcc cagaactacc tctggcacat cctccaaatg 1200

aaaggactca cttggtaatt ctgggagcca tcttattatg ccttggtgta gcactgacat 1260

tcatcttccg tttaagaaaa gggagaatga tggatgtgaa aaaatgtggc atccaagata 1320

caaactcaaa gaagcaaagt gatacacatt tggaggagac gtaaggcgcg ccgcgaaggg 1380

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agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg 1500

ggtgttgggt cgtttgttca taacttcgta taggatactt tatacgaagt tatatacttc 1560

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caagacatca gcatgatgcg ca 1702

<210> 9

<211> 953

<212> DNA

<213> 经第三载体 pBP-B2M改造后的猪基因序列信息

<400> 9

ttcgaggtct agccagcctt agcatgacaa agataacttc gtatagcata cattatacga 60

agttatgtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 120

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 180

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 240

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 300

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 360

ctagaggatc gaacccttgc ggccgctatg tctcgctccg tggccttagc tgtgctcgcg 420

ctactctctc tttctggcct ggaggctatc cagcgtactc caaagattca ggtttactca 480

cgtcatccag cagagaatgg aaagtcaaat ttcctgaatt gctatgtgtc tgggtttcat 540

ccatccgaca ttgaagttga cttactgaag aatggagaga gaattgaaaa agtggagcat 600

tcagacttgt ctttcagcaa ggactggtct ttctatctct tgtactacac tgaattcacc 660

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agtaatgagt ttaaacgggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga 840

acccgcgcta tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acgggtgttg ggtcgtttgt 900

tcataacttc gtataggata ctttatacga agttatgaat atcaggatct gca 953

<210> 10

<211> 1994

<212> DNA

<213> 经第三载体 pBP-Factor VII改造后的猪基因序列信息

<400> 10

ttcgaggtct agccagcctt agcatgacaa agataacttc gtatagcata cattatacga 60

agttatgtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 120

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 180

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gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 300

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 360

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gtgaacgaga acggcggctg tgagcagtac tgcagtgacc acacgggcac caagcgctcc 900

tgtcggtgcc acgaggggta ctctctgctg gcagacgggg tgtcctgcac acccacagtt 960

gaatatccat gtggaaaaat acctattcta gaaaaaagaa atgccagcaa accccaaggc 1020

cgaattgtgg ggggcaaggt gtgccccaaa ggggagtgtc catggcaggt cctgttgttg 1080

gtgaatggag ctcagttgtg tggggggacc ctgatcaaca ccatctgggt ggtctccgcg 1140

gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg aggaacctga tcgcggtgct gggcgagcac 1200

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gtggtcctca ctgaccatgt ggtgcccctc tgcctgcccg aacggacgtt ctctgagagg 1380

acgctggcct tcgtgcgctt ctcattggtc agcggctggg gccagctgct ggaccgtggc 1440

gccacggccc tggagctcat ggtcctcaac gtgccccggc tgatgaccca ggactgcctg 1500

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tatcaggatc tgca 1994

<210> 11

<211> 14360

<212> DNA

<213> 经第三载体 pBP-FAT-1改造后的猪基因序列信息

<400> 11

ttcgaggtct agccagcctt agcatgacaa agataacttc gtatagcata cattatacga 60

agttatgtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 120

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 180

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 240

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 300

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 360

ctagaggatc gaacccttgc ggccgctatg gggagacatt tggctttgct cctgcttctg 420

ctccttctct tccaacattt tggagacagt gatggcagcc aacgacttga acagactcct 480

ctgcagttta cacacctcga gtacaacgtc accgtgcagg agaactctgc agctaagact 540

tatgtggggc atcctgtcaa gatgggtgtt tacattacac atccagcgtg ggaagtaagg 600

tacaaaattg tttccggaga cagtgaaaac ctgttcaaag ctgaagagta cattctcgga 660

gacttttgct ttctaagaat aaggaccaaa ggaggaaata cagctattct taatagagaa 720

gtgaaggatc actacacatt gatagtgaaa gcacttgaaa aaaatactaa tgtggaggcg 780

cgaacaaagg tcagggtgca ggtgctggat acaaatgact tgagaccgtt attctcaccc 840

acctcataca gcgtttcttt acctgaaaac acagctataa ggaccagtat cgcaagagtc 900

agcgccacgg atgcagacat aggaaccaac ggggaatttt actacagttt taaagatcga 960

acagatatgt ttgctattca cccaaccagt ggtgtgatag tgttaactgg tagacttgat 1020

tacctagaga ccaagctcta tgagatggaa atcctcgctg cggaccgtgg catgaagttg 1080

tatgggagca gtggcatcag cagcatggcc aagctaacgg tgcacatcga acaggccaat 1140

gaatgtgctc cggtgataac agcagtgaca ttgtcaccat cagaactgga cagggaccca 1200

gcatatgcaa ttgtgacagt ggatgactgc gatcagggtg ccaatggtga catagcatct 1260

ttaagcatcg tggcaggtga ccttctccag cagtttagaa cagtgaggtc ctttccaggg 1320

agtaaggagt ataaagtcaa agccatcggt ggcattgatt gggacagtca tcctttcggc 1380

tacaatctca cactacaggc taaagataaa ggaactccgc cccagttctc ttctgttaaa 1440

gtcattcacg tgacttctcc acagttcaaa gccgggccag tcaagtttga aaaggatgtt 1500

tacagagcag aaataagtga atttgctcct cccaacacac ctgtggtcat ggtaaaggcc 1560

attcctgctt attcccattt gaggtatgtt tttaaaagta cacctggaaa agctaaattc 1620

agtttaaatt acaacactgg tctcatttct attttagaac cagttaaaag acagcaggca 1680

gcccattttg aacttgaagt aacaacaagt gacagaaaag cgtccaccaa ggtcttggtg 1740

aaagtcttag gtgcaaatag caatccccct gaatttaccc agacagcgta caaagctgct 1800

tttgatgaga acgtgcccat tggtactact gtcatgagcc tgagtgccgt agaccctgat 1860

gagggtgaga acgggtacgt gacatacagt atcgcaaatt taaatcatgt gccgtttgcg 1920

attgaccatt tcactggtgc cgtgagtacg tcagaaaacc tggactacga actgatgcct 1980

cgggtttata ctctgaggat tcgtgcatca gactggggct tgccgtaccg ccgggaagtc 2040

gaagtccttg ctacaattac tctcaataac ttgaatgaca acacaccttt gtttgagaaa 2100

ataaattgtg aagggacaat tcccagagat ctaggcgtgg gagagcaaat aaccactgtt 2160

tctgctattg atgcagatga acttcagttg gtacagtatc agattgaagc tggaaatgaa 2220

ctggatttct ttagtttaaa ccccaactcg ggggtattgt cattaaagcg atcgctaatg 2280

gatggcttag gtgcaaaggt gtctttccac agtctgagaa tcacagctac agatggagaa 2340

aattttgcca caccattata tatcaacata acagtggctg ccagtcacaa gctggtaaac 2400

ttgcagtgtg aagagactgg tgttgccaaa atgctggcag agaagctcct gcaggcaaat 2460

aaattacaca accagggaga ggtggaggat attttcttcg attctcactc tgtcaatgct 2520

cacataccgc agtttagaag cactcttccg actggtattc aggtaaagga aaaccagcct 2580

gtgggttcca gtgtaatttt catgaactcc actgaccttg acactggctt caatggaaaa 2640

ctggtctatg ctgtttctgg aggaaatgag gatagttgct tcatgattga tatggaaaca 2700

ggaatgctga aaattttatc tcctcttgac cgtgaaacaa cagacaaata caccctgaat 2760

attaccgtct atgaccttgg gataccccag aaggctgcgt ggcgtcttct acatgtcgtg 2820

gttgtcgatg ccaatgataa tccacccgag tttttacagg agagctattt tgtggaagtg 2880

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gggcccaacg gacacgtgac gtactcaatt gttacagaca cagacacatt ttcaattgac 3000

agcgtgacgg gtgttgttaa catcgcacgc cctctggatc gagagctgca gcatgagcac 3060

tccttaaaga ttgaggccag ggaccaagcc agagaagagc ctcagctgtt ctccactgtc 3120

gttgtgaaag tatcactaga agatgttaat gacaacccac ctacatttat tccacctaat 3180

tatcgtgtga aagtccgaga ggatcttcca gaaggaaccg tcatcatgtg gttagaagcc 3240

cacgatcctg atttaggtca gtctggtcag gtgagataca gccttctgga ccacggagaa 3300

ggaaacttcg atgtggataa actcagtgga gcagttagga tcgtccagca gttggacttt 3360

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ctgtcttcta cttgctatgt tgaagttgag gtggttgatg tgaatgagaa cctgcaccca 3480

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ttggtaatga cggtgtcggc tcatgatgag gacgccagaa gagatgggga gatccgatac 3600

tccattagag atggctctgg cgttggtgtt ttcaaaatag gtgaagagac aggtgtcata 3660

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atcagactcc ctgagcggga aaagccagac cgagaaagaa atgccagacg ggagccgctc 4200

tatcacgtca tagccaccga caaggatgag ggccccaatg cagaaatctc ctacagcatc 4260

gaagacggga atgagcatgg caaatttttc atcgaaccga aaactggagt ggtttcgtcc 4320

aagaggtttt cagcagctgg agaatatgat attctttcaa ttaaggcagt tgacaatggt 4380

cgccctcaaa agtcatcaac caccagactc catattgaat ggatctccaa gcccaaaccg 4440

tccctggagc ccatttcatt tgaagaatca ttttttacct ttactgtgat ggaaagtgac 4500

cccgttgctc acatgattgg agtaatatct gtggagcctc ctggcatacc cctttggttt 4560

gacatcactg gtggcaacta cgacagtcac ttcgatgtgg acaagggaac tggaaccatc 4620

attgttgcca aacctcttga tgcagaacag aagtcaaact acaacctcac agtcgaggct 4680

acagatggaa ccaccactat cctcactcag gtattcatca aagtaataga cacaaatgac 4740

catcgtcctc agttttctac atcaaagtat gaagttgtta ttcctgaaga tacagcgcca 4800

gaaacagaaa ttttgcaaat cagtgctgtg gatcaggatg agaaaaacaa actaatctac 4860

actctgcaga gcagtagaga tccactgagt ctcaagaaat ttcgtcttga tcctgcaacc 4920

ggctctctct atacttctga gaaactggat catgaagctg ttcaccagca caccctcacg 4980

gtcatggtac gagatcaaga tgtgcctgta aaacgcaact ttgcaaggat tgtggtcaat 5040

gtcagcgaca cgaatgacca cgccccgtgg ttcaccgctt cctcctacaa agggcgggtt 5100

tatgaatcgg cagccgttgg ctcagttgtg ttgcaggtga cggctctgga caaggacaaa 5160

gggaaaaatg ctgaagtgct gtactcgatc gagtcaggaa atattggaaa ttcttttatg 5220

attgatcctg tcttgggctc tattaaaact gccaaagaat tagatcgaag taaccaagcg 5280

gagtatgatt taatggtaaa agctacagat aagggcagtc caccaatgag tgaaataact 5340

tctgtgcgta tctttgtcac aattgctgac aacgcctctc cgaagtttac atcaaaagaa 5400

tattctgttg aacttagtga aactgtcagc attgggagtt tcgttgggat ggttacagcc 5460

catagtcaat catcagtggt gtatgaaata aaagatggaa atacaggtga tgcttttgat 5520

attaatccac attctggaac tatcatcact cagaaagccc tggactttga aactttgccc 5580

atttacacat tgataataca aggaactaac atggctggtt tgtccactaa tacaacggtt 5640

ctagttcact tgcaggatga gaatgacaac gcgccagttt ttatgcaggc agaatataca 5700

ggactcatta gtgaatcagc ctcaattaac agcgtggtcc taacagacag gaatgtccca 5760

ctggtgattc gagcagctga tgctgataaa gactcaaatg ctttgcttgt atatcacatt 5820

gttgaaccat ctgtacacac atattttgct attgattcta gcactggtgc tattcataca 5880

gtactaagtc tggactatga agaaacaagt atttttcact ttaccgtcca agtgcatgac 5940

atgggaaccc cacgtttatt tgctgagtat gcagcgaatg taacagtaca tgtaattgac 6000

attaatgact gcccccctgt gtttgccaag ccattatatg aagcatctct tttgttacca 6060

acatacaaag gagtaaaagt catcacagta aatgctacag atgctgattc aagtgcattc 6120

tcacagttga tttactccat caccgaaggc aacatcgggg agaagttttc tatggactac 6180

aagactggtg ctctcactgt ccaaaacaca actcagttaa gaagccgcta cgagctaacc 6240

gttagagctt ccgatggcag atttgccggc cttacctctg tcaaaattaa tgtgaaagaa 6300

agcaaagaaa gtcacctaaa gtttacccag gatgtctact ctgcggtagt gaaagagaat 6360

tccaccgagg ccgaaacatt agctgtcatt actgctattg ggaatccaat caatgagcct 6420

ttgttttatc acatcctcaa cccagatcgc agatttaaaa taagccgcac ttcaggagtt 6480

ctgtcaacca ctggcacgcc cttcgatcgt gagcagcagg aggcgtttga tgtggttgta 6540

gaagtgacag aggaacataa gccttctgca gtggcccacg ttgtcgtgaa ggtcattgta 6600

gaagaccaaa atgataatgc gccggtgttt gtcaaccttc cctactacgc cgttgttaaa 6660

gtggacactg aggtgggcca tgtcattcgc tatgtcactg ctgtagacag agacagtggc 6720

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ttgggtgaaa tttcactgaa aaagcaattt gagcttgaca ccttaaataa agaatatctt 6840

gttacagtgg ttgcaaaaga tggagggaac ccggcctttt cagcggaagt tatcgttccg 6900

atcactgtca tgaataaagc catgcctgtg tttgaaaaac ctttctacag tgcagagatt 6960

gcagagagca tccaggtgca cagccctgtg gtccacgtgc aggctaacag cccggaaggc 7020

ctgaaagtgt tctacagcat cacagacgga gaccctttca gccagttcac tattaacttc 7080

aatactggag ttatcaatgt catagctcct ctggactttg aggcccaccc ggcatataag 7140

ctgagcatac gcgcaactga ctccttgacg ggcgctcatg ctgaagtatt tgtggacatc 7200

atagtagacg acatcaatga taaccctcct gtgtttgctc agcagtctta tgcggtgacc 7260

ctgtctgagg catctgtaat tggaacgtct gttgttcaag ttagagccac cgattctgat 7320

tcagaaccaa atagaggaat ctcataccag atgtttggga atcacagcaa gagtcatgat 7380

cattttcatg tagacagcag cactggcctc atctcactac tcagaaccct ggattacgag 7440

cagtcccggc agcacacgat ttttgtgagg gcagttgatg gtggtatgcc cacgctgagc 7500

agtgatgtga ttgtcacggt ggacgttacc gacctcaatg ataatccacc actctttgaa 7560

caacagattt atgaagccag aattagcgag cacgcccctc atgggcattt cgtgacctgt 7620

gtaaaagcct atgatgcaga cagttcagac atagacaagt tgcagtattc cattctgtct 7680

ggcaatgatc ataaacattt tgtcattgac agtgcaacag ggattatcac cctctcaaac 7740

ctgcaccggc acgccctgaa gccattttac agtcttaacc tgtcagtgtc tgatggagtt 7800

tttagaagtt ccacccaggt tcatgtaact gtaattggag gcaatttgca cagtcctgct 7860

ttccttcaga acgaatatga agtggaacta gctgaaaacg ctcccctaca taccctggtg 7920

atggaggtga aaactacgga tggggattct ggtatttatg gtcacgttac ttaccatatt 7980

gtaaatgact ttgccaaaga cagattttac ataaatgaga gaggacagat atttactttg 8040

gaaaaacttg atcgagaaac cccggcggag aaagtgatct cagtccgttt aatggctaag 8100

gatgctggag gaaaagttgc tttctgcacc gtgaatgtca tccttacaga tgacaatgac 8160

aatgcaccac aatttcgagc aaccaaatac gaagtgaata tcgggtccag tgctgctaaa 8220

gggacttcag tcgttaaagt tcttgcaagt gatgccgatg agggctccaa tgccgacatc 8280

acctatgcca ttgaagcaga ctctgaaagt gtaaaagaga atttggaaat taacaaactg 8340

tccggcgtaa tcactacaaa ggagagcctc attggcttgg aaaatgaatt cttcactttc 8400

tttgttagag ctgtggataa tgggtctcca tcaaaagaat ctgttgttct tgtctatgtt 8460

aaaatccttc caccggaaat gcagcttcca aaattttcag aacctttcta tacctttaca 8520

gtgtcagagg acgtgcctat tggaacagag atagatctca tccgagcaga acatagtggg 8580

actgttcttt acagcctggt caaagggaat actccagaaa gcaataggga tgagtccttt 8640

gtgattgaca gacagagcgg gagactgaag ttggagaaga gtcttgatca tgagacaact 8700

aagtggtatc agttttccat actggccagg tgcactcaag atgaccatga gatggtggct 8760

tctgtagatg ttagtatcca agtgaaagat gcaaatgaca acagcccggt ctttgaatct 8820

agtccatatg aggcattcat tgttgaaaac ctgccagggg gaagtagagt aattcagatc 8880

agggcatctg atgctgactc aggaaccaac ggccaagtta tgtatagcct ggatcagtca 8940

caaagtgtgg aagtcattga atcctttgcc attaacatgg aaacaggctg gattacaact 9000

ttaaaggaac ttgaccatga aaagagagac aattaccaga ttaaagtggt tgcatcagat 9060

catggtgaaa agatccagct atcctccaca gccattgtgg atgttaccgt caccgatgtc 9120

aacgatagtc caccacgatt cacggccgag atctataaag ggactgtgag tgaggatgac 9180

ccccaaggtg gggtgattgc catcttaagt accacggatg ctgattctga agagatcaac 9240

agacaagtta catatttcat aacaggaggg gatcctttag gacagtttgc cgttgaaact 9300

atacagaatg aatggaaggt atatgtgaag aaacctctag acagggaaaa aagggacaat 9360

taccttctta ctatcacggc aactgatggc accttctcat caaaagcgat agttgaagtg 9420

aaagttctgg atgcaaatga caacagtcca gtttgtgaaa agactttata ttcagacact 9480

attcctgaag acgtccttcc tggaaaattg atcatgcaga tctctgctac agacgcagac 9540

atccgctcta acgctgaaat tacttacacg ttattgggtt caggtgcaga aaaattcaaa 9600

ctaaatccag acacaggtga actgaaaacg tcaacccccc ttgatcgtga ggagcaagct 9660

gtttatcatc ttctcgtcag ggccacagat ggaggaggaa gattctgcca agccagtatt 9720

gtgctcacgc tagaagatgt gaacgataac gcccccgaat tctctgccga tccttatgcc 9780

atcaccgtgt ttgaaaacac agagccggga acgctgctga caagagtgca ggccacagat 9840

gccgacgcag gattaaatcg gaagatttta tactcactga ttgactctgc tgatgggcag 9900

ttctccatta acgaattatc tggaattatt cagttagaaa aacctttgga cagagaactc 9960

caggcagtat acaccctctc tttgaaagct gtggatcaag gcttgccaag gaggctgact 10020

gccactggca ctgtgattgt atcagttctt gacataaatg acaacccccc tgtgtttgag 10080

taccgtgaat atggtgccac cgtgtctgag gacattcttg ttggaactga agttcttcaa 10140

gtgtatgcag caagtcggga tattgaagca aatgcagaaa tcacctactc aataataagt 10200

ggaaatgaac atgggaaatt cagcatagat tctaaaacag gggccgtatt tatcattgag 10260

aatctggatt atgagagctc tcatgagtat tacctaacag tagaggccac tgatggaggc 10320

acgccttcac tgagcgacgt tgccactgtg aacgttaatg taacagatat caacgataat 10380

acccctgtgt tcagccaaga cacctacacg acagtcatca gtgaagatgc cgttcttgag 10440

cagtctgtca tcacggttat ggccgatgat gccgatggac cttccaacag ccacatccac 10500

tactcaatta tagatggcaa ccaaggaagc tcgttcacaa ttgaccccgt caggggagaa 10560

gtcaaagtga ccaaacttct cgaccgagaa acgatttcag gttacacgct cacggttcaa 10620

gcttctgata atggcagtcc acccagagtc aacacgacga ccgtgaacat cgatgtgtcc 10680

gatgtcaatg acaacgcgcc cgtcttctcc aggggaaact acagtgtcat tatccaggaa 10740

aataagccag tgggcttcag cgtgctgcag ctggtagtaa cagatgagga ttcttcccat 10800

aacggtccac ccttcttctt tactattgta actggaaatg atgagaaggc ttttgaagtt 10860

aacccgcaag gagtcctcct gacatcatct gccatcaaga ggaaggagaa agatcattac 10920

ttactgcagg tgaaggtggc agataatgga aagcctcagt tgtcatcttt gacatacatt 10980

gacattaggg taattgagga gagcatctat ccgcctgcga ttttgcccct ggagattttc 11040

atcacctctt ctggagaaga atactcaggt ggcgtcattg ggaagatcca tgccacagac 11100

caggacgtgt atgatactct aacctacagt ctcgaccctc agatggacaa cctgttctct 11160

gtttccagca cagggggcaa gctgatagca cacaaaaagc tagacatagg gcaatacctt 11220

ctcaatgtca gcgtaacaga tgggaagttc acgacggtgg ccgacatcac agtgcatatc 11280

agacaagtca cacaggagat gttgaaccac accatcgcga tccgctttgc caacctcact 11340

ccggaagaat tcgttggtga ctactggcgc aacttccagc gagctttacg gaacatcctg 11400

ggtgtgagga ggaacgacat acagattgtt agtttgcagt cctctgaacc tcacccacat 11460

ctggacgtct tactttttgt agagaaacca ggtagtgctc agatctcaac aaaacaactt 11520

ctgcacaaga ttaactcttc cgtgactgac attgaggaaa tcattggagt taggatactg 11580

aatgtattcc agaaactctg cgcgggactg gactgcccct ggaagttctg cgatgaaaag 11640

gtgtctgtgg atgaaagtgt gatgtcaaca cacagcacag ccagactgag ttttgtgact 11700

ccccgccacc acagggcagc ggtgtgtctc tgcaaagagg gaaggtgccc acctgtccac 11760

catggctgtg aagatgatcc gtgccctgag ggatccgaat gtgtgtctga tccctgggag 11820

gagaaacaca cctgtgtctg tcccagcggc aggtttggtc agtgcccagg gagttcatct 11880

atgacactga ctggaaacag ctacgtgaaa taccgtctga cggaaaatga aaacaaatta 11940

gagatgaaac tgaccatgag gctcagaaca tattccacgc atgcggttgt catgtatgct 12000

cgaggaactg actatagcat cttggagatt catcatggaa ggctgcagta caagtttgac 12060

tgtggaagtg gccctggaat tgtctctgtt cagagcattc aggtcaatga tgggcagtgg 12120

cacgcagtgg ccctggaagt gaatggaaac tatgctcgct tggttctaga ccaagttcat 12180

actgcatcgg gcacagcccc agggactctg aaaaccctga acctggataa ctatgtgttt 12240

tttggtggcc acatccgtca gcagggaaca aggcatggaa gaagtcctca agttggtaat 12300

ggtttcaggg gttgtatgga ctccatttat ttgaatgggc aggagctccc tttaaacagc 12360

aaacccagaa gctatgcaca catcgaagag tcggtggatg tatctccagg ctgcttcctg 12420

acggccacgg aagactgcgc cagcaaccct tgccagaatg gaggcgtttg caatccgtca 12480

cctgctggag gttattactg caaatgcagt gccttgtaca tagggaccca ctgtgagata 12540

agcgtcaatc cgtgttcctc caagccatgc ctctatgggg gcacgtgtgt tgtcgacaac 12600

ggaggctttg tttgccagtg tagaggatta tatactggtc agaggtgtca gcttagtcca 12660

tactgcaaag atgaaccctg taagaatggc ggaacatgct ttgacagttt ggatggcgcc 12720

gtttgtcagt gtgattcggg ttttagggga gaaaggtgtc agagtgatat cgacgagtgc 12780

tctggaaacc cttgcctgca cggggccctc tgtgagaaca cgcacggctc ctatcactgc 12840

aactgcagcc acgagtacag gggacgtcac tgcgaggatg ctgcgcccaa ccagtatgtg 12900

tccacgccgt ggaacattgg gttggcggaa ggaattggaa tcgttgtgtt tgttgcaggg 12960

atatttttac tggtggtggt gtttgttctc tgccgtaaga tgattagtcg gaaaaagaag 13020

catcaggctg aacctaaaga caagcacctg ggacccgcta cggctttctt gcaaagaccg 13080

tattttgatt ccaagctaaa taagaacatt tactcagaca taccacccca ggtgcctgtc 13140

cggcctattt cctacacccc gagtattcca agtgactcaa gaaacaatct ggaccgaaat 13200

tccttcgaag gatctgctat cccagagcat cccgaattca gcacttttaa ccccgagtct 13260

gtgcacgggc accgaaaagc agtggcggtc tgcagcgtgg cgccaaacct gcctccccca 13320

cccccttcaa actccccttc tgacagcgac tccatccaga agcctagctg ggactttgac 13380

tatgacacaa aagtggtgga tcttgatccc tgtctttcca agaagcctct agaggaaaag 13440

ccttcccagc catacagtgc ccgggaaagc ctgtctgaag tgcagtctct gagctccttc 13500

cagtccgaat cgtgcgatga caatgggtat cactgggata catcagattg gatgccaagc 13560

gttcctctgc cggacataca agagttcccc aactatgagg tgattgatga gcagacaccc 13620

ctgtactcag cagatccaaa cgccatcgat acggactatt accctggagg ctacgacatc 13680

gaaagtgatt ttcctccacc cccagaagac ttccccgcag ctgatgagct accaccgtta 13740

ccgcccgaat tcagcaatca gtttgaatcc atccaccctc ctagagacat gcctgccgcg 13800

ggtagcttgg gttcttcatc aagaaaccgg cagaggttca acttgaatca gtatttgccc 13860

aatttttatc ccctcgatat gtctgaacct caaacaaaag gcactggtga gaatagtact 13920

tgtagagaac cccatgcccc ttacccgcca gggtatcaaa gacacttcga ggcgcccgct 13980

gtcgagagca tgcccatgtc tgtgtacgcc tccaccgcct cctgctctga cgtgtcagcc 14040

tgctgcgaag tggagtccga ggtcatgatg agtgactatg agagcgggga cgacggccac 14100

ttcgaagagg tgacgatccc gcccctggat tcccagcagc acacggaagt ctgaggcgcg 14160

ccgcgaaggg ttcgatccct accggttagt aatgagttta aacgggggag gctaactgaa 14220

acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat 14280

aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttca taacttcgta taggatactt tatacgaagt 14340

tatgaatatc aggatctgca 14360

<210> 12

<211> 1670

<212> DNA

<213> 经第三载体 pBP-HLAE改造后的猪基因序列信息

<400> 12

ttcgaggtct agccagcctt agcatgacaa agataacttc gtatagcata cattatacga 60

agttatgtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 120

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 180

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 240

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 300

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 360

ctagaggatc gaacccttgc ggccgctatg gtagatggaa ccctcctttt actcctctcg 420

gaggccctgg cccttaccca gacctgggcg ggctcccact ccttgaagta tttccacact 480

tccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc cgcttcatct ctgtgggcta cgtggacgac 540

acccagttcg tgcgcttcga caacgacgcc gcgagtccga ggatggtgcc gcgggcgccg 600

tggatggagc aggaggggtc agagtattgg gaccgggaga cacggagcgc cagggacacc 660

gcacagattt tccgagtgaa tctgcggacg ctgcgcggct actacaatca gagcgaggcc 720

gggtctcaca ccctgcagtg gatgcatggc tgcgagctgg ggcccgacgg gcgcttcctc 780

cgcgggtatg aacagttcgc ctacgacggc aaggattatc tcaccctgaa tgaggacctg 840

cgctcctgga ccgcggtgga cacggcggct cagatctccg agcaaaagtc aaatgatgcc 900

tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa 960

tacctggaga aggggaagga gacgctgctt cacctggagc ccccaaagac acacgtgact 1020

caccacccca tctctgacca tgaggccacc ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct 1080

gcggagatca cactgacctg gcagcaggat ggggagggcc atacccagga cacggagctc 1140

gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct 1200

tctggagagg agcagagata cacgtgccat gtgcagcatg aggggctacc cgagcccgtc 1260

accctgagat ggaagccggc ttcccagccc accatcccca tcgtgggcat cattgctggc 1320

ctggttctcc ttggatctgt ggtctctgga gctgtggttg ctgctgtgat atggaggaag 1380

aagagctcag gtggaaaagg agggagctac tctaaggctg agtggagcga cagtgcccag 1440

gggtctgagt ctcacagctt gtaaggcgcg ccgcgaaggg ttcgatccct accggttagt 1500

aatgagttta aacgggggag gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc 1560

cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttca 1620

taacttcgta taggatactt tatacgaagt tatgaatatc aggatctgca 1670

<210> 13

<211> 1295

<212> DNA

<213> 经第三载体 pBP-TNFα改造后的猪基因序列信息

<400> 13

ttcgaggtct agccagcctt agcatgacaa agataacttc gtatagcata cattatacga 60

agttatgtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 120

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 180

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 240

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 300

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 360

ctagaggatc gaacccttgc ggccgctatg agcactgaaa gcatgatccg ggacgtggag 420

ctggccgagg aggcgctccc caagaagaca ggggggcccc agggctccag gcggtgcttg 480

ttcctcagcc tcttctcctt cctgatcgtg gcaggcgcca ccacgctctt ctgcctgctg 540

cactttggag tgatcggccc ccagagggaa gagttcccca gggacctctc tctaatcagc 600

cctctggccc aggcagtcag atcatcttct cgaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat 660

gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc 720

ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg 780

tacctcatct actcccaggt cctcttcaag ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc 840

ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct 900

gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat 960

gagcccatct atctgggagg ggtcttccag ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag 1020

atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt 1080

gccctgtgag gcgcgccgcg aagggttcga tccctaccgg ttagtaatga gtttaaacgg 1140

gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca 1200

ataaaaagac agaataaaac gcacgggtgt tgggtcgttt gttcataact tcgtatagga 1260

tactttatac gaagttatga atatcaggat ctgca 1295

<210> 14

<211> 1443

<212> DNA

<213> 敲除CMAH基因4号外显子区域后的猪基因序列信息

<400> 14

atcacgtacc ttactcacgc ctgcatggac ctcaagctgg ataacttcgt atagcataca 60

ttatacgaag ttatgtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 120

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 180

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 240

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 300

cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 360

tccggactct agaggatcga acccttgcgg ccgctgtgag caagggcgag gagaccacaa 420

tgggcgtaat caagcccgac atgaagatca agctgaagat ggagggcaac gtgaatggcc 480

acgccttcgt gatcgagggc gagggcgagg gcaagcccta cgacggcacc aacaccatca 540

acctggaggt gaaggaggga gcccccctgc ccttctccta cgacattctg accaccgcgt 600

tcagttacgg caacagggcc ttcaccaagt accccgacga catccccaac tacttcaagc 660

agtccttccc cgagggctac tcttgggagc gcaccatgac cttcgaggac aagggcatcg 720

tgaaggtgaa gtccgacatc tccatggagg aggactcctt catctacgag atacacctca 780

agggcgagaa cttccccccc aacggccccg tgatgcagaa ggagaccacc ggctgggacg 840

cctccaccga gaggatgtac gtgcgcgacg gcgtgctgaa gggcgacgtc aagatgaagc 900

tgctgctgga gggcggcggc caccaccgcg ttgacttcaa gaccatctac agggccaaga 960

aggcggtgaa gctgcccgac tatcactttg tggaccaccg catcgagatc ctgaaccacg 1020

acaaggacta caacaaggtg accgtttacg agatcgccgt ggcccgcaac tccaccgacg 1080

gcatggacga gctgtacaag taaggcgcgc cgcgaagggt tcgatcccta ccggttagta 1140

atgagtttaa acgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc 1200

gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat 1260

aacttcgtat aggatacttt atacgaagtt atgagacaag aggatggtgt tcgatccttg 1320

gttaatcggt cctgcttttg cgcgaggatg gtggttacta cacgagcctc catctgattg 1380

gctggagagg ctgagccgcg cagatttaat ttacatcagt cacatgcact cagaccacct 1440

gag 1443

<210> 15

<211> 1442

<212> DNA

<213> 敲除B4GALNT2 基因2号外显子区域后的猪基因序列信息

<400> 15

ccctagatgt ctgtcgatcc tcaagatatc gatgataact tcgtatagca tacattatac 60

gaagttatgt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 120

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 180

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 240

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 300

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgga 360

ctctagagga tcgaaccctt gcggccgctg tgagcaaggg cgaggagacc acaatgggcg 420

taatcaagcc cgacatgaag atcaagctga agatggaggg caacgtgaat ggccacgcct 480

tcgtgatcga gggcgagggc gagggcaagc cctacgacgg caccaacacc atcaacctgg 540

aggtgaagga gggagccccc ctgcccttct cctacgacat tctgaccacc gcgttcagtt 600

acggcaacag ggccttcacc aagtaccccg acgacatccc caactacttc aagcagtcct 660

tccccgaggg ctactcttgg gagcgcacca tgaccttcga ggacaagggc atcgtgaagg 720

tgaagtccga catctccatg gaggaggact ccttcatcta cgagatacac ctcaagggcg 780

agaacttccc ccccaacggc cccgtgatgc agaaggagac caccggctgg gacgcctcca 840

ccgagaggat gtacgtgcgc gacggcgtgc tgaagggcga cgtcaagatg aagctgctgc 900

tggagggcgg cggccaccac cgcgttgact tcaagaccat ctacagggcc aagaaggcgg 960

tgaagctgcc cgactatcac tttgtggacc accgcatcga gatcctgaac cacgacaagg 1020

actacaacaa ggtgaccgtt tacgagatcg ccgtggcccg caactccacc gacggcatgg 1080

acgagctgta caagtaaggc gcgccgcgaa gggttcgatc cctaccggtt agtaatgagt 1140

ttaaacgggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta 1200

tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acgggtgttg ggtcgtttgt tcataacttc 1260

gtataggata ctttatacga agttatgtgc ttttggtcct gagcgttgga ctctttatgt 1320

tccaaagcgt gttcctcgat acagacttca gtctcctcaa ctcacccatc ccgtccccca 1380

ccctggatgc gcagacgctg aagcttctac ctgagaaacc cgatttctac ggtgaaaacg 1440

gg 1442

<210> 16

<211> 8838

<212> DNA

<213> 敲入人源vWF基因后的猪基因序列信息

<400> 16

gtggcagctc acagctattg tggtgggaaa gggagggtgg ttggtggatg tcacagcttg 60

ggctttatct cccccagcag tggggactcc acagcccctg ggctacataa cagcaagaca 120

gtccggagct gtagcagacc tgattgagcc tttgcagcag ctgagagcat ggcctagggt 180

gggcggcacc attgtccagc agctgagttt cccagggacc ttggagatag ccgcagccct 240

catttgcagg ggaagatgat tcctgccaga tttgccgggg tgctgcttgc tctggccctc 300

attttgccag ggaccctttg tgcagaagga actcgcggca ggtcatccac ggcccgatgc 360

agccttttcg gaagtgactt cgtcaacacc tttgatggga gcatgtacag ctttgcggga 420

tactgcagtt acctcctggc agggggctgc cagaaacgct ccttctcgat tattggggac 480

ttccagaatg gcaagagagt gagcctctcc gtgtatcttg gggaattttt tgacatccat 540

ttgtttgtca atggtaccgt gacacagggg gaccaaagag tctccatgcc ctatgcctcc 600

aaagggctgt atctagaaac tgaggctggg tactacaagc tgtccggtga ggcctatggc 660

tttgtggcca ggatcgatgg cagcggcaac tttcaagtcc tgctgtcaga cagatacttc 720

aacaagacct gcgggctgtg tggcaacttt aacatctttg ctgaagatga ctttatgacc 780

caagaaggga ccttgacctc ggacccttat gactttgcca actcatgggc tctgagcagt 840

ggagaacagt ggtgtgaacg ggcatctcct cccagcagct catgcaacat ctcctctggg 900

gaaatgcaga agggcctgtg ggagcagtgc cagcttctga agagcacctc ggtgtttgcc 960

cgctgccacc ctctggtgga ccccgagcct tttgtggccc tgtgtgagaa gactttgtgt 1020

gagtgtgctg gggggctgga gtgcgcctgc cctgccctcc tggagtacgc ccggacctgt 1080

gcccaggagg gaatggtgct gtacggctgg accgaccaca gcgcgtgcag cccagtgtgc 1140

cctgctggta tggagtatag gcagtgtgtg tccccttgcg ccaggacctg ccagagcctg 1200

cacatcaatg aaatgtgtca ggagcgatgc gtggatggct gcagctgccc tgagggacag 1260

ctcctggatg aaggcctctg cgtggagagc accgagtgtc cctgcgtgca ttccggaaag 1320

cgctaccctc ccggcacctc cctctctcga gactgcaaca cctgcatttg ccgaaacagc 1380

cagtggatct gcagcaatga agaatgtcca ggggagtgcc ttgtcacagg tcaatcacac 1440

ttcaagagct ttgacaacag atacttcacc ttcagtggga tctgccagta cctgctggcc 1500

cgggattgcc aggaccactc cttctccatt gtcattgaga ctgtccagtg tgctgatgac 1560

cgcgacgctg tgtgcacccg ctccgtcacc gtccggctgc ctggcctgca caacagcctt 1620

gtgaaactga agcatggggc aggagttgcc atggatggcc aggacgtcca gctccccctc 1680

ctgaaaggtg acctccgcat ccagcataca gtgacggcct ccgtgcgcct cagctacggg 1740

gaggacctgc agatggactg ggatggccgc gggaggctgc tggtgaagct gtcccccgtc 1800

tatgccggga agacctgcgg cctgtgtggg aattacaatg gcaaccaggg cgacgacttc 1860

cttaccccct ctgggctggc ggagccccgg gtggaggact tcgggaacgc ctggaagctg 1920

cacggggact gccaggacct gcagaagcag cacagcgatc cctgcgccct caacccgcgc 1980

atgaccaggt tctccgagga ggcgtgcgcg gtcctgacgt cccccacatt cgaggcctgc 2040

catcgtgccg tcagcccgct gccctacctg cggaactgcc gctacgacgt gtgctcctgc 2100

tcggacggcc gcgagtgcct gtgcggcgcc ctggccagct atgccgcggc ctgcgcgggg 2160

agaggcgtgc gcgtcgcgtg gcgcgagcca ggccgctgtg agctgaactg cccgaaaggc 2220

caggtgtacc tgcagtgcgg gaccccctgc aacctgacct gccgctctct ctcttacccg 2280

gatgaggaat gcaatgaggc ctgcctggag ggctgcttct gccccccagg gctctacatg 2340

gatgagaggg gggactgcgt gcccaaggcc cagtgcccct gttactatga cggtgagatc 2400

ttccagccag aagacatctt ctcagaccat cacaccatgt gctactgtga ggatggcttc 2460

atgcactgta ccatgagtgg agtccccgga agcttgctgc ctgacgctgt cctcagcagt 2520

cccctgtctc atcgcagcaa aaggagccta tcctgtcggc cccccatggt caagctggtg 2580

tgtcccgctg acaacctgcg ggctgaaggg ctcgagtgta ccaaaacgtg ccagaactat 2640

gacctggagt gcatgagcat gggctgtgtc tctggctgcc tctgcccccc gggcatggtc 2700

cggcatgaga acagatgtgt ggccctggaa aggtgtccct gcttccatca gggcaaggag 2760

tatgcccctg gagaaacagt gaagattggc tgcaacactt gtgtctgtcg ggaccggaag 2820

tggaactgca cagaccatgt gtgtgatgcc acgtgctcca cgatcggcat ggcccactac 2880

ctcaccttcg acgggctcaa atacctgttc cccggggagt gccagtacgt tctggtgcag 2940

gattactgcg gcagtaaccc tgggaccttt cggatcctag tggggaataa gggatgcagc 3000

cacccctcag tgaaatgcaa gaaacgggtc accatcctgg tggagggagg agagattgag 3060

ctgtttgacg gggaggtgaa tgtgaagagg cccatgaagg atgagactca ctttgaggtg 3120

gtggagtctg gccggtacat cattctgctg ctgggcaaag ccctctccgt ggtctgggac 3180

cgccacctga gcatctccgt ggtcctgaag cagacatacc aggagaaagt gtgtggcctg 3240

tgtgggaatt ttgatggcat ccagaacaat gacctcacca gcagcaacct ccaagtggag 3300

gaagaccctg tggactttgg gaactcctgg aaagtgagct cgcagtgtgc tgacaccaga 3360

aaagtgcctc tggactcatc ccctgccacc tgccataaca acatcatgaa gcagacgatg 3420

gtggattcct cctgtagaat ccttaccagt gacgtcttcc aggactgcaa caagctggtg 3480

gaccccgagc catatctgga tgtctgcatt tacgacacct gctcctgtga gtccattggg 3540

gactgcgcct gcttctgcga caccattgct gcctatgccc acgtgtgtgc ccagcatggc 3600

aaggtggtga cctggaggac ggccacattg tgcccccaga gctgcgagga gaggaatctc 3660

cgggagaacg ggtatgagtg tgagtggcgc tataacagct gtgcacctgc ctgtcaagtc 3720

acgtgtcagc accctgagcc actggcctgc cctgtgcagt gtgtggaggg ctgccatgcc 3780

cactgccctc cagggaaaat cctggatgag cttttgcaga cctgcgttga ccctgaagac 3840

tgtccagtgt gtgaggtggc tggccggcgt tttgcctcag gaaagaaagt caccttgaat 3900

cccagtgacc ctgagcactg ccagatttgc cactgtgatg ttgtcaacct cacctgtgaa 3960

gcctgccagg agccgggagg cctggtggtg cctcccacag atgccccggt gagccccacc 4020

actctgtatg tggaggacat ctcggaaccg ccgttgcacg atttctactg cagcaggcta 4080

ctggacctgg tcttcctgct ggatggctcc tccaggctgt ccgaggctga gtttgaagtg 4140

ctgaaggcct ttgtggtgga catgatggag cggctgcgca tctcccagaa gtgggtccgc 4200

gtggccgtgg tggagtacca cgacggctcc cacgcctaca tcgggctcaa ggaccggaag 4260

cgaccgtcag agctgcggcg cattgccagc caggtgaagt atgcgggcag ccaggtggcc 4320

tccaccagcg aggtcttgaa atacacactg ttccaaatct tcagcaagat cgaccgccct 4380

gaagcctccc gcatcaccct gctcctgatg gccagccagg agccccaacg gatgtcccgg 4440

aactttgtcc gctacgtcca gggcctgaag aagaagaagg tcattgtgat cccggtgggc 4500

attgggcccc atgccaacct caagcagatc cgcctcatcg agaagcaggc ccctgagaac 4560

aaggccttcg tgctgagcag tgtggatgag ctggagcagc aaagggacga gatcgttagc 4620

tacctctgtg accttgcccc tgaagcccct cctcctactc tgccccccga catggcacaa 4680

gtcactgtgg gcccggggct cttgggggtt tcgaccctgg ggcccaagag gaactccatg 4740

gttctggatg tggcgttcgt cctggaagga tcggacaaaa ttggtgaagc cgacttcaac 4800

aggagcaagg agttcatgga ggaggtgatt cagcggatgg atgtgggcca ggacagcatc 4860

cacgtcacgg tgctgcagta ctcctacatg gtgactgtgg agtacccctt cagcgaggca 4920

cagtccaaag gggacatcct gcagcgggtg cgagagatcc gctaccaggg cggcaacagg 4980

accaacactg ggctggccct gcggtacctc tctgaccaca gcttcttggt cagccagggt 5040

gaccgggagc aggcgcccaa cctggtctac atggtcaccg gaaatcctgc ctctgatgag 5100

atcaagaggc tgcctggaga catccaggtg gtgcccattg gagtgggccc taatgccaac 5160

gtgcaggagc tggagaggat tggctggccc aatgccccta tcctcatcca ggactttgag 5220

acgctccccc gagaggctcc tgacctggtg ctgcagaggt gctgctccgg agaggggctg 5280

cagatcccca ccctctcccc tgcacctgac tgcagccagc ccctggacgt gatccttctc 5340

ctggatggct cctccagttt cccagcttct tattttgatg aaatgaagag tttcgccaag 5400

gctttcattt caaaagccaa tatagggcct cgtctcactc aggtgtcagt gctgcagtat 5460

ggaagcatca ccaccattga cgtgccatgg aacgtggtcc cggagaaagc ccatttgctg 5520

agccttgtgg acgtcatgca gcgggaggga ggccccagcc aaatcgggga tgccttgggc 5580

tttgctgtgc gatacttgac ttcagaaatg catggtgcca ggccgggagc ctcaaaggcg 5640

gtggtcatcc tggtcacgga cgtctctgtg gattcagtgg atgcagcagc tgatgccgcc 5700

aggtccaaca gagtgacagt gttccctatt ggaattggag atcgctacga tgcagcccag 5760

ctacggatct tggcaggccc agcaggcgac tccaacgtgg tgaagctcca gcgaatcgaa 5820

gacctcccta ccatggtcac cttgggcaat tccttcctcc acaaactgtg ctctggattt 5880

gttaggattt gcatggatga ggatgggaat gagaagaggc ccggggacgt ctggaccttg 5940

ccagaccagt gccacaccgt gacttgccag ccagatggcc agaccttgct gaagagtcat 6000

cgggtcaact gtgaccgggg gctgaggcct tcgtgcccta acagccagtc ccctgttaaa 6060

gtggaagaga cctgtggctg ccgctggacc tgcccctgcg tgtgcacagg cagctccact 6120

cggcacatcg tgacctttga tgggcagaat ttcaagctga ctggcagctg ttcttatgtc 6180

ctatttcaaa acaaggagca ggacctggag gtgattctcc ataatggtgc ctgcagccct 6240

ggagcaaggc agggctgcat gaaatccatc gaggtgaagc acagtgccct ctccgtcgag 6300

ctgcacagtg acatggaggt gacggtgaat gggagactgg tctctgttcc ttacgtgggt 6360

gggaacatgg aagtcaacgt ttatggtgcc atcatgcatg aggtcagatt caatcacctt 6420

ggtcacatct tcacattcac tccacaaaac aatgagttcc aactgcagct cagccccaag 6480

acttttgctt caaagacgta tggtctgtgt gggatctgtg atgagaacgg agccaatgac 6540

ttcatgctga gggatggcac agtcaccaca gactggaaaa cacttgttca ggaatggact 6600

gtgcagcggc cagggcagac gtgccagccc atcctggagg agcagtgtct tgtccccgac 6660

agctcccact gccaggtcct cctcttacca ctgtttgctg aatgccacaa ggtcctggct 6720

ccagccacat tctatgccat ctgccagcag gacagttgcc accaggagca agtgtgtgag 6780

gtgatcgcct cttatgccca cctctgtcgg accaacgggg tctgcgttga ctggaggaca 6840

cctgatttct gtgctatgtc atgcccacca tctctggtct acaaccactg tgagcatggc 6900

tgtccccggc actgtgatgg caacgtgagc tcctgtgggg accatccctc cgaaggctgt 6960

ttctgccctc cagataaagt catgttggaa ggcagctgtg tccctgaaga ggcctgcact 7020

cagtgcattg gtgaggatgg agtccagcac cagttcctgg aagcctgggt cccggaccac 7080

cagccctgtc agatctgcac atgcctcagc gggcggaagg tcaactgcac aacgcagccc 7140

tgccccacgg ccaaagctcc cacgtgtggc ctgtgtgaag tagcccgcct ccgccagaat 7200

gcagaccagt gctgccccga gtatgagtgt gtgtgtgacc cagtgagctg tgacctgccc 7260

ccagtgcctc actgtgaacg tggcctccag cccacactga ccaaccctgg cgagtgcaga 7320

cccaacttca cctgcgcctg caggaaggag gagtgcaaaa gagtgtcccc accctcctgc 7380

cccccgcacc gtttgcccac ccttcggaag acccagtgct gtgatgagta tgagtgtgcc 7440

tgcaactgtg tcaactccac agtgagctgt ccccttgggt acttggcctc aactgccacc 7500

aatgactgtg gctgtaccac aaccacctgc cttcccgaca aggtgtgtgt ccaccgaagc 7560

accatctacc ctgtgggcca gttctgggag gagggctgcg atgtgtgcac ctgcaccgac 7620

atggaggatg ccgtgatggg cctccgcgtg gcccagtgct cccagaagcc ctgtgaggac 7680

agctgtcggt cgggcttcac ttacgttctg catgaaggcg agtgctgtgg aaggtgcctg 7740

ccatctgcct gtgaggtggt gactggctca ccgcgggggg actcccagtc ttcctggaag 7800

agtgtcggct cccagtgggc ctccccggag aacccctgcc tcatcaatga gtgtgtccga 7860

gtgaaggagg aggtctttat acaacaaagg aacgtctcct gcccccagct ggaggtccct 7920

gtctgcccct cgggctttca gctgagctgt aagacctcag cgtgctgccc aagctgtcgc 7980

tgtgagcgca tggaggcctg catgctcaat ggcactgtca ttgggcccgg gaagactgtg 8040

atgatcgatg tgtgcacgac ctgccgctgc atggtgcagg tgggggtcat ctctggattc 8100

aagctggagt gcaggaagac cacctgcaac ccctgccccc tgggttacaa ggaagaaaat 8160

aacacaggtg aatgttgtgg gagatgtttg cctacggctt gcaccattca gctaagagga 8220

ggacagatca tgacactgaa gcgtgatgag acgctccagg atggctgtga tactcacttc 8280

tgcaaggtca atgagagagg agagtacttc tgggagaaga gggtcacagg ctgcccaccc 8340

tttgatgaac acaagtgtct ggctgaggga ggtaaaatta tgaaaattcc aggcacctgc 8400

tgtgacacat gtgaggagcc tgagtgcaac gacatcactg ccaggctgca gtatgtcaag 8460

gtgggaagct gtaagtctga agtagaggtg gatatccact actgccaggg caaatgtgcc 8520

agcaaagcca tgtactccat tgacatcaac gatgtgcagg accagtgctc ctgctgctct 8580

ccgacacgga cggagcccat gcaggtggcc ctgcactgca ccaatggctc tgttgtgtac 8640

catgaggttc tcaatgccat ggagtgcaaa tgctccccca ggaagtgcag caagtgaggc 8700

tgctgcagct gcatgggtgc ctgctgctgc ctgccttggc ctgatggcca ggccagagtg 8760

ctgccagtcc tctgcatgtt ctgctcttgt gcccttctga gcccacaata aaggctgagc 8820

tcttatcttg caaaaggc 8838

Claims (4)

1.一种猪细胞基因改造的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使所述猪原代成纤维细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；

步骤S02.在Cas9-gRNA的作用下将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的基因，记为基因I；所述第一DNA载体、第二DNA载体、第三DNA载体的一端部均含有Loxp位点，另一端部均含有Lox2272；所述人补体调节蛋白为CD46、CD55、CD59中的至少一种；所述人免疫细胞激活通路负性蛋白为CTLA-4、PD-L1、PD-L2中的至少一种；所述凝血激活通路负性调节蛋白为CD39、EPCR中的至少一种；所述人巨噬细胞激活通路负性蛋白为CD47；所述人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白为B2M、HLAE中的至少一种；

步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；

步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；

步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞。

2.如权利要求1所述的猪细胞基因改造的方法，其特征在于：所述第一DNA载体为pBP-CD46、pBP-CD55、pBP-CD59中的任一种；所述第二DNA载体为pBP-CTLA-4、pBP-PD-L1、pBP-CD39、pBP-EPCR、pBP-CD47中的任一种；所述第三DNA载体为pBP-B2M、pBP-HLAE、pBP-FAT-1、pBP-TNFα、pBP-Factor VII中的任一种。

3.如权利要求1所述的猪细胞基因改造的方法，其特征在于：所述第三DNA载体中还组装有细胞保护基因，所述细胞保护基因为FAT-1、肿瘤坏死因子α受体中的任一种。

4.如权利要求1所述的猪细胞基因改造的方法，其特征在于：所述猪体细胞为胚胎成纤维细胞。

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